Gotowa bibliografia na temat „Chaperons d’histone”

La variante d'histone H2AZ joue un rôle important dans l'activation de la transcription, la prolifération cellulaire, le développement et la différentiation. H2AZ orne les promoteurs de la majorité des gènes, mais les mécanismes de bases de cette localisation sont inconnus. La compréhension de l'assemblage et du désassemblage du nucléosome passe par la caractérisation de la dynamique du nucléosome et des chaperonnes d'histones. L'objectif de ma thèse était d'identifier des chaperonnes spécifiques impliqués dans la dynamique de H2AZ en utilisant une approche de protéomique. Pour élucider les mécanismes de déposition/éviction de H2AZ, j'ai purifié le complexe prénucléosomale de H2AZ et j'ai caractérisé toutes les protéines associées. J'ai trouvé que Anp32e fait partie du complexe p400/TIP60 qui est présumée pour être responsable de l'échange d'H2AZ sur la chromatine. Anp32e présente une spécificité pour le dimère H2AZ-H2B, car il n'interagit pas avec le dimère H2A-H2B. L'interaction est accomplie au niveau d'une petite région dans le domaine d'ancrage sur H2AZ et au niveau d'un nouveau domaine ZID sur Anp32e. Finalement, j'ai montré que la suppression d'Anp32e entraine : un défaut dans la dé-répression des gènes dont l'expression est contrôlée par une hormone et une accumulation sur les promoteurs de ces derniers. Dans l'ensemble ces résultats identifient Anp32e comme une nouvelle chaperonne de la variante d'histoneH2AZ impliquée dans l'éviction de H2AZ chez les mammifères.

La chromatine chez les eucaryotes, porte des informations génétiques et épigénétiques. Les mécanismes garantissant le maintien de ces informations lors de la division cellulaire ou la réparation de l’ADN sont encore mal connus et ils constituent l’enjeu principal du projet de thèse. Plus particulièrement, l’objectif du projet de thèse est de chercher à comprendre comment les chaperons d’histones coordonnent leur action avec des partenaires associés à la fourche de réplication pour conserver les marques épigénétiques portées par les histones parentales et les reporter sur les histones nouvellement synthétisées. Cette thèse décrit précisément comment ASF1 (Anti Silencing Function 1) coopère avec le complexe CAF-1 (Chromatin Assembly Factor 1) et la sous-unité de l’hélicase réplicative MCM2 (Mini Chromosome Maintenance 2), pour la prise en charge des H3-H4 dans la réplication et la réparation de l’ADN.La thèse s’intéresse également à la régulation de l’activité de ces chaperons d’histones par des kinases activées suite à des stress réplicatifs ou des dommages de l’ADN. En particulier nous avons cherché à mieux comprendre comment l’ajout de groupements phosphate sur ASF1 par une enzyme appelée TLK (Tousled Like Kinase) module son activité au cours du cycle cellulaire et en réponse aux dommages de l’ADN. La caractérisation de l'importance des sites phosphorylés sur les propriétés de liaison du chaperon, permet de mieux comprendre le rôle joué par différent forme d’ASF1 dans l’assemblage des histones sur l’ADN et le maintien des informations épigénétiques. Le travail de thèse contient d’analyses biochimiques et structurales par une combinaison de techniques (SEC-MALS, AUC, ITC, RMN, cristallographie des rayons X) et d’analyses fonctionnelles sur des modèles cellulaires
In eukaryotes, chromatin carries both, the genetic and epigenetic information. Mechanisms implicated in maintenance of these information during cell division or DNA repair remain poorly understood and they constitute the main issue of this thesis project. More specifically, the goal of the project is to understand how histone chaperones coordinate their action with partners associated with the replication fork to recognize and preserve the epigenetic marks carried by parental histones and to copy on the newly synthesized histones. The work unravels how ASF1 (Anti-Silencing Function 1) cooperates with the CAF-1 complex (Chromatin Assembly Factor 1) and with the replicative helicase subunit MCM2 (Mini Chromosome Maintenance 2), for the management of H3-H4 histones in DNA replication and repair.Moreover, this thesis investigates the regulation of histone chaperones activities by kinases activated after a replicative stress or DNA damage. In particular, we analyzed the consequences of ASF1 phosphorylation by the enzyme called TLK (Tousled like kinase). The activity of TLK is modulated during the cell cycle and after DNA damage. Characterization of the importance of phosphorylated sites on the chaperone binding properties, allows a better understanding of the role played by different forms of ASF1 in the assembly of histones on DNA and maintenance of epigenetic information. The thesis work included biochemical and structural analysis with a combination of different techniques (SEC-MALS, AUC, ITC, NMR, X-ray crystallography) and functional analysis in cellular models

Afin d’étudier la prise en charge des histones H3 jusqu’à l’ADN et pour comprendre l’influence de leur dynamique dans l’organisation d’ordre supérieur de la chromatine, une analyse des chaperonnes d’histones a été menée. Nous avons identifié et caractérisé les sous-unités du complexe HIR, impliqué dans l’assemblage de la chromatine réplication-indépendante chez Arabidopsis. La perte d’AtHIRA, la sous-unité centrale du complexe, affecte le niveau d’histone soluble, l’occupation nucléosomale des régions euchromatiniennes et héterochromatiniennes ainsi que la mise sous silence transcriptionnel des séquences d’ADN répétées. Alors que le complexe HIR ne participe pas à l’organisation d’ordre supérieur de la chromatine, j’ai montré que CAF-1, impliqué dans l’assemblage de la chromatine au cours de la réplication, joue un rôle central dans la formation des chromocentres. Lors du développement post-germinatif des cotylédons, les séquences d’ADN répétées centromériques et péricentromériques se concentrent dans les chromocentres et s’enrichissent en histone H3.1 de manière CAF-1 dépendante. Cet enrichissement, associé à des modifications post-traductionnelles d’histones associées à un état répressif de la transcription, participe à la formation des chromocentres et met en évidence l’importance de l’assemblage de la chromatine par CAF-1 dans la structure et le maintien du génome. Alors que la perte individuelle de HIR ou de CAF-1 n’affecte pas la viabilité, l’absence des deux complexes altère fortement l’occupation nucléosomale et le développement des plantes. Ceci suggère que la compensation fonctionnelle entre ces complexes de chaperonnes ainsi que la plasticité des voies de dépôt des histones restent limitées
To understand how histones H3 are handled and how histone dynamics impact higher-order chromatin organization such as chromocenter formation in Arabidopsis, a comprehensive analysis of the different histone chaperone complexes is required. We identified and characterized the different subunits of the Arabidopsis HIR complex. AtHIRA is the central subunit and its loss affects non-nucleosomal histone levels, reduces nucleosomal occupancy not only at euchromatic but also at heterochromatic targets and alleviates transcriptional gene silencing. While the HIR complex-mediated histone deposition is dispensable for higher-order organization of Arabidopsis heterochromatin, I show that CAF-1 plays a central role in chromocenter formation. During postgermination development in cotyledons when centromeric and pericentromeric repeats cluster progressively into chromocenter structures, these repetitive elements but not euchromatic loci become enriched in H3.1 in a CAF-1- dependent manner. This enrichment, together with the appropriate setting of repressive histone post-translational marks, contributes to chromocenter formation, identifying chromatin assembly by CAF-1 as driving force in formation and maintenance of genome structure. Finally, while absence of HIR or CAF-1 complexes sustains viability, only the simultaneous loss of both severely impairs nucleosomal occupancy and plant development, suggesting a limited functional compensation between the different histone chaperone complexes and plasticity in histone variant interaction and deposition in plants

Le rôle fonctionnel des transcrits de l’hétérochromatine péricentromérique reste à ce jour largement incompris chez les eucaryotes supérieurs. Néanmoins, il a été montré que ces transcrits sont soumis à un contrôle très précis, fonction du cycle cellulaire. La régulation de la transcription est fortement contrôlée par la structure de la chromatine qui peut être modifiée localement en changeant la composition biochimique du nucléosome, notamment par l’utilisation des variantes d’histones. L’objectif de ma thèse a été de mieux comprendre le rôle de la protéine chaperonne d’histone DAXX et de sa variante d’histone H3.3 dans la régulation de la transcription des séquences répétées péricentromériques. Par la méthode de purification TAP-TAG, les partenaires spécifiques de DAXX ont été identifiés à partir d’extraits solubles nucléaires de fibroblastes embryonnaires murins. Ces analyses ont mis en évidence que CAF-1, classiquement associé à H3.1, et les facteurs de remodelage de la chromatine ATRX et CHD4 interagissent spécifiquement avec DAXX. Le rôle de ces protéines dans le contrôle de la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique a ensuite été mis en évidence par une approche combinant l’interférence ARN et la Q-PCR. Enfin, les résultats suggèrent fortement que ces mécanismes de régulation ont lieu au niveau des corps nucléaires PML. L’ensemble de ces données montre qu’il existe une régulation spatio-temporel très fine de la structure de la chromatine régulant la transcription de l’hétérochromatine péricentromérique
The functional role of pericentromeric heterochromatin transcripts remains largely unknown in higher eukaryotes. Nevertheless, it has been shown that these transcripts are subject to very precise control, depending on the cell cycle. Regulation of transcription is tightly controlled by chromatin structure that can be modified locally by changing the biochemical composition of the nucleosome, including the use of histone variants. The aim of my thesis was to better understand the role of the histone chaperone protein DAXX and its histone variant H3.3 in the regulation of transcription of pericentromeric repeats. By the method of TAP-TAG purification, DAXX specific partners were identified from soluble nuclear extracts of murine embryonic fibroblasts. These analyzes revealed that CAF-1, classically associated with H3.1, and the chromatin remodeling factors, ATRX and CHD4, specifically interact with DAXX. The role of these proteins in the control of transcription of pericentromeric heterochromatin was then highlighted by an approach combining RNAi and Q-PCR. Finally, the results strongly suggest that these regulatory mechanisms take place at PML nuclear bodies. Taken together, these data show that there is a spatio-temporal regulation of the fine structure of chromatin regulates transcription of pericentromeric heterochromatin

Le virus de l'hépatite B (HBV) infecte de manière chronique 240 millions de personnes dans le monde, et est la principale cause de carcinome hépatocellulaire. Actuellement, les traitements standards permettent une suppression virale à long terme, mais ne sont pas capables d'éliminer complètement le virus, en raison de la persistance de l'ADN circulaire et clos de façon covalente (ADNccc). Ce minichromosome viral réside dans le noyau des hépatocytes infectés, grâce à sa structure chromatinienne. En effet, lors de l'infection d'un hépatocyte, l'ADN viral partiellement double brin (ADN relâché circulaire (rc)) est libéré dans le noyau, où il est réparé et enveloppé par des protéines histones, afin de former une structure d'épisome chromatinisé. Les mécanismes conduisant à la formation ainsi qu'à la chromatinisation de l'ADNccc sont encore largement inconnus, et leur élucidation constituerait une première étape vers l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques, susceptibles d'altérer la persistance de l'ADNccc. Dans ce but, nous avons étudié le rôle des facteurs hôtes de réparation de l'ADN, et des voies d'assemblage des nucléosomes, dans la formation de l'ADNccc, à des stades précoces (entre 30 minutes et 72 heures) de l'infection, dans des lignées cellulaires d'HepG2-NTCP, ainsi que dans des hépatocytes primaires humains. Nous nous sommes particulièrement concentrés sur la protéine chaperone d'histones, HIRA, qui est connue pour déposer le variant d'histone 3.3 (H3.3) sur l'ADN cellulaire d'une manière indépendante de la réplication et en association avec le remaniement des nucléosomes pendant la transcription et la réparation de l'ADN. Nous avons été capables de détecter l'ADNccc dans la fraction nucléaire des hépatocytes dès 30 minutes et 24 heures post-infection, par qPCR et Southern Blotting (SB), respectivement. L'extinction de HIRA par ARN interférent (siARN) avant l'inoculation du virus, a conduit à une forte diminution de l'accumulation de l'ADNccc (à la fois par qPCR et Southern Blot), qui était indépendante de la protéine HBx (en utilisant un virus HBx-défectueux). Les niveaux d'ADNrc sont restés stables, indiquant soit une éventuelle transition de l'ADNrc en ADNccc incomplète, ou retardée. L'analyse par immunoprécipitation de la chromatine a montré que HIRA était liée à l'ADNccc dès 30 minutes après infection, et que son recrutement était concomitant avec le dépôt de l'histone H3.3, ainsi que la liaison de la protéine de capside du HBV (HBc). Après 24 heures d'infection, une augmentation de la liaison de H3.3 et de l'ARN polymérase II sur l'ADNccc a été observée, en corrélation avec l'initiation de la transcription de l'ARN viral de 3.5 kb. Par des expériences de co-immunoprécipitation et de test de proximité entre protéines (PLA), nous avons montré que HIRA était capable d'interagir avec HBc dans des hépatocytes infectés et dans une lignée cellulaire HepaRG exprimant HBc de manière inductible. En conclusion, nos résultats suggèrent que la chromatinisation de l'ADN viral entrant est un événement très précoce, nécessitant l'histone chaperone HIRA. Bien que HBx ne soit pas requis pour ce processus, HBc pourrait jouer un rôle majeur, suggérant que l'interaction entre HIRA et HBc pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique à étudier
Hepatitis B virus (HBV) chronically infects 240 million people worldwide and is the major cause of hepatocellular carcinoma (HCC). Currently standard-of-care treatments can achieve longterm viral suppression, but are not able to completely eliminate the virus, due to the persistence of the covalently closed circular DNA (cccDNA). cccDNA, the viral minichromosome, resides in the nucleus of infected hepatocytes by virtue of its chromatin structure. Indeed, upon entry into hepatocytes, the partially double stranded viral DNA (relaxed circular (rc)DNA) is released into the nucleus, where it is repaired and wrapped by histones to form an episomal chromatinized structure. The mechanisms leading to cccDNA formation and chromatinization are still largely unknown and their elucidation would be a first step toward the identification of new therapeutic targets to impair cccDNA persistence. To this aim, we investigated the role of host factors belonging to DNA repair and nucleosome assembly pathways in cccDNA formation at early time points (i.e. between 30 minutes and 72 hours) post-infection in both HepG2-NTCP cell line and Primary Human Hepatocytes (PHH). We particularly focused on the histone chaperone Hira, which is known to deposit histone variant 3.3 (H3.3) onto cellular DNA in a replication-independent manner and in association to nucleosome reshuffling during transcription and DNA repair. We were able to detect cccDNA in the nuclear fraction of hepatocytes as early as 30 minutes and 24h post-infection, by qPCR and Southern Blotting (SB), respectively. Knock-down of Hira by RNA interference before virus inoculation led to a strong decrease in cccDNA accumulation (both in qPCR and SB) which was independent from HBx protein expression (using an HBx defective virus). rcDNA levels remained stable, indicating either a possible incomplete or delayed rcDNA to cccDNA transition. Chromatin Immunoprecipitation analysis showed that Hira was bound to cccDNA already at 2 hours post-infection and that its recruitment was concomitant with the deposition of histone H3.3 and the binding of HBV capsid protein (HBc). After 24 hours of infection, an increase of H3.3 and Pol2 binding on cccDNA was observed, correlating with the initiation of the transcription of the 3.5 kb RNA. By Co-Immunoprecipitation and Proximity Ligation Assay experiments, we showed that Hira was able to interact with HBc in infected hepatocytes and in a HepaRG cell line expressing HBc in an inducible manner. Altogether, our results suggest that chromatinization of incoming viral DNA is a very early event, requiring the histone chaperone Hira. While HBx is not required for this process, HBc could play a major role, suggesting that the interaction between Hira and HBc could represent a new therapeutic target to be investigated

La protéine Bcd1 est un facteur nucléaire essentiel à la viabilité cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae. Il est décrit comme requis pour assurer la stabilité des snoRNA à boîtes C/D. Ces petits ARN non codants s’assemblent à un jeu de 4 protéines invariables pour former les snoRNP à boîtes C/D qui sont des acteurs cruciaux de la biogenèse des ribosomes. En effet, quelques-unes de ces particules participent aux mécanismes assurant la maturation du précurseur des ARN ribosomiques et la grande majorité des autres particules sont des catalyseurs de la modification par 2’-O-méthylation des riboses. Bcd1p n’est pas présente au sein des particules matures, mais fait partie de ses facteurs d’assemblage, au même titre que les sous-complexes Rsa1p:Hit1p et R2TP (Rvb1p:Rvb2p:Tah1p:Pih1p). Notre analyse de différents fragments de Bcd1p a dans un premier temps montré que sa région N-terminale (résidus 1 à 96) suffit à lui conférer son caractère essentiel. Cette région comprend un domaine à double doigt à zinc de la famille zf-HIT, également présent chez un autre facteur d’assemblage des snoRNP à boîtes C/D, la protéine Hit1. Nous avons résolu la structure 3D en solution de ces doigts à zinc et montré que ce sont des modules d’interaction avec les protéines Rvb1/2. Dans un second temps nous avons identifié la région C-terminale (résidus 120 à 303) de la protéine Bcd1 comme étant suffisante pour interagir avec la chaperonne d’histone Rtt106p. La structure 3D en solution de ce domaine a été déterminée par RMN. Différentes approches de cinétique d’échange hydrogène/deutérium et d’expériences de cross-link suivies par des analyses par spectrométrie de masse, des expériences de titrage par RMN et de SAXS nous ont permis d’obtenir des informations sur les surfaces d’interaction de chacune de ces deux protéines. Un fragment, défini à partir des données de RMN de Bcd1p libre, nous a permis d'obtenir des cristaux du complexe Bcd1p:Rtt106p ouvrant la perspective de résoudre sa structure 3D par diffraction aux rayons X. De plus, des études fonctionnelles ont débuté visant à déterminer l’importance de la formation de ce complexe sur la biogenèse des snoRNP à boîtes C/D et l’impact de Bcd1p sur l’interaction entre Rtt106p et les nucléosomes
The protein Bcd1 is a nuclear factor essential for the cellular viability of the yeast Saccharomyces cerevisiae. It is described as required to ensure box C/D snoRNA stability. These small non-coding RNAs associate with an invariable set of 4 proteins to form the box C/D snoRNPs that are crucial players in ribosome biogenesis. Indeed, some of these particles participate in mechanisms for the maturation of the ribosomal RNA precursor (prerRNA) and the vast majority of the other particles are catalysts of 2’-O-methylation of riboses. Bcd1p is not present in mature particles, but is one of the assembly factors in addition to the Rsa1p:Hit1p and R2TP (Rvb1p:Rvb2p:Tah1p:Pih1p) sub-complexes. Our analysis of the different Bcd1p fragments has firstly shown that the essential function of Bcd1p relies on its N-terminal region (residues 1 to 96). It comprises a double zinc finger domain from the zf-HIT family, also present in another box C/D snoRNP assembly factor, the protein Hit1. We solved the 3D solution structure of these two zinc fingers and showed that these are modules for the interaction of Bcd1p with the Rvb1/2 proteins. Secondly, we identified the C-terminal region (residues 120 to 303) of Bcd1p as being sufficient to interact with the histone chaperone Rtt106p. The 3D solution structure of this domain of Bcd1p was determined by NMR. Different approaches of hydrogen/deuterium kinetic exchange and cross-link experiments followed by mass spectrometry analysis, NMR titration, and SAXS allowed us to obtain information about the interaction surfaces on each of the two proteins. A fragment defined from NMR data on the free Bcd1p allowed us to obtain crystals of the Bcd1p:Rtt106p complex, opening the perspective to solve its 3D structure by X-ray diffraction. Furthermore, functional studies started in order to determine the importance of this complex formation in box C/D snoRNP biogenesis and the impact of Bcd1p on the interaction of Rtt106p with nucleosomes