Gotowa bibliografia na temat „ARN interférant”

Des progrès récents dans l’utilisation préclinique et clinique des petits ARN interférents (siRNA) ont montré leur potentiel en tant qu’inhibiteur de la synthèse protéique dans de nombreuses pathologies comme le cancer. L’administration des siRNA rencontre un certain nombre de problèmes liés à leur dégradation rapide dans les milieux biologiques, ainsi qu’à leur difficulté à pénétrer au sein des cellules cibles en raison de leur hydrophilie et de leur charge négative. Une des clés de l’amélioration de l’efficacité thérapeutique de ces molécules repose sur l’emploi de vecteurs. Au cours de cette thèse, des lipoplexes capables de protéger les siRNA contre la dégradation et de favoriser leur transport jusqu’aux cellules cibles ont été développés et optimisés. Pour ce faire, des lipoplexes recouverts d’HA ont été formulés pour la vectorisation active de siRNA vers des cellules tumorales surexprimant le récepteur CD44. Dans la première partie de cette thèse, la formation des lipoplexes a été étudiée, ainsi que les paramètres influençant leur organisation supramoléculaire. L'insertion de l'HA dans la structure du liposome au moment de la formation des vésicules a entraîné une augmentation de la taille des liposomes en fonction de la concentration d’HA. Leur complexation avec les siRNA a encore augmenté la taille des particules obtenues. L’ajout des acides nucléiques lors de la formation des lipoplexes a provoqué un déplacement d'une partie du conjugué HA-DOPE de la structure des lipoplexes, comme montré par électrophorèse capillaire. La titration calorimétrique isotherme et les études de diffraction des rayons X ont démontré que, sous l’effet des interactions électrostatiques avec les siRNA, un réarrangement des bicouches lipidiques a lieu, conduisant à la formation de vésicules oligolamellaires, confirmé visuellement par cryo-microscopie. Enfin, le positionnement convenable de l’HA sur la surface des lipoplexes et sa capacité de se lier spécifiquement aux récepteurs de CD44 ont été démontrés par la technique de résonance plasmonique de surface. Dans la deuxième partie de cette thèse, la capture cellulaire et localisation intracellulaire des lipoplexes-HA ont été évalués par cytométrie en flux et microscopie de fluorescence, et ont montré que les lipoplexes modifies par l’HA sont internalisés plus rapidement que les lipoplexes non modifiés, et une fois dans des cellules, ils sont localisés principalement à l’intérieur des endosomes. La capacité des lipoplexes à transporter des molécules de siRNA intactes au cytoplasme a été confirmée par 81 % d'inhibition d'expression de luciferase in vitro sur la lignée cellulaire de cancer du poumon A549-luc. In vivo, le traitement avec les lipoplexes-HA transportant un siRNA anti-luciferase a mené à une diminution statistiquement significative de l’expression de luciferase, ce qui a été confirmé par la réduction de l'expression d’ARNm de la luciferase dans le poumon des animaux traités avec les lipoplexes-HA. L'analyse de la distribution des lipoplexes dans les poumons a montré que les lipoplexes modifiés par l’HA sont distribués de façon plus importante et plus homogène dans le tissu pulmonaire que les lipoplexes non modifiés. Dans la troisième partie de cette thèse, la diffusion des lipoplexes-HA de siRNA dans le mucus a été étudié, afin d’évaluer la faisabilité de l’administration pulmonaire de ces particules. Les études utilisant la technique de « multiple particle tracking (MPT) » ont montré que la présence d’HA combinée à l'ajout de siRNA ont permis l’obtention de deux formulations de lipoplexes présentant une pénétration efficace dans le mucus, les lipoplexes-HA and les lipoplexes-PEG/HA. En conclusion, un système efficace de lipoplexes utilisant siRNA pour l'inhibition de l'expression génique ciblant les récepteurs CD44 a été développé. Les résultats obtenus confirment que les HA-lipoplexes sont capables de libérer efficacement le siRNA dans le cytoplasme des cellules in vitro et in vivo
Recent progresses in the preclinical and clinical use of small interfering RNA (siRNA) have shown their potential as an inhibitor of protein synthesis in many diseases such as cancer. The administration of siRNA encounters a number of problems related to their rapid degradation in biological media, and their difficulty in penetrating targeted cells due to their hydrophilicity and negative charge. A key to improving the therapeutic efficacy of these molecules is based on the use of vectors. In this thesis, lipoplexes that can protect siRNA against degradation and facilitate their transport into target cells were developed and optimized. To do this, lipoplexes covered with HA were formulated for active vectorization of siRNA to tumor cells overexpressing the receptor CD44.In the first part of this thesis, the formation of lipoplexes was studied, and the parameters influencing their supramolecular organization. Insertion of HA within the liposome structure during vesicle formation resulted in the increase in liposome size as a function of HA concentration. Their complexation with siRNA has further increased the size of the particles obtained. The addition of siRNAs when forming lipoplexes caused a displacement of a portion of the HA-DOPE conjugate from the lipoplexes structure, as shown by capillary electrophoresis. The isothermal titration calorimetry and X-ray diffraction studies showed that a rearrangement of the lipid bilayers occur under the effect of electrostatic interactions with siRNAs, leading to the formation of oligolamellar vesicles, which was visually confirmed by cryo-microscopy. Finally, the proper positioning of the HA on the surface of the lipoplexes and its ability to specifically bind to the CD44 receptors has been demonstrated by the surface plasmon resonance technique.In the second part of this thesis, cellular uptake and intracellular localization of HA-lipoplexes were assessed by flow cytometry and fluorescence microscopy, and showed that lipoplexes modified by HA are internalized more rapidly than unmodified lipoplexes, and once in the cells, they are mainly localized within the endosomes. The ability of lipoplexes to transport intact siRNA molecules to the cytoplasm was confirmed by 81% of luciferase in vitro expression inhibition on the lung cancer cell line A549-luc. In vivo, treatment with HA-lipoplexes carrying anti-luciferase siRNA led to a statistically significant decrease in expression of luciferase, which was confirmed by reducing the mRNA expression of luciferase in lungs of animals treated with HA-lipoplexes. The analysis of the distribution of lipoplexes in the lungs showed that lipoplexes modified with HA are distributed more evenly in the lung tissue than unmodified lipoplexes.In the third part of this thesis, the movement of siRNA HA-lipoplexes in the mucus was studied to assess the feasibility of administering these particles directly to the lungs. Studies using the technique of "multiple particle tracking (MPT)" showed that the presence of HA combined with the addition of siRNA allowed the preparation of two lipoplexes formulations with efficient mucus-penetration, HA-lipoplexes and PEG/HA-lipoplexes.In conclusion, an efficient siRNA lipoplex system for inhibiting gene expression targeted TO the CD44 receptorS has been developed. The results confirm that the HA-lipoplexes are able to effectively release in vitro and in vivo the siRNA molecules in the cytoplasm of cells

Seuls 2 % du génome humain est codant ; le reste est majoritairement constitué de séquences répétées parmi lesquelles se trouvent les éléments transposables (ÉTs). Présent dans le génome de tous les organismes séquencés - et représentant près de 45 % de l'ADN humain -, les ÉTs sont des séquences nucléotidiques capables de se mouvoir dans le génome ; ce phénomène de transposition en fait de forts agents mutagènes internes, raison pour laquelle les organismes ont mis au point différents stratégies afin de réguler leur mobilisation.La voie des piARNs est un mécanisme conservé dans le tissu reproducteur des métazoaires afin de réguler l'expression des ÉTs. Les clusters de piARNs sont des loci dédiés à la production des piARNs, acteurs clefs de la voie pour protéger le génome de la lignée germinale contre l'invasion de ces ÉTs, potentielles sources de mutations et de pathologues transmissibles.Chez la drosophile, la voie des piARNs est aussi présente dans les cellules somatiques bordant les cellules germinales et supportant leur développement. Malgré des progrès significatifs dans la compréhension du rôle des petits ARN dans la formation de l'hétérochromatine et la répression des ÉTs, les mécanismes par lesquels ces processus sont mises en place au cours du développement et maintenus à travers les divisions cellulaires, en particulier dans les cellules somatiques, restent sous-explorés. Notre étude a pu démontrer que, contrairement aux clusters de piARNs germinaux, dont l'identité est acquise par un dépôt maternel de petits ARNs aux premiers stades embryonnaires, l'expression du cluster somatique majoritaire, flamenco, a lieu plus tardivement, dès lors que les cellules somatiques de la gonade embryonnaire rencontrent la lignée germinale et se différencient. L'accumulation des transcrits de flamenco est non seulement nécessaire pour la mise en place de la voie des piARNs somatique, mais aussi pour son maintien tout au long de la vie de la drosophile ; la moindre perturbation de flamenco conduit en effet à une dérépression des ÉTs corrélée à une stérilité des femelles. L'étude a également été réalisée chez le mâle avec la mise en évidence d'un rôle moins drastique de flamenco dans la répression des ÉTs au sein du testicule
Only 2% of the human genome is coding; most of the rest is made up of repeated sequences, including transposable elements (TEs). Present in the genome of all sequenced organisms - and representing almost 45% of human DNA - TEs are nucleotide sequences capable of moving around the genome. This transposition phenomenon makes them strong internal mutagens, which is why organisms have developed different strategies to regulate their mobilisation.The piRNA pathway is a conserved mechanism in the reproductive tissue of metazoans for regulating the expression of TEs. PiRNA clusters are loci dedicated to the production of piRNAs, key players in the pathway to protect the germline genome from invasion by these TEs, potential sources of mutations and transmissible pathologies.In Drosophila, the piRNA pathway is also present in somatic cells bordering germ cells and supporting their development. Despite significant progress in understanding the role of small RNAs in heterochromatin formation and repression of TEs, the mechanisms by which these processes are set up during development and maintained through cell divisions, particularly in somatic cells, remain underexplored. Our study has shown that, unlike the germline piRNA clusters, whose identity is acquired by maternal deposition of small RNAs in the early embryonic stages, expression of the majority somatic cluster, flamenco, occurs later, when the somatic cells of the embryonic gonad meet the germline and differentiate. The accumulation of flamenco transcripts is not only necessary for the establishment of the somatic piRNA pathway, but also for its maintenance throughout the life of Drosophila; the slightest disruption of flamenco leads to a derepression of TEs correlated with female sterility. The study was also carried out in males, showing that flamenco plays a less drastic role in the repression of TEs in the testis

La répression par les petits ARN non-codant (ARNnc) est un mécanisme répandu de régulation génétique. Chez l’homme, ses dérégulations sont liées à des phénotypes et des pathologies sévères. Parmi ses voies les mieux caractérisées sont les voies des siRNA (petits ARN interférent), miRNA (microARN) et piRNA (ARN interagissant avec piwi).Ce manuscrit de thèse décrit les fonctions moléculaires de deux 2'-O-ARN-méthylases de Drosophila melanogaster conservées de la levure (Trm7) à l'homme (FTSJ1). Des mutations dans Trm7 sont liées à un défaut de croissance sévère et dans FTSJ1 à une déficience intellectuelle non syndromique liée au chromosome X. Les mouches mutantes ont une réduction de la taille des ovaires, une résistance réduite à l'infection virale par le DCV et des niveaux d'expression différentiels des éléments transposables. CG7009 est impliqué à la fois dans les voies des miRNA Ago-2-dépendante et siRNA dans la lignée cellulaire de Drosophile S2 et dans les mouches adultes. CG5220, un paralogue de CG7009, est impliqué dans la voie des miRNA Ago-2-dépendante chez les mouches, de manière similaire au CG7009. De plus, CG7009 et CG5220 ont un rôle dans la voie somatique des piRNA.L'absence de 2'-O méthylation (Nm) sur l’ARNt Phe chez les mutants CG7009 est associée à une accumulation de fragments d'ARNt (tRF). Les tRF sont des ARN stables issus du clivage des ARNt matures. Ils sont détectés dans une multitude d’organismes et ont des diverses fonctions. Des recherches récentes indiquent que les tRF sont une nouvelle classe d'ARNnc. Nos résultats établissent un lien entre la perte de Nm, l'accumulation de tRF et la régulation des voies des petits ARNnc « classiques »
Small non-coding RNA-mediated silencing is a widespread mechanism of genetic repression. Its deregulations have been linked to severe phenotypes and pathologies. The best-characterized small RNA silencing pathways are the small interfering RNA (siRNA), the microRNA (miRNA) and the piwi-interacting RNA (piRNA) pathways.In this PhD manuscript are characterized the molecular functions of CG7009 and CG5220: two 2’-O tRNA methyltransferases of Drosophila melanogaster which are conserved from yeast (Trm7) to human (FTSJ1). Mutations in their yeast ortholog Trm7 are linked to a severe growth defect phenotype and in their human ortholog, FTSJ1, to non-syndromic X-linked intellectual disability (NSXLID). Mutant flies have an ovarian size reduction phenotype, decreased resistance to DCV viral infection, and differential transposable element expression levels in somatic and germinal tissues. CG7009 is involved in both the miRNA Ago-2-dependent and in the siRNA pathways in the Drosophila melanogaster S2 cell line and in developing flies. CG5220, a paralog of CG7009, is involved in the miRNA Ago-2-dependent pathway in flies, similarly to CG7009. Furthermore, CG7009 and CG5220 have a role in the somatic piRNA pathway. Lack of 2’-O methylation (Nm) on tRNAPhe in CG7009 mutants triggers differential tRNA fragmentation profiles and tRNA fragments (tRFs) accumulation. tRFs are stable RNAs derived from the cleavage of mature tRNAs, that have been detected in bacteria, plants, yeast, flies and humans and linked to various functions. Recent research point to tRFs as a novel class of sncRNAs. Our results link the loss of Nm with tRFs accumulation and the regulation of the sncRNA pathways

Les copolymères à blocs amphiphiles comptent aujourd'hui parmi les vecteurs les plus efficaces pour le transfert de gène in vivo dans de nombreux tissus tels que le muscle squelettique, le cœur ou les poumons. Le mécanisme d'action de ces vecteurs demeure peu connu, et l'étude de ce mécanisme représente un enjeu majeur pour leur futur développement clinique. Au cours de cette thèse, nous nous sommes plus particulièrement intéressés au Lutrol®, polymère efficace in vivo et déjà admis par les pharmacopées internationales. L'incapacité de ces molécules à transfecter des cellules en culture suggère que l'environnement cellulaire détermine leur mécanisme d'action. Afin d'étudier le mécanisme de ces vecteurs au niveau cellulaire, nous avons conçu un modèle permettant d'observer le mécanisme du Lutrol® sur les différentes étapes du trajet des acides nucléiques, depuis l'internalisation du transgène jusqu'à son expression. En utilisant plusieurs stratégies in vitro faisant intervenir le Lutrol® en association directe ou indirecte avec les vecteurs cationiques, nous avons déterminé son niveau d'implication dans la transfection, son rôle au niveau de la cellule et des acides nucléiques, mais également les raisons de son inaptitude à transfecter des cellules en culture en identifiant les barrières limitant son utilisation in vitro. Les résultats obtenus suggèrent fortement que le Lutrol® améliore l'efficacité de transfection par un mécanisme physico-chimique inerte et passif, aboutissant in vivo à une internalisation cellulaire du plasmide par un mécanisme de délivrance directe dans le cytoplasme, indépendant de l'endocytose, et donc en rupture avec celui des lipides cationiques
Amphiphilic block copolymers have been developed recently for their efficient in vivo transfection activities in various tissues including skeletal muscle, heart and lung. However their mechanism of action remains unknown and better understanding of this mechanism represents a major goal for the future development of this new class of vectors. In this study, we particularly focused on Lutrol®, an FDA approved polymer, because of its high in vivo efficiency and remarkably low toxicity. As block copolymers does not allow the transfection of cultured cells in vitro, we suggested that the cell environment was strongly involved in their mechanism of action. In order to evaluate the mechanism of these polymers at the cellular level, we designed a model allowing us to observe the impact of Lutrol® on the different steps involved in the nucleic acids trafficking, from the transgene internalisation to its expression. Using several in vitro transfection strategies involving direct or indirect assemblies of Lutrol® / nucleic acids / cationic vectors, we attempted to elucidate which steps were influenced by lutrol, its role on nucleic acids and cells, but also the reasons of its in vitro transfection inability. Results presented in this report strongly suggest that Lutrol® improves transfection efficiency by a passive and inert physico-chemical mechanism, leading to the enhancement of cellular uptake through a direct delivery mechanism into the cell cytoplasm, and not via an endosomal pathway, strongly contrasting with cationic lipids internalisation pathway

Les arénavirus Mopeia (MOPV) et Lassa (LASV) bloquent l'induction de la réponse interféron (IFN) de type I grâce à leur nucléoprotéine (NP) qui dégrade spécifiquement TARN double brin (ARNdb) via leur domaine exonucléasique (ExoN). Cependant, l'identité des ARNdb produits par les arénavirus et des senseurs intracellulaires capables d'induire la réponse IFN reste inconnue. J'ai émis l'hypothèse que des virus recombinants MOPV-ExoN et LASV-ExoN mutés dans leur domaine ExoN produiraient des ARNdb et que la reconnaissance de ces ARNdb par les senseurs intracellulaires pourraient activer la réponse antivirale, permettant ainsi d'identifier les ARNdb et les senseurs impliqués. J'ai pu démontré que les virus ExoN sont en effet atténués par rapport aux virus sauvages, induisant une forte réponse IFN de type I. J'ai aussi démontré que RIG-I et MAVS étaient responsables de l'induction de la réponse antivirale. En purifiant RIG-I dans les cellules infectées par les virus MOPV et LASV, j'ai pu isoler les ARN fixés à RIG-I lors de l'infection. J'ai mis en évidence une plus forte immunogénicité des ARN de MOPV liés à RIG-I que ceux de LASV et j'ai pu identifier par séquençage à haut débit les séquences virales responsables de l'activation de la réponse IFN. J'en ai confirmé l'immunogénicité par transfection d'ARN synthétiques. J'ai ensuite émis l'hypothèse que l'IFN induirait l'expression de protéines antivirales ciblant l'ARN viral qui pourraient participer au contrôle de la réplication virale. J'ai donc étudié le rôle de plusieurs protéines antivirales dans le contrôle de l'infection virale. J'ai pu mettre en évidence un rôle antiviral de deux de ces protéines sur la réplication des arénavirus. Ainsi, mon projet de thèse a permis d'améliorer les connaissances de la biologie des arénavirus et d'éclairer des différences notables entre les virus MOPV et LASV qui pourraient en partie expliquer leur différence de pathogénicité
The genus Mammarenavirus is comprised of several highly pathogenic viruses of global health concern. Lassa virus (LASV) in particular is responsible for thousands of cases annually in Western Africa. Ail Mammarenavirus possess an exoribonuclease (ExoN) domain in their nucleoproteins (NP). This domain dégradés double-stranded RNA (dsRNA) with high affinity and therefore has been proposed to prevent the récognition of viral dsRNA produced during the viral réplication, therefore preventing the activation of the interferon (IFN) response. While the importance of this ExoN activity in arénavirus virulence is well established, nothing is known about the dsRNA molécules that are targeted by NP for dégradation and the dsRNA sensors activated by these dsRNA molécules are yet to be described. In addition, important différences may exist in the control of the IFN response by pathogenic arenaviruses such as LASV or closely related but non-pathogenic viruses such as Mopeia virus (MOPV). I addressed these questions using reverse genetics Systems developed in our laboratory. We generated recombinant LASV and MOPV with abrogated ExoN domains that are no longer able to control the IFN response. I hypothesized that these LASVExoN and MOPVExoN viruses would no longer be capable of degrading dsRNA produced during viral réplication and therefore would be recognized by the host innate immune response. I présent here novel data in A549 cells using these MOPVExoN and LASVExoN mutants, demonstrating that the MAVS signaling pathway and particularly RIG-I is responsible for LASV and MOPV sensing, viral atténuation and IFN production. I was also able to purify RNA bound to RIG-I during the réplication of these viruses, which I showed were immunostimulatory even outside of an infectious context via transfection of synthetic RNA. I also demonstrated that blocking expression of antiviral proteins allowed these ExoN viruses to replicate in A549 cells and I identified two key antiviral proteins in our infection model in A549 cells. I présent these results in the hope that it will enrich our understanding of Mammarenavirus biology, and to bring to light notable différences that we can use to explain the différence in Mammarenavirus pathogenicity and immunogenicity

L'explosion des technologies basées sur l'ARN a relancé la recherche de méthodes plus efficaces pour sa synthèse chimique. De plus, l'utilisation des ARN en tant que médicament est fortement limitée par des problèmes de distribution et de stabilité dans l'organisme. Ces travaux se sont donc inscrits dans ces deux enjeux majeurs : améliorer la synthèse d'ARN naturels pour faire face à la forte demande de telles molécules et développer des ARN modifiés afin d'augmenter leur efficacité in vivo. Ce manuscrit rapporte une nouvelle méthode de synthèse chimique d'ARN basée sur l'utilisation de groupements acétalester pour la protection des hydroxyles en position 2' du ribose. Cette méthode a permis de simplifier l'accès à des séquences hétéropolymères d'ARN et est actuellement évaluée pour une application commerciale. Une deuxième partie présente la synthèse d'ARN modifiés portant, après élongation et déprotection, des groupements acétalester enzymolabiles en positions 2' du ribose. Les conditions d'obtention de ces ARN, désignés par pro-ARN en vue d'une application comme prodrogues de siARN dans le mécanisme de l'ARN interférence, ainsi que leurs propriétés sont décrites
Expansion of RNA based technology has revived research for more powerful methodology for chemical RNA synthesis. Moreover, use of unmodified RNA as drug is restricted by poor cell permeation and low enzymatic stability in vivo. This work was related to these two challenges : find a new efficient strategy for chemical RNA synthesis and develop modified RNA in order to improve in vivo efficiency. Here, an original methodology for chemical RNA synthesis based on the protection of ribonucleosides 2'-hydroxyl by acetalester groups is presented. Thus, natural RNA heterosequences could be obtained with high purity and efficacy. This technology is currently under evaluation for commercial application. In a second part, we describe the synthesis of modified RNA bearing biolabile acetalester groups on nucleoside 2'-hydroxyl after full deprotection of other RNA functions. Synthesis and properties of this modified RNA, named pro-RNA in relation to their potential activity as siRNA prodrugs in RNA interference mechanism, are reported

La chimiokine monocyte-chemoattractant protein-1 (MCP-1 ou CCL2) est un neuromodulateur de l'influx nociceptif au sein du système nerveux. Son activité biologique est attribuée à l'activation du récepteur couplé aux protéines G, CCR2. Le couple CCL2/CCR2 joue un rôle important dans la genèse et le maintien de la transmission nociceptive en contidition de douleur chronique. L'ARN interférent est un outil de recherche grandement utilisé dans la découverte de nouvelle cible thérapeutique touchant les désordres du système nerveux. Son potentiel thérapeutique a aussi été investigué dans diverses études cliniques et demeure controversé. Les Dicer-substrate siRNA (DsiRNA) sont des molécules synthétiques d'ARNi qui ont été développées afin d'améliorer les paramètres pharmacologiques des siRNA. Ils ont une meilleure efficacité in vitro et in vivo à faible dose ce qui limite les effets indésirables. Ces performances s'expliquent par la longueur des DsiRNA; un duplex linéaire asymétrique de 27 nucléotides de long plutôt que de 21 mers pour les siRNA classiques. Ce mémoire présente les résultats de recherche du développement des DsiRNA sélectifs pour la cible de l'ARN messager du récepteur rCCR2 et de leur application dans la prévention de la douleur aiguë. Pour cette étude, dix DsiRNA ayant des séquences différentes ont été synthétisées puis validées in vitro. Basés sur leur performance à taire l'expression du récepteur CCR2, deux duplex ont été retenus (933 & 1049). Leur propriété a été optimisée par l'ajout de deux motifs de méthylation (2'OMe) distincts nommés M7 et Evader le long de leur séquence. Les DsiRNA anti-CCR2 ont ensuite été testés in vivo dans un modèle de douleur aiguë induit par l'injection spinale de CCL2 exogène (1µg). Pour cette étude, deux injections de DsiRNA (5µg, i.t.) couplé à l'agent de transfection peptidique Transductin ont été administrées à 24h d'intervalle à des rats sains. Au troisième jour, le modèle allodynique aiguë a été induit. Les résultats du von fry dynamique ont montré que les DsiRNA anti-CCR2 testés ont prévenu 100 % de l'allodynie mécanique induit par le modèle. Aussi, les résultats de qPCR ont montré que 72 h suivant la première administration des DsiRNA, l'effet d'interférence de l'ARNm était toujours observable dans les structures des ganglions de la racine dorsale. Les niveaux d'expression de rCCR2 étaient 50 % plus bas chez les animaux traités au DsiRNA (933 et 1049) que chez les animaux en douleur aigu non traités. Les niveaux de CCL2 étaient également abaissés, suggérant ainsi que l'effet anti-allodynique des DsiRNA passe par le blocage de la boucle d'autorégulation du couple CCL2/CCR2 en condition douloureuse.

La maladie de Huntington (MH) est une maladie neurodégénérative autosomale dominante fatale causée par une expansion de triplets CAG dans le gène codant la huntingtine (htt). Actuellement, il n’existe aucun traitement curatif pour cette pathologie. Des études récentes montrent que la technique d’ARN interférence (ARNi) est prometteuse pour traiter des maladies autosomales dominantes dont la MH. Dans ce projet, nous avons développé les outils permettant d’étudier la faisabilité et l’efficacité de deux approches : l’inactivation non allèle-spécifique des 2 allèles de la htt ou une inactivation allèle-spécifique de la forme mutée, chez des modèles rongeurs de la MH. La stratégie non allèle-spécifique s’est montrée très efficace à long terme, même lorsque le traitement est initié après l’apparition des symptômes. La dégradation de la forme sauvage provoque des modifications transcriptomiques dans des voies de signalisation associées à des fonctions connues de la htt. Ces changements d’expression n’altèrent pas l’efficacité du traitement et ne sont pas associés à des effets délétères. Les effets à long terme d’une dégradation partielle de la htt sauvage restent cependant à déterminer. En parallèle, nous avons développé une approche ciblant la htt mutée tout en préservant l’expression de la forme sauvage, en tirant parti de la présence de SNP (polymorphisme nucléotidique simple) sur le gène de la htt. Cette approche a conduit à l’inactivation efficace et sélective de la htt mutée, prévenant ainsi l’apparition de la neuropathologie MH pour la majorité des SNP ciblés. L’ensemble de ces résultats confirme la faisabilité et l’efficacité de la stratégie ARNi pour traiter la MH.

L'ARN interférence est un mécanisme d'inhibition post-transcriptionnel, capable de réguler l'expression des gènes. Ce mécanisme endogène, activé par l'intermédiaire de microARN, peut être détourné après transfection de cours fragments d'ARN synthétiques, notamment les siARN. Cette technique autorise ainsi le ciblage spécifique de l'ensemble des gènes composant le génome, dont l'extinction transitoire permet d'étudier à la fois leurs fonctions, mais aussi de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques ou de nouveaux biomarqueurs. Ce très fort potentiel pour la recherche in vitro se retrouve également in vivo, où l'ARN interférence peut être directement utilisé comme agent thérapeutique pour des situations pathologiques telles que les cancers, les infections ou les maladies systémiques. Cependant, la délivrance intra-cytoplasmique des ARN interférents exogènes est nécessaire pour déclencher ce mécanisme de régulation. À l'heure actuelle, en dépit de nombreuses méthodes de transfection développées dans la littérature, cette étape de délivrance reste une limite importante selon les applications envisagées.En ce sens, ces travaux de thèse ont permis de développer un nouveau vecteur à base de nanoparticules lipidiques cationiques, les cLNP, dédié à la transfection cellulaire de siARN. Cette formulation de cLNP a été adaptée, à l'aide d'un plan d'expérience, d'une formulation neutre de LNP permettant l'encapsulation de molécules lipophiles pour des applications en imagerie de fluorescence et/ou de délivrance de médicaments liposolubles. Les caractérisations physico-chimiques des particules cLNP ont démontré une très forte stabilité colloïdale, à la fois pour dans les tampons aqueux et dans les milieux de culture cellulaire complémentés par du sérum. En outre, ces nano-vecteurs se sont avérés extrêmement efficaces pour établir et conserver des liaisons électrostatiques avec des siARN, permettant ainsi d'obtenir rapidement des complexes démontrant une stabilité élevée dans le temps. Les efficacités d'inhibition fonctionnelle de ces nanoparticules ont été testées avec succès sur 3 lignées cellulaires différentes (PC3, HeLa et U2OS). L'ensemble des résultats obtenus confirme le fort potentiel de ce nouveau nano-vecteur, en termes d'inhibition fonctionnelle et d'absence de cytotoxicité, et le positionne parmi les meilleurs agents de transfection commerciaux testés. Ces caractéristiques sont complétées par des capacités de multi-modalité, dont la possibilité d'encapsuler dans le cœur des particules des drogues ou des fluorophores lipophiles. Enfin, des tests préliminaires réalisés sur des cellules considérées comme difficile à transfecter (cellules primaires, cellules non-adhérentes, neurones), ou sur des structures cellulaires tridimensionnelles plus complexes, ouvrent de nouvelles perspectives extrêmement prometteuses
L'auteur n'a pas fourni de résumé en anglais