Rozprawy doktorskie na temat „Arcobacter”

The genus Arcobacter, belongs to the family Campylobacteraceae, along with. Some species, are considered emerging pathogens and have been associated with gastrointestinal diseases and bacteraemia in humans and with diarrhoea, mastitis and abortions in animals. Diarrhoea, is the most common clinical presentation in humans. However, still are not fully defined the routes of transmission, the virulence factors present in pathogenic strains have not been determined and the isolation and identification methods are still deficient. All of these factors contribute to a possible underestimation of the sanitary importance of this genus. In this thesis it has been demonstrated the existence of five new species of this genus. In their differentiation, new tools have been used, such as the Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI TOF) Multilocus Phylogenetic Analysis (MLPA) with concatenated 5 genes (rpoB, gyrB, hsp60, gyrA and atpA). Furthermore, the performance of 5 molecular identification methods was compared and none of them was useful for all the strains studied. In this regard, the updating of 16S rRNARFLP method for the identification of all species proved very useful. Moreover, in this thesis was a great diversity of species of this genus in samples of shellfish and sewage. Both matrices have epidemiological importance; however, they have been poorly studied. It was also demonstrated that the use in parallel of direct culturing and post enrichment, as well as the incubation under aerobic and microaerophilic, enhances the recovery and diversity of arcobacters. Regarding the virulence of Arcobacter spp., most of them proved to be potential enteropathogens for man, as they showed the presence of virulence factors and were able to adhere and invade human intestinal cells (Caco-2). Finally, it was demonstrated that Arcobacter may be confused with Campylobacter sp., generating an underestimation of their sanitary importance.
El género Arcobacter incluye especies consideradas patógenos emergentes, ya que se han asociado con patologías gastrointestinales y bacteriemia en humanos y con diarrea, mastitis y abortos en animales. Sin embargo, aún no se ha definido completamente las rutas de transmisión, los factores de virulencia presentes en cepas patogénicas no se han determinado y los métodos de aislamiento e identificación aún son deficientes. Todo esto genera una subestimación de la importancia sanitaria de Arcobacter. En esta tesis doctoral se demostró la existencia de 5 nuevas especies de este género. Para su diferenciación se utilizó herramientas nuevas, tales como el Matrix Assisted Laser desorption Ionization Time of Flight (MALDI TOF) y un Multilocus Phylogenetic Analysis (MLPA) con 5 genes concatenados (rpoB, gyrB, hsp60, atpA y gyrA). Considerando el número de especies incluidas actualmente en el género (n=17), se evaluó si 5 de los métodos moleculares de identificación son todavía útiles para la identificación de las especies para las que se habían definido o si se generan confusiones, demostrrando que todos ellos generan algún error que osciló entre el 16,8% y 67,4% de las cepas estudiadas. En este sentido, la ampliación del método 16S rRNA-RFLP para poder identificar todas las especies resultó ser de gran utilidad. Por otra parte, en esta tesis se observó una gran diversidad de especies de este género en muestras de mariscos y aguas residuales. Ambas matrices han sido poco estudiados a pesar de su importancia epidemiológica. Más aún, se demostró que el uso en paralelo del cultivo por siembra directa y post enriquecimiento, además de incubación en aerobiosis y microaerofilia, favorece la recuperación de una mayor diversidad. Por otra parte, también se demostró que la mayoría de las especies de este género, en especial algunas cepas A. butzleri, A. cryaerophilus, A. skirrowii, A. trophiarum y A. defluvii, son potenciales enteropatógenos para el hombre, ya que presentaron factores de virulencia y fueron capaces de adherir e invadir células intestinales humanas (Caco-2). Por último, se demostró que Arcobacter puede ser confundido con Campylobacter sp., lo que puede contribuir aún más a subestimar su importancia sanitaria.

This study is the first to analyse the genome of A. butzleri NCTC12481. By using one- and two-dimensional Pulsed Field Gel Electrophoresis in combination with Southern hybridisation the A. butzleri genome size was estimated (2.5 Mb) and a physical map was constructed, containing 35 restriction enzyme recognition sequences and 14 gene markers (5 copies of the genes for 16S rRNA and 23S rRNA’ 2 copies for glyA; one for rpoC and rpoB). In the attempt to identify virulence factors of A. butzleri, a homologue of pglF, a gene involved in N-linked protein glycosylation in C. jejuni, was found. Although the genes surrounding pglF in A. butzleri did not reveal a cluster order as in C. jejuni, the intriguing possibility for protein glycosylation in A. butzleri (perhaps involving different mechanisms) remains, since a glycosylated protein was detected by Alcian blue staining of an outer membrane protein extract. Three major proteins of the A. butzleri outer membrane extract were identified as PorA, FlaB and CadF which are known to play a role in pathogenicity in other bacteria. Electron microscopic analysis revealed a polysaccharide capsule on the surface of A. butzleri. In vitro studies of the interaction of A. butzleri with epithelial cultured cells (Caco-2) demonstrated the ability of A. butzleri to attach to and to invade Caco-2 cells. In order to develop a method for transposon mutagenesis of A. butzleri, a Himar1 transposon delivering vector carrying C. jejuni kanamycin resistance gene (aphA type III), was constructed. Attempts to introduce the vector into A. butzleri by electroporation, conjugation or heat shock transformation all failed. The obtained results provide an important foundation for further investigation of this organism and contribute towards broadening the knowledge of this potential foodborne pathogen.

El género Arcobacter incluye especies capaces de producir patología gastrointestinal en humanos y aborto, diarrea y mastitis en ganado. Sin embargo se desconoce su prevalencia en el agua y no existen métodos que permitan la identificación de sus 9 especies. En esta tesis hemos desarrollado un protocolo (16S rDNA-RFLP) capaz de diferenciar la mayoría de las especies. Además, demostramos que la presencia de Arcobacter en aguas se correlaciona con la contaminación fecal y que tiene una elevada prevalencia y diversidad genética en el río Llobregat. Sin embargo, estos microorganismos nunca fueron detectadas en al agua potable, lo que demuestra que el tratamiento de potabilización del agua del río es efectivo para su eliminación. Comprobamos que Arcobacter presentan una elevada prevalencia tanto en diferentes tipos de carnes como en mariscos. Finalmente, se han descubierto y descrito 4 especies nuevas para el género: Arcobacter mytili, Arcobacter valdiviensis, Arcobacter defluvii y Arcobacter molluscorum.
The genus Arcobacter includes species associated with human and animal diseases. However, its prevalence in water is unknown and so far do not exist methods able to differentiate the nine accepted species. In this thesis we have developed a molecular identification method (16S rDNA-RFLP) that enables the differentiation of most of species. In addition, we have demonstrated that the presence of Arcobacter in environmental waters correlates with high level of faecal pollution. Theses microorganisms showed a high prevalence in the Llobregat River and a high genetic diversity. However, these microorganisms were never detected from drinking water, which demonstrate that the treatment of the river water is effective for its elimination. Additionally, have been demonstrated the high prevalence of Arcobacter in several types of meat and shellfish. Finally, 4 new species have been discovered and described: Arcobacter mytili, Arcobacter valdiviensis, Arcobacter defluvii y Arcobacter molluscorum.

El gènere Arcobacter pertany a la família Campylobacteraceae i inclou espècies, considerades patògens emergents ja que son responsables de produir infeccions en humans i animals. Les bactèries d'aquest gènere tenen una àmplia distribució a nivell mundial i es creu que es transmeten pel consum d'aigües o aliments contaminats. Hi ha diverses eines per a l'estudi epidemiològic que ens ajudarien a aclarir aquestes rutes de contagi. No obstant això, els mecanismes d'acció d'aquests bacteris són encara poc coneguts i no hi ha un tractament estandarditzat. El nombre d'espècies del gènere ha augmentat considerablement en els últims anys i l'ús de noves tècniques d'aïllament ha permès trobar d'altres espècies noves. En la present tesi, es va demostrar que l'ús de la tècnica de Multilocus Sequence Typing (MLST) per a l'estudi epidemiològic és poc precisa. A més, es va evidenciar l'elevada resistència a determinats antibiòtics que suggereixen un canvi en l'ús de les teràpies fins ara utilitzades en les infeccions de Arcobacter. També es van descriure un total de 4 noves espècies utilitzant tècniques com l'anàlisi fenotípic i el Multilocus Phylogenetic Analysis (MLPA) mitjançant la concatenació de 5 gens (atpA, gyrA, gyrB, hsp60 i rpoB) i afegint a més la informació extreta dels genomes seqüenciats d'aquestes espècies i de les espècies filogenèticament properes. L'ús dels genomes i la seva comparació i anàlisi filogenètica va evidenciar també que l'espècie A. cryaerophilus està formada per 4 genomovars, les quals representen espècies genòmiques però que no es van poder diferenciar amb proves fenotípiques. Finalment, l'anàlisi filogenètic dels genomes de totes les espècies del gènere, juntament amb el càlcul de diferents índexs genòmics (ANI, isDDH, AAI, POCP i RSCU) va permetre descobrir que el gènere Arcobacter està en realitat format per almenys 7 gèneres, diferenciables genèticament i mitjançant combinació de proves fenotípiques.
El género Arcobacter pertenece a la familia Campylobacteraceae e incluye especies consideradas patógenos emergentes ya que producen infecciones en humanos y animales. Las bacterias de este género presentan una amplia distribución a nivel mundial y se cree que se transmiten por el consumo de aguas o alimentos contaminados. Existen diversas herramientas para el estudio epidemiológico que nos ayudarían a esclarecer estas rutas de contagio. Sin embargo, los mecanismos de acción de estas bacterias son todavía poco conocidos y no existe tratamiento estandarizado. El número de especies del género ha aumentado considerablemente en los últimos años y el uso de nuevas técnicas de aislamiento ha provocado el hallazgo de otras especies nuevas. En esta tesis, se ha demostrado que el uso de la técnica de Multilocus Sequence Typing (MLST) para el estudio epidemiológico es poco precisa. Además, se evidenció la elevada resistencia a determinados antibióticos que sugieren la necesidad de introducir un cambio en el uso de las terapias utilizadas hasta ahora en las infecciones ptoducidas por Arcobacter. También se describieron un total de 4 nuevas especies utilizando técnicas como el análisis fenotípico, el Multilocus Phylogenetic Analysis (MLPA) mediante la concatenación de 5 genes (atpA, gyrA, gyrB, hsp60 y rpoB) y la información extraída de los genomas secuenciados de dichas especies y de las especies filogenéticamente cercanas. El uso de los genomas, su comparación y el análisis filogenético evidenció además que la especie A. cryaerophilus está formada por 4 genomovares, que representan especies genómicas pero que no se pudieron diferenciar fenotípicamente. Finalmente, el análisis filogenético de los genomas de todas las especies del género, junto con el cálculo de diferentes índices genómicos (ANI, isDDH, AAI, POCP y RSCU) permitió descubrir que el género Arcobacter está en realidad formado por al menos 7 géneros, diferenciables genéticamente y mediante combinación de pruebas fenotípicas.
The genus Arcobacter belongs to the family Campylobacteraceae and includes species considered emergent pathogens because they can produce infections in humans and animals. The species of the genus are widely distributed worldwide and the consumption of contaminated food or water is considered the source of the infection. There are several tools for the epidemiological characterization of the strains that could help to clarify the routes of infection. However, the mechanisms of action of these bacteria are still poorly understood and there is no standardized treatment. The number of species of the genus has increased considerably in recent years and the use of new isolation techniques has led to the discovery of other new species. In this thesis, it was demonstrated that the epidemiological analysis using the Multilocus Sequence Typing (MLST) technique is not precise. In addition, the high resistance to certain antibiotics suggested the need for introducing changes in the treatments used in Arcobacter infections. A total of 4 new species were described using phenotypic characterization, Multilocus Phylogenetic Analysis (MLPA) of 5 genes (atpA, gyrA, gyrB, hsp60 and rpoB) and information extracted from the sequenced genomes of these species and the phylogenetically close ones. The use of genomes and their comparison and phylogenetic analysis also showed that the species A. cryaerophilus is composed by 4 genomovars, which represent genomic species that could not be phenotypically differentiated. Finally, the phylogenetic analysis of the genomes of all the species of the genus, together with the calculation of different genomic indexes (ANI, isDDH, AAI, POCP and RSCU) allowed us to discover that the genus Arcobacter is actually formed by at least 7 genera, differentiable genetically and with a combination of phenotypic tests.

Twenty species and six subspecies of the genera Arcobacter and Campylobacter have been described to date. All are Gram-negative, microaerophilic, curved, spiral or S-shaped cells, and are members of the order Campylobacterales, class Epsilonproteobacteria phylum Proteobacteria. Though most members are pathogenic, C. jejuni, C. coli and A. butzleri are the most frequently isolated species from patients suffering from gastrointestinal illness. The current methods for their detection, identification, and differentiation are cumbersome, time consuming and lack specificity. DNA based molecular techniques including real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) and Fingerprinting methods Terminal Restriction Fragments Length Polymorphism (T-RFLP) and Ligase Detection Reaction (LDR) have been used in this project to develop rapid detection and identification methods for Campylobacter and Arcobacter species. Five real-time PCR methods were developed which include: (a) rapid detection and identification of Campylobacter species using real-time PCR adjacent hybridisation probes, (b) rapid identification of C. jejuni using SYBR Green I, (c) rapid detection and differentiation of Arcobacter species using adjacent hybridisation probes, (d) rapid detection and differentiation of Arcobacter species and the Campylobacter group (C. coli, C. jejuni, C. lari, C. hyoilei, C. helviticus, C. hyointestinalis, C. insulaenigrae, C lanienae) using melting temperature (Tm) of adjacent hybridisation probes, and (e) a one tube real-time PCR multiplex for the rapid detection and identification of Campylobacter species, C. coli and C. jejuni using a TaqMan Probe, in an iCycler iQTM (BioRad, USA) and Light CyclerTM (Idaho Technology, USA). [Continued ...]

Twenty species and six subspecies of the genera Arcobacter and Campylobacter have been described to date. All are Gram-negative, microaerophilic, curved, spiral or S-shaped cells, and are members of the order Campylobacterales, class Epsilonproteobacteria phylum Proteobacteria. Though most members are pathogenic, C. jejuni, C. coli and A. butzleri are the most frequently isolated species from patients suffering from gastrointestinal illness. The current methods for their detection, identification, and differentiation are cumbersome, time consuming and lack specificity. DNA based molecular techniques including real-time Polymerase Chain Reaction (PCR) and Fingerprinting methods Terminal Restriction Fragments Length Polymorphism (T-RFLP) and Ligase Detection Reaction (LDR) have been used in this project to develop rapid detection and identification methods for Campylobacter and Arcobacter species. Five real-time PCR methods were developed which include: (a) rapid detection and identification of Campylobacter species using real-time PCR adjacent hybridisation probes, (b) rapid identification of C. jejuni using SYBR Green I, (c) rapid detection and differentiation of Arcobacter species using adjacent hybridisation probes, (d) rapid detection and differentiation of Arcobacter species and the Campylobacter group (C. coli, C. jejuni, C. lari, C. hyoilei, C. helviticus, C. hyointestinalis, C. insulaenigrae, C lanienae) using melting temperature (Tm) of adjacent hybridisation probes, and (e) a one tube real-time PCR multiplex for the rapid detection and identification of Campylobacter species, C. coli and C. jejuni using a TaqMan Probe, in an iCycler iQTM (BioRad, USA) and Light CyclerTM (Idaho Technology, USA). [Continued ...]
Thesis (PhD Doctorate)
Doctor of Philosophy (PhD)
School of Biomolecular and Biomedical Sciences
Full Text

Arcobacter species, a genus previously classified as ‘aerotolerant campylobacters’, have gained consideration as emerging food and water-borne pathogens. Studies increasingly suggest that they are of significance to veterinary public health and agriculture, but their pathogenicity mechanisms and ability to cause disease in animals and humans are not well understood. This project has revealed that only two of eleven Scottish surface water sources were contaminated with Arcobacter (18 %), and this was the first isolation of Arcobacter spp. from surface waters in Scotland. The two Arcobacter water isolates (SW-DL2 and SW-OL2) were shown to be closely related to species of Arcobacter butzleri. The extracellular proteins (ECP) of all strains were positive for gelatinase activity (50-310 units) and caused haemolysis of sheep and chicken erythrocytes. The A. butzleri reference strain D2686 showed poor haemolysis of human erythrocytes. The cadF genes of A. butzleri D2686 and SW-OL2 were cloned and sequenced, and showed high levels of sequence identity with a gene that encodes fibronectin-binding protein in Campylobacter jejuni. All Arcobacter strains in this study showed the ability to adhere to INT-407 cells in vitro and mutagenizing the cadF genes of A. butzleri D2686 and SW-OL2 resulted in a significant reduction in adherence (P >0.01 and P >0.001 respectively). Five putative virulence genes (cadF, ciaB, flaA, flaB and pldA) have been detected in each of the Arcobacter strains studied. cadF mRNA was also shown to be expressed in all strains with higher levels in A. cryaerophilus and SW-OL2 than the other strains. RT-PCR analysis also revealed that expression of the cadF gene was upregulated in all strains on infection of tissue culture cells with significant differences in levels of expression observed.

Les Arcobacters sont considérés comme des pathogènes émergents essentiellement en pathologie digestive humaine bien que quelques cas de bactériémie aient été décrits. La principale voie de contamination de l'homme par Arcobacter serait la voie alimentaire par les volailles dont les carcasses contaminées seraient le véhicule potentiel de transmission de cette bactérie à l'homme. Arcobacter butzleri et Arcobacter cryaerophilus sont les espèces le plus souvent isolées dans les échantillons humains, animaux et environnementaux. Ce travail de thèse a permis de mieux appréhender la taxonomie du groupe des Arcobacters à l'aide des séquences de la sous-unité A de l'ADN gyrase, d'identifier les mutations associées à la résistance aux fluoroquinolones et de mettre en place une PCR en temps réel permettant l'identification des différentes espèces d'Arcobacter qui permettra d'évaluer leur prévalence chez l'homme, dans les élevages, dans les viandes animales, dans le lait ainsi que dans leurs différents réservoirs hydrotelluriques. Nous avons aussi étudié l'effet de l'inactivation des sous unités FlaA et FlaB du flagelle d'A. Butzleri dans la virulence de la bactérie et montré que l'adhérence est essentielle pour la réponse proinflammatoire.

7.1 Foreword The genus Arcobacter, previously classified as “aerotolerant campylobacter”, from 1991 is classified as a new genus member of the family of Campylobacteriaceae, belonging to the epsilon-proteobacteria. The genus Arcobacter contains eight described species: Arcobacter butzleri, A. cryaerophilus, A. nitrofigilis; A. skirrowii ,A. cibarius, A. thereius, A. halophilus and 46 A. mytili . The bacteria are Gram negative, non-sporeforming, motile, curved, occasionally straight, rods which may appear as spiral. The most important differences between Arcobacter and Campylobacter are the ability of Arcobacter to grow at 15-25°C and its marked aerotolerance. Arcobacter spp. have been considered as potential zoonotic foodborne and waterborne agents (. Arcobacter spp. can be found in meat (veal, beef, pork and poultry), milk and water. Nevertheless the real occurrence of these potential pathogens in food is largely unknown. 7.2 Objectives The aim of this study is to evaluate prevalence and distribution of Arcobacter spp. in food of animal origin (raw meat and milk) in Northern Italy and to test the antimicrobial susceptibility of collected strains. 7.3 Trial 1: Prevalence and Distribution of Arcobacter spp. In Veal Calves in Northern Italy In this study the prevalence and distribution of Arcobacter spp. in samples taken from feces and carcasses of healthy veal calves, raised in Northern Italy, were investigated. A membrane filtration technique with a non-selective blood agar was employed after enrichment in Arcobacter selective broth to isolate a wide range of Arcobacter spp. In addition, the same samples were tested at the species level by using a multiplex-PCR assay. Samples from feces (50 during a summer sampling, 50 during a winter sampling) and carcasses (50 during a summer sampling a 50 during a winter sampling) were collected at the slaughterhouse from 50 veal calves originating from five different farms. Of the fecal samples examined, 36 (72%) were found positive for at least one species of Arcobacter during summer sampling and 38 (76%) were found positive during winter sampling. Of the sampled carcasses examined, 50 (100%) were found positive for at least one species of Arcobacter in summer sampling and 20 (40%) in winter sampling. From feces, 23 (46%), 17 (34%) and 5 (10%) samples were found positive by m-PCR for A. cryaerophilus, A. skirrowii and A. butzleri, respectively in summer. On the other side in winter 15 (30%), 12 (24%) and 2 (8%) samples were found positive by m-PCR for A. cryaerophilus, A. skirrowii and A. butzleri, respectively. From carcasses, 47 (94%), 17 (34%) and 5 (10%) samples were positive for A. cryaerophilus, A. skirrowii and A. butzleri, respectively in summer sampling whereas 5 (10%), 4 (8%) and 8 (16%) samples were positive for A. cryaerophilus, A. skirrowii and A. butzleri, respectively in winter sampling . Some sampled carcasses (34% in summer and 6% in winter) and some fecal samples (18% both in summer and in winter) resulted contaminated with multiple Arcobacter species. The present study indicates that veal calves can harbour a variety of Arcobacter spp. in the intestinal tract and that the presence of Arcobacter spp. may represent a source of contamination and dissemination in slaughterhouse. 7.4 Trial 2: Isolation and Characterization of Arcobacter spp. in Bulk Tank Milk Bulk tank milk (BTM) from 50 dairy herds in Northern Italy was examined for the presence of foodborne pathogen: Arcobacter spp. A membrane filtration technique with a non-selective blood agar was employed after enrichment in Arcobacter selective broth to isolate a wide range of Arcobacter spp. In addition, the same samples were tested at the species level by using a multiplex-PCR assay. Arcobacter butzleri and A. cryaerophilus were detected in 40 and 8% of bulk tank milk samples, respectively. One bulk tank milk sample contained both Arcobacter butzleri and A. cryaerophilus. No BTM sample resulted positive to A. skirrowii. No significant association between the presence of Arcobacter spp. in BTM and herd management was observed. The findings of the study demonstrated the presence Arcobacter spp. as a potential milkborne pathogen and warrant the need for educational programs for dairy producers about the risks associated with consumption of raw milk. 7.5 Trial 3: Antimicrobial Susceptibility of Arcobacter spp. Isolated from Food of Animal Origin Arcobacter spp. is a human pathogen and a potential animal pathogen. Thus is important to study antimicrobial susceptibility of strains collected from food of animal origin testing the most common antimicrobial agents used in human and veterinary medicine. In the present study, we examined the antimicrobial susceptibility of 50 Arcobacter spp. strains collected in previous studies from veal calves carcasses and bulk tank milk (BTM), testing 8 antimicrobial agents by disk diffusion testing. Antibiotics and the concentrations of discs (μg) were kanamycin (30), streptomycin (10), gentamicin (10), tetracycline (30), cephalothin (30), ciprofloxacin (5), nalidixic acid (50) and sulfamethoxazole–trimethoprim (23.75 and 1.25, respectively). The plates were cultured at 37 °C and after 48 h of incubation, the diameter of the inhibition zones was measured with a slide caliper. All the tested Arcobacter strains showed resistance to cephalotin, sulfamethoxazole+trimethoprim and nalidixic acid. A. cryaerophilus from veal calf carcasses showed a 100% susceptibility to tetracycline. A. butzleri from BTM showed 100% susceptibility to gentamycin. 7.6 Conclusions This study shows that Arcobacter spp. is largely diffused in healthy livestock and in food of animal origin, both raw meat and raw milk. Although their pathogenicity remains to be fully elucidated, arcobacters are potential foodborne pathogens and their prevalence should be carefully investigated to guarantee public human and animal health.

As espécies do gênero Arcobacter eram classificadas até a década de 1990 como pertencentes ao gênero Campylobacter. Atualmente três das cinco espécies deste gênero são consideradas potencialmente zoonóticas, podendo ser transmitidas por alimentos de origem animal. O presente estudo teve como objetivo isolar e caracterizar geneticamente amostras de Arcobacter spp., isoladas a partir de 120 amostras de carcaças, 120 amostras de fezes e 24 de amostras de músculo suíno coletadas em dois abatedouros localizados no Estado de São Paulo. Os isolados obtidos foram submetidos ao PCR-Multiplex para a determinação das espécies do gênero e analisados através da eletroforese em campo pulsado. O agente foi isolado de 71,6% das carcaças, 4,16% das amostras de fezes e 8,3% das amostras de músculo. As espécies mais prevalentes foram A. butzleri e A. cryaerophilus. A análise dos dados obtidos no PFGE (SmaI) revelou 51 perfis distintos, com um índice discriminatório de 0,98 e grande diversidade genotípica entre as amostras . O sítio de isolamento mais frequente para o agente foram as carcaças e o PFGE mostrou-se um bom instrumento para a caracterização e discriminação de cepas deste gênero
The species of Arcobacter spp. genus have been classified until 1990 as species belonging to the genus Campylobacter. Nowadays, three of five species of this genus are consider as potencially zoonotic, and can be transmitted from food of animal origin. The present study goal was to isolate and characterize genetically strains of Arcobacter spp. isolated from 120 carcasses, 120 faeces and 24 swine muscle sampled in two swine slaughterhouses located in São Paulo State. Isolates were submitted to multiplex-PCR to identify species of the genus and analyzed by pulsed field gel electrophoresis. The agent was isolated from 71,6% of carcasses, 4,16% of faeces and 8,3% of muscles samples. A. butzleri and A. cryaerophilus were the most prevalent species. The analysis of data obtained in PFGE showed 51 distinct profiles, the discriminatory index of 0,98 and it demonstrated large genotipic diversity among the strains. The main isolation site were the carcasses and the PFGE was a good tool to characterize and discriminate Arcobacter spp. strains.

Arcobacter spp. é um micro-organismo Gram negativo que provoca diarreia aquosa e sepse em seres humanos. A. butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowii são espécies patogênicas para humanos. O objetivo deste estudo foi detectar a presença de Arcobacter spp. na carne de aves comercializadas em açougues na cidade de São Paulo, verificando os genes de virulência e o perfil genotípico. Um total de 300 cortes de carne de frango foram submetidos ao cultivo e isolamento sob condições aeróbicas, a 30°C por 72 horas. Colônias suspeitas de Arcobacter spp. foram selecionadas para a detecção molecular pela reacção em cadeia da polimerase (PCR), a fim de determinar as espécies e os genes de virulência. Os resultados revelaram a presença de Arcobacter spp. em 18.3% (55/300) de amostras de carne de aves, sendo identificado como A. butzleri 63,6% (35/55) e A. cryaerophilus 36,3% (20/55). Os genes de virulência pesquisados demonstraram positividade de 100% (55/55) para o ciaB e mviN, seguidos de cj1349 98,1% (54/55), pldA 94,4% (52/55), cadF 72,7% (40/55), tlyA 92,7% (51/55), hecA 49% (27/55), irgA 47,2% (26/55) e hecB 34,5% (19/55). Estas cepas foram submetidas ao AFLP gerando dois dendogramas. Foram identificados 19 perfis genotípicos para A. butzleri e 17 para A. cryaerophilus. Os resultados desta pesquisa apontam a presença de A. butzleri e A. cryaerophilus na fase final da distribuição de carne de frangos nos açougues. A falta de inocuidade dos alimentos de origem animal, bem como a presença de estirpes virulentas representam riscos de Saúde Pública, com especial atenção para a possibilidade de contaminação cruzada gerados por alimentos crus e utensílios de cozinha
Arcobacter spp. is a Gram negative microorganism that causes watery diarrhea and septicemia in humans. A. butzleri, A. cryaerophilus and A. skirrowii are pathogenic for humans. The aim of this study was to detect the presence of Arcobacter spp. in poultry meat from butcher shops in the city of São Paulo, checking the virulence genes and profile genotypic. A total of 300 chicken cuts were used for cultivation and isolation in broth and JM agar, under aerobic conditions, at 30 °C for 72 hours. Arcobacter colonies were selected and submitted to molecular detection by polymerase chain reaction (PCR), in order to determine species and virulence genes. Results show the presence of Arcobacter spp. in 18.3% (55/300) of poultry meat samples, identified as A. butzleri 63.6% (35/55) and A. cryaerophilus 36.3% (20/55) in chicken isolates. The virulence genes on Arcobacter spp. researched demonstrated positive these 100% (55/55) for ciaB and mviN, followed by cj134998,1% (54/55), pldA 94,4% (52/55), cadF 72.7% (40/55), tlyA 92,7% (51/55), hecA 49% (27/55), irgA 47,2% (26/55) and hecB 34,5% (19/55). These strains were submitted to AFLP generating two dendogramas. Nineteen profiles genotypins were obtained for A. butzleri and seventeen for A. cryaerophilus. The results of this research point to the presence of Arcobacter butzleri and A. cryaerophilus in the final stage of distribution of poultry meat to butcher shops. The lack of safety of food of animal origin, as well as the presence of virulent strains pose risks to Public Health, with special focus on cross contamination risks generated by uncooked food and utensils

Thesis (M.S.)--West Virginia University, 2002.
Title from document title page. Document formatted into pages; contains viii, 71 p. : ill. (some col.). Vita. Includes abstract. Includes bibliographical references (p. 65-70).

Dentre as espécies conhecidas do gênero Arcobacter, as espécies A. butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowii são consideradas potecialmente zoonóticas, podendo ser transmitidas por alimentos de origem animal. O presente estudo teve como objetivos isolar e caracterizar fenotipica e genotipicamente cepas de Arcobacter spp. provenientes de carcaças de suínos e amostras de ambiente de abatedouro localizado no Estado de São Paulo. As cepas isoladas foram submetidas a reação em cadeia pela polimerase para a identificação e detecção de um grupo de genes de virulência. A concentração inibitória mínima frente a nove antimicrobianos usados para o controle da infecção pelo agente foi determinada e as cepas foram analisadas através do PFGE e pelo AFLP. Dentre as 30 carcaças avaliadas, 25 foram positivas para o agente e 70 cepas foram selecionadas e identificadas como Arcobacter spp. As espécies isoladas foram A. butzleri (n=61), A. cryaerophilus (n=7) e A. skirrowii (n=2). A frequência dos possíveis genes de virulência encontrada variou de 71,4% a 100% para os genes tlyA, pldA, cj1349, ciaB, cadF e mviN. Não foram detectados os genes hecA, hecB e irgA. O perfil de virulência ciaB/ cj1349/ mviN/ cadF/ pldA/ tlyA foi o mais frequente e detectado em 66% das cepas. Todas as cepas foram sensíveis à gentamicina e tetraciclina e 77,1% foram multirresistentes, dentre estas o perfil mais frequente foi de resistência a azitromicina/ florfenicol/ ácido nalidíxico/ telitromicina/ clindamicina Houve grande diversidade genotípica entre as cepas através do PFGE e do AFLP, e ambas a técnicas apresentaram o mesmo poder discriminatório na análise das cepas isoladas.
Among the known species of the genus Arcobacter, the species A. butzleri, A. cryaerophilus and A. skirrowii are considered potentially zoonotic and can be transmitted by food of animal origin. This study aimed to isolate and characterize phenotypically and genotypically strains of Arcobacter spp from swine carcasses and slaughterhouse environment samples located in the State of São Paulo. The isolated strains were subjected to polymerase chain reaction for identification and detection of a group of putative virulence genes. The minimum inhibitory concentration was determined against nine antimicrobials indicated for the control of infection by the agent and the strains were analyzed by PFGE and by AFLP. Among the 30 carcasses evaluated, 25 were positive for the agent and 70 strains were selected and identified as Arcobacter spp. The isolated species were A. butzleri (n = 61), A. cryaerophilus (n = 7) and A. skirrowii (n = 2). The frequency of virulence genes found ranged from 71.4 % to 100 % for genes tlyA , pldA , cj1349 , ciaB , cadF and mviN . The genes hecA, hecB and irgA were not detected. The virulence profile ciaB/ cj1349/ mviN/ cadF/ pldA/ tlyA was the most frequent and detected in 66 % of the strains. All strains were susceptible to gentamicin and tetracycline and 77.1% were multirresistant, among these the most common profile of resistance was azithromycin/ florfenicol/ nalidixic acid/ telithromycin/ clindamycin There were large genotypic diversity among strains by PFGE and AFLP and both techniques showed the same discriminatory power in the analysis of the isolated strains.

Microbial fuel cells (MFCs) are electrochemical devices that exploit the ability of certain microorganisms to anaerobically respire using an insoluble terminal electron acceptor and therefore generate an electrical current. These bacteria are called electrogens or electrogenic bacteria. Two species of Arcobacter, Arcobacter butzleri ED-1 and Arcobacter L were isolated from the anodic chamber of an acetate fed MFC, and A. butzleri ED-1 was found to be the more electrogenic of the two bacteria. Arcobacter spp. are  proteobacteria and A. butzleri ED-1 and Arcobacter L were the first example of electrogenically active e proteobacteria. It was decided to study their interactions with the anode by fluorescent microscopy and study their electrogenic mechanisms by comparative proteomics using the iTRAQ method as it would allow for simultaneous identification and quantification of peptides in multiple samples. Fluorescent imaging over a period of 120 h in a half MFC showed that both A. butzleri ED-1 and Arcobacter L formed a thin anodic biofilm of a few cells thick and that A. butzleri ED-1 maintained a more stable anodic biofilm than Arcobacter L. iTRAQ analysis showed that the flagellin FlaA was up-regulated 2.4 fold at the anode but no other electron transport proteins or adhesins were upregulated. These results were distinct from those observed for other electrogenic bacteria (Geobacter sulfurreducens and Shewanella oneidensis MR-1) in previous studies which exhibited up-regulated electron transport proteins at the anode as well as forming an anodic biofilm of 50 μm thick. Therefore based on these results it was concluded that FlaA was most likely playing an important role A. butzleri ED-1 anode biofilm formation and that the mechanisms of electrogenesis in A. butzleri ED- 1 and Arcobacter L may be novel compared to those previously characterised. It was also concluded that one possible reason for A. butzleri ED-1 being more electrogenic than Arcobacter L was its ability to form a more stable anodic biofilm. It must be noted that both of these conclusions are highly speculative and further study is needed to elucidate the electrogenic mechanisms of A. butzleri ED-1 and to further compare biofilm formation between the two species.

The present study investigates Acanthamoeba-bacteria interaction and how this relation can influence human health aiming at the influence of bacteria on Acanthamoeba in terms of their isolation and diversity, and the effect of Acanthamoeba on bacteria focusing on two emerging human bacterial pathogens Arcobacter butzleri and Rhodococcus equi. To first objective was investigated by the test question “can the presence of a particular type of bacteria play role in the diversity of Acanthamoeba by masking and/or favouring certain genotypes of Acanthamoeba?” To answer this, two different bacteria the Gram+ve Enterococcus the Gram-ve Arcobacter were used as food source for isolation of Acanthamoeba from 102 soil samples while E. coli was used as control. It was found that the presence of different bacteria could affect the isolation of genotypes specially the subgroups and subtypes of Acanthamoeba as manifested by greater diversity of 18S rRNA sequences of Acanthamoeba isolated from environmental samples on Arcobacter (Arc) and Enterococcus (Ent) than those isolated on E. coli (Eco). The Eco isolates consisted of only T4 > T11=T13 compared to Ent isolates with T4 > T16 > T13/16 and the Arc isolates which comprised of T4 > T2 > T2/6 = T13 > T13/16. The T13/16 were the intermediate sequence types with no match to any T types. There were also considerable differences among the T4 subgroups; the Eco isolates consisted of T4-A > T4-B > T4-N > T4- E > T4-D > T4-C while Ent isolates comprised of T4-A > T4-C=T4-D=T4-E=T4-N > T4-B and the Arc isolates had only T4-E > T4-A > T4-B > T4-N. In both Eco and Ent isolates 11 subtypes were recovered with T4-36 being the most abundant, however, in Arc isolates eight subtypes were recovered with T4-12 as the most abundant. The non-Eco isolates were also different in their bacterial endosymiotic profile from Eco isolates with Arc isolates having the greatest proportion of bacterial endosymbionts (15.7%) as compared to 7.8% of Eco and 12.9% of Ent isolates. Together these results indicate a prominent role of prey bacteria on favouring certain genotypes and thus compelling consideration for use of different types of bacteria for isolation of Acanthamoeba to help surface the masked populations as well for more realistic prevalence that will help in better designing of prevention and control strategies. The influence of Acanthamoeba on bacteria was investigated for A. butzleri and R. equi both of which appeared to exploit the former as an environmental reservoir and for modulation of their pathogenic potential. A. butzleri which are closely related to Campylobacter, appeared to have a smooth interaction with Acanthamoeba. They were shown to be easily located through chemotaxis, readily attached and internalized using monosaccharide receptors and a complex phagocytic process, and could survive/proliferate in Acanthamoeba by defying the intra-vacuolar killing processes. Intracellular survival in Acanthamoeba did play a role in promoting the pathogenicity of these bacteria enabling them to survive more than three times longer. Co-culturing of the two organisms also seemed to benefit the bacteria but not Acanthamoeba. A. butzleri were found to be able to sense the environmental changes and thus modulate their virulence, a feature that together with selection pressure for intracellular survival in Acanthamoeba can cause rapid adaptation to intra-amoebal environment and enhance the pathogenic potential of these bacteria for humans and animals. Exploitation of Acanthamoeba for survival was also found to be exhibited by the Mycobacterium-resembling Gram+ve R. equi by utilizing similar strategies for survival/proliferation as used for macrophages, which involved the definite presence of virulence plasmid and its activation at higher temperatures. Moreover, similar genes (vapA, vapC and vapF) were found to play role in intracellular survival in both the macrophages and amoeba cells. The intra-amoebal survival/proliferation capabilities of A. butzleri and R. equi appear to support the notion that free living protists like Acanthamoeba act as environmental reservoirs/virulence trait selectors and are strong candidates for the “missing link” between the ecology and pathology of these emerging pathogenic pathogens. Overall, the observations made in this study explore the vital role of Acanthamoeba-bacteria interaction not only mutually on each other but as a consequence the impact on human health either as a result of masked genotypes in clinical diagnosis of Acanthamoeba or due to environmental reservoir role of Acanthamoeba in selecting virulence traits of bacteria, can pose serious challenges leaving ample opportunities for more emerging bacterial pathogens. These observations call for revising the protocols for Acanthamoeba prevalence, eradication and control strategies.

El gènere Arcobacter, que ha estat recentment dividit en 7 nous gèneres, comprèn espècies zoonòtiques i patògenes. Aquests gèneres han estat detectats, amb un alt percentatge de positivitat en marisc i juntament amb el fet que aquests aliments són consumits poc cuinats, suposen un risc per al consumidor. En aquesta tesi, s'ha estudiat la relació entre aquests bacteris i bivalves exposats a aigües amb diferents nivells de contaminació fecal. El desenvolupament d'una nova metodologia, que consisteix en el suplement del brou Arcobacter-CAT amb 2.5% NaCl i el seu posterior cultiu en agar marí, ha millorat l'aïllament d'espècies relacionades amb Arcobacter d'ambients salobres i marins. Una correlació positiva entre els nivells de Escherichia coli i Arcobacter va ser observada en bivalves i la seva aigua circumdant. No obstant això, quan els bivalves són cultivats en aigua amb temperatures superiors a 26.2ºC, E. coli no prediu la presència d'aquests patògens. L'avaluació de la distribució de Arcobacter en els teixits de musclos i ostrons, va mostrar que el líquid intervalval és el compartiment amb major prevalença de Arcobacter. La depuració de E coli, A. butzleri i M. molluscorum en musclo i ostró sota diferents condicions de càrrega bacteriana i en dues estacions diferents (estiu i hivern) va ser analitzada. Es va observar que aquest procés no elimina del tot Arcobacter dels bivalves, i que depèn de la temperatura. També es va desenvolupar una v-qPCR per a la detecció de cèl·lules viables de Arcobacter spp. en diferents bivalves. Aquest mètode va aconseguir una inhibició de l'amplificació de l'ADN procedent de cèl·lules mortes en el 85% de les espècies de Arcobacter examinades. Com a resultat de tots aquests experiments, juntament amb l'ús en paral·lel de la metodologia enriquida i no enriquida amb NaCl, s'han aïllat i descrit set noves espècies pertanyents a quatre nous gèneres.
El género Arcobacter, que ha sido recientemente dividió en 7 nuevos géneros, comprende especies zoonoticas y patógenas. Estos géneros han sido detectados, con un alto porcentaje de positividad en marisco y junto con el hecho de que estos alimentos son consumidos poco cocinados, suponen un riesgo para el consumidor. En esta tesis, se ha estudiado la relación entre estas bacterias y bivalvos expuestos a aguas con diferentes niveles de contaminación fecal. El desarrollo de una nueva metodología, consistente en el suplemento del caldo Arcobacter-CAT con 2.5%NaCl y su posterior cultivo en agar marino, ha mejorado el aislamiento de especies relacionadas con Arcobacter de ambientes salobres y marinos. Una correlación positiva entre los niveles de Escherichia coli y Arcobacter fue observada en bivalvos y su agua circundante. Sin embargo, cuando los bivalvos son cultivados en agua con temperaturas superiores a 26.2ºC, E. coli no predice la presencia de estos patógenos. La evaluación de la distribución de Arcobacter en los tejidos de mejillones y ostrones, mostró que el líquido intervalval es el compartimento con mayor prevalencia de Arcobacter. La depuración de E. coli, A. butzleri y M. molluscorum en mejillón y ostrón bajo distintas condiciones de carga bacteriana y en dos estaciones distintas (verano e invierno) fue analizada. Se observó que este proceso no elimina del todo Arcobacter de los bivalvos, y que es dependiente de la temperatura. También se desarrolló una v-qPCR para la detección de células viables de Arcobacter spp. en diferentes bivalvos. Este método consiguió una inhibición de la amplificación del ADN procedente de células muertas en el 85% de las especies de Arcobacter examinadas. Como resultado de todos estos experimentos, junto con el uso en paralelo la metodología enriquecida y no enriquecida con NaCl, se han aislado y descrito siete nuevas especies pertenecientes a cuatro nuevos géneros.
The genus Arcobacter, which recently has been divided into 7 new genera, comprises species that have been considered zoonotic agents and emergent pathogens. Arcobacter-related species have been recovered with a high positivity from seafood, posing a risk for the consumer as they are consumed raw or slightly cooked. In this thesis, the relationship between these bacteria and shellfish exposed to water with different levels of fecal pollution has been studied. A new approach, for improving the recovery of Arcobacter-related genera from marine and brackish environments was developed and consisted on the supplementation of Arcobacter-CAT broth with 2.5% NaCl and posterior culture in marine agar. The correlation between the levels of Escherichia coli and Arcobacter was also examined in shellfish and their surrounding water, showing positive results. However, when shellfish were harvested from water with a temperature above 26.2ºC, E. coli would fail to predict the presence of these pathogens. The distribution of Arcobacter-related genera within the tissues of mussels and oysters showed that the intervalval liquid was the compartment with higher prevalence of Arcobacter. Depuration of E. coli, A. butzleri and M. molluscorum in mussels and oysters under different bacterial loads and in two seasons (summer and winter) was analyzed. The efficacy of the conventional depuration process may not fully eliminate Arcobacter from shellfish and, probably, it is a temperature dependent process. A viable qPCR method for the detection of viable Arcobacter spp. cells in different shellfish matrixes was developed with a satisfactory inhibition of DNA amplification from dead cells in 85% of the Arcobacter species tested. As results of all these experiments, together with the use in parallel of the NaCl.enriched and non-enriched approaches, the isolation and description of seven new species belonging to four new different genera was performed.

Species of Campylobacter, Arcobacter and Helicobacter have been associated with various diseases in humans and animals
and chickens have been identified as a reservoir of these microorganisms. Two published techniques and a new technique, developed in this dissertation, were evaluated to test its efficiency in removing PCR inhibitors from chicken samples. All of the techniques were based on agarose/DNA slants and were evaluated using multiplex PCR and an Internal Amplification Control. The new technique was found to be most effective and consequently used further in the study. A novel study was done to evaluate the survival of Campylobacter, Arcobacter and Helicobacter strains in chicken blood at -20, 4, 37 and 42º
C as well as at ambient room temperature (±
22º
C). It was found that all strains could survive at all temperatures, albeit at different duration times. Most notably, an A. butzleri strain was able to survive at 4oC for up to 297 days.

Bacteria of the Arcobacter genus are microorganisms belonging to the Campylobacteraceae family. Currently, the Arcobacter genus comprises 23 species, isolated from a variety of hosts and ecological niches. Although most of the pathogenic species are from fecal origin, seawater is considered to be the habitat for most of them. The transmission to humans seems to be associated to the consumption of raw food or not entirely-cooked. In this regard, the presence of pathogenic Arcobacter species in food of marine origin and vegetables has not been deeply studied. When the detection and identification of Arcobacter is performed exclusively using conventional culture-based methods, the process is slow, tedious and rarely effective many times, originating frequently false negatives. Molecular biology-based methods analyzing nucleic acids with the use of the Polymerase Chain Reaction (PCR), are alternative procedure characterized by being reliable, faster, more sensitive. In this thesis we have analysed the presence of Arcobacter spp in 100 samples from shellfish and another 100 samples from vegetables using both approaches, on one side through the isolation and characterization by plate culture in and on the other side by PCR. The results obtained by both methods confirm the presence of Arcobacter spp. in the samples. An enrichment period followed by PCR has proved to be more sensitive than culture for the detection of the microorganism in the samples. In this study, Arcobacter contamination has been detected in 71 % of the shellfish samples and 20 % of vegetable samples. The obtained Arcobacter isolates have been identified to the species level analyzing the 16 rRNA gene by PCR-RFLP. This technique has allowed the identification of the species A. butzleri, A. cryaerophilus and A. defluvii in the shellfish isolates, being the first time that A. defluvii is identified in clams. Additionally, it is also the first time that Arcobacter spp. is detected in cockles. A. butzleri and A. cryaerophilus have been isolated in vegetables being the last one the first time in this type of samples. The sensitivity of the obtained isolates to ciprofloxacin and levofloxacin has also been studied. 2 % in analysed shellfish and 1 % in vegetables were contaminated with resistant strains. Three isolates from shellfish and 2 from vegetables, previously identified as A. butzleri, have shown resistance to both fluoroquinolones. In all of them, a mutation in the 254 position (C normal to T mutant) in the Quinolone Resistance-Determining Region (QRDR) of the gyrA gene has been detected. Our results regarding the presence of the pathogen in both types of samples are sufficiently relevant as to consider that the consumption of these contaminated foods with Arcobacter, especially A. butzleri, could suppose a risk for human health. In addition, in this thesis the analisys of Helicobacter spp. and H. pylori by conventional PCR and real-time PCR has been carried out. The Helicobacter genus comprises a large number of species considered pathogenic. The most studied specie is H. pylori, one of the most common pathogens in humans and responsible of 90 % of peptic ulcers and closely related to the development of gastric cancer. Although it seems clear that H. pylori is transmited by fecal-oral route through the water, its presence in food is poorly known. Therefore, another objective of the present study has been to study the presence of these organisms in shellfish and vegetable samples. Helicobacter spp. or H. pylori could not be detected by conventional PCR. However, the real-time PCR technique allowed the detection of H. pylori in a sample from vegetables (lettuce).
Las bacterias del género Arcobacter son microorganismos pertenecientes a la familia Campylobacteraceae. Actualmente, el género Arcobacter comprende 23 especies, aisladas de una gran diversidad de hospedadores y nichos ecológicos. Las aguas de mar son consideradas el hábitat natural para muchas de ellas, aunque la mayor parte de las especies patógenas son de origen fecal. La transmisión al hombre parece estar asociada al consumo de alimentos crudos o poco cocidos. Sin embargo, la presencia de especies patógenas de Arcobacter en alimentos de origen marino y vegetales ha sido muy poco estudiada. Cuando la detección e identificación de Arcobacter, se establece exclusivamente en función de métodos convencionales de cultivo, el proceso resulta lento, tedioso y poco efectivo en muchas ocasiones, originando frecuentes falsos negativos. Los métodos de detección molecular basados en el análisis de ácidos nucleicos, como la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), pueden suponer una alternativa más rápida, sensible y fiable. Por todo ello, en este trabajo se ha realizado la detección de Arcobacter spp. mediante aislamiento por cultivo en placa y PCR, a partir de 100 muestras de moluscos y 100 de verduras. Los resultados obtenidos por ambos métodos confirman la existencia de Arcobacter en las muestras. La PCR, realizada tras un periodo de enriquecimiento, ha resultado ser más sensible que el cultivo para la detección del microorganismo en las muestras. En este trabajo se ha detectado contaminación por Arcobacter en el 71 % de las muestras de moluscos y el 20 % de las muestras de verduras. Los aislados de Arcobacter obtenidos han sido identificados a nivel de especie mediante un análisis PCR-RFLP del gen 16 ARNr. Esta técnica ha permitido identificar las especies A. butzleri, A. cryaerophilus y A. defluvii de los aislados de moluscos, siendo la primera vez que es identificada A. defluvii de muestras de almejas. También es la primera vez que se detecta Arcobacter spp. en berberechos. En el caso de las verduras, se han aislado A. butzleri y A. cryaerophilus. Esta última especie ha sido identificada por primera vez en este tipo de muestras. También se ha estudiado la sensibilidad de los aislados obtenidos a ciprofloxacino y levofloxacino. El porcentaje de muestras contaminadas con cepas resistentes fue del 2 % en moluscos y del 1 % en verduras. Tres aislados procedentes de moluscos y 2 de verduras, identificados previamente como A. butzleri, han mostrado resistencia a ambas fluoroquinolonas. En todos ellos se ha detectado la existencia de una mutación en la posición 254 (C normal por T mutante) en la Región Determinante de Resistencia a Quinolonas (QRDR) del gen gyrA. Nuestros resultados sobre la presencia del patógeno en ambos tipos de muestras son lo suficientemente relevantes como para considerar que el consumo de estos alimentos contaminados con Arcobacter, especialmente A. butzleri, podría suponer un riesgo para la salud humana. Adicionalmente, en este trabajo se ha realizado un análisis de detección de Helicobacter spp. y H. pylori mediante PCR convencional y PCR a tiempo real. El género Helicobacter comprende un gran número de especies consideradas patógenas. La especie más estudiada es H. pylori, uno de los patógenos más comunes en humanos, responsable del 90 % de las úlceras pépticas y relacionado estrechamente con el desarrollo de cáncer gástrico. Aunque parece claro que H. pylori se transmite por la vía fecal-oral a través del agua, su presencia en los alimentos es poco conocida. Por lo tanto, en este estudio se tomó como objetivo estudiar la presencia de estos microorganismos en las muestras de moluscos y verduras. El análisis mediante PCR convencional no mostró resultados positivos para la detección de Helicobacter spp. ni H. pylori. La técnica PCR a tiempo real, sin embargo, ha permitido la detección de H. pylori en una muestra procedente de verduras (lechuga).
Els bacteris del gènere Arcobacter són microorganismes pertanyents a la família Campylobacteraceae. Actualment, el gènere Arcobacter comprèn 23 espècies, aïllades d'una gran diversitat d'hostes i nínxols ecològics. Les aigües de la mar són considerades l'hàbitat natural per a moltes d'aquestes espècies, encara que la major part de les patògenes són d'origen fecal. La transmissió a l'home sembla estar associada al consum d'aliments crus o poc cuits. No obstant això, la presència d'espècies patògenes d'Arcobacter en aliments d'origen marí i vegetals ha sigut molt poc estudiada. Quan la detecció i identificació d'Arcobacter s'estableix exclusivament en funció de mètodes convencionals de cultiu, el procés resulta lent, tediós i sovint poc efectiu, i origina amb freqüència falsos negatius. Els mètodes de detecció molecular basats en l'anàlisi d'àcids nucleics, com la reacció en cadena de la polimerasa (PCR), poden suposar una alternativa més ràpida, sensible i fiable. Per tot això, en aquest treball s'ha realitzat la detecció d'Arcobacter spp. mitjançant aïllament per cultiu en placa i PCR, a partir de 100 mostres de mol·luscos i 100 de verdures. Els resultats obtinguts pels dos mètodes confirmen l'existència d'Arcobacter en les mostres. La PCR, després d'un període d'enriquiment, ha resultat ser més sensible que el cultiu per a la detecció del microorganisme en mostres de mol·luscos. En aquest treball, s'ha detectat contaminació per Arcobacter en el 71 % de les mostres de mol·luscos i el 20 % de les mostres de verdures. Els aïllats d'Arcobacter obtinguts han sigut identificats a nivell d'espècie mitjançant una anàlisi PCR-RFLP del gen 16 ARNr. Aquesta tècnica ha permès identificar les espècies A. butzleri, A. cryaerophilus i A. defluvii en els aïllats de mol·luscos. Aquesta és la primera vegada que A. defluvii és identificada en mostres de cloïsses. També és la primera vegada que es detecta Arcobacter spp. en catxels. En el cas de les verdures, s'han aïllat A. butzleri i A. cryaerophilus. Aquesta última espècie ha sigut identificada per primera vegada en aquest tipus de mostres. També s'ha estudiat la sensibilitat dels aïllats obtinguts a la ciprofloxacina i la levofloxacina. El percentatge de mostres contaminades amb soques resistents va ser del 2 % en mol·luscos i de l'1 % en verdures. 3 aïllats procedents de mol·luscos i 2 de verdures, identificats prèviament com A. butzleri, han mostrat resistència a ambdues fluoroquinolones. En tots aquests s'ha detectat l'existència d'una mutació en la posició 254 (C normal per T mutant) en la regió determinant de resistència a quinolones (QRDR) del gen gyrA. Els nostres resultats sobre la presència del patogen en els dos tipus de mostres són prou rellevants per a considerar que el consum d'aquests aliments contaminats amb Arcobacter, especialment A. butzleri, podria suposar un risc per a la salut humana. Addicionalment, en aquest treball s'ha fet una anàlisi de detecció d'Helicobacter spp. i H. pylori mitjançant PCR convencional i PCR a temps real. El gènere Helicobacter comprèn un gran nombre d'espècies considerades patògenes. L'espècie més estudiada és H. pylori, un dels patògens més comuns en humans, responsable del 90% de les úlceres pèptiques i relacionada estretament amb el desenvolupament de càncer gàstric. Encara que sembla clar que H. pylori es transmet per la via fecal-oral a través de l'aigua, la presència d'aquest bacteri en els aliments és poc coneguda. Per tant, en aquest estudi es va definir com a objectiu estudiar la presència d'aquests microorganismes en les mostres de mol·luscos i verdures. L'anàlisi mitjançant PCR convencional no va mostrar resultats positius per a la detecció d'Helicobacter spp. ni d'H. pylori. La tècnica PCR a temps real, en canvi, ha permès la detecció d'H. pylori en una mostra procedent de verdures (encisam).
Bayas Morejón, IF. (2016). Aportaciones a la epidemiología de Arcobacter y Helicobacter spp.: Aplicación de métodos moleculares a su detección e identificación en alimentos [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/75087
TESIS

This doctoral thesis studies the abundance, diversity, seasonal dynamics and activity of Epsilonproteobacteria in a meromictic basin of Lake Banyoles during three year cycles. We applied a complementary array of molecular techniques to resolve the identity and ecological role of Epsilonproteobacteria in the system, with special focus on the contribution of these microorganisms on linking C and S cycles. Our results pointed to a clear seasonality of Epsilonproteobacteria, with maximal abundances at the redoxcline and upper monimolimnion in winter. Furthermore, results revealed the predominance of sequences affiliated to genus Arcobacter, and clearly indicated that Epsilonproteobacteria actively assimilated CO2 in the dark thus being responsible of the high rates of dark carbon fixation measured at the redoxcline in winter. Additional analyses provided additional evidence that the dominant member of the epsilonproteobacterial community is a chemolithotrophic, sulfide-oxidizing member of the genus Arcobacter, distantly related to its marine counterpart Candidatus A.sulfidicus.
En aquesta tesi doctoral s’ha estudiat l’abundància, diversitat, dinàmica estacional i activitat dels Epsilonproteobacteria en una cubeta meromíctica de l’Estany de Banyoles durant tres cicles anuals. L’estudi combina diferents tècniques moleculars per resoldre la identitat i funció ecològica d’aquests microorganismes al sistema, amb especial atenció a la seva contribució als cicles del C i del S. Els resultats van mostrar una clara estacionalitat en l’abundància d’Epsilonproteobacteria amb màxims hivernals a la redoxclina i al monimolimnion, i van revelar un predomini de seqüències afiliades al gènere Arcobacter. A més, els resultats van demostrar que els Epsilonproteobacteria assimilen activament CO2 en la foscor, essent els responsables de les elevades taxes de fixació fosca de C mesurades a la redoxclina a l’hivern. Anàlisis moleculars complementàries van resoldre que el membre predominant de la comunitat estudiada és un microorganisme quimiolitotròfic i oxidador de sofre del gènere Arcobacter, filogenèticament emparentat amb l’espècie marina Candidatus A.sulfidicus.

Arcobacter butzleri é, dentro do género Arcobacter, a espécie mais frequentemente associada a quadros diarreicos em humanos, bem como a alguns casos de bacteriemias. A. butzleri demonstra uma elevada diversidade genética, o que poderá contribuir para o aumento da sua capacidade adaptativa aos diferentes ambientes onde pode ser encontrado. Um dos mecanismos que contribui para a diversidade genética, poderá ser a transferência horizontal de genes, através do processo de transformação natural, que é caracterizado pela absorção, incorporação e expressão funcional de DNA exógeno, e que pode ocorrer em condições normais de crescimento. Assim, de modo a esclarecer se A. butzleri é naturalmente competente para transformação e quais os fatores que influenciam este processo, foram testados diferentes protocolos de transformação, com a utilização de DNA exógeno e isogénico contendo marcas de resistência a antibióticos. Foi possível verificar neste trabalho que quatro das cinco estirpes de A. butzleri estudadas foram naturalmente transformáveis, com uma frequência de transformação máxima obtida de 10-5 transformantes por célula recetora, obtida após 5 dias de incubação. Confirmou-se ainda que a competência se mantém desde a fase exponencial à fase estacionária de crescimento, e as melhores condições de transformação demonstraram ser a utilização de 1 μg de DNA isogénico, com incubação a 30°C e sob uma atmosfera de microaerofilia. A. butzleri também demonstrou favorecer a incorporação de material genético da sua estirpe/espécie. Observou-se ainda que o processo de incorporação de gDNA ocorre logo após a sua adição. Finalmente, verificou-se que A. butzleri tem a capacidade de trocar material genético em coculturas. Em suma, a transferência horizontal de genes mediada por transformação natural é provavelmente um dos processos que contribui para a diversidade genética em A. butzleri, sendo que esta ferramenta pode ser usada para estudos genéticos desta espécie.

Arcobacter butzleri is an emergent pathogen found in a wide range of habitats and hosts, which has developed resistance to several antibiotics. Efflux pumps are an important mechanism of antimicrobial resistance, therefore, the use of efflux pump inhibitors (EPIs) may have the potential to restore A. butzleri susceptibility to old antibiotics. Plants have shown the ability to fight off infections despite the moderate antimicrobial action of some phytochemicals, so we aimed to test several bioactive compounds as putative EPIs, evaluating their role in the improvement of antibiotics’ performance against A. butzleri. To achieve this goal, the tolerance or resistance profile of A. butzleri strains regarding phytochemicals and antibiotics was traced through the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC); assays of ethidium bromide accumulation were performed to assess the inhibition of the efflux pumps; the MIC of the phytochemicals in the presence of known EPIs was determined to examine the potential role of efflux pumps as resistance mechanism to the phytochemicals; checkerboard assays were made to investigate if the phytochemicals had a synergic interaction with the antibiotics; and finally, quorum sensing inhibition tests were carried out, since this mechanism is a promisor target to fight off bacterial infection. The determination of the MIC of the phytochemicals demonstrated that none of the compounds had antimicrobial activity at the concentrations tested, except for stilbenes, which MIC ranged from 64 to 512 µg/mL. Ethidium bromide accumulation assays showed that some of the tested phytochemicals presented a fluorescence folding increase higher than the controls, indicating that they may inhibit efflux pumps; however only the stilbenes presented a typical EPI profile. The assessment of the MIC of the phytochemicals in the presence of a sub-inhibitory concentration of EPIs, revealed that the importance of efflux pumps in the bacteria resistance to phytochemicals is dependent on the strain. Several phytochemicals were selected for checkerboard titration assays revealing no synergism with antibiotics, however, several cases of additivity were detected. Quorum sensing assays revealed that resveratrol and pinosylvin were able to inhibit this mechanism. In conclusion, some of the phytochemicals tested presented potential to reduce A. butzleri resistance to antibiotics as demonstrated by the results obtained to resveratrol, pinosylvin and gallic acid, which have shown an additive effect when combined with the antibiotics. According to the ethidium bromide accumulation assay, the additive action of resveratrol and pinosylvin may be associated with efflux pump inhibition. Furthermore, these two stilbenes also possess the capacity to inhibit quorums sensing, suggesting that they may be able to inhibit A. butzleri virulence traits.
Arcobacter butzleri é um patogéneo emergente normalmente associado a doenças gastrointestinais em humanos e animais, e a problemas reprodutores, nomeadamente abortos, em animais. Como muitos agentes patogénicos, A. butzleri tem vindo a desenvolver resistência e multirresistências a vários antibióticos. Considerando que as bombas de efluxo são um importante mecanismo de resistência antimicrobiana, sendo essenciais para o desenvolvimento de multirresistências, a estratégia de usar inibidores de bombas de efluxo para restaurar a suscetibilidade desta bactéria a antibióticos comuns é deveras promissora. Tendo em conta que as plantas estão constantemente expostas a stresses bióticos e abióticos e, apesar de alguns fitoquímicos apresentarem fraca atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-negativas, as plantas conseguem combater infeções bacterianas com sucesso através do sinergismo entre compostos, surgindo assim como uma potencial fonte de compostos a explorar. O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de 14 fitoquímicos em inibir as bombas de efluxo de A. butzleri, e avaliar o seu potencial na melhoria da atividade de vários antibióticos contra esta bactéria. Para alcançar este objetivo, o perfil antimicrobiano dos fitoquímicos e de vários antibióticos foi avaliado através da determinação da concentração mínima inibitória. Ensaios de acumulação de brometo de etídio foram realizados para determinar a possível inibição das bombas de efluxo pelos compostos em estudo. A concentração mínima inibitória dos fitoquímicos na presença de inibidores de bombas de efluxo conhecidos foi definida, a fim de investigar se as bombas de efluxo são o principal mecanismo de resistência da bactéria aos fitoquímicos. Também foram realizados ensaios de checkerboard para avaliar o potencial sinergismo entre os fitoquímicos e antibióticos e por fim também foram realizados ensaios de inibição do quorum sensing. A determinação da concentração mínima inibitória dos fitoquímicos e dos antibióticos revelou que todos os fitoquímicos têm uma concentração mínima inibitória superior a 1024 µg/mL, exceto o resveratrol, o pterostilbeno e o pinosilvino, cujos valores variam entre 64 e 512 µg/mL, para as estirpes em estudo. Os resultados obtidos relativos aos ensaios de acumulação de brometo de etídio mostraram que alguns fitoquímicos, nomeadamente (+)-catequina, (-)-epicatequina, rutina, ácidos cafeico e clorogénico, resveratrol, pterostilbeno e pinosilvino levam a um aumento de fluorescência superior ao aumento de fluorescência verificado para os controlos dos solventes. Isto é, eles levam a uma acumulação de brometo de etídio dentro das células superior aos controlos, o que sugere que estes compostos podem estar a inibir as bombas de efluxo. Porém, somente os estilbenos registaram um aumento de fluorescência superior ao verificado para o inibidor de bombas de efluxo usado como controlo. Estes compostos são também os únicos que apresentam um perfil típico de um inibidor de bombas de efluxo. A fim de determinar se as bombas de efluxo são um mecanismo relevante de resistência aos fitoquímicos, a concentração mínima inibitória dos fitoquímicos foi determinada na presença de concentrações sub-inibitórias de inibidores de bombas de efluxo para as estirpes de A. butzleri mais suscetível (DQ46M1) e mais resistente (CR50-2), de entre as estudadas. Verificou-se que a importância das bombas de efluxo na resistência da bactéria aos fitoquímicos é dependente da estirpe, sendo a mais resistente mais dependente das bombas de efluxo do que a mais suscetível. Com base nos resultados do ensaio da acumulação de brometo de etídio, vários fitoquímicos foram selecionados para testes de checkerboard. Os resultados mostraram que várias combinações fitoquímico/antibiótico apresentaram um efeito aditivo, não se observando interação antagonista para nenhuma das combinações avaliadas. Os estilbenos, mais uma vez, foi a classe de fitoquímicos que apresentou os melhores resultados. Por fim, ensaios de inibição do quorum sensing foram realizados a fim de determinar se os fitoquímicos têm a capacidade de inibir estes mecanismos de comunicação celular. Os ensaios mostraram que o resveratrol e o pinosilvino conseguem inibir estes sistemas. Assim, uma vez que o quorum sensing é fundamental para a regulação de diversos fatores de virulência como é o caso da formação de biofilmes, estes compostos bioativos podem ter o potencial de contribuir para o controlo de A. butzleri ao atuar sobre a formação de biofilmes, inibindo-os. Concluindo, apesar do reduzido potencial antimicrobiano da maioria dos fitoquímicos testados, alguns destes compostos apresentaram potencial no aumento de atividade de antibióticos, como foi o caso do resveratrol, pinosilvino e ácido gálico, os quais mostraram ter uma interação aditiva com os antibióticos. De acordo com o ensaio da acumulação de brometo de etídio, o efeito aditivo apresentado pelo resveratrol e pelo pinosilvino pode estar associado à inibição das bombas de efluxo. Estes dois estilbenos também demostraram a capacidade de inibir o quorum sensing, o que sugere que podem ter a capacidade de inibir fatores de virulência associados a A. butzleri.

Arcobacter is a genus of Gram-negative, spiral-shaped bacteria in the Epsilonproteobacteria class. It was first proposed in 1991 and was included in the Campylobacteraceae family together with the genera Campylobacter and Sulfurospirillum. There are currently 18 species described, among which A. butzleri, A. cryaerophilus and A. skirrowii are known to be human and animal pathogens. Arcobacter genus shows an unusually wide range of habitats, having been isolated from food, water, food processing and handling facilities, diverse environmental, animal and human samples. In fact, consumption of Arcobacter-contaminated food or water is regarded as the most probable cause of infection by this bacterium. Therefore it is important to evaluate its distribution in food or food processing environment, together with the assessment of its genetic variability and other phenotypic and genotypic features associated with virulence potential, to be able to understand the persistence mechanism of Arcobacter in the food chain. Thus, this study intend to evaluate the presence, genetic diversity, and virulence characteristics (namely antibiotic resistance, biofilm-forming capacity and detection of putative virulence genes) of A. butzleri strains isolated from poultry and from the environment of a Portuguese slaughterhouse. A. butzleri isolates revealed a high genetic diversity, with all isolates showing to be susceptible to gentamicin, in contrast to 55.8% that were resistant to ciprofloxacin. The latter resistance was associated with the presence of a cytosine to thymine transition in the quinolone resistance determining region of the gyrA gene. Among selected isolates, 72.2 % presented biofilm-forming ability and in all strains putative virulence genes were detected. These results highlight the relevance of A. butzleri relevance as food-borne pathogen. Taking into account that Arcobacter is potentially transmitted through contaminated food and is resistant to common antimicrobials, it is important to develop alternative control strategies that could be both effective and safe for human consumption. Therefore, the antimicrobial properties of resveratrol against A. butzleri and A. cryaerophilus were studied. Resveratrol exhibited a bacteriostatic or bactericidal activity dependent on cellular growth phase and resveratrol concentration, leading to both DNA content and metabolic activity reduction on Arcobacter cells. Resveratrol also showed the ability to act as an efflux pump inhibitor, and to induce cellular damage. Thus, resveratrol showed anti-Arcobacter activity, with the results obtained suggesting that this compound inhibits this microorganism through different pathways, which together with resveratrol beneficial properties described for human health may encourage its use as a food preservative. Some of the species of Arcobacter genus have been associated with gastrointestinal disease in humans, however there were a lack of studies evaluating its prevalence in Portugal, with the same happening for non-Campylobacter jejuni/coli species. Therefore, the frequency of Arcobacter and Campylobacter species in faeces from patients with diarrhoea in Portugal was assessed using a molecular approach. Concerning, Arcobacter and Campylobacter prevalence and distribution, 298 diarrhoeal samples from Portuguese patients were analysed, 1.3% of the samples were positive for A. butzleri and 0.3 % for A. cryaerophilus. Campylobacter species were found in 31.9 % of diarrhoeic faeces samples, with C. jejuni and C. concisus being the most prevalent species of this genus (13.7 % and 8.0 %, respectively). In this cohort of samples, A. butzleri was the fourth most frequent species. These results evidence the importance of Arcobacter and Campylobacter species as aetiological agents of acute gastroenteritis among Portuguese patients, affecting particularly the paediatric age group. Although A. butzleri has been implicated in human diseases, much of its pathogenesis and virulence factors remain unclear. Thus, A. butzleri virulence potential was also investigated, through the characterization of genotypic and pathogenic properties of human and non- human isolates. The isolates showed to be susceptible to tetracyclines and aminoglycosides, however displaying high resistance to quinolones. A. butzleri demonstrated a weak haemolytic activity and the ability to form biofilms in polystyrene surfaces. Adhesion levels similar to Salmonella Typhimurium were found for A. butzleri on Caco-2 cells, with pre- existing inflammation showing no significant effect on its adherence ability, yet invasion ability showed to vary among the isolates. A. butzleri was able of intracellular survival in Caco-2 cells and to induce a significant up-regulation of interleukin-8 secretion, as well as to promote structural cell disturbance. These data brings new insights to A. butzleri virulence and highlights its pathogenic potential. Overall in this work, the prevalence of Arcobacter species both in human and food-related samples was evaluated, contributing to understanding the epidemiology of Arcobacter in Portugal. The survival and persistence of this organism in the environment was highlighted due to its ability to form biofilms. Its relevance as a human pathogen was underlined by the resistance to antimicrobials, the presence of several putative virulence genes, along with its adherence, invasion, intracellular survival abilities and induction of proinflammatory cytokine secretion in intestinal epithelial cells. Finally, resveratrol was tested as an alternative to control the growth of Arcobacter. This work provided new insights on the epidemiology and pathogenicity of Arcobacter, and also identified a natural compound with anti-Arcobacter activity, which may contribute for future developments of new control approaches.
O género Arcobacter foi proposto em 1991 e faz parte da família Campylobacteraceae juntamente com os géneros Campylobacter e Sulfurospirillum, compreendendo atualmente 18 espécies. Entre as espécies reconhecidas, Arcobacter butzleri, Arcobacter cryaerophilus e Arcobacter skirrowii têm sido associados a doença em humanos e animais. O género Arcobacter está amplamente distribuído, tendo sido isoladas espécies em alimentos, água, instalações de processamento e manipulação de alimentos, diversas amostras ambientais, animais e amostras humanas. Em produtos de origem animal, este microrganismo, tem sido isolado com maior prevalência em frangos, seguido de porco e vaca. O consumo de alimentos ou água contaminados com Arcobacter é considerado como a via de transmissão mais provável. Assim, o conhecimento sobre a distribuição de Arcobacter em alimentos ou ambiente de processamento alimentar, juntamente com a avaliação da variabilidade genética e outras características fenotípicas e genotípicas associadas ao seu potencial de virulência, pode ajudar na compreensão do mecanismo de persistência de Arcobacter na cadeia alimentar e contribuir para o seu controlo. Devido à ausência de estudos prévios sobre a prevalência de Arcobacter em Portugal para humanos ou relativos ao sector alimentar, procedeu-se neste trabalho ao seu isolamento a partir de amostras recolhidas de três bandos de frangos e de superfícies da linha de processamento do matadouro. A. butzleri foi isolado e identificado em todas as amostras recolhidas, com exceção das amostras correspondentes ao conteúdo cecal. Quarenta e três isolados de A. butzleri foram caracterizados por eletroforese em gel de campo pulsado, utilizando as enzimas de restrição Smal e Sacll, revelando uma elevada diversidade genética, com os 43 isolados pertencendo a 32 padrões distintos. No entanto, foram identificados genótipos comuns entre diferentes amostras, indicando a possibilidade de ocorrência de contaminação cruzada durante o processo de abate. Verificou-se ainda neste estudo que os isolados de A. butzleri apresentaram elevados níveis de resistência aos antibióticos em estudo, com todos os isolados a serem resistentes a pelo menos três antibióticos dos nove testados. Enquanto os 43 isolados demonstraram ser suscetíveis à gentamicina e 2,3 % resistentes ao cloranfenicol, 55,8 % das estirpes foram resistentes à ciprofloxacina. Genotipicamente a resistência à ciprofloxacina foi associada a uma transição de citosina para timina na região determinante de resistência às quinolonas do gene gyrA, como previamente descrito. Entre 36 isolados selecionados, 72,2 % apresentaram capacidade de formação de biofilme, o que poderá em parte estar associado à sobrevivência de A. butzleri em ambiente de matadouro, provavelmente por favorecer a dispersão e contaminação cruzada ao longo da linha de processamento. A deteção de genes putativos de virulência por PCR demonstrou a presença dos genes cadF, ciaB, cj1349, mviN, pldA e tlyA em todos os isolados, com uma deteção variável dos genes hecA (75 %), hecB (89 %) e irgA (42 %). Como neste estudo se encontrou uma elevada prevalência de A. butzleri nas amostras estudadas, pressupõe-se que o frango possa ser considerado uma via de transmissão importante para humanos. Este facto associado a diversos fatores de virulência, como elevada resistência a antimicrobianos, capacidade de formação de biofilmes e presença de possíveis genes de virulência, tornam este microrganismo como um patogéneo potencialmente relevante a nível alimentar. A potencial transmissão de Arcobacter através de alimentos contaminados, a elevada prevalência encontrada para A. butzleri e o facto de A. cryaerophilus ser a segunda espécie mais comum associada com alimentos, para além da resistência a antimicrobianos comuns e da sua capacidade de sobreviver a tratamentos físicos e químicos, torna relevante encontrar estratégias alternativas para o seu controlo. Assim sendo, o objetivo seguinte foi centrado na avaliação das propriedades antimicrobianas do resveratrol contra A. butzleri e A. cryaerophilus. O resveratrol exibiu atividade bactericida, levando a uma redução igual ou superior a 3 log10 UFC/mL do inóculo inicial, para células em fase exponencial de crescimento de A. butzleri após 6 horas de incubação com uma concentração de resveratrol de 100 Xg/mL, ou de 200 Xg/mL após 24 horas de incubação com células em fase estacionária. Para as células de A. cryaerophilus em fase exponencial de crescimento, o efeito bactericida foi observado após 24 horas com 100 Xg/mL, enquanto para as células em fase estacionária, a atividade bactericida foi apenas detetada com 200 Xg/mL. Com o objetivo de elucidar o potencial mecanismo de ação deste composto sobre Arcobacter, começou por se avaliar o conteúdo intracelular de ADN e atividade metabólica por citometria de fluxo. Após incubação com resveratrol verificou-se uma diminuição em ambos os parâmetros avaliados. Este composto levou também a um aumento na acumulação de brometo de etídio nas células, demonstrando que o resveratrol pode agir como inibidor de bombas de efluxo, e a uma redução da concentração mínima inibitória de resveratrol pelo inibidor de bombas de efluxo fenilalanina-arginina Z-naftilamida. Para avaliar a ação do resveratrol sobre a morfologia e integridade celular de Arcobacter usou-se a técnica de microscopia eletrónica de varrimento. Com esta técnica verificou-se que o resveratrol provocou desintegração das células de A. butzleri tratadas com concentração mínima inibitória de resveratrol durante 6 horas, enquanto nenhuma alteração morfológica foi observada para as células de A. cryaerophilus. Deste estudo concluiu-se que o resveratrol mostrou elevada atividade anti-Arcobacter e os resultados obtidos sugerem que esta atividade antibacteriana pode resultar da ação do mesmo sobre diferentes alvos celulares, o que pode por sua vez levar à indução de morte celular, em consequência de danos nas funções celulares. Assim, neste estudo foram realçadas as potencialidades antimicrobianas do resveratrol sobre um patogéneo de origem alimentar, Arcobacter. Este aspeto associado ao facto de o resveratrol ser naturalmente sintetizado por plantas em respostas a diversas agressões, e de adicionalmente exibir diversas propriedades descritas como benéficas para a saúde humana e ser um reconhecido antioxidante, encoraja a utilização do resveratrol como um potencial conservante alimentar. O género Arcobacter compreende algumas espécies que têm sido relacionadas maioritariamente com doença gastrointestinal em humanos, no entanto, apesar de algumas serem consideradas patogéneos emergentes, não têm sido vistas como microrganismo de elevada preocupação para a saúde pública. Diversos estudos de prevalência têm apresentado A. butzleri como a quarta espécie mais comum em fezes humanas de indivíduos com gastroenterite, de entre os organismos denominados Campylobacter-like organisms. Assim, foi realizado um estudo de prevalência em 298 amostras de fezes de pacientes com diarreia, recolhidas de 22 hospitais portugueses, entre setembro e novembro de 2012. As amostras foram analisadas quanto à prevalência e diversidade de espécies de Arcobacter e Campylobacter, usando técnicas de deteção molecular. Relativamente às espécies de Arcobacter, 1,3 % das amostras foram positivas para A. butzleri e 0,3% para A. cryaerophilus. Foram encontradas espécies de Campylobacter em 31,9 % das amostras de fezes diarreicas, com C. jejuni e C. concisus sendo as espécies predominantes deste género (13,7 % e 8,0 % , respetivamente). Neste grupo de amostras, A. butzleri foi a quarta espécie mais frequente. Estes resultados evidenciam a importância das espécies de Arcobacter e Campylobacter como agentes etiológicos de gastroenterite aguda entre os pacientes portugueses, afetando particularmente a faixa etária pediátrica. Dado que não existe nenhum trabalho prévio relativo à prevalência e distribuição de Arcobacter em Portugal, este trabalho contribui para um conhecimento da epidemiologia local de Arcobacter, tal como de espécies de Campylobacter. Embora A. butzleri tenha sido implicado em algumas doenças em humanos como diarreia e bacteriémia, ainda são necessários mais estudos para clarificar a patogénese associada a este microrganismo. Assim, o potencial de virulência de A. butzleri foi avaliado através da caracterização genotípica e de propriedades patogénicas de três isolados humanos e três não- humanos. Os isolados mostraram suscetibilidade às tetraciclinas e aminoglicosídeos testados, porém exibindo alta resistência às quinolonas. A. butzleri demonstrou uma atividade hemolítica fraca e capacidade de formar biofilmes em superfícies de poliestireno. Foram demonstrados níveis de adesão semelhantes aos de Salmonella Typhimurium para A. butzleri em células Caco-2, sendo que a inflamação pré-existente das células mostrou não ter efeito significativo sobre a capacidade de adesão dos isolados, no entanto, a capacidade de invasão aumentou significativamente para dois dos isolados humanos. A. butzleri demonstrou capacidade de sobrevivência intracelular em células Caco-2 e de indução significativa da secreção de interleucina-8, assim como demonstrou capacidade de induzir perturbação da estrutura celular. Não foi encontrada correlação entre a presença de genes putativos de virulência e os diferentes fenótipos de patogenicidade. Estes resultados forneceram novas perspetivas acerca da virulência e potencial patogénico de A. butzleri. Em conclusão, este trabalho avaliou a prevalência de espécies Arcobacter tanto em amostras humanas como alimentares o que vem contribuir para um melhor conhecimento acerca da epidemiologia deste microrganismo em Portugal. A sobrevivência e a persistência deste organismo no ambiente foi evidenciada devido à sua capacidade de formação de biofilmes, tal como a sua importância como patogéneo humano foi salientada pela resistência aos antimicrobianos, presença de vários genes de virulência, capacidade de adesão, invasão, sobrevivência intracelular e indução da secreção de citoquinas pró-inflamatórias em células de epitélio intestinal. Para controlar este microrganismo foi ainda testada uma abordagem baseada no resveratrol, um composto de origem natural com o potencial para atuar como conservante na indústria alimentar. Este trabalho permitiu assim ampliar o conhecimento acerca da epidemiologia e patogenicidade de Arcobacter, bem como contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias de controlo.

O género Arcobacter é constituído por 23 espécies até agora reconhecidas, e tem vindo a ser isolado a partir dos mais diversos ambientes e hospedeiros, tais como animais de consumo humano, alimentos e superfícies de processamento alimentar, águas ou amostras clínicas humanas, sendo considerado um agente patogénico emergente de origem alimentar com a capacidade de provocar doença quer em humanos quer em animais. A sua ampla distribuição e elevada prevalência em alimentos de consumo humano é motivo de preocupação, pois a ingestão destes alimentos e água contaminada é considerada a principal via de transmissão de Arcobacter spp. a humanos. Por outro lado, a elevada taxa de resistência a diversas classes de antibióticos pode colocar em risco o tratamento eficaz de possíveis infeções causadas por Arcobacter. Assim, considerando que ainda existem poucos estudos relativos à distribuição de Arcobacter em alimentos, mas também referentes à resistência desta bactéria, os objetivos deste trabalho foram analisar a prevalência de Arcobacter spp. em diversos alimentos, identificar a diversidade genética entre os isolados e avaliar a sua resistência a 9 antibióticos normalmente utilizados no tratamento de infeções por este microrganismo. Para tal procedeu-se a diversas amostragens em comércios a retalho nos concelhos da Covilhã e Fundão durante o período de um ano, tendo sido depois analisada a presença e prevalência de Arcobacter spp. nas diferentes amostras. Após o isolamento e identificação molecular dos isolados, estes foram genotipados recorrendo ao uso de Enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR), de forma a avaliar a sua variabilidade genética, seguindo-se por uma avaliação da sua resistência aos diferentes antibióticos. Os resultados demonstraram uma elevada percentagem de contaminação dos alimentos analisados por Arcobacter spp., observando-se uma discrepância entre os valores de prevalência quando feita a identificação molecular diretamente aos meios de enriquecimento (72,2 %) e através de isolamento a partir das amostras (47,0 %). Relativamente ao isolamento, nas diferentes categorias alimentares em estudo alcançaram-se valores de 28,6 % para os vegetais embalados; 68,0 % para carnes de aves de capoeira; 37,5 % para carnes de porco; 43,8 % para carnes de vaca; 56,0 % para amostras de peixes, e 100% para uma amostra de mistura de carnes de vaca e porco. Foi ainda observada uma grande heterogeneidade genética entre os isolados, registando-se 103 perfis genéticos diferentes entre os isolados provenientes das 54 amostras. A genotipagem dos isolados demonstrou ainda a possível existência de contaminação cruzada entre diferentes amostras. Quando avaliada a resistência a antibióticos, observou-se multiresistência para 94 dos 106 isolados avaliados. Assim, concluiu-se que o género Arcobacter se encontra amplamente distribuído em amostras alimentares, apresentando heterogeneidade genética significativa entre os isolados, tal como elevada resistência a diversos antibióticos.
The genus Arcobacter currently includes 23 recognized species, and has been isolated from a wide range of hosts and environments such as food and food processing surfaces, water, or human clinical samples. It is considered a foodborne emerging pathogen with ability to cause disease among humans and animals. The wide distribution and high prevalence of Arcobacter in food is a significant concern, since consumption of contaminated food and water is considered the most probable route of transmission of Arcobacter spp. to humans. High level of resistance to several antibiotics has been demonstrated, which may threaten the effective treatment of infections caused by this genus. Considering that there are still few studies analysing the distribution of Arcobacter spp. in food and also the resistance of these bacteria to antibiotics, the objectives of this work were to evaluate the prevalence of Arcobacter spp. in different food products, to characterize the genetic diversity among the isolates and to assess the resistance to 9 antibiotics commonly used to treat infections by this microrganism. Therefore, food samples were collected in retail shops at Covilhã and Fundão during one year, which were then tested for the presence and prevalence of Arcobacter spp.. After isolation and molecular identification of the isolates, these were genotyped using Enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction (ERIC-PCR), followed by an assessment of their resistance to different antibiotics. The results demonstrated a high contamination of food by Arcobacter spp., being observed a discrepancy between the prevailing values when the molecular detection was applied to enrichment broth (72.2 %) versus when the isolation methodology was performed (47.0 %). Regarding isolation, prevalence values of 28.6% for packaged vegetables, 68.0 % for poultry meat, 37.5 % for pork, 43.8 % for beef, 56 % fish samples, and 100 % for a single sample constituted by two different types of meat were obtained. A large genetic heterogeneity among the isolates was also observed, revealing 103 different genetic profiles among isolates from 54 samples. Nonetheless, genotyping of the isolates showed a possible cross-contamination between food samples. Concerning to antibiotic resistance, multiresistance was observed for 94 of the 106 analyzed strains. In conclusion, the Arcobacter genus was widely distributed among the collected food samples, showing a high genetic heterogeneity and high resistance to several antibiotics.

Na última década, os estudos em Arcobacter spp. têm vindo a intensificar-se para colmatar a falta de conhecimento ao nível da patogenicidade, resistência e sobrevivência deste microrganismo. Algumas das espécies de entre o género Arcobacter são vistas como uma preocupação para a saúde pública e também para a segurança alimentar devido à sua associação a doenças tanto em humanos como em animais e também à sua elevada distribuição em alimentos, ambiente de processamento alimentar ou águas de consumo humano. De entre as 30 espécies do género Arcobacter, Arcobacter butzleri foi incluído na lista de microrganismos considerados um perigo grave para a saúde humana, pela Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos. No entanto, ainda pouco se sabe relativamente à sua capacidade de sobrevivência e persistência em alimentos, tal como à sobrevivência de A. butzleri em condições de stress associadas ao processamento alimentar e condições de higienização. Assim, o objetivo deste trabalho passou por avaliar a capacidade de sobrevivência de A. butzleri na ausência e presença de matrizes alimentares (frango e alface) quando sujeito a condições de stress (temperatura de 55 ºC, vinagre e AMUKINA). Quando se avaliou a capacidade de sobrevivência de A. butzleri na ausência de matrizes alimentares, em geral existiu uma elevada redução do número de células para todas as condições de stress estudadas, isto é, para o tratamento térmico ocorreu uma redução na sobrevivência de A. butzleri e a aplicação do vinagre e AMUKINA levou à eliminação de A. butzleri. No entanto, na presença de matrizes alimentares a redução da sobrevivência não se mostrou tão acentuada como na ausência de matrizes alimentares, ou seja, estes tratamentos deixaram de ser eficazes para algumas estirpes, ocorrendo uma diminuição da atividade da temperatura, do vinagre e da AMUKINA na eliminação de A. butzleri. Concluindo-se assim, que apesar da eficácia da temperatura, vinagre e AMUKINA na eliminação de A. butzleri na ausência de matrizes alimentares, estas influenciam os processos de processamento alimentar e higienização, apontando assim um potencial perigo para a saúde do consumidor.
In the last decade, an intensification of studies regarding Arcobacter spp. has occurred, in order to fulfil the lack of knowledge that still exists about subjects as pathogenicity levels, resistance and survival of this microorganism. Some of the species among the genus Arcobacter are seen as a concern to public health, as well as to food safety, due to its association to illness in humans and in animals, and also due to its high distribution in food, food processing environments or water for human consumption. Among the 30 species of the Arcobacter genus, Arcobacter butzleri was included in the list of microorganisms that are considered serious hazard to human health by the International Commission on Microbiological Specifications for Foods. In the meantime, a limited knowledge about its survival capacity and persistence in foods still exists, such as the survival of the A. butzleri in conditions of stress associated with food processing and hygienization conditions. Therefore, the aim of this work was to evaluate the survival capacity of the A. butzleri in the presence and absence of food matrixes (chicken and lettuce), when submitted to stress conditions (temperature of 55 ºC, vinegar and AMUKINA). When the survival ability of the A. butzleri was evaluated in the absence of food matrixes, in a general manner, it was observable a high decline of the number of cells for all the stress conditions evaluated in this study. As to what concerns the other stress conditions, for the thermal treatment a reduction in the survival of the A. butzleri was noticeable, and in the group submitted to vinegar and AMUKINA an elimination of the A. butzleri was verified. However, in the presence of food matrixes the survival reduction was not as accentuated as in the absence of food matrixes, that is, these treatments stopped being effective for some strains of this bacterial group, being therefore evidenced a decrease in the effectiveness of the temperature, vinegar and AMUKINA in the elimination of the A. butzleri. In sum, despite the effectiveness of the temperature, vinegar and AMUKINA in the elimination of A. butzleri in the absence of food matrixes, the food matrixes influenced the course of food processing and hygienization, pointing towards a hazard for the consumer’s heath.

O género Arcobacter é constituído por 26 espécies reconhecidas até ao momento, de entre as quais Arcobacter butzleri, A. cryaerophilus e A. skirrowii são consideradas agentes patogénicos emergentes associados a enterites e bacteremias em humanos. A. butzleri é a espécie mais frequentemente encontrada em amostras humanas, ambientais e alimentares, pertencendo à lista de microrganismos considerados como perigosos para a saúde humana pela Comissão Internacional de Especificações Microbiológicas para Alimentos. Em paralelo, as elevadas taxas de resistência em A. butzleri têm vindo a aumentar, o que pode colocar em causa o tratamento de infeções graves ou mesmo levar a disseminação de resistência. Assim, considerando que a investigação em torno dos mecanismos de resistência desta bactéria é escassa, mas relevante, o objetivo deste trabalho passou pela avaliação do papel de bombas de efluxo na resistência a antimicrobianos por A. butzleri e estudo da relevância de um sistema de efluxo putativo da superfamília Resistance-Nodulation-cell-Division (RND). De forma a avaliar o papel do efluxo na resistência em A. butzleri, neste trabalho começou por se determinar o efeito de inibidores de bombas de efluxo (EPI) na resistência a antimicrobianos, através da determinação da concentração mínima inibitória (CMI) de antibióticos, sais biliares e um desinfetante na ausência e presença de EPIs em cinco estirpes de A. butzleri. Seguidamente, através de análise in silico caracterizou-se a bomba de efluxo putativa do tipo CmeABC pertencente à superfamília RND. Por forma a compreender qual o seu papel na resistência de A. butzleri construiu-se um mutante por inativação do gene tipo cmeB da bomba de efluxo tipo CmeABC. Para a construção do mutante utilizou-se o método de transformação natural por mutagénese insercional, através de aplicação de DNA transformante contendo uma cassete de resistência à canamicina flanqueada por regiões integrantes do gene tipo cmeB da estirpe parental. Após a confirmação da mutação, comparou-se a influência da inativação do gene nas CMI a antimicrobianos das estirpes parentais e respetivas mutantes, bem como as alterações sofridas a nível de acumulação de brometo de etídio (EtBr). Com base nos resultados deste trabalho, pôde verificar-se que algumas das estirpes estudadas apresentaram um perfil de multirresistência, sendo que todas elas apresentavam resistência à cefotaxima. Por outro lado, nenhuma estirpe demonstrou resistência à gentamicina. A utilização de EPIs demonstra ter efeito, baixando os valores da CMI a alguns compostos. O PAßN, que é um inibidor de sistemas de efluxo do tipo RND, mostrou ser o inibidor globalmente mais eficaz. Estes resultados, sugerem que as bombas de efluxo RND terão um papel relevante na resistência de A. butzleri a antimicrobianos como a eritromicina, o Irgasan e em alguns casos a sais biliares. A análise in silico realçou a existência de uma bomba de efluxo putativa do tipo CmeABC em A. butzleri que apresenta uma identidade elevada com outros sistemas RND. Através da comparação entre a CMI das estirpes parentais e respetivas mutantes, verificou-se que efetivamente a bomba de efluxo tipo CmeABC tem um papel na resistência de A. butzleri à ciprofloxacina, ß-lactâmicos e eritromicina. Por sua vez, os ensaios de acumulação de EtBr confirmaram uma correlação entre a inativação do gene cmeB e o aumento da acumulação de EtBr, verificando-se que o gene cmeB, e por consequência a bomba de efluxo do tipo CmeABC, tem um papel no efluxo de compostos. Em suma, este trabalho demonstra o papel global das bombas de efluxo na resistência a antibióticos, sais biliares e desinfetante e a existência de uma bomba de efluxo tipo CmeABC funcional com papel na resistência de A. butzleri a alguns antimicrobianos.
The genus Arcobacter consists of 26 species recognized so far, among them Arcobacter butzleri, A. cryaerophilus and A. skirrowii are considered as emergent pathogens associated with human enteritis and bacteremia. A. butzleri is the most frequently found on human, environmental and food samples, and it pertains to the list of microorganisms considered to be a serious hazard to human health by the International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF). Simultaneously, the high resistance rates in A. butzleri have been increasing, which may jeopardize the treatment of serious infections or even lead to the spread of resistance. Regarding this, and considering that the research on the resistance mechanisms of this bacterium is scarce but relevant, the focus of this investigation was to evaluate the efflux pumps role on the resistance mechanisms of A. butzleri against antimicrobials, and study the relevance of a putative efflux system of the RND superfamily. To evaluate the efflux pump role on the resistance mechanism of A. butzleri, it was first assessed the effect of the efflux pump inhibitors on antimicrobial resistance, through determination of the minimum inhibitory concentration of antibiotics, bile salts and a disinfectant in the presence and absence of EPIs in five strains of A. butzleri. Subsequently, in silico analysis was used to characterize the putative efflux pump CmeABC, belonging to the superfamily RND. Aiming to understand its role on the resistance mechanism of A. butzleri, a mutant strain was created containing an inactivated cmeB gene from the efflux pump CmeABC. The mutant was constructed by natural transformation through insertional mutagenesis, inserting transforming DNA containing a kanamycin resistance cassette flanked by upstream and downstream regions of cmeB gene from the native strain. After confirmation of the mutation, the minimum inhibitory concentration of antimicrobials of the native and respective mutant strains were compared, as well as changes on the accumulation of EtBr. Considering the obtained results, it was observed a multidrug resistance profile of some strains, with all strains being resistant to cefotaxime. On the other hand, none of the strains were resistant to gentamicin. The use of EPIs is effective, lowering the minimum inhibitory concentration values to some compounds. The PAßN, which is an inhibitor of RND efflux systems, demonstrated to be the most effective inhibitor. These results suggest that the RND efflux pumps could play an important role on the resistance of A. butzleri against antimicrobials such as erythromycin, Irgasan, and in some cases bile salts. The in silico analysis shows the existence of a putative efflux pump CmeABC in A. butzleri, which presents a high identity with other RND systems. By comparing the minimum inhibitory concentration of the parent strains to their respective mutant strains, it was possible to confirm that the efflux pump CmeABC has a role on the A. butzleri resistance against ciprofloxacin, ß-lactams and erythromycin. Indeed, EtBr accumulation assays confirmed a correlation between the inactivation of the cmeB gene and increase in EtBr accumulation, showing that the cmeB gene, and consequently the efflux pump CmeABC, has a role on the efflux of compounds. In sum, this work demonstrates that the efflux pumps play a global role on the resistance against antibiotics, bile salts and disinfectant, and demonstrates the existence of an efflux pump CmeABC with a functional role on the resistance mechanisms of A. butzleri against some antimicrobials.

As bactérias do género Campylobacter e do grupo Arcobacter sensu lato são bacilos de Gramnegativo, pertencentes à família Campylobacteraceae. Até ao momento, 35 espécies foram reconhecidas no género Campylobacter, e 31 no grupo Arcobacter sensu lato, sendo que entre elas, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Aliarcobacter butzleri, Aliarcobacter cryaerophilus e Aliarcobacter skirrowii, são as principais espécies associadas a infeções em humanos e animais. Embora exijam um hospedeiro, as bactérias do género Campylobacter são comumente isoladas de amostras de águas naturais, como nascentes, rios e lagos. De igual forma, mais de metade das espécies de Arcobacter sensu lato foram isoladas a partir de ambientes aquáticos. Esta situação revela-se como uma importante ameaça à saúde pública devido ao contacto direto do Homem com este tipo de águas. Esta preocupação é acrescida pela associação de surtos de doenças com o consumo de água contaminada com estas bactérias, sendo esta uma importante via de transmissão. Assim, o objetivo deste estudo focou-se na avaliação da distribuição de Campylobacter spp. e Arcobacter sensu lato em diferentes amostras de água, nomeadamente água de rio, água de afluentes e água de nascente não tratada, recolhidas no concelho da Covilhã, e avaliação da sua resistência a 7 antibióticos, normalmente utilizados no tratamento de infeções por estes microrganismos. Pela análise dos resultados, das 150 amostras analisadas por duas metodologias de deteção distintas, PCR e cultura, 56 (37,3 %) foram positivas para Campylobacter spp. quando utilizada deteção direta por PCR no meio de enriquecimento, e por isolamento 22 (14,6 %) revelaram a presença deste género; no total 60 amostras foram positivas por ambos os métodos. Em 8 de 22 amostras (36,4%) foi identificado C. jejuni, em 7 (31,4 %) C. coli, em 4 (18,2 %) C. lari, e 1 (4,5 %) foi positiva para C. upsaliensis, sendo que para duas amostras não foi possível obter uma identificação a nível de espécie. Em relação a Arcobacter sensu lato, também alguma variabilidade foi encontrada aquando da utilização destas duas metodologias, onde 72 de 150 amostras (48 %) foram positivas para o género quando utilizada deteção direta por PCR no meio de enriquecimento, e através de cultura foi possível o isolamento de bactérias deste grupo em 89 (59,3%) amostras; no total 99 amostras foram positivas considerando ambos os métodos. Em 74 das 89 amostras (83,1%) foram identificadas como positivas para A. butzleri, 20 (22,5%) para A. cryaerophilus e 28 amostras encontravam-se contaminadas por outras espécies de Arcobacter. Pela avaliação da diversidade genética, pela técnica de reação em cadeia da polimerase por consenso intergénico repetitivo enterobacteriano (ERIC-PCR - do inglês enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR), foi observada uma grande heterogeneidade genética entre os isolados de ambos os grupos bacterianos, registando-se 37 perfis genéticos diferentes entre os isolados provenientes das 22 amostras positivas para Campylobacter spp., e da mesma forma foram observados 255 perfis únicos de um total de 291 isolados de Arcobacter sensu lato. Quando avaliado o perfil de suscetibilidade a antibióticos, foram observadas diferenças nos perfis de resistência entre ambos os grupos bacterianos. Desta forma, para além de resistências pontuais, observou-se uma baixa multirresistência para o género Campylobacter, em apenas 2 dos 25 isolados avaliados, tendo-se obtido valores superiores para Arcobacter sensu lato, onde de um total de 238 isolados, 194 mostraram perfil de multirresistência, tendo-se verificado casos em que a resistência foi transversal a seis dos sete antibióticos testados. Assim, os resultados deste estudo demonstram uma elevada prevalência de Campylobacter spp e Arcobacter sensu lato, agravada pela alta resistência a antibióticos encontrada, em amostras de água superficial de acesso ao homem, apresentando não só alto risco para a população e animais da região, mas também para uma possível contaminação de alimentos.
The bacteria of the genera Campylobacter and Arcobacter sensu lato group are Gram-negative bacilli, belonging to the Campylobacteraceae family. Until now, 35 species have been recognized for the genus Campylobacter, and 31 species for Arcobacter sensu lato. Amongst the species of both groups, Campylobacter jejuni, Campylobacter coli, Aliarcobacter butzleri, Aliarcobacter cryaerophilus and Aliarcobacter skirrowii are the most frequently associated with infections in humans and animals. Although requiring a host, bacteria of the genus Campylobacter are commonly isolated from samples of natural waters, such as spring waters, rivers and lakes. Likewise, more than half of the Arcobacter sensu lato species have been isolated from aquatic environments. In fact, water is considered a relevant contamination source and an important threat to public health due to their consumption and direct contact with humans. This concern is increased by the association of outbreaks with the consumption of water contaminated with these bacteria, pointing to their consumption as an important route of transmission. Thus, this study focused on assessing the distribution of Campylobacter spp. and Arcobacter sensu lato in different water samples, such as river water, water from affluents and untreated spring water, collected in the municipality of Covilhã, and evaluation of their resistance to seven antibiotics commonly used in the treatment of infections by these microorganisms. Through the analysis of the results, of the 150 samples evaluated by two distinct detection methodologies, PCR and culture, 56 (37.3 %) samples were positive for Campylobacter spp. when using direct detection on the enrichment broth, and 22 (14.6%) were positive by culture; in total, 60 samples were positive by both methods. The distribution by species was as follows: eight of 22 samples (36.4%) were positive for C. jejuni, seven (31.4 %) for C. coli, four (18.2 %) for C. lari, one sample (4.5 %) was positive for C. upsaliensis, and for two of the samples it was not possible to obtain an identification at the species level. Regarding Arcobacter sensu lato, some variability was also found when using these two methodologies, where 72 out of 150 samples (48%) were positive for the genus when using direct PCR detection in the enrichment medium. Through culture it was possible the isolation of bacteria from this group from 89 (59.3%) samples; and in total 99 samples were positive by both methods. Concerning Arcobacter sensu lato, the distribution of the species was as follows: 74 of the 89 samples (83.1%) were positive for A. butzleri, 20 (22.5%) for A. cryaerophilus and 28 samples were contaminated with other species of Arcobacter. Through the evaluation of the genetic diversity by enterobacterial intergenic consensus-PCR polymerase chain reaction technique (ERIC-PCR), a large genetic heterogeneity was observed among isolates of both genera. Among isolates from 22 Campylobacter spp. positive samples by culture, 37 different genetic profiles were found. Similarly, 255 unique profiles of a total of 291 Arcobacter sensu lato isolates were observed. When the antibiotic susceptibility profile was evaluated, divergences between the resistance of both groups were noted. Thus, in addition to pontual resistances, a low multidrug resistance was observed for the genus Campylobacter, only two among the 25 isolates studied. Higher values were obtained for Arcobacter sensu lato, where from a total of 238 isolates, 194 showed a multidrug resistance profile, of which some presented transversal resistance to six of the seven antibiotics tested. In sum, the results of this study demonstrate a high prevalence of both bacterial groups in water samples accessible to humans, worsen by the high resistance found in those samples, presenting not only high risk for the population and animals of the region, but also for possible food contamination.

género Arcobacter tem atualmente 18 espécies descritas, das quais se destaca a espécie A. butzleri, uma vez que esta é atualmente considerada um agente enteropatogénico zoonótico emergente tanto para animais como para humanos. Este microrganismo é geralmente detetado em produtos de origem alimentar e em água, possuindo também elevada resistência antimicrobiana a antibióticos e desinfetantes o que tem conduzido, nos últimos anos, à necessidade de desenvolver novas técnicas e investigar novos compostos para o controlo e, em última instância, erradicação desta bactéria. O resveratrol, principal composto da família das fitoalexinas, possui inúmeras propriedades bioativas, nomeadamente a atividade antimicrobiana contra fungos e bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, tendo sido recentemente demonstrada a sua inibição sobre espécies de Arcobacter. De modo a fomentar a utilização deste composto em diversas aplicações, a sua baixa estabilidade e solubilidade aquosa têm vindo a ser ultrapassadas pela sua complexação e inclusão em diversos polímeros como, por exemplo, ciclodextrinas, sais biliares e microesferas poliméricas. De facto, a complexação do resveratrol com ciclodextrinas modificadas demonstrou um aumento considerável da solubilidade aquosa e da fotoestabilidade deste composto. Desta forma, o objetivo deste trabalho residiu no estudo da atividade antimicrobiana do resveratrol (RV), sob a forma de complexos de inclusão com a ciclodextrina modificada hidroxipropil-gama-ciclodextrina (HP-?-CD) contra uma estirpe de referência de A. butzleri (LMG 10828), dois isolados de origem animal (AB 17/11 e AB 36/11) e dois isolados de origem clínica (INSA 593 e INSA 776). Primeiramente procedeu-se à determinação dos fatores de virulência, onde os dois isolados clínicos revelaram a presença dos genes cadF, tlyA, cj1349, hecA, pldA, ciaB e mviN; a estirpe AB 36/11, apresentou mais um gene, o hecB, enquanto as estirpes LMG 10828 e AB 17/11 além dos oito genes descritos anteriormente, apresentaram no seu genoma o gene irgA. A resistência das estirpes a 9 antibióticos comuns foi também determinada, observando-se para a estirpe de referência e para os isolados clínicos a resistência à ampicilina, à amoxicilina, à vancomicina, à cefoperazona, à piperacilina e ao trimetoprim. Para além de apresentar resistência a estes antibióticos, a estirpe AB 36/11 tem resistência à ciprofloxacina. A estirpe AB 17/11 foi de todas elas, aquela que apresentou maior suscetibilidade, uma vez que o seu perfil de resistência inclui apenas os antibióticos vancomicina, ciprofloxacina e trimetoprim. A suscetibilidade do microrganismo aos complexos de inclusão (CI) formados foi determinada pelo método de microdiluição, onde se observou uma concentração mínima inibitória (CMI) de 256 µg/mL para as estirpes LMG 10828 e INSA 776 e 64 µg/mL para AB 36/11, AB 17/11 e INSA 593. Nesta fase foi também avaliada a suscetibilidade na presença de RV livre, obtendo-se uma CMI de 100 µg/mL para as cinco estirpes. De modo a determinar a ação bacteriostática ou bactericida dos CIs foram realizadas curvas de morte para um isolado clínico (INSA 776) e um de origem animal (AB 36/11), o que permitiu concluir que os CIs possuem atividade bactericida dependente tanto do tempo de incubação como da concentração de agente antimicrobiano. Para concentrações de CI correspondentes a 2x e 4x a CMI a viabilidade celular é semelhante para os dois isolados, sendo que o isolado de origem humana demonstrou ser mais suscetível. Para o RV livre, o efeito bactericida ocorre de forma mais rápida para 1x, 2x e 4xCMI em ambos os isolados. O mecanismo de ação dos CI foi avaliado por citometria de fluxo para estes dois isolados, usando os fluorocromos SYTO® 40 para marcação de todas as células, bis-(ácido 1,3-dibutilbarbitúrico) trimetina oxonol (BOX) e 5-ciano-2,3-ditolil cloreto de tetrazólio (CTC), para avaliação de alterações a nível do potencial de membrana e atividade metabólica, respetivamente. Os resultados de citometria de fluxo demonstraram que, com o aumento da concentração de CI, ocorre a diminuição da atividade metabólica das células e, consequentemente, o aumento da despolarização da membrana das mesmas. Dado que a formação de biofilmes por parte dos microrganismos está associada com a sua virulência, colonização e resistência a antibióticos, torna-se importante a sua monitorização bem como o estudo de formas que inibam o seu desenvolvimento. Assim sendo, foi também evidenciada a ação dos CIs e do RV livre na formação e na promoção da dispersão de biofilmes pré-formados, com elevada redução de biomassa de biofilme para as concentrações de 1x, 2x e 4x a CMI. De forma geral, os resultados demonstram que os CIs apresentam atividade antimicrobiana sobre os isolados de A. butzleri tanto em células planctónicas como em biofilmes, sugerindo a aplicação destas formulações como soluções de origem natural para a indústria alimentar contra o desenvolvimento de Arcobacter spp.
Currently, the genus Arcobacter has 18 described species, with the most relevant being A. butzleri since it is now considered an emerging zoonotic enteropathogenic agent for both animals and humans. This microorganism is usually detected in food products and water environments and also presents a high antimicrobial resistance to antimicrobials and disinfectants which has led, in recent years, to the need to develop new techniques and to search new compounds for the control and, even, eradication of this bacterium. Resveratrol, the main compound of the phytoalexins family, has innumerous bioactive properties, including antimicrobial activity against fungi and Gram-positive and Gram-negative bacteria, and recently its inhibition over Arcobacter species was demonstrated. In order to promote the use of this compound in various applications, its low stability and water solubility have been overcome by its complexation and inclusion in various polymers such as cyclodextrins, bile salts and polymeric microspheres. In fact, resveratrol complexation with modified cyclodextrins showed a considerable increase in the aqueous solubility and photostability of this compound. Thus, the main goal of this work was the evaluation of resveratrol antimicrobial activity, inclusion complexes with modified cyclodextrin hydroxypropyl-gamma-cyclodextrin (HP-?-CD) against an A. butzleri reference strain (LMG 10828), two animal origin (AB 17/11 and AB 36/11) and two clinical origin (INSA 593 and INSA 776) isolates. The first step of the study was the determination of the virulence factors where both clinical isolates presented the cadF, tlyA, cj1349, hecA, pldA, ciaB and mviN genes, the strain AB 36/11 presented one more gene, hecB while the strains LMG 10828 and AB 17/11 presented in their genome the gen irgA besides the eight ones already described for the other strains. The antimicrobial resistance profile to 9 common antibiotics was also evaluated and the results showed that both the reference strain and the clinical isolates were resistant to ampicillin, amoxicillin, vancomycin, cefoperazone, piperacillin and trimethoprim. Besides being resistant to all antibiotics previously mentioned, the strain AB 36/11 also presented resistance to ciprofloxacin. The strain AB 17/11 was the one that exhibited the highest susceptibility since its resistance profile only included vancomycin, ciprofloxacin and trimethoprim. This microrganism’s susceptibility to the inclusion complexes (ICs) was determined by the microdilution method where minimum inhibitory concentrations (MIC) of resveratrol contained in the IC of 256 µg/mL for strains LMG 10828 and INSA 776 and 64 µg/mL for AB 36/11, AB 17/11 and INSA 593 were obtained. At this stage, the susceptibility of all strains to free RV was also assessed, obtaining a MIC of 100 µg/mL for the five strains studied. In order to determine the bacteriostatic or bactericidal action of ICs, time-kill curves were performed for a clinical (INSA 776) and an animal origin (AB 36/11) isolates, which showed that the observed bactericidal activity of the ICs was dependent on both incubation time and antimicrobial agent concentration. For IC concentrations corresponding to 2x and 4x MIC, cell viability is similar for both isolates, with the clinical origin isolate exhibiting a higher susceptibility when exposed to concentrations equal to MIC values. For free RV, the bactericidal effect occurs more quickly for 1x, 2x e 4xMIC in both isolates. The ICs mechanism of action was evaluated by flow cytometry for these two isolates, using SYTO® 40 fluorochrome for total cell staining and bis-(1,3-dibutylbarbituric acid)trimethine oxonol (BOX) and 5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride (CTC) for the evaluation of cell membrane potential and metabolic activity, respectively. Flow cytometry results showed that increasing IC concentration led to increased reduction of the metabolic activity of cells which, in turn, resulted in increased cell membrane depolarization. A microorganism’s ability to form biofilms is commonly associated with its increased virulence, colonization and resistance to antibiotics, thus being of extreme relevance to monitor these biofilms’ formation while studying new ways to prevent or inhibit their development. Given this, this work also evidenced ICs and free RV action on biofilm formation as well as dispersion of pre-formed biofilms showing a high reduction in the biofilm’s biomass for concentrations of 1x, 2x and 4x CMI. Overall, the results obtained in this work showed that the ICs exhibited antimicrobial activity over A. butzleri reference strain and isolates both in planktonic cells and biofilms, suggesting the application of these natural-origin formulations in the food industry to prevent Arcobacter spp. development.

Arcobacter butzleri é considerado o quarto agente de Campylobacter-like organism isolado a partir de amostras diarreicas em humanos. As fluoroquinolonas são normalmente utilizadas na primeira linha de tratamento de infeções severas causadas por Arcobacter spp.. A elevada frequência de resistência a esta classe de antibióticos observada em A. butzleri poderá constituir uma grande preocupação para a saúde pública. Assim, este trabalho tem como objetivo avaliar os mecanismos de resistência às fluoroquinolonas em A. butzleri, tendo como foco a contribuição de mutações espontâneas, bem como na sua diversidade, e no papel das bombas de efluxo. Inicialmente procedeu-se à determinação da concentração mínima inibitória (CMI) de estirpes suscetíveis a três fluoroquinolonas (ciprofloxacina, levofloxacina e moxifloxacina). Através do ensaio de flutuação foi determinada uma taxa média de mutação espontânea de 2.34x10-9 ± 1.72x10-9 para todas as estirpes de A. butzleri estudadas. Posteriormente, os mutantes foram avaliados pela determinação da concentração mínima inibitória e pela análise das mutações presentes na região determinante de resistência às quinolonas (RDRQ) dos genes gyrA e gyrB através da amplificação e sequenciação destas regiões. Todos os mutantes avaliados apresentaram resistência às fluoroquinolonas, tendo sido identificadas três mutações pontuais, uma já descrita para esta resistência em A. butzleri, a mutação Thr85Ile (C254T), e duas novas mutações nunca descritas em A. Butzleri, Asp89Asn e Asp89Gli (G265A e A266G respetivamente) na RDRQ da gyrA, associada à resistência, mas sem correlação com o valor de CMI. A influência do gene gyrB na resistência às fluoroquinolonas em A. butzleri foi também estudada, porém não foi verificada. Quando não foi observada relação entre resistência e mutação pontual no gene gyrA, os resultados sugerem um contributo das bombas de efluxo na resistência às fluoroquinolonas por parte de membros de A. butzleri. A transformação de uma estirpe suscetível permitiu validar o papel da mutação C254T na RDRQ do gene gyrA. Verificou-se ainda que a presença desta mutação, espontânea ou por transformação, parece não afetar a robustez de A. butzleri. Assim, os resultados sugerem que as mutações encontradas nos codões 85 e 89 da RDRQ da gyrA bem como a ação das bombas de efluxo estão na base da resistência às fluoroquinolonas.
Arcobacter butzleri is the fourth Campylobacter-like organism found in human diarrhoeal disease samples. The first line treatment for severe infections by Arcobacter spp. is based in the use of fluoroquinolones. The high frequency of resistance to this class of antibiotics found in A. butzleri strains could raise a significant public health concern. Thus, this work aimed to evaluate the mechanisms of resistance to fluoroquinolone in A. butzleri, with focus in the contribution of spontaneous mutations and their diversity, also in the contribution of efflux pumps. Firstly, the minimal inhibitory concentration (MIC) of the susceptible strains to three fluoroquinolones (ciprofloxacin, levofloxacin, and moxifloxacin) was determined. The spontaneous mutation rate was then calculated by a fluctuation assay procedure, where all the tested A. butzleri strains had an average rate of around 2.34x10-9 ± 1.72x10-9. After, the MIC for A. butzleri mutants derived from this assay was determined, followed by the analysis of target mutations in the quinolone resistance determining region (QRDR) of gyrA and gyrB through amplification and sequencing of these regions. The mutants were confirmed to be fluoroquinolone-resistant, where three different single point mutations were identified in QRDR of gyrA, one previously described to A. butzleri the mutation Thr85Ile (C254T), and two new mutations correlated with the fluoroquinolone resistance in A. butzleri Asp89Asn and Asp89Gli (G265A and A266G respectively); however with no direct correlation with the MIC value was found. The influence of gyrB in fluoroquinolone-resistance in A. butzleri was not confirmed. Nonetheless, for the cases where no point mutation was found in the gyrA gene, the obtained results suggest an influence of efflux pumps to fluoroquinolone-resistance. The role of C254T point mutation in gyrA QRDR was validated by transformation of a susceptible strain. The presence of this mutation, either arising spontaneously or by transformation, does not seem to have a cost to the fitness of A. butzleri. In sum, the results propose the mutations found in codons 85 and 89 of QRDR of gyrA, as well as, the action of efflux pumps as mechanisms behind the fluoroquinolone resistance in A. butzleri strains.

Thesis (Ph. D.)--University of Georgia, 2005.
Directed by Mark A. Harrison. Includes articles submitted to International journal of food microbiology, Journal of food protection and International journal of antimicrobial agents. Includes bibliographical references.