Letteratura scientifica selezionata sul tema "Voie du méthylérythritol phosphate (la voie du MEP)"

L'un des moyens de lutter contre la résistance aux antimicrobiens est de se concentrer sur des séries d'enzymes cibles sous-exploitées. Dans la plupart des bactéries et certains parasites, les précurseurs isoprénoïdes sont synthétisés par la voie du 2C-méthyl-d-érythritol 4-phosphate (MEP), absente chez l'homme, et qui représente donc une cible intéressante pour le développement de nouveaux anti-infectieux. IspH est une oxydoréductase contenant un cluster [4Fe-4S]2+ sensible à l'oxygène qui catalyse la dernière étape de la voie du MEP en convertissant l’HMBPP en IPP et DMAPP. Une stratégie pluridisciplinaire a été appliquée pour découvrir de nouvelles classes d'inhibiteurs contre l'IspH de Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis et Plasmodium falciparum. Une méthode a été mise au point pour produire les différents orthologues de l'IspH sous forme d'holoenzymes, suivie par le développement d'un test enzymatique qui a été utilisé pour un criblage in vitro de différentes chimiothèques. Cette dernière a conduit à la découverte d'un puissant nouvel inhibiteur ciblant les trois orthologues. En outre, une approche de prodrogue a été exploitée pour un inhibiteur d'IspH d'E. coli déjà connu ((E)-4-amino-3-méthylbut-2-en-1-yl diphosphate) dans le but d'obtenir une activité antibactérienne, antituberculeuse et antipaludéenne
One way to tackle the arising antimicrobial resistance is to focus on underexploited series of target enzymes. In most bacteria and some parasites, the isoprenoid precursors are synthesized via the 2C-methyl-d-erythritol 4-phosphate (MEP) pathway, which is absent in humans, and it thus represents an interesting target for the development of novel anti-infectives. IspH is an oxidoreductase containing an oxygen-sensitive [4Fe-4S]2+ cluster that catalyzes the last step of the MEP pathway converting HMBPP into IPP and DMAPP. A multidisciplinary strategy has been applied for the discovery of new classes of inhibitors against IspH from Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis and Plasmodium falciparum. A method was developed to produce the IspH orthologs as holoenzymes, followed by the development of the enzymatic assay which was used for an in vitro screening campaign of different chemical libraries. The latter led to the discovery of a novel potent inhibitor targeting the three orthologs object of this study. Moreover, a prodrug approach has been exploited for an already known E. coli IspH inhibitor ((E)-4-amino-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate) with the goal of reaching antibacterial, antitubercular, and antimalarial activity

Les isoprénoïdes sont des produits naturels présents chez tous les organismes vivants qui peuvent être synthétisés selon deux voies de biosynthèse différentes : la voie du mévalonate et la voie du méthylérythritol 4-phosphate (MEP). Les enzymes de la voie du MEP présentes chez de nombreux microorganismes mais absentes chez les animaux, représentent des cibles potentielles pour le développement de nouveaux médicaments contre les maladies causées par des bactéries pathogènes ou par des parasites. Dans cet objectif, l'élaboration d'inhibiteurs potentiels de cette voie a été envisagée. La désoxyxylulose réducto-isomèrase (DXR), une enzyme de la voie du MEP, a été choisie comme cible et des analogues de son substrat, le désoxyxylulose 5-phosphate, (DXP), ont été préparés puis leurs caractéristiques biochimiques (substrat, inhibiteur) ont été déterminées. La première partie de ce travail consiste en la mise au point d'une synthèse simple et efficace du DXP qui a été appliquée à la préparation de DXP marqué au deutérium, de son analogue non phosphorylé, le DX, et de DX marqué au deutérium. Ces composés ont été utilisés dans le cadre de collaborations. Dans une deuxième partie, la synthèse d'analogues phosphonates et fluorés du DXP est réalisée selon deux approches : une approche à partir de chirons et une approche par synthèse asymétrique. Les chirons utilisés sont des dérivés du L-tartrate. L'approche par synthèse asymétrique utilisée met en jeu une aldolisation asymétrique enzymatique. Au cours de ce travail une nouvelle méthode de synthèse d'un précurseur de la dihydroxyacétone phosphate (DHAP), substrat spécifique des aldolases, a été mise au point. L'activité biologique des analogues du DXP synthétisés a ensuite été évaluée in vitro sur la DXR et in vivo sur des souches d'E. Coli. Nous avons pu montrer que l'analogue phosphonate du DXP est substrat de la DXR et que les autres composés synthétisés se comportent comme des inhibiteurs
Isoprenoids are natural compounds present in all living organism and can be synthesised via two different biosyntheses: the mevalonate pathway or the methylerytritol phosphate pathway (MEP). The enzymes involved in the MEP pathway are present in many microorganisms but absent in animal cells and therefore are potential targets for the design of new drugs acting on the diseases cause by pathogenic bacteria or parasites. In this purpose, the elaboration of potential inhibitors of this pathway has been considered. The deoxyxylulose 5-phosphate reducto-isomerase (DXR), one of the enzymes of the MEP pathway, has been chosen as a target. The synthesis of analogues of deoxuxylulose phosphate (DXP), the natural substrate of the DXR has been developed and their biochemical properties (substrate, inhibitor) have been determined. The first part of this work is the elaboration of a practical and efficient synthesis of DXP. This relevant synthesis allowed the preparation of deuterium labelled DXP, and its non phosphorylated analogue, DX, with a possible deuterium labelling at C-5. All these compounds were used for investigations on the MEP pathway. In a second part, phosphonate and fluorinated analogues of DXP have been synthesised via two different approaches: one from chirons and the other one from asymmetric synthesis. Compounds derived from the L-tartrate ester were used as chirons for the synthesis of the analogues of DXP. Such compounds were prepared by using biocatalysts: the aldolases, allowing an asymmetric aldolisation reaction. Due to the specific substrate of aldolases, the dihydroxyacetone phosphate (DHAP), a short and efficient synthesis of a precursor of DHAP, has been developed. The biological activity of the synthesised compounds was then determined in vitro on the DXR and in vivo on E. Coli. We found that the phosphonate analogue of DXP is substrate of DXR and that the other analogues are inhibitors

LytB, une protéine à centre [4Fe-4Sy+, catalyse la réduction de l'HMBPP en IPP et DMAPP dans la voie du méthylérythritol phosphate. Comme le cluster Fe/S est sensible à l'oxygène, l'enzyme doit être reconstituée en présence de FeCh, Na2S, et DTT ou purifié dans une boîte à gants contenant moins de 2 ppm d' oxygène. Deux tests enzymatiques ont été développés pour déterminer les paramètres cinétiques de LytB. La méthode par radiomarquage mesure directement la quantité de produits formés alors que le test spectrophotométrique est fondé sur le changement de l'absorbance du NADPH en relation avec la flavodoxine réductase et la flavodoxine, le système de réduction associé à LytB. Le Km de LytB obtenu par le test par radiomarquage est différent du Km publié par les concurrents, mais en accord avec le résultat obtenu dans le laboratoire. En raison de la limite de détection du spectrophotomètre, le Km exact ne peut pas être déterminé par cette méthode. LytB reconstituée et LytB purifée en boîte à gants montrent des Km similaires. Le mécanisme de LytB a été étudié en utilisant deux analogues d'HMBPP. Ces analogues ne sont pas substrats de LytB, mais inhibiteurs compétitifs et réversibles. L'un des deux analogues est un inhibiteur de type slow binding. D'après le test par radiomarquage, les Ki des deux inhibiteurs sont au niveau nanomolaire. L'origine de la voie de la biosynthèse du caoutchouc naturel a été étudiée chez Ficus elastica par incubation in vivo de [l-l3C]glucose. Les protocoles pour isoler trois isoprénoïdes, (ficaprénols, phytol et P-sitostérol) ont été mis au point, mais la voie de la biosynthèse des ficaprénols n'a pas pu être identifiée, le glucose marqué n'ayant pas été incorporé
LytB, a [4Fe-4S] ~+ protein, catalyzes the reduction of HMBPP to IPP and DMAPP in the methylerythritol phosphate pathway. Due to the oxygen sensitivity of the Fe/S cluster, the enzyme had to be reconstituted with FeCI3, Na2S, and OTT or purified in the glove box containing less than 2 ppm of oxygen. Two enzymatic assay methods were developed to determine LytB kinetic parameters. The radiometric method counts directly the amounts of products formed whereas the spectrophotometric method is based on the change in NADPH absorbance, which in combination with flavodoxin reductase (FpRl) and flavodoxin (FldA) forms the reducing system required for the reaction. The Km of LytB for HMBPP measured from the radiometric method was different from the Km published by a competitor group but was in agreement with the previous results obtained in the laboratory. Due to the limit in sensitivity of the spectrophotometer, the exact Km cannot be determined from the spectrophotometric tests. Both reconstituted and glove box purified LytB gave the same range of Km. The mechanism of LytB was investigated using two HMBPP analogues. Tests showed that these analogues were not substrates of LytB but reversible and competitive inhibitors. One of these two analogues is a slow binding inhibitor. According to the radiometric method, the Ki of both inhibitors were in the nanomolar range. Attempts were made to identify the biosynthetic route of natural rubber in Ficus elastica. The isolation protocols of the key isoprenoids, (ficaprenols, phytol, and P-sitosterol) from this plant have been developed, but the biosynthesis route of ficaprenols could not be assessed

La résistance de plus en plus importante des microorganismes aux antibiotiques et antiparasitaires actuels, nous incite à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour lutter contre ces agents pathogènes. Les isoprénoïdes constituent une vaste famille de composés naturels présents chez tous les organismes vivants. Ils peuvent être biosynthétisés selon deux voies: la voie du mévalonate et la voie du 2-C-méthylérythritol 4-phosphate (MEP) ; Cette dernière voie est présente chez de nombreux microorganismes pathogènes ou parasites, mais absente chez l’homme. La voie de biosynthèse des isoprénoïdes selon la voie du MEP devient donc une cible parfaite pour identifier de nouveaux antimicrobiens. Dans cette optique, nous avons choisi de synthétiser dans une première partie six prodrogues de deux acides phosphoniques déjà synthétisés au laboratoire. Ces derniers, dérivés de la fosmidomycine, s’étant déjà distingués par leur pouvoir inhibiteur sur la DXR d’Escherichia coli. Ces prodrogues ont été testées sur des cultures de cellules de tabac, les BY-2 ainsi que sur une bactérie, Mycobacterium smegmatis. Les résultats obtenus sur BY-2 révèlent que ces prodrogues sont de meilleurs inhibiteurs que la fosmidomycine et qu’ils sont toujours actifs à des concentrations auxquelles la fosmidomycine n’a plus aucun effet. Parallèlement à ce travail une synthèse de MEP sous forme de prodrogue a été envisagée ; malgré les différents groupements utilisés pour masquer le phosphate ainsi que les nombreux jeux de protections et déprotections, le MEP prodrogue n’a pu être obtenu. Dans une troisième partie nous nous sommes intéressés à la synthèse de la DHAP (dihydroxyacétonephosphate) qui est une petite molécule hautement fonctionnalisée intervenant dans bon nombre de voies métaboliques. La synthèse mise au point dépasse par sa simplicité et son efficacité toutes les préparations de DHAP réalisées à ce jour. La dernière partie de ce travail est consacrée à l’étude de la sélectivité de la première enzyme de la voie du MEP, la désoxyxylulose phosphate synthase (DXS). Pour ce faire, nous avons tenté de synthétiser le L-GAP (L-glycéraldéhyde 3- phosphate) qui est l’énantiomère du substrat naturel de la DXS. Malgré les différents chemins réactionnels testés, cette synthèse n’a pu être menée à son terme
Isoprenoïds are components of the vast family of « natural compounds » present in all living organisms. They are biosynthetically obtained by two distinct pathways: the mevalonate pathway and the 2-C-methylerithritol 4-phosphate pathway; the latter is present in numerous pathogenous microorganisms and parasites. Growing microorganism resistance to antibiotics and antiparasitics forces us to identify new therapeutic targets to fight against pathogens. The great advantage of the 2-C-methylerithritol 4-phosphate pathway is that it is absent in humans thus being the ideal target to discover new antibiotics. To that end, we decided to synthesize six prodrugs derived from two phosphonic acids previously obtained in our research group. The latter, directly related to fosmidomycin were proven to be potent inhibitors of E. Coli’s DXR enzyme. The new prodrugs were tested on tobacco cell cultures, on BY-2 as well on Mycobacterium smegmatis. Results obtained on BY-2 show that our prodrugs are stronger inhibitors than fosmidomycin. Moreover, they still have an inhibitory effect on very low concentrations were fosmidomycin does not. In addition, organic synthesis of 2-C-methylerithritol 4-phosphate was studied. Though various protecting groups of the phosphate moiety were used and numerous protection / deprotection steps were tested, 2-C-methylerithritol 4-phosphate was never obtained. We then pursued our efforts on synthesizing dihydroyacetone phosphate, a small organic compound found in various metabolic pathways. The organic synthesis we propose surpasses all others by its simplicity and efficiency. Finally, we tried to synthesize L-glyceraldehyde 3-phosphate; this compound is the enantiomericaly pure substrate of DXS (deoxyxylulose phosphate synthase). Though many different synthetic schemes were tested, none of them yielded the desired product

Les isoprénoïdes, présents dans tous les organismes vivants, sont synthétisés selon deux processus: la voie du Mevalonate et la voie Méthylérythritol phosphate (MEP). Cette dernière, absente chez l’humain, est très étudiée car elle représente une cible pour le développement de nouveaux antimicrobiens. Le ME-N3, un analogue du méthylérythritol portant un azoture, a été synthétisé et exploité dans des expériences de marquage métabolique de la voie MEP en utilisant un couplage bioorthogonale suivi d’une analyse par LC/MS. De façon intéressante, nous avons découvert que le MEP-N3, un analogue du MEP, inhibe l'enzyme IspD d’ E. coli (3ème enzyme de la voie MEP). Les études cinétiques ont révélé que le MEP-N3 possède la meilleure activité inhibitrice sur IspD d’ E.coli en comparaison avec les inhibiteurs connus, et que le mécanisme d'inhibition est de type mixte. Une étude détaillée du mécanisme de la réaction catalysée par IspD a été réalisée pour la première fois, en utilisant une analyse cinétique à deux substrats
Isoprenoids, present in all living organisms, are synthesised according to two routes: the Mevalonate and the Methylerythritol phosphate (MEP) pathways. The MEP pathway, absent in humans, is extensively investigated as it is a target for the development of new antimicrobials. ME-N3 an azide tagged analogue of methylerythritol was synthesised and utilised for metabolic labelling studies of the MEP pathway using bioorthogonal ligation followed by LC-MS analysis. Interestingly, we found that MEP-N3, an analogue of MEP, inhibits E.coli IspD (3rd enzyme of the MEP pathway). Further inhibition kinetic studies revealed that MEP-N3 possesses the highest inhibitory activity on E.coli ispD when compared to known inhibitors. In addition, the mechanism of inhibition of E.coli ispD by MEP-N3 was found to be best described using a mixed type model. Moreover, determination of the IspD reaction mechanism has been carried out for the first time, by virtue of a bisubstrate steady state kinetic analysis

Catharanthus roseus est une plante tropicale qui produit spécifiquement des alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) d’intérêt thérapeutique. Chez C. roseus, la branche terpénique incluant la voie du méthylérythritol phosphate (MEP) est considérée comme limitante et présente une régulation transcriptionnelle coordonnée en réponse aux hormones inductrices de l’accumulation alcaloïdique. Lors de ce travail, suite à des analyses bioinformatiques et à la caractérisation de promoteurs de gènes de la voie MEP, nous avons identifié de nouvelles familles de facteurs de transcription impliquées dans la régulation de la biosynthèse des AIM. Des membres de la famille des ZCT, des WRKY et des RR type B interagissent avec le promoteur du gène hds de la voie MEP et régulent son activité. Ces travaux ont permis d’approfondir les connaissances sur les réseaux transcriptionnels régulateurs de la biosynthèse des AIM. L’utilisation de ces nouveaux facteurs de transcription activateurs peut désormais être envisagée dans le cadre d’expériences d’ingénierie métabolique afin d’augmenter l’accumulation d’alcaloïdes d’intérêt pharmaceutique chez C. roseus
Catharanthus roseus is a tropical plant producing specifically monoterpene indole alkaloids (MIA) of high interest due to their therapeutical values. In C. roseus cells, the terpenoid branch including the methyl erythritol phosphate pathway (MEP) provides the MIA terpenoid moiety and is regarded as limited for MIA biosynthesis. This branch presents a coordinated transcriptional regulation in response to hormonal signals leading to MIA production. In this context, bioinformatic analysises and functional characterization of MEP pathway gene promoters allowed the identification of new transcription factor families involved in the MIA pathway regulation. Members of ZCT proteins, WRKY and type B RR families specifically interact with the hds promoter from the MEP pathway and regulate its activity. This work permits to gain into insight the transcriptional network controlling the MIA biosynthesis. It is possible now to consider using transcription factor that act as activators and target genes from the terpenoid branch to increase the accumulation of alkaloids of pharmaceutical interest in C. roseus by metabolic engineering approaches

Les alcaloïdes indoliques monoterpéniques (AIM) sont des molécules à propriétés anti-tumorales extraites de Catharanthus roseus. Leur coût de production et les besoins encore importants de ces médicaments en chimiothérapie, en font des cibles majeures pour la recherche de stratégies de production plus efficaces. L’objectif de ce travail vise à identifier de nouveaux facteurs de transcription (FT) régulateurs de la production des AIM. Cette étude porte plus particulièrement sur la caractérisation fonctionnelle et l’implication dans la régulation de la biosynthèse des AIM, de protéines de la famille des WRKY (CrWRKYs) et des protéines de type doigt de zinc (ZCTs) précédemment isolées au sein de l’EA2106 « Biomolécules et Biotechnologies Végétales ». Nos expériences ont révélé que, parmi ces protéines, CrWRKY22, CrWRKY32, ZCT1 et ZCT2 agissent en tant que facteurs de transcription et plus spécifiquement interagissent avec le promoteur du gène Crhds. Ce dernier code une enzyme de la voie du méthyl érythritol phosphate (MEP) considérée limitante pour la production des AIM. Ces travaux ont permis d’identifier de nouveaux FT ciblant la voie du MEP dont la régulation via les FT est encore peu élucidée à ce jour et d’envisager leur utilisation en ingénierie métabolique pour augmenter la production d’AIM par la modulation du flux terpénique chez C. roseus
Monoterpene indole alkaloids (MIA) are molecules with anti-cancer properties from Catharanthus roseus. Their production cost and the important need in chemiotherapy make them major targets for the research of more efficient production strategies. The aim of this work is to identify new transcription factors (TF) that regulate MIA production. This study focuses especially on the functional characterization and the involvement in the MIA biosynthesis regulation, of proteins previously isolated in the EA2106 “Plant Biocompounds and Biotechnology” laboratory: 3 proteins that belong to the WRKY family (CrWRKYs) and 3 zinc finger proteins named ZCTs. Our experiments revealed that among them, CrWRKY22, CrWRKY32, ZCT1 and ZCT2 act as transcription factors and more specifically interact with the promoter of Crhds gene. Crhds encodes an enzyme of the methyl erythritol phosphate (MEP) pathway that is considered as limiting for MIA production. Our work allowed identifying new TFs targeting the MEP pathway those regulation through TFs is mostly unknown. Using such transcription factors in metabolic engineering could be now considered increasing MIA production by the modulation of terpenoid flux in C. roseus