Letteratura scientifica selezionata sul tema "Vésicules géantes unilamellaires (GUVs)"

Le transport intracellulaire met en jeu des vésicules et nécessite ainsi des modifications de la membrane plasmique. En particulier, des nanotubes de membrane de quelques dizaines de nanomètres peuvent se former. Nous avons mis en place un système biomimétique à base de liposomes pour décrypter les mécanismes de changement de forme membranaire, en particulier sous l’action du cytosquelette d’actine. La physique des tubes de membrane est bien connue, notamment la force nécessaire au maintien de ce type de tube, qui dépend de l’élasticité de courbure du liposome et de sa tension de membrane imposée par l’aspiration d’une micropipette. En utilisant une diode quatre quadrants, nous avons atteint une résolution temporelle de l’ordre de 4 µs, et une résolution en termes de force plus précise que le pN. Ce montage permet pour la première fois d’étudier les fluctuations de tels tubes. Cette thèse ouvre la voie à l’étude des effets de la polymérisation d’actine sur ces nanotubes
Intracellular transport involves membrane compartments and thus requires dynamic changes in the morphology of cell membranes. In this case, membrane tubes are formed whose radius is of the order of several tens of nanometers. We develop biomimetic systems based on model lipid membranes to decipher the mechanisms of membrane remodelling in particular under the action of the actin cytoskeleton. The mechanics of membrane nanotubes, especially the force needed to form and maintain a nanotube, are now well understood. The force depends on the curvature elasticity of the membrane and on its mechanical tension that is controlled in our experiment by micropipette aspiration. By using a four-quadrant diode, we obtain an unprecedented temporal resolution, in the order of 4 µs, and a force resolution under pN. This setup allows us to access unrivaled membrane nanotube properties.This thesis paves the way for studying the effect of actin dynamics on membrane nanotubes

Il est difficile d'étudier in vivo le rôle de la membrane dans l'excitabilité des cellules car les paramètres pertinents (composition et état mécanique de la membrane, densité de canaux...) sont activement régulés par la cellule elle-même et donc difficilement ajustables expérimentalement. J'ai donc développé une méthode pour reconstituer un canal voltage-dépendant dans une membrane où ces paramètres peuvent être contrôlés. Pour cela j'ai exprimé, purifié et marqué KvAP, un canal potassique voltage-dépendant. J'ai ensuite adapté une méthode existante pour le reconstituer dans des Vésicules Unilamellaires Géantes (GUVs). J'ai mesuré la densité des canaux dans les GUVs grâce à la microscopie confocale. Des expériences d'électrophysiologie ont, de plus, montré que le canal reste fonctionnel après reconstitution. Ce système m'a permis d'étudier tout d'abord l'affinité du canal pour les membranes courbées. Pour cela, j'ai tiré des nanotubes de rayon contrôlé à partir de ces GUVs et j'ai mesuré la distribution du canal entre la vésicule et le tube par microscopie confocale. J'ai montré que le canal est enrichi dans le tube proportionnellement à sa courbure. Ce résultat est en accord avec une théorie basée sur l'élasticité de la membrane. Nous avons également étudié l'effet du confinement de la membrane sur la diffusion de KvAP. Par des expériences de suivi de particule unique, nous avons montré que le coefficient de diffusion le long du tube diminue d'un facteur 3 lorsque le rayon du tube décroît de 250 à 10 nm. Ce résultat est en accord avec le modèle hydrodynamique de Saffman et Delbrück appliqué à la géométrie cylindrique.

Le but de ce travail était de développer des modèles mécaniques de cellules basés sur les vésicules lipidiques géantes unilamellaires (GUVs) et d'étudier les relations entre paramètres mécaniques et comportements sous contraintes. Nous avons tout d'abord réussi à modifier les propriétés structurelles des membranes soit en les décorant de polyélectrolytes (chitosane ou acide hyaluronique), soit en utilisant la transition de phase des lipides pour obtenir des membranes en phase gel. La caractérisation des membranes décorées a montré l'origine électrostatique de l'interaction polyélectrolyte/membrane, et a mis en évidence le rôle de la structure chimique des polymères sur leur conformation à la surface des vésicules. Concernant les membranes en phase gel, nous proposons un protocole astucieux permettant de préserver la forme sphérique de GUVs lors de la diminution de température. Nous avons ensuite montré que la structure de la membrane influence fortement la valeur des paramètres mécaniques et le comportement des GUVs complexes soumises à différentes contraintes (pression osmotique, chocs de pH et de sel, compression entre deux plans (microscopie à force atomique) ou force ponctuelle (extrusion de nanotubes de membrane)). Les expériences d'AFM ont révélées que la décoration rigidifie les membranes, augmentant notamment leur module de compressibilité. Le dégonflement osmotique de GUVs en phase gel a mis en évidence une grande variété de formes polyédriques, que nous avons pu retrouver numériquement en utilisant un modèle 2D élastique adapté. Nous avons enfin proposé une technique originale pour caractériser les vésicules en étudiant leur écoulement dans des géométries confinées.

Mimer les propriétés des cellules vivantes dans des protocellules artificielles suscite un intérêt considérable, notamment pour reproduire la motilité et le mouvement directionnel dans des applications de thérapies « intelligentes ». En raison de leur morphologie vésiculaire et de leur stabilité, les polymersomes présentent un grand potentiel pour la délivrance de médicaments, et l'introduction d'une asymétrie est essentielle pour permettre leur auto-propulsion. Bien que plusieurs approches, telles que la séparation de phase au sein de la membrane, aient été utilisées pour créer des polymersomes asymétriques, le choix des polymères appropriés reste un défi. Cette thèse de doctorat vise à concevoir des polymersomes asymétriques, de type Janus, capables de s'auto-propulser grâce à la décomposition enzymatique du glucose. Nous décrivons le développement de vésicules géantes unilamellaires de type Janus (JGUVs) par séparation de phase au sein de la membrane de deux copolymères à blocs distincts composés de blocs hydrophobes chimiquement incompatibles. En utilisant la théorie de Flory-Huggins, nous démontrons que les copolymères peuvent être rationnellement sélectionnés et conçus pour s'auto-assembler en polymersomes asymétriques, avec une séparation de phase modulable selon des paramètres tels que la composition, la masse molaire et la température. Notre méthode prédictive s'est avérée efficace pour les techniques d'auto-assemblage avec et sans solvant, permettant l'élaboration de diagrammes de phase génériques corrélant l'énergie libre de mélange à la morphologie des polymersomes, fournissant ainsi des indications clés pour la conception de JGUVs. Nous montrons également que la présence de solvant lors de la formation des vésicules permet d'étendre la gamme des polymères incompatibles pouvant être utilisés. De plus, nous avons réussi à contrôler, grâce à l'extrusion, la taille des vésicules tout en préservant leur morphologie Janus et avons montré que les JGUVs ainsi obtenus pouvaient être stables pendant plusieurs mois. Enfin, nous avons fonctionnalisé asymétriquement les JGUVs avec l'enzyme glucose oxydase par chimie click, et une étude préliminaire sur leur dynamique en présence de glucose est présentée, fournissant des indications pour leur utilisation comme micromoteurs
Mimicking the properties of living cells in artificial protocells has attracted significant interest, particularly for replicating motility and directional swimming for applications in smart therapeutics. Due to their vesicular and stable morphology, polymersomes hold great promise for drug delivery, and the introduction of asymmetry is crucial to enable self-propulsion. While several approaches, such as phase separation within the membrane, have been used to create asymmetric polymersomes, the selection of appropriate polymers remains a challenge. This PhD thesis aims at designing asymmetric, Janus-like polymersomes capable of self-propulsion, and powered by enzymatic glucose decomposition. We describe the development of Janus Giant Unilamellar Vesicles (JGUVs) through phase separation within the membrane of two distinct block copolymers comprising chemically incompatible hydrophobic blocks. We demonstrate, using the Flory-Huggins theory, that copolymers can be rationally selected and designed to self-assemble into asymmetric polymersomes, with tunable phase separation driven by parameters such as composition, molecular weight, and temperature. Our predictive method proves to be effective for both solvent-free and solvent-switch self-assembly processes, enabling the elaboration of generic phase diagrams correlating mixing free energy with polymersome morphology, providing valuable insights for JGUVs design. We also evidence that the presence of solvent during the vesicle formation broadens the range of incompatible polymers that can be used. Additionally, we successfully control, thanks to extrusion, the vesicle size while preserving their Janus morphology and evidence that the resulting JGUVs could be stable for several months. Furthermore, we asymmetrically functionalized JGUVs with glucose oxidase enzymes via click-chemistry, and a preliminary study on their dynamic behavior in the presence of glucose is presented, looking forward to their potential use as micromotors

L'électroperméabilisation est un procédé fondé sur l'application d'impulsions électriques qui peuvent induire une perméabilisation réversible de la membrane plasmique de cellules vivantes. En d'autres termes: si vous soumettez une cellule à des impulsions électriques d'amplitude et de durée judicieusement choisies, vous serez alors en mesure d'introduire dans son cytoplasme des molécules d'intérêt autrement incapables de traverser son enveloppe externe, et ce sans affecter sa viabilité. Cette technique a donné lieu à diverses applications, notamment dans le cadre de la lutte contre le cancer ou des thérapies géniques. Comportant moins de risques que les méthodes de transfection virales ou chimiques, son usage est de plus en plus répandu dans la communauté médicale. Cependant, les processus de réorganisation de la membrane, au niveau microscopique, sont encore méconnus et sujets à débat. Une meilleure description de ces phénomènes permettrait d'améliorer l'efficacité et la sécurité des protocoles de traitement. Une stratégie possible pour accroître notre compréhension de l'électroperméabilisation consiste en la réalisation d'expériences sur des systèmes modèles. Cette thèse aborde l'étude de l'effet d'impulsions électriques perméabilisantes de longue durée (quelques millisecondes) sur des systèmes lipidiques artificiels, des vésicules unilamellaires géantes. Il est décrit comment ce travail sur systèmes modèles a contribué à améliorer notre compréhension fondamentale de l'électroperméabilisation, mais aussi comment il a donné lieu à deux catégories d'applications: le chargement de vésicules avec des macromolécules et la mesure de grandeurs physiques caractéristiques des bicouches lipidiques, les tensions de bord. Ces recherches comportent aussi un aspect de modélisation de l'entrée dans des cellules électroperméabilisées de différentes molécules, via la résolution numérique d'équations aux dérivées partielles gouvernant l'évolution de leur concentration. Cette partie apporte des éléments de réponse visant à expliquer les différences observées expérimentalement entre le transfert de petites et de macro-molécules
Electropermeabilization is a process based on the application of electric pulses which can induce a transient permeabilization of the cell plasma membrane. If you submit a cell to a sequence of electric pulses with appropriate amplitude and duration, you will manage to introduce in the cytoplasm some molecules otherwise unable to cross the external envelope, and to do so without decreasing cell viability. This technique has led to various applications, notably in the fight against cancer and in the field of gene therapy. Being safer than chemical and viral transfection methods, it has become increasingly popular among the medical community. However, membrane reorganization processes at the microscopic level are not yet fully understood, and are still a matter of debate. A better description of these phenomena would allow to improve the efficiency and the safety of the clinical protocols. In this prospect, a possible strategy consists in the study of electric field effects on model systems. This thesis focuses on the influence of long duration (in the millisecond range) electric pulses on artificial lipid systems, giant unilamellar vesicles. It explains how these studies on model systems contributed to our fundamental knowledge of electropermeabilization, and also how they resulted in two practical applications: a method for loading liposomes with macromolecules, and a method for measuring a characteristic physical property of lipid bilayers, the edge tension. It also contains a part where the entry of different molecules into electropermeabilized cells was studied via the numerical resolution of partial differential equations governing the evolution of the molecule concentration. This part of the thesis brings some clues for understanding the experimentally observed different behaviours between the electrotransfer of small and macromolecules

L'obésité est une maladie définie par une accumulation de masse grasse dans le tissu adipeux ayant des conséquences néfastes pour la santé. Les causes de l’obésité sont multiples. Dans un travail récent, il y a été démontré le rôle de la pollution environnementale dans la prise de poids. Dans ce travail, les hypothèses selon lesquelles les récepteurs adrénergiques situés à la surface des cellules adipeuses seraient le siège de l’action des polluants aromatiques polycycliques ont été vérifiées par le dosage de plusieurs agonistes et antagonistes spécifiques et non spécifiques en présence ou non du benzo[a]pyrène sur des récepteurs humains et de cellules d’hamster chinois (CHO). Les quantités d’AMPc obtenues montrent que les HAP ne se déposent pas sur les récepteurs β1, β2, β3 adrénergiques.Cette accumulation se fait au niveau des phospholipides de la membrane cytoplasmique des cellules. Ce qui cause une rigidité des membranes.Cette observation tend à renforcer l'hypothèse selon laquelle le benzo[a]pyrène induirait une inhibition de la lipolyse par l'accumulation au niveau de la bicouche de phospholipides et des changements de conformation de la bicouche de phospholipides dans les environs des récepteurs à sept domaines transmembranaires qui sont β-adrénergiques.La liaison de la bicouche phospholipidique avec les HAP utilisés est une réaction exothermi-que avec un faible dégagement de chaleur
Obesity is a disease defined by an accumulation of fat in adipose tissue with adverse consequences for health. The causes of obesity are many.In recent work, there was demonstrated the role of environmental pollution in weight gain.In this work, the assumptions that the adrenergic receptors on the surface of fat cells would home to the accumulation of polycyclic aromatic pollutants have been verified by measurement of several agonists and antagonists specific and non-specific in the presence or absence of benzo[a]pyrene receptors on human cells and Chinese hamster (CHO). The amounts of cAMP obtained showed that PAHs are not deposited on β-receptors, β1, β2, β3 adrenergic receptors.This accumulation occurs at the cytoplasmic membrane phospholipids of the cells. What cau-ses stiffness of the membranes. This observation tends to reinforce the hypothesis that benzo [a]pyrene induce an inhibition of lipolysis by the accumulation in the phospholipid bilayer and conformational changes of the bilayer phospholipids in the vicinity of receptors seven transmembrane domains which are β-adrenergic receptors

L'électroperméabilisation est un procédé fondé sur l'application d'impulsions électriques qui peuvent induire une perméabilisation réversible de la membrane plasmique de cellules vivantes. En d'autres termes: si vous soumettez une cellule à des impulsions électriques d'amplitude et de durée judicieusement choisies, vous serez alors en mesure d'introduire dans son cytoplasme des molécules d'intérêt autrement incapables de traverser son enveloppe externe, et ce sans affecter sa viabilité. Cette technique a donné lieu à diverses applications, notamment dans le cadre de la lutte contre le cancer ou des thérapies géniques. Comportant moins de risques que les méthodes de transfection virales ou chimiques, son usage est de plus en plus répandu dans la communauté médicale. Cependant, les processus de réorganisation de la membrane, au niveau microscopique, sont encore méconnus et sujets à débat. Une meilleure description de ces phénomènes permettrait d'améliorer l'efficacité et la sécurité des protocoles de traitement. Une stratégie possible pour accroître notre compréhension de l'électroperméabilisation consiste en la réalisation d'expériences sur des systèmes modèles. Cette thèse aborde l'étude de l'effet d'impulsions électriques perméabilisantes de longue durée (quelques millisecondes) sur des systèmes lipidiques artificiels, des vésicules unilamellaires géantes. Il est décrit comment ce travail sur systèmes modèles a contribué à améliorer notre compréhension fondamentale de l'électroperméabilisation, mais aussi comment il a donné lieu à deux catégories d'applications: le chargement de vésicules avec des macromolécules et la mesure de grandeurs physiques caractéristiques des bicouches lipidiques, les tensions de bord. Ces recherches comportent aussi un aspect de modélisation de l'entrée dans des cellules électroperméabilisées de différentes molécules, via la résolution numérique d'équations aux dérivées partielles gouvernant l'évolution de leur concentration. Cette partie apporte des éléments de réponse visant à expliquer les différences observées expérimentalement entre le transfert de petites et de macromolécules.

L'étude présentée illustre l'interaction entre un agent pathogène et sa cellule hôte en caractérisant un processus d'endocytose non conventionnelle. Nous avons mis évidence à l'aide d'un système modèle de membranes cellulaires, les Vésicules Unilamellaires Géantes, les étapes précoces d'endocytose des toxines de Shiga. Ce travail, réalisé en collaboration avec des biologistes de l'UMR 144 de l'Institut Curie, et des physiciens de l'UMR 7083 de l'ESPCI, montre que la toxine de Shiga est capable, après liaison spécifque avec son récepteur lipidique, le Gb3, de réorganiser la membrane et d'induire des déformations tubulaires dirigées vers l'intérieur des vésicules. Le système modèle reproduit les observations faites sur des cellules, où les toxines liées à la membranes plasmique sont capables seules de promouvoir l'initation de leur propre endocytose. Nous avons proposé que la formation de domaines riches en toxines et en Gb3 lors de la liaison de la Shiga à la membrane induisait localement, sur un feuillet une compaction de la membrane et donc une courbure locale spontanée. Nous avons étudié l'influence de la composition lipidique sur la présence d'invaginations et montré que les tubules sont enrichis en toxines, mais aussi près de la limite de phase, en glycolipides n'interagissant pas avec la toxine. Enfn, en s'appuyant sur des techniques de caractérisation mécanique des membranes, nous avons montré que la toxine ne se liait pas sur des membranes courbées positivement (jusqu'à 100 nm de rayon) ; ensuite nous avons mesuré le dépliement des tubules en fonction de la tension appliquée à la membrane et confronté les résultats à un modèle thermodynamique à l'équilibre.

Les propriétés mécaniques de la membrane cellulaire contrôlent de nombreux processus biologiques. Les vésicules unilamellaires géantes (GUV) sont une approche facile pour reproduire la membrane cellulaire. L'aspiration par micropipettes est une technique bien connue utilisée pour caractériser leurs propriétés mécaniques, bien qu'elle implique une expérimentation de longue durée pour une mesure et une configuration complexe. Nous avons développé des plates-formes microfluidique visant à intégrer l'aspiration par micropipettes. Un avantage crucial de l'approche la plus avancée que nous avons mise en place est la flexibilité en termes de forme que nous pouvons fabriquer (en particulier forme de piège cylindrique). Cette approche permet également de multiplexer des micropipettes, offrant des mesures à haut débit, et enfin la possibilité de fabriquer les éléments composant la micropipette par centaines à la fois. Nous avons d'abord pu caractériser des compositions lipidiques simples telles que DOPC, POPC et Brain SM, dont les modules de courbure et d'étirement étaient en très bon accord avec les valeurs rapportées dans la littérature. Nous avons également caractérisé l'effet du cholestérol sur les membranes DOPC : le cholestérol augmentait le module d'étirement de la membrane DOPC mais n'affectait pas son module de courbure, rendant ainsi la membrane plus rigide. De plus, nous avons caractérisé la membrane DOPC contestée avec des nanoparticules de copolymères, généralement utilisées pour l'administration de médicaments. Ces nanoparticules ont induit un ramollissement de la membrane, qui pourrait être dû à l'effet de perméabilisation des NP sur la membrane, ou à leur insertion dans les membranes provoquant des défauts. Cette méthode étant polyvalente, en changeant la forme de la micropipette cylindrique en une section transversale permettant de piéger les GUV avec un écoulement résiduel autour d'elle, nous avons pu avoir une caractérisation préliminaire de l'effet de l'écoulement sur la fluidité des membranes. Enfin, nous avons adapté la taille de la micropipette afin de caractériser les propriétés viscoélastiques des sphéroïdes, agrégats de cellules cancéreuses 3D. Nous avons caractérisé la viscosité des cellules cancéreuses du pancréas et démontré qu'elle est indépendante de la taille des sphéroïdes
The mechanical properties of the cell's membrane control many biological processes. Giant Unilamellar vesicle (GUV) are an easy approach to reproduce cells membrane. Micropipette aspiration is a well-known technique used to characterize their mechanical properties, though it involves long time experimentation, and huge set up. Here we present a microfluidic platform that reproduce micropipette aspiration especially by its cylindrical trap form. The main advantage is the flexibility in terms of the shape we can fabricate, as well as the multiplexing micropipette, offering high throughput measurements and finally the ability to fabricate the elements composing the micropipette by hundreds at a time. We were able first to characterize simple lipid compositions such as DOPC, POPC and Brain SM, whose bending and stretching moduli are in very good agreement with the values reported in the literature. We also characterized the effect of cholesterol on DOPC membranes: cholesterol does increase the stretching modulus of DOPC membrane but does not affect its bending modulus, making therefore the membrane stiffer. Moreover, we characterized DOPC membrane challenged with co-polymers nanoparticles which are usually used for drug delivery and which showed a softening in the membrane which could be due to the permeation effect of the NP on the membrane. As this method is versatile, by changing the shape of the cylindrical micropipette to a cross section which allows the GUVs to be trapped with a residual flow around it, we were able to have a preliminary characterization of the effect of flow on the membranes' fluidity properties. Finally, we adapted the size of the micropipette in order to characterize the viscoelastic properties of spheroids made of cancer cells. We characterized the viscosity of pancreatic cancer cells and demonstrated that it is independent on the spheroids size