Tesi sul tema "Tripuna"

Orientador: Sergio Marangoni
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-07-26T17:22:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JoseAntonioda_M.pdf: 9541917 bytes, checksum: add850a1bcd914f9e54f920e79088cf3 (MD5) Previous issue date: 2000
Resumo: Os inibidores foram isolados de TOI em sementes de Copaifera langsorffii, conhecida vulgarmente por Copaíba, uma árvore nativa do Brasil da subfamília Caesalpinoideae da família Leguminosae. A fração TOI foi purificada a partir de precipitação com sulfato de amônio, cromatografia em uma coluna de troca-iônica em OEAE-Sepharose e coluna de afinidade em Sepharose- Trypsina. TOI apresentou-se homogêneo em gel de poliacrilamida-SOS 12,5%, com uma massa molecular aparente de 24 kOa em condições não reduzidas, e 12 kOa em condições reduzidas com OIT. A massa molecular relativa estimada por filtração em gel em uma coluna Superdex-75, sistema FPLC, confirmou os resultados obtidos em PAGE-SOS. TOI tem um Ki de 1,2nM para a enzima tripsina bovina mostrando uma alta afinidade. No entanto, TOI não mostrou atividade inibitória para quimotripsina. O estudo da estequiometria do complexo TOI-tripsina revelou que este inibe tripsina na razão molar de 1: 1. O complexo TripsinaTOI foi eluído na cromatografia de filtração em gel com um tempo de retenção equivalente a uma massa molecular relativa de 39 kOa. Evidenciou-se também que TOI é ativo na sua forma monomérica e não na sua forma dimérica. A Focalização Isoelétrica de TOI revelou a presença de duas bandas de proteínas, ambas coradas para inibidor de tripsina com pls de 6,45 e 7,35, indicando dois inibidores em TO!. Os inibidores de TOI, designadas por TOI-I e TOI-II, foram isoladas em coluna de fase reversa C18 /lBondapack, em Sistema HPLC Walters. Foi observado em gel de Tricina 16,5% uma diferença mínima na massa molecular aparente, sendo aproximadamente 12 e 10 kOa para TOI-I e TOI-1I respectivamente. O sequenciamento N-terminal dos inibidores de TOI revelou a presença da sequência consenso observada nos inibidores de tripsina tipo Kunitz para TOI-I, contudo, pesquisas nos banco de dados de proteínas não revelou nenhuma homologia para TOI-II. TOI mostrou alta estabilidade para diferentes condições de pH, temperatura e concentração de OTT, indicando um possível número elevado de pontes de dissulfeto na estrutura molecular. TOI não foi degradado proteoliticamente na digestibilidade in vitro pelas proteases encontradas no intestino médio do gorgulho Callosobruchus maculatus, e demonstrou um efeito deletério no desenvolvimento dos insetos, sugerindo que TOI atua como um fator antinutritivo e prejudica o desenvolvimento de Callosobruchus maculatus
Abstract: Two inhibitors have been isolated de TOI fraction in seeds of Copaifera langsorffii, ordinarily known as Copaíba, one Brazilian native tree of the Caesalpinoideae subfamily of Leguminosae family. The fraction TOI was purified by ammonium sulfate preeipitation, ion-exehange ehromatography on OEAE-Sepharose and affinity ehromatography on trypsin-Sepharose. TOI presented homogeneity in PAGE-SOS geI12,5%, with apparent moleeular mass of 24 and 12 kOa in non-and reduetion condition, respeetively. The relative moleeular mass determined by FPLC gel filtration on a Superdex 75 eolumn, eonfirmed on the results in PAGE-SOS. TOI have Ki of 1,2nM to bovine trypsin enzyme showing high affinity. However, no inhibition was found for quimotrypsin. The stoiehiometrie study of the trypsin-TOI eomplex evideneed that inhibitor is aetive for trypsin at 1: 1 molar ratio. The trypsin- TOI eomplex was eluted on a gel filtration ehromatography with retention time equivalent a relative moleeular mass of the 39kOa. Evidenced too, that TOI is active on enzyme trypsin on its monomerie form and not dimerie one. The isoelectrie foeusing of TOI demonstrated the presenee of two proteie bands, with isoelectrie point between 6.45 e 7,35, indicating two inhibitors in TOI. These inhibitors of TOI, designated for TOI-I and TOI-II, was isolated by reversed - phase HPLC on a J.L-Bondapaek column (Waters System) and was observed in Trieine-gel 16,5% one minimal differenee on apparent moleeular mass, of approximately 12 and 10 kOa for TOI-I and TOI-1I respectively. N-terminal sequeneing of the inhibitors of TOI, demonstrated the presenee of the eonsensus sequenee present in the soybean Kunitz-Type trypsin inhibitor for TOI-I, however, protein database searehes did not reveal any homology to TOI-II. The TOI showed high stability to pH different eonditions, temperature and amount of OTT, indicating one elevated number of disulfides bonds in a moleeular strueture. The TOI was not proteolytically degraded on a in vitro digestibility by midgut proteinases of the gorgulho Callosobruchus maculatus and demonstrated one deleterious effect on a insect's development, suggesting that TOI acts like toxie factor and deereased survival of Callosobruchus maculatus
Mestrado
Bioquimica
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Maria Ligia Rodrigues Macedo
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-07-27T11:17:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Mello_GlauciaCoelhode_M.pdf: 8782241 bytes, checksum: b2eab6f44b4a7734dcb76be2f126999a (MD5) Previous issue date: 2001
Resumo: Algumas espécies vegetais podem apresentar em suas sementes, agentes bioquímicos que atuam no mecanismo de defesa da planta. Uma grande variedade destes são, na maioria, constituídos de proteínas e carboidratos. Dentre os agentes de origem protéica estão os inibidores de proteinases, que além da sua atuação em plantas, podem ter aplicações no tratamento de patologias, como inflamações, hemorragia e até mesmo o câncer. Neste trabalho, um inibidor de tripsina presente nas sementes de Dimorphandra mollis (Leguminosae-Mimosoideae), conhecida comumente por Faveiro-Doce, foi isolado e purificado a partir de precipitação com sulfato de amônio (30-60%), cromatografias em coluna de exclusão molecular (Sephadex G-75), troca iônica (DEAE-Sepharose) e de afinidade (Sepharose- Tripsina). A pureza do inibidor de D. mollis (DMTI-II) foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida, que revelou uma única banda de proteína, mesmo em condições redutoras (O,IM DTT), indicando que DMTI-II é constituído por uma única cadeia polipeptídica. A massa molecular relativa de 25 kDa foi estimada por gel filtração em coluna de Superdex-75, em sistema FPLC. Uma constate de inibição de Ki de 1,7 x IO-IOM foi obtida para DMTI-II com a enzima tripsina bovina, mostrando portanto uma alta afinidade entre enzima e inibidor. Estudos estequiométricos revelaram que DMTI-II inibiu a tripsina na razão molar de 1:1, sendo a massa molecular do complexo formado de 46 kDa, determinada por cromatografia de filtração em gel, em coluna Superdex-75 (sistema FPLC). A atividade inibitória de DMTI-II mostrou ser altamente estável para diferentes condições de pH e concentrações do agente redutor DTT. A determinação da sequência N-terminal do inibidor que apresentou alto grau de homologia com outros inibi dores da família Kunitz, permitiu confnmar as características e propriedades mostradas durante o decorrer do trabalho. DMTI-II foi também submetido a ensaios de digestibilidade in vitro por pepsina e papaína e por enzimas presentes no intestino médio de larvas de Callosobruchus macu/atus com o intuito de verificar sua provável ação contra esta espécie de inseto. Os resultados mostraram que DMTI-II foi refratário à ação dessas enzimas, sugerindo uma possível aplicação na biotecnologia vegetal
Abstract: Some plants species can have in their seeds biochemical agents that act on their defense mechanism. A great number of them are of proteins or carbohydrates nature. Among the ones with protein origin are the proteinase inhibitors, that can also have a role on the treatment of pathologies, such as inflammation, hemorrhage and even on cancer. In this work, a trypsin inhibitor from Dimorphandra mol/is (Leguminosae Mimosoideae) seeds, commonly known as "Faveiro-Doce", was isolated and purified by ammnium sulfate precipitation (30-60%), gel filtration chromatography (Sephadex G-75), ionexchange chromatography (DEAE-Sepharose) and affinity chromatography (SepharoseTrypsin). D. mollis inhibitor's (DMTI-II) was assayed by polyacrylamide gel electrophoresis, yielding a single protein band, indicating that DMTI-II is constituted by one polypeptide chain. A molecular weight of25 kDa was estimated by gel filtration on Superdex G-75 column (FPLC system). An inhibition constant value of 1.7 x IO-IOM was obtained for DMTI-II with bovine trypsin, showing a high affmity between enzyme and inhibitor. Stoichiometric studies showed that DMTI-II inhibited trypsin in a I: I molar ratio. The molecular weight of the complex was determined as 46 kDa, by gel filtration chromatography in the Superdex G75 column. DMTI-II inhibitory activity was stable in the different pH conditions and reducing agent (DTT) concentration. Determination ofthe inhibitor N-terminal sequence showed a high degree of homology in relation to other inhibitors from the Kunitz fami1y, reinforcing the characteristics and properties found during this work. DMTI-II inhibitor was submitted to digestion assays in vitro by pepsin and papain and by enzymes present in the larvae midgut from Callosobruchus maculatus, to verify its probable _on against this insect specie. The results showed that DMTI-II was refractory to the action of those enzymes, suggesting a possible application on plant biotechnology
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2013.
Made available in DSpace on 2013-12-05T23:14:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 317829.pdf: 1196028 bytes, checksum: b45c41979d2169d09b0d948da10f4639 (MD5) Previous issue date: 2013
A artrite reumatoide é uma doença autoimune que em seu curso pode causar inatividade do paciente e levá-lo a óbito. Acredita-se que 1,5% da população mundial seja afligida pela doença, que não tem cura e os tratamentos disponíveis nos dias de hoje além de terem alto custo, podem causar efeitos adversos graves, limitando o tratamento da doença. A pesquisa em busca de medicamentos com menos efeitos adversos e de custo acessível faz-se então necessária. O presente estudo mostrou que a tripsina administrada em ratas pela via oral na dose de 2,95mg/Kg foi capaz de diminuir a dor e a inflamação articular em um modelo de artrite induzida por CFA, e que uma única administração foi capaz de manter o efeito antiartrítico durante os 7 dias de avaliação. Animais vagotomizados não tiveram melhora do quadro artrítico após a administração da tripsina na mesma dose anterior, indicando um papel vagal na atividade da enzima. Da mesma forma, a tripsina não teve efeito quando administrada em animais que receberam injeção intratecal das neurotoxinas 6-OHDA e 5,7-DHT. Esse resultado sugere o papel das vias descendentes inibitórias noradrenérgicas e serotoninérgicas, respectivamente, na ação da tripsina. As vias descendentes inibitórias monoaminérgicas não somente podem diminuir a nocicepção, como também, a partir da inibição do reflexo da raiz dorsal, seria capaz de controlar a inflamação articular. O presente trabalho propõe, então, que a ativação vagal seguida da liberação de monoaminas na medula pela via descendente inibitória compõem o mecanismo de ação da tripsina via oral, que pode ser considerada como uma alternativa de tratamento para doenças inflamatórias crônicas como a artrite reumatoide. Por extensão, esse trabalho sugere que ativadores orais de aferências do nervo vago subdiafragmático, e não absorvíveis, podem ser um novo ramo para o desenvolvimento de fármacos com menos efeitos colaterais.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-10-05T10:54:28Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896783 bytes, checksum: da2d7082fa8f5e79329235b48767490e (MD5)
Made available in DSpace on 2016-10-05T10:54:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 896783 bytes, checksum: da2d7082fa8f5e79329235b48767490e (MD5) Previous issue date: 2002-08-05
O desdobramento no equilíbrio para a β-tripsina, induzido por desnaturação térmica, foi caracterizado termodinamicamente. O desdobramento foi acompanhado através de absorção no ultravioleta (UV) e espectroscopia de dicroísmo circular (DC) no UV próximo e distante. Além disso, experimentos utilizando a técnica de calorimetria diferencial de varredura (DSC) foram realizados. As curvas de transição térmica foram reversíveis mostrando um desdobramento altamente cooperativo, e os dados experimentais foram bem ajustados à um modelo de transição de dois-estados, para o desdobramento dessa proteína. O gráfico da fração desnaturada versus temperatura, calculado a partir das curvas de desnaturação térmica, em diferentes comprimentos de onda, mostra coincidência dessas curvas. Além disso, a razão entre a entalpia de desnaturação calorimétrica e a entalpia de van ́t Hoff, obtidas por DSC, é próxima à unidade, o que suporta o modelo de dois-estados. O espectro de DC da enzima nativa foi registrado na faixa espectral de 184 a 260 nm e utilizado para se estimar as porcentagens dos elementos da estrutura secundária, pelos métodos VARSCL e SELCON. A estimativa da estrutura secundária, em solução, correspondeu aos resultados de difração de raios-X. As mudanças na estrutura da β-tripsina, resultante de desnaturação por calor e por uréia foram monitoradas por meio de espectroscopia de DC no UV próximo e distante. A quantidade dos vários elementos de estrutura secundária foi estimada para essas mudanças espectrais, através dos espectros no UV distante, utilizando o método CCA (“Convex Constraint Algorithm”). De acordo com as estimativas, os estados desdobrados para essa proteína, ou seja, a 70 o C e em uréia 2,6 M, apresentaram quantidades consideráveis de estrutura secundária regular. Os espectros de fluorescência intrínsica dos resíduos de triptofano, registrados em diferentes concentrações de uréia, mostram a presença de um estado intermediário no equilíbrio, que apresenta grande afinidade pela sonda bis-ANS. Além disso, a ausência de contatos terciários e a presença de estrutura secundária para esse estado, verificados por meio de espectros de DC no UV próximo e distante, são consistentes com as características de um molten globule. As mudanças na atividade da β-tripsina foram observadas em concentrações de uréia nas quais não foram visualizadas nenhuma alteração espectroscópica da estrutura terciária da proteína. Os parâmetros cinéticos, k cat e K M , determinados na ausência e na presença de uréia, mostraram que o decréscimo na atividade da enzima, em baixas concentrações de uréia, foi provavelmente devido à formação do complexo EI, formado entre a β-tripsina e a uréia, um inibidor competitivo dessa enzima.
The unfolding equilibrium of β-trypsin induced by thermal denaturation was thermodynamically characterized. Thermal unfolding equilibrium were monitored using UV absorption and both far- and near-UV CD spectroscopy. In addition, experiments using differential scanning calorimetry (DSC), were performed. Thermal transition curves showed to be reversible and cooperative, and the data could be reasonably fitted using a two-state model for the unfolding of this protein. Plots of the fraction denatured, calculated from thermal denaturation curves at different wavelengths, versus temperature were coincident. In addition, the ratio of the enthalpy of denaturation obtained by scanning calorimetry to the van ́t Hoff enthalpy was close to one, which supports the two-state model. The dichroism circular (CD) spectrum of the native protein was taken over the wavelength range of 184- 260 nm, and the amount of various secondary structures were estimated using VARSLC and SELCON methods. The CD estimation of secondary strucutre, showed excellent agreement with X-ray results. The CD spectra of β-trypsin, as a function of temperature and urea, were monitored by far- and near-UV CD, and the relative proportions of secondary structures calculated by CCA method. According to CD estimation, although the secondary structure changed upon denaturation, its denatured state still has considerable amounts of ordered structure. The intrinsic fluorescence emission spectra of β-trypsin, at different urea concentration, showed an intermediate equilibrium state, with great affinity by bis-ANS. Besides, the absence of terciary contacts and the presence of secondary structure for this state, are consistent with the molten globule characteristics. Changes on the activity of β-trypsin were observed at urea concentrations in which terciary structure changes were not detected. Kinetic parameters, k cat and K M , determined in the presence and absence of urea, showed that the decreases in enzyme activity, at low concentrations of urea, were probably due to a development of the enzyme-inhibitor complex between β-trypsin and urea, a competitive inhibitor of this enzyme.
Tese importada do Alexandria

Submitted by Maykon Nascimento (maykon.albani@hotmail.com) on 2016-04-18T19:53:42Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Lacerda CD.pdf: 1763421 bytes, checksum: 9db822a6306602d4f7c830ea507fcc4a (MD5)
Approved for entry into archive by Patricia Barros (patricia.barros@ufes.br) on 2016-06-27T18:49:55Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Dissertacao Lacerda CD.pdf: 1763421 bytes, checksum: 9db822a6306602d4f7c830ea507fcc4a (MD5)
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Uma nova isoforma tripsina bovina foi purificada a partir de amostras comerciais por cromatografia de troca iônica por Sephadex SP C50®. A nova isoforma contém, além da perda do hexapeptídeo N-terminal (como encontrado na molécula progenitora β-tripsina) uma clivagem intra-cadeia entre o Lys-155 e Ser-156. A nova enzima denominada -tripsina mostrou propriedades similares com a isoforma α-tripsina que contém o mesmo número de cadeia polipeptídica (duas cadeias), massa molecular (23312 Da), estrutura secundária, volume hidrodinâmico e outros. Apesar das semelhanças estruturais e enzimáticas dessas duas isoformas, -tripsina tem uma taxa de formação inferior a partir da β-tripsina, carga superficial inferior, mas a -tripsina tem estabilidade térmica mais elevada do que a α-tripsina. Devido à facilidade de purificação das isoformas a partir de tripsina bovina de fonte comercial, e as propriedades descritas acima, esta enzima tornar-se uma alternativa interessante para a indústria de alimentos e de detergente, bem como para pesquisa de biocatalisadores.
A novel bovine trypsin isoform was purified from commercial sample by ion exchange chromatography by Sephadex SP C50®. New isoform contain in addition of loss of N- terminus hexapeptide (as found in parent molecule β-trypsin) an intra-chain split between Lys-155 and Ser-156. The novel enzyme denominate gamma-trypsin showed similar properties with α-trypsin isoform in: polypeptide number chain (two chain), molecular masses (23,312 Da), secondary structure, hydrodynamic radius and others. In spite of enzymatic and structural similarities of both isoforms, -trypsin preferably has a lower rate formation from β-trypsin, a lower surface charge, but the gamma-trypsin has a higher thermal stability than α-trypsin. Due to obtaining facility of purification of bovine trypsin isoforms from commercial font, and properties described above, become this enzyme an interesting alternative for the food industry, detergent and biocatalysis research.

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:37:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_6919_CAROLINE DUTRA LACERDA.pdf: 5298429 bytes, checksum: b9a5ee4af3131c1baa3726d590e70c88 (MD5) Previous issue date: 2014-06-26
Uma nova isoforma tripsina bovina foi purificada a partir de amostras comerciais por cromatografia de troca iônica por Sephadex SP C50®. A nova isoforma contém, além da perda do hexapeptídeo N-terminal (como encontrado na molécula progenitora β-tripsina) uma clivagem intra-cadeia entre o Lys-155 e Ser-156. A nova enzima denominada -tripsina mostrou propriedades similares com a isoforma α-tripsina que contém o mesmo número de cadeia polipeptídica (duas cadeias), massa molecular (23312 Da), estrutura secundária, volume hidrodinâmico e outros. Apesar das semelhanças estruturais e enzimáticas dessas duas isoformas, -tripsina tem uma taxa de formação inferior a partir da β-tripsina, carga superficial inferior, mas a -tripsina tem estabilidade térmica mais elevada do que a α-tripsina. Devido à facilidade de purificação das isoformas a partir de tripsina bovina de fonte comercial, e as propriedades descritas acima, esta enzima tornar-se uma alternativa interessante para a indústria de alimentos e de detergente, bem como para pesquisa de biocatalisadores.

Orientador: Sergio Marangoni
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-07-24T16:20:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_SilvanaCristina_M.pdf: 4387966 bytes, checksum: 19da59ac17254dba0a8949838880eefc (MD5) Previous issue date: 1999
Resumo: No presente trabalho foi investigado um inibidor de proteinases em sementes da espécie Delonix regia Leguminosae-Caesalpinioideae). As sementes das leguminosas contêm uma alta concentração de proteína em relação aos outros componentes da planta. Dentre essas proteínas, os inibidores de proteinases, particularmente inibidores de enzimas da família das serinoproteinases (que inclui tripsina, quimotripsina e enzimas da coagulação sanguínea), exercem uma importante função na fisiologia da planta. Os inibidores de proteinases têm sido estudados há mais de 50 anos. Eles têm mostrado ser muito importantes no tratamento de disfunções metabólicas associadas às enzimas proteolíticas, tais como em casos de pancreatites, efizemas, alergias, inflamação, hipertensão e câncer. O inibidor de Delonix regia (DrTI) foi isolado em solução salina 10% (p/v), submetido a uma precipitação por acetona 80% (v/v) e purificado através de cromatografias de troca iônica (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) e de exclusão molecular (Sephadex G-75). o DrTI inibiu tripsina bovina e porcina e a calicreína plasmática humana. Os valores de Ki encontrados foram 2, 19x1 0-8M, 4,53x10-8M e 5,25x 10-9 M, respectivamente. A pureza do inibidor foi verificada por eletroforese em gel de poliacrilamida (10-20%), na presença de 5DS. O inibidor apresentou uma única banda de proteína em condições nativas e reduzidas (0,1 M DTT). Estes resultados indicam que o DrTI é constituído por uma única cadeia polipeptídica. A massa molecular aparente do inibidor foi de 22 kDa, um resultado similar aos inibidores de proteinase do tipo Kunitz. O DrTI foi submetido a estudos cristalográficos e seu modelo permitiu comparação estrutural com o inibidor de tripsina do tipo Kunitz isolado de sementes de Erythrina caffra
Abstract: In the present work, a proteinase inhibitor in seeds of Delonix regia (LeguminosaeCaesalpinioideae) specie, was investigated. The Leguminosae seeds contain a high concentration of protein in relation to the other components of the plant. Among these proteins, the proteinase inhibitors, particularly enzymes inhibitors of serinoproteinases family (that include trypsin, chymotrypsin and blood coagulating enzymes), play an important role in plant physiology. Plant inhibitors have been investigated for more than fifty years ago. They have been shown to be very important in the treatment of metabolic disfunctions associated to proteolytic enzymes, such as in cases of pancreatits, emphyzema, allergy, inflamation and cancers. The Delonix regia inhibitor (DrTI) was isolated in saline solution 10% (p/v), after acetonic precipitation 80% (v/v), and purified through ion exchange chromatography (Sephadex A-50 e DEAE 5PW) and molecular exclusion (Sephadex G-75). DrTI inhibited bovine and porcine trypsin and human plasma kallikrein. The values of Ki found were 2,19 x 10-8M, 4,53 x 10-8M and 5,25 x 10-9M, respectively. Purity of inhibitor was detected by poliacrylamide gel electrophoresis (10-20%) in the presence of SDS. The inhibitor displayed a single protein band, in native and reduced conditions (0,1 M DTT). These results indicate that DrTI is constituted by a single polipeptide chain.The apparent molecular mass of inhibitor was of 22 kDa, a result similar to the proteinase inhibitors of the Kunitz-type. DrTI was submitted to crystallographic studies and its model allowed structural comparison to the trypsin inhibitor of the Kunitz-type isolated from Erythrina caffra seeds
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Pedro L. O. Volpe
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica
Made available in DSpace on 2018-07-20T05:05:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 SilvaFilho_EloiAlvesda_D.pdf: 2324435 bytes, checksum: cff02643fe1c231fb562af4fe6d9df31 (MD5) Previous issue date: 1995
Doutorado

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:53:10Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4829_1.pdf: 884668 bytes, checksum: 9c05559206daab03f988ac7b46326e0d (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2005
Tripsina (E.C. 3.4.21.4) foi imobilizada covalentemente em membranas de exopolisacarídeo celulósico produzido pela Zoogloea sp. em melaço de cana de açúcar. Grupos carbonila foram introduzidos na matriz através da oxidação com metaperiodato de sódio e a enzima foi imobilizada diretamente e através de albumina de soro bovino (BSA) como espaçador. A retenção de atividade na tripsina-membrana e na tripsina-BSA-membrana foi, respectivamente, 37,2% e 9,16% da atividade específica da enzima nativa atuando no benzoil-DL-Arginina-p-Nitroanilida. Não foi observado decréscimo de atividade em ambos os preparados após sete reutilizações assim como eles mostraram ter mais estabilidade térmica do que a enzima nativa. A tripsina-BSA-membrana apresentou a mesma atividade inicial (99%) após 54 dias de estocagem em solução tampão Tris-HCl 0,1M, pH 8,0 a 4ºC, mas a tripsina-membrana perdeu 15% de sua atividade. Além disso, procedimento similar em que as preparações foram reusadas a cada nove dias mostraram que a tripsina-BSA-membrana novamente foi mais estável (decresceu 31% em atividade) do que a tripsina-membrana (decresceu 69%). Estes resultados demonstraram que esta matriz celulósica pode ser usada para imobilização de tripsina e que a presença de BSA como braço apresentou uma matriz mais adequada

Esse trabalho teve como objetivo a determinação da estrutura tridimensional do inibidor de tripsina purificado de sementes de Enterolobium contortisiliquum (EcTI) e a modelagem molecular dos complexos EcTItripsina, EcTI-quimotripsina , EcTI-trombina, EcTI-fator Xa, e suas análises. O EcTI possui 19kDa de peso molecular inibe tripsina, quimotripsina, calicreína plasmática humana, plasmina humana e fator Xlla, mas não inibe fator Xa e ativador de plasminogênio. Monocristais apropriados à coleta de dados de difração de raios-X foram obtidos na condição 50 do fatorial da Hampton (PEG8000 - 0,5M, LiSO4 - 0,5M) através da técnica de acupuntura em gel à temperatura constante de 15°C após três semanas. O grupo espacial encontrado foi o P21 com uma molécula na unidade assimétrica. Os dados de difração foram coletados num detetor de placas de imagem MAR345 na linha de Cristalografia de Proteínas (PCr) no Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS) em Campinas até uma resolução de 1,96Å, completeza de 87% e Rsym=10,3%. A estrutura foi resolvida por Substituição Molecular tendo-se como molde a estrutura do inibidor de tripsina proveniente de Erythrina caffra que apresenta 39% de identidade seqüencial com a seqüência primária do EcTI. Divergências entre a seqüência primária esperada e a observada no mapa de densidade eletrônica levaram à suposição da existência de isoformas para este inibidor. Acatando esta hipótese e supondo que a isoforma cristalizada era diferente da isoforma cuja seqüência foi publicada, mudanças na seqüência guiadas pelo mapa de densidades foram realizadas. Um total de 33 substituições e 1 inserção foram feitos. Diferentemente das tentativas de refinamento com a seqüência original, após as substituições o refinamento convergiu para valores aceitáveis de Rfactor=17% e Rfree=25%. A estrutura apresenta o enovelamento β-trefoil com uma pseudo simetria de ordem 3. Os grampos de cabelo presentes na estrutura são espiralados mas isto não é resultado de repetições sistemáticas nos ângulo Φ/Ψ como esperado. Baseado nesta estrutura cristalográfica, um modelo da seqüência original foi construído por modelagem por homologia. A avaliação do modelo em termos de estereoquímica e compatibilidade estrutura-seqüência mostra uma boa qualidade, mesmo existindo a formação de uma ponte salina enterrada no núcleo hidrofóbico da molécula. Estruturas cristalográficas de complexos entre tripsina, quimotripsina, fator Xa e trombina foram usados para gerar modelos de complexos entre as serinoproteases correspondentes e o EcTI. A falta de atividade de EcTI contra fator Xa e trombina pode ser atribuída à incompatibilidade química e estrutural na interface do complexo.
The principal objective of this work was the 3D structural determination of a Trypsin inhibitor from Enterolobium contortisiliquum (EcTI) seeds as well as the modeling of the complexes between EcTI and trypsin, chymotrypsin, thrombin and factor Xa and their subsequent analysis. The inhibitor has a molecular weight of 19.5 kDa and inhibits trypsin, chymotrypsin, human plasma kallikrein, human plasmin and factor Xlla but not factor Xa and tissue type plasminogen activator. A single crystal appropriate for X-ray data collection was grown using condition 50 of Hampton\'s Research fatorial (PEG8000 - 15%, LiSO4 - 0.5mM) by the gel acupuncture technique at 15°C. The crystal grew in three weeks in the space group P21 with one molecule in the assymetric unit. Crystallographic data were acquired using an image plate detector MAR345 on the Protein Crystallography beam line at the Laboratório Nacional de Luz Síncrotron (LNLS), Campinas, out to 1,96Å resolution, with a completeness of 87% and Rsym= 10.3%. The structure was solved by the Molecular Replacement method using the previous determined structure of the trypsin inhibitor from Erythrina caffra which presented 39% sequence identity to EcTI. Discrepancies in the primary structure, as observed in the electron density map led to the supposition of the existence of isoforms for this particular inhibitor. In total 33 substitutions and 1 insertion were made. In contrast with the attempts made with the original sequence, after the amino acids were substituted the refinement converged to acceptable values for Rfactor=17% and Rfree=25%. The 3D fold of EcTI is a β-trefoil as expected. The hairpins present in this fold are coiled coils, but not as a result of the systematic alternation of the Φ/Ψ angles as expected. Using the crystallographic structure as a template a homology model for the original sequence was built. The model evaluation in terms of stereochemistry and structure-sequence compatibility showed it to be of generally good quality, despite the presence of a salt bridge buried in the hydrophobic core. Docking experiments using crystallographic structures of trypsin, chymotripsin, factor Xa and thrombin complexed with their respective inhibitors were undertaken. The lack of EcTI activity against factor Xa and thrombin is predicted to be due to chemical and structural incompatibility at the complex interface.

O objetivo principal deste trabalho é o estudo de transistores MuGFETs de porta tripla de Corpo de canal tipo-n com e sem a aplicação da configuração DTMOS. Este estudo será realizado através de simulações numéricas tridimensionais e por caracterizações elétricas. A corrente de dreno, a transcondutância, a resistência, a tensão de limiar, a inclinação de sublimiar e a Redução da Barreira Induzida pelo Dreno (DIBL) serão analisadas em modo DTMOS e em configuração de polarização convencional. Importantes figuras de mérito para o desempenho analógico como transcondutância-sobre-corrente de dreno, a condutância de saída, a tensão Early e o ganho de tensão intrínseco serão estudados tanto experimentalmente como através de simulações numéricas tridimensionais para diferentes concentrações de dopantes no canal. Os resultados indicam que a configuração DTMOS apresenta as características elétricas superiores (4 e 10 %) e maior eficiência dos transistores. Além disso, os dispositivos DTMOS com alta concentração de dopantes no canal apresentaram um desempenho analógico muito melhor quando comparados ao transistor de porta tripla de Corpo em modo de operação convencional. O ruído de baixa frequência (LF) é pela primeira vez experimentalmente analisado na região linear e saturação. A origem do ruído é analisada de maneira a compreender os mecanismos físicos envolvidos neste tipo de ruído. As medições mostraram que os espectros do sinal dos dispositivos de porta tripla de Corpo e DTMOS são compostos por flutuações referentes ao número de portadores devido ao ruído flicker e por ondas de ruído de geração e recombinação no dielétrico de porta que se torna maior com o aumento da tensão de porta. No entanto, o principal fato desta análise é que o dispositivo DTMOS apresentou praticamente a mesma magnitude do ruído LF na região linear e de saturação que o dispositivo de Corpo. A energia de 60 MeV na fluência de p/1012 cm-2 de radiações de prótons é também estudada experimentalmente em termos das características elétricas, desempenho do analógico e ruído LF nos dispositivos de porta tripla de Corpo e DTMOS. Os resultados indicam que combinado com as suas melhores características elétricas e um ótimo desempenho analógico do DTMOS, faz o transistor de porta tripla de Corpo um candidato muito competitivo para aplicações analógicas em ruído de baixa frequência antes e depois da irradiação. A vantagem da técnica DTMOS em transistores de porta tripla em ambientes onde os dispositivos têm de suportar alta radiação é devido à menor penetração do campo de dreno que reduz o efeito das cargas induzidas pelo óxido de isolação (STI). Finalmente, o transistor de Corpo de porta tripla de canal tipo-n é experimentalmente estudado como célula de memória, isto é, como 1T-DRAM (Memória de Acesso Aleatório Dinâmico com 1 transistor). Para escrever e ler 1 é utilizado um modo de programação que utiliza o efeito do transistor bipolar parasitário (BJT) enquanto a polarização direta da junção do corpo e do dreno é usada para escrever 0. As correntes de leitura e escrita aumentam com o aumento da tensão do corpo (VB) porque as cargas induzidas pelo efeito BJT é armazenada dentro da aleta. Quando o corpo do transistor está flutuante, o dispositivo retém mais cargas dentro da sua aleta. Além disso, transistor de Corpo pode ser utilizado como 1T-DRAM com eletrodo de porta e substrato flutuando. Neste caso, o dispositivo funciona como um biristor (sem porta).
The main goal of this work is to investigate the n-channel MuGFETs (triple-gate) Bulk transistors with and without the application of DTMOS operation. This work will be done through three-dimensional numerical simulation and by electrical characterizations. The drain current, transconductance, resistance, threshold voltage, subthreshold swing and Drain Induced Barrier Lowering (DIBL) will be analyzed in the DTMOS mode and the standard biasing configuration. Important figures of merit for the analog performance such as transconductance-over-drain current, output conductance, Early voltage and intrinsic voltage gain will be studied experimentally and through three-dimensional numerical simulations for different channel doping concentrations. The results indicate that the DTMOS configuration has superior electrical characteristics (4 e 10 %) and higher transistor efficiency. In addition, DTMOS devices with a high channel doping concentration exhibit much better analog performance compared to the normal operation mode. Low-Frequency (LF) noise is for the first time experimentally investigated in linear and saturation region. The origin of the noise will be analyzed in order to understand the physical mechanisms involved in this type of noise. Measurements showed that the signal spectra for Bulk and DTMOS are composed of number fluctuations related flicker noise with on top generation and recombination noise humps, which become more pronounced at higher gate voltage. However, the most important finding is the fact that DTMOS devices showed practically the same LF noise magnitude in linear and saturation region than standard Bulk device. Proton irradiation with energy of 60 MeV and fluence of p/1012 cm-2 is also experimentally studied in terms of electric characteristic, analog performance and the LF noise in Bulk and DTMOS triple gate devices. The results indicate that the combined of the better electrical characteristics and an excellent analog performance of DTMOS devices, makes it a very competitive candidate for low-noise RF analog applications before and after irradiation. The advantage of dynamic threshold voltage in triple gate transistors in environments where the devices have to withstand high-energy radiation is due to its lower drain electric field penetration that lowers the effect of the radiation-induced charges in the STI (shallow trench isolation) regions adjacent to the fin. Finally, the n-channel triple gate Bulk device is used for memory application, that is, 1T-DRAM (Dynamic Random Access Memory with 1 Transistor). Bipolar junction transistor (BJT) programming mode is used to write and read 1 while the forward biasing of the body-drain junction is used to write 0. The reading and writing current increases with increasing body bias (VB) because the load induced by the BJT effect is stored within the fin. When the body of the transistor is floating, the device retains more charge within its fin. In addition, transistor could also operate as 1T-DRAM with both gate and bulk contacts floating, which is similar to the biristor (gateless) behavior.

Orientador: Elias Basile Tambourgi
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica
Made available in DSpace on 2018-07-25T17:07:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Moro_JoseaneRodrigues_M.pdf: 3167683 bytes, checksum: 1b1a07712fbc086745e5a80fcd30575d (MD5) Previous issue date: 1999
Resumo: A viabilidade da produção e comercialização de substâncias obtidas por meio de processos biotecnológicos depende das técnicas de separação empregadas na purificação dos compostos desejados. Algumas características das misturas envolvidas nesses processos, tais quais baixa concentração inicial, necessidade de produtos de alto grau de pureza, sensibilidade térmica e necessidade de preservar as propriedades dos compostos, fazem com que a etapa de purificação exija um processo econômico e que seja biologicamente compatível com os produtos envolvidos. Neste sentido, a extração líquido-líquido por micelas reversas se apresenta como uma técnica de separação extremamente interessante. Tendo-se em vista o desenvolvimento de extratores mais eficientes, é fundamental o estudo da hidrodinâmica e dos mecanismos de transferência de massa no interior dos extratores. Este trabalho teve como objetivo principal o estudo de uma micro-coluna agitada por campânulas perfuradas pulsadas que foi usada para extração de proteína. O sistema de agitação formado pelas campânulas pulsadas tem como objetivo promover uma melhor mistura dos líquidos no interior da coluna e assim, aumentar a transferência de massa. O sistema de extração foi formado por proteína modelo (tripsina -que se encontra em meio aquoso), e dioctilsulfossuccinato de sódio (AOT) em isooctano, que formam um sistema de micelas reversas. ...Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital
Abstract: The production and commercialization suitability of substances obtained by means of biotechnologica1processes depend on the separation techniques used for the purification of the desired compounds. Some features of the mixtures involved in these processes, such as low initial concentration, high purity level products desired, thermal sensitivity and the need of preserving the compounds' properties, require a purification step that must be economical and biologically compatible with the chemica1sinvolved. As a matter of fact, liquid-liquid extraction by reversed micelles is presented as an out standing separation technique. The hydrodynamics and the mass transfer mechanismin the interior of the extractors are fundamental for the development of more efficient equipment. The main goal of this work was the study of a micro-column stirred by bell-shaped meshes for the extraction of a protein. The stirring system composed by the bell-shaped meshes promotes a better mixture of the fluids in the inner side of the column and, as a result, increase the mass transfer. The extraction system was composed of a model protein (tripsin, which is in aqueous medium), and sodium dioctilsulfosuccinate (AOT) dissolved in iso-octane, that is a reversed micellar system. The first part of this work was conducted in sampling tubes to find the optimum parameters of the chemical solutions involved, such as pH, ionic strength and AOT concentration, for the column operation. ...Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations
Mestrado
Sistemas de Processos Quimicos e Informatica
Mestre em Engenharia Química

Orientadores: Rahoma Sadeg Mohamed, Pedro de Alcantara Pessoa Filho
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica
Made available in DSpace on 2018-08-04T00:06:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Watanabe_ErikaOhta_M.pdf: 2988962 bytes, checksum: bf4098211fb214faf6ddf984cf711041 (MD5) Previous issue date: 2004
Resumo: A precipitação induzida pela adição de sais é um processo freqüentemente utilizado na purificação de proteínas em solução aquosa. Após a separação da proteína, o sal presente no precipitado deve ser removido e a solução remanescente necessita de tratamento para que os eletrólitos sejam recuperados e reutilizados no processo, para reduzir o custo e evitar a contaminação do meio ambiente. A precipitação com uso de sais voláteis pode ser uma alternativa a este tipo de processo pois, por elevação de temperatura ou abaixamento de pressão, o eletrólito passa para a forma gasosa e pode ser reutilizado sem purificação adicional. Neste trabalho foi estudada a precipitação de tripsina suina a 4°C utilizando-se o sal volátil carbamato de amônio ('NH IND. 4''NH IND. 2'COO), preparado a partir de carbonato de amônio e hidróxido de amônio de modo que a razão entre as quantidades totais de nitrogênio e carbono (RNlc) fosse. igual a 2,0. A solubilidade da tripsina foi determinada experimentalmente: as concentrações de proteína das fases sobrenadante e precipitado foram obtidas por absorção a 280 nm e confinadas por liofilização. Balanços de massa foram verificados, bem como o tempo necessário para que o equihbrio fosse atingido. Por ser a tripsina uma enzima proteolítica, que apresenta problemas específicos de autólise em seu pH ótimo igual a 8,0, e devido ao caráter básico do sal carbamato de amônio, ensaios de atividade enzimática e avaliação do nível de autólise foram efetuados. Os estudos realizados demonstram que o carbamato de amônio é capaz de induzir a precipitação por "salting-out" da tripsina, e que o acréscimo de amônia ao sistema reduz a efetividade da precipitação. Da análise do balanço de massa observou-se que a concentração inicial de proteína não afeta sua solubilidade, e que o estado de equilibrio é atingido após 1 h. Comparando-se os resultados de atividade total recuperada da tripsina precipitada com o sal volátil e com sulfato de amônio verificou-se a diminuição na atividade da proteína precipitada com carbamato de amônio. Este comportamento é devido provavelmente a um efeito desnaturante do carbamato de amônio, conforme observado por meio de eletroforese SDS-PAGE. Estudos para a remoção do sal volátil da solução de tripsina no processo de precipitação por "salting-out" foram realizados, de modo a demonstrar que a utilização do sal para a precipitação em larga escala é factível
Abstract: Salt-induced precipitation is an extensively used method to purify proteins in aqueous solution. Once precipitation is carried out, additionaI separation steps are necessary both to remove the salt ITomthe precipitate, which is often accomplished by dialysis, and to treat the remaining aqueous phase to recover biomolecules still in solution and to prepare the solution for final disposal or recycling. This post-precipitation treatment can be very costly. The use of volatile electrolytes, which can be removed ITomthe solution by temperature increase or pressure decrease, can be an economically attractive alternative for the precipitation process by conventionaI salts. In this work, the precipitation of suine trypsin at 4°C with the volatile salt ammonium carbamate ('NH IND. 4''NH IND. 2'COO) was investigated. The solubility curve of trypsin was determined by .measuring absorbance at 280 nm of precipitate and supernatant phases, and con:firmed by lyophilization. Mass balance was verified as well as the time necessary to reach the equihDrium.Once trypsin is a proteolitic enzyme presenting autolysis problems at pH equal to 8,0, which is close to the pH of ammonium carbamate solutions, the activity recovery and autolysis leveI in the process were investigated. Experimental results showed that ammonium carbamate is able to induce the trypsin precipitation by salting-out. Mass balance indicated tOOtthe solubility of trypsin is independent of the inicial protein concentration and the equihDriumis reached afier 1 hour. Comparative results of the total activity recovered of the trypsin precipitated with ammonium carbamate and ammonium sulfate showed a decrease of 20% in the activity of the protein precipitated with ammonium carbamate. These results can bé related to denaturing effect of ammonium carbamate as suggested by SDS-PAGE ana1ysis.Volatile salt remova! in the protein solution afier the salting out precipitation was studied to demonstrate the feasibilityofthis precipitation technique
Mestrado
Engenharia de Processos
Mestre em Engenharia Química

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Bioquímica Estrutural e Funcional
O conhecimento e compreensão das interacções entre proteínas e ligandos é muitas vezes a base para a resolução de questões complexas a nível biológico. Na presente dissertação são estudadas as proteínas Aldeído Oxidorredutase de Desulfovibrio gigas (DgAOR) e a tripsina de Bos taurus com vários ligandos por Cristalografia de Raios-X. A DgAOR é uma enzima de molibdénio da família da Xantina Oxidase que apresenta a função de catalisar a hidroxilação oxidativa de aldeídos a ácidos carboxílicos. Com o objectivo de se perceber qual a diferença entre as formas activa e inactiva desta enzima, foram realizados estudos cinéticos com ditionito de sódio e sulfureto de sódio, reagentes utilizados na activação de proteínas da mesma família. Os resultados mostraram uma activação inicial seguida de uma inactivação. O modelo cristalográfico determinado nas mesmas condições sugere uma molécula de peróxido de hidrogénio ligada ao átomo de molibdénio do centro activo. Quando comparada com a estrutura obtida usando apenas peróxido de hidrogénio, as semelhanças são notórias reforçando a presença desta espécie a bloquear o centro activo. De modo a elucidar o mecanismo de reacção da enzima, foram executados estudos com diferentes aldeídos, tendo-se observado a interacção entre o cofactor e os substratos, nalguns casos originando os produtos da reacção. A tripsina é uma protease de serina que catalisa a hidrólise de ligações peptídicas. Esta foi utilizada como modelo cristalográfico para o estudo de interacções com cinco compostos desenhados para a inibição da urocinase, uma enzima muito semelhante, da mesma família. Foram obtidas estruturas com os compostos AB1 e JS62 ligados ao centro activo permitindo a visualização das interacções entre estes e os resíduos chave da proteína. O composto AB11 não se ligou à proteína, enquanto que, para os restantes dois compostos, JS67 e SR5, obteve-se densidade electrónica de difícil interpretação no centro activo.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-04-08T13:42:05Z No. of bitstreams: 2 Jackeline da Costa Maciel_TESE.pdf: 15099500 bytes, checksum: a4b1377fba226f8f7186189dda07bc4d (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5)
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CNPq; FACEPE
As enzimas são muito utilizadas em processos industriais; então, a busca por novas tecnologias, que permitam o uso otimizado dessas biomoléculas, confere redução dos custos e permite melhor rendimento da enzima. Uma das alternativas para isso consiste na imobilização dessas proteínas em suportes insolúveis. Dentre os diferentes tipos de suportes existentes, os compósitos de nanopartículas magnéticas e polímeros apresentam algumas vantagens, tais como: oferecem maior área superficial para ligação da enzima devido ao reduzido tamanho; permitem a rápida separação utilizando apenas um campo magnético externo e a presença do revestimento polimérico contribui com grande quantidade de grupos funcionalizáveis. Embora se conheçam todas as ferramentas, é preciso escolher as mais adequadas para a aplicação desejada. Neste trabalho, foram produzidos compósitos de partículas magnéticas e polímeros. Dois tipos de polímeros foram utilizados, o polissacarídeo levana e o polímero sintético polianilina (PANI). Nosso objetivo foi obter derivados enzimáticos com boa retenção de atividade. O compósito de partículas magnéticas e levana foi obtido pelo método de co-precipitação na presença do polissacarídeo. Para produção do compósito com PANI, o polímero só foi adicionado após a síntese das partículas magnéticas por coprecipitação. O processo de revestimento das partículas magnéticas com PANI foi otimizado por meio do uso de dois planejamentos fatoriais completos (23). Propriedades físicas, químicas e magnéticas de ambos os compósitos foram determinadas através de técnicas de microscopia eletrônica, FTIR, difração de raios-X, espectroscopia Mössbauer, área de superfície BET e porosidade e medidas de magnetização. Os resultados mostraram que as partículas magnéticas sintetizadas, na ausência do polímero, possuem menores tamanhos e estrutura cristalina bem definida. Ambos compósitos foram utilizados para imobilização de tripsina. No caso do compósito de partículas magnéticas e levana, após dez reutilizações, o derivado enzimático exibiu 84% de sua atividade inicial. Em relação, a tripsina imobilizada em compósito de partículas magnéticas e PANI, o derivado enzimático apresentou maior estabilidade térmica em temperaturas acima de 25C°; maior afinidade pelo substrato BAPNA (Kmap 1,4 vezes menor que aquele para enzima solúvel); pequena redução na eficiência catalítica (1,1 vezes menor que aquele para enzima solúvel); retenção de 89% de sua atividade inicial após 48 dias de estocagem a 4°C e retenção de 81% de sua atividade inicial após vinte reutilizações. Tanto o compósito magnético com PANI quanto aquele com levana apresentaram bom resultado quanto à retenção da atividade da enzima imobilizada, sendo o derivado com PANI o de menor custo.

Orientador: Sergio Marangoni
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-07-28T11:16:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pando_LuziaAparecida_D.pdf: 10632318 bytes, checksum: 45612dfee93908b50ef1254a32637591 (MD5) Previous issue date: 2001
Resumo: As leguminosas contêm quantidades relativamente grandes de proteínas e dentre essas proteínas destacam-se os inibidores de proteinases e lectinas. O objetivo do presente trabalho foi estudar o efeito de inibidores de proteinases sobre o desenvolvimento da Diatraea saccharalis e sobre microrganismos fitopatogênicos, assim como caracterizar físico-quimicamente uma lectina de Crota/aria paulina e estudar suas propriedades biológicas. A lectina das sementes de Crota/aria paulina foi purificada por cromatografia de troca iônica em coluna de DEAE Sepharose Fast Flow e em cromatografia de fase reversa-HPLC. A massa molecular determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições redutoras e não redutoras foi calculada em aproximadamente 30 kDa. A hemaglutinação induzida por CrpL sobre eritrócitos humanos e bovinos é inibida por N-acetil-D-galactosamina, D-galactose e pela glicoproteína asialofetuína. A lectina não requer íons divalentes para sua atividade, pois não é inibida por EDT A. A análise do conteúdo de carboidrato para CrpL indicou que esta lectina contém aproximadamente 6,2% de carboidratos, utilizando galactose e manose como padrões, o que comprova que esta lectina é uma glicoproteína. A composição global de aminoácido mostrou que a lectina é rica em resíduos de aminoácidos prolina, glicina, serina e alanina, e não apresenta resíduos de histidina, arginina, metionina e fenilalanina. A seqüência N-terminal apresentou-se bloqueada e os poucos resíduos obtidos não mostraram qualquer homologia com outras lectinas da família leguminosa. Estudos de agregação plaquetária induzida por ADP com plasma humano até a concentração de 100ug/ml de CrpL, demonstraram não haver modulação significativa sobre plaquetas. O estudo envolvendo CrpL sobre bactérias Xanthomonas campestris pv. phaseoli e Xanthomonas campestris pv. passiflorae, demonstrou que esta lectina afetou o crescimento dessas bactérias. As propriedades antimetabólicas dos inibidores de proteinases (IPs) de soja e feijão, foram determinadas "in vivo" após a incorporação em dieta artificial, com avaliação do potencial de crescimento de populações da broca-da-cana Diatraea saccharalis (Lepidoptera: Pyralidae). Os inibidores foram incorporados em dieta artificial à base de farelo de soja e levedura de canade-açúcar. O efeito dos inibidores sobre o desenvolvimento das lagartas de D. saccharalis foi avaliado aos 16 dias de idade para os diferentes tratamentos (T1, T2 e T3), através da viabilidade larval; % de eficiência de lagartas aptas; peso das lagartas e peso de pupas com 24 horas. Os inibidores de tripsina de soja e de feijão atrasaram o desenvolvimento das lagartas, além de interferir no peso. Foram analisados também, os inibidores de CpTI, CjTI, CsTI, SBTI e PvTI sobre o crescimento micelial de fungos do gênero Fusarium e Colletotrichum. Os experimentos foram conduzidos sobre placas de Petri, usando meio de BDA para Fusarium sp e meio de aveia para o Coletotrichum, com 10 repetições. Como controle foi usada água esterilizada. As placas foram deixadas á 28°C no escuro. Quando o controle alcançou o diâmetro total da placa, o experimento foi interrompido. Os inibidores mostraram diferentes efeitos sobre o crescimento de Fusarium s p "in vitro". O CpTI não mostrou qualquer efeito em relação ao controle, e o PvTI não teve efeito fungicida mas reduziu a concentração de hifas. Inibidor de CjTI foi capaz de ocasionar mudanças na morfologia do fungo. CjTI and PvTI mostrou efeito fungistático sobre o crescimento de Colletotrichum graminicola, sendo que o inibidor PvTI mostrou-se mais eficaz no controle do crescimento micelial. O SBTI não foi efetivo contra quaisquer espécies de fungos estudados. Estudos envolvendo CpTI e PvTI sobre a germinação de esporos de fungos da espécie Ustilago scitaminia, demonstrou que esses inibidores não têm efeitos sobre esses fungos. Inibidores de CpTI foram capazes de inibir o crescimento de duas espécies de bactérias, assim como BvcTI foi capaz de inibir o crescimento de Xanthomonas sp da cana de açúcar. PvTI não mostrou efeito sobre essas bactérias. Os resultados obtidos sugerem que CrpL, assim como os inibidores de proteinases estudados de várias sementes de leguminosas, podem estar envolvidos no mecanismo de defesa contra microrganismos fitopatogênicos. Os resultados com inibidores de serinoproteinases, de feijão e soja, sugerem, também, a possibilidade desses inibidores serem utilizados como ferramentas no estudo de plantas transgênicas de cana-de-açúcar no controle da broca (Diatraea saccharalis)
Abstract: A naturaly occuring lectin activity was detected in the extract of Crota/aria paulina seeds. The crude lectin extract was prepared by grounding the seeds followed by acid extraction with glycine 0.1 M I NaCI 0.15 buffer, pH 2.6. The lectin from C. paulina was purified by ion-exchange and reverse fase chromatography. The lectin purified was assayed with human (A, S, AS, O) and animal (Cow) erythrocytes and it was nonspecific for any human blood group. This lectin agglutinated native and trypsintreated erythrocytes and it requires no Ca++ or Mg++ for hemagglutination activity. Hemagglutinating inhibitory assay was performed with mono and disaccharides solution (100mM) and it was inhibited by N-acetyl-D-galactosamine, D-galactose and byasialofetuin. Studies performed in SDS-PAGE (12,5%) of purified lectin under non-reducing and reducing conditions showed a single band of 30 kDa. The data obtained for the lectin of Crota/aria paulina, when compared to the one obtained from Crota/aria juncea and Crota/aria striata showed that in spite of belonging to the same genus they possess different agglutination properties and specificity for carbohydrate. On ADPinduced platelet aggregation assay with human plasma up to 100ug/ml of the lectin showed no significant modulation on platelets. Studies of CrpL on Xanthomonas campestris pv. phaseoli and Xanthomonas campestris pv. passiflorae, showed that the lectin was able to inhibit the growth and development these bacteria. The evaluation of proteinaceous inhibitors of proteolytic enzymes as candidates to provide resistance to economically important crops against insect pests is currently attracting much research interest. The antimetabolic properties of the SPI after incorporation into artificial diet, in vivo, and its interference on population increase potential of the pest have been evaluated. The incorporation of SPI into an artificial diet of larvae significantly reduced the growth and development of the insect, reflecting an increase of the instar number and duration, and a significantly lower average weight. It was also observed that the diet nutrition value affects the insect susceptibility to the inhibitor. The effect on growth rates observed in this study resulted in significant differences in mean weights of larvae at the conclusion of the experiment (day 16). Here, the mean weight of larvae fed on control diet was significantly greater than the mean weight of larvae fed diet containing proteinase inhibitors CpTI and SSTI. The study of the effects from CpTI, CsTI, CjTI, SBTI and PVTI on the mycelial growth of the genus Fusarium and Colletotrichum were carried out on Petri slabs, using medium of BOA for Fusarium sp and medium of oat for Colletotrichum graminicola, with 10 repetitions. Sterilized water was used as control. Plates were kept at 28°C in the dark. When the control reached the whole diameter of plate, the experiment was interrupted. Inhibitors showed different effects on the growth of Fusarium sp in vitro. CpTI did not show any effects in relation to the control, and PvTI did not have effects but reduced the concentration of hyphas. CpTI had effect and occasioned a change in the colony morphology. CjTi and PvTI showed antifungal effect on the growth of Colletotrichum graminicola, being that PvTI showed itself quite efficient in the growth control of the colony. CpTI were able to inhibit the bacterial development and growth of the two pathogenic bacteria species of Xanthomonas, Xanthomonas campestris pv. Phaseoli and Xanthomonas campestris pv. passiflorae. BvcTI was also able to inhibit the bacterial growth of Xanthomonas sp. On the other hand, PvTI it was not effective against these bacteria. The results presented here suggest that CrpL and proteinase inhibitors may be involved in the defense mechanism against pathogenic microorganisms. These results suggest also a potential value of SPI for protecting sugarcane plants against damage by Diatraea saccharalis
Doutorado
Bioquimica
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3107_1.pdf: 1671474 bytes, checksum: 24bd8cb473e30b625f220e29f8df13a5 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
Dengue é uma arbovirose transmitida pelo Aedes aegypti e o controle do mosquito é fundamental para reduzir a propagação da doença. As larvas de A. aegypti têm desenvolvido resistência a inseticidas organofosforados. O uso de compostos naturais que promovam mortalidade pode evitar a emergência de larvas resistentes, devido à rotatividade dos inseticidas. Este trabalho relata a atividade larvicida (CL50 de 0.925%, p/v) do extrato de flores de Moringa oleifera sobre o quarto instar larval (L4) de A. aegypti. Inibidor de tripsina de natureza protéica (MoFTI, 169,9 kDa, Ki: 0,38 nM), triterpeno (β-amirina), esteróide (β- sitosterol) e flavonóides (kaempferol e quercetina) foram detectados no extrato; lectina não foi detectada. Tripsina do extrato do intestino de L4 foi inibida por MoFTI (Ki: 0,6 nM); entretanto, a atividade de acetilcolinesterase (AChE) do extrato de L4 inteiras não foi alterada. Ensaio em condições in vivo mostrou que a atividade de tripsina do intestino de L4 tratadas com o extrato de flores de M. oleifera diminuiu ao longo do tempo (0 a 1440 min) e foi fortemente inibida (98,6 %) após 310 min de incubação; a atividade de AChE do extrato de L4 inteiras não foi afetada neste período. O estudo aponta o extrato de flores de M. oleifera como uma ferramenta biodegradável para o controle de larvas de A. aegypti e sugere que o mecanismo larvicida envolve a inibição da tripsina do intestino das L4 por MoFTI

Orientadores: Maria Lígia Rodrigues Macedo, Ricardo Aparício
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-17T17:21:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_CaioFernandoRamalhode_M.pdf: 5489630 bytes, checksum: 6240754a8c7ab9bd7931534cadba14a6 (MD5) Previous issue date: 2011
Resumo: Diversas pesquisas buscam candidatos para o controle alternativo de pragas agrícolas, uma vez conhecidos os malefícios oriundos do emprego de inseticidas químicos nas lavouras. Neste trabalho, um inibidor de tripsina isolado de sementes de Entada acaciifolia (Mimosoideae) - (EATI) foi purificado e caracterizado sob o ponto de vista funcional e estrutural. O inibidor mostrou-se estável a variações térmicas e de pH, alem de apresentar sua atividade inibitória inalterada tanto na forma oxidada quanto na forma reduzida com 100 mM de DTT. Quando submetido a cromatografia liquida de alta eficiência em coluna C-18, EATI foi resolvido em 4 picos, indicando a presença de 4 isoformas, sendo que a isoforma majoritária apresentou uma massa acurada de 19.725 Daltons, revelada através de espectrometria de massa MALDI-TOF. Outras características como a estequiometria de inibição, a constante de inibição (Ki), a analise da composição global de aminoácidos e o sequenciamento N-terminal permitiram classificar EATI como membro da família Kunitz de inibidores de serinoprotease. Estudos de dicroísmo circular revelaram um alto conteúdo de fohas-? e estruturas não ordenadas alem da aparente ausência de ?-helices, padrão comum a esta classe de proteínas. A incubação em 1 mM de DTT resultou em perturbações em sua cadeia polipeptídica, corroborando os ensaios in vitro. EATI foi resistente a desnaturação por uréia, característica relatada para outros inibidores vegetais. O inibidor apresentou uma interessante atividade inibitória in vitro contra as proteases de diversos insetos-praga. De acordo com estes resultados, apontamos EATI como uma ferramenta promissora no combate a pragas agrícolas
Abstract: Several studies seeking alternative candidates for the control of agricultural pests, once known harm from the use of chemical insecticides in crops. In this work, a trypsin inhibitor isolated from Entada acaciifolia seeds (Mimosoideae) - (EATI) was purified and characterized from the point of view unctional and structural. The inhibitor was stable to thermal heat and pH range, in addition to its inhibitory activity unchanged in both the oxidized and in reduced form with 100 mM DTT. When subjected to high performance liquid chromatography on C-18 column, EATI was resolved in four peaks, indicating the presence of four isoforms, with the major isoform showing an accurate mass of 19,725 Daltons, as revealed by MALDI-TOF mass spectrometry. Other characteristic such as stoichiometry of inhibition, the dissociation constant (Ki), the analysis of global amino acid composition and N-terminal sequencing allowed to classify EATI as member of the Kunitz family of serine protease inhibitors. Circular dichroism studies revealed a high content of ?- sheets and unordered structures beyond the apparent absence of ?-helix, typical of this class of proteins. Incubation in 1 mM DTT resulted in small perturbations in their polypeptide chain, corroborate the in vitro assays. EATI was resistant to denaturation by urea, a characteristic reported for other plant inhibitors. The inhibitor presented an interesting inhibitory activity in vitro against the proteases of several insect pests. According to these results, we focused EATI as a promising tool in the fight against agricultural pests
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

O presente trabalho avaliou a efetividade do tratamento com tripsina (TT) na eliminação do BoHV-1 Colorado, causador da Rinotraqueíte Infecciosa Bovina (IBR). Camundongos fêmeas Swiss, com idade entre 6 e 8 semanas, foram superovuladas com 0,2mL a 5UI de hormônio eCG e, após 48h com hCG e acasaladas com machos inteiros da mesma linhagem e idade. Após 18 horas, as fêmeas foram eutanasiadas e, através de abertura no peritônio, os zigotos foram coletados. Foram separados zigotos para cinco ensaios que forneceram os seguintes dados: o BoHV-1 Colorado altera a taxa de clivagem e a morfologia do embrião; a tripsina, seguindo recomendações da IETS, não danifica o embrião; os embriões expostos aos vírus e submetidos ao TT não alteram sua morfologia e taxa de clivagem; foram detectados (nested-PCR+) vírus viáveis (MDBK+) após o TT. Estes resultados demonstram que o TT não foi efetivo para eliminar o BoHV-1 Colorado, porém em alguns ensaios o TT demonstrou eficiência na inativação do vírus o que torna-o um importante método de controle in vitro.
This study evaluated the effectiveness of treatment with trypsin (TT) in the elimination of BoHV-1 Colorado, which causes infectious bovine rhinotracheitis (IBR) Swiss female mice, aged 6 and 8 weeks, were superovulated with 0.2 mL 5UI hormone eCG and 48h after hCG and mated with males of the same lineage and age. After 18 hours, females were euthanized, and through na opening in the peritoneum, the zygotes were collected. Zygotes were separated for five trials that provided the following data: the Colorado BoHV-1 alters the cleavage rate and embryo morphology; trypsin, following recommendations of the IETS, does not damage the embryo; the embryos exposed to the virus and subjected to TT does not change their morphology and cleavage rate; were detected (nested-PCR +) viable virus (MDBK +) after the TT. These results demonstrate that TT was not effective to eliminate the BoHV-1 Colorado, but in some tests showed the TT efficiency in inactivating the virus makes it na important method of control in vitro.

In spite of being an opening concept, innovation has fomented useful theoretical discussions. One of the most applied approaches is the `Triple Helix´ model, which identifies societies with higher ability of promoting innovative practices and environments as those where the helixes `Government´, `Universities´ and `Industry´ are better articulated, in a horizontal relation. What it follows is a work that aims to problematize that discussion to Brazilian context, pointing the existence of socio-political features which inhibit the interconnection among these main participants of the process. First, we take into account some aspects connected to Brazilian constitution, which reveals into a developmentalism logic. Later, we discuss the national technic-scientific activities, analyzing them based on Triple Helix theory and general theoretical contributions. And, as an attempt to delineate this relation more clearly, the next step was chosen looking at a more restrictive and specific object: the RHAE-Pesquisador na Empresa program, which confirmed the difficulties of a consolidation of this intended articulation among those helixes. In this way, we undertake a quite wide although needful sociological research, once the chosen thematic has a complex dynamics.
A inovação, apesar de ser um conceito ainda em aberto, tem fomentado discussões teóricas profícuas. Uma das abordagens mais utilizadas é o modelo da Tripla Hélice , que aponta as sociedades com maior capacidade de promover práticas e ambientes inovadores como aquelas onde as hélices Estado , Universidades e Empresas melhor se articulam, numa relação horizontal. Este trabalho procura problematizar essa discussão para o contexto brasileiro e aponta para a existência de características sócio-políticas que inibem a interconexão entre os três partícipes principais desse processo. Primeiramente, abordamos aspectos prenhes à constituição do Estado brasileiro, que desemboca na lógica desenvolvimentista. Posteriormente, discutimos o cenário das atividades tecno-científicas nacionais, analisando-as à luz da teoria da Tripla Hélice e de contribuições teóricas mais gerais. E, na tentativa de delinear mais claramente esta relação, na etapa seguinte foi escolhido como objeto mais restritivo e específico o programa RHAE-Pesquisador na Empresa que, por sua vez, confirmou as dificuldades da consolidação de uma pretendida articulação entre as hélices do sistema. Desse modo, empreendemos uma pesquisa sociológica bastante ampla, mas que fez-se necessária, em virtude da dinâmica complexa inerente à temática escolhida.

Orientador: Sandra de Negraes Brisolla
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Geociencias
Made available in DSpace on 2018-07-27T01:20:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DalPoz_MariaEsterSoares_M.pdf: 7066563 bytes, checksum: 4fa2ae0545f461de380685f038969a48 (MD5) Previous issue date: 2000
Resumo: Esta dissertação apresenta um estudo do caso do Projeto Genoma Xylella (pGX), uma investida pública na área de política C&T da área de genética molecular. Em 1996, a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo percebe a lacuna que existia na área de genômica na base paulista de pesquisas. Era urgente que fosse instalado um programa de capacitação de pesquisadores, e, para tal, a bactéria Xyle/lafastidiosa teve seu genoma seqüenciado. O PGX tem o objetivo de inaugurar as pesquisas em genética molecular, contribuindo com a futura resolução da c/orose variegada do citros, importante fitopatologia das plantações de cítricos do Estado. Encontram-se aliados interesses da universidade, do governo e das empresas agro-industriais de cítricos. Daí o título ser "Da dupla à tripla hélice": analisa o caso do PGX, um programa de pesquisa sobre o DNA - a molécula em dupla hélice -frente às tríplices relações entre universidade, empresa e governo. São discutidos: 1) O contexto político-acadêmico daformulação e a implementação do PGX, no Capítulo 1, no qual são analisados os parâmetros científicos da tomada de decisão acerca do PGX e sua implementação, e o Capítulo 2, referente ao papel do setor de cítricos na definição do organismo a ser geneticamente seqüenciado. 2) Os nexos tecnológicos das pesquisas sobre a X fastidiosa, em termos da resolução do problema da CVC, vis-a-vis as redes de biotecnologia internacionais. O caso da rede norte-americana de pesquisa genômica é apresentado no Capítulo 3, e demonstra como os programas integrados de pesquisa e capacitação de recursos humanos em várias áreas do conhecimento, as políticas de captação de recursos financeiros e o estabelecimento de direitos de propriedade intelectual são equacionados em rede. Um círculo virtuoso de governança é estabelecido entre os setores acadêmico e empresarial, que se beneficiam da pesquisa cooperativa, elevando o aporte de recursos financeiros para programas públicos de pesquisa, originando spin o.ffs, e resultando em inovação. 3) O potencial e os obstáculos para aformação de redes de inovação em biotecnologia no Brasil, dadas as dinâmicas de produção de conhecimentos em genômica geradas pelo PGX Em termos científicos, o PGX alcançou todos seus objetivos, originando uma malha de pesquisas em genômica no Brasil e fora dele; alcançou visibilidade social e política e é hoje um modelo de gestão como programa de C&T, colocando o Brasil no contexto internacional do mercado de modernas biotecnologias derivadas de genômica. Diante do caráter semipúblico das informações genômicas no contexto internacional, os resultados de pesquisa básica originam biotecnologias, desde que três grupos de fatores condicionantes - integração das pesquisas com negócios de desenvolvimento de biotecnologias, criação de novas e alternativas formas de captação de recursos financeiros e organização de estrutura institucional sejam equacionados. O endereçamento destes fatores pode induzir a emergência de redes de bio-inovações, garantindo que os esforços de capacitação de pesquisadores e os resultados de pesquisa no Brasil não se restrinjam à fase de seqüenciamento genômico. Esta análise prospectiva constitui o Capítulo-Conclusão deste estudo
Abstract: This thesis examines the Genome Xylella Project (GXP) case, a govemmental effort of S&T policy in molecular genetics. In 1996, the Research Foundation ofthe State ofSão Paulo Research detected a research gap in genomics scientific area base. It was urgent to adress a hunian resources capacitation and research programo Then, Xylella fastidiosa, a bacterial organism, was chosen to have its genome sequenced. GXP was implemented, aiming at inaugurating molecular genetics research, that could contribute with citrus variegaded clorosis, a serious phyto-pathology of citrus crop, caused by X fastidiosa in the State of São Paulo. Interests of academia, principalloeus of knowledge production, govemment - represented by Fapesp - and agribusiness citrus production sector are aIlied. Thereftom is the title "From the double to triple helix". This is a GXP anaIysis, that is a DNA - the inherited double helix molecule - research program, in ftont of university-industry-govemment triple relationships. There are discussions regarding: 1) The PGXformulation and implemmentation processes, what is made in Chapter 1 and 2. 2) The technological nexus ofXfastidiosa scientific research vis-a-vis the international biotechnology networks. The USA genomics and biotech network case is presented in Chapter 3. It demonstrates how are sorted, in network, the integrated programs for the capacitation of human resources, in many knowledge areas, research funding mechanisms and research results apropriability roles management. As a result, this system brings modem biotech innovation. A govemance virtuous cycle is established, that makes a proclivity academic and entrepreneurialship sectors profit condition ftom cooperative research. This makes the increasing the funding resources for public research programs, creates spin offs and results in process and product innovation. 3) The potential and the obstacles of a biotech innovation network development in Brazil, since the genomics knowledge production dynamics inbreeded by GXP. In scientific terms, GXP has reached alI its objectives, and has originated a genomics research spot inside and outside Brazil; it has reached social and political visibility, and today is a multidisciplinar and interinstitutional model of management, that puts Brazil in the intemational genomic driven biotech marked context, for which scale and scope human resources are needed. In the face of semi-public character of genomic information in the intemational context, it is possible to transfer basic research results into biotechnologies, ever since three groups of conditional factors - basic research and biotech business, new and alternativeforms offunding criation and institutional structure organization - are equated. The adress of these factors may induce innovation networks emergence, assuring that researchers capacitation efforts and research results do not become restricted to genomic seftqencing fase. This prospective analysis constitutes the Conclusion-chapter ofthis study
Mestrado
Politica Cientifica e Tecnologica
Mestre em Política Científica e Tecnológica

ALENCAR, Rafael Silva. Propriedades vibracionais de nanotubos de carbono de parede tripla. 2012. 56 f. Dissertação (Mestrado em Física) - Programa de Pós-Graduação em Física, Departamento de Física, Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012.
Submitted by Edvander Pires (edvanderpires@gmail.com) on 2015-10-20T18:07:10Z No. of bitstreams: 1 2012_dis_rsalencar.pdf: 14324978 bytes, checksum: c3141fb65daa6e09440a353e83cd0d08 (MD5)
Approved for entry into archive by Edvander Pires(edvanderpires@gmail.com) on 2015-10-20T21:04:27Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_dis_rsalencar.pdf: 14324978 bytes, checksum: c3141fb65daa6e09440a353e83cd0d08 (MD5)
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The study of the electronic, mechanical and vibrational properties of the carbon nanotubes with few layers is important for developing and improving models that could describe the behavior of multi-walled carbon nanotubes (MWNTs), which is the kind of nanotube most used in technological applications. Several theoretical and experimental studies have been conducted for understanding the behavior of single and double walled carbon nanotubes (SWNT and DWNT, respectively) under high hydrostatic pressures. However, the behavior of triple walled carbon nanotubes (TWNTs) under such conditions is still unknown. Here, we present a study of resonance Raman spectroscopy in TWNTs as function of hydrostatic pressure. We used paraffin oil and a mixture of methanol:ethanol in 4:1 ratio as pressure transmitting media (PTM) and a diamond anvil cell (DAC) for applying pressure. The evolution of the radial breathing modes (RBM) and the tangential modes (G band) as a function of pressure was analyzed in detail and compared with existing results for SWNTs and DWNTs. The Raman spectroscopy data show that the shielding effects of inner tubes in TWNTs are more pronounced than in DWNTs. The changes in the intensities of Raman modes were interpreted as being associated with pressure induced changes in the resonance conditions.
O estudo das propriedades eletrônicas, mecânicas e vibracionais dos nanotubos de carbono com poucas camadas é importante para desenvolver e aprimorar os modelos que descrevem o comportamento dos nanotubos de parede múltipla, que é o tipo de nanotubo mais usado em aplicações tecnológicas. Diversos estudos teóricos e experimentais têm sido realizados visando o entendimento do comportamento dos nanotubos de carbono de paredes simples e dupla (SWNT e DWNT, respectivamente) submetidos a altas pressões hidrostáticas. Entretanto, o comportamento de nanotubos de carbono de parede tripla (TWNTs) sob tais condições é ainda desconhecido. Neste trabalho, apresentamos um estudo de espectroscopia Raman ressonante em TWNTs em função da pressão hidrostática. Utilizamos óleo de parafina (Nujol) e uma mistura de metanol:etanol na proporção de 4:1 como meios transmissores de pressão (PTM) e uma célula de pressão de bigorna de diamante (DAC-Diamond Anvil Cell) para a aplicação da pressão. A evolução dos modos radiais (RBM) e tangenciais (Banda G) em função da pressão foi analisada de forma detalhada e comparada com os resultados existentes para os nanotubos de parede simples e dupla. Os dados de espectroscopia Raman mostram que os efeitos de blindagem internos dos TWNTs são mais acentuados que nos DWNTs. As modificações nas intensidades dos modos Raman foram interpretadas como sendo associadas as mudanças nas condições de ressonância dos modos RBM em função da pressão.

Orientador: Everson Alves Miranda
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica
Made available in DSpace on 2018-07-25T18:39:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tamagawa_RosanaEmi_M.pdf: 11882548 bytes, checksum: d2bd23974f6d646f4758b4919437dd5e (MD5) Previous issue date: 1999
Resumo: Aprotinina é uma proteína presente em alguns órgãos bovinos (tais como pâncreas, fígado e pulmão). Devido sua propriedade de inibição de serino-proteases possui diversas aplicações, inclusive na área médica. O objetivo deste trabalho foi a recuperação de aprotinina a partir de efluente do processamento industrial de insulina bovina através da técnica IMAC ("Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography"). Uma vez que a aprotinina não possui o requerimento básico para adsorção em matrizes IMAC (resíduos de histidina disponíveis na superfície da molécula) a estratégia deste trabalho baseou-se na formação do complexo do inibidor com tripsina. A primeira etapa do trabalho que consistiu no estudo da adsorção de complexo a partir de solução tampão mostrou a possibilidade do processo utilizando matriz IMAC sílica-EDA-Cu2+. A remoção de complexo a partir de solução tampão não foi influenciada pelo aumento do pH de 7,0 a 8,5. Entretanto, foi significantemente afetada pela força iônica com maiores capacidades de adsorção com o decréscimo da concentração de NaCl de 1,0 para 0,5 M. Capacidades de adsorção de até 20 miligramas de complexo por grama de matriz foram obtidas. A dessorção foi conduzida contactando-se a matriz contendo complexo adsorvido com tampão a baixo pH (2,1). A força iônica teve um efeito significativo nesta etapa: a eficiência de dessorção foi elevada de 40 a cerca de 100% com a adição de 1,0 M de NaCl no tampão de dessorção O segundo estágio deste trabalho foi o estudo da adsorção de complexo a partir do efluente industrial. Primeiramente, a verificação da adsorção de impurezas (proteínas do efluente) sugeriu baixa especificidade na adsorção do complexo devido intensa adsorção destas impurezas. Esta baixa especificidade foi confirmada com a adsorção de complexo a partir do efluente industrial. Alguma seletividade foi alcançada com a dessorção em duas etapas como verificado através de eletroforese SDS-PAGE: numa primeira etapa eluiu-se com tampão a pH baixo principalmente impurezas e nenhum complexo ao passo que, numa segunda etapa da dessorção, obteve-se eluição significativa de complexo com tampão a pH baixo na presença de NaCl a 1,0 M
Aprotinin is a small protein present in some bovine organs (pancreas, liver and lung). It is a serine-protease inhibitor that has medical applications. The objective of this work was to recover aprotinin from industrial insulin production effluent by IMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography). Since aprotinin does not have the basic requirements for adsorption onto IMAC matrices (available histidine residues on its surface), the approach used for its recovery was to exploit its complex formation with trypsin. The first stage of this work was the study of adsorption of the aprotinin-trypsin complex from buffer solutions. Stirred tank batch type experiments indicated that the complex could be adsorbed onto an IMAC matrix (silica-IDA-Cu2+). The increase of pH from 7.0 to 8.5 did not affect the uptake of complex from solution. However, adsorption capacity was significantly affected by ionic strength: higher capacity values were obtained as the ionic strength was decreased in the range from 1.0 to 0.5 M NaCl. Adsorption capacities as high as 20 milligram of complex per gram of matrix were achieved. Desorption was carried out by contacting the complex containing matrix with a low pH buffer (pH 2.1). The ionic strength had a strong effect in this step: the desorption efficiency increased from 40 to virtually 100% when 1 M of NaCl was added to the desorption buffer. The second stage of the work was complex adsorption out of the industrial effluent. First, evaluation of the adsorption of impurities (effluent proteins) suggested low specificity of complex adsorption due to intense adsorption of these impurities. This low specificity was confirmed with complex adsorption after spiking the effluent with stoichiometric amounts of trypsin and aprotinin Some selectivity was achieved with the desorption step as verified by SDS-PAGE: desorption with buffer at low pH eluted mainly impurities and no complex; addition of 1.0 M NaCl in a second desorption treatment allowed the elution of complex besides some impurities
Mestrado
Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos
Mestre em Engenharia Química

Orientador: Valdemiro Carlos Sgarbieri
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos
Made available in DSpace on 2018-07-21T04:31:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carvalho_MariaReginaBarbieriDe_D.pdf: 28183156 bytes, checksum: bf7a539a7aa882bc0e3dbf77dd91a0ab (MD5) Previous issue date: 1996
Doutorado

Orientador: Sergio Marangoni
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-05T02:12:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_JoseAntonioda_D.pdf: 21581539 bytes, checksum: 099864fc5149a9352616af17207c291d (MD5) Previous issue date: 2004
Resumo: As técnicas utilizadas no esclarecimento de estruturas macromoleculares estão situadas em campos interdisciplinares, onde os pesquisadores encontram-se unidos por um interesse comum, no sentido de detalhar o entendimento da função biológica e a relação com sua estrutura primária e tridimensional. Os inibidores de sementes de leguminosas são encontrados sob várias isoformas. Alguns métodos, como a espectrometria de massas, determinação da seqüência Nterminal e eletroforese bidimensional, vêm sendo amplamente explorados com o propósito de caracterizar melhor as isoformas presentes em sementes. A eletroforese bidimensional do inibidor de tripsina de Copaíba (CTI) revelou a presença de vários spots na faixa de 11 e 9 kDa. CTI foi resolvido em dois picos (CTI-I e CTI-II) quando submetido à cromatografia de fase reversa em coluna C18 em sistema HPLC. Esses picos distintos foram submetidos à eletroforese bidimensional sendo três spots observados para CTI-I com pl de 8.0, 8.5 e 9.0 e três spots para CTI-II com pl de 4.7, 4.6 e 4.3. A análise por espectrometria de massa foi realizada para as subunidades CTI-I e CTI-II objetivando determinar as massas moleculares acuradas e prováveis números de isoformas para cada subunidade. Os espectros confirmaram uma heterogeneidade para CTI-I e CTI-II com predominância dos picos de massa 10.719 e 8.244, respectivamente. A impossibilidade em seqüenciar todos os spots para cada subunidade de CTI, norteou a escolha dos spots A e F de forma continuar os estudos de sequenciamento. Os spots A e F foram submetidos a digestões enzimáticas com as proteases tripsina, SV8 e clostripaína. A massa exata dos peptídeos de cada digesto foi determinada por espectrometria de massas utilizando MALDI- TOF. Os peptídeos mais intensos foram purificados e seqüenciados em um HPLC capilar acoplado ao espectrômetro de massas ESI QTOF. A estrutura primária final de CTI, determinada a partir da massa dos peptídeos das digestões enzimáticas e da seqüência obtida por espectrometria de massas indicou 182 resíduos de aminoácidos, apresentando elevado grau de homologia em relação a outros inibidores de tripsina do tipo Kunitz de vegetais; inclusive com o resíduo de arginina na posição do sítio reativo. A estrutura cristalográfica CTI foi resolvida, revelando que este inibidor é composto por duas cadeias polipeptídicas não covalentemente ligadas e possui apenas uma ponte dissulfeto. t de as diferenças estruturais, CTI é um inibidor efetivo de tripsina com uma constante de dissociação de 1,2 nM, da mesma ordem de grandeza que os inibidores padrões como STI, ETI ou WCI. Sua estrutura tridimensional revela que isso se deve ao fato de que as discrepâncias estruturais não afetam a conformação canônica do seu loop reativo. A comparação entre a seqüência deduzida dos mapas experimentais da densidade eletrônica e a seqüência determinada por 2D-PAGE e espectrometria de massas MALDI-TOF e ESI-QTOF, mostra um acordo de aproximadamente 75%, que pode ser devido à presença de várias isoformas que é um aspecto comum das proteínas extraídas de sementes. Experimentos objetivando a determinação dos residuos de aminoácidos importantes na atividade inibitória de CTI foram realizados utilizando reagentes modificadores específicos. O inibidor CTI foi inativado em 48 e 81% por EDC e PGO, respectivamente. Esses compostos atuam em grupos carboxila de Asp e Glu (EDC) e resíduos de arginina (PGO) , indicando funcionalmente a importância do resíduo de arginina na interação do inibidor com a protease. Estudos da estabilidade conformacional em diferentes pHs, temperaturas e agentes caotrópicos fomecem importantes informações sobre a biogênese e estrutura das proteínas. Um estudo verificando o efeito de agentes físico-químicos (pH, temperatura, DTT, uréia e cIoreto de guanidina) na estabilidade conformacional do inibidor de tripsina (CTI) purificado de sementes de Copaifera langsdorffii foi realizado. CTI, um inibidor atípico da família Kunitz, demonstrou ser resistente em sua estabilidade funcional, apesar de sofrer prejuízos na estrutura quatemária após redução em 1 mM DTT como evidenciado por SDS-PAGE, gel filtração em protein-pack, experimentos cinéticos, espectros de fluorescência e de dicroísmo circular. Os experimentos de desnaturação em função dos agentes caotrópicos foram monitorados pela intensidade de fluorescência dos resíduos de triptofano. A desnaturação de CTI na presença de agentes caotrópicos mostrou ser um processo reversível após diálise, para estrutura e função no caso da uréia e do cloreto de guanidina. Os resultados indicaram que a desnaturação de CTI envolve pelo menos dois estágios: nativo e desnaturado. A presença de 3.5 M de uréia ou GdnHCI inibiu 50% e 100% da atividade inibitória, respectivamente. Ambos agentes caotrópicos promoveram um deslocamento do centro de massa. O cálculo da estabilidade conformacional AG (H20) foi feito tomando-se o deslocamento nos comprimentos de onda máxima de emissão de fluorescência como parâmetro. O AG (H2O) em função da concentração de uréia e guanidina foi de 63.0 e 54.0 Kcal mol-1, respectivamente. Os cálculos de centro de massa foram tomados em função da concentração do agente desnaturante em ambos os casos
Abstract: The techniques used in the clarification of macromolecular structures are situated in interdisciplinary fields, where the researchers find themselves united by a common interest in detailing the agreement of the biological function and the relation with its primary and threedimensional structure. The inhibitors of leguminous seeds are found under severa I isoforms. Some methods, as the mass spectrometry, determination of the N-terminal sequence and bidimensional electrophoresis have been widely explored with the purpose of better characterizing these isoforms in seeds. The bidimensional electrophoresis of the Copaiba trypsin inhibitor (CTI) disclosed to the presence of several spots in the 9 and 11 kDa. CTI was resolved in two peaks (CTI-I and CTI-II) when submitted to the reverse phase chromatography in C18 column in HPLC system. These distinct peaks had been submitted to bidimensional electrophorese, 3 spots had been observed for CTI-I with pl of 8.0, 8.5 and 9.0 and three spots for CTI-II with pl of 4.7, 4.6 and 4.3. The analysis for mass spectrometry was carried through for subunits CTI-I and CTI-II objectifying to determine the accurate molecular masses and probable numbers of isoforms for each subunit. The specters had respectively confirmed microheterogeneity for CTI-I and CTI-II with predominance ofthe peaks ofmass 10,719 and 8,244, respectively. The impossibility to sequence ali spots for each subunit of CTI guided the choice of spots more intense (A and F) to continue the sequence studies. Spots A and F had been submitted to the enzymatic digestions with proteases trypsin, SV8 and clostripain. The accurate mass of the peptide of each digest was determined by mass spectrometry using MALDI-TOF MS. The most intense peptides were been purified and sequenced in a LC connected to the spectrometer of mass ESI QTOF. The primary structure of CTI, determined trom the mass of the peptide of the enzymatic digestions and the sequence gotten for mass spectrometry indicated 182 residues of amino acids, presenting a raised degree of similarity to other Kunitz-type inhibitors of the plant, also with the residue of arginine in the position of the reactive site. The crystallographic structure of CTI inhibitor was solved and reveals that, CTI is composed by two non-covalently bound polypeptide chains and only one disulfide bridge. In spite of these structural differences, CTI is an effective trypsin inhibitor with a dissociation constant of 1.2 nM, a value comparable to other standard Kunitz-type inhibitors like STI, ETI or WCI. It three-dimensional structure reveals that this is because the structural discrepancies do not affect the canonical conformation of reactive loop of CTI. The comparison between the sequence deduced from the experimental electron density maps and the sequence determined using 2D-PAGE, MALDI- TOF and ESI-QTOF mass spectrometry shows an agreernent of about 75%, which can be due to the presence of various isoforms that is a common aspect of proteins extracted trom seeds. Experiments objectifying the determination of the important amino acid residues in the inhibitory activity of the CTI were perfomed using specific modifying reagents. The CTI inhibitor was inactivated in 48 and 81% for EDC and PGO, respectively. These composites act in carboxyl group of Asp and Glu (EDC) and residues of arginine (PGO), indicating functionally the importance of the arginine residue in the interaction of inhibitor with protease. Studies of the conformacional stability in different pHs, temperatures and chaotropic agents have given a wealth of information on the structure and biogenesis of proteins. A study verifying the effect of physico-chemical agents (pH, temperature, DTT, urea and guanidine hydrochloride) in the conformacional stability of trypsin inhibitor (CTI) purified trom seeds trom Copaifera langsdorffii was carried through. CTI an atypical inhibitor of the Kunitz family demonstrated to be resistant in its functional stability, although suffering trom damages in the quatemary structure with reduction in 1 mM DTT as evidenced for SDS-PAGE, gel filtration in protein-pack, kinetic experiments, spectrum of fluorescence and circular dichroism. The denaturation experiments in function of the chaotropic agents were monitored by the intensity of the fluorescence of tryptofan residues. The CTI denaturation in the presence of chaotropic agents showed to be a reversible process after dialysis, for structure and function in the case of the urea and guanidine chloride. The results had indicated that the denaturation of CTI involves at least two steps: native and denatured. The presence of 3.5 M of urea or GdnHCI inhibited 50% and 100% of the inhibitory activity, respectively. 80th chaotropic agents had promoted a displacernent of the mass center. The conformational stability calculations dG (H2O) were made by taking the wavelengths corresponding to the maximum fluorescence emission as a pararneter. The dG (H2O) value in function of the concentration of urea and guanidine chloride were 63,0 and 54,0 Kcal mol-1, respectively. The calculations of center of mass were taken as a function of the denaturating agent concentration in both cases
Doutorado
Bioquimica
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015.
Made available in DSpace on 2015-11-10T03:09:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 335902.pdf: 2687568 bytes, checksum: e03093465c18cbe2c270a6e5604b628f (MD5) Previous issue date: 2015
Entre as patologias que acometem a articulação temporomandibular (ATM), a doença articular degenerativa, ou osteoartrite (OA), constitui-se a mais comum. Estima-se que 10% da população mundial com idade acima de 60 anos sofre de algum tipo de dor associada à OA, sendo considerada uma doença relacionada à idade. Entre gêneros, sua prevalência apresenta proporções acima de 2:1 para mulheres. Dessa maneira, o presente trabalho teve por objetivo avaliar comportamental e farmacologicamente a eficácia do composto iodoacetato monossódico (MIA) injetado na ATM de ratos. A injeção bilateral (50 µl) de MIA foi aplicada no compartimento superior da ATM dos animais. Para avaliar alterações nociceptivas e funcionais, procederam-se testes de observação comportamental nociceptiva (OCN) e ingesta alimentar (IA). Inicialmente, realizou-se uma curva dose-resposta do MIA (doses de 0,5; 1; 2 e 3 mg) para padronização da dose capaz de reproduzir alterações nociceptivas e funcionais na articulação durante 21 dias. A dose de 0,5 mg de MIA foi a menor dose responsiva capaz de sustentar as alterações durante todo o protocolo e demonstrar características crônicas do modelo. Para validação farmacológica do modelo, tratamentos utilizando fármacos mais comuns para dor da OA temporomandibular foram realizados no sétimo dia após injeção do MIA: dexametasona (2,5; 4 e 6 mg/kg, i.p.); naproxeno (30,9 e 61,8 mg/kg, v.o.); celecoxibe (6,3; 12,6 e 25,1 mg/kg, v.o.); paracetamol (30 e 45 mg/kg, v.o.); morfina (1, 2 e 4 mg/kg, i.p.); amitriptilina (1,5 e 10,8 mg/kg, i.p.). Além destes, como proposta experimental, avaliou-se a tripsina (0,75; 1,5; 2,95 e 6 mg/kg, v.o.). Os mesmos foram testados quanto a sua capacidade analgésica nos testes de OCN e IA. Os fármacos dexametasona (4,6 mg/kg), paracetamol (30 mg/kg), morfina (4 mg/kg), amitriptilina (10,8 mg/kg) e tripsina (1,5 mg/kg) foram capazes de alterar para padrões positivos todos os comportamentos observados (coçar com a pata traseira, chacoalhar de cabeça, repousar/dormir e mastigar). Contudo, os AINES celecoxibe (12,6 mg/kg) e naproxeno (30,9 mg/kg) foram capazes de reduzir apenas o tempo do comportamento de mastigar e o número de chacoalhadas de cabeça. Em relação ao teste de IA, somente a dexametasona e o paracetamol não elevaram a quantidade de ração ingerida pelos animais. Ainda, a vagotomia subdiafragmática foi capaz de inibir a ação da tripsina (1,5 mg/kg, v.o.) sobre os testes nociceptivos, sugerindo uma relação entre nervo vago e a atividade da protease. Em suma, a injeção de MIA na ATM levou a alterações comportamentais nociceptivas, bem como prejuízo funcional da articulação durante 21 dias, além de responder à abordagem farmacológica comum da OA, revelando perfil semelhante à patologia humana e, dessa forma, constituindo-se promissor e consistente modelo para estudo da OA na ATM.

Abstract : The degenerative joint disease, also known as osteoarthritis (OA), is among the most common pathologies affecting the temporomandibular joint (TMJ). Around 10% of worldwide people over 60 years suffer from some pain related to OA and, therefore, it is considered an age-related disease. Among genders, its prevalence shows ratios over 2:1 for women. Therefore, this study aimed to evaluate pharmacological and behaviorally the effectiveness of monosodium iodoacetate compound (MIA) injection into TMJ of rats. Bilateral MIA-injection (50 µl) was applied into the TMJ upper compartment. To assess nociceptive and functional changes, nociceptive behavioral observation (NBO) and food intake (FI) tests were conducted. Initially, to evaluate the lowest dose capable of reproducing joint nociceptive and functional changes, a dose-response curve (0.5, 1, 2 e 3 mg/kg) was performed throughout 21 days. MIA 0.5 mg dose was the lowest responsive dose, holding the changes throughout entire protocol and demonstrating chronic features of the model. Thus, for pharmacological validation of the MIA model as TMJ-OA inducer, the most common drugs to OA pain treatment were assessed on day 7th after MIA injection: dexamethasone (2.5, 4 e 6 mg/kg, i.p.); naproxen (30.9 e 61.8 mg/kg, p.o.); celecoxib (6.3, 12.6 e 25.1 mg/kg, p.o.); paracetamol (30 e 45 mg/kg, p.o.); morphine (1, 2 e 4 mg/kg, i.p.); amitriptyline (1.5 e 10.8 mg/kg, i.p.). Addition to these, as an experimental proposal, trypsin (0.75, 1.5, 2.95 e 6 mg/kg, p.o.) was assayed. The drugs were assessed regarding their analgesic power in the NBO and FI tests. The drugs dexamethasone (4.6 mg/kg) paracetamol (30 mg/kg), morphine (4 mg/kg), amitriptyline (10.8 mg/kg) and trypsin (1.5 mg/kg) were able to change to positive patterns all observed behaviors (scratching, head flinching, rest/sleep and chewing-like). However, NSAID celecoxib (12.6 mg/kg) and naproxen (30.9 mg/kg) were able to reduce only chewing-like behavior and the number of head flinchings. Regarding the FI test, only acetaminophen and dexamethasone did not improve the amount of food taken by animals. Furthermore, the subdiaphragmatic vagotomy was capable of inhibiting the trypsin action on nociceptive tests, suggesting a relationship between vagus nerve and trypsin activity. In summary, TMJ MIA-injection led to nociceptive behavioral changes, as well as joint functional impairment throughout 21 days, besides of answering to common pharmacological approach of OA, revealing similar profile to human pathology and, thereby, becoming a promising and consistent model for TMJ-OA study.

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CAPES
Proteases estão entre as mais produzidas no mundo. Dentre elas a tripsina é a mais utilizada em diversas áreas da biotecnologia. A purificação de biomoléculas por partículas magnéticas baseia-se na interação dos ligantes, componentes químicos presentes na superfície das partículas, com a molécula alvo. Neste trabalho, foram preparados dois compósitos magnéticos: o primeiro a partir de azocaseína e óxido de ferro (mAzo) e o segundo, a partir de partículas de óxido de ferro revestidas com polianilina tratadas com azocaseína (mPANI-Azo). Os novos compósitos foram avaliados como matriz para a purificação de tripsina de extrato bruto de Tilapia (Oreochromis niloticus). Uma caracterização físico-química do compósito magnético (mAzo) foi também realizada para descrever as principais características do material sintetizado. Os resultados da purificação mostraram que as partículas mAzo e mPANI-Azo permitiram purificar o extrato bruto de peixe, sem nenhum pré tratamento, 61 vezes e 43 vezes, respectivamente. A eletroforese (SDS-PAGE) da alíquota purificada revelou uma banda a 24 kDa, valor compatível com tripsina obtida de vísceras de tilapia. As analises das técnicas de caracterização (MEV-EDX, DRX, FTIR e medidas de magnetização) evidenciaram o sucesso da síntese do compósito magnético (mAzo). Além disso, foi observado que as partículas mAzo são heterogêneas e apresentam rápida resposta magnética. Por fim, ao purificar a tripsina com precipitação, dialise e mAzo obteve-se um aumento da purificação de até 220 vezes. Concluímos que o compósito magnético mAzo mostrou ser uma matriz eficiente para a purificação de e o reuso do manteve a qualidade da purificação. Nesta pesquisa desenvolvemos uma técnica de purificação simples, eficaz e econômica que pode ser utilizada para a purificação de proteases utilizando as partículas mAzo como matriz.
Proteases are among the most produced in the world. Among them trypsin is the most used in several areas of biotechnology. The purification of biomolecules by magnetic particles is based on the interaction of the binders, chemical components present on the surface of the particles, with the target molecule. In this work, two magnetic composites were prepared: the first from azocasein and iron oxide (mAzo) and the second from iron oxide particles coated with azacasein-treated polyaniline (mPANI-Azo). The new composites were evaluated as a matrix for the purification of trypsin from Tilapia (Oreochromis niloticus) crude extract. A physical-chemical characterization of the magnetic composite (mAzo) was also performed to describe the main characteristics of the synthesized material. The results of the purification showed that the mAzo and mPANI-Azo particles allowed to purify the fish crude extract, without any pretreatment, 61 times and 43 times, respectively. Electrophoresis (SDS-PAGE) of the purified aliquot revealed a band at 24 kDa, trypsin compatible value obtained from tilapia viscera. The analysis of the characterization techniques (SEM-EDX, XRD, FTIR and measurements of magnetization) evidenced the success of the synthesis of the magnetic composite (mAzo). In addition, it was observed that the mAzo particles are heterogeneous and have a fast magnetic response. Finally, after precipitation, dialysis and mAzo treatment, a purification increase up to 220 times was obtained. We conclude that the magnetic composite mAzo has proved to be an efficient matrix for the purification and reuse of the quality of the purification. In this research we have developed a simple, efficient and economical purification technique that can be used for the purification of proteases using the mAzo particles as matrix.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:50Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3112_1.pdf: 7058509 bytes, checksum: c034ea1869017a968a8ceca4f8707aae (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
O tambaqui (Colossoma macropomum) é um peixe de importância comercial no Brasil e por isso, o estudo das biomoléculas obtidas a partir do processamento dos seus resíduos pode agregar valor à produção deste animal nativo dos rios e lagos amazônico. Dentre as biomoléculas de maior interesse comercial estão as peptidases alcalinas, como a tripsina, sendo elas aplicáveis em processos industriais e de biorremediação. Visando um aprofundamento do estudo das enzimas de peixes para aplicação comercial, o presente trabalho teve como objetivo purificar uma peptidase dos cecos pilóricos do tambaqui, através de um processo desenvolvido em quatro etapas (aquecimento, fracionamento salino, gel filtração e afinidade). A enzima purificada apresentou massa molecular de 23,9 kDa e sequência NH2-terminal IVGGYECKAHSQPHVSLNI. Na caracterização físico-química desta enzima com z-FR-MCA (substrato fluorogênico), a atividade mais alta foi observada no pH e temperatura de 9,0 e 50°C, respectivamente. Já nos experimentos com o substrato cromogênico BAPNA, a atividade máxima da enzima foi encontrada na faixa de pH entre 7,5 to 11,5 e na temperatura de 70°C. Quanto à sua estabilidade térmica, a enzima manteve mais de 60% da sua atividade inicial após 3h a 60°C, mas foi completamente desnaturada após passar o mesmo tempo a 70°C. A enzima foi significativamente inibida por TLCK e benzamidina (inibidores específicos de tripsina), bem como por PMSF (inibidor de serino peptidases) e pelos íons Al+3, Cu+2, Hg+2, Pb+2 Zn+2 e Ni+2. A especificidade de hidrólise desta enzima foi avaliada com duas séries de substratos fluorogênicos sintéticos (Abz- XRFK-Dnp-OH and Abz-RXFK-Dnp-OH), apresentando especificidade pelo aminoácido arginina na posição P1 e alta eficiência para a hidrólise de substratos com leucina (L) e lisina (K) na posição P2 e serina (S) e arginina (K) na posição P1 , sendo também capaz de hidrolisar substratos com prolina (P) na posição P1 . Na presença dos sabões em pó Omo multi ação®, Bem-te-vi®, Minerva® e Ala®, a enzima purificada do tambaqui manteve mais de 70% da sua atividade proteolítica, apresentando estabilidade semelhante à Alcalase® e sendo mais estável que a tripsina comercial de porco Sigma®. A enzima do tambaqui também se manteve estável na presença de tenso-ativos, como Triton X-100, SDS, Tween 20, Tween 80 e Chaps, bem como o agente oxidante, H2O2, em várias concentrações. Esses resultados indicam a versatilidade e estabilidade da tripsina-símile purificada

Este trabalho discute e analisa os processos harmônicos utilizados numa composição eletroacústica mista para Flauta tripla e tape denominada "Uma visão dimensional de uma gama tripla". O tape desta peça musical está composto de sons de diversos tipos de flautas étnicas, wind controller e sons de aplicativos para celulares. Os eventos musicais do tape estão construídos sobre escalas mesoamericas utilizadas na música para marimbas da região de Guanacaste (Costa Rica) discutidas e detalhadas por Acevedo (1986). A Flauta tripla executada nesta peça é uma versão moderna da Flauta triple deTenenexpan (Veracruz, México) conforme publicação de Boiles e Lafayette na revista da Universidad de Veracruz, em 1965. Os processos harmonicos e as técnicas estendidas utilizadas na peça são comparados com cinco peças do repertório da flauta doce: Fragmente (Shinohara, 1968), Music for a bird (Martin Linde, 1968), Gesten (Klaus Hashagen, 1966), East Wind (Barry Truax, 1981),e Kage (Roderik de Man, 2000). As composições: Fragmente e Music for a bird foram concebidas para flauta doce solo e as composições Gesten, East Wind e Kage são composições eletroacústicas mistas. As referências culturais inseridas em "Uma visão dimensional de uma gama tripla" também são analisadas e correspondem a objetos encontrados em sítios arqueológicos da Ámerica Central, a arquitetura mesoamericana, os desenhos e figuras geométricas, elementos da natureza e animais das regiões mencionadas, os instrumentos musicais comuns às civilizações pré-colombianas (maia e inca). O uso de diferentes digitações na execução da flauta tripla, o uso de técnicas estendidas, a utilização de amostras sonoras de instrumentos que não necessariamente seguem o temperamento igual e o processamento dos sons que constituem a parte eletroacústica revelam uma atenção especial às questões tímbricas. O resultado geral da obra corresponde a uma ampliação da palheta sonora que se obteria com o instrumento solo por meio da exploração das possibilidades musicais da flauta tripla (execução de acordes, sobreposições de notas e técnicas estendidas) no contexto da música eletroacústica mista. Isso permitiu explorar relações e diálogos entre as flauta tripla e uma ampla gama de sonoridades do tape.
This dissertation analyzes the harmonic processes used in an electroacoustic composition for triple flute and tape called "Uma visão dimensional de uma gama tripla". The tape of this piece consists of sounds produced by several types of ethnic flutes, wind controller and applications for smartphones. The musical events of the tape are based on mesoamerican scales used in music for marimbas from the Guanacaste (Costa Rica) region, as discussed and detailed by Acevedo (1986). The Triple Flute performed on this piece is a modern version of the Tenenexpan Triple Flute (Veracruz, Mexico), as published by Boiles and Lafayette in a journal of the University of Veracruz in 1965. The harmonic processes and extended techniques used in the piece “Uma visão dimensional de uma gama tripla” are compared with five other pieces of the contemporary repertoire for recorder: Fragmente (Shinohara, 1968), Music for a bird (Martin Linde, 1968), Gesten (Klaus Hashagen, 1966), East Wind (Barry Truax, 1981), and Kage (Roderik de Man, 2000). Fragment and Music for a Bird were composed for solo recorder Gesten, East Wind and Kage are mixed electroacoustic compositions. The cultural references included in the piece "Uma visão dimensional de uma gama tripla" are also analyzed. They correspond to objects found in archeological sites inCentral America, to features of the Mesoamerican architecture, geometric drawings and figures, elements of nature and animals of the regions mentioned, and also musical instruments that are common to pre-Columbian civilizations (Maya and Inca). The use of different types of fingerprints in the execution of the triple flute, the use of extended techniques, the use of sound samples of instruments that do not necessarily follow the same temperament and the processing of the sounds that make up the electroacoustic part show special attention to timbral issues. The overall result of the work corresponds to an amplification of the sound pick that would be obtained with the solo instrument through the exploration of the musical possibilities of the triple flute (chord execution, note overlays and extended techniques) in the context of mixed electroacoustic music. This allowed him to explore relationships and dialogues between the triple flute and a wide range of sonorities of the tape..
Dissertação (Mestrado)

Frente à crescente necessidade de que novas tecnologias sejam capazes de operar com confiabilidade em ambientes hostis, a análise dos efeitos da radiação ionizante em dispositivos semicondutores se tornou um ramo de pesquisa em contínua ascensão, contribuindo para o desenvolvimento de tecnologias estratégicas e promovendo o aprimoramento científico e o desenvolvimento tecnológico da humanidade. Por outro lado, a atual tecnologia CMOS de fabricação de circuitos integrados apresenta sinais de limitação, em grande parte, devido às características físicas inerentes ao seu princípio de funcionamento, sendo necessário, portanto, que dispositivos com novos mecanismos de operação e geometrias sejam desenvolvidos. Dentre eles, transistores de tunelamento induzido por efeito de campo (TFET) se destacam por apresentarem menor corrente de dreno quando desligados e a possibilidade de se atingir inclinações de sublimiar abaixo do limite teórico estabelecido por dispositivos MOSFET de 60 mV/déc à temperatura ambiente, permitindo-se a redução da tensão de alimentação dos transistores para cerca de 0,5 V. Buscando contribuir com as necessidades destas duas áreas de pesquisa, neste projeto de mestrado, foi analisado o comportamento de TFETs de silício com porta tripla, fabricados sobre lâmina SOI (silício sobre isolante), submetidos a até 10 Mrad(Si) de dose acumulada total enquanto não polarizados, gerada por uma fonte de prótons de 600 keV de energia. Em uma análise inicial, após exposição de dispositivos de 1 µm de largura de aleta a uma dose de 1 Mrad(Si), foi possível observar uma redução no nível corrente de dreno de estado ligado do dispositivo (ION ? 300 pA) de até 10%, não associada à uma alteração da corrente de porta. Além disso, o efeito da radiação nesses transistores reduz de 10% para 2% quando se aumenta o comprimento do canal de 150 nm para 1 µm. As razões para ambos os fenômenos foram discutidas com base na competição entre os efeitos de divisão da corrente de dreno na primeira e segunda interfaces e do aumento da resistência de canal em dispositivos mais longos. Para uma análise em função da dose acumulada total, dispositivos SOI TFET e SOI MOSFET, ambos de porta tripla, foram caracterizados eletricamente 14 dias após cada etapa de irradiação. De maneira geral, dispositivos de ambas as tecnologias, com largura de aleta igual a 40 nm, apresentaram baixa susceptibilidade aos efeitos cumulativos da radiação ionizante. No entanto, quando considerados dispositivos com largura de aleta muito maior que a altura da aleta (WFIN = 1 µm), nos quais a influência das portas laterais sobre o acoplamento eletrostático do canal é praticamente inexistente, transistores túnel-FET se destacaram positivamente. Esses dispositivos se mostraram resistentes aos efeitos de dose ionizante total (TID) mesmo para doses de 5 Mrad(Si), enquanto os transistores SOI MOSFET apresentaram uma variação gradual de seus parâmetros a cada dose acumulada. Um exemplo disso é a variação observada na inclinação de sublimiar, de 32,5% nos transistores SOI MOSFET e 5,6% nos transistores SOI TFET. Somente após 10 Mrad(Si) de irradiação por prótons é que os TFETs de aleta larga apresentaram variações mais significativas em sua curva de transferência (ID x VG). Tanto para a configuração como tipo P quanto para a configuração como tipo N, notou-se um deslocamento de até 80 mV da curva de transferência do dispositivo para a esquerda, provocado, segundo análise via simulações, pelas cargas fixas positivas geradas pela irradiação no óxido enterrado do dispositivo. Adicionalmente, foi possível observar um aumento da corrente de tunelamento assistido por armadilhas (TAT) nesses dispositivos, provocada pelo aumento da densidade de estados de interface causada também pelos efeitos de TID. O aumento de TAT foi reconhecido como o principal responsável pela degradação de 23,3% da inclinação de sublimiar dos TFETs, com WFIN igual 1 µm, após 10 Mrad(Si). Apesar das mudanças observadas, foi possível se sugerir, através da comparação com transistores SOI MOSFET de dimensões equivalentes, que transistores de tunelamento induzido por efeito de campo podem, futuramente, se tornar referência no quesito imunidade aos efeitos de dose ionizante total.
In light of the increasing need for new technologies to be able to operate reliably in harsh environments, the analysis of the effects of ionizing radiation on semiconductor devices has become a continually rising field of research, contributing to the development of strategic technologies and promoting scientific improvement and technological development of humankind. On the other hand, the current CMOS technology for the manufacture of integrated circuits shows signs of limitation, mostly, due to the physical characteristics inherent to its operating principle, thus, it is necessary that devices with new operating mechanisms and geometries be developed. Among them, tunnel field-effect transistors (TFET) stand out because of its lower OFF state current and the possibility of reaching subthreshold swing below the theoretical limit established by MOSFET devices of 60 mV/dec at room temperature, allowing to reduce transistors supply voltage to about 0.5 V. In order to contribute with both areas, the behavior of silicon based triple gate TFETs fabricated on a SOI (silicon-on-insulator) substrate and exposed to a total cumulative dose of 10 Mrad (Si) (while not biased) generated by a 600 keV proton beam was analyzed. In an initial analysis after exposure of 1 µm width devices to 1 Mrad(Si), it was possible to observe an ON state current reduction (ION ? 300 pA) up to 10%, not associated to a gate current change. Beyond that, irradiation effects on these devices reduce from 10% to 2% with the channel length increasing from 150 nm to 1 µm. The reasons behind these phenomena were discussed based on the competition between a high channel resistance present in longer devices and the TFET drain current reduction due to the irradiation. For a total cumulative dose analysis, triple gate SOI TFET and triple gate SOI MOSFET devices were characterized 14 days after each irradiation phase. In general, devices of both technologies, with 40 nm fin width, presented low susceptibility to the cumulative effects of ionizing radiation. However, for devices with fin width larger than fin height (WFIN = 1 µm) in which the influence of side gates on the electrostatic coupling of the channel is weak, tunnel-FET transistors have stood out. These devices were resistant to the effects of total ionizing dose (TID) even for doses as high as 5 Mrad(Si), while SOI MOSFET transistors showed a gradual variation of their parameters at each accumulated dose. The variation observed for the subthreshold swing, for example, was about 32.5% for SOI MOSFET devices and 5.6% for SOI TFET devices. TFETs with wider fin have shown significant variations on its transfer characteristic (ID x VG) only after 10 Mrad(Si) of proton irradiation. For both P-type and N-type configurations, it was observed a shift of the transfer curve to the left up to 80 mV caused by, according to simulations, the positive fixed charges generated in the buried oxide by irradiation. In addition, it was possible to observe a trap assisted tunneling (TAT) current increase caused by interface states promoted by TID effects. The increase of TAT was recognized as the main responsible for the degradation of 23.3% of the subthreshold swing of the TFETs after 10 Mrad(Si). In spite of the observed changes, it was possible to suggest, through comparison with SOI MOSFET devices of equivalent dimensions, which tunnel field-effect transistors may become a reference when considering immunity against total ionizing dose effects.

Submitted by Fernanda Rodrigues de Lima (fernanda.rlima@ufpe.br) on 2018-10-05T20:39:23Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Leydianne Leite de Siqueira Patriota Queiroz.pdf: 1890707 bytes, checksum: 03464b332cc53d519ebcbeca1662febe (MD5)
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Made available in DSpace on 2018-11-14T20:11:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 811 bytes, checksum: e39d27027a6cc9cb039ad269a5db8e34 (MD5) DISSERTAÇÃO Leydianne Leite de Siqueira Patriota Queiroz.pdf: 1890707 bytes, checksum: 03464b332cc53d519ebcbeca1662febe (MD5) Previous issue date: 2017-02-20
CNPq
Microgramma vacciniifolia (Polypodiaceae, Pteridophyta) é uma planta epífita que possui propriedades medicinais, por exemplo, no tratamento de infecções respiratórias. Lectinas de origem vegetal são capazes de exercer ação imunomoduladora sobre células do sistema imune de mamíferos, através da interação com receptores de superfície celular. Esta dissertação descreve a purificação e caracterização de uma lectina a partir das frondes de M. vacciniifolia (MvFL), assim como a avaliação da sua toxicidade e efeito imunomodulador sobre células mononucleares de sangue periférico (PBMCs) humano. Extrato proteico foi obtido por homogeneização do pó das frondes secas em NaCl 0,15 M (10%, p/v) por 16 h a 25ºC. MvFL foi isolada a partir do extrato através de cromatografia de gel filtração em coluna de Sephadex G-75 seguida de cromatografia de troca iônica utilizando a matriz DEAE-Sephadex A25. A homogeneidade de MvFL foi avaliada por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) em condições nativas para proteínas básicas ou ácidas. MvFL foi caracterizada quanto a especificidade de ligação a carboidratos, massa molecular nativa, ponto isoelétrico (pI), composição em subunidades, presença de glicosilação e similaridades na sua estrutura primária com outras proteínas vegetais. A estabilidade da lectina em diferentes valores de pH (3,0–9,0) e após aquecimento a diferentes temperaturas (30–100°C) foi avaliada por ensaio de hemaglutinação e espectrometria de fluorescência. Adicionalmente, MvFL foi avaliada quanto à atividade inibitória de tripsina. Citotoxicidade foi investigada através da avaliação da indução de apoptose/necrose em PBMCs tratados com MvFL (6,25–50μg/mL). A atividade imunomoduladora de MvFL (12,5 μg/mL) sobre PBMCs foi avaliada através da determinação dos níveis de citocinas, quimiocinas e óxido nítrico (NO). Diferenciação e ativação de células T também foram investigadas. MvFL foi isolada com elevada atividade hemaglutinante específica (10.240) e elevado fator de purificação (3.413). Ela foi revelada como uma glicoproteína de pI 4,51 e massa molecular nativa de 54 kDa, sendo composta por 3 subunidades distintas. Espectrometria de massas de peptídeos derivados da hidrólise de MvFL por tripsina revelou similaridades (cobertura de sequência de 32%) com a estrutura primária de uma proteína vegetal ligadora de RNA de Theobroma cacao. A atividade hemaglutinante da lectina foi inibida apenas por glicoproteínas (fetuína e ovoalbumina). O aquecimento de MvFL não afetou a atividade hemaglutinante nem promoveu desenovelamento da lectina. Tanto a atividade hemaglutinante quanto a conformação da lectina variaram dependendo do pH do meio, sendo MvFL menos ativa em pH alcalino. A lectina apresentou atividade inibidora de tripsina (3360,1 U/mg) e não apresentou toxicidade para PBMCs nas concentrações de 6,25 a 25 μg/mL. A lectina promoveu um aumento na produção de TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-10 e NO, bem como estimulou a diferenciação e ativação de linfócitos T CD8+. MvFL não alterou a produção das quimiocinas testadas. Em conclusão, as frondes de M. vacciniifolia contêm uma proteína termoestável e multifuncional, com atividades lectínicas e inibidora de tripsina, baixa toxicidade para linfócitos, ação imunomoduladora sobre PBMCs, induzindo predominantemente uma resposta Th1, e capaz de promover ativação e diferenciação de linfócitos humanos.
Microgramma vacciniifolia (Polypodiaceae, Pteridophyta) is an epiphytic plant that has medicinal properties, for example, in the treatment of respiratory infections. Lectins of plant origin are able to exert immunomodulatory action on cells from mammalian immune system by interacting with cell surface receptors. This work describes the purification and characterization of a lectin from the M. vacciniifolia fronds (MvFL), as well as the evaluation of its toxicity and immunomodulatory effect on human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Protein extract was obtained by homogenizing the powder of dried fronds in 0.15 M NaCl (10%, w/v) for 16 h at 25°C. MvFL was isolated from the extract by gel filtration chromatography on Sephadex G-75 column followed by ion exchange chromatography using the DEAE-Sephadex A25 matrix. The homogeneity of MvFL was evaluated by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) under native conditions for basic or acidic proteins. MvFL was characterized in terms of carbohydrate specificity, native molecular mass, isoelectric point (pI), subunit composition, presence of glycosylation and similarities in its primary structure with plant proteins. The stability of the lectin at different pH values (3.0-9.0) and after heating at different temperatures (30-100°C) was evaluated by hemagglutination assay and fluorescence spectrometry. Additionally, MvFL was evaluated for trypsin inhibitory activity. Cytotoxicity was investigated by evaluating the induction of apoptosis/necrosis in PBMCs treated with MvFL (6.25–50 μg/mL). Immunomodulatory activity of MvFL (12.5 μg/mL) on PBMCs was assessed by determining the levels of cytokines, chemokines and nitric oxide (NO). Differentiation and activation of T cells were also investigated. MvFL was isolated with high specific hemagglutinating activity (10,240) and purification factor (3,413). It was revealed as a glycoprotein with pI 4.51 and native molecular weight of 54 kDa, being composed of three distinct subunits. Mass spectrometry of peptides derived from the hydrolysis of MvFL by trypsin revealed similarities (32% sequence coverage) with the primary structure of a RNA-binding protein from Theobroma cacao. The hemagglutinating activity of MvFL was inhibited only by glycoproteins (fetuin and ovalbumin). Heating of MvFL did not affect hemagglutinating activity or promote lectin unfolding. Both the hemagglutinating activity and the conformation of the lectin varied depending on the pH of the medium, with MvFL being less active at alkaline pH. The lectin showed trypsin inhibitory activity (3,360.1 U/mg) and no toxicity to PBMCs at concentrations of 6.25 to 25 μg/mL. The lectin promoted an increase in the production of TNF-α, IFN-γ, IL-6, IL-10 and NO, as well as stimulated the differentiation and activation of T CD8+ lymphocytes. MvFL did not alter the production of the chemokines tested. In conclusion, the fronds of M. vacciniifolia contain a thermostable and multifunctional protein with lectin and trypsin inhibitor activities, low toxicity to lymphocytes, immunomodulatory action on PBMCs, inducing predominantly a Th1 response, as well as able to promote differentiation and activation of human lymphocytes.

Made available in DSpace on 2014-03-29T02:01:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000455926-Texto+Completo-0.pdf: 1580649 bytes, checksum: 43ccab4db0f539ea4361b47f57d0cedd (MD5) Previous issue date: 2014
We assessed the effects of pharmacological spinal inhibition of voltage-gated calcium channels (VGCC) in mouse pruritus. The epidural administration of P/Q-type MVIIC or PhTx3. 3, L-type verapamil, T-type NNC 55-0396 or R-type SNX-482 VGCC blockers failed to alter the scratching behavior caused by the PAR-2 activator trypsin, injected into the mouse nape skin. Otherwise, trypsin-elicited pruritus was markedly reduced by the spinal administration of preferential N-type VGCC inhibitors MVIIA and Phα1β. C. magus-obtained toxin MVIIA displayed significant effects when dosed from 1 to 4 h before trypsin, whereas the effects of P. nigriventer-derived Phα1β remained for up to 12 h. MVIIA or Phα1β also prevented the itching elicited by intradermal (i. d. ) injection of SLIGRL-NH2, compound 48/80 or chloroquine, although they did not affect H2O2-induced itching. Furthermore, the co-administration of MVIIA or Phα1β markedly inhibited the pruritus caused by the spinal injection of gastrin-releasing peptide (GRP), but not morphine. Notably, spinal MVIIA or Phα1β greatly prevented chronic pruritus allied to dry skin. However, either toxin failed to alter the edema formation or neutrophil influx caused by trypsin. In addition, epidural MVIIA or Phα1β did not modify the expression of GRP receptor (GRP-R) in the spinal cord, whilst they brought c-Fos activation to control levels. Finally, the in vitro incubation of MVIIA or Phα1β prevented the calcium influx evoked by the synthetic PAR-2 agonist AC264613 in spinal cord synaptosomes. Data brings novel evidence on itching transmission mechanisms, pointing out the therapeutic relevance of N-type VGCC inhibitors to control refractory pruritus.
Foram avaliados os efeitos da inibição farmacológica dos canais de cálcio voltagem-dependentes (CCVD) no prurido em camundongos. A administração intratecal (i. t. ) dos bloqueadores CCVD do subtipo P/Q (MVIIA ou PhTx3. 3), subtipo L (verapamil), subtipo T (NNC 55-0396) ou do subtipo R (SNX-482) não alterou o comportamento de coçar induzido pela tripsina (agonista do receptor PAR-2), aplicada na região dorsal do pescoço de camundongos. Entretanto, o comportamento de coçar induzido pela tripsina foi significativamente diminuído pela administração i. t. dos bloqueadores de CCVD do subtipo N (MVIIA e Phα1β). A toxina MVIIA, derivada do C. magus, apresentou efeitos significativos quando administrada entre 1 a 4 horas antes da aplicação de tripsina. Por outro lado, a toxina Phα1β derivada do veneno da aranha P. nigriventer demonstrou atividade, quando injetada até 12 h antes da tripsina.O pré-tratamento com MVIIA ou Phα1β foi efetivo em inibir o comportamento de coçar induzido pela aplicação intradérmica (i. d. ) de SLIGRL-NH2, composto 48/80 ou cloroquina; entretanto, as toxinas não inibiram o comportamento de coçar induzido pela injeção i. d. de H2O2. A co-injeção de MVIIA ou Phα1β inibiu o comportamento de coçar induzido pela aplicação i. t. do peptídeo liberador de gastrina (GRP), mas não inibiu o prurido causado pela morfina. Relevantemente, a administração i. t. da toxina MVIIA ou Phα1β inibiu a coceira crônica induzida pelo modelo de pele seca em camundongos. A atividade anti-pruritogênica de ambas as toxinas não parece estar relacionada com a modulação do processo inflamatório na pele, uma vez que as toxinas MVIIA ou Phα1β não foram capazes de inibir o edema e a migração de neutrófilos induzidos pela aplicação i. d. de tripsina.A aplicação i. t. de MVIIA ou Phα1β não modificou a expressão do receptor para o GRP (GRP-R) na medula espinhal. Por outro lado, as duas reduziram a expressão de c-Fos aos níveis do grupo controle, de acordo com a avaliação na medula dos camundongos. Finalmente, a incubação de MVIIA ou Phα1β preveniu o influxo de cálcio estimulado pelo agonista do receptor PAR-2 AC264613 em sinaptossomas de medula de camundongos. Estes resultados trazem uma nova perspectiva acerca dos mecanismos envolvidos na sinalização da coceira, indicando os inibidores de CCVD do subtipo N como possíveis estratégias para o tratamento do prurido, especialmente nas condições onde há ausência de resposta à terapia atual.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Química, Programa de Pós-Graduação em Química, 2016.
Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2016-05-13T13:13:32Z No. of bitstreams: 1 2016_DiegoEliasHonda.pdf: 2169221 bytes, checksum: 3f749f9435181b7433ed52f969f2025d (MD5)
Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-05-20T21:34:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_DiegoEliasHonda.pdf: 2169221 bytes, checksum: 3f749f9435181b7433ed52f969f2025d (MD5)
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O inibidor de serinoproteases da família Bowman-Birk Black eyed-pea Trypsin/Chymotrypsin Inhibitor (BTCI), encontrado em grãos de feijão de corda Vigna unguiculata, é uma proteína com enorme potencial biotecnológico, sendo destacado seu aspecto farmacológico. Sua estrutura possuí sete ligações dissulfeto que estendem sua ação a condições mais extremas de temperatura e pH. Toda sua aplicabilidade decorre do fato de inibir as enzimas tripsina e quimotripsina. Neste trabalho, buscou-se encontrar metodologia semi-empírica que fosse capaz de extrair informações químicas sobre o processo inibitório que ocorre entre o BTCI e a tripsina, bem como a construção de um sistema que permita um olhar mais detalhado sobre os fenômenos que ocorrem na interface entre o inibidor e a enzima a ser inibida. Neste sentido, as propriedades avaliadas foram os orbitais de fronteira e seus quatro vizinhos imediatos. Não obstante, também foi mensurada a força de cada uma das sete ligações dissulfeto. Observou-se que, para o estudo do BTCI no vácuo, diferentes metodologias semi-empíricas forneceram resultados adversos. Conclusão semelhante foi observada para o caso do BTCI complexado com a tripsina. Todavia, quando se analisou a interface entre essas duas proteínas, os métodos em questão tiveram grande correspondência entre si, indicando que a Cys22 é um dos resíduos mais importantes na interface, provavelmente ajudando a manter a conformação durante o processo de ancoragem. Quanto às ligações dissulfeto, não foi possível afirmar sobre qual delas maior impacta a estrutura do BTCI. Contudo, verificou-se que as ligações entre os resíduos Cys34 e Cys19, e Cys61 e Cys46 foram as de menor contribuição energética. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT
The Bowman-Birk Trypsin/Chymotrypsin inhibitor from Vigna unguiculata seeds (BTCI) is a protein with high biotechnological potential, especially due to its pharmacological aspects. Its structure has seven disulfide bonds which extends BTCI working range to some severe temperature and pH conditions. All BTCI applicability is due to its trypsin and chymotrypsin inhibition. This way, we tried to find some semi-empirical methodology capable to give chemical information about the inhibition process between BTCI and trypsin, as well as to construct a system that allows a closer look about what happens within those proteins interface. To accomplish this objective, we looked to the frontier orbitals and their four immediate neighbors. Likewise, each of its seven disulfide bonds had their energy determined. We conclude that the study of BTCI in vacuum with different methodologies give different results. Similar conclusion was seen for BTCI complexed with trypsin. However, when we analyzed the interface between those two proteins all methods are in agreement, pointing that Cys22 is responsible to maintain the interface conformation during the enzyme-inhibitor docking. About the disulfide bonds, it wasn’t possible to confirm which one has the greatest impact on BTCI structure. Nevertheless, we saw that bonds between Cys34 and Cys19, and Cys61 and Cys46 residues had the lowest energy contribution.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:49:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
O polissacarídeo levana foi utilizado como revestimento de partículas de magnetita, as quais foram obtidas pelo método de co-precipitação de uma solução contendo íons de Fe(II) e Fe(III) em meio aquoso alcalino. As partículas de levana-magnetita foram caracterizadas por microscopia eletrônica de varredura (MEV), magnetometria, difração de Raios-X (DRX) e espectroscopia na região do infravermelho (IV). As partículas de magnetita, não-revestidas e revestidas, foram ambas heterogêneas na forma sendo as partículas revestidas de tamanhos maiores. As partículas revestidas exibiram uma magnetização dez vezes menor comparada àquelas não-revestidas provavelmente devido à camada de revestimento. O difratograma de raios X mostrou que a magnetita é a fase dominante nas partículas revestidas e a espectroscopia no infravermelho mostrou bandas de absorção características do polissacarídeo levana e da magnetita presentes nas partículas com revestimento (O H, C O C, e Fe O). As partículas de levana-magnetita foram ativadas com periodato de sódio e utilizadas como matriz para imobilização da enzima proteolítica tripsina. A quantidade de proteína imobilizada foi de 79,66 % e sua atividade específica variou com a quantidade de enzima imobilizada. A tripsina imobilizada foi reutilizada dez vezes seguidas e apresentou uma atividade específica média igual a 17,41 ± 0,53 mU/mg correspondendo a 84,43 ± 5,42 % da atividade específica inicial. Após estocagem por 30 dias a 4 °C e 25 °C, a tripsina imobilizada mostrou uma perda de 40,69 % e 41,47 % da atividade inicial, respectivamente. Em relação ao tempo de prateleira, uma perda de 70,56 % da atividade inicial foi observada depois de estocada por 21 dias e reutilizada cinco vezes durante este período. Ela mostrou significantemente uma maior estabilidade em condições de aumento da temperatura (40°C e 50°C) quando comparada à enzima solúvel. A faixa de pH para atividade ótima da tripsina imobilizada foi de 8,5 9,0 e para tripsina solúvel foi de 8,0 9,0. A tripsina imobilizada apresentou um Km aparente (0,257 ± 0,04 mM) aproximadamente 2 vezes menor que aquele encontrado para a enzima solúvel (0,528 ± 0,26 mM). As partículas de magnetita revestidas mostraram boa capacidade para serem usadas como matriz para imobilização de enzimas, em especial sua capacidade para retenção de proteína, reuso e estabilidade térmica

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia
Made available in DSpace on 2012-10-23T05:31:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 238176.pdf: 1523972 bytes, checksum: 1339a1f91b3dcdae6ffe52dfe88cf2ae (MD5)
Além de funcionarem como enzimas de degradação, certas proteases atuam como moléculas de sinalização que regulam algumas atividades celulares por clivarem e ativarem membros da família de receptores acoplados à proteína G, os receptores ativados por proteases (PARs). A tripsina é uma protease capaz de gerar respostas nociceptivas e inflamatórias por ativar principalmente o receptor PAR-2. O objetivo do presente estudo foi analisar os mecanismos e mediadores envolvidos nas respostas nociceptivas e inflamatórias induzidas pela tripsina na pata de camundongos. A injeção intraplantar de tripsina produziu aumento tempo- e dose-dependente do volume da pata dos camundongos associado com nocicepção espontânea. A resposta edematogênica foi inibida pelo antagonista seletivo do receptor B2 para as cininas FR173657 (48 ± 5 %), pelo inibidor não seletivo das enzimas COX1/2 indometacina (33 ± 3 %), pelo bloqueador da enzima COX-2 celecoxib (30 ± 5 %), pelo inibidor de síntese protéica dexametasona (30 ± 6 %), pelo antagonista do receptor de CGRP CGRP8-37 (39 ± 6 %), pelo antagonista do TRPV1 SB366791 (49 ± 4 %) ou pela deleção do receptor p55 do TNFa (42 ± 6 %). Ademais, o antagonista do receptor B1 para cininas SSR240612, o inibidor da enzima COX-1 SC560, o depletor de mastócitos composto 48-80, o estabilizador de mastócitos cromoglicato de sódio, o antagonista do receptor H1 de histamina pirilamina ou os antagonistas seletivos para os receptores NK1 FK888, NK2 SR48968, NK3 SR142801, foram todos capazes de reduzir o edema induzido pela tripsina. Ao contrário, o inibidor não seletivo da enzima óxido nítrico sintase (NOS) L-NOARG ou a deleção gênica enzima NOS induzida não foram capazes de reduzir o edema de pata causado pela tripsina. Interessantemente, o edema de pata foi significativamente reduzido em animais com deleção gênica para o receptor PAR-2, apenas na primeira hora, mas não nos pontos tardios após a injeção de tripsina. Já a nocicepção induzida pela tripsina foi significativamente reduzida pelo FR173657 (57 ± 8 %), composto 48/80 (56 ± 6 %), cromoglicato de sódio (47 ± 7 %), SB366791 (48 ± 8 %), FK888 (41 ± 8 %), SR48968 (60 ± 3 %), SR142801 (46 ± 9 %), CGRP8-37 (35 ± 5 %), em animais com deleção gênica para o receptor p55 do TNFa (38 ± 6 %) ou em animais com deleção gênica para o receptor PAR-2 (85 ± 3 %). Entretanto, as respostas nociceptivas induzidas pela tripsina não foram alteradas pelo tratamento com o SSR240612, indometacina, dexametasona, pirilamina ou L-NOARG. Além disso, a tripsina produziu aumento na atividade da enzima mieloperoxidase, o qual foi ausente em animais com deleção gênica para o PAR-2. A tripsina também induziu aumento tempo-dependente dos níveis das citocinas TNFa e IL-1ß na pata dos camundongos. O presente estudo mostra que a injeção intraplantar de tripsina na pata de camundongos produz respostas nociceptivas e inflamatórias marcantes que são mediadas pela geração de um conjunto de mediadores inflamatórios e, em grande parte, mas não exclusivamente, pela ativação do receptor PAR-2.

Made available in DSpace on 2018-08-01T22:57:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10774_025 - DAYANNE PINHO ROSA - DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - FINAL.pdf: 805134 bytes, checksum: a0838bf2c2101acc6105315b494bc58a (MD5) Previous issue date: 2017-02-23
Os solventes orgânicos são comuns em processos industriais que utilizam enzimas, mas, ao mesmo tempo, sabe-se que alteram suas propriedades. Assim, os efeitos do solvente orgânico aquoso (etanol) em diferentes concentrações na estrutura α- tripsina foram investigadas por técnicas espectroscópicas e análise de dados termodinâmicos. A espectroscopia de absorção UV-Vis, a fluorescência intrínseca do triptofano e o espalhamento dinâmico da luz (DLS) sugerem a formação de estados parcialmente dobrados, em vez de estados agregados, em alta concentração de etanol (> 60% v/v de etanol/tampão), exibindo pouca perda de estrutura secundária, mas alterações significativas na estrutura terciária. Os dados termodinâmicos (Tm e ∆H) sugerem um afrouxamento de interações intramoleculares fracas, o que se reflete em um aumento de flexibilidade de tal forma que a capacidade catalítica pode ser aumentada ou diminuída de acordo com a concentração de etanol no sistema. Os resultados globais sugerem que na faixa de 0-60% v/v de etanol/tampão, a α- tripsina sofre fenômenos de multimerização reversíveis, mantendo a sua atividade catalítica. No entanto a partir de 60% v/v de etanol/tampão, a população de estados parcialmente enovelados com menor atividade catalítica é predominante. Palavras chaves: tripsina, isoformas, enzimologia, solventes orgânicos, estrutura, termodinâmica.

Orientadora : Profa. Dra. Jovanir Inês Müller Fernandes
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Palotina, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Defesa: Palotina, 24/02/2017
Inclui referências
Resumo: Esse trabalho foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito da adição de queratinase em dietas contendo inibidores de tripsina sobre o desempenho produtivo, peso do pâncreas, rendimento e composição de carcaça e integridade intestinal de frangos de corte submetidos ou não a um modelo de desafio sanitário. Foram realizados dois experimentos. No experimento 1 foram alojados 1280 pintos em esquema fatorial 2 x 2 (com e sem a presença de soja x com e sem queratinase). A inclusão da queratinase foi de 250 g/tonelada. O desempenho das aves foi avaliado semanalmente até os 42 dias. Aos 21 e 42 dias de idade, o peso do pâncreas foi obtido para cálculo do peso relativo. Aos 42 dias foi determinado o rendimento de carcaça, avaliação da ocorrência de White Striping, resistência de pele e composição de carcaça. Aos 21 e 42 dias foram coletados segmentos intestinais para histomorfometria, contagem de caliciformes e Índice de Saúde intestinal (ISI). No experimento 2; 640 pintos foram alojados em gaiolas experimentais e distribuídos em esquema fatorial 2 x 2 (com e sem queratinase e com e sem desafio). As rações foram formuladas com farelo de soja subprocessado. O desafio foi promovido por meio da utilização de cama descartada. Aos 21 dias foi realizado o desempenho zootécnico das aves. Aos 14 e 21 dias foram coletados segmentos intestinais para histomorfometria, contagem de caliciformes e avaliação da saúde intestinal. No experimento 1, a suplementação da queratinase resultou em maior ganho de peso e a inclusão de soja crua em pior conversão alimentar aos 7 dias. Aos 21 dias, a associação entre a queratinase e a soja crua reduziu o peso do pâncreas. Aves suplementadas com a queratinase apresentaram maior rendimento de carcaça. A inclusão de soja crua resultou em maior elasticidade de pele. Aos 21 dias, aves que consumiram dieta com soja crua apresentaram menor relação V:C e maior número de criptas por vilo. A utilização da queratinase reduziu os escores de ISI aos 21 dias. No entanto, aos 42 dias a queratinase resultou em maior inflamação intestinal. No experimento 2, o desafio resultou em maior largura de cripta e menor relação vilo:cripta, aos 14 dias. Aves que sofreram o desafio e receberam a suplementação de queratinase apresentaram maior área de absorção do jejuno. Aos 21 dias, aves suplementadas com a queratinase apresentaram maior largura de vilo e as desafiadas, em maior número de caliciformes no jejuno. Aves que receberam dietas sem a inclusão da queratinase e foram desafiadas apresentaram maior número de caliciformes no duodeno. Resultado semelhante foi observado nas aves não desafiadas e que receberam a suplementação de queratinase. Aves desafiadas apresentaram maior escore de ISI aos 14 dias. Aos 21 dias, aves suplementadas com queratinase e desafiadas apresentaram maior inflamação intestinal. Portanto, a suplementação de queratinase resultou em melhora no desempenho e integridade intestinal na fase inicial de criação. Além disso, a associação da queratinase e soja crua resultou em redução no peso do pâncreas e da inflamação intestinal no íleo. Palavras-chave: desafio sanitário, globulinas, inflamação intestinal
Abstract: The aim was to evaluate the effect of queratinase addition on diets containing trypsin inhibitors on the productive performance and intestinal health of broilers and under sanitary challenge. There were two trials; in the first one there were 1280 chicks housed in a completely randomized design in a 2 x 2 factorial scheme (with and without raw soybean replacing deactivated soybean x with and without queratinase). The queratinase was added in the diets at a dose of 250 g/ton. The performance of the birds was weekly assessed. At 21 and 42 days of age, the weight of the pancreas was obtained in order to calculate the relative weight. At 42 days, the carcass yield was performed, assessment of White Striping, skin resistance and carcass composition. At 21 and 42 days, intestine fragments were collected for histomorphometry, goblet cell counting and intestinal health evaluation, applying the morphometric index "I See Inside" (ISI). In the second trial, there were 640 chicks housed in experimental cages and placed in a completely randomized design following a 2 x 2 factorial scheme (with and without queratinase and with and without challenge). The diets were calculated with subprocessed soybean meal. The challenge was promoted through the use of discarded bedding. At 21 days, the performance of the animals was obtained. At 14 and 21 days intestine fragments were collected for histomopho metry, goblet cell counting and intestinal health evaluation. The results were submitted to analysis of variance at the 5% level of significance using SAS. In the first trial, the queratinase supplementation showed higher weight gain and raw soybean worst feed conversion ratio at 7 days of age. At 21 days, the association of queratinase and raw soybean resulted in a reduction of pancreatic weight. Birds supplemented with queratinase showed higher carcass yield. The addition of raw soybean caused higher skin elasticity. At 21 days, birds that received the diet with raw saybean showed lower V:C and higher number of crypts per villi. The use of queratinase provided a decrease of the ISI scores at 21 days. However, at 42 days, the queratinase showed higher intestinal inflammation. In the second trial, the challenge resulted in larger crypts and lower V:C at 14 days. The birds that underwent the challenge and received the queratinase supplementation had higher absorption area of jejunum. At 21 days, birds supplemented with queratinase showed higher larger villi; and the ones that were challenged higher number of goblet cells in the jejunum. Animals that received diets without queratinase and underwent the challenge had higher number of goblet cells. A similar result was noticed in birds that were not challenged and received queratinase supplementation. Challenged birds presented higher score of ISI at 14 days. At 21 days, challenged birds supplemented with queratinase had higher intestinal inflammation. The results obtained in this study indicate that the benefits of exogenous queratinase are better in the initial phase of broilers. Key-words: globulins, intestinal inflammation, sanitary challenge

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:52:03Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3131_1.pdf: 596856 bytes, checksum: 6ecd36106eae78833584c1e83095f1fe (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2011
Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia do Estado de Pernambuco
Tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus) é um dos peixes mais populares de criação no mundo, tem excelente adaptação e reprodução em ambientes lênticos e possui filé de alta qualidade. Além das peças limpas e comestíveis do pescado, há uma quantidade substancial de resíduos de peixe. Muitas vezes, esse remanescente de resíduos é despejado em rios, causando um desequilíbrio ambiental. Carcaças e vísceras de tilápia têm um alto valor protéico a ser usado na produção de alimentos para organismos aquáticos. A utilização de resíduos de pescado diminui o risco de poluição ambiental e gera receitas econômicas. Estudos mostraram que os resíduos podem ser usados na recuperação de compostos úteis, incluindo proteínas que têm atividade antimicrobiana. O presente trabalho relata a presença de inibidor de tripsina de tilápia no fígado, estômago e intestino, bem como a purificação do inibidor de tripsina O. niloticus (OnTI) e atividade antibacteriana do fígado, víscera de maior atividade inibidora de tripsina específica. As vísceras foram separadas e homogeneizadas com 0,15 M NaCl e os homogeneizados foram tratados com sulfato de amônio. Concentrações de proteínas das frações dos precipitados e sobrenadantes foram dosadas, aquecida a 80 ° C por 1 h, e avaliadas quanto à atividade do inibidor de tripsina. O precipitado da fração 20-40% de fígado (LF20-40) de alta atividade inibidora de tripsina específica foi utilizado para purificação do inibidor e em testes de atividade antibacteriana; sendo determinadas as concentrações inibitórias mínima (CIM) e bactericidas (CBM). Frações de sulfato de amônio de fígado e estômago apresentaram atividade do inibidor de tripsina superior às frações de intestino. O. niloticus inibidor de tripsina (OnTI) ligado à coluna Tripsina-Agarose foi eluído com 0,5 M KCl-HCl pH 2,0. OnTI apresentou atividade específica de 950 U / mg e duas bandas de proteínas em SDS-PAGE. A atividade antibacteriana sobre S. aureus foi detectada pela LF20-40 (MIC: 0,09 mg / mL; MBC: 0,76 mg / mL), a fração também foi capaz de inibir o crescimento de K. pneumoniae (MIC: 1,53 mg / mL), mas não apresentou atividade antibacteriana contra E. coli. Os resultados revelaram que o fígado e estômago de tilápia contem inibidor de tripsina. O efeito da preparação do fígado de tilápia sobre S. aureus e K. pneumoniae, indica que esta víscera, normalmente descartada como resíduo, é uma fonte potencial de agentes antibacterianos

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-13T12:31:48Z No. of bitstreams: 2 TESE Marina Marcuschi.pdf: 36600890 bytes, checksum: 8fe67b125b035ecb70519097b1f641d1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5)
Made available in DSpace on 2015-03-13T12:31:48Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Marina Marcuschi.pdf: 36600890 bytes, checksum: 8fe67b125b035ecb70519097b1f641d1 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014
FINEPE; CAPES; CNPq; FACEPE
A presente tese reporta a estrutura, função e aplicação como aditivo pré lavagem de uma tripsina do peixe amazônico tambaqui (Colossoma macropomum). O capítulo um traz a aplicação de tripsinas purificada dos peixes tambaqui e tilapia do Nilo (Oreochromis niloticus) como componentes para soluções de pré-lavagem de roupas, comparando-as com tripsina de porco, subtilisina bacteriana e quimotripsina bovina. No capítulo dois, o efeito do cálcio sobre a tripsina do tambaqui e do porco foi comparado através de ensaios bioquímicos, eletroforéticos, de espectrometria de massas e de fluorescência intrínseca. Já o capítulo três abordou o uso de dinâmica molecular e dicroísmo circular na análise da estrutura da tripsina do tambaqui, porco e salmão submetidas a variações de temperatura, bem como a criação de um banco de dados com sequências aniônicas e catiônicas de tripsinas de peixes e animais homeotérmicos. Com os resultados apresentados na presente tese, pode-se afirmar que a tripsina do tambaqui apresenta uma estrutura mais flexível que a do porco, e que consegue suportar um leque maior de temperaturas e agentes denaturantes, principalmente por conta de sua baixa propensão à autodigestão. Assim, considerando que a tripsina do tambaqui é mais ativa e robusta do que as tripsinas de mamíferos, pode-se dizer que ela apresenta potencial para aplicações industriais, principalmente aquelas que se dão em presença de agentes denaturantes e em temperaturas entre 25 e 60 °C.

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:51:42Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3102_1.pdf: 1259276 bytes, checksum: c0878ec8ef24a46259582227748106b4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
A protease alcalina extraída do ceco pilórico do pirarucu (Arapaima gigas) foi purificada em quatro etapas: tratamento térmico, precipitação com sulfato de amônio, cromatografia de gel-filtração em coluna Sephadex® G-75 e cromatografia de afinidade em coluna benzamidina-agarose. Após as etapas de purificação aplicou-se uma amostra da proteina obtida em gel de eletroforese e verificou-se a presença de única banda que apresentou peso molecular aproximado de 28,0 kDa. Desta forma, após purificação, avaliaram-se as propriedades físico-químicas e cinéticas da enzima e o efeito de íons metálicos e de inibidores de proteases na atividade proteolítica da mesma, utilizando-se benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide (BApNA) como substrato. O pH e a temperatura ótima de reação encontrada foram 9,0 e 65°C, respectivamente. A enzima mostrou-se estável, após 30 min de incubação, em ampla faixa de pH alcalino (pH 6,0 a 11,5). Após 30 minutos de incubação a 60ºC, foi detectada uma perda de 10% da atividade tríptica. Os valores encontrados para os parâmetros cinéticos (Km, Kcat e Kcat/Km) foram: 0,47 ± 0,042 mM, 1,33 s-1 and 2,82 s-1 · mM-1, respectivamente, usando BApNA como substrato. A atividade tríptica mostrou-se sensível a alguns íons metálicos. A atividade tríptica foi inibida, em ordem crescente, pelos íons: Mn2+ > Ca2+ > Li+ > Cd2+ > Cu2+ > Fe2+ > Hg2+ > Zn2+ > Al3+ > Pb2+. Por outro lado, os íons K+, Mg2+ e Ba2+ não promoveram nenhum efeito na atividade da protease. A enzima foi fortemente inibida por inibidores de tripsina. Os ensaios com substrato específico e inibidores de tripsina forneceram evidências de que esta enzima é provavelmente uma tripsina-símile e suas características sugerem um forte potencial para ser utilizada em processos e produtos industriais

Orientador: Elias Basile Tambourgi
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica
Made available in DSpace on 2018-07-28T03:32:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Hirose_AndreLuisSakaguchi_M.pdf: 3299228 bytes, checksum: 5d6c0fe1dc897fb8c952d6febe4c979c (MD5) Previous issue date: 2001
Resumo: A viabilidade da produção e comercialização de substâncias obtidas por meio de processos biotecnológicos depende de técnicas de separação empregadas na purificação dos compostos desejados. Algumas características das misturas envolvidas nesses processos, tais como baixa concentração inicial, necessidade de produtos de alto grau de pureza, sensibilidade térmica e necessidade de preservar as propriedades dos compostos, fazem com que esta etapa de purificação exija um processo econômico e que seja biologicamente compatível com os produtos envolvidos. Neste sentido, a extração líquido-líquido por sistemas aquosos bifásicos se apresenta como uma técnica de separação extremamente interessante. Tendo-se em vista o desenvolvimento de extratores mais eficientes, é fundamental o estudo da hidrodinâmica e dos mecanismos de transferência de massa no interior dos extratores. Este trabalho teve como objetivo principal o estudo de uma micro-coluna agitada por campânulas perfuradas pulsantes que foi usada para extração da proteína. O sistema de agitação formado por campânulas pulsadas tem como objetivo promover uma melhor mistura dos líquidos no interior da coluna e assim, aumentar a transferência de massa. Os estudos foram realizados com sistemas de duas fases aquosas formadas por PEG (polietileno glicol) e sal (fosfato de potássio mono e bibásico). Realizou-se o estudo da extração em descontínuo, a fim de encontrar-se as concentrações de equilíbrio e os melhores sistemas de extração (concentrações de PEG e de sal e massa molecular de PEG). A melhor condição obtida foi usada na operação contínua da micro-coluna. Pôde-se concluir que a coluna de extração testada teve um rendimento superior de proteína extraída que os encontrados nos tubos de ensaio, e é adequada para utilização em sistemas biotecnológicos
Abstract: The production and commercialization suitability of substance obtained by means of biotechnological processes depend on the separation techniques used for the purification of the desired compounds. Some features of the mixtures involved in these processes, such as low initial concentration, high purity level products desired, thermal sensitivity and the need of preserving the compounds properties, require a purification step that must be economical and biologically compatible with the chemicals involved. As a matter of fact, liquid-liquid extraction by aqueous two-phase systems is presented as an outstanding separation technique. The hydrodynamics and the mass transfer mechanism in the interior of the extractors are fundamental for the development of more efficient equipment. The more goai of this work was the study of a micro-column stirred by bell-shaped meshes for the extraction of a protein. The stirring system composed by the bell-shaped meshes promotes a better mixture of the fluids in the inner side of the column and, as a result, increase the mass transfer. The aqueous two-phase systems studied were formed by PEG (polyethyiene glycol) and salts (Potassium Phosphate monobasic and dibasic). It was done bath experiments, for finding the equilibrium concentrations and the better system for the extraction (PEG and salt concentrations and polymer molecular weight). The better condition obtained was used in the continuous extraction in the micro-column. As a conclusion, the extraction apparatus tested here had a much better yield of protein recovery than the observed in the batch system, what makes it suitable for use in biotechnologicai systems
Mestrado
Sistemas de Processos Quimicos e Informatica
Mestre em Engenharia Química

Submitted by Jean Medeiros (jeanletras@uepb.edu.br) on 2016-03-09T13:28:58Z No. of bitstreams: 1 PDF - Géssica Laize Berto Gomes.pdf: 960450 bytes, checksum: 01f35541007decb425986338cf77d27a (MD5)
Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-21T21:00:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Géssica Laize Berto Gomes.pdf: 960450 bytes, checksum: 01f35541007decb425986338cf77d27a (MD5)
Approved for entry into archive by Secta BC (secta.csu.bc@uepb.edu.br) on 2016-07-21T21:01:00Z (GMT) No. of bitstreams: 1 PDF - Géssica Laize Berto Gomes.pdf: 960450 bytes, checksum: 01f35541007decb425986338cf77d27a (MD5)
Made available in DSpace on 2016-07-21T21:01:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PDF - Géssica Laize Berto Gomes.pdf: 960450 bytes, checksum: 01f35541007decb425986338cf77d27a (MD5) Previous issue date: 2014-02-28
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
The Brazilian production of grains has grown every year, transforming Brazil in one of the main cereals and oilseeds producers. However, the post-harvest losses are huge, causing production loss by the inadequacy of storage, especially in order of pest occurrence. In the case of sesame, there has been a marked occurrence of P. interpuctella, which attack stored grains accompanied by other pests causing economic damage to the crop. With this, the Breeding Program Sesame Embrapa Cotton seeks alternatives to control these pests by genotypes that express high levels of protein inhibitors (PIs) with ability to inhibit proteolytic digestive enzymes of insects. The objective of this study was to detect trypsin inhibitors in genotypes of sesame (S. indicum L.) with potential use in biotechnological applications and programs to improve the species, aiming selection of genotypes resistant to stored grain pests, so we proceeded to study PIs in 10 sesame genotypes belonging to the Active Germplasm Bank at Embrapa Cotton. The total protein extracts of accessions were extracted and tested in vitro with bovine pancreatic trypsin (BPT) and intestinal homogenate of larvae of P. interpuctella. After selection of the most promising genotypes, we proceeded to a protein fractionation with ammonium sulfate. The protein fractions obtained were analyzed for inhibitory activity with BPT and intestinal homogenate of larvae of P. interpuctella, and yet, as the thermal stability and hydrogen ion and bioassays with P. interpuctella. Data were analyzed by Tukey test at 5% of probability. The results showed the presence of trypsin inhibitors in the total protein extracts of 10 sesame genotypes, ranging from 51% to 90% inhibition, among which, the BRS-SEDA, CNPA G3 and CNPA G4 stood out with 87%, 88% and 90% inhibition, respectively. These genotypes inhibitory activity have been demonstrated for the intestinal homogenate of larvae of P. interpuctella, with inhibition between 60% and 76%. The fractions F2 of the three genotypes were relatively stable to changes in temperature and pH. In the bioassay, the larvae of P. interpuctella. were susceptible to protein extracts of the three genotypes of sesame, with a maximum of 83% mortality of larvae in different strengths with total protein extracts and 58% in fractions F2, however, did not observe statistically a significant difference between genotypes. In this regard, BRS-SEDA, CNPA G3 and CNPA G4 have protein inhibitors that can prevent the development of P. interpuctella, suggesting candidates with potent insecticidal properties to control stored grain pests.
A produção brasileira de grãos tem crescido a cada ano levando o Brasil a um dos principais produtores de cereais e oleaginosas. No entanto, as perdas na pós-colheita são enormes provocando uma redução da produção em função do controle inadequado no armazenamento, especialmente em função da ocorrência de pragas. No caso do gergelim, tem havido uma ocorrência acentuada de P. interpuctella, que ataca os grãos armazenados acompanhado de outras pragas, causando danos econômicos à cultura. Com isto, o Programa de Melhoramento Genético de Gergelim da Embrapa Algodão busca alternativas para controlar essas pragas, por meio de genótipos que expressem altos níveis de inibidores proteicos (IPs) com capacidade de inibir enzimas proteolíticas digestivas de insetos. Objetivou-se com este trabalho detectar inibidores de tripsina em genótipos de gergelim (Sesamum indicum L.) com potencial uso na aplicação biotecnológica e no programa de melhoramento da espécie, visando seleção de genótipos resistentes a pragas de grãos armazenados. Assim, procedeu-se o estudo de IPs em 10 genótipos de gergelim, pertencentes ao Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa Algodão. Os extratos proteicos totais dos acessos foram extraídos de sementes de gergelim e testados in vitro com tripsina pancreática bovina (TPB) e homogenato intestinal de larvas de P. interpuctella. Após seleção dos genótipos mais promissores, procedeu-se um fracionamento proteico com sulfato de amônia. As frações proteicas obtidas foram analisadas quanto a atividade inibitória com TPB e homogenato intestinal de larvas de P. interpuctella, e ainda, quanto a estabilidade térmica e hidrogeniônica e em bioensaios com P. interpuctella. Os dados foram analisados pelo teste de Tukey a 5% de probalibilidade. Os resultados obtidos mostraram a presença de inibidores de tripsina nos extratos proteicos totais dos 10 genótipos de gergelim, com variação de 51% a 90% de inibição, dentre os quais, o BRS-SEDA, CNPA G3 e CNPA G4 se destacaram com 87%, 88% e 90% de inibição, respectivamente. Nesses genótipos foram evidenciadas atividade inibitória para o homogenato intestinal de larvas de P. interpuctella, com inibição entre 60% e 76%. As frações F2 dos três genótipos foram relativamente estáveis às variações de temperatura e pH. No ensaio biológico, as larvas de P interpuctella mostraram-se suscetíveis aos extratos proteicos dos três genótipos de gergelim, com mortalidade máxima de 83% das larvas em diferentes dosagens com extratos proteicos totais e 58% nas frações F2, contudo, estatisticamente não observou-se diferença significativa entre os genótipos. Neste aspecto, os genótipos BRS-SEDA, CNPA G3 e CNPA G4 possuem inibidores proteicos capazes de impedir o desenvolvimento P. interpuctella, o que sugere potentes candidatos com propriedades inseticidas no controle de pragas de grãos armazenados.