Letteratura scientifica selezionata sul tema "Spectrométrie de masse cross-linking"

ABSTRACTBackground: Surfaces in health care centres are often contaminated with traces of antineoplastic drugs. Such contamination should be limited as much as possible, to reduce workers’ exposure.Objectives: The primary objective was to monitor environmental contamination with 9 antineoplastic drugs in oncology pharmacy and patient care areas of Canadian health care centres. The secondary objective was to explore the use of sodium hypochlorite as a cleaning agent for cyclophosphamide contamination. Methods: This cross-sectional evaluation was conducted from January to April 2018. Twelve standardized sites were sampled at each participating centre: 6 in the oncology pharmacy and 6 in patient care areas. Six of the antineoplastic drugs (cyclophosphamide, ifosfamide, methotrexate, gemcitabine, 5-fluorouracil, and irinotecan) were quantified by ultra-performance liquid chromatography – tandem mass spectrometry. For the other 3 antineoplastic drugs (docetaxel, paclitaxel, and vinorelbine), samples were screened for contamination but not quantified. The effect of using sodium hypochlorite as a cleaning agent was evaluated with a Kolmogorov-Smirnov test for independent samples.Results: Of 202 Canadian centres invited, 79 participated. A total of 887 surface samples were analyzed, 467 from pharmacy areas and 420 from patient care areas. Cyclophosphamide was the drug most often found as a contaminant (32.2% [286/887] of samples positive, 75th percentile of measured contamination 0.0017 ng/cm², 90th percentile 0.021 ng/cm²). The front grille inside the hood (80.8% [63/78] of samples positive for at least one antineoplastic drug), treatment chair armrest (78.9% [60/76]), storage shelf in pharmacy (61.5% [48/78]), and floor in front of the hood (60.3% [47/78]) were the most frequently contaminated surfaces. Cleaning with a sodium hypochlorite solution was highly variable. Among centres that reported using sodium hypochlorite to clean armrests on patient chairs, the concentration of cyclophosphamide was lower (0.00866 versus 0.0300 ng/cm², p = 0.014). Conclusions: Despite growing awareness and implementation of new safe-handling guidelines, surfaces in health care centres were contaminated with traces of many antineoplastic drugs. Providing centres with attainable goals (e.g., 75th to 90th percentile relative to other similar centres) would help in identifying the sampling sites where improvements are needed and in achieving lower surface contamination.RÉSUMÉContexte : Les surfaces dans les centres de santé sont souvent contaminées par des traces de médicaments antinéoplasiques. Une telle contamination devrait être limitée autant que faire se peut afin de réduire l’exposition des employés à ces produits.Objectifs : L’objectif principal consistait à mesurer la contamination environnementale provenant de neuf médicaments antinéoplasiques dans la section de la pharmacie oncologique et celle des soins offerts aux patients dans des centres de soins de santé canadiens. L’objectif secondaire consistait à explorer l’action nettoyante de l’hypochlorite de sodium pour éliminer la contamination par la cyclophosphamide. Méthodes : Cette évaluation transversale a été menée de janvier à avril 2018. Des échantillons ont été prélevés dans douze endroits standardisés de chaque centre participant : six dans la section de la pharmacie oncologique et six dans celle des soins donnés aux patients. La présence de six des médicaments antinéoplasiques examinés (cyclophosphamide, ifosfamide, méthotrexate, gemcitabine, 5-fluorouracil et irinotécan) a été quantifiée par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) avec spectrométrie de masse en tandem. Quant aux trois autres échantillons de médicaments antinéoplasiques (docetaxel, paclitaxel et vinorelbine), ils ont été analysés pour rechercher la présence d’une contamination qui n’a pas été quantifiée. L’action nettoyante de l’hypochlorite de sodium a été évaluée à l’aide d’un test de Kolmogorov-Smirnov pour les échantillons indépendants.Résultats : Sur 202 centres canadiens invités à participer à l’étude, 79 ont répondu à l’invitation. L’analyse a porté sur 887 échantillons de surfaces des lieux sélectionnés : 467 dans la section de la pharmacie et 420 dans la section des soins donnés aux patients. La cyclophosphamide était le médicament contaminant le plus souvent décelé (32,2 % d’échantillons positifs [286/887], 75e percentile de contamination mesurée 0,0017 ng/cm², 90e percentile 0,021 ng/cm²). La grille frontale à l’intérieur de la hotte de laboratoire (80,8 % des échantillons [63/78] étaient positifs pour au moins un médicament antinéoplasique), l’accoudoir de la chaise du patient (78,9 % [60/76]), l’étagère de stockage dans la pharmacie (61,5 % [48/78]) et le sol en face de la hotte (60,3%[47/78]) étaient les surfaces le plus souvent contaminées. L’usage d’une solution d’hypochlorite de sodium pour le nettoyage variait grandement d’un centre à l’autre. Dans les centres qui indiquaient utiliser cet agent pour nettoyer les accoudoirs des chaises du patient, la concentration de cyclophosphamide sur les accoudoirs était moins élevée (0,00866 contre 0,0300 ng/cm², p = 0,014). Conclusions : Malgré la prise de conscience et la mise en place croissantes de nouvelles lignes directrices en matière de manipulation sécuritaire, les surfaces de certains endroits des centres de santé sont contaminées par des traces de nombreux médicaments antinéoplasiques. La fixation d’objectifs atteignables pour les centres (p. ex., entre le 75e et le 90e percentile par rapport aux autres centres similaires) aide à déterminer les sites d’échantillonnage où des améliorations sont nécessaires et à diminuer la contamination des surfaces.

Les protéines sont impliquées dans de nombreux processus biologiques. Il est nécessaire pour comprendre en détail leur fonction et leur mode d’action afin d’obtenir des informations sur leur structure et sur leurs interactions éventuelles avec leurs partenaires. Le travail réalisé durant cette thèse a consisté à développer deux méthodes innovantes utilisant la spectrométrie de masse pour étudier la structure des protéines et à appliquer ces méthodes à une problématique biologique. Nous avons optimisé une méthode associant les échanges H/D et la spectrométrie de masse sur une protéine modèle, la protéine PBP-2X. L’utilisation combinée de trois protéases nous a permis d’obtenir un meilleur recouvrement de séquence de la protéine étudiée et une plus grande résolution spatiale dans la localisation des zones d’intérêt. Une méthode associant la réticulation chimique et la spectrométrie de masse a été mise au point sur une protéine modèle : le cytochrome c. Les contraintes de distances ainsi obtenues vont intervenir dans une démarche bioinformatique visant à déterminer la famille de repliement d’une protéine de structure inconnue. Enfin, ces deux méthodes ont été appliquées avec succès sur des protéines du système de sécrétion de type III de Pseudomonas aeruginosa : PcrV et PcrG. Nos résultats expérimentaux sur PcrV corrèlent à la structure modélisée de PcrV et la protéine PcrG est globalement peu structurée. L’interaction PcrV-PcrG a été caractérisée, elle met en jeu les domaines « coiled-coil » de chacune des deux protéines. La formation du complexe induit un changement de la conformation de PcrV qui pourrait avoir pour conséquence la stabilisation de PcrG
Proteins are involved in many biological processes. They might be targets for medical treatments as well as therapeutic agents. A detailed knowledge of protein structure and a characterization of protein complexes are important to understand protein functions in a cell. In this study, we developed two new methods, which use mass spectrometry, to elucidate protein structure. These methods were then applied with success on a biological study. We improved a method that combines H/D exchange experiments with mass spectrometry on a model protein: PBP-2X. We show that the combination of three proteases increases the sequence coverage of the protein and the spatial resolution in the determination of interest areas. We developed a method, which associates intramolecular cross-linking and mass spectrometry on a model protein: the cytochrome c. Distance constraints determined by this way will be included in a bioinformatic project, that could give the folding family of a protein of which the tri-dimensional structure is unknown. We applied these two methods on proteins which are involved in type III protein secretion system from Pseudomonas aeruginosa: PcrV and PcrG. Experimental data (accessibility, secondary structures and distance constraints) are in agreement with the structural predictions on PcrV. PcrG is mainly unstructured. PcrG and PcrV are in interaction through their coiled-coil domains. Complexation between the two proteins induces conformational changes on PcrV, which could stabilize PcrG

L’élucidation des interactions non-covalentes des complexes biologiques revêt d’une importance majeure dans la compréhension du fonctionnement cellulaire. L’objectif de ce travail de thèse est d’approfondir les développements de la spectrométrie de masse (MS) pour l’étude de ces complexes, que ce soit par MALDI-MS (la désorption-ionisation laser assistée par matrice) ou par ESI-MS (l’ionisation électrospray). Ce travail s’est articulé autour de trois axes : i) étude de la stœchiométrie et de la topologie du complexe SAGA HAT (Spt-Ada-Gcn5 Acétyltransferase, module Histone Acétyl Transferase) par pontage chimique couplé à la MS ; ii) suivi de la dimérisation des complexes formés par RAR-RXR (récepteur de l’acide rétinoïque - récepteur X des rétinoïdes) avec différents ADNs ; iii) mesure de la constante de dissociation des complexes RXR-ligand. Les méthodologies développées ont permis de repousser le potentiel de la MS et d’obtenir des informations structurales des complexes biologiques
Elucidation of non-covalent interactions of biological complexes takes on great importance for the understanding of cellular function. The purpose of this thesis is a further development of mass spectrometry (MS) for the study of these complexes, either by MALDI-MS (matrix-assisted laser desorption-ionization) or by ESI-MS (electrospray ionization). This work was focused on three main lines: i) study of the stoichiometry and the topology of SAGA HAT (Spt-Ada-Gcn5 Acetyltransferase, Histone Acetyl Transferase module) complex by chemical cross-linking coupled to MS; ii) monitoring the dimerization of the complexes formed by RAR-RXR (retinoic acid receptor - retinoid X receptor) with different DNAs; iii) measuring the dissociation constant of RXR-ligand complexes. The developed methodologies made it possible to expand the potential of MS and get insight into structure of biological complexes

Les composés perfluorés possèdent des propriétés à la fois hydrophobes et lipophobes et sont commercialisés depuis les années 1950. Ils ont été depuis largement utilisés dans de nombreuses applications industrielles. Cependant, il s’agit de composés persistants, bioaccumulatifs, avec de grandes durées de vie atmosphérique. Ces espèces sont considérées comme de puissants gaz à effet de serre, et seraient principalement dégradées par photolyse, dans la haute atmosphère. Un travail de caractérisation physicochimique de deux composés perfluorés, le PFOA et le PFOS, produits de dégradation ultime des composés perfluorés les plus utilisés, a été réalisé. Des expériences de spectroscopie VUV et spectrométrie de masse ont permis d’identifier les voies de relaxation de ces composés après photoactivation. Une méthodologie par couplage rayonnement synchrotron/spectrométrie de masse permettant la mesure de sections efficaces absolues a été développée puis appliquée aux composés d’intérêt. Ces mesures ont ensuite été reliées à leur taux de photolyse et durées de vie atmosphérique selon l’altitude
Perfluorocarbons compounds have both hydrophobic and lipophobic properties. They have been manufactured since the 1950s, and widely used in many industrial applications. However, they are persistent, bioaccumulative compounds with long atmospheric lifetimes. They are considered to be potent greenhouse gases, and are supposed to be mainly degraded by photolysis in the upper atmosphere. A work of physicochemical characterization of two perfluorinated compounds was realized on the PFOA and PFOS. They have been found to be the final compounds of degradation of the majority of perfluororinated compounds. VUV spectroscopy and mass spectrometry experiences have been undertaken to identify their relaxation pathways after photoactivation. A methodology based on the coupling of synchrotron radiation and mass spectrometry was developed to perform absolute cross section measurements and was apply to the compounds of interest. These measurements have been used to determine their photolysis rates and atmospheric lifetimes according to the altitude

Les polyoxométallates (POM) sont des composés anioniques constitués par l’assemblage de polyèdres d’oxydes métalliques {MOy}, (avec M, MoVI ou WVI) reliés entre eux par des atomes d'oxygène. Les POM forment ainsi une classe remarquable de clusters d’oxydes métalliques inorganiques nanométriques, avec une grande variété de charges et de structures. Il est possible de former des systèmes hybrides incluant la partie inorganique du POM et une partie organique greffée, permettant d’apporter de nouvelles fonctionnalités aux POM, tel que l’auto-assemblage. Nous avons consacré ces travaux de thèse à la caractérisation de systèmes classiques, hybrides et auto-assemblés de POM par spectrométrie de masse couplée à la spectrométrie à la mobilité ionique (IMS-MS). Une première approche expérimentale par spectrométrie de mobilité ionique en tube de dérive (DTIMS) nous a permis de déterminer les sections efficaces de collisions (CCS) de POM étalons dans l’hélium et dans l’azote. Les CCS des étalons POM nous ont ensuite permis d’étalonner une cellule IMS de type Travelling Wave (TWIMS). L’analyse par IMS-MS de POM hybrides organiques-inorganiques seuls ou en présence de PdCl2 a mis en évidence la présence de systèmes auto-assemblés triangulaires [POM3·cation3], carrés [POM4·cation4] ou pentagonaux [POM5·cation5] avec différents états de charges. Des valeurs de CCS de ces auto-assemblages ont également pu être estimées à partir de l’étalonnage de la cellule TWIMS. Par une approche théorique, nous avons modélisé plusieurs structures de POM standards avec et sans contre-ion tetrabutylammonium (TBA+) par la théorie de la fonctionnelle de la densité (DFT). Les structures optimisées ont été utilisées afin de déterminer des CCS théoriques grâce au logiciel MOBCAL, auquel nous avons incorporé les atomes de molybdène et de tungstène pour lesquels nous avons optimisé de nouveaux paramètres de potentiel de Lennard Jones. La correspondance des CCS expérimentales et théoriques des structures de POM standards offre de nouvelles possibilités pour une attribution structurale pour les POM hybrides auto-assemblés par coordination en présence de cations métalliques
Polyoxometalates (POM) are anionic compounds formed by the assembly of metal oxide polyhedra {MOy}, (with M, MoVI or WVI) linked together by oxygen atoms. POM thus form a remarkable class of nanometric inorganic metal oxide clusters, with a wide variety of charges and structures. It is possible to form hybrid systems including the inorganic part of the POM and a grafted organic part, allowing new functionalities to be added to the POM, such as selfassembly. We have dedicated this thesis work to the characterization of standards, hybrid and self-assembled POM systems by mass spectrometry coupled to ion mobility spectrometry (IMS-MS). A first experimental approach using drift tube ion mobility spectrometry (DTIMS) allowed us to determine the collision cross sections (CCS) of standard POM in helium and nitrogen. The CCS of the POM standards then allowed us to calibrate an IMS cell of a Travelling Wave ion mobility instrument (TWIMS). The analysis by IMS-MS of organic-inorganic hybrid POMs alone or in the presence of transition metal cations revealed the presence of self-assembled triangular [POM3·cation3], square [POM4·cation4] or pentagonal [POM5·cation5] systems with different charge states. CCS values of these self-assemblies was estimated from the calibration of the TWIMS cell. Using a theoretical approach, we modelled several standard POM structures with and without tetrabutylammonium counterion (TBA+) using density functional theory (DFT). The optimized structures were used to determine theoretical CCS using the trajectory method of the MOBCAL software, in which we incorporated molybdenum and tungsten atoms for which we optimized new Lennard Jones potential parameters. The correspondence of experimental and theoretical CCS of standard POM structures offers new possibilities for structural attribution of self-assembled hybrid POM by coordination in the presence of metal cations

La maladie d’Alzheimer (MA) est un désordre neuro-dégénératif chronique fatal et la forme la plus répandue des démences chez l’adulte qui touchent plus de 28 millions de personnes dans le monde. En absence de traitement pour les démences neurodégénérative dont la maladie d’Alzheimer, le coût de celles-ci est estimé à 1 trillion d’USD en 2018 ce qui représente des enjeux économiques et sociétaux majeurs au niveau national et mondial. La MA est une forme d’amylose qui est caractérisée par l’agrégation du peptide amyloïde beta (Aβ) dans le cerveau des patients. Le facteur de risque génétique principal de la forme tardive (après 65 ans) de cette maladie est l’isoforme E4 de l’apolipoprotéine E (apoE) qui intervient dans le transport et le métabolisme des lipides et interagit avec le peptide Aβ. La modulation de la structure des isoformes d’apoE et de leur interaction avec l’Aβ apparaît comme une cible prometteuse dans la conception rationnelle de thérapies de la maladie. Celle-ci nécessite néanmoins une compréhension approfondie des propriétés structurales et dynamiques des deux partenaires moléculaires. Dans le cadre de cette thèse, nous avons étudié la structure de trois isoformes (E2, E3 et E4) de l’apoE par différentes techniques de biologie structurale et principalement par la réticulation chimique couplée à la spectrométrie de masse (CXMS) quantitative et par la bioinformatique structurale. Ces données complémentées par la spectroscopie infrarouge ont permis de construire des modèles structuraux de l’apoE2, E3 et E4. Nous avons mis en évidence l’interaction des domaines N- et C-terminal et la présence de multiples conformations de l’apoE chez les trois isoformes. Nos données suggèrent un équilibre entre deux principales conformations de l’apoE dont la population relative diffère entre les trois isoformes. Nous proposons les interfaces à cibler dans le cadre de thérapie visant à moduler les propriétés structurales des isoformes de l’apoE.Nous avons également mis en évidence que chaque isoforme d’apoE (E2, E3 et E4) interfère avec l’agrégation d’Aβ. Le peptide interagit avec les deux domaines N- et C- terminal de l’apoE. L’étude quantitative de l’interaction par CXMS a révélé des différences entre les cross-links formés en présence des isoformes. La modélisation du complexe apoE-Aβ a permis de mettre en évidence les interfaces impliquées dans l’interaction. Celle-ci possède une composante hydrophobe et électrostatique qui diffère chez les isoformes d’apoE. Nous proposons un mécanisme de l’interaction apoE-Aβ qui est initié par les propriétés hydrophobes des deux partenaires et qui est stabilisé par la suite via des contacts électrostatiques. Par ailleurs, une étude permettant d’explorer le potentiel de la nouvelle chimie de réticulation des résidues acides de protéine dans des applications en protéomique structurale a été effectuée.
Doctorat en Sciences
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Le cancer de l'ovaire (OvCa) est le cancer le plus mortel parmi les cancers féminins. Il est souvent diagnostiqué tardivement ou mal diagnostiqué, ce qui le rend difficile à traiter. Les options de traitement incluent la chirurgie ou la chimiothérapie, toutefois la résistance à la chimiothérapie est un problème majeur. Il est donc urgent de trouver de nouvelles cibles et de développer de nouvelles stratégies pour surmonter cette résistance.Dans ce contexte le protéome fantôme est une source potentiellement riche de biomarqueurs. Le protéome fantôme, ou protéome alternatif, est composé de protéines traduites à partir de cadres de lecture ouverts alternatifs (AltORFs). Ces AltORFs proviennent de différents codons START issus de différente région de l'ARNm, tels qu'un décalage de cadre de lecture (+1, +2) dans la séquence codante de l'ADN (CDS), dans le 5'-UTR, 3'-UTR et éventuellement de la traduction d'ARN non codants (ncRNA).Les études sur les protéines alternatives (AltProts) sont souvent complexes et nécessite des études biomoléculaires coûteuses. Cependant, leurs fonctions peuvent être déduites en identifiant leurs partenaires d'interaction, la détection des interactions protéine-protéine (PPI) entre AltProts et protéines de référence (RefProts) peut aider à identifier leur fonction. La stratégie de pontage chimique (crosslink) combiné à la spectrométrie de masse (XL-MS) est un outil approprié à cet objectif. De plus, les outils bioinformatiques qui relient les informations fonctionnelles des RefProt et les analyses d'ontologie génique (GO) permettent la visualisation des voies de signalisation et le regroupement des RefProts en fonction de leur processus biologique, de leur fonction moléculaire ou de leur localisation cellulaire, et ainsi y placer certaine AltProt.Dans ce travail, nous avons développé une méthodologie combinant XL-MS et le fractionnement subcellulaire. L'étape de fractionnement subcellulaire nous a permis de réduire la complexité des échantillons analysés par chromatographie liquide et spectrométrie de masse (LC-HRMS/MS). Pour évaluer la validité des interactions, nous avons réalisé une modélisation moléculaire des structures 3D des AltProts, suivie d'une prédiction informatique de l'interaction et de mesure des distances de pontages identifiés expérimentalement. L'analyse a révélé des rôles d'AltProts dans les fonctions et les processus biologiques tel que la réparation de l'ADN ou encore la présentation d'antigène.La protéogénomique a été utilisée pour générer des bases de données protéiques personnalisées à partir des données de séquençage ARN afin d'étudier les protéomes de deux lignées cellulaires de cancer de l'ovaire (PEO-4 et SKOV-3) en comparaison avec une lignée cellulaire ovarienne normale (T1074). L'expression différentielle de plusieurs protéines a ainsi été identifiée entre les lignées cellulaires cancéreuses et normales, avec une association aux voies de signalisation connues pour le cancer. Des PPI ont également été identifiées dans les lignées cellulaires cancéreuses en utilisant la méthodologie XL-MS.Ce travail met en évidence le potentiel de l'approche protéogénomique pour découvrir de nouveaux aspects de la biologie du cancer de l'ovaire. Il nous permet d'identifier des protéines et des variants auparavant inconnus qui peuvent avoir une signification fonctionnelle. L'utilisation de bases de données protéiques personnalisées et de l'approche de réticulation a mis en lumière le "protéome fantôme", une vision du protéome restée inexplorée jusqu'à présent
Ovarian cancer (OvCa) has the highest mortality rate among female reproductive cancers worldwide. OvCa is often referred to as a stealth killer because it is commonly diagnosed late or misdiagnosed. Once diagnosed, OvCa treatment options include surgery or chemotherapy. However, chemotherapy resistance is a significant obstacle. Therefore, there is an urgent need to identify new targets and develop novel therapeutic strategies to overcome therapy resistance.In this context the ghost proteome is a potentially rich source of biomarkers. The ghost proteome, also known as the alternative proteome, consists of proteins translated from alternative open reading frames (AltORFs). These AltORFs originate from different start codons within mRNA molecules, such as the coding DNA sequence (CDS) in frameshifts (+1, +2), the 5'-UTR, 3'-UTR, and possible translation products from non-coding RNAs (ncRNA).Studies on alternative proteins (AltProts) are often limited due to their case-by-case occurrence and complexity. Obtaining functional protein information for AltProts requires complex and costly biomolecular studies. However, their functions can be inferred by profiling their interaction partners, known as "guilty by association" approaches. Indeed, assessing AltProts' protein-protein interactions (PPIs) with reference proteins (RefProts) can help identify their function and set them as research targets. Since there is a lack of antibodies against AltProts, crosslinking mass spectrometry (XL-MS) is an appropriate tool for this task. Additionally, bioinformatic tools that link protein functional information through networks and gene ontology (GO) analysis are also powerful. These tools enable the visualization of signaling pathways and the grouping of RefProts based on their biological process, molecular function, or cellular localization, thus enhancing our understanding of cellular mechanisms.In this work, we developed a methodology that combines XL-MS and subcellular fractionation. The key step of subcellular fractionation allowed us to reduce the complexity of the samples analyzed by liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). To assess the validity of crosslinked interactions, we performed molecular modeling of the 3D structures of the AltProts, followed by docking studies and measurement of the corresponding crosslink distances. Network analysis indicated potential roles for AltProts in biological functions and processes. The advantages of this workflow include non-targeted AltProt identification and subcellular identification.Additionally, a proteogenomic analysis was performed to investigate the proteomes of two ovarian cancer cell lines (PEO-4 and SKOV-3 cells) in comparison to a normal ovarian epithelial cell line (T1074 cell). Using RNA-seq data, customized protein databases for each cell line were generated. Differential expression of several proteins, including AltProts, was identified between the cancer and normal cell lines. The expression of some RefProts and their transcripts were associated with cancer-related pathways. Moreover, the XL-MS methodology described above was used to identify PPIs in the cancerous cell lines.This work highlights the significant potential of proteogenomics in uncovering new aspects of ovarian cancer biology. It enables us to identify previously unknown proteins and variants that may have functional significance. The use of customized protein databases and the crosslinking approach have shed light on the "ghost proteome," an area that has remained unexplored until now

L'α-Synuclein (αSyn) fibrillaire, impliqué dans la maladie de Parkinson et d’autres synucleinopathies, peut se propager entre cellules de manière « prion-like » et cette propagation est liée à la progression de la maladie. Durant cette étude, nous nous sommes tournés vers les chaperons moléculaires impliqués dans l’agrégation de l’αSyn ou bien dans sa toxicité afin de trouver des candidats capables d’interférer avec la propagation. Nous avons ensuite testé l’effet des chaperons capables de se lier aux fibres d’αSyn sur l’internalisation des fibres d’αSyn par les cellules Neuro-2a. Nous démontrons que l’interaction avec l’αSyn agrégeant avec αB-crystallin (αBc) ou Carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein (CHIP) a mené à la formation de fibres qui sont moins internalisées par les cellules. Enfin, en passant par une stratégie de pontage chimique optimisé couplé à la spectrométrie de masse, nous avons identifié les zones d’interaction entre l’αSyn fibrillaire et soit αBc, soit CHIP. Ces résidus issus des chaperons, se trouvant à proximité des fibres d’αSyn dans les complexes, pourraient être développés dans des mini-chaperons peptidiques, capables d’enrober la surface des fibres et ainsi de bloquer la liaison à la membrane et l’internalisation des fibres. De surcroît, des polypeptides issus des partenaires précédemment identifiés d’αSyn ont été testé pour leur liaison aux fibres et leur effet sur la propagation des fibres
Fibrillar α-Synuclein (αSyn) is the molecular hallmark of Parkinson’s Disease and other synucleinopathies. Its prion-like propagation between cells is linked to disease progression. In this study, we looked to molecular chaperones previously implicated in αSyn fibrillation and/or toxicity to identify proteins capable of binding αSyn fibrillar aggregates in order to target their propagation. We further assessed the effect of the fibril-binding chaperones on internalization of αSyn fibrils by Neuro-2a cells. We demonstrate that the interaction of aggregating αSyn with αB-crystallin (αBc) or Carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein (CHIP) led to the formation of fibrils that are less internalized by cells. Finally, using an optimized chemical cross-linking and mass spectrometry strategy, we identified the interaction areas between fibrillar αSyn and either αBc or CHIP. These chaperone residues, located proximally to αSyn fibrils, could be subsequently developed into peptidic mini chaperones, capable of coating the fibril surface and thereby blocking fibrillar cell binding and internalization. Furthermore, polypeptides derived from previously identified αSyn binding partners were tested for their binding to αSyn fibrils and subsequent effect on fibril propagation

L'évolution des réserves de pétrole implique l'utilisation en raffinerie de pétroles bruts non conventionnels, bien souvent plus lourds et donc difficiles à caractériser. Les produits pétroliers sont en effet des mélanges chimiques extrêmement complexes. La partie légère et volatile peut être analysée par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC/MS), permettant l'identification des composés par l'utilisation de mesures de masses précises et de modèles de fragmentation. Cependant ces techniques sont inadaptées à l'analyse des fractions lourdes. Dans la pratique, la caractérisation des mélanges les plus complexes implique l'utilisation de spectromètres de masse à ultra-haute résolution généralement par analyse directe sans séparation chromatographique. La technique de référence est aujourd’hui la spectrométrie de masse à transformée de Fourier par résonance cyclotronique des ions (FTICR). Grâce à une résolution supérieure à 106 et à une précision de mesure de masse inférieure à 0,1 ppm, cet instrument permet de séparer toutes les espèces présentes dans un produit pétrolier et d'attribuer à chaque valeur de m/z une composition élémentaire unique. Ceci permet d'obtenir très facilement des cartes moléculaires qui peuvent être présentées graphiquement en utilisant le diagramme de Kendrick, le diagramme de van Krevelen ou le nombre d'insaturations (DBE) en fonction du nombre de carbones. Ce travail de thèse a permis grâce à la caractérisation moléculaire de produits pétroliers (Vacuum Gas Oil, Pétroles Bruts, Matériel Interfacial, Asphaltènes et Bio-Oil…) d'aborder la complexité de leur traitement dans l’outil de raffinage. Des protocoles d'analyses des échantillons ont été développés, à l'aide de différentes sources d'ionisation à pression atmosphérique (ESI, APCI et APPI) ainsi que par désorption/ionisation laser (LDI) sur le spectromètre de masse FTICR 12T. Les informations sur le contenu isomérique des produits pétroliers ont ensuite été déterminées grâce à l'apport de la spectrométrie de mobilité ionique (IMS)
The evolution of oil reserves requires the use in refineries of unconventional crude oils, which are often heavier and therefore difficult to characterize. Petroleum products are in fact extremely complex chemical mixtures. The light and volatile part can be analysed by gas chromatography coupled with mass spectrometry (GC/MS), allowing the identification of compounds by using precise mass measurements and fragmentation models. However, these techniques are inappropriate for the analysis of heavy fractions. In practice, the characterization of the most complex mixtures involves the use of ultra-high-resolution mass spectrometers generally by direct analysis without chromatographic separation. The reference technique today is Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry (FTICR). With a resolution of more than 106 and a mass measurement accuracy of less than 0.1 ppm, this instrument can separate all the species present in a petroleum product and assign a unique elemental composition to each m/z value. This makes it very easy to obtain molecular maps that can be presented graphically using the Kendrick diagram, the van Krevelen diagram or the number of unsaturations (DBE) as a function of the number of carbons. This thesis work has allowed thanks to the molecular characterization of petroleum products (Vacuum Gas Oil, Crude Oil, Interfacial Material, Asphaltenes and Bio-Oil...) addressing the complexity of their treatment in the refining tool. Protocols for sample analysis have been developed, using different sources of ionization at atmospheric pressure (ESI, APCI and APPI) as well as laser desorption/ionization (LDI) on the FTICR 12T mass spectrometer. Information on the isomeric content of petroleum products was then determined using ion mobility spectrometry (IMS)

L'étude de l'irradiation dans le système moléculaire à l'échelle du nanomètre est un domaine d'investigation innovant des sciences des radiations. Le Dispositif d'Irradiation d'Agrégats Moléculaires (DIAM) est conçu en vue les conséquences de l'irradiation dans des petits systèmes moléculaires modèles comme les agrégats d'eau protonés. L'irradiation provoque la fragmentation en plusieurs fragments neutres ou chargés. La technique de spectrométrie de masse COINTOF (Correlated Ion and Neutral Time of Flight) permet la détection corrélées des fragments neutres et chargés issus de la dissociation d'un système moléculaire préalablement sélectionné en masse et en vitesse. Les données collectées sont traitées et structurées pour permettre l'analyse statistique des corrélations sur un grand nombre d'événements de fragmentation. Parallèlement à l'identification des canaux de fragmentation, la technique COINTOF permet la mesure de leur rapport de branchement et de leur section efficace. La méthode est présentée pour la dissociation induite par collision sur un atome d'argon, d'agrégats d'eau protonés H+(H2O)n:[2;7], accélérés à 8keV. L'efficacité de détection, information déterminante pour la production de données quantitatives, est mesurée à partir des données et étudiée en fonction de la distribution l'amplitude des signaux de détection. Enfin, un nouveau système de cible constituée de nanogouttes de gaz rares a été développé

Dans l'introduction, diverses voies de trafic intracellulaire et endocytose seront discutées. Je familiarise le lecteur avec des protéines inactivant les ribosomes, en mettant l'accent sur la structure, l'endocytose, et le trafic intracellulaire de la toxine bactérienne Shiga toxin (STX). STx et la ricine suivent la voie rétrograde pour exercer leur effet toxique sur les cellules. Ils sont respectivement, une menace maladie infectieuse pour la santé humaine et des outils potentiels pour le bioterrorisme pour lequel aucun antidote n’existe actuellement. D'un criblage à haut débit, Retro-1 et Retro-2 avaient déjà été identifiés comme de puissants inhibiteurs de la voie rétrograde à l'interface des endosomes précoces-TGN, et Retro-2 a été démontré pour protéger les souris contre la ricine. Parmi les facteurs de trafic analysés, seule la protéine SNARE syntaxine-5 a été ré- localisée dans les cellules traitées avec Rétro - 2
In the introduction, various endocytic and intracellular trafficking pathways will be discussed. I acquaint the reader with ribosome-inactivating proteins, with emphasis on the structure, endocytosis, and intracellular trafficking of the bacterial toxin Shiga toxin (STx). STx and ricin follow the retrograde route to exert their toxic effect on cells. They are respectively, an infectious disease threat to human health and potential tools for bioterrorism for which no antidote currently exists. From a high throughput screening, Retro-1 and Retro-2 had previously been identified as potent inhibitors of the retrograde route at the early endosomes-TGN interface, and Retro-2 was demonstrated to protect mice against ricin. Of the trafficking factors analyzed, only the SNARE protein syntaxin-5 was re-localized in Retro-2 treated cells. Yet, whether syntaxin-5 is the direct target of Retro-2 and whether its re-localization was directly responsible for retrograde transport inhibition remained to be established