Tesi sul tema "Signalisation du BCR"

Une des molécules clés des fonctions biologiques du lymphocyte B est le BCR (B Cell Receptor). Les connaissances concernant l'altération du signal BCR et son implication dans l'apparition des lymphopathies B ne cessent de s'élargir. De ce fait, le ciblage pharmacologique de cette molécule et de sa signalisation a constitué le centre d'intérêt de mes travaux de thèse. Ainsi nous avons montré que le Rituximab (anticorps thérapeutique anti-CD20) est capable d'inhiber le signal BCR à travers la diminution de son expression et que l'enzastaurine qui est un inhibiteur de protéines kinases situées en aval du BCR représente un potentiel anti-tumoral pour le lymphome folliculaire. Ainsi, ces travaux participent à la compréhension des mécanismes d'action de ces molécules thérapeutiques et démontrent l'importance du signal BCR dans la thérapie des lymphomes
Beside its central role in the recognition of antigen, the BCR (B Cell Receptor) controls a multitude of intracellular mechanisms that regulate B lymphocyte biology. Altered BCR signaling has been demonstrated in various types of B-cell lymphoma and some autoimmune diseases. Thus, therapeutic targeting of BCR signaling has been the focus of my PhD studies. We demonstrate that the monoclonal anti-CD20 antibody, Rituximab, inhibits BCR signaling at least by down-regulating BCR expression. Furthermore, enzastaurin (kinases inhibitor) exerts an anti-tumoral effect on follicular lymphoma cells by inhibiting downstream BCR signaling. Then, we characterized new mechanisms of action of Rituximab and enzastaurin and we focused on the importance of BCR signaling in lymphoma's therapy

La signalisation du BCR présente une dualité fonctionnelle, dépendante de l'état de différenciation des lymphocytes B. L'activité pro-apoptotique de la protéine Bad et son trafic intracellulaire sont modulés par phosphorylation/déphosphorylation. Aucun travail n'a mis en évidence la modulation de la phosphorylation de Bad au cours de l'apoptose induite par le BCR, ni établit une connexion avec la phase mitochondriale initiatrice de mort. Nous montrons par cytométrie en flux, immunoprécipitation, Western Blot et microscopie confocale que : (i) l'activation de Bad (déphosphorylation) est impliquée dans l'apoptose des lymphocytes B immatures induite par le BCR (ii) la régulation de l'état de phosphorylation de Bad pourrait être au centre de la dualité fonctionnelle du BCR (survie/apoptose) (iii) la capacité différente à séquestrer Bad dans certains compartiments subcellulaires (rafts) pourrait contribuer à la plus grande susceptibilité des lymphocytes B immatures à l'apoptose
BCR signaling presents differential functional responses, dependent of B cell stage of differentiation. The pro-apoptotic activity of Bad protein and its intracellular traffic are regulated by phosphorylation and dephosphorylation. Modulation of Bad phosphorylation during BCR-induced apoptosis and correlation with cell death mitochondrial pathway are not fully characterized. We show by flow cytometry, immunoprecipitation, Western Blotting and confocal microscopy that : (i) Bad activation (dephosphorylation) is implicated in BCR-induced apoptosis of immature B lymphocytes (ii) regulation of Bad phosphorylation status may contribute to BCR functional duality (survival/apoptosis) (iii) differential subcellular compartmentalization of Bad (in particular in rafts) may contribute to sensitize immature B cells to apoptosis

Afin de positionner des QTL de fertilité mâle, nous avons utilisé un ensemble de lignées interspécifiques, recombinantes et congéniques (IRCS). Nous avons positionné 8 QTL influençant les paramètres : poids testiculaire, et prostatique, morphologie et vitalité des spermatozoïdes. Nous avons ciblé notre étude sur une lignée IRCS portant un QTL impliqué dans une réduction du poids testiculaire, et une tératozoospermie sur le chromosome 11. L'analyse en cartographie fine nous a permis de proposer une région candidate de 4 gènes significativement exprimés dans le testicule. Par ailleurs, nous avons conduit une analyse du transcriptome testiculaire de trois lignées IRCS et des lignées parentales qui a montré comment des gènes spretus étaient régulés lorsqu'ils étaient introgressés dans un génome musculus. Cette étude nous a permis d'amorcer une réflexion sur la tolérance d'un génome vis-à-vis des flux de gènes entre espèces voisines dans la constitution d'un génome mosaïque
In order to map new QTL regulating male fertility parameter, we analysed a set of Interspecific Recombinant Congenic strain. We mapped 8 QTL implicated in testis, development, prostate growth, sperm vitality and morphology. We performed fine mapping analysis of a QTL of reduced testis weight associated with teratozoospermia, localised on MMU11. We proposed a candidate locus encompassing four testis expressed gene. Moreover, in order to understand gene expression regulation in interspecific mosaic genome, we analysed testis transcriptome of three IRC strains compared with parental strains testis transcriptome. In this study, we describe how spretus genes are regulated when introgressed in musculus background. This study gives some insight concerning gene flow tolerance across the specie barrier during emergence of mosaic genome

La leucémie lymphoïde chronique (LLC) a une évolution clinique variable, certains patients restant stables tandis que d'autres connaissent une progression. En stimulant le récepteur des cellules B (BCR) de LLC ex vivo, il est possible de distinguer les non-répondeurs (NR) des répondeurs (R) sur la base de la survie des cellules. Ce taux de survie est en corrélation avec la survie globale du patient. Les niveaux de phosphorylation différentiels de Syk, une kinase clé dans la signalisation du BCR, suggèrent que les modifications post-traductionnelles de Syk contribuent à la progression de la LLC. Nos études révèlent des différences dans la cinétique de phosphorylation globale et spécifique et un profil de Syk entre les cellules B de la LLC dans des conditions basales et stimulées par le BCR, ce qui suggère un rôle spécifique des sites spécifiques de Syk. L'analyse fonctionnelle des mutants de phosphorylation de Syk ciblant son processus d'activation ou sa capacité à lier des partenaires montre leur implication distincte dans l'activité métabolique, la sécrétion de cytokines et les voies de signalisation lors de l'activation du BCR. Dans l'ensemble, nos résultats fournissent de nouvelles informations sur le rôle potentiel de la conformation de Syk dans la pathogenèse de la LLC et offrent des indications sur des cibles thérapeutiques potentielles pour la maladie
Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL) has a variable clinical course, with some patients remaining stable while others experience progression. By stimulating the B Cell Receptor (BCR) in CLL B cells ex-vivo, it is possible to distinguish between non-responder (NR) and responder (R) cases based on cell survival. This survival rate correlates with overall patient survival. Differential phosphorylation levels of Syk, a key kinase in BCR signaling, suggest that post-translationally modified Syk contributes to CLL progression. Our studies reveal differences in global and specific phosphorylation kinetics and spot patterns of Syk between CLL B cells in basal and BCR-stimulated conditions, arguing for the dedicated role of Syk-specific sites. Functional analysis of Syk phosphorylation mutants targeting its activation process or its ability to bind partners shows their distinct involvement in metabolic activity, cytokine secretion, and signaling pathways upon BCR activation. Collectively, our findings provide new insights into the potential role of Syk conformation in CLL pathogenesis and offer insights into potential therapeutic targets for the disease

Les oncogènes Bcr-Abl (p190bcr-abl et p210bcr-abl) sont issus d'une translocation chromosomique t(9,22) qui fusionne en phase les gènes bcr et c-abl. p210bcr-abl est généralement responsable de la Leucémie Myéloïde Chronique (LMC) alors que p190bcr-abl induit un sous type de Leucémie Aigue Lymphoblastique (LAL). La seule différence structurale entre ces deux protéines est la présence d'un domaine DH/PH au sein de p210bcr-abl activateur spécifique de RhoA. L'expression de Bcr-Abl dans la lignée Ba/F3 est associée au déclenchement d'une migration spontanée, dépourvue de directionnalité, sous la dépendance de la GTPase Rac1.L'activation de RhoA, spécifique des cellules Ba/F3p210, est associée à un phénotype migratoire amœboïde dans une matrice de Matrigel™ en 3D où les cellules Ba/F3p190 dépourvues de RhoA activé, présentent une mobilité de type roulement. Dans ce travail, nous avons mis en évidence que l'activation spécifique de ROCK1 par RhoA détermine deux voies parallèles et mutuellement indispensables pour le mouvement amœboïde : 1) la voie de la Chaine Légère de Myosine (CLM) 2) celle des protéines de la famille ADF (Actin Depolymerizing Factor), et plus particulièrement l'isoforme ADF/destrine. Nous démontrons également l'existence d'invadopodes spécifiquement dans les cellules Ba/F3p190, dont la formation est sous la dépendance de l'absence d'activation de RhoA corrélée à une augmentation de l'activation de Cdc42. Enfin nous démontrons que la voie de signalisation RhoA/ROCK est spécifiquement activée dans les progéniteurs hématopoïétiques CD34+ issus de patients atteints de LMC et ce, indépendamment de l'activité tyrosine kinase de Bcr-Abl
Bcr-Abl chimeric oncogenes (p190bcr-abl and p210bcr-abl) result from the t(9,22) chromosomal translocation that fuse the bcr and the c-abl genes. p210bcr-abl and p190bcr-abl are associated with Chronic Myelogenous Leukemia (CML) and a subset of Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL) respectively. The only difference between these two chimeras is the presence of a specific RhoA-GEF domain in the p210bcr-abl oncogene. Bcr-Abl expression in Ba/F3 lymphoblasts induces spontaneous migration of these cells without apparent directionality. Motility triggering of Bcr-Abl-expressing Ba/F3 depends on the RhoGTPase Rac1.RhoA activity is associated with a typical amoeboid movement of Ba/F3p210 cells embedded in Matrigel™ 3D matrix, whereas the Ba/F3p190 cells, devoid of RhoA activity, display a rolling-type motility. In this work we showed that activation of the RhoA effector ROCK1 triggers two parallel pathways which are both necessary for amoeboid movement: 1) the Myosin Light chain (MLC) pathway 2) ADF family proteins (Actin Depolymerizing Factor) pathway, specifically the ADF/destrin isoform. Besides, we showed that Ba/F3p190 cells could assemble invadopodia-like structures. The formation of these structures is driven by the reduction of RhoA activity associated with the absence of the DH/PH domain in p190bcr-abl and correlates with an increase in Cdc42 activity. We finally demonstrated that the RhoA/ROCK pathway is constitutively activated in CD34+ cells isolated from CML patients while not in their normal counterparts. We also demonstrated that this activation is independent of the tyrosine Kinase activity of Bcr-Abl

Les cellules dendritiques plasmacytoïdes sont les productrices majeures d’IFN de type I dans l’organisme humain. Durant les infections virales chroniques, telles que l’infection par le Virus de l’Hépatite C, les pDCs sont fonctionnellement altérées. L’efficacité dans plus de 50% des cas du traitement par IFN-α, utilisé jusqu’à récemment, suggère que la modulation de la fonction des pDCs serait une cible intéressante pour le traitement HCV. Les pDCs reconnaissent l’ARN du HCV par les récepteurs Toll-like, et disposent de plus d’un set de récepteurs dits régulateurs qui régulent la production d’IFN-I. L’activation de ces RR inhibe la production d’IFN-I par les pDCs stimulées par les agonistes de TLR7/9. Nous montrons ici que la glycoprotéine d’enveloppe E2 du HCV est un nouveau ligand des RR BDCA2 et DCIR des pDCs, et que cette liaison est responsable de l’inhibition d’IFN-I via l’activation de la voie de signalisation BCR-like. Nous avons ensuite voulu restaurer la production d’IFN-I dans les pDCs en ciblant les kinases décrites de la voie BCR-like, Syk et Mek. En inhibant Syk, l’IFN-I n’a été que partiellement restauré par les concentrations subliminales de l’inhibiteur; les concentrations élevées de cet inhibiteur ont bloqué la production d’IFN-I, suggérant l’implication de Syk dans la voie TLR7/9 comme montré pour l’activation des TLR dans les macrophages. En inhibant MEK, la restauration d’IFN-I est efficace. Les mécanismes de cette restauration sont explorés. Le ciblage pharmacologique de la signalisation BCR-like constituerait une nouvelle approche intéressante pour étudier les mécanismes de modulation de l’activation des pDCs dans les conditions physiopathologiques
Plasmacytoid dendritic cells are major producers of type I IFN in human organism. During chronic viral infections, such as Hepatitis C Virus infection, pDCs are functionally impaired. More than 50% efficiency of IFN-α treatment, until recently used, suggested that modulation of pDC function could be an important target for HCV treatment. pDCs recognize HCV RNA by Toll-like receptors, and dispose of a set of so-called regulatory receptors that regulate IFN-I production. Crosslinking of these RR such as BDCA-2 and ILT7 has been shown to inhibit IFN-I production by pDCs stimulated with TLR7/9 agonists. In this work we show that HCV envelope glycoprotein E2 is a novel ligand of pDC RR, BDCA-2 and DCIR, and that this binding is responsible for IFN-I inhibition via the activation of the BCR-like pathway. Then we assayed to restore IFN-I in pDCs with crosslinked RR by targeting well-known kinases of BCR-like pathway, Syk and Mek. When inhibiting Syk, IFN-I was only partially restored by subliminal concentrations of Syk inhibitor; high concentrations of Syk inhibitor effectively blocked IFN-I production, suggesting involvement of Syk in the TLR7/9 pathway as it was already demonstrated in TLR activation in macrophages. When inhibiting MEK, the restoration of type I IFN was effective. The underlying mechanisms leading to the restoration are further explored. Pharmacological targeting of BCR-like signaling may constitute an attractive new approach to study mechanisms of modulation of pDC activation in pathophysiological conditions

Parmi les mécanismes de réparation de l'ADN, la réparation par excision de nucléotides (NER) est celui qui corrige la plus grande variété de dommages. Nous avons étudié l'effet de l'expression de deux kinases (p210BCR-ABL et PKCzeta) dans la modulation des capacités de réparation de l'ADN. La transfection de l'oncogène p210bcr-abl dans les cellules myéloi͏̈des stimule l'activité NER de façon strictement dépendante de son activité kinase. Inversement, l'expression de p210BCR-ABL dans une lignée lymphoi͏̈de réprime l'activité NER et sensibilise les cellules aux UVC de façon dépendante de son activité kinase. Le rôle de p210BCR-ABL dans la modulation de NER se situe au début du processus NER, avant le recrutement de XPB. L'expression ectopique de PKCzeta confère aux cellules myéloi͏̈des une résistance aux UVC, au cisplatine et au melphalan. L'activité NER est stimulée par la surexpression de PKCzeta qui active les deux voies alternes de NER en augmentant l'expression des complexes de reconnaissance. Les protéines CSA et CSB sont surexprimées par la stimulation de leur transcription via l'activation de Sp1, alors que le complexe XPC/hHR23B est surexprimé pour des raisons non encore élucidées mais les hypothèses de régulation transcriptionnelle et de phosphorylation directe semblent exclues. Parallèlement, PKCzeta interagit avec et phosphoryle le complexe de reconnaissance des mésappariements de l'ADN, hMutSalpha. Cette phosphorylation empêche sa dégradation par le protéasome et conduit à l'activation de la réparation des mésappariements. .
Cells and DNA are exposed to various endogenous or exogenous genotoxic insults. Cells dispose of six DNA repair mechanisms. Among these, the nucleotide excision repair, NER, corrects a large variety of damage. We focused on the impact of kinase expression, p210BCR-ABL and PKCzeta, in DNA repair activity modulation. P210bcr-abl oncogene transfection in myeloid cells increases NER activity in a kinase activity-dependant pathway. Inversely, p210BCR-ABL expression in a lymphoid cell line represses NER activity and sensitises cells to UVC in a kinase activity-dependant pathway. P210BCR-ABL seems to target the initial steps of the NER process, before XPB recruitment occurs. We also show that ectopic expression of PKCzeta confers cell resistance to UVC, cisplatin and melphalan. PKCzeta overexpression stimulates NER activity by increasing global genome repair and transcription-coupled repair detection complex levels. CSA and CSB proteins are overexpressed by Sp1-mediated transcriptional stimulation. Reasons for XPC/hHR23B overexpression were unable to be elucidated thought transcriptional and direct phosphorylation, however are excluded. PKCzeta interacts with, and phosphorylates, the mismatch detection complex, hMutSalpha. Its phosphorylation prohibits proteasome degradation and increases mismatch repair activity. .

Les protéines STAT5A et B sont des facteurs de transcription jouant un rôle important dans l'hématopoïèse normale et leucémique. Ce sont en effet des effecteurs essentiels d’oncogènes à activité tyrosines kinases, tels que BCR-ABL ou JAK2V617F responsables de la genèse d’hémopathies malignes. Ces oncogènes régulent la production de ROS (Reactive Oxygen Species) via l’activation de différentes voies de signalisation impliquées dans la prolifération et la survie cellulaire. Dans ce travail de thèse, nous montrons que l’activation oncogénique de STAT5, induite par BCR-ABL, favorise un stress oxydatif dans les cellules de Leucémie Myéloïde chronique (LMC), via la répression de l’expression des enzymes anti-oxydantes catalase et glutaredoxine-1 et la modulation potentielle de l’activité des NADPH oxydases. Nous montrons pour la première fois que l’effet pro-oxydant de STAT5 est régulé par la phosphorylation sur tyrosine de ces protéines et que les formes non phosphorylées et transcriptionnellement inactives exercent un effet anti-oxydant et protecteur contre le stress oxydatif, via des mécanismes non canoniques. Cette dualité de fonction est illustrée dans un modèle de co-culture de cellules de LMC et de cellules stromales médullaires, que nous avons développé dans le laboratoire afin de mimer le microenvironnement médullaire des cellules leucémiques. Dans ce modèle, nous montrons que le contact avec les cellules stromales permet d’inactiver STAT5 dans les cellules leucémiques et donc de promouvoir son activité anti-oxydante. Nous observons également un arrêt de prolifération et une entrée en phase G0 du cycle cellulaire des cellules leucémiques au contact des cellules stromales, ainsi qu’une résistance accrue de ces cellules à l’Imatinib, un inhibiteur de BCR-ABL. Ces données suggèrent un lien important entre activité anti-oxydante de STAT5, quiescence et chimio résistance des cellules leucémiques
The Signal Transducer and Activator of Transcription factors 5A and B are two closely related STAT family members that play a major role in normal and leukemic hematopoiesis. STAT5 proteins are frequently activated in hematopoietic neoplasms and are targets of various tyrosine kinase oncogenes such as BCR-ABL and JAK2V617F. Both oncogenes were shown to stimulate the production of intracellular ROS (Reactive Oxygen Species) in leukemic cells and evidences for a cross talk between STAT5 and ROS metabolism have recently emerged. Herein, we demonstrate that sustained activation of STAT5 induced by BCR-ABL promotes ROS production in Chronic Myeloid Leukemia (CML) cells by repressing expression of two antioxidants, catalase and glutaredoxin1 and by possible functional interactions with NADPH oxidase complexes. We also provide compelling evidences that tyrosine phosphorylation regulate the pro-oxidant activity of STAT5 and that non phosphorylated STAT5 displays antioxidant properties and protection against oxidative stress via non-genomic effects. This dual function of STAT5 is also illustrated in an in vitro microenvironment model that we develop in our laboratory to analyze interactions between bone marrow stromal cells and CML cells. Using these coculture experiments, we show that STAT5 phosphorylation was reduced and its antioxidant activity enhanced in leukemic cells in contact with stromal cells. We also demonstrate in this model that leukemic cells stopped dividing, entered a quiescent G0 state and became resistant to Imatinib, a BCR-ABL kinase inhibitor. Collectively, these findings suggest an important link between antioxidant activity of STAT5, quiescence and resistance to chemotherapeutic agents in leukemic cells

L’immunité humorale fournit à l’organisme des armes solubles et spécifiques permettant de combattre les infections et d’en conserver une mémoire immunologique. Les travaux de cette thèse ont porté sur l’étude de la régulation positive et négative de l’activation des lymphocytes B lors des réponses immunes humorales. En effet, les membres de la famille du TNF (Tumor Necrosis Factor) tels que le CD40L et BAFF, sont capables d'amplifier la prolifération et de renforcer la survie des cellules B activées par l’antigène. Inversement, le RFcIIB1 assure un rétro-contrôle négatif de l’activation des lymphocytes B. Tout d’abord, ce travail a permis de montrer que l’engagement unique du RFcIIB1 à la surface de lymphocytes B humains IgM+, sans co-agrégation avec le BCR (B-cell antigen receptor), active la phosphorylation du récepteur et permet le recrutement de la phosphatase SHIP1. Cette agrégation suffit à inhiber l’influx calcique et la prolifération des cellules B IgM+ de manière réversible sans induire d’apoptose. Ces résultats m’ont permis de suggérer que l’agrégation seule du RFcIIB1 pourrait réguler négativement l’activation des lymphocytes B humains naïfs IgM+ sans induire leur apoptose. Puis, en collaboration avec l’équipe du Dr. Srini Kaveri, nous avons montré que les anti-CD40 contenus dans les IVIg (Intavenous Immunoglobulin), utilisées en thérapie de remplacement chez les patients atteints de Déficit Immunitaire Commun Variable, induisent la prolifération et la sécrétion d’immunoglobulines par des cellules B issues de ces patients. Ces observations suggèrent que ces anticorps pourraient participer à l’efficacité des IVIg en compensant le défaut de signalisation via le CD40 observé chez ces patients. Enfin, en collaboration avec le Dr. Chris Mueller, cette étude a permis de mettre en évidence que les cellules CD14+ présentes dans le stroma tumoral des Lymphomes Diffus à Grandes Cellules B favorisent la survie et la prolifération des cellules B tumorales via la production de la molécule BAFF.

Dans le cadre de la recherche de nouvelles molécules permettant une meilleure vaccination des individus contre la tuberculose, mon étude consiste à mieux comprendre les voies de signalisation cellulaires dans la reconnaissance hôte-pathogène par l'analyse de la mise en place des réponses immunitaires innée et acquise dans des modèles murins déficients pour les récepteurs TLR impliqués dans la reconnaissance des mycobactéries (TLR2, TLR4, TLR6) ou la molécule adaptatrice MyD88 infectés par M. Bovis BCG. Des études in vitro sur les cellules dérivées des souris déficientes ont mis en évidence les effets agonistes ou antagonistes de certains composants moléculaires de la paroi du BCG pour les différents TLR. Les études in vivo, d'autre part, ont montré que la déficience en TLR2 ou TLR6 n'entraîne pas de phénotype majeur de la réponse immunitaire à l'infection à M. Bovis BCG. En revanche, l'absence de voie de signalisation MyD88 induit un défaut du contrôle de l'infection, avec une inflammation pulmonaire exacerbée.

Les cancers de l’ovaire représentent la première cause de décès par cancer gynécologique. L’échec des traitements, lié à l’apparition d’une chimiorésistance, implique de trouver de nouvelles stratégies thérapeutiques. Dans ce cadre, le laboratoire a mis en évidence la coopération de deux molécules anti-apoptotiques surexprimées dans les cancers de l’ovaire, Mcl-1 et Bcl-xL, qui empêchent alors le déclenchement de la mort cellulaire par apoptose. L’inhibition de ces cibles est alors mise en place. Un BH3-mimétique inhibiteur de Bcl-xL a été développé par la société Abbvie, l’ABT-737, qui possède un dérivé administrable par voie orale l’ABT-263 en essai clinique. En revanche, aucun inhibiteur de Mcl-1 n’est actuellement en clinique. L’inhibition de cet anti-apoptotique est donc l’un des objectifs du laboratoire. Sachant que Mcl-1 est extrêmement régulée, que l’inhibition de la voie de signalisation PI3K/Akt/mTOR conduit à l’inhibition de cet anti-apoptotique, et que le calcium est capable de moduler cette voie, nous nous sommes demandés si la modulation des flux calciques permettait l’inhibition de Mcl-1 dans nos cellules. Ces travaux de thèse ont pu montrer dans un premier temps que la chélation calcique par le BAPTA-AM permettait d’inhiber Mcl-1 via la voie mTORC1 et de sensibiliser les cellules à l’ABT-737. Dans un second temps, l’étude de l’effet d’un inhibiteur des flux calciques en essais cliniques, le carboxyamidotriazole a permis de mettre en évidence que l’inhibition des canaux calciques capacitifs pouvait entraîner l’inhibition de Mcl-1 de nouveau en inhibant mTORC1 et induire la mort cellulaire en combinaison avec l’ABT-737. Enfin des observations morphologiques ont montré que le CAI induisait un changement morphologique aboutissant à la mort des cellules. Ce type de mort semble être lié à une perturbation du métabolisme des cellules cancéreuses IGROV1-R10 et se rapprocherait d’une mort récemmement décrite dans la littérature : l’autosis
Ovarian cancer is the leading cause of death from gynecological cancer. There is an urgent need to find new therapeutic strategies due to failure of treatments associated to development of chemoresistance. In this context, the laboratory has shown the cooperation of two anti-apoptotic proteins overexpressed in ovarian cancer, Mcl-1 and Bcl-xL, for preventing apoptotic cell death. ABT-737, a Bcl-xL inhibitor BH3-mimetic, was developed by Abbvie and has a clinically derivative named ABT-263. In contrast, no Mcl-1 inhibitor is currently available in clinic. The inhibition of this anti-apoptotic protein is therefore one of the objectives of the laboratory. Since inhibition of PI3K / Akt / mTOR signaling pathway leads to inhibition of Mcl-1 expression and calcium is able to modulate this pathway, we wondered if the modulation of calcium fluxes allowed the inhibition of Mcl-1 in ovarian cancer cells. First we were able to show that calcium chelation by BAPTA-AM allowed to inhibit Mcl-1 expression via mTORC1 pathway and to sensitize the cells to ABT-737. In a second step, we investigated the effect of an inhibitor of calcium fluxes that is evaluated in clinical studies, carboxyamidotriazole. We show that the inhibition of capacitive calcium channels could lead to Mcl-1 down-expression via inhibition of mTORC1 and promote apoptosis in combination with ABT-737. Finally, we observed that CAI induces a morphological change resulting in cell death. This type of death seems to be related to disruption of metabolism in IGROV1-R10 cancer cells and would be close to a cell death recently described in the literature: autosis

Contrôle de la signalisation oncogénique du mutant L858R de l'EGFR par la protéine suppresseur de tumeur p14ARF dans les adénocarcinomes pulmonaires. Le récepteur à l'EGF (EGFR) est un oncogène puissant impliqué dans le développement des cancers du poumon. Dans ces cancers, la présence de mutations activatrices de l'EGFR (majoritairement L858R et Del19) est un facteur prédictif de réponse aux agents pharmacologiques qui ciblent spécifiquement ce récepteur (EGFR-TKI). Cependant, l'association entre réponse thérapeutique et mutation est plus complexe que prévue, soulignant la nécessité d'approfondir la compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans développement de ces cancers. Nous avons précédemment montré que la quasi-totalité des tumeurs pulmonaires avec des mutations activatrices de l'EGFR présente une expression faible ou indétectable de la protéine suppressive de tumeur p14ARF. Ces résultats nous ont conduites à émettre l'hypothèse que l'expression de p14ARF était un frein essentiel à l'expansion clonale de ces cellules. Nous décrivons pour la première fois une relation fonctionnelle entre p14ARF et du mutant L858R de l'EGFR dans laquelle p14ARF inhibe la croissance de cellules exprimant ce mutant en induisant leur apoptose. Les effets suppresseurs de tumeur de p14ARF impliquent une fonction pro-apoptotique originale de STAT3 qui conduit à l'inhibition de l'expression de la protéine anti-apoptotique Bcl-2. De plus, nous montrons que les cellules EGFR-L858R maintiennent leur avantage de croissance en inhibant l'expression de p14ARF et la signalisation pro-apoptotique STAT3/Bcl-2 qui en découle. Nos résultats identifient également p14ARF comme une nouvelle cible transcriptionnelle de STAT3, mettant ainsi en évidence une boucle de rétrocontrôle positif entre ces deux protéines qui pourrait entretenir la signalisation pro-apoptotique médiée par STAT3. Sur la base de ces résultats, nous suggérons que la réactivation de la voie p14ARF/STAT3/Bcl-2 pourrait être une nouvelle stratégie thérapeutique dans le traitement de ces cancers.

Le carcinome hépatocellulaire est le plus fréquent parmi les tumeurs hépatiques primitives du foie et constitue un des cancers les plus répandus dans le monde ayant un très mauvais pronostique. La chimiothérapie conventionnelle se révèle souvent peu efficace et toxique pour les tissus sains adjacents à la tumeur. Elle consiste en l'administration de molécules anticancéreuses qui induisent l'apoptose des cellules tumorales. Ce travail de thèse concerne l'étude, dans des lignées d'hépatomes humains, des voies de signalisation mises en jeu par ces molécules dans l'induction de l'apoptose, dépendante et indépendante de p53. Pour cela, nous avons étudié à la fois l'effet des molécules anticancéreuses conventionnelles et celui de nouvelles molécules hybrides capables de cibler sélectivement les cellules tumorales. Dans la première partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à la voie de signalisation du suppresseur de tumeur p53 induit par les molécules anticancéreuses. La protéine p53 est extrêmement régulée en réponse à un stress cellulaire. En effet, les modifications post-traductionnelles de p53 constituent un mécanisme majeur de la régulation de son activité. Nous avons mis en évidence l'induction par la DOX et l'octréotide, d'une nouvelle protéine de 40 kDa, issue du clivage post-traductionnel de p53 au niveau de son domaine C-terminal (p40 ΔC). Ce clivage de p53 est induit dans les cellules tumorales et non tumorales et ne dépend ni du statut de p53 ni de la nature des lésions qui endommagent la cellule. Nous avons montré que p40 est localisée dans le noyau et n'est pas issue d'un épissage alternatif de p53. De plus, notre étude a montré que ce clivage protéolytique de p53 est indépendant de l'action des caspasesr des calpaïnes et du protéasome. Dans la deuxième partie, nous avons étudié l'effet apoptotique d'une molécule hybride, l'AN-238, associant une molécule génotoxique, PAN-201, avec un peptide hormonal analogue de la SST, le RC-121, dans des lignées d'hépatomes exprimant ou pas p53. Le concept de ces nouvelles molécules comprenant un peptide cible, est basé sur le fait que les cellules tumorales expriment fortement les récepteurs de la SST, alors que les cellules non tumorales n'en possèdent pas ou très peu. Les résultats que nous avons obtenus montrent la présence des sst2 et ssts dans les lignées d'hépatomes humains. Par ailleurs, nous avons montré que l'AN-238 est capable d'induire efficacement l'apoptose indépendante de p53, après seulement 15 minutes d'incubation de ces molécules avec les cellules. Dans les hépatocytes isolés de rat, l'exposition à l'AN-238 ne provoque pas l'apoptose contrairement aux cellules d'hépatomes. Ces résultats montrent que dans le cancer du foie humain, l'analogue cytotoxique de la SST est un agent puissant capable d'induire par l'intermédiaire des ssts l'apoptose indépendamment de p53. Dans la troisième partie, nous avons étudié les voies de signalisations de l'apoptose indépendante de p53, p73 et Pas, induite par des molécules anticancéreuses conventionnelles dans la lignée d'hépatome Hep3B. Grâce à une technologie antisens et à l'aide d'inhibiteurs spécifiques, Gleevec et rottlérine, nous avons montré que cette apoptose était dépendante de c-Abl et PKC. Ces molécules génotoxiques induisent précocement la translocation mitochondriale de c-Ab1 et PKC ainsi que leur interaction avec la protéine Bcl-XL. Une induction consécutive d'EROs sensible aux inhibiteurs de ces deux kinases a également été mise en évidence
Hepatocellular carcinoma is the most frequent among the primitive hepatic tumours of the liver and constitutes one of the most widespread cancers in the world having very bad prognostic. Conventional chemotherapy appears often not very effective and cause sévère toxicity for adjacent healthy tissues with the tumour. It consists of the administration of anti-cancer molecules which induce the apoptosis of tumoral cells. This work of thesis concern the study. In hepatoma cell lines, of the induction of apoptosis signaling pathway by these molecules witch can be dependent and independent of p53. For that, we studied at the same time the effect of the conventional anti-cancer molecules and that of new hybrid molecules able to target the tumoral cells selectively. In the first part of this work. We were interested in the suppressor of tumour p53 signaling pathway induced by the anti-cancer molecules. The protein p53 is extremely regulated in response to a cellular stress. Indeed, the post-translational modifications of p53 constitute a major mechanism of the regulation of its activity. We observed the induction by the DOX and the octreotide. Of a shorter protein of 40 kPa, resulting from a post-translational cleavage of the p53 C-terminal region (p40 ΔC). This cleavage of p53 is induced in the tumoral and non tumoral cells and depends neither on the statute of p53 nor of the nature of the lesions which damage the cell. We showed that p40 is localised in the nucleus and is not resulting from an alternative splicing of p53. Moreover. Our study showed that this proteolytic cleavage of p53 is independent of the action of the caspases. Of the calpaïnes and the proteasome. In the second part we studied the apoptotic effect of a hybrid molecule, the AN-238. Associating a cytotoxic molecule, the AN-201, with the somatostatin analogue of the SST. The RC-121, in the hepatoma cell lines expressing or not p53. The concept of these new molecules including a target peptide, is based on the fact that the tumoral cells strongly express the receptors of the SST. Whereas the non tumoral cells do not have any or very little. The results which we obtained show the presence of the sst2 and sst5 in the human hepatoma cell lines. In addition, we showed that the AN-238 is able to eftectively induce the apoptosis independent of p53. After only 15 minutes of incubation of these molecules with the cells. In the rat isolated hepatocytes. The exposure to the AN-238 does not cause the apoptosis contrary to the rat hepatoma cell lines. These results show that in the cancer of the human liver, the cytotoxic analogue of the SST is a powerful agent able to induce apoptosis bv the intermediary of the sst;, independently of p53. In the third part, we studied the apoptotic signaling pathways independent of p53. P73 and Pas, induced by conventional anti-cancer molecules in the hepatoma cell line. Hep3B. Using a technology antisens and specific inhibitors. Gleevec and rottlerin. We showed that this apoptosis was dependent on c-Abl and PKC5. These genotoxic molecules induce the translocation of c-Abl and PKC6 to mitochondria and their interaction with the Bel-XL protein. A consecutive induction of ROS witch is sensitive to the inhibitors of these two kinases was also highlighted

Les récepteurs Toll-like (TLR), impliqués dans la reconnaissance de nombreux pathogènes comme les mycobactéries, jouent un rôle important pour la mise en place de l’immunité innée. L’utilisation de souris déficientes en différents TLR (TLR1-6, TLR9) a permis l’étude de ces récepteurs dans des modèles d’infection in vivo à Mycobacterium bovis BCG par voie intraveineuse ou à Mycobacterium tuberculosis par aérosol ou par voie intranasale. Les phénotypes observés, notamment chez les souris déficientes en TLR2 ou TLR4, se sont avérés mineurs en comparaison de celui des souris déficientes en MyD88, protéine adaptrice commune aux TLRs (sauf TLR3), qui meurent rapidement de pneumonie nécrotique sévère après infection par Mycobacterium tuberculosis. Cette déficience de l’immunité innée n’empêche cependant pas la mise en place de l’immunité acquise chez ces souris. MyD88 est un adaptateur commun aux voies de signalisation de l’IL-1R et de l’IL-18R. Afin d’étudier la contribution relative de l’absence des signaux TLRs versus IL-1R et IL-18R dans le défaut de contrôle de l’infection à Mycobacterium tuberculosis observé en l’absence de MyD88, des souris déficientes en TIRAP (protéine indispensable aux signaux via TLR2-TLR1-TLR6 et TLR4), IL-1R1, IL-18R ou caspase-1 (enzyme permettant la production d’IL-1b active) ont été utilisées. Les résultats montrent que le phénotype sévère des souris déficientes en MyD88 serait dû plutôt au défaut de signalisation par le récepteur IL-1R1 et non à l'absence d'IL-1B active ou de signal via les différents TLRs, via TLR2-TLR1-TLR6-TLR4 ou via l'IL-18R.

One major reason of CNS pharmacotherapy's impediment is the existence of "barriers" between blood and CNS, especially the Blood-Brain Barrier (BBB), a neurovascular structure localized at the level of brain microvasculature. Main factors responsible for this barrier function are drug efflux transporters type ABC (ATP-Binding Cassette) and SLC (SoLute Carrier) expressed at BBB level and known to be at the origin of multi-drug resistance phenomenon. Recent researches aim at unraveling the signaling mechanisms regulating these transporters in order to modulate their activity and improve pharmacotherapy in brain diseases. For years, these transporters have been studied in adult organism. But, there is a wide spread belief that the BBB in embryo, fetus, new born and infant is "immature", implying caution in giving drugs to infants. However, current knowledge on the functional status of the BBB in immature organism remains very limited.This study was performed in the aim of understanding: 1) The ontogenesis of ABC and SLC transporters during brain maturation, 2) the functional role of four BBB drug efflux transporters (P-glycoprotein (P-gp), Breast Cancer Resistance Protein (bcrp), Organic Anion Transporter 3 (oat3), and Transporting Peptide 1a4 (oatp1a4) transporters) in children's brain, and 3) the mechanisms that regulate their functional expression under normal and pathological conditions, mostly under inflammatory conditions, because indeed alterations in structural and functional components of the BBB have been reported in a long list of CNS pathologies in adults. Our results showed changing properties of the BBB during ontogenesis, as well as an age-related differential regulation of BBB drug efflux transporters under normal and inflammatory conditions.These findings highlight the importance of considering an age-related response of CNS to drugs and of taking into account the specific properties of juvenile BBB during definition of therapeutic strategies designed to treat childhood brain diseases, and this in the clinical perspective of developing new drugs with enhanced efficacy in children's CNS.

Les polymorphonucléaires neutrophiles (PMNs) représentent une arme primordiale dans la défense contre divers agents pathogènes; notamment les bactéries, les champignons, les cellules tumorales de même que les cellules infectées par des virus. Cependant, certaines pathologies reliées à l’inflammation chronique soulèvent l’implication des neutrophiles notamment dans l’arthrite rhumatoïde. La réponse inflammatoire persistante générée par l’activation et la survie des neutrophiles engendre une destruction des tissus environnants suite à la sécrétion non contrôlée de leurs produits cytotoxiques. Même si l’activation chronique des neutrophiles est néfaste dans plusieurs pathologies, elle pourrait s’avérer un bon outil en cas de neutropénie, comme c’est souvent le cas les patients ayant reçu des traitements de chimiothérapie. Ce projet fait suite aux travaux doctoraux de Lagraoui (1999). Il vise à identifier le(s) facteur(s) du liquide synovial qui augmente la survie des neutrophiles ainsi que le mécanisme d’action impliqué dans ce processus. Similairement au facteur semi-pur isolés par Lagraoui (1999), le milieu conditionné concentré (MCC) augmente la survie des PMNs de 75% (39% ± 9.5 vs 68% ± 2.5, p<0.01). Suivant le séquençage du MCC parallèlement au facteur semi-pur actif, deux protéines ont été identifiées à la fois dans le MCC et dans le facteur semi-pur soient : l’albumine et la fétuine. Notre projet vise donc à comparer les effets de l’albumine et de la fétuine à ceux du GM-CSF dans l’optique d’une thérapie alternative au GM-CSF en tant qu’adjuvant de chimiothérapie. La présence d’albumine, de fétuine ou de GM-CSF chez les PMNs incubés 24 heures avec la Mutamycin® induit une diminution du nombre de cellules en apoptose par rapport à la Mutamycin® (Ctrl : 43% ± 10; A : 74% ± 3; F : (82% ± 6 et GM : 74% ± 7; p<0.01). L’effet de l’albumine dépend de la voie de la kinase PI3 mais également celle la kinase ERK, alors que celle de la fétuine dépend de la kinase PI3. Similairement l’EPO, l’albumine et la fétuine supporte la différentiation des HSCs en précurseurs érythrocytaires de type BFU-E. Dans un modèle murin de chiomioprotection, l’albumine augmente la concentration cellulaire rapport au groupe contrôle des leukocytes de la rate (66 ±8 x106c/ml vs 81 ±16 x106c/ml) et du sang (3.6 ±0.4 x106c/ml vs 5.7 ±2.3 x106c/ml). Donc, in vitro, l’albumine et la fétuine sont comparables au GM-CSF au niveau fonctionalité et mécansimes d’action. Cependant, vu leur manque de spécificité, l’application thérapeutique en tant qu’adjuvant de chiomiothérapie de l’albumine et la fétuine est peu prometteuse. Par contre, les maladies dégénératives et les évènements ischémiques pourraient s’avérer de bonnes cibles thérapeutiques, principalement pour l’albumine.
Circulating polymorphonuclear neutrophils (PMN) possess a short half-life and are constantly renewed by the bone marrow to ensure the first-line of defense. Therefore, homeostasis must be maintained through a well-regulated process of apoptosis. Survival of PMN can be regulated by several cytokines as well as conditioned media (CM). Although PMN are crucial for protection against microorganisms, activated neutrophils can lead to severe tissue damage in diseases characterized by chronic inflammation. Indeed, in rheumatoid arthritis (RA), activated PMN contribute to tissue damage by releasing a number of destructive agents. On the other hand, chronic activation of PMN could prevent opportunistic infections present in immunosuppressed patients. This project addresses the isolation and mechanism of action of synovial liquid components on the survival of neutrophils based on previous work (Lagraoui, 1999). Following tangential flow filtration (MW cut off: 30 and 50 kDa), concentrated CM enhanced the viability (75%) of 24-hour cultured human neutrophils isolated from peripheral blood of healthy volunteers (39% ± 9.5 vs 68% ± 2.5, p<0.01) as seen in Lagraoui (1999) previous work. N-terminal protein sequence analysis of the concentrated CM and fractionated conditioned media from previous work revealed 2 known proteins contained in both analysis: albumin, and fetuin. In view of the importance of neutrophiles in immune defense, we compared the benefits of albumin and fetuin to those of granulocytes macrophages-colony stimulating factor (GM-CSF), a growth factor used as an adjunct to cancer chemotherapy. Albumin and fetuin were tested by the AnnexinV-FITC/7-AAD method and displayed an inhibition of neutrophil apoptosis of two to three folds relative to control value. Moreover, albumin (A : 200μM) and fetuin (F : 200μM) rescue human PMN from mutamycin-induced apoptosis, comparable to GM-CSF (GM : 10ng/ml); (Ctrl : 43% ± 10; A : 74% ± 3; F : (82% ± 6 et GM : 74% ± 7; p<0.01). Albumin also induces cellular signaling pathways activation via PI3-K and ERK, whereas fetuin acts through PI3-K pathway only. They induce the differentiation of HSCs into erythrocytes progenitors BFU-E. In immunosuppressed mice, albumin protects white blood cells depletion induced by cytotoxic agent from spleen and blood. Considering all the benefits of albumin and fetuin, their targeting as an adjunct to cancer chemotherapy could be disappointing in view of their lack of specificity. On the other hand, their multiple benefits could have a major impact on neurodegenerative disorders and ischemic events.