Tesi sul tema "Résistance aux fongicides – Viticulture"

La pourriture grise causée par le champignon phytopathogène Botrytis cinerea, omniprésent et très polyphage, a clairement un impact dans de nombreuses régions en raison de la large gamme d'hôtes y compris la vigne (Vitis vinifera L.), causant de graves dommages dépassant 10 à 100 milliards de dollars dans le monde. Les fongicides chimiques, qui sont la mesure la plus importante pour assurer un rendement adéquat, restent la méthode la plus courante pour lutter contre la pourriture grise. Cependant, malgré la diversité des produits utilisés, des cas de résistance sont détectés. Aussi, la lutte chimique a révélé des effets néfastes sur l'environnement et la santé du consommateur ce qui a remis en cause son application. Pour y remedier, des méthodes de lutte alternatives en l’occurrence l'efficacité des agents de lutte biologique a été étudiée avec un grand succès. Ainsi, l’objectif de notre étude portera sur l'utilisation de bactéries bénéfiques pour lutter contre la pourriture grise de la vigne. La rhizosphère de la vigne est riche en microorganismes qui présentent de fortes aptitudes dans la lutte biologique contre les maladies des plantes. Dans la présente étude, l’isolement de microorganismes bénéfiques a été réalisé sur des plantes de vigne saines. Quarante deux bactéries ont été isolées de différents sols rizosphériques échantillonnés dans les principaux vignobles de la région de Meknès au Maroc (Latitude 33.75989, Longitude -5.43909). Le test d’antagonisme in vitro des différents isolats envers B. cinerea a révélé que parmi l’ensemble des isolats testés les souches S3, S4, S5 et S6 ont montré un résultat positif. Ces isolats inhibent la croissance du B. cinerea. Les quatres souches ont été identifiées par l’étude des caractères biochimiques et l’analyse phylogénétique des séquences du gène de l’ARNr 16S. Les résultats des analyses ont montré que les souches bactériennes retenues ont été apparentées aux espèces, du genre Bacillus, suivantes : S3 : B. velezensis ; S4 : B. velezensis ; et S5 : B. halotollerans. L’isolat S6 a été classé dans le genre Enterobacter et identifié comme étant E. cloacae. Le test d’antagonisme effectuén planta sur des vitroplants de vigne indique que les quatres rhizobactéries réduisent de façon plus ou moins significative, (59 %, 39 %, 55 %, et 17 %, respectivement), les symptômes de la maladie et réduisent les dommages de l’activité photosynthétique (PSII) dus à l’attaque de B. cinerea. Cette étude a permis de révéler que les souches du genre Bacillus et Enterobacter isolées de la rhizosphère de la vigne pourraient être utilisées comme agents de lutte biologique dans la protection de la vigne
The gray mold caused by Botrytis cinerea has a devastating impact on various economically important crops, including grapevine (Vitis vinifera L.), with annual economic losses exceeding10 to 100 billion dollars worldwide. Currently, pesticides remain the main method used to reduce the incidence of this phytopathogenic fungus. However, in addition to emergence of multidrug resistance, chemicals must be increasingly restricted in order to limit their impact on the environment and human health. Thus, in recent years, biological protection is gaining renewed interest. Therefore, the aim of our project is the development of new biotechnologies allowing the grapevine to better resist pathogenic pressures, through the use of beneficial microorganisms. The rhizosphere is a rich source of microorganisms with strong abilities in the biocontrol of plant diseases. In the present study, isolation of plant beneficial microorganisms was carried out on healthy plants. A total of 42 micro-organisms were isolated from different rhizospheric semi-arid soils collected in vineyards of Meknes in Morocco (Latitude 33.75989, Longitude -5.43909). The in vitro antagonism test of the various isolates towards B. cinerea evealed that among all the isolates tested the strains S3, S4, S5 and S6 showed a positive result. These isolates inhibit the growth of B. cinerea. The four strains were identified by the study of biochemical characters and phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences. The results of the analyzes showed that the bacterial strains retained were related to the following species, of the Bacillus genus: S3: B. velezensis; S4: B. velezensis; and S5: B. halotollerans. Isolate S6 was classified in the genus Enterobacter and identified as E. cloacae. The antagonism test carried out in planta on vine vitroplants indicates that the four rhizobacteria reduce significantly (59%, 39%, 55%, and 17%, respectively), the symptoms of the disease and reduce damage to photosynthetic activity (PSII) due to attack by B. cinerea. This study revealed that strains of the genus Bacillus and Enterobacter isolated from the rhizosphere of the vine could be used as biological control agents in the protection of the vine

Apres avoir isole et identifie 284 levures a partir de raisins et de mouts de fronton, margaux, gaillac et cahors, l'auteur en a teste une partie vis-a-vis de sept fongicides et cinq insecticides, par la determination de leur concentratio minimale inhibitrice a l'aide de la methode des dilutions en milieu solide. Le mancozebe, tres utilise contre le mildiou, le black-rot et l'excoriose, s'est montre le plus influant parmi les fongicides testes. Les insecticides, le penconazole et le soufre, par contre, se sont reveles inoffensifs. Differents essais en fermenteur de petite echelle simulant les conditions nologiques, ont confirme l'action inhibitrice du mancozebe sur la fermentation de saccharomyces cerevisiae. Quelques souches de saccharomyces cerevisiae resistantes a ce produit ont ete selectionnees. Leur concentration minimale inhibitrice, apres traitement par le bromure d'ethidium, a diminue sur milieu solide et en fermenteur. Parmi ces mutants homothalliques, quelques-uns ont ete croise avec une souche sauvage haploide par fusion de protoplastes. Les cellules filles obtenues ont perdu leur resistance sur milieu solide. Leur profil de croissance et de metabolisme en fermenteur, etait similaire a celui des parents sauvages. L'information genetique mitochondriale est donc impliquee dans le mecanisme de resistance de saccharomyces cerevisiae vis-a-vis du mancozebe. Mais il semble que celui-ci soit du a une interaction entre genes mitochondriaux et nucleaires

Notre étude vise à déterminer le rôle de la reproduction sexuée d’Uncinula Necator dans l’évolution de la résistance de ce parasite aux fongicides inhibiteurs de la biosynthèse des stérols. Le cycle sexué de ce champignon biotrophe a éte réalisé en conditions contrôlées. Les conditions favorables à cette réalisation nécessitent d’assurer un juste équilibre entre le développement du champignon et la survie prolongée de l’hôte. Pour cela, un support végétal de réceptivité moyenne et des conditions environnementales adaptées sont nécessaires. Des ascospores infectieuses ont été obtenues moins de trois mois après le croisement de deux souches d’oïdium connues. La filiation a été vérifiée par la technique de RAPD et deux marqueurs du type sexuel ont été mis en évidence. L’hétérothallisme bipolaire du champignon a été confirmé. D’autres facteurs que le type sexuel semblent néanmoins influencer la production de cléistothèces matures. Un croisement a été réalisé entre une souche sensible à quatre DMIs et une souche résistante à trois d’entre eux. L’étude de la sensibilité de la descendance permet : - d’affirmer que la résistance d’U. Necator à ces fongicides est de nature polygénique, probablement additive ; - de corroborer que la résistance croisée entre DMIs n’est pas systématique ; - de confirmer que la présence de la mutation ponctuelle Mut-1 sur le gène de la C14-déméthylase confère une résistance au triadiménol ; - d’observer l’apparition ou l’expression d’une nouvelle résistance. L’étude de l’effet d’un DMI, sur la biosynthèse des stérols parentale et filiale a par ailleurs confirmé la présence d’un mécanisme de résistance induisant une surproduction des stérols. Ces résultats et l’observation de l’augmentation de résistance d’une population d'oïdium après deux cycles sexués successifs en laboratoire permettent d’affirmer que la reproduction sexuée joue un rôle important dans l’évolution et la persistance de la résistance au vignoble. L’absence de liaison entre le type sexuel et la résistance aux fongicides étudiés suggère la création à l’infini de nouveaux phénotypes de résistance

Candida lusitaniae, un pathogène opportuniste émergent, est à l'origine d'infections fongiques systémiques dont le traitement est compliqué par le profil de sensibilité inhabituel de cette espèce. En particulier, des cas de résistance à l'amphotéricine B, un phénomène considéré comme exceptionnel chez les levures et encore mal connu, ont été souvent décrits. L'objectif de cette étude est d'analyser le support moléculaire de la résistance à l'amphotéricine B chez C. Lusitaniae. La première partie de notre travail a porté sur la caractérisation et la sélection des souches à analyser. Etant donné qu'il n'existe pas de méthode de référence pour déterminer in vitro la sensibilité des levures à l'amphotéricine B, différents tests ont été utilisés avec un panel de souches de référence et de souches cliniques. Parmi les méthodes classiques, notre étude a mis en évidence la supériorité du E-test®. Elle a permis d'autre part de valider une méthode de test alternative basée sur l'analyse par cytométrie en flux des modifications du potentiel de membrane qui sont précocement induites lorsque l'amphotéricine B se lie à sa cible cellulaire. La confrontation des résultats avec les données obtenues in vivo a permis la sélection de certaines des souches cliniques. Dans un deuxième temps, l'analyse de la composition en stérols cellulaires de ces souches a permis de mettre en évidence le lien qui existe entre la résistance à l'amphotéricine B et un taux d'ergostérol minimum. La composition en stérols des souches résistantes est compatible avec une déficience de la delta 8-7 isomérase. Aucune modification de la composition en acides gras n'a été mise en évidence. La structure de la paroi, zone par laquelle les levures régulent leur interface avec le milieu, a été étudiée par microscopie électronique en transmission. La distribution des polysaccharides pariétaux des souches résistantes ne présente pas de modification particulière.

La sélection naturelle constitue un processus clé de l'adaptation des populations à leur environnement, favorisant les variants présentant les meilleures valeurs sélectives. Les champignons présentent généralement des traits biologiques (diversité des modes de reproduction, grandes tailles de populations, fortes capacités de dispersion, entre autres) qui favorisent leur adaptation à des environnements variés. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l'évolution de leurs populations sous les contraintes, naturelles et anthropiques, qu'elles subissent constituent donc un enjeu majeur pour la protection des plantes, en particulier dans le contexte actuel de durabilité des méthodes de lutte. Dans cette thèse, nous avons décrit la structure et la diversité des populations Botrytis cinerea à l'aide de marqueurs neutres et sélectionnés et d'un échantillonnage emboîté, et avons proposé des mécanismes pouvant expliquer les résultats observés. Puis nous avons analysé la réponse adaptative des populations de B. cinerea en Champagne, aux applications de fongicides. Premièrement, nous avons montré que la pourriture grise était causée par un complexe de deux espèces cryptiques, vivant en sympatrie sur des hôtes communs. De plus, les populations françaises de B. cinerea sont structurées en cinq dèmes, caractérisés par le système de culture (sélection directionnelle), la plante-hôte (adaptation écologique), et dans une moindre mesure, par la géographie. Sur vigne, nous avons mis en évidence une entité dont l'isolement génétique semble lié à un isolement temporel. Par ailleurs, nous avons montré que l'application de fongicides conduit à la sélection de phénotypes résistants spécifiquement à quasiment tous les modes d'action homologués, selon des proportions variant suivant les vignobles et les usages. Plus particulièrement, la résistance aux fongicides inhibiteurs de la succinate déshydrogénase (SDHI) est causée par au moins sept mutations affectant les gènes encodant la protéine cible de ces fongicides, déterminant ainsi une grande variété de phénotypes. Enfin, nous avons montré que les fongicides ne modifiaient pas la structure neutre des populations mais qu'ils pouvaient conduire à une perte de richesse allélique dans les populations traitées ainsi qu'à un équilibre sélection-migration détectable dans certaines situations sous forme de clines au loci sous pression de sélection contemporaine tels que ceux déterminant la résistance multidrogues. La modélisation de l'évolution des fréquences de résistance hivernale a permis d'estimer le coût de la résistance pour quatre loci déterminant la résistance aux fongicides. Cette thèse a permis d'appréhender le fonctionnement des populations de B. cinerea et de comprendre et quantifier partiellement les mécanismes sélectifs opérant in natura. Ces informations seront utilisées pour raisonner des stratégies anti-résistance adaptées localement et durables.

Chez Fusarium solani f. Sp. Pisi, après irradiation de spores sensibles par des rayons U. V, il a été possible de sélectionner des mutants résistants au tébuconazole : un inhibiteur de la C-14 déméthylation des stérols. Quatre gènes : teb1, teb2, teb3 et teb4 ont été identifiés ; les trois premiers confèrent une résistance à tous les inhibiteurs de le C-14 déméthylation des stérols alors que le dernier détermine une hypersensibilité à certains d’entre eux comme le fénarimol ou le penconazole. Les mutants ayant le gène teb1 et teb4 présentent une agressivité proche de celle de la souche sauvage, alors que cette dernière s’est avérée plus agressive que le mutant comportant le gène teb3. La souche sauvage est plus compétitive que le mutant ayant le gène teb1 ; l'inverse est observé avec le mutant comportant le gène teb4. La composition stérolique des souches sauvages et des différents mutants s'est révélée similaire ; l'ergostérol étant majoritaire. Dans tous les cas, le traitement avec le tébuconazole entraîne une accumulation de stérols méthylés en C-14 (éburicol et obtusifoliol). La souche sauvage et le mutant comportant le gène teb4 absorbent plus de 14C fénarimol, de 14C flusilazol et de 14C penconazole que celui renfermant le gène teb1 ; les mutants ayant les gènes teb2 ou teb3 présentent un comportement intermédiaire. Chez toutes les souches, l'adjonction d'inhibiteurs de la production d'énergie cellulaire entraîne une forte rétention mycélienne de ces fongicides impliquant l'existence d'une excrétion active des inhibiteurs de la C-14 déméthylation des stérols. Cette propriété peut expliquer l'effet synergique parfois observé entre ces deux types d'inhibiteurs ; toutefois cette propriété n'est pas toujours observée (il peut même y avoir antagonisme).

La sélection naturelle constitue un processus clé de l’adaptation des populations à leur environnement, favorisant les variants présentant les meilleures valeurs sélectives. Les champignons présentent généralement des traits biologiques (diversité des modes de reproduction, grandes tailles de populations, fortes capacités de dispersion, entre autres) qui favorisent leur adaptation à des environnements variés. La compréhension des mécanismes qui sous-tendent l’évolution de leurs populations sous les contraintes, naturelles et anthropiques, qu’elles subissent constituent donc un enjeu majeur pour la protection des plantes, en particulier dans le contexte actuel de durabilité des méthodes de lutte. Dans cette thèse, nous avons décrit la structure et la diversité des populations Botrytis cinerea à l’aide de marqueurs neutres et sélectionnés et d’un échantillonnage emboîté, et avons proposé des mécanismes pouvant expliquer les résultats observés. Puis nous avons analysé la réponse adaptative des populations de B. cinerea en Champagne, aux applications de fongicides. Premièrement, nous avons montré que la pourriture grise était causée par un complexe de deux espèces cryptiques, vivant en sympatrie sur des hôtes communs. De plus, les populations françaises de B. cinerea sont structurées en cinq dèmes, caractérisés par le système de culture (sélection directionnelle), la plante-hôte (adaptation écologique), et dans une moindre mesure, par la géographie. Sur vigne, nous avons mis en évidence une entité dont l’isolement génétique semble lié à un isolement temporel. Par ailleurs, nous avons montré que l’application de fongicides conduit à la sélection de phénotypes résistants spécifiquement à quasiment tous les modes d’action homologués, selon des proportions variant suivant les vignobles et les usages. Plus particulièrement, la résistance aux fongicides inhibiteurs de la succinate déshydrogénase (SDHI) est causée par au moins sept mutations affectant les gènes encodant la protéine cible de ces fongicides, déterminant ainsi une grande variété de phénotypes. Enfin, nous avons montré que les fongicides ne modifiaient pas la structure neutre des populations mais qu’ils pouvaient conduire à une perte de richesse allélique dans les populations traitées ainsi qu’à un équilibre sélection-migration détectable dans certaines situations sous forme de clines au loci sous pression de sélection contemporaine tels que ceux déterminant la résistance multidrogues. La modélisation de l’évolution des fréquences de résistance hivernale a permis d’estimer le coût de la résistance pour quatre loci déterminant la résistance aux fongicides. Cette thèse a permis d’appréhender le fonctionnement des populations de B. cinerea et de comprendre et quantifier partiellement les mécanismes sélectifs opérant in natura. Ces informations seront utilisées pour raisonner des stratégies anti-résistance adaptées localement et durables
Natural selection is the most powerful force driving population adaptation to their environment, favoring the variants with the best fitness. Fungi generally exhibit biological traits (diversity of reproduction modes, large population sizes, and intense dispersion) that favor their adaptation to changing environments. Therefore, disentangling the mechanisms that explain their evolution under natural and anthropic constraints constitute a major challenge for plant protection, especially in the actual context of agriculture sustainability. In this thesis, we described Botrytis cinerea population structure and diversity, using neutral and selected markers and a hierarchical sampling, and proposed mechanisms that may explain these observations. We then analyzed the adaptive answer of this species towards fungicide applications. First, we showed that grey mold populations were caused by a complex of two cryptic species, living sympatrically on the same hosts. Second, B. cinerea populations are divided into five demes, according to the cropping system (directional selection), the host-plant (ecological adaptation), and to a lesser extent, by geography. On grapevine, we identified a specific populations exhibiting temporal isolation, as an evidence of extreme exploration of the viticultural conditions. Moreover, fungicide applications select resistance towards all unisite modes of action, with few exceptions, but at varying proportions according to vineyards and fungicide use. More specifically, resistance to succinate dehydrogenase inhibitors (SDHIs) is caused by at least seven mutations altering the target genes of these fungicides, and determines a large variety of phenotypes in the field. At last, we showed that fungicides did not shape population structure but that they could decrease allele richness in treated areas and lead to migration-selection equilibrium, detectable in some situation and for loci under contemporary selective pressures as clines. Modeling the evolution of resistance during winter allowed estimating fitness cost of four loci involved in contemporary fungicide resistance, such as multidrug resistance. As a conclusion, this thesis helped to understand how B. cinerea populations evolve and to detect and quantify selective mechanisms at work in natura. This information will be useful to deign sustainable and locally-adapted anti-resistance strategies

L'émergence et le traitement des candidoses ont généré des problèmes de résistance aux antifongiques, thématique sur laquelle nous travaillons chez Candida lusitaniae. Cette levure pathogène opportuniste est en effet connue pour développer facilement des résistances aux antifongiques, et présente l'avantage d'être haploi͏̈de et de posséder un cycle sexuel. Avant d'en faire notre modèle d'étude il était nécessaire de développer des outils génétiques et moléculaires chez cette levure. La caractérisation du cycle sexuel de C. Lusitaniae chez 76 isolats d'une collection clinique, nous a permis d'en maîtriser les conditions d'obtention in vitro, de mettre au point une méthode d'isolement des ascospores pour réaliser des analyses génétiques, et de proposer un test d'identification alternatif de cette espèce, fondé sur sa capacité à se reproduire sexuellement. Par une technique d'amplification alliée à une marche chromosomique, nous avons ensuite cloné et séquencé le gène URA3 de C. Lusitaniae, codant pour l'orotidine 5'-phosphate decarboxylase, afin de l'utiliser comme marqueur génétique dans un système de transformation propre à cette espèce. Des mutants ura3 de C. Lusitaniae ont été transformés par électroporation avec des efficacités comparables à celles observées chez C. Albicans. Enfin, nous avons mis en évidence et caractérisé un phénotype original de résistance croisée vis-à-vis de l'association 5-fluorocytosine (5FC) / fluconazole (FCZ), chez des isolats cliniques de C. Lusitaniae 5FC-résistants et FCZ-sensibles. D'après les analyses génétiques, ce phénotype serait contrôlé par le seul gène de résistance à la 5FC. Les analyses cinétiques de transport de [14C]5FC ont montré un défaut d'entrée de la 5FC, liée à une déficience de la cytosine perméase, protéine codée par le gène FCY2. La résistance croisée pourrait alors s'expliquer par une inhibition compétitive du transport de FCZ par la 5FC. Cette hypothèse suppose l'existence d'un transport d'entrée de FCZ, ce qui n'a jamais été évoqué jusqu'à présent, et apporte des informations sur une nouvelle voie possible de résistance au FCZ par l'inhibition de son transport d'entrée chez les levures du genre Candida
The increase of candidiasis in immunodefficient patients generates antifungal resistance problems among Candida species. We worked in this field with C. Lusitaniae, an opportunistic and pathogenic yeast known as easily developing resistance, and furthermore an avantageous haploid organism with a sexual cycle. Before its use as a model, the development of genetic and molecular tools was necessary. We first have determined the environmental conditions to trigger and complete the sexual cycle of all isolates in a collection of 76 clinical specimens. This led us to develop a method for isolating ascospores in order to perform genetic analysis and to propose an alternative identification test relying upon sexual reproductive ability. Using an amplification strategy combined to a chromosome walking, we have then cloned and sequenced the C. Lusitaniae URA3 gene, encoding orotidine 5'-phosphate decarboxylase, to use it as a selectable marker in a specific tranformation system. C. Lusitaniae ura3 mutants were succesfully electrotransformed with an efficiency comparable to that observed in C. Albicans. Finally, in the course of the study of C. Lusitaniae clinical isolates 5-fluorocytosine (5FC)-resistant and fluconazole (FCZ)-susceptible, we provided evidence and characterized an original cross-resistance phenotype appearing when 5FC / FCZ were used in association. According to genetic analysis, only the 5FC resistant gene would control this phenotype. Kinetic transport studies with [14C]5FC showed a defect of 5FC uptake related to a deficiency of the purine-cytosine permease, encoded by the FCY2 gene. Cross resistance could be the result of a competitive inhibition of FCZ uptake transport by extracellular 5FC. This hypothesis supports the occurrence of a FCZ uptake transporter, which has never been suggested thus far, and provides information on a new possible mechanism of resistance to FCZ, associated to an uptake deficiency of this drug, which can affect all species of the Candida genus

En vue de selectionner des clones resistants a l'eutypiose a partir d'un cultivar tres sensible (cabernet-sauvignon), on met au point des essais biologiques permettant de tester rapidement l'activite toxique de composes purifies ou d'extraits. Eutypa lata produit une famille de composes acetyleniques (vinylacetylene aromatique) parmi lesquels l'hydroxy-4-methyl-3-benzaldehyde est le plus toxique. Elle modifie la permeabilite membranaire des cellules de vigne et l'activite respiratoire des varietes resistantes et sensibles

Afin de définir le rôle de la paroi et en particulier la chitine dans la résistance des levures à l'Amphotéricine E, plusieurs espèces et souches sont utilisées pour cette étude : Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Candida et Kluyveromyces. Bien que ces levures ne soient pas des agents pathogènes (à l'exception de la souche Candida albicans), elles ont la caractéristique d'avoir des différences de résistance ainsi que des taux de chitine différents. Les sphéroplastes des souches étudiées ont montré une sensibilité élevée à l'AmE. En effet, les levures débarrassées de leur paroi sont 3 à 6 fois plus sensibles à l'AmE que les cellules intactes, et dans ces conditions les différences de sensibilité à l'AmE entre les souches sont moins prononcées. De plus, l'extraction et le dosage des stérols des levures ne montrent aucune relation directe entre la quantité de ces stérols et en particulier de l'ergostérol et la résistance de ces levures à l'AmE. Ceci montre que la membrane n'est pas la seule structure cellulaire impliquée dans le mécanisme d'action de l'AmE. Il existe donc un rôle de la paroi dans l'action de l'AmE sur les levures. Dans le but de perturber la structure pariétale et de cibler ainsi le composé intervenant dans la rés'istance des levures à l'antifongique, les levures ont été traitées par différentes enzymes. Or, après incubation des cellules avec les protéases, phosphatases et les glucanases ces dernières deviennent plus sensibles à cet antifongique. Par contre, le traitement des levures par la chitinase rend les levures plus résistantes à cet antifongique. L'analyse quantitative des constituants de la paroi montre qu'à l'exception de la chitine qui varie, les teneurs des autres constituants ne montrent aucune relation entre leurs variations quantitatives et la résistance (et sensibilité) des levures à l'AmE. Par contre, les parois des deux levures qui ont acquis une résistance à l'AmE sont toutes les deux plus riches en chitine que leurs cellules mères respectives, alors que l'augmentation de la résistance , intrinsèque des autres souches de levures s'accompagne d'une diminution du taux de chitine. Les activités chitine synthétases, CSI, CSII et CSIII montrent que les trois chitine synthétases sont présentes tant chez les mutants que chez les souches mères et que la souche Kb présente une activité enzymatique plus élevée que la souche Kbm. Ce qui rejette l 'hypothèse de l'augmentation des taux de chitine dans les parois des mutants en conséquence à une activation des chitine synthétases. Comme la chitinase peut aussi agir sur les taux de chitine pariétale, nous avons vérifié l'expression de cette enzyme chez les différentes souches. Cette enzyme est détectée à des taux très faibles chez les souches qui ont acquis une résistance à l'AmE par comparaison à l'activite des souches mères respectives. Ainsi l'augmentation du taux de chitine dans les parois cellulaires des mutants semble résulter d'une répression ou diminution d'activités de la chitinase et la chitine pariétale est un élément à retenir pour expliquer les mécanismes d'action de l 'AmE pour chaque type de levures.

La septoriose causée par le champignon Zymoseptoria tritici est une maladie majeure du blé et provoque des pertes de rendement pouvant atteindre 50 %. Le contrôle de ce pathogène repose en partie sur la lutte variétale et agronomique, mais aussi et principalement sur la lutte chimique. La durabilité des fongicides est cependant menacée par l’émergence de mutants résistants, i.e. présentant une moindre sensibilité à une ou plusieurs substances actives. Lorsque le niveau de résistance et/ou la fréquence de ces individus sont élevés dans la population, la protection chimique peut être mise en échec. Alors, les doses et/ou le nombre d’applications peuvent être amenés à augmenter pour maintenir un même seuil de protection. La gestion des résistances apparaît ainsi nécessaire à la réduction de l’utilisation des pesticides, s’inscrivant dans la vision d’une agriculture plus durable et moins dépendante des intrants chimiques.Le réseau Performance (Arvalis-INRA), créé en 2004, a pour rôle de faire des recommandations régionales et annuelles sur l’utilisation des fongicides anti-septoriose. En 2017, il recueillait des informations de 1007 essais blé répartis dans les différents bassins céréaliers français. Ces essais portaient sur l’efficacité de traitements fongicides et leur capacité à gérer les résistances. Dans cette thèse, nous avons décidé d’analyser ces données dans leur globalité, en abordant la question des déterminants de l’évolution des résistances à l’échelle de la région et de la parcelle. Pour y parvenir, nous avons développé des modèles statistiques permettant de quantifier l’effet de différents facteurs sur les fréquences de résistance observées dans les parcelles traitées et non traitées du réseau.Dans un premier temps, nous avons mis en évidence et quantifié l’hétérogénéité de la sélection des résistances à 3 modes d’action fongicides, à l’échelle régionale. L’estimation de taux de croissance a montré que les différentes résistances évoluaient à des vitesses significativement différentes, avec des vitesses bien supérieures pour la résistance aux strobilurines. Nous avons montré que la résistance pouvait évoluer de manière inégale au sein d’un territoire et segmenter l’espace selon la nature et la fréquence des résistances, opposant généralement le Nord et du Sud de la France. Ensuite, nous avons expliqué ces hétérogénéités par (i) l’utilisation régionale des fongicides (i.e. pression de sélection), (ii) la proportion en surfaces non traitées (i.e. refuges) et (iii) les pertes de rendement liées à la septoriose (i.e. taille de population du pathogène). Nous avons montré que l’utilisation des fongicides avait un poids prépondérant dans la variabilité observée (jusqu’à 87 %). Enfin, nous avons étudié, à l’échelle de la parcelle, l’effet du mélange et de la réduction de la dose de fongicide sur la sélection, qui sont des stratégies de lutte anti-résistance couramment utilisées par les agriculteurs. Nous avons montré que la sélection est ralentie par la diversité des fongicides utilisés (diversité intra- et inter- mode d’action). De plus, comme précédemment à l’échelle régionale, nous avons estimé la manière dont la quantité de fongicide appliquée sur une parcelle module la sélection des différentes résistances.En conclusion, ces travaux ont permis de décrire, quantifier et produire un cadre de référence pour étudier l’évolution des résistances à grande échelle, mais également de comparer la durabilité de deux stratégies majeures d’utilisation des fongicides à l’échelle de la parcelle. Ces analyses ont été réalisées sur des échelles spatiales et temporelles inédites dans la littérature scientifique grâce à la richesse des jeux de données étudiés. Les méthodes développées ne sont pas spécifiques à l’étude de Z. tritici et les résultats obtenus pourront servir d’appui à l’amélioration de la prédiction de l’évolution des résistances, indispensable pour contribuer au changement des pratiques de lutte chimique en agriculture
Septoria leaf blotch is a major wheat disease caused by the pathogenic fungus Zymoseptoria tritici. It can induce yield losses up to 50%. The control of this pathogen relies on cultivar resistance, cultural control but mostly on the use of fungicides. However, the sustainability of chemical control is threatened by the emergence of resistant mutants, i.e. individuals with decreased sensitivity to one or several active ingredients. When resistance factors and/or resistance frequencies are high in populations, chemical control efficacy can be jeopardized. Therefore, the dose and/or the number of sprays may have to be increased in order to ensure the same level of crop protection. Resistance management thus appears crucial to reduce pesticide use, in line with the vision of a more sustainable agriculture that is less dependent on chemical inputs.The Performance network (Arvalis-INRA) has been created in 2004 to provide regional and annual recommendations for the use of anti-septoria fungicides. In 2017, it gathered information from 1007 wheat trials, distributed in the various French cereal basins. These trials were designed to determine the efficacy of different spray programs and their ability to manage resistance. In this thesis, we decided to analyze the Performance dataset as a whole, to understand the determinants of resistance evolution at the regional and field scales. To achieve this, we developed statistical models to quantify the effect of several factors on the observed resistance frequencies from both treated and untreated plots.First, we highlighted and quantified the heterogeneity of resistance selection towards 3 modes of action at the regional scale. Growth rates estimates showed that the different resistances evolved at significantly different rates, with much higher rates for the resistance to strobilurins. We detected contrasted resistance evolutions within the French regions, with a clear disparity between the North and the South of France. Then, we explained these heterogeneities using (i) the regional use of fungicides (i.e. selection pressure), (ii) the proportion of untreated surfaces (i.e. refuges), (iii) yield losses related to septoria leaf blotch (i.e. population size of the pathogen). We showed that fungicide use was a major factor in the observed variability (up to 87 %). Finally, we studied at the field scale the effect of fungicide mixture and dose reduction on selection, which are common anti-resistance strategies used by farmers. We showed that selection is slowed down by the diversity of fungicides used (intra- and inter-mode of action diversity). In addition, as previously at the regional scale, we estimated how the amount of fungicide applied to a plot modulates the selection of different resistances.To conclude, we described, quantified and produced a reference framework to study of large-scale resistance evolution. In addition, we also compared the sustainability of two major anti-resistance strategies at the field scale. These analyses were carried out on spatial and temporal scales unprecedented in the scientific literature. The methods developed are not specific to Z. tritici and our results can be used to improve the prediction of resistance, which is essential to change chemical control practices in agriculture

L'incidence des candidoses invasives a considérablement augmenté au cours des dernières décennies, parallèlement à l'augmentation du nombre de patients à risque. Ces pathologies sont associées à une morbi-mortalité élevée. Ce pronostic peut toutefois être amélioré par l'instauration d'un traitement antifongique précoce. Quatre classes de molécules antifongiques sont aujourd’hui disponibles pour la prévention et le traitement des candidoses invasives : échinocandines, antifongiques azolés, polyènes et pyrimidines. Du fait d’une efficacité importante et d’une meilleure tolérance, les échinocandines et les antifongiques azolés sont les plus largement utilisés. L'utilisation massive de ces molécules a conduit à une modification de l'épidémiologie des candidoses invasives, avec l'émergence d'espèces non-albicans intrinsèquement moins sensibles à ces antifongiques, à l'exemple de C. glabrata ou C. parapsilosis. De plus, des souches résistantes voire multi-résistantes aux échinocandines et aux antifongiques azolés sont de plus en plus fréquemment isolées, et associées à des échecs thérapeutiques. L'activité de ces antifongiques est également limitée par le phénomène de tolérance, résultant de la capacité d'adaptation des levures aux stress membranaires et pariétaux induits par ces molécules.Pour toutes ces raisons, l'identification et le développement de nouvelles stratégies antifongiques sont nécessaires. Ce travail de thèse s'inscrit dans cette optique, avec pour objectifs l'étude de la tolérance et de la résistance aux antifongiques chez Candida spp. et la caractérisation de nouvelles cibles thérapeutiques impliquées dans ces processus.La première partie de ce travail a permis de démontrer l'intérêt du séquençage nouvelle génération et d'une approche multigénique pour l'étude des mécanismes impliqués dans la résistance aux antifongiques azolés et aux échinocandines chez Candida spp. Par ce biais, il a été possible d'appréhender de nouveaux mécanismes potentiellement impliqués dans la résistance aux antifongiques, qui nécessitent toutefois d'être confirmés.Dans un deuxième temps, ce travail a permis de mettre en évidence que l'ensemble des protéines de la voie de signalisation du pH ou voie Rim chez les levures est impliqué dans la tolérance aux antifongiques chez C. albicans, l'espèce la plus fréquemment isolée en pathologie humaine. De plus, de nouveaux gènes Rim-dépendants ont été identifiés par RNA-sequencing, à l'exemple de HSP90, codant pour une protéine chaperone responsable de la régulation de multiples processus biologiques, et IPT1, responsable de la biosynthèse du principal sphingolipide membranaire. Ces deux gènes ont précédemment été impliqués dans la tolérance aux antifongiques azolés et aux échinocandines chez C. albicans et pourraient participer à la tolérance aux antifongiques médiée par la voie Rim. Ces résultats ouvrent des perspectives intéressantes : en effet, en ciblant la voie Rim, il pourrait être possible de potentialiser l'activité des molécules antifongiques actuellement commercialisées et de cibler indirectement Hsp90 tout en s'affranchissant des problèmes de toxicité car cette voie de signalisation est spécifique du règne fongique.Enfin, une dernière partie de ce travail réalisée dans le cadre du partenariat de l'ANR FungiBET a permis de montrer que la protéine BET (Bromodomain and Extra-Terminal) Bdf1 de C. glabrata, impliquée dans la régulation épigénétique de la transcription, est essentielle à la croissance in vitro. Plus précisément, l'intégrité des deux bromodomaines BD1 et BD2 de Bdf1, responsables de la liaison de cette protéine aux histones, est essentielle chez cette espèce, qui est la deuxième la plus fréquemment isolée dans les candidoses invasives en Europe et aux Etats-Unis. Ce résultat confirme les premières données obtenues chez C. albicans, et l'intérêt de l'inhibition des protéines BET fongiques comme nouvelle stratégie antifongique
The incidence of invasive candidiasis (IC) has dramatically increased over the past decades, partly due to the increasing number of at-risk patients. IC is associated with high mortality rates: however, its prognosis can be improved by early treatment. Four antifungal classes are available today for the prevention and treatment of IC: echinocandins, azoles, polyenes and pyrimidines. Due to their high efficacy and interesting safety profile, echinocandins and azoles are more commonly used. Massive use of these compounds has led to epidemiological changes in IC, with the emergence of non-albicans species which are intrinsically less susceptible to these antifungals, such as C. glabrata or C. parapsilosis. In addition, Candida spp. strains resistant, or even multiresistant, to azoles and echinocandins are increasingly isolated and associated with therapeutic failures. Antifungal activity is also limited by tolerance, a reversible phenomenon resulting from the yeast's adaptation to membrane and cell wall stresses caused by these molecules.For these reasons, identification and development of new antifungal strategies are needed. This work aimed at studying antifungal resistance and tolerance in Candida spp. and characterizing new therapeutic targets involved in these process.First, this work showed the interest of next-generation sequencing and multigene approaches to study mechanisms involved in resistance to echinocandins and azoles antifungals in Candida spp. It notably allowed to identify new mechanisms involved in antifungal resistance, which still need to be confirmed.In a second part, this work allowed to show that all the proteins of the pH-signaling pathway, known as the Rim pathway in yeasts, are involved in antifungal tolerance in C. albicans, the most frequent species responsible for IC in humans. In addition, new Rim-dependent genes were identified through RNA-sequencing, such as HSP90, coding for a major chaperone involved in the regulation of multiple cellular process, as well as IPT1, responsible for the synthesis of the main membrane sphingolipid.Both genes were previously shown to be involved in azoles and echinocandins tolerance in C. albicans, and could therefore play a role in antifungal tolerance mediated by the Rim pathway. These results offer great perspectives. Indeed, targeting the Rim pathway would allow to enhance the activity of commercially available antifungals and to indirectly target Hsp90, with no or limited toxicity as this signaling pathway is fungal-specific.Thirdly, a last part of this work performed in the context of the ANR FungiBET consortium, allowed to show that the BET protein Bdf1 in C. glabrata, which is involved in epigenetic regulation of transcription, is required for in vitro growth. More precisely, the integrity of both BD1 and BD2 Bdf1 bromodomains are essential in this species, which ranks second among causes of IC. This result confirms the first data obtained in C. albicans and the interest of inhibiting fungal BET proteins as a new antifungal strategy

Les études menées au cours de ces travaux de recherche portent sur la mise au point de nouvelles méthodes de modification chimique du matériau bois basées sur l'utilisation de produits fortement hydrophobes tels que des composés à chaînes grasses ou perfluorées dans le but d'augmenter sa stabilité dimensionnelle ainsi que sa résistance aux microorganismes. La première partie concerne la modification chimique du bois à l'aide d'anhydrides impliquant soit des anhydrides symétriques perfluorés, soit des anhydrides mixtes obtenus à partir d'acides gras et d'anhydride trifluoroacétique. Après avoir vérifié la faisabilité de la réaction sur de la sciure, la transposition des différents traitements au cas d'éprouvettes de hêtre a permis de mettre en évidence dans le cas des spécimens traités une augmentation de la stabilité dimensionnelle, une augmentation du caractère hydrophobe de la surface ainsi qu'une augmentation de la résistance à Coriolus versicolor, particulièrement dans le cas de l'utilisation d'acides gras. La deuxième partie concerne le greffage d'alcools hydrophobes (alcools gras ou perfluorés) sur le bois en utilisant un diisocyanate comme maillon d'ancrage. Plusieurs stratégies ont été envisagées utilisant soit des mélanges alcool/diisocyanate, soit des monoadduits alcool-diisocyanate ou encore des adduits bloqués alcool-diisocyanate-oxime de butanone. Dans tous les cas les traitements conduisent à une hydrophobation de la surface, à une augmentation de la stabilité dimensionnelle et à une augmentation de la résistance aux microorganismes. Des études par microscopie électronique à transmission ont permis de localiser le greffage qui se situe principalement à la surface de la paroi secondaire et dans le lumen constituant une barrière hydrophobe à l'humidité et aux microorganismes.

Alternaria brassicicola est responsable du blackspot des crucifères, une maladie transmissible par les semences qui entraîne des pertes importantes de rendement. Des isolats de terrain de ce champignon hautement résistants aux fongicides dicarboximides et phenylpyrroles ont été identifiés. Ces isolats résistants restent néanmoins pathogènes mais la plupart sont plus sensibles aux chocs osmotiques que des souches sauvages. Pour élucider les bases moléculaires de la résistance et de l’ osmosensibilité, un gène AbNIK1 codant une histidine kinase osmosenseur a été isolé à partir d’un isolat sauvage et sa séquence comparée avec des séquences correspondantes isolées de souches résistantes. Toutes les souches résistantes et osmosensibles correspondent à des mutants nuls pour le gène AbNIK1. Afin d'analyser les effets des mutations nulles dans le gène AbNIK1 sur la fitness du pathogène, les souches présentant un tel génotype ont été inoculées sur radis en conditions naturelles. Les analyses sanitaires des semences produites indiquent que les mutants nuls sont fortement affectés dans leur compétitivité avec les souches sauvages en absence de pression de sélection. En parallèle, la diversité génétique au sein de l’espèce A. Brassicicola a été étudiée. Douze loci microsatellites polymorphes ont été identifiés et analysés au sein d’une population d’origine géographique variée. En accord avec la biologie de ce champignon, absence de reproduction sexuée et transmission via les semences, un polymorphisme assez faible (3,5 allèles par locus) et une absence de structuration de la population étudiée ont été observés
Alternaria brassicicola causes blackspot disease of crucifers worldwide. This disease is seed-borne and responsible for important yield losses. Field isolates of A. Brassicicola highly resistant to dicarboximide and phenylpyrroles fungicides have been identified. These isolates are still pathogenic to host plants and most of them are more sensitive to osmotic stress than wild type strains. To elucidate the molecular basis of the osmosensitive and dicarboximide/phenylpyrrole-resistant phenotypes, an osmosensing histidine kinase gene AbNIK1 was isolated from a fungicide-sensitive isolate and its sequence compared with corresponding sequences from fungicide-resistant isolates. All the fungicide-resistant strains displaying a osmosensitive phenotype were found to have null mutations in the AbNIK1 gene. To investigate the effects of AbNIK1 null mutations on their fitness, these strains were inoculated on radish under field conditions. Quality controls of produced seeds revealed that null mutants are strongly affected in their competitivity towards wild type strains in the absence of selective pressure. In parallel, the genetic diversity within the species A. Brassicicola was estimated. Twelve polymorphic microsatellite loci were identified and used to analyze a population of strains with various geographic origins. In agreement with the lifestyle of this fungus (absence of sexual reproduction and seed transmission) a relatively weak polymorphism (3. 5 alleles per locus) and an absence of population structuration were observed

La lutte chimique est la principale méthode utilisée pour contrôler les maladies causées par les champignons phytopathogènes. Dans certains cas, desphénomènes de résistance envers les fongicides se développent au sein despopulations, altérant parfois l’efficacité des molécules. La compréhension du moded’action des fongicides et des mécanismes de résistance sous-jacents participe à élaboreret à adapter des stratégies de management anti résistance ; et ainsi permettre depérenniser la durée de vie des molécules. Le fenhexamid est un fongicide récent (BayerCropScience, 2000), avec un mode d’action unique. Il est le seul fongicide commercialisébloquant l’étape de C4-déméthylation de la biosynthèse de l’ergostérol. Plusieurs typesde résistance (naturelle et acquises) ont été détectées dans les vignobles européens chez lecomplexe d’espèces Botrytis spp. responsable de la pourriture grise de la vigne. Lestravaux développés durant la thèse s’inscrivent dans l’objectif de la caractérisation dumode d’action et de l’élucidation des mécanismes de résistance. Le premier axe s’estattaché à la caractérisation fonctionnelle de deux gènes impliqués dans la C-4déméthylation de la biosynthèse de l’ergostérol : le gène erg27 codant la 3-céto réductase,cible du fenhexamid, et le gène erg28 codant une protéine qui interagirait en partie avecla 3-céto réductase. Concernant la résistance au fenhexamid, il a été démontré que, pargénétique inverse, les mutations détectées dans le gène erg27 de différents types d'isolatsrésistants issus du vignoble (phénotypes de résistance HydR3- et HydR3+) conféraient larésistance. Par ailleurs, une analyse de fitness du phénotype le plus préoccupant(phénotype HydR3+) a été réalisée en conditions contrôlées sur des souches isogéniquesartificielles afin d’apporter une réponse sur la persistance possible de ces souches auvignoble. Une méthode fine de quantification moléculaire de ces mêmes isolats aégalement été mise au point pour faciliter le suivi de leur évolution et de la persistancedes populations naturelles à l’échelle des vignobles. Cette nouvelle méthode, nomméeASPPAA PCR, exploite le polymorphisme nucléotidique du gène erg27, à l’origine de larésistance. Enfin, la résistance naturelle au fenhexamid de l’espèce apparentée à Botrytiscinerea, appelée Botrytis pseudocinerea a été élucidée. La résistance au fongicide de cetteespèce a été expliquée par la combinaison de modifications de cible (mécanismeminoritaire) et d’une dégradation du fongicide par un cytochrome P450 nomméCyp68.4 (mécanisme majeur). Il s’agit de la première identification et caractérisationgénétique d’un mécanisme de résistance à un fongicide conférée par un processus dedétoxification chez un champignon phytopathogène
Chemical control is the main method used to control diseases caused byphytopathogenic fungi. In some cases, the resistance phenomena towardfungicides occur within fungal populations, which might alter practicalefficiency of molecules. Understanding modes of action of fungicides andunderlying resistance mechanisms participate to the development and adaptationof management strategies against resistance, and thus help to sustain the life ofmolecules. Fenhexamid is a recent fungicide (Bayer CropScience, 2000), with aparticular mode of action. It is the only fungicide marketed blocking the C4-demethylation step of ergosterol biosynthesis. Several types of resistance (naturaland acquired) were detected in European vineyards in the Botrytis spp speciescomplex, causing grey mold disease. This work focused on the characterization ofthe mode of action and the elucidation of resistance mechanisms. The first aspectinvestigated the functional characterization of two genes involved in the C4-demethylation of ergosterol biosynthesis. The erg27 gene potentially encoding the3-keto reductase which is the fenhexamid target and the erg28 gene encoding aprotein that interact in part with the 3-ketoreductase. Concerning fenhexamidresistance, we shown by reverse genetics that mutations detected in the erg27 genefrom different resistant isolates from the vineyards (phenotypes HydR3- andHydR3+) confer resistance. Furthermore, a fitness analysis under controlledconditions on the most worrying resistant phenotype (HydR3+) was performed onisogenic artificial strains in order to predict the possible persistence of these strainsin vineyards. A fine molecular method to quantify these isolates was developed tofacilitate the follow-up of evolution and persistence of resistant populations in thevineyard. This new method, named ASPPAA PCR is based on the nucleotidepolymorphism of the erg27 gene, responsible for fenhexamid resistance. Finally,the natural resistance to fenhexamid of the related species to Botrytis cinerea, B.pseudocinerea, was elucidated. Fungicide resistance of this species is explained bythe combination of target site modifications (minor mechanism) and fungicidedegradation mediated by a cytochrome P450 named Cyp68.4 (major mechanism).This is the first characterization of a genetic resistance mechanism to a fungicideconferred by detoxification in a phytopathogenic fungus

L’étude présentée comporte deux parties distinctes qui ont le même objectif. La première partie s'intéresse à la modification de la structure chimique des sels d'ammonium quaternaire à chaînes grasses. Les essais en boite de pétri montrent que les sels modifiés ont une activité fongicide comparable à celle des sels de départ. Les essais d'imprégnation montrent que, la modification de la structure chimique des sels est très bénéfique. Nous constatons que la rétention des sels modifiés au sein du bois a doublé. Les analyses au M. E. T. Nous ont permis de confirmer les résultats obtenus aux essais d'imprégnations. La modification de la structure chimique du sel d'ammonium permet d'augmenter le taux d'azote dans le bois de 44,4%, d'où une augmentation du sel d'ammonium retenu par le bois. Les analyses au M. E. B. Ont permis de localiser le sel d'ammonium modifié au niveau des cavités cellulaires, alors qu'il nous était difficile de visualiser le sel d'ammonium soluble. Les résultats que nous avons obtenus dans les essais mycologiques sur bois, constituent un point très positif dans le cadre des objectifs que nous nous sommes fixés à savoir la minimisation de la proportion du sel lessivé tout en gardant intact l'activité fongicide de ces derniers. La dernière partie a consisté à étudier le comportement biologique de la sciure d'Epicéa commun modifiée par des motifs acyles gras à longue chaîne carbonée face au Poria placenta. Nous avons démontré que le bois modifié et exposé au Poria placenta pendant 7, 14 et 21 jours en présence ou en absence de glucose, reste intacte, en particulier au niveau des greffages. Ce résultat très intéressant, peut apporter une réponse aux problèmes poser par la stabilité du matériau bois, et en même temps pour le préserver contre l'attaque du Poria placenta.

La pourriture grise, causée par le champignon Botrytis cinerea, est l'une des principales maladies aériennes fongiques sur diverses cultures d'importance agronomique. La diversité génétique de B. cinerea est très forte et la capacité rapide d'adaptation de ce champignon à une pression sélective est également avérée. Ce champignon est ainsi capable de développer des résistances à une grande variété de composés fongicides de synthèse ou d'origine naturelle. Des méthodes alternatives de lutte ont de ce fait été développées ces dernières années : divers agents de lutte biologique (ALB) présentant différents modes d'actions ont été identifiés et pour certains d'entre eux commercialisés pour contrôler B. cinerea. Cependant la durabilité de la lutte biologique est un domaine encore très peu étudié. La perte d'efficacité d'un ALB pourrait résulter de la préexistence d'isolats moins sensibles de pathogènes dans les populations naturelles et/ou de la capacité de l'agent pathogène à produire, sous une pression de sélection continue exercée par l'ALB, des mutants ayant une sensibilité réduite. L'objectif global de la présente étude est d'évaluer le risque potentiel de perte d'efficacité de la lutte biologique vis-à-vis de B. cinerea. Dans cette étude, les efforts ont été concentrés sur la pyrrolnitrine, un antibiotique produit par divers ALBs, dont certains sont efficaces contre B. cinerea. Les objectifs spécifiques de l'étude étaient (i) d'évaluer la diversité de la sensibilité à la pyrrolnitrine au sein de la population naturelle de B. cinerea, (ii) d'estimer le risque de perte d'efficacité des ALBs produisant la pyrrolnitrine due à la pression de sélection exercée par la pyrrolnitrine et (iii) d'étudier le mécanisme de résistance à la pyrrolnitrine chez B. cinerea. Parmi 204 isolats de B. cinerea, une gamme importante de sensibilité à la pyrrolnitrine a été observée, avec un facteur de résistance de 8,4 entre l'isolat le plus sensible et l'isolat le moins sensible. La production de 20 générations successives pour 4 isolats de B. cinerea, sur des doses croissantes de pyrrolnitrine, a abouti au développement de mutants avec des niveaux élevés de résistance à l'antibiotique, et à une réduction in vitro de la sensibilité à la bactérie productrice de pyrrolnitrine Pseudomonas chlororaphis PhZ24. La comparaison entre les mutants résistants à la pyrrolnitrine et leurs parents sensibles pour la croissance mycélienne, la sporulation et l'agressivité sur plantes a révélé que la résistance à la pyrrolnitrine est associée à un fort coût adaptatif. Des observations cytohistologiques sur tomates ont confirmé que l'isolat sensible à la pyrrolnitrine attaque le pétiole rapidement et envahit la tige, alors que le mutant résistant à la pyrrolnitrine ne s'étend pas au-delà du pétiole. De plus, ce dernier mutant forme un mycélium anormal et des cellules ressemblant à des chlamydospores. Les résultats ont d'autre part révélé que les mutants de B. cinerea résistants à la pyrrolnitrine sont résistants au fongicide iprodione, suggérant ainsi qu'une pression exercée par la pyrrolnitrine sur le champignon conduit à une résistance au fongicide. Réciproquement, la production de générations successives sur iprodione conduit à une résistance à l'antibiotique. Afin d'étudier les déterminants moléculaires de la résistance de B. cinerea à la pyrrolnitrine, le gène histidine kinase Bos1, impliqué entre autres dans la résistance aux fongicides chez B. cinerea a été séquencé chez les souches sensibles et les mutants résistants. La comparaison des séquences a mis en évidence des mutations ponctuelles différentes chez les mutants de B. cinerea obtenus sur la pyrrolnitrine et ceux obtenus sur l'iprodione. De plus, les résistances à la pyrrolnitrine et à l'iprodione ne sont pas systématiquement associées à une mutation ponctuelle dans le gène Bos1. Enfin, aucune modification n'a été détectée dans la taille des allèles de neuf locus microsatellites quelle que soit la pression sélective exercée et quelle que soit le phénotype du mutant produit. Cette étude montre qu'un champignon pathogène des plantes est capable de développer progressivement une moindre sensibilité à un agent de lutte biologique mais que cette moindre sensibilité est associée à une forte perte de fitness

Les cascades de signalisation fongiques du type Hog1 sont impliquées dans diverses fonctions telles l'adaptation aux stress, la résistance aux fongicides, le développement et, dans certains cas, la virulence. Nous avons caractérisé la cascade homologue chez l'ascomycète phytopathogène Botrytis cinerea via l'inactivation de l'histidine-kinase senseur Bos1, sa relation par rapport à la MAPK Sak1 et la régulation de gènes cibles. Les analyses de phosphorylation montrent que Bos1 inhibe la phosphorylation de Sak1 en l'absence de stimulus externe. En conditions de stress, cette inhibition est levée conduisant à la phosphorylation de Sak1, laquelle est impliquée dans l'adaptation aux stress ionique et peroxide, le développement des macroconidies, la pénétration et le développement des nécroses. Par un test d'épistasie, nous montrons que Bos1 régule certaines fonctions cellulaires indépendamment de Sak1 (sensibilité au superoxide; adaptation et conidiation en milieu hyperosmotique neutre; sensibilité aux fongicides de la classe des dicarboximides, phénylpyrroles et aromatiques; production de la mélanine). Deux cascades parallèles sous le contrôle de Bos1 régulent l'intégrité de la paroi et le développement des appressoria et des sclérotes. Afin d'identifier des gènes régulés par la cascade Bos1-Sak1, nous avons réalisé des analyses de RT-qPCR sur des gènes sélectionnés en fonction des phénotypes mutants. Certains des phénotypes peuvent ainsi être corrélés à des expressions différentielles des gènes chez les mutants. Les profils d'expression, en conditions standard, de la plupart des gènes co-régulés par Bos1 et Sak1 corroborent le contrôle négatif de la phosphorylation de Sak1
Hog1-like fungal signal transduction cascades are involved in diverse cellular functions, such as adaptation to various stresses, fungicide resistance, development and, in some cases, virulence. In this work we characterized the homologous pathway of the plant pathogenic ascomycete Botrytis cinerea via the inactivation of the sensor histidine kinase Bos1, its relationship to the downstream MAP kinase (MAPK) Sak1, and the regulation of target genes. Phosphorylation assays show that, without any external stimulus, Bos1 inhibits Sak1 phosphorylation. Under stress conditions, this inhibition is released, leading to Sak1 phosphorylation, which is involved in the adaptation to high ionic and peroxide stress, macroconidia development, plant penetration and necrosis development. Through an epistasis test, we demonstrate that Bos1 regulates certain functions, independently of Sak1. They include superoxide tolerance, adaptation and conidiation on high neutral osmolarity, and susceptibility to three families of fungicides (dicarboximides, phenylpyrroles and aromatic hydrocarbons) as well as melanin production. Cell wall integrity, appressoria- and sclerotia development are probably controlled by two parallel signalling cascades both regulated by the Bos1 HK. To identify the downstream genes regulated by the Bos1-Sak1 cascade, real-time RT-PCR analysis was conducted on selected sets of genes based on the different mutant phenotypes. Some but not all phenotypes can be related to differential gene expression. Expression pattern of most Bos1-Sak1 controlled genes under standard conditions corroborates the negative control of Sak1 phosphorylation

Zymoseptoria tritici, causant la septoriose, est aujourd’hui l'agent pathogène le plus fréquent et le plus nuisible sur les cultures de blé, en particulier en France et dans le nord-ouest de l'Europe. La lutte contre Z. tritici repose essentiellement sur l'utilisation des fongicides, mais le champignon développe régulièrement des résistances à ces derniers, dont les inhibiteurs de la 14-α-déméthylase (IDM), l’une des familles les plus utilisées au champ. Toutefois, aucune étude approfondie n’a jusqu’ici été réalisée pour Z. tritici pour caractériser ses résistances aux IDM dans le nord de la France, où le blé est soumis à de fortes pressions de traitements. Ainsi, 100 souches monospores de Z. tritici ont été isolées dans cette région, et préalablement identifiées comme différents génotypes à l’aide de marqueurs microsatellites, ont été caractérisées pour leur statut de résistance aux IDM. Le séquençage du gène cyp51 a mis en évidence 18 altérations (dont cinq nouvelles) au niveau la protéine CYP51, la cible des IDM, distribuées en 23 haplotypes (combinaisons). Une modélisation in silico suggère que, parmi les cinq nouvelles altérations identifiées, seules deux d’entre elles (F218L et L385M) peuvent réduire l’affinité des IDM au site catalytique de la CYP51, donc potentiellement impacter la résistance. Un criblage moléculaire a permis de détecter, dans la population étudiée, 22 souches présentant des mécanismes de résistance additionnels (15 souches surexprimant le gène cyp51 et 7 souches multidrug resistant, MDR). Les souches possédant des mécanismes de résistance additionnels ont présenté in vitro des niveaux de résistance plus élevés à cinq IDM (époxiconazole, prothioconazole, metconazole, tébuconazole et prochloraz). De façon intéressante, les altérations sur la CYP51 est le mécanisme qui contribue le plus au niveau de résistance aux IDM (de 62 à 99 % du niveau de résistance totale observé, en fonction de la matière active considérée), suivi du caractère MDR (1 à 24 %) et de la surexpression du gène cyp51 (0 à 14 %). En revanche, aucune corrélation claire entre les altérations détectées et les niveaux de résistance phénotypiques (CI50) n’a été décelée, mais la présence d’autres mécanismes non-connus impliqués dans la résistance est suggérée, suite à l’observation d’une grande variabilité de CI50 pour des souches ayant le même profil moléculaire pour les trois mécanismes étudiés. Pour évaluer la fitness des souches hautement résistantes, en particulier MDR, 50 souches ont été évaluées pour leurs adaptations aux contraintes environnementales comme le stress thermique mais aussi pour des traits du pouvoir pathogène (taux de symptômes, sporulation et taille des pycnidiospores) et de compétition. En conditions in vitro et en présence d’IDM, les souches MDR possèdent une meilleure croissance pour toutes les températures testées (5, 10, 15, 20, 25 et 30 °C), suggérant que les variabilités thermiques saisonnières et les changements climatiques n’impacteraient pas l’expression du caractère MDR chez Z. tritici. En conditions in planta, sur deux cultivars de blé et en absence de fongicides, aucun coût de la fitness concernant le pouvoir pathogène n’a été observé pour les souches présentant des mécanismes de résistance additionnels. Toutefois, des co-inoculations de souches MDR vs non-MDR a montré que les souches MDR présentent une plus faible compétitivité comparativement aux souches non-MDR. L’ensemble de ces résultats fournis de nouvelles données sur la fitness des souches MDR de Z. tritici et met en lumière de nouvelles pistes d’études pour mieux comprendre leurs propagations
Zymoseptoria tritici, causing Septoria tritici blotch, is today the most frequent pathogen on wheat crops, particularly in France and north-western Europe. Management of the disease is mainly based on the use of fungicides, but the fungus regularly develops resistance to them, particularly against 14-α-demethylase inhibitors (DMI), one of the most widely used families in the field. However, no studies have been carried out for Z. tritici to characterize resistance to these fungicides in northern France, where wheat is subject to high pressure from fungicide treatments. A total of 100 monospore strains of Z. tritici were thus isolated from this region, and previously identified as different genotypes using microsatellite markers, were characterized for DMI resistance status. Sequencing of the cyp51 gene revealed 18 alterations (including five new ones) in the CYP51 protein, the target of DMIs, distributed in 23 haplotypes (combinations). In silico modelling suggests that, among the five new alterations identified, only two of them (F218L and L385M) can reduce the affinity of IDMs at the catalytic site of CYP51, thus potentially impacting resistance. Molecular screening detected 22 strains with additional resistance mechanisms in the study population (15 strains overexpressing the cyp51 gene and 7 multidrug resistant strains (MDR)). Phenotypically, strains with additional resistance mechanisms showed higher levels of resistance at five MDRs (epoxiconazole, prothioconazole, metconazole, tebuconazole and prochloraz) tested in vitro. Interestingly, alterations in CYP51 is the mechanism that contributes the most to the level of resistance to IDMs (62-99% of the total resistance level observed, depending on the active ingredient considered), followed by the MDR trait (1-24%) and overexpression of the cyp51 gene (0-14%). However, no clear correlation between the alterations obtained and the levels of phenotypic resistance was detected, but the presence of other unknown mechanisms involved in resistance is suggested following the demonstration of high phenotypic variability for strains with the same molecular profile for the three mechanisms studied. To assess the fitness of highly resistant strains, 50 strains were evaluated for their adaptation to environmental constraints such as heat stress but also for pathogenicity traits (symptom rate, sporulation capacity and pycnidiospore size) and competition. Under in vitro conditions and in the presence of DMI fungicides, the MDR strains showed better growth at all tested temperatures (5, 10, 15, 20, 25 and 30 °C). Under in planta conditions, on two wheat cultivars and in the absence of fungicides, no fitness cost regarding pathogenicity was observed for strains with additional resistance mechanisms. However, MDR versus non-MDR co-inoculations showed that MDR strains showed lower fitness cost in planta compared to non-MDR strains. All these results provide new data on the fitness of MDR strains of Z. tritici and highlight new aims of study to better understand their spread

Les polyoxines, peptidonucléosides d'origine naturelle connus pour leurs propriétés antifongiques en tant qu'inhibiteurs de la biosynthèse de la chitine, sont des composés très actifs in vitro, mais présentant une faible biodisponibilité in vivo. Le but de cette thèse a donc été de trouver des méthodes de synthèse d'analogues C2'-désoxy-C2'-fluorés de la thymine polyoxine C, constituant nucléosidique de la polyoxine J (la plus active), ainsi que d'obtenir, d'une manière originale, la partie peptidique non naturelle de la polyoxine J, à savoir l'acide 5-O-carbamoyle polyoxamique. Après une présentation de la cible biologique et de l'intérêt de l'introduction d'un atome de fluor, ce travail s'est divisé en deux grandes parties. Tout d'abord, deux approches de la synthèse de la partie nucléosidique fluorée par passage par des 2-désoxy-2-fluorobutyrolactones, puis une optimisation de la synthèse de la partie peptidique via la formation d'un intermédiaire oxazolidinone
Polyoxins, which form an important class of peptidyl nucleosidic antibiotics that selectively and competitively inhibit chitin synthase, are very active components in vitro, but weakly bioavailable in vivo. The subject of this thesis has been to found new synthetic methods to access to C2'-fluoro-C2'-deoxy analogues of thymine polyoxine C, nucleosidic part of polyoxine J (the more active one), and to obtain, by an original way, the non natural peptidic moiety of polyoxine J, which is the 5-O-carbamoyl polyoxamic acid. After a presentation of the biological target and the interest of the introduction of a fluorine atom, this work is divided into two parts. Fisrt, two approaches of the fluorinated nucleosodic part using 2-deoxy-2-fluorobutyrolactones as intermediates, and then, an optimization of the synthesis of the peptidic part using the formation of an oxazolidonone intermediate

La pourriture brune des fruits (BR), causée par les champignons du genre Monilinia, est une maladie courante qui peut provoquer jusqu’à 40% de pertes de récolte chez la pêche. Toutes les pêches cultivées sont plus ou moins sensibles à la moniliose. Aucune alternative aux traitements chimiques n’est disponible, ce qui rend nécessaire les applications de fongicides jusqu'au stade pré-récolte, qui sont préjudiciables pour l'environnement et peuvent laisser des résidus sur les fruits. Une revue de la littérature compile les connaissances disponibles sur le couple pêcher-monilioses.Le but de cette étude est d'étudier les facteurs de résistance du fruit à M. laxa à différents stades de croissance chez la pêche et de déterminer leur contrôle génétique.Nous avons focalisé d’abord sur quelques cultivars pour étudier l'évolution de la sensibilité des fruits à M. laxa au cours de leur développement en relation avec les caractéristiques structurales et biochimiques des fruits (conductance cuticulaire du fruit, micro-fissures de l’épiderme et composés de surface des fruits). Certains composés ont été détectés pour la première fois chez la pêche. Les résultats ont confirmé que lors de la phase I les fruits immatures sont sensibles à la moniliose. Au stade de durcissement du noyau, les fruits sont résistants, la conductance cuticulaire faible et les niveaux de composés de surface présentaient un pic de teneurs. A l’approche de la maturité, les fruits sont sensibles de nouveau. Au stade I, nous avons exploré le rôle des stomates et de la conductance du fruit immature en relation avec la sensibilité à M. laxa. Une centaine de génotypes d'une descendance interspécifique de pêchers appelée BC2 a été caractérisée par une infection au laboratoire, un suivi de pertes transpiratoires des fruits et une estimation de la densité de stomates (uniquement pour les nectarines). Des symptômes inattendus (une ‘tache claire’ qui ne progresse pas) ont été observés. La conductance cuticulaire était significativement liée à la probabilité d'infection, mais le nombre de stomates n’a montré aucun effet sur la probabilité d'infection. Des QTL contrôlant la résistance des fruits à la moniliose, à la conductance cuticulaire et au nombre de stomates ont été identifiés et des co-localisations observées.A maturité, le contrôle génétique de la résistance à la moniliose et des composés biochimiques de l'épiderme des fruits a été étudié. Pendant trois ans, les fruits de la BC2 ont été infectés avec une suspension de spores de champignon selon deux modalités. La BC2 a affiché une forte variabilité de résistance à la moniliose. Malgré une faible stabilité entre les années, des génotypes à haut niveau de résistance ont été identifiés. De plus en 2015, nous avons exploré la variation des composés de l'épiderme des fruits au sein de la BC2. Les composés phénoliques, les terpènes et dérivés ont été quantifiés par HPLC. La relation entre la résistance à la moniliose et la présence et / ou les niveaux de certains composés de l'épiderme et le contrôle génétique de ces composés ont été étudiés.La moniliose des fruits de pêche est un problème complexe qui est encore loin d'être résolu. Des progrès ont été accomplis dans la connaissance des caractéristiques structurales et biochimiques impliquées dans la résistance et des régions du génome qui pourraient conférer une certaine tolérance à la maladie ont été détectées. Des travaux supplémentaires sont nécessaires pour développer des marqueurs moléculaires pour la sélection assistée par marqueurs. Les résultats obtenus suggèrent que des solutions pour l'avenir résident dans l’association de cultivars tolérants _ moins sensibles aux micro-fissures et à haute teneur en composés épidermiques potentiellement inhibiteurs du développement du champignon _ avec des pratiques culturales réduisant les risques de fissuration des fruits et d'apparition de conditions climatiques favorables à la propagation de la moniliose
Brown rot (BR) in peach fruit caused by the fungus Monilinia spp. is a common disease that can provoke as much as 30 to 40% losses of crop. Currently, all cultivated peaches are more or less sensitive to BR. No other alternative than chemical treatment is available, hence fungicide applications are required until pre-harvest. Such applications are damaging the environment and may let residues in fruits. A review of literature was accomplished to compile the knowledge scattered in the literature from many years. The aim of this study is to investigate the factors of resistance of the fruit to M. laxa at different stages of fruit growth and their genetic control by studying contrasted genotypes and an interspecific peach progeny. The first focus was made on few cultivars to study the evolution of sensibility of fruits to M. laxa during their development in relation with structural and biochemical characteristics of the fruit, e.g. cuticular conductance, micro-cracks and fruit surface compounds. Some compounds were detected for the first time on peach fruit. The results confirmed that during the stage I immature fruits are susceptible to BR. Fruit cuticular conductance was high probably due to high density of stomata and thin cuticule in formation. In contrary, at pit hardening stage fruits were resistant, cuticular conductance was low and the levels of surface compounds exhibit a peak. When maturity approaches, fruit become susceptible again. With rapid development of the fruit during this stage, the surface compounds were diluted and micro-cracks often appear which resulted in high cuticular conductance. At stage I we explored the different physical characteristics of the immature fruit in relation with susceptibility to M. laxa. A hundred of individuals of an interspecific peach progeny called BC2 were characterized through laboratory infection, monitoring of fruit transpiratory losses and estimating stomata density (only for nectarines). Unexpected symptoms (not progressing ‘clear spot’) were observed. The cuticular conductance was significantly linked to the likelihood of infection, but the stomata number had no effect on the likelihood of infection. QTL controlling fruit resistance to BR, cuticular conductance and stomata number have been identified and some co-locations observed. At maturity stage we investigated the genetic control of BR resistance together with biochemical compounds of fruit epidermis. For three years, mature fruits from the BC2 progeny were infected with two modalities of infection: spray until runoff in the orchard to measure infection probability and drop in the laboratory conditions in order to observe the characters of beginning, progression and speed of infection. The BC2 progeny displayed high variability for BR resistance. Despite low stability between years, genotypes with high level of resistance were identified. In addition in 2015, we explored the variation in epidermis compounds of fruit within the BC2 progeny. Phenolic compounds, terpenoids and derivatives were quantified by HPLC. The relationship between BR resistance and presence and/or levels of certain epidermis compounds and the genetic control of these compounds were investigated. BR of peach fruit is a complex problem which is still far from resolved. Progress has been made in the knowledge of structural and biochemical characteristics involved in BR resistance and regions of the genome that could confer certain disease tolerance have been detected. Further work is needed to develop molecular markers for marker assisted selection. The results obtained suggest that solutions for the future lie in associations of tolerant cultivars _ less susceptible to micro-cracks and with high content of epidermis compounds potential inhibitor of the fungus development _ with cultural practices reducing both risks of fruit cracking and occurrence of micro-climatic conditions favorable to BR spread and sporulation

La pyriculariose, maladie causée par le champignon phytopathogène Magnaporthe oryzae, affecte gravement le riz qui constitue l'aliment de base de plus de la moitié de la population mondiale. La connaissance des mécanismes de résistance est nécessaire pour guider la sélection variétale. Au cours de ce travail, une synthèse de la littérature a permis de recenser plus de 60 gènes régulateurs du riz impliqués dans la résistance du riz à différents agents pathogènes. Nous avons complété ces données en étudiant le rôle in planta de huit de ces régulateurs. Un rôle central du facteur de transcription OsWRKY28 a pu être établi et le rôle du récepteur CEBiP a été démontré. Ce travail a aussi exploré l'éventuelle implication d'une nouvelle famille de récepteurs, les Wall-Associated Kinases (WAK) dans la résistance chez le riz. Ce travail montre l'implication des WAK dans la résistance à M. oryzae. Alors que la transcription de la plupart de ces gènes est induite au cours de l'infection, celle du gène WAK112d est réprimée. La régulation transcriptionnelle précoce observée pour certains gènes WAK est déclenchée par la chitine et sous contrôle partiel du récepteur CEBiP et d'OsWRKY28. L'étude de mutants d'insertion et de lignées de surexpression a permis de montrer le rôle positif de trois gènes WAK et le rôle négatif du gène WAK112d dans la résistance. Des approches biochimiques seront nécessaires pour comprendre le mode de fonctionnement de ces récepteurs et pour les relier aux autres systèmes de défense connus
Rice blast disease, caused by the fungus Magnaporthe oryzae, is one of the most serious diseases on rice which is the staple food of more than the half of the world population. Improving our knowledge of resistance mechanisms is necessary to guide breeding programs. In this study, we reviewed over 60 rice gene regulators involved in resistance against various pathogens. We completed these data by analyzing the role of eight of these regulators. A pivotal role for the transcription factor OsWRKY28 has been established and the role of the CEBiP receptor in planta has been demonstrated. This work also shows the implication of some WAKs in rice blast resistance. Whereas the transcription of most of these genes is induced, transcription of the OsWAK112d gene is repressed upon infection. The early transcriptional regulation observed for some OsWAK genes is triggered by chitin and partially under CEBiP and OsWRKY28 regulation. Analysis of insertion mu tants and over-expressor lines revealed a positive role for three OsWAK genes and a negative role for OsWAK112d gene in rice blast resistance. Biochemical studies will be essential to understand how these receptors work and to connect them to other known defense systems

La succinate déshydrogénase (SDH) est à la fois une enzyme clé du cycle de Krebs oxydant le succinate en fumarate et le complexe II de la chaîne respiratoire mitochondriale impliqué dans le transfert des électrons et la réduction de l’ubiquinone. Des inhibiteurs de cette enzyme (SDHI) ont été développés ou sont en cours de développement comme antifongiques. Cette famille de fongicides est notamment utilisée pour lutter contre Botrytis cinerea, champignon phytopathogène responsable de la pourriture grise sur de nombreuses cultures dont la vigne. Des souches résistantes aux SDHI ont été isolées chez B. cinerea et d’autres champignons phytopathogènes. Chez ces isolats résistants, des mutations ont été identifiées dans les gènes codant la SDH. Au cours de cette thèse, nous avons étudié l’impact de mutations affectant la sous-unité B (SdhB) de la succinate déshydrogénase sur l’activité de l’enzyme, la biologie du champignon B. cinerea et la résistance aux inhibiteurs ciblant cette enzyme. Par mutagénèse dirigée du gène sdhB, nous avons obtenu des mutants dits « isogéniques » qui ont permis de confirmer l’implication de ces mutations dans la résistance aux différentes molécules SDHI. Par ailleurs, nos résultats montrent que les modifications de la sous-unité SdhB affectent l’affinité des SDHI pour la SDH et les niveaux d’inhibition de l’activité SDH par les molécules inhibitrices ; ce qui explique - in fine - les spectres de résistance des mutants aux SDHI. Actuellement, tous les mutants sont résistants au boscalid et les mutants les plus fréquemment retrouvés au vignoble, sdhBH272R/Y, sont sensibles au fluopyram. Les travaux réalisés sur les mutants sdhB montrent que les mutations étudiées ont également un impact sur l’activité de l’enzyme et sur le développement du champignon, conséquences dépendantes du résidu substitué et de la substitution. En particulier, les mutations sdhBH272L/R affectent fortement l’activité de l’enzyme et la fitness du champignon alors que le mutant sdhBH272Y est peu affecté. Enfin, l’analyse de populations de pourriture grise de différentes origines (région, plantes hôtes) par rapport à la résistance aux SDHI réalisée sur les années 2009/2010 montre que les mutants sdhBH272R/Y sont toujours les plus fréquents mais leurs fréquences varient en fonction des situations agronomiques. Notamment la fréquence du mutant sdhBH272R augmente avec la pression de sélection exercée par les fongicides. Ce mutant attire particulièrement notre attention du fait de sa relation non linéaire entre fitness et fréquence au champ
Succinate dehydrogenase is both a key enzyme of the TCA cycle, oxidizing succinate into fumarate and complex II of the mitochondrial respiratory chain involved in electron transfer and ubiquinone reduction. Inhibitors of this enzyme (SDHIs) have been developed or are in the developmental process as fungicides. Actually, SDHIs are registered to deal with Botrytis cinerea, a phytopathogenic fungus responsible for grey mold on many crops including grapevine. Strains of B. cinerea and other pathogenic fungi have been isolated for their resistance to SDHI. They mainly harbor mutations in genes encoding SDH subunits. During this thesis, we studied the impact of mutations modifying subunit B of succinate dehydrogenase on enzyme activity, fungal biology and resistance to SDHIs. “Isogenic” mutants obtained through site-directed mutagenesis and homologous recombination allowed us to confirm the role of sdhB mutations in SDHIs resistance. Our results also show that the substitutions in the SdhB subunit impact respectively the affinity of SDHIs to SDH and the inhibition levels of SDH activity by inhibitors, which explain – in fine – the resistance spectra observed for the mutants. Up to now, all sdhB mutants are resistant to boscalid and the most frequent mutants observed in grapevines, sdhBH272R/Y, are susceptible to fluopyram. Studies on sdhB mutants reveal that the mutations also impact the enzymatic activity and the fungal development depending on the substitution. In particular, sdhBH272L/R mutations have the strongest impact on enzyme activity and the fitness of the fungus, whereas these parameters are almost not altered in the sdhBH272Y mutant. Finally, grey mold populations from different origins (country, plant host) were analyzed for their SDHI resistance pheno- and genotypes. Yet, the sdhBH272R/Y mutants were the most frequent, but these frequencies varied according to the agronomical situation. Interestingly, the frequencies of the sdhBH272R mutant seem to increase with the selective pressure exerted by fungicides. This mutant is of particular interest because of the absence of correlation between the fitness we measured and the frequencies we observed in natura

Dans le cadre de la promotion d'une viticulture durable, le développement d'alternatives écologiques à l’utilisation de pesticides de synthèse pour le contrôle des maladies de la vigne (Vitis vinifera) gagne en importance. Une des méthodes de bio-contrôle proposée est l'induction de l'immunité des plantes par l’application de substances biodégradables, non toxiques pour la santé et l'environnement, appelées éliciteurs ou stimulateurs de défense des plantes (SDP). La résistance conférée contre divers agents pathogènes peut être obtenue grâce à l’emploi de molécules utilisant le plus fréquemment les voies de signalisation de l'acide jasmonique (JA), de l'acide salicylique (SA) et/ou de l'éthylène (ET). De telles voies peuvent déclencher l'induction de gènes liés à la défense tels ceux codant des enzymes responsables de la biosynthèse des stilbènes, des métabolites phénoliques antimicrobiens parmi les plus importants des Vitacées. Au vignoble, pour contrôler les maladies, les éliciteurs peuvent être appliqués en complément des pesticides de synthèse et non en remplacement total car leur efficacité est souvent variable selon les agents pathogènes et les conditions environnementales. Afin de développer leur utilisation, des études supplémentaires qui pourraient notamment élucider leur mécanisme d'action sont nécessaires. L’objectif de cette thèse était d'étudier les réponses de la vigne à des éliciteurs de différents modes d'action, comme le jasmonate de méthyle (MeJA), impliqué dans la voie de signalisation du JA, l’acide S-méthyl ester 2,1,3-benzothiadiazole-7-carbothioïque (BTH), un analogue synthétique du SA, des phosphonates (PHOS), molécules à double action stimulateur-fongicide. Le profil des stéroïdes et des triterpénoïdes pentacycliques a été caractérisé par des analyses en chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (GC-MS). Dans un premier temps, l'effet éliciteur du MeJA a été évalué dans des suspensions cellulaires (in vitro) de plusieurs cultivars de V. vinifera. Une surproduction de triterpénoïdes pentacycliques a été observée avec des différences selon la variété considérée : induction de l’accumulation de la bétuline et de l'acide oléanolique ou des phytostérols pour le Petit Verdot, le Gamay Teinturier) et le Cabernet Sauvignon, respectivement. Puis les élicitations ont été effectuées au niveau des feuilles de boutures de serre de V. vinifera cv. Cabernet Sauvignon. Un effet stimulant sur les triterpénoïdes pentacycliques liés à la défense a été démontré au détriment de la biosynthèse des stérols, composants structurels essentiels des membranes cellulaires. Par l’utilisation de puces NeoVigen et la chromatographie liquide à ultra haute performance couplée à la spectrométrie de masse (UHPLC-MS), l’induction de l’expression de gènes liés à la défense et l'accumulation de polyphénols (stilbènes, flavanols et flavonols) ont été notées suite aux trois traitements éliciteurs. La protection de la vigne conférée par les éliciteurs a été confirmée par des biotests sur disques foliaires inoculés par l’oomycète biotrophe Plasmopara viticola, l’agent responsable du mildiou. Par ailleurs, il est important d’avoir connaissance de l’impact des éliciteurs sur le métabolisme général afin d'obtenir l’effet optimal entre croissance, rendement et défense. Ainsi, une approche métabolomique utilisant la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire du proton (RMN 1H) a été menée. Une reprogrammation similaire et/ou spécifique selon l'éliciteur considéré a été notée en particulier au niveau des glucides, des acides aminés et de certains intermédiaires du cycle de Krebs. Les recherches présentées dans cette thèse, démontrent que la compréhension approfondie de l'interaction entre l'éliciteur, les réponses moléculaires et métaboliques de la plante et le pathogène, est cruciale pour le développement de stratégies de protection efficaces basées sur l'utilisation des SDP pour contrôler les maladies de la vigne
In the frame of promoting sustainable vitiviniculture, the development of eco-friendly alternatives to synthetic chemical products for phytosanitary treatments against grapevine (Vitis vinifera) pests is gaining importance. One of the bio-control methods that can be proposed is the induction of plant immunity by using elicitors, also called plant defense stimulators (PDS), as these substances are biodegradable and, non-toxic to health and environment. A conferred resistance against various pathogens can be obtained with natural molecules acting most frequently through jasmonic acid (JA), salicylic acid (SA), and/or ethylene (ET) signaling pathways. These pathways are involved in the induction of defense-related genes such as those encoding enzymes responsible for the biosynthesis of stilbenes, which are the most important polyphenolic antimicrobial metabolites (phytoalexins) in Vitaceae. For vineyard protection, PDS can be applied as a complement for pesticides and not as a full replacement since their effectiveness is often variable according to pathogens and environmental conditions. In order to develop the strategies based on PDS use, more studies which could elucidate their mechanism of action are needed. The aim of this thesis was to examine the responses of grapevine to elicitors of different mode of action, as methyl jasmonate (MeJA), implicated in JA signaling pathway, 2,1,3-benzothiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester (BTH), a synthetic analogue of SA, and phosphonates (PHOS), molecules of a double stimulator-fungicide action. Due to scarce information about steroids and pentacyclic triterpenoids in grapevine, their profile after PDS treatment were characterized in different grapevine experimental models using gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) analyses. Firstly, the effect of elicitation with MeJA was evaluated in cell suspension cultures (in vitro) of V. vinifera. An overproduction of bioactive pentacyclic triterpenoids occurred with differences according to the cultivar studied, i.e., acumulation of betulin and oleanolic acid or phytosterols was noted in respectively Petit Verdot, Gamay Teinturier and Cabernet Sauvignon cell suspension cultures. Then, elicitations were effectuated on the leaves of V. vinifera cv. Cabernet Sauvignon greenhouse cuttings. A stimulatory effect on the potentially defense-related pentacyclic triterpenoids at the expense of the biosynthesis of sterols, which are essential structural components of cell membranes, was shown. By the use of NeoVigen microarrays, and ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UHPLC-MS), the accumulation of defense-related transcripts and polyphenols (stilbenes, flavanols and flavonols) were noted after the three elicitors treatments. Grapevine protection conferred by these elicitors was confirmed on foliar discs against the biotrophic oomycete Plasmopara viticola, the causal agent of downy mildew. Furthermore, the impact of PDS on primary metabolism should be evaluated in order to ensure, in the longer term, the best trade-off between growth, yield and defense. Thus, a thorough metabolomic approach using proton nuclear magnetic resonance spectroscopy (1H-NMR) was performed. A reprogramming similar and/or specific to the elicitor applied was noted, particularly within carbohydrates, amino acids, and some of the Krebs cycle intermediates. The research presented in the current dissertation revealed that the thorough comprehension of the interaction between elicitor, plant molecular and metabolic responses and pathogen, is crucial for the development of effective protection strategies based on the use of PDS for grapevine diseases control

De nombreux travailleurs utilisent le captan et le folpet comme fongicides en agriculture, mais leur exposition n’est pas toujours mesurée de manière spécifique et précise. La surveillance biologique est un excellent outil à cet effet puisqu’elle permet de quantifier l’exposition réelle. Toutefois, la majorité des connaissances toxicologiques pour ces fongicides proviennent d’études sur les animaux, et les données chez l’humain sont limitées. Le but du présent projet est donc de développer des outils de surveillance biologique pour évaluer l’exposition de travailleurs au captan et au folpet. Dans cette perspective, le projet a été subdivisé en trois parties complémentaires, soit i) de développer des méthodes analytiques spécifiques pour quantifier les biomarqueurs d’intérêt du captan, à savoir le tétrahydrophtalimide (THPI), et du folpet, à savoir le phtalimide (PI) et l’acide phtalique, dans le plasma et l’urine; ii) de déterminer la toxicocinétique des deux fongicides en exposant des volontaires de façon aigüe à de faibles doses de captan ou de folpet par voie orale et cutanée dans des conditions semi-contrôlées et en quantifiant les biomarqueurs dans chacune des deux matrices, excepté l’acide phtalique qui a été mesuré seulement dans l’urine; iii) de valider les biomarqueurs d’exposition sélectionnés et d’évaluer l’exposition réelle des travailleurs et les voies prédominantes d’exposition au captan et au folpet en collectant des données biologiques chez des travailleurs en arboriculture et en viticulture lors d’activités de traitement et d’effeuillage pendant sept jours consécutifs. Selon ces travaux, le THPI et le PI sont deux biomarqueurs valides et spécifiques pour quantifier l’exposition au captan et au folpet, respectivement, chez l’humain. En effet, les méthodes développées pour ces deux métabolites sont robustes avec des limites de détection plus sensibles que celles rapportées dans la littérature, un taux de recouvrement de 90% pour le THPI et de 75% pour le PI, une très bonne linéarité (R2>0,99) et une bonne stabilité avec des variations intra- et inter-journalières faibles (RSD<15%). Elles ont permis de déterminer les profils cinétiques des deux métabolites chez les volontaires et chez les travailleurs. Ces derniers indiquent d’ailleurs une élimination rapide, avec une demi-vie d’élimination dans l’urine de 11,7 h et 18,7 h pour le THPI et de 27,3 h et 28,8 h pour le PI, respectivement après une absorption par voie orale et cutanée, ainsi qu’une faible absorption cutanée lorsque les valeurs sont comparées pour les deux voies d’exposition. Des profils parallèles sont aussi observés entre le PI et l’acide phtalique pour les volontaires et les agriculteurs, mais le folpet se retrouve davantage métabolisé sous forme d’acide phtalique que de PI. Quant à l’étude des agriculteurs, elle montre que la voie principale d’exposition de ces travailleurs est la voie cutanée. Il est aussi souligné qu’il est important 1) de favoriser les collectes d’urines complètes sur 24 h au urines ponctuelles, 2) de mesurer plusieurs métabolites, et 3) d’associer les données de surveillance biologique à la toxicocinétique. Ainsi, les connaissances acquises par cette étude peuvent s’appliquer à d’autres fongicides, voire d’autres substances.
Several workers use captan and folpet as fungicides in agriculture, but their exposure has yet to be measured specifically and precisely. Biomonitoring is an excellent tool for this purpose since it allows to quantify internal exposure. However, the majority of toxicological data on these fungicides come from animal studies and data in humans are limited. The aim of this project was thus to develop biological monitoring tools in order to assess exposure to captan and folpet in humans. In this perspective, the project was divided into three complementary parts: i) to develop specific and accurate analytical methods in order to quantify captan and folpet metabolites in urine and blood, namely tetrahydrophthalimide (THPI) for captan and phthalimide (PI) and phthalic acid for folpet; ii) to determine the toxicokinetics of the two fungicides in humans by exposing volunteers acutely to low-doses of captan or folpet by oral and dermal routes under semi-controlled conditions and by quantifying the biomarkers in plasma and urine, except phthalic acid which was only measured in urine; iii) to validate the use of the selected biomarkers of exposure to captan and folpet and estimate actual exposures of workers and main exposure routes to these fungicide in the context of a field biomonitoring study in farmers during treatment and harvest activities over seven consecutive days. This study showed that THPI and PI are both valid and specific biomarkers of exposure to captan and folpet, respectively, in humans. Indeed, the developed methods for these two metabolites are accurate showing more sensitive detection limits than those reported in the literature, good recovery rate (90% for THPI and 75% for PI), linearity (R2>0.99) and stability (RSD<15% for intra-and inter-day precision and accuracy). They allowed determining the kinetic profiles of the two metabolites in healthy volunteers and in workers. These profiles indicate a rapid elimination of both metabolites, since the urinary elimination half-life of THPI was 11.7 h and 18.7 h following an oral and dermal absorption, respectively, and 27.3 h and 28.8 h for PI. They also evidence a low dermal absorption for both fungicides when oral and dermal route are compared. In addition, parallel profiles were observed between PI and phthalic acid, but the administrated dose of folpet was mostly recovered as phthalic acid rather than PI. As for the study of farmers, it showed that the dermal route was the main route of exposure. It also pointed out that it is important 1) to perform 24-h complete urine collections rather than collect spot urines, 2) to measure several metabolites to better assess actual exposure, and 3) to rely on the toxicokinetics to help interpret biomonitoring data. Overall, knowledge acquired from this study may be applied to other fungicides or even to other substances.