Letteratura scientifica selezionata sul tema "Protéines NLR"

La Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2 (RIPK2) est un médiateur crucial des voies de signalisation de l'immunité innée, en particulier celles initiées par les NOD-like receptors NOD1 et NOD2. Les voies inflammatoires NOD1/2 - RIPK2 ont suscité un grand intérêt en tant que cibles thérapeutiques pour diverses maladies inflammatoires. Compte tenu de l'expertise de notre équipe dans ce domaine, nous avons décidé de nous concentrer sur ces voies. Ce projet a été divisé en plusieurs tâches. La première a permis d'établir les relations structure-activité (RSA) de deux séries de petites molécules inhibitrices de RIPK2. Ces composés étaient pour la plupart actifs à l'échelle du nanomolaire sur la voie NOD1 et sélectifs de cette voie par rapport à la voie NOD2. La deuxième stratégie s'est concentrée sur le développement de dégradeurs par stratégie de marquage hydrophobe. La dégradation de kinases est une stratégie émergente ayant le potentiel d’améliorer la sélectivité par rapport aux inhibiteurs conventionnels, raison pour laquelle elle a été envisagée. Enfin, la dernière stratégie visait à identifier des inhibiteurs de l'interaction XIAP-RIPK2, essentielle à l’activation des voies inflammatoires, par le biais d'un criblage virtuel. Les composés recherchés ont été synthétisés (pour les deux premières tâches) et testés sur les essais biologiques de notre équipe. Pour la première série de composés, des études complémentaires ont été réalisées (structurales, ADMET, sélectivité, in vivo) et ont permis de confirmer le potentiel thérapeutique de nos composés en vue d’un traitement des maladies inflammatoires
The Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 2 (RIPK2) is a crucial mediator of innate immune signaling pathways, and particularly those initiated by NOD-like receptors (NLRs) NOD1 and NOD2. NOD1/2 - RIPK2 signaling pathways have garnered significant interest as therapeutic targets for various inflammatory diseases. In view of our team's expertise in the field, we decided to focus on these pathways. This project has been divided into several tasks. The first led to the establishment of structure-activity relationships (SAR) of series of small molecule RIPK2 inhibitors. These compounds were for the most part active at the nanomolar range on NOD1 pathway and selective toward this pathway vs NOD2. The second strategy was focused on the development of hydrophobic tagged degraders. Degrading kinases is an emerging strategy and has shown potential for providing greater selectivity compared to conventional inhibitors which is why it was investigated. Finally, the last strategy aimed at the identification of XIAP-RIPK2 interaction inhibitors, essential to the inflammatory pathways, through virtual screening. The desired compounds were synthesized (for the two first tasks) and tested on our team’s biological assays. For the first series of compounds, additional studies were carried out (structural, ADMET, selectivity, in vivo) and confirmed our compounds’ therapeutic potential in inflammatory diseases

L’inflammasome NLRP3 est un complexe multi-protéique responsable de la production d’IL-1β en réponse à des signaux de danger. Certaines mutations de NLRP3 étant responsables de maladies inflammatoires l’activation de ce complexe se doit d’être finement régulée. Dans cette étude je me suis intéressé à l’importance de la protéine de choc thermique HSP70 dans l’activation de l’inflammasome NLRP3. J’ai dans un premier temps mis en évidence que l’absence d’HSP70 entraine une amplification des symptômes de la péritonite chez la souris. Le manque d’HSP70 augmente également l’activation de la caspase-1 et la production d’IL-1β par les macrophages issus de la moelle osseuse de souris (BMDMs) à la suite d’un traitement par différents activateurs de NLRP3 in vitro. Ces phénomènes sont associés à une augmentation du nombre et de la taille des complexes ASC/NLRP3 dans la cellule. De manière correspondante, la surexpression d’HSP70 dans les BMDMs diminue l’activation de la caspase-1 et la production d’IL-1β après traitement par des activateurs de NLRP3. Une des explications possibles de l’effet inhibiteur d’HSP70 est son interaction avec NLRP3 que j’ai observé par PLA (Proximity Ligation Assay). J’ai également utilisé un choc thermique pour surexprimer HSP70 et observé une inhibition de l’inflammasome NLRP3 in vitro. Finalement, une hyperthermie in vivo inhibe également les symptômes de la péritonite chez la souris, soulignant la relevance physiologique de ces observations. Cette étude fournit donc des preuves de l’effet inhibiteur d’HSP70 sur l’inflammasome NLRP3 et met en lumière un possible nouvel outil de traitement des maladies inflammatoires
NLRP3 inflammasome is a multi-protein complex aimed at producing IL-1β in response to danger signals. Gain of function mutations of NLRP3 are responsible for inflammatory diseases, so NLRP3-dependent inflammation required tight regulation. Here we investigated the importance of the stress sensor, Heat Shock Protein 70 (HSP70) on the NLRP3 inflammasome activation. First, the lack of HSP70 leads to a worsening of NLRP3-dependent peritonitis in mice. HSP70 deficiency also enhances caspase-1 activation and IL-1β production by murine Bone Marrow-Derived Macrophages (BMDMs) under NLRP3 activators treatment in vitro. These phenomena are associated with an increase in the number and size of ASC/NLRP3 specks. At the opposite side, the overexpression of HSP70 in BMDMs decreases caspase-1 activation and IL-1β production under NLRP3 activators treatment in vitro. One possible explanation of the inhibitory effect of HSP70 is its interaction with NLRP3. A heat shock, used as a way to induce the expression of HSP70 also inhibits the NLRP3 inflammasome activation in vitro. Finally, in vivo hyperthermia also inhibits peritonitis features in mice, highlighting the physiological relevance of our observations. This study provides evidences on the inhibitory role of HSP70 on the NLRP3 inflammasome and on the possibility to treat inflammatory diseases by inducing its expression, mainly by hyperthermia

Les protéines 14-3-3 sont des protéines adaptatrices qui exercent leurs fonctions biologiques en modulant l’activité de centaines d’autres protéines. De part leur impressionnant interactome, les protéines 14-3-3 sont des acteurs qui influencent de nombreux événements cellulaires et, par conséquent, de maladies associées. La stabilisation ou l’inhibition sélective d’interactions protéine-protéine (IPP) de 14-3-3 sont considérées comme des approches prometteuses pour trouver des thérapies innovantes contre des maladies comme la maladie d’Alzheimer, certains cancers ou la maladie de Parkinson.Notre premier but afin de trouver des petites molécules capables de moduler ces cibles a été d’étudier au niveau moléculaire des IPP de 14-3-3. Dans ce but, nous avons utilisé la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) pour attribuer les déplacements chimiques des atomes du squelette de 14-3-3σ. Nous avons ensuite étudié l’interaction entre 14-3-3 et la protéine Tau phosphorylée. Nous avons découvert que Tau se lie strictement dans la cavité amphipathique de 14-3-3 et peut s’ancrer aux deux monomères du dimère de 14-3-3. Nous avons aussi étudié l’interaction 14-3-3/p53 et avons découvert, en utilisant la RMN, que l’affinité du peptide p53 envers 14-3-3 est liée à des interactions intramoléculaires au niveau du peptide. Nous nous sommes enfin focalisés sur l’optimisation d’expériences RMN visant le criblage et la caractérisation de l’activité des petites molécules qui se lient à 14-3-3 ou à des complexes de 14-3-3 avec des peptides phosphorylés. Nous avons aussi utilisé des peptides phospho-mimétiques pour inhiber l’interaction 14-3-3/Tau. D’autre part, nous avons criblé une bibliothèque de fragments contre 14-3-3σ et trouvé trois hits qui se lient à des régions différentes de la protéine. Des expériences RMN ont ensuite permis de caractériser l’activité de certaines petites molécules actives sur des complexes de 14-3-3 avec, par exemple des peptides de p53 ou p65, et nous avons aussi démontré la capacité de certains de ces composés à stabiliser les complexes
14-3-3 proteins are adapter proteins that exert their biological functions by modulating the activity of hundreds of proteins. This remarkable interactome makes 14-3-3 proteins influent actors in many cellular events and, by consequence, in several pathologies. The selective stabilization or inhibition of 14-3-3 protein-protein interactions (PPIs) are therefore seen as promising approaches for finding innovative therapies for a number of conditions like Alzheimer’s, cancer or Parkinson. Our first objective towards finding small molecule modulators of these targets was to obtain the molecular detail of 14-3-3 PPIs. To this end, using Nuclear Magnetic Resonance (NMR), we assigned the backbone chemical shifts of 14-3-3σ. We then studied the 14-3-3/phosphorylated Tau interaction and found that Tau binds strictly within the amphipathic binding grove of 14-3-3 and can anchor in both monomers of the 14-3-3 dimer. We also studied the 14-3-3/p53 interaction and showed by NMR, that intramolecular interactions within the peptide define a conformation that drives the affinity towards 14-3-3. 2019We then focused on the optimization of NMR assays for screening and characterization of the effect of small-molecules binding to 14-3-3 or 14-3-3 complexes with target’s phosphopeptides. We used, for example, phospho-mimetic peptides to inhibit the Tau/14-3-3 interaction. In a different strategy, we screened a fragment library against 14-3-3σ and found three hits binding to different regions of the protein. Using our NMR assays we further characterized small molecules binding 14-3-3 complexes with, for example, p53 and p65 peptides and demonstrated the stabilization capacity of some compounds

De nombreuses protéines ou domaines de protéines sont intrinsèquement non structurés/désordonnés (IUPs), mais possèdent néanmoins des fonctions diverses et importantes in vivo. La technique de choix pour étudier les IUPs est la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN). Cependant, pour obtenir de l'information à partir des différentes expériences de RMN possibles, les spectres doivent d'abord être attribués. Pour faciliter cette attribution, un outil graphique, semi-automatique qui utilise le concept des plans produit et somme a été développé. Cet outil a permis l'étude de deux IUPs individuelles, Tau et NS5A VHC. Les résonances RMN du squelette et des Cb ont été attribuées entièrement pour deux fragments de Tau (F3 et F5) et partiellement pour Tau entier P301L. Ces attributions RMN de Tau pourraient mener à davantage de compréhension sur le comportement structural de cette protéine quand elle se lie à, ou polymérise des microtubules. Aussi la formation des agrégés de Tau, qui est une des caractéristiques de la maladie d'Alzheimer, pourrait être étudiée plus en détail. Dans un deuxième temps, la protéine non structurale 5A (NS5A) du virus de l'Hépatite C (VHC) a été étudiée. Les propriétés structurales du deuxième et troisième domaine (sur trois) de cette protéine ont été évaluées. De la structure hélice alpha résiduelle a été observée, ce qui pourrait indiquer des régions prédisposées à interagir avec d'autres partenaires cellulaires. On a également examiné l'interaction entre CypA et CypB et les domaines D2 et D3 de NS5A, car ces PPIases pourraient jouer un rôle dans la réplication de VHC
Many proteins and protein regions have been shown be intrinsically unstructured/disordered (IUPs) and still carry out diverse and important functions in vivo. The technique of choice for studying IUPs is Nuclear Magnetic Resonance (NMR). However, to be able to obtain information of many possible NMR spectra, these must first be assigned. This process is complicated in the case of IUPs by the increased amount of signal overlap. To facilitate the assignment, a graphical semi-automatic assignment tool using the concept of product and sum planes was developed. Using this tool, the study of individual IUPs by NMR became conceivable. A first considered IUP is human Tau. The backbone and Cb resonances have been fully assigned for two Tau fragments (F3 and F5) and partially assigned for full-length Tau P301L. These NMR assignments of Tau could eventually lead to more insight in the structural behaviour of the protein upon its binding to or polymerisation of microtubules, and in its aggregated form which is observed to be one of the hallmarks of Alzheimer's disease. Secondly, the Hepatitis C virus (HCV) non-structural protein 5A (NS5A) was considered. The structural properties of both the second and third domain (out of three) of this protein have been assessed and some residual a-helical structure was observed, which could be indicative of regions prone to interaction with other cellular partners. We have also examined the interaction between both CypA and CypB and the domains D2 and D3 of NS5A, as these PPIases might be involved in HCV replication

La compréhension de la fonction des protéines et des systèmes biologiques passe par une connaissance fine des mécanismes moléculaires sous-jacents. La cristallographie et la résonance magnétique nucléaire permettent d'appréhender ces mécanismes au niveau atomique en fournissant des informations sur la structure et sur la dynamique des macromolécules biologiques. Nous nous sommes ainsi intéressés à deux protéines, la lipase lip2 de la levure Yarrowia lipolytica et la protéine membranaire OmpA de la bactérie Klebsiella pneumoniae. Nous avons recherché des conditions d'expression de la protéine lip2 marquée uniformément ou spécifiquement sur une boucle (appelée " lid ") afin d'en étudier la dynamique. Des conditions de marquage uniforme à l'azote 15 de lip2 recombinante dans Yarrowia lipolytica ont été mises au point, mais le marquage acide aminé spécifique n'a pu être réalisé à cause de phénomènes de dilution isotopique trop importants dans cette levure. Nous avons résolu par cristallographie aux rayons X la structure du domaine C-terminal de la protéine OmpA et étudié sa dynamique en solution par RMN (techniques de relaxation 15N). Nous avons caractérisé la dynamique de son domaine N-terminal membranaire reconstitué en liposomes par RMN du solide : en utilisant la rotation à l'angle magique à 60kHz et à la détection 1H sur un spectromètre 1 GHz, nous avons pu attribuer une majorité des résonances du tonneau ? et établir un profil de paramètre d'ordre des vecteurs NH. Des expériences de protéolyse ménagée ont révélé par ailleurs un site de coupure unique à la trypsine au sein de la boucle extracellulaire L3. Enfin, une première caractérisation de la protéine complète exprimée dans la membrane externe d'Escherichia coli a été entreprise par RMN du solide sur membranes externes natives
Understanding the function of proteins and biological systems requires an accurate knowledge of the underlying molecular mechanisms. Crystallography and nuclear magnetic resonance provide a detailed description of these mechanisms, with an atomic resolution, by providing data on both structures and motions. We investigated two proteins, the lip2 lipase from the yeast Yarrowia lipolytica and the membrane protein OmpA from the bacteria Klebsiella pneumoniae. We tried to produce lip2 with uniform and amino-acid specific stable isotope labelling on its functional loop (the lid) for NMR experiments. The homologous recombinant expression in Yarrowia lipolytica turned out to be the most efficient for uniform labelling but failed for specific labelling due to extensive isotope scrambling. We solved the structure of OmpA C-terminal domain by X-ray crystallography, and analyzed its dynamics in solution by NMR (15N relaxation techniques). We characterized its transmembrane N-terminal domain in proteoliposomes by solid state NMR: using state of the art ultra-fast MAS (60 kHz), 1H detection and a 1 GHz spectrometer, we could assign most ?-barrel resonances and establish a NH order parameter profile. In a complementary approach, we used proteolysis to reveal a unique trypsin cleavage site on the extracellular loop 3. Finally, a first characterization of the full-length protein expressed in the outer membrane of Escherichia coli was initiated by solid state NMR on intact outer membranes

Les TSPO forment une famille ancienne et hautement conservée à travers l’évolution de protéines à 5 domaines transmembranaires, que l’on retrouve aussi bien chez les animaux que les plantes, ou encore les bactéries. La TSPO animale (ou TSPO1), la plus étudiée des TSPO à ce jour, se trouve majoritairement dans les tissus stéroïdiens où sa fonction précise est controversée. Chez certaines espèces animales, il existe une isoforme, la TSPO2, localisée dans la membrane plasmique des globules rouges alors que la TSPO1 est mitochondriale. La fonction de la TSPO2 n’est pas bien caractérisée. La TSPO végétale, localisée dans le réticulum endoplasmique, possède une extension N-terminale que n’ont pas les TSPO animale et bactérienne. Elle semble être impliquée dans la régulation du stress, tout comme la TSPO bactérienne. Les études structure/fonction des différentes TSPO réalisées dans ce travail ont nécessité leur production par voie recombinante car elles sont naturellement peu abondantes.Nous avons produit la TSPO1 murine marquée 15N,13C par surexpression dans la bactérie E. coli. Puis la protéine purifiée en détergent (SDS et DPC) a été étudiée par différentes techniques (CD, fluorescence, RMN). L’ajout du ligand spécifique de la TSPO1, le PK11195, stabilise une conformation en DPC ce qui a permis en 2014 la résolution de sa structure, par RMN du liquide, par une équipe allemande. Afin d’étudier la TSPO1 dans un environnement plus proche de sa membrane native, nous l’avons reconstituée dans des liposomes DMPC/DMPE et étudiée par RMN du solide. Les 1ers résultats sont encourageants et ouvrent une nouvelle approche expérimentale pour la détermination de sa structure en présence et, plus particulièrement, en absence de ligand. La surexpression de la TSPO2 humaine dans la bactérie E. coli s’est avérée difficile et nous avons dû la réalisée par système acellulaire (cell-free). Les quantités obtenues par cette méthode permettent d’envisager le développement futur des études des relations structure/fonction.La production et la purification du Nter de la TSPO d’A. thaliana marqué 15N,13C ont permis la détermination de sa structure par RMN du liquide. Son interaction avec des lipides chargés mise en évidence par les études RMN, suggère une nouvelle fonction de l’AtTSPO dans le trafic lipidique
TSPO are five-transmembrane domain proteins that form a protein family highly conserved throughout evolution and that are found in animals as well as in plants and bacteria.Animal TSPO (referred to as TSPO1), the most studied TSPO, is highly expressed in tissues involved in steroid biosynthesis where its precise role remains controversial. In some animal species the presence of a less characterized TSPO isoform, TSPO2, has been reported. TSPO2 was found to be located in the plasma membrane of red blood cells whereas TSPO1 is located in mitochondrial outer membrane. Plant TSPO, which is located in the endoplasmic reticulum, possesses an N-terminal extension that is absent in bacterial and animal TSPO. This TSPO, along with the bacterial TSPO, seems to be involved in stress regulation.The structural and functional studies of TSPO proteins conducted in this work required their production through recombinant expression because they are naturally non-abundant proteins.We made use of E. coli to produce the recombinant 15N,13C-labelled mouse TSPO1. Then the protein purified in detergent was studied through several methods (CD, fluorescence, NMR). High-affinity binding of PK11195 to TSPO1 stabilizes a conformation in DPC, which made possible the structure determination of the protein in solution by NMR by a German team. We have incorporated TSPO1 into DMPC/DPME liposomes in order to provide a native-like environment and we then studied it by solid-state NMR. Preliminary results are encouraging and open up a new approach for TSPO1 structure determination in presence or in absence of ligand.Human TSPO2 overexpression in E. coli proved to be difficult and we therefore use the cell-free method. The amounts we obtained by this method allows us to consider future developments of structurefunction relationship studies.Production and purification of 13C,15N labelled N-terminal of A. thaliana TSPO have made it possible to determine its structure by liquid state NMR. Interaction of this peptide with charged lipids revealed by NMR, suggests a new fonction of AtTSPO in lipid trafficking

De nombreuses fonctions cellulaires essentielles telles que la traduction, l'épissage, la biogenèse des ribosomes et la réplication des télomères font appels aux particules RNP non codantes. La biogenèse de ces dernières chez les eucaryotes est un processus très complexes qui fait intervenir de nombreux facteurs cellulaires. La biogenèse du ribosome nécessite au moins 150 facteurs. Ceux-ci sont importants pour faciliter mais également contrôler la biogenèse de cette machinerie cellulaire essentielle qu'est le ribosome. Parmi ces facteurs, nous avons les snoRNP à boîtes C/D. Ces RNP sont impliqués dans la maturation des pré-ARNr (méthylation post-transcriptionnelle des riboses et clivages endonucléolytiques). Récemment notre laboratoire a participé à la découverte de facteurs d'assemblage de ces RNP. Il s'agit entre autre des protéines Rsa1p, du complexe R2TP (Rvb1p, Rvb2p, Tah1p et Pih1p) et de Hit1p chez la levure Saccharomyces cerevisiae. En utilisant une approche de co-expression à haut débit, nos travaux ont révélé un réseau complexe d'interactions entre les protéines constitutives des snoRNP et leurs facteurs d'assemblage. Couplé à une stratégie de protéolyse ménagée, la co-expression nous a permis d'obtenir des sous-complexes protéiques Snu13p/Rsa1p et Rsa1p/Hit1p qui font actuellement l'objet d'une étude structurale par RMN. En collaboration avec l'équipe de F. Allain (ETH Zurich), nous avons également déterminé la structure tridimensionnelle de la protéine Tah1p, ainsi que de son complexe avec le peptide C-terminale de la protéine chaperonne Hsp90 à haute résolution. Ces travaux ont révélé un mode d'association particulier entre le domaine TPR de la protéine et le peptide
A lot of essential cellular functions like translation, splicing, ribosome biogenesis and telomere replication need the activity of non coding RNPs. The biogenesis of non coding RNPs in eukaryotes is a complex pathway involving numerous cellular factors. For instance, ribosome biogenesis requires more than 150 factors. They are important to facilitate and to control the biogenesis of this essential cellular machinery. These factors include the C/D box snoRNPs. These RNPs are involved in pre-rRNA maturation (post-transcriptional ribose methylation and endo-nucleolytic cleavages). Recently, our laboratory participated to the discovery of snoRNP assembly factors: the Rsa1p protein, R2TP complex (Rvb1p, Rvb2p, Tah1p and Pih1p) and Hit1p in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Using a high throughput co-expression approach, we deciphered a network of interactions between RNP core proteins and the assembly factors. Coupled with a limited proteolysis strategy, the co-expression method allowed us to obtain proteins sub-complexes Snu13p/Rsa1p and Rsa1p/Hit1p which are currently studied by NMR. In collaboration with the F. Allain team (ETH Zurich), we also determined the tridimensional structure of protein Tah1p and its complex with the chaperon Hsp90 C-terminal peptide at high resolution. The data obtained reveal a particular mode of association of the Tah1p TPR domain with the Hsp90 peptide

L’inflammation joue un rôle central dans la rupture des membranes fœtales (MF), que celle-ci ait lieu à terme ou prématurément, mais l’ensemble des mécanismes reste encore à élucider. Dans ce contexte, les études sur les inflammasomes, un des acteurs clés de l’inflammation, se sont récemment intensifiées. Ces plateformes intracellulaires, formées suite à un signal pro-inflammatoire, sont impliquées dans la mise en place et la propagation d’une réaction inflammatoire. Leur fonction au sein des MF commence à être décrite mais de nombreuses zones d’ombre persistent. L’objectif de ce travail a donc été de compléter la caractérisation des processus inflammatoires dépendant des inflammasomes dans les MF, en se focalisant sur les inflammasomes de type NLRP.Les inflammasomes NLRP sont constitués d’un récepteur NLRP, de l’adaptateur ASC et de la pro-caspase-1. Après avoir vérifié la présence de ces acteurs dans les MF à terme, un intérêt particulier a été porté à l’inflammasome de type NLRP7. En effet, sa fonction a déjà été étudiée dans la sphère placentaire mais jamais dans les MF. La stimulation de cellules épithéliales amniocytaires primaires avec un ligand spécifique de l’inflammasome NLRP7 a permis de montrer (i) l’augmentation du niveau protéique des trois acteurs de cet inflammasome (NLRP7, ASC et pro-caspase-1), (ii) la formation de l’inflammasome par co-localisation entre NLRP7 et ASC, (iii) l’activation de cet inflammasome montré par le clivage de deux effecteurs terminaux, la pro-caspase-1 et la gasdermine D. Ces résultats indiquent pour la première fois que les MF sont capables de mettre en jeu la signalisation de l’inflammasome NLRP7 en réponse à un signal pro-inflammatoire.En parallèle, deux activateurs naturels de l’inflammasome NLRP7 ont été identifiés pour la première fois dans les MF humaines à terme : il s’agit de Mycoplasma salivarium et Mycoplasma fermentans. Leur présence suggère le fait que l’inflammasome NLRP7 puisse jouer un rôle majeur dans les processus inflammatoires au sein des MF. L’ensemble de ce travail suggère donc fortement l’implication de l’inflammasome NLRP7 dans la physiopathologie de la rupture des membranes fœtales humaines, qui pourrait être une cible thérapeutique potentielle pour prévenir les ruptures prématurées des membranes fœtales
Inflammation plays a pivotal role in term or preterm fetal membranes (FM) rupture, but the detailed mechanisms remain unclear. In this context, studies on inflammasomes, one of the key inflammation actors, recently intensified. These intracellular platforms, formed following a pro-inflammatory signal, are involved in the establishment and propagation of an inflammatory reaction. Their functions in FM begin to be described but grey areas remain. Thus, the aim of this work was to complete the characterization of inflammasomes-dependent inflammatory processes, focusing on NLRP inflammasomes.NLRP inflammasomes are composed of a NLRP receptor, the adapter ASC and the pro-caspase-1. After verifying the presence of these actors in term human FM, we focused our interest on NLRP7 inflammasome. Indeed, its function has been studied in the placental area but never in FM. The stimulation of primary amnion epithelial cells with an NLRP7 inflammasome specific ligand demonstrated (i) an increased protein level of the three actors of this inflammasome (NLRP7, ASC and pro-caspase-1), (ii) the formation of this inflammasome by NLRP7 and ASC colocalization and (iii) the activation of this inflammasome, by cleavages of two end-effectors, pro-caspase-1 and gasdermin D. These results indicate for the first time that FM are able to activate NLRP7 inflammasome signalization in response to a pro-inflammatory signal. Moreover, two natural activators of NLRP7 inflammasome have been newly identified in term human FM: Mycoplasma salivarium and Mycoplasma fermentans. Their presence suggests that NLRP7 inflammasome could play an essential role in inflammatory processes in FM. All this work strongly suggests the involvement of NLRP7 inflammasome in pathophysiology of human FM rupture, which could be a potential therapeutic target to prevent premature rupture of FM

RMN à l'état solide est devenue un outil de premier plan pour la caractérisation morphologique, structurale et dynamique de protéines microcristallines, de matériaux polymères, synthétiques ou naturels, de petites molécules d’intérêt pharmaceutique ou des minéraux. Les progrès dans la compréhension de la structure et de la dynamique des systèmes moléculaires à l’état solide sont très fortement dépendants des méthodologies mises en œuvre dans leurs études. Cette thèse s’inscrit dans cette optique en portant l’effort principal sur certains aspects méthodologiques de la RMN à l’état solide, avec comme objectif de développer des nouvelles approches ou améliorer les méthodes déjà utilisées et ceci afin d’extraire de façon optimale des informations spécifiques sur le système de spins étudié. Les études fondamentales de systèmes solides d’intérêt biologique, la mise au point de nouvelles méthodologies ainsi qu’une analyse méthodologique approfondie forment l’essentiel de cette thèse ayant pour le dénominateur commun une amélioration de la sensibilité des expériences RMN à l’état solide. Le mémoire de thèse présente dans sa première partie de nouvelles approches dans les études structurales et dynamiques des protéines microcristallines, membranaires et fibrillaires ainsi qu’une étude dynamique et conformationnelle des chaines phospholipidiques dans les liposomes. La deuxième partie est essentiellement concentrée sur une analyse détaillée de certains aspects méthodologiques de la RMN du solide en relation avec le découplage dipolaire hétéronucléaire, indispensable dans l’obtention des spectres de haute résolution
NMR in the solid state has become a major tool for morphological characterization, structural and dynamic microcrystalline proteins, polymers, synthetic or natural materials, small molecules of pharmaceutical interest or minerals. Progress in understanding the structure and dynamics of molecular systems in the solid state are very heavily dependent on methodologies implemented in their studies. This thesis in this context carrying the main effort on certain methodological aspects of NMR in the solid state, with the goal of developing new approaches and improve the methods already used and in order to extract optimum specific information on the spin system under study. The fundamental studies of solid biologically relevant systems, the development of new methodologies and a thorough methodological analysis form the core of this thesis with the common denominator for an improvement of the sensitivity of NMR experiments in solid state. The thesis presents the first part of new approaches in structural and dynamic studies microcrystalline proteins, membrane and fibrillar and a dynamic study and conformational channels in phospholipid liposomes. The second part is mainly concentrated on a detailed analysis of some methodological aspects of solid state NMR related heteronuclear dipolar decoupling essential in obtaining high resolution spectra

Les chaperonines sont des chaperonnes moléculaires indispensables pour le repliement de certaines protéines dans les cellules. La taille et la complexité de ces machineries biologiques rendent complexes l'étude de leurs propriétés structurales et fonctionnelles. La spectroscopie RMN permet de suivre des changements structuraux et dynamiques en temps réel avec une résolution atomique. Cependant, l'étude par RMN de protéines ou de complexes de haut poids moléculaires a été un challenge pendant de nombreuses années. Dans la première partie de cette thèse, il a été montré que la combinaison de marquage spécifique des groupements méthyles, d'expériences RMN optimisées et de microscopie électronique peut être utilisée pour suivre différents états du cycle fonctionnel d'une chaperonine de 1 MDa. Pour étudier ce mécanisme, la chaperonine native a été reconstituée avec un marquage des groupements méthyles des méthionines et valines. Les résidus méthionines ont pu être utilisés comme des sondes pour identifier les spectres RMN correspondant aux états intermédiaires et aux espèces actives du cycle fonctionnel. Grâce à ces sondes il a été possible de suivre en temps réel les réarrangements structuraux correspondant aux différentes conformations de la chaperonine durant son cycle fonctionnel. La seconde partie traite de la caractérisation de l'interaction de la chaperonine avec une protéine cliente dépliée. L'observation de la stabilisation de l'état déplié de la protéine par la chaperonine a permis de mettre en évidence une activité de "holdase" de la chaperonine. En utilisant une combinaison astucieuse de différents marquages de groupements méthyles et d'expériences RMN optimisés pour des assemblages de haut poids moléculaire, il a été possible d'observer le repliement de cette protéine par la chaperonine et les effets de la présence d'une protéine dépliée sur le cycle fonctionnel de la chaperonine en action
Chaperonins are essential molecular chaperons for the refolding of proteins in the cells. Size and complexity of these biological machineries make complex the study of their structural and functional properties. NMR spectroscopy offers an unique ability to monitor structural and dynamic changes in real-time and at atomic resolution. However, the NMR studies of large proteins and complexes has been a real challenge for a long time. In the first part of this thesis, it has been shown that the combination of methyl specific labeling, optimized NMR spectroscopy for large assemblies and electron microscopy can be used to monitor the different states of the functional cycle of a 1 MDa chaperonin. To study this mechanism, the native chaperonin was reconstituted with a labeling of the methionines and valines methyl groups. Methionines residues have been used as probes to identify the NMR spectra corresponding to intermediates states and active species of the functional cycle. Thanks to theses probes, it has been possible to follow in real time the structural rearrangements corresponding to the different conformations of the chaperonin during its functional cycle. The second part deals with the characterization of the interaction between the chaperonin and an unfolded protein. Observation of the stabilization of the unfolded protein by the chaperonin allowed to identify the holdase activity of the chaperonin. Using a clever combination of a differential methyl labeling and optimized NMR spectroscopy for large assemblies, it has been possible to follow the refolding of the unfolded protein by the chaperonin and the effects of the unfolded protein on the functional cycle of the chaperonin in action