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Tesi sul tema "Petite protéine"
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Rouhana, Jad. "Etude et modulation des interactions protéine-protéine : l’activation de la petite protéine G Arf1 par son facteur d’échange Arno". Thesis, Montpellier 1, 2013. http://www.theses.fr/2013MON13507/document.
Testo completoAbstract (sommario):
Arf1 est une petite protéine G (pG), essentiellement impliquée dans le trafic vésiculaire. Arf1 oscille entre deux conformations, l'une active liée au GTP et l'autre inactive associée au GDP. Arno est un des facteurs d'échange (GEF) capable d'activer Arf1 en stimulant l'échange GDP/GTP. Suractivée dans les cellules invasives du cancer du sein, Arf1 joue un rôle important dans la migration et la prolifération des cellules cancéreuses.Le but de ma thèse s'inscrit dans l'étude et la modulation de l'interaction pG-GEF, et plus spécifiquement, le couple Arf1-Arno. Mon travail a été planifié autour de deux axes: (1) L'étude fine de l'interaction entre Arf1 et Arno, et sa modulation avec un inhibiteur connu la Bréféldine A (BFA). (2) La mise en place d'une stratégie de conception d'inhibiteurs de l'interaction protéine-protéine du couple Arf1-Arno.Dans un premier temps, nous avons mis en place une méthode basée sur la résonance plasmonique de surface (SPR) permettant la détermination des paramètres cinétiques de l'interaction entre Arf1 et Arno. Nous avons précisé aussi les conséquences des partenaires allostériques (GDP, GTP, et Mg2+) et de la BFA sur les paramètres cinétiques de l'interaction. Ceci a permis une analyse fine de la régulation allostérique et du mode d'action de la BFA. Appliquée à d'autres inhibiteurs, cette méthode permettra d'examiner leur mécanisme d'inhibition.Dans la deuxième partie j'expose, la stratégie que nous avons utilisé pour la conception rationnelle d'inhibiteur de l'interaction entre Arf1 et Arno. Elle est basée sur le criblage virtuel de fragments au niveau des résidus clé « hotspots » de l'interaction, la validation des molécules-touches par des techniques biophysiques, et l'élimination de molécules artefacts. Les structures des complexes fragments-Arno ont été résolues, ce qui confirme la validité de cette stratégie ouvrant la voie vers l'optimisation moléculaire pour obtenir des inhibiteurs plus efficacesArf1 is a small GTPases, essentially involved in the vesicular traffic. Arf1 switch between two conformations, an active form bound to GTP and an inactive form bound to GDP. Arno is one of the exchange factors (GEF) that can activate Arf1, through its catalytic Sec7 domain, promoting the exchange of GDP by GTP. Activated in breast cancer cells, Arf1 plays an important role in the migration and proliferation of cancer cells.The aim of my thesis was the study and the modulation of the interaction between small G proteins and their GEFs, more precisely the Arf1-Arno interaction. My work has been planned around two axes: (1) the study of the interaction between Arf1 and Arno, and its modulation with a known inhibitor Brefeldin A (BFA). (2) The development of a rational strategy for designing inhibitors of protein-protein interaction for the Arf1-Arno complex.In the first part of my PhD work, we set up a Surface Plasmon Resonance (SPR) method allowing to determine the kinetic parameters of the interaction between Arf1 and Arno. We also studied the effects of allosteric partners such as GDP, GTP and Mg2+ as well as the known uncompetitive inhibitor (Brefeldin A). This SPR approach allowed a very informative analysis at qualitative and quantitative levels of the various complexes taking place during the exchange reaction that should help to solve the inhibitory mechanism for the known inhibitors reported in the literature. In the second part of my thesis, we propose a strategy for targeting the interaction between Arf1and Arno. This approach is based on virtual screening of fragments at hotspot regions. Using biophysical techniques such fluorescence techniques, SPR, NMR and X-Ray crystallography, we identified and validated Hits, showing by crystallographic structural data their modes of interaction with the target protein Arno. A fluorescence polarization test was also developed to identify false positive fragments to eliminate promiscuous aggregators. Taken together, our work proposes a method based on SPR allowing the study of known inhibitors of GEFs, understanding at molecular level their mode of action. We also propose a general strategy for finding Hit fragments that designing competitive inhibitor of the interaction small G protein with its GEFs, that can be the scaffold for designing more powerful inhibitors
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Ben, Hamida-Rebaï Meriam. "Etude du mécanisme d'activation de la petite protéine G ArF1". Paris 7, 2009. http://www.theses.fr/2009PA077042.
Testo completoAbstract (sommario):
Arf 1 appartient à la grande famille des petites protéines G. Ces protéines sont impliquées dans un grand nombre de processus cellulaires fondamentaux tels que la transduction du signal, le réarrangement du cytosquelette et la formation des vésicules de transport. Elles ont la caractéristique d'alterner dans la cellule entre une forme inactive liée au GDP et une forme active liée au GTP. L'activation de Arf 1 nécessite l'éjection du GDP au profit de la fixation du GTP. Elle est catalysée par les facteurs d'échanges (GEFs) alors que l'inactivation est régulée par les protéines GAP. Notre étude porte sur l'utilisation de simulations de dynamique moléculaire pour comprendre le mécanisme d'activation de Arf1 et plus précisément le rôle du facteur d'échange dans le mécanisme d'éjection du nucléotide. Pour cela, des simulations de dynamique moléculaire sous contraintes RMSD puis sous contraintes de distance du complexe Arfl-GDP-GEF ont été établies. Ainsi, nous avons mis en évidence que certains résidus et changements conformationnels du facteur d'échange étaient impliqués dans le mécanisme d'activation. Un autre volet de cette thèse a consisté à étudier le rôle du magnésium dans le mécanisme d'activation de Arfl. Les résultats que nous avons obtenus montrent que cet ion bivalent stabilise les phosphates du GDP dans leur site de fixation, De plus, il empêcherait par déstabilisation électrostatique le rapprochement de certains résidus du facteur d'échange impliqués dans l'éjection du nucléotide. Ce cation semblerait donc devoir s'éloigner du nucléotide pour permettre au facteur d'échange déjouer son rôle catalytiqueArf1 is a member of the small-G-protein superfamily. Small G proteins are involved in various cellular functions such as signal transduction, cytoskeletal rearrangement and formation of transport vesicles. Small G proteins cycle in the cell between an inactive GDP-bound form and an active GTP-bound form. Activation of Arf1 occurs by GDP/GTP exchange. The activation reaction is catalyzed by exchange factors (GEFs) whereas inactivation is regulated by proteins of the GAP family. In our work, we used molecular dynamics simulations to better understand the mechanism of activation of Arf1 and the role of exchange factors in GDP ejection. We developed restrained molecular dynamics approaches to study GDP extraction from the Arf 1-GDP-GEF complex as well as the related conformational transition. We identified key residues and conformational changes involved during in the activation process. These methods also permitted a better understanding of the role of the magnesium ion in the mecanism of Arf1 activation. Our results showed that Mg ion stabilizes the GDP phosphates in the Arf1 binding site. In addition, it seemed to prevent the approach of critical residues in the exchange factor necessary for nucleotide ejection because of electrostatic destabilisation. It would seem to be necessary that this cation dissociate in order to permit the exchange factor to play its catalytic role in nucleotide ejection
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Bruey, Jean-Marie. "Rôle de la petite protéine de stress HSP27 dans l'apopotose et la tumorigénèse". Dijon, 2001. http://www.theses.fr/2001DIJOMU01.
Testo completoAbstract (sommario):
Les protéines de choc thermique,[ou] protéines de stress, ont été identifiées [pour] leur capacité à protéger la cellule contre un certain nombre d'agressions. La petite protéine de stress HSP27. . . [a un] effet anti-apoptotique. . . Démontré. Cet effet s'exerce vis-à-vis de stimuli très variés, notamment. . . Vis-àvis de médicaments cytotoxiques. Nous avons étudié les mécanismes moléculaires de l'effet anti-apoptotique de la protéine HSP27 dans la lignée leucémique humaine U937, en utilisant l'étoposide, un médicament cytotoxique couramment utilisé en chimiohthérapie, comme stimulus apoptotique. Nous avons d'abord montré que l'effet anti-apoptotique. . . S'exerçait en aval de la mitochondrie et en amont de l'activation de la caspase-9. Puis, nous avons prouvé que cet effet était la conséquence d'une interaction directe rt spécifique d'HSP27 avec le cytochrome c dans le cytosol. .[Pas de résumé en anglais]
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Bouvet, Samuel. "Lipides et trafic : rôles de GBF1, facteur d’échange de la petite protéine G Arf1". Thesis, Paris 11, 2013. http://www.theses.fr/2013PA112172/document.
Testo completoAbstract (sommario):
La cellule eucaryote compartimentalise ses tâches au sein d’organelles communiquant les unes avec les autres au moyen de vésicules de transport. Le trafic vésiculaire est contrôlé par des petites protéines G de la superfamille Ras, activées par un changement de nucléotide guanidique catalysé par un facteur d’échange (GEF). En particulier, au niveau du cis-Golgi la petite protéine G Arf1 est activée par GBF1, permettant le transport rétrograde des vésicules COPI vers le réticulum endoplasmique. Récemment, GBF1 a été impliqué dans d’autres fonctions, notamment dans le cycle réplicatif de certains virus ou dans le métabolisme des gouttelettes lipidiques.Les gouttelettes lipidiques sont les organelles ubiquitaires du stockage des lipides et ont un rôle majeur dans l’homéostasie des lipides à l’échelle de la cellule. Le trafic intracellulaire des ces organelles dynamiques serait contrôlé par des petites protéines G. Notre équipe à montré dans une précédente étude que GBF1 est localisé sur les gouttelettes lipidiques et est impliqué dans le recrutement de PLIN2 et de la lipase ATGL sur les gouttelettes lipidiques. Cette thèse montre, par des études de biologie cellulaire et de microscopie, que GBF1 possède un domaine de fixation aux phospholipides via une hélice amphipatique. Cette hélice est nécessaire et suffisante pour l’association aux gouttelettes lipidiques in cellulo. La régulation de la localisation de GBF1 repose sur l’interaction avec Rab1B (cascade entre Rab1 et Arf1 dans la voie sécrétoire précoce) ainsi que sur les interactions intramoléculaires entre les différents domaines de GBF1The eukaryotic cell physically separates its functions within several membrane-bound organelles, which communicate using vesicles. Vesicular trafficking is under the control of small GTPases that exist as an inactive GDP-bound form and an active GTP-bound form. The switch between GDP and GTP is catalyzed by a guanine nucleotide exchange factor (GEF). On cis-Golgi membranes, Arf1, activated by the large GEF GBF1, recruits the COPI coat. COPI coated vesicles ensure the retrograde transport from the Golgi to the ER. Recently, GBF1 has been implicated in other pathways, such as the life cycle of various viruses and lipid droplet metabolism.Lipid droplets (LD), the major lipid storage organelle, play a major role in lipid homeostasis within the cell. LDs are connected to membrane trafficking and are therefore under the control of GTPases. In previous studies, our team showed that GBF1 localizes around LDs and that it is required for protein loading onto the LD surface. Here, data support the idea that GBF1 localizes to the LD surface. Using cell biology tools and microscopy, we identified, within GBF1, a lipid binding domain. In this domain, a single amphipathic helix is necessary and sufficient for LD targeting in cells. The regulation of GBF1 localization relies on interaction with Rab1 (data support a Rab1-Arf1 cascade between the ER and the Golgi) and on intramolecular interactions between GBF1 domains
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Desrames, Alexandra. "Etude de la structure de la petite protéine d'enveloppe du virus de l'hépatite B". Paris 7, 2014. http://www.theses.fr/2014PA077161.
Testo completoAbstract (sommario):
L'infection chronique par le virus de l'hépatite B (HBV) reste un problème de santé publique majeure à l'échelle mondiale puisqu'elle touche près de 300 millions d'individus. Le HBV est un virus à ADN de la famille des Hepadnaviridae, dont l'enveloppe du virion est composée de lipides d'origine cellulaire et de glycoprotéines transmembranaires de trois types, S-, M- et L-AgHBs. La protéine S- AgHBs, majoritaire dans l'enveloppe virale, est l'élément moteur de l'assemblage, et elle porte dans le domaine exposé à la surface des particules virales, un déterminant immunodominant appelé "déterminant- a" contre lequel la majorité des anticorps neutralisants sont dirigés. Ce déterminant antigénique est intimement associé à un déterminant du caractère infectieux qui assure l'interaction avec les sulfates d'héparane à l'étape initiale d'entrée. A ce jour, nous possédons très peu d'information sur la structure de la boucle antigénique (BAG) de la protéine S-AgHBs qui sous-tend le caractère antigénique et fonctionnel d'entrée virale. L'objectif du travail de thèse était d'obtenir des informations sur l'organisation tridimensionnelle du polypeptide BAG, afin de mieux comprendre son rôle à l'étape d'entrée virale. La première étape a été de déterminer la sous-unité minimale de l'enveloppe des particules virales, qui porte le déterminant-a, en utilisant une série d'anticorps monoclonaux spécifiques de ce déterminant. Nous avons montré que la plupart des anticorps étaient bien spécifiques d'épitopes conformationnels, qu'ils étaient neutralisants, et qu'ils réagissaient avec des formes dimériques de protéines S-AgHBs. La majorité des épitopes du déterminant-a sont donc présents sur des dimères de protéines S-AgHBs solubles. De plus, nous avons mis en évidence la présence de deux isoformes de dimères à la surface des particules virales, que nous pouvons distinguer par leur comportement électrophorétique en gel SDS et par leur réactivité avec les anticorps monoclonaux. Nous pensons que les deux isoformes de protéines S-AgHBs correspondent à deux combinaisons de ponts disulfures inter- ou intra-chaînes entre les nombreux résidus cystéine de la BAG. Dans le but d'obtenir des préparations homogènes et pures de dimères de protéines S-AgHBs comme substrat de cristallisation, nous avons suivi plusieurs stratégies : la production de la protéine S- AgHBs par traduction in vitro, la production dans Escherichia coli, et la purification de particules virales à partir de surnageant de culture de cellules Huh-7 ou de plasmas infectieux. La stratégie de purification de particules produites en culture de cellules Huh-7 est apparue la plus fiable en termes de qualité et rendement, et la plus adaptée à l'analyse de mutants de la protéine S-AgHBsChronic infection with the hepatitis B virus (HBV) represents a major public health concern worldwide because an estimated 300 million individuals are affected. HBV is the prototype of the Hepadnaviridae family, a DNA virus with an envelope consisting of cell derived lipids associated to three types of transmembrane glycoproteins: S-, M- et L-HBsAg. S-HBsAg, the most abundant in the viral envelope, is the driving force of viral particle assembly, but it also bears in its ectodomain, an immunodominant determinant, referred to as the a-determinant, against which most of the neutralizing antibodies are directed. This antigenic determinant is also closely associated to an infectivity determinant responsible for interacting with cell surface heparan sulfate at the initial step of viral entry. As of today, we have little information on the structure of the antigenic loop (AGL) of the S-HBsAg protein that underlies the antigenic and function at viral entry. The aim of this thesis project was to gather information on the three dimensional organization of the AGL polypeptide, for a better understanding of its function at viral entry. The first step of the study was to identify the minimum subunit of the viral envelope, which bears the a-determinant. This was achieved using a panel of monoclonal antibodies that are specific for the a-determinant. We have shown most of the antibodies were: i) directed to conformational epitopes, ii) neutralizing, and iii) reactive with the dimeric forms of S-HBsAg. We concluded that most of a-determinant epitopes are conserved on the soluble dimeric forms of S-HBsAg. Furthermore, we demonstrate the presence in the HBV envelope, of two isomers of S- HBsAg dimers, which can be separated by SDS-PAGE and identified by isomer-specific antibodies. We propose that the two isomers correspond to two distinct networks of disulfide bonds between the numerous AGL cystein residues. In an effort to obtain pure and homogenous preparations of S-HBsAg dimers, as substrate for crystallization, we adopted several strategies: i) production of S-HBsAg by in vitro translation, ii) production in E. Coli, and iii) the purification of viral particles from transfected Huh-7 cell culture medium or from infectious plasmas. The purification of S-HBsAg dimers from cell culture-derived particles clearly appeared as the strategy of choice, in terms quality and yield, and flexibility of the approach in case of S- HBsAg mutants analysis
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Lebreton, Stéphanie. "Étude de la petite protéine G XralB au cours du développement embryonnaire de Xenopus Laevis". Paris 6, 2002. http://www.theses.fr/2002PA066216.
Testo completo
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Duverger, Olivier. "Etude du rôle de la petite protéine de choc thermique HSP25 dans la différenciation cellulaire". Paris 6, 2003. http://www.theses.fr/2003PA066104.
Testo completo
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Steuve, Séverine. "Contribution à la caractérisation de la Rhophiline-2, un nouveau partenaire d'une petite protéine G Rho". Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2006. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/210750.
Testo completo
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Moutaoufik, Mohamed Taha. "Étude de la structure et de la fonction de la petite protéine de choc thermique DmHsp27". Doctoral thesis, Université Laval, 2017. http://hdl.handle.net/20.500.11794/30306.
Testo completoAbstract (sommario):
Les petites protéines de choc thermique (sHsps : small heat shock proteins) sont présentes en nombre variable dans tous les organismes. Le génome de Drosophila melanogaster encode 12 sHsps, avec une expression au cours de développement, une localisation intracellulaire et une spécificité de substrats différents. DmHsp27 est l’une des rares sHsps à avoir une localisation nucléaire avant et après un choc thermique. Cette localisation nucléaire est inhabituelle, d’autant plus qu’aucune fonction spécifique de cette protéine n’a encore été identifiée. Les mécanismes responsables de la localisation nucléaire de DmHsp27 ainsi que sa probable fonction dans le noyau restent peu connus. L’étude des orthologues de DmHsp27 chez les insectes a permis de déterminer que la localisation nucléaire n’est pas spécifique à DmHsp27 et d’autres sHsps chez les insectes présentent le même signal de localisation nucléaire que DmHsp27. Le réseau d’interaction de DmHsp27 nous laisse croire que cette protéine ne joue pas seulement le rôle de chaperon moléculaire, mais qu’elle est probablement impliquée dans différents processus nucléaires. Au niveau structurel, contrairement aux sHsps chez les métazoaires, DmHsp27 forme deux populations d'oligomères non en équilibre. Des mutations indépendantes de trois arginines hautement conservées au niveau du domaine alpha-cristallin (R122, R131 et R135) à la glycine affectent l’oligomérisation par formation d’une seule population de grand poids moléculaire. In vitro, l'activité de chaperon de DmHsp27WT est comparable à celle de ses deux populations isolées et à celle des mutants R122G, R131G et R135G utilisant la luciférase comme substrat. Cependant, dans un essai de protection contre l’aggrégation de l’insuline, l'activité de chaperon de DmHsp27 est inférieure à celle des mutants R122G et R131G. Une stratégie de délétion et mutation a été utilsée pour étudier le rôle de la région N-terminale sur l’oligomérisation et la fonction chaperon de DmHsp27. Tel que déterminé par chromatographie d'exclusion et gel natif, des mutations au niveau de F29, G30 et G32 présentent des structures oligomériques différentes de celle du type sauvage. Aucun de ces mutants sauf l'élimination complète de la région N-terminale n’a montré une perte d'activité chaperon, suggérant un rôle important dans la reconnaissance et liaison de substrat. Étonnamment, les deux glycines (G30 et G32) conservées chez les orthologues de DmHsp27 agissent comme régulateurs négatifs de l'activité chaperon; leurs mutations améliorent grandement la prévention d’agrégation d’insuline. La différence du rendement de la protéine sauvage et des mutants G30R et G32R à prévenir l’agrégation de l’insuline à 20 °C et à 42 °C a permis d’établir un lien entre la structure et la fonction chaperon de DmHsp27 et de définir le mode d’action de DmHsp27 suite au stress thermique. En résumé, cette étude a permis de caractériser DmHsp27 et ses mutants au niveau du domaine alpha cristallin et de la région N-terminale et a donné un aperçu d’un nouveau mécanisme de protection contre l’agrégation des sHsps. Le rôle de chaperon moléculaire joué par DmHsp27 et son induction durant le développement embryonnaire laisse cependant présumer que cette protéine remplit d’autres fonctions cellulaires importantes.Small heat shock proteins are present in varying numbers in all organisms. In Drosophila melanogaster there are 12 sHsps, which have distinctive developmental expression patterns, intracellular localizations and substrate specificities. DmHsp27 is one of the very few sHsps that have a nuclear localization before and after heat shock. This nuclear localization is unusual, especially since no specific function has yet been identified. The mechanisms responsible for the nuclear localization of DmHsp27 and its function in the nucleus remain poorly understood. First, the study of DmHsp27 orthologs helped to determine that nuclear localization is not specific to DmHsp27 and other sHsps in insects have the same nuclear localization signal as DmHsp27. The DmHsp27 interaction network leads to believe that this protein does not only play the role of chaperone, but it is also involved in various nuclear processes. Second, unlike metazoan sHsps, DmHsp27 forms two populations of oligomers not in equilibrium. Mutations of highly conserved arginine residues in the ACD domain in mammalian sHsps has been reported to be associated with protein conformational defects and intracellular aggregation. Independent mutation of three highly conserved arginines (R122, R131 and R135) to glycine in DmHsp27 results in only one population of higher molecular weight form. In vitro, the chaperone-like activity of wild type DmHsp27 was comparable with that of its two isolated populations and to the single population of the R122G, R131G and R135G using luciferase as substrate. However, using insulin, the chaperone-like activity of wild type DmHsp27 was lower than that of R122G and R131G mutants. Finaly, we established the importance of the N-terminal region for oligomerization and we investigated the heat activation under in vitro experimental conditions using size exclusion chromatography and gradient native gels electrophoresis. By deletion strategy, we have examined the role of the N-terminal region and delineated a motif (FGFG) important for the oligomeric structure and chaperone-like activity of this sHsp. Deletion of the full N-terminal domain, resulted in total loss of chaperon-like activity; intriguingly deletion of the (FGFG) at position 29 to 32 or single mutation of G30R and G32R enhanced oligomerization and chaperoning capacity under non heat shock conditions using the insulin assay suggesting the importance of this site for chaperone activity. Unlike mammalian sHsps heat activation of DmHsp27 leads to enhanced dissociation/association of oligomers to form large structures about 1000 kDa. We suggest a new mechanism of heat activation for DmHsp27. In summary, this study characterized DmHsp27 and mutant in the alpha crystallin domain and the N-terminal region and provided an overview of a new protection mechanism. The role played by DmHsp27 as molecular chaperone and its induction during embryonic development, suggest that this protein may perform other important cellular functions
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Koraïchi, Faten. "Etude de l'activation de la GTPase RhoB par complémentation split-GFP tripartite". Thesis, Toulouse 3, 2016. http://www.theses.fr/2016TOU30081.
Testo completoAbstract (sommario):
RhoB est une petite GTPase rapidement activée par les facteurs de croissance et les stress cellulaires, qui régule des processus biologiques fondamentaux comme la migration, l'angiogenèse, la réparation de l'ADN, l'apoptose ainsi que la réponse à des thérapeutiques anticancéreuses. L'activité des petites GTPases est finement régulée par leur localisation subcellulaire. Cependant, l'activation de RhoB en cellules vivantes n'avait jamais été investiguée. Ce travail a permis d'adapter et de valider une méthode innovante d'analyse des interactions protéine-protéine par complémentation split-GFP tripartite, pour la détection sensible et spécifique de l'activation des petites GTPases en cellules vivantes. Nous avons ensuite développé un modèle cellulaire optimisé par la combinaison de la technologie split-GFP tripartite et d'un intracorps anti-GFP amplificateur de fluorescence, pour détecter la régulation de l'activation de RhoB avec une haute résolution spatiale. Ce biosenseur a mis en évidence la translocation de la forme active de RhoB en réponse au sérum à partir des endosomes pour s'accumuler au niveau de la membrane plasmique, révélant ainsi une nouvelle plateforme de signalisation membranaire de RhoB. Ce biosenseur permettra d'analyser le profil d'activation de RhoB et d'autres petites GTPases, sous d'autres stimulations ou dans différents contextes cellulaires, et d'identifier leurs partenaires et les modulateurs de leur activationRhoB is a small GTPase that is rapidly activated in response to growth factors and cellular stress. It regulates fundamental biological processes such as cell migration, angiogenesis, DNA repair, apoptosis and response to anticancer therapies. Small GTPases activity is tightly regulated by their subcellular localization. However, RhoB activation had never been investigated in living cells. In this work, we have adapted and validated an innovative method of protein-protein interactions analysis using tripartite split-GFP complementation, for the sensitive and specific detection of small GTPases activation in living cells. Then, we developed an optimized cellular model by combining the tripartite split-GFP technology with an anti-GFP intrabody fluorescence-enhancer to detect the regulation of RhoB activation with high spatial resolution. This biosensor highlighted the translocation of active RhoB from endosomes to accumulate at the plasma membrane upon serum stimulation, revealing a novel membrane signaling platform of RhoB. Future studies based on this biosensor will enable the analysis of RhoB activation profile and other small GTPases upon various stimuli or in different cellular contexts, as well as the identification of the GTPases partners and activation modulators
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Guimond, Marie-Odile. "Analyse moléculaire de la localisation cellulaire de la petite protéine de choc thermique Hsp27 de Drosophila melanogaster". Thesis, Université Laval, 2004. http://www.theses.ulaval.ca/2004/22332/22332.pdf.
Testo completoAbstract (sommario):
La petite protéine de choc thermique Hsp27 chez Drosophila melanogaster est localisée au noyau. Dans le but d’identifier la séquence peptidique responsable de cette localisation, la mutagenèse dirigée d’un signal potentiel de localisation nucléaire bipartite situé entre les acides aminés 42 et 59 a été effectuée, et les vecteurs obtenus ont été transfectés dans des cellules de mammifères HeLa. Il s’est avéré que la mutation des arginines 54, 55 et 56 de la protéine occasionne une diminution importante de la localisation nucléaire, bien qu’on observe toujours des résidus nucléaires localisés au niveau de structures granulaires. La localisation au niveau de structures granulaires est également observée avec la protéine sauvage. Des analyses avec des marqueurs de corps nucléaires ont donc été effectuées afin de déterminer si ces granules contenant Hsp27 correspondaient à des corps nucléaires connus. Il a été observé que la protéine colocalise avec le facteur d’épissage SC35 au niveau des "speckles" nucléaires. Ces observations s’avéreront utiles dans l’identification de fonctions pour la protéine Hsp27.
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Chaufour, Sylvain. "Fonctions de la petite protéine de stress humaine lors de traitements par des agents différenciants et chimiothérapeutiques". Lyon 1, 1997. http://www.theses.fr/1997LYO10148.
Testo completoAbstract (sommario):
Les petites protéines de stress (shsp) sont induites lorsque les cellules sont soumises à des perturbations physiologiques. Sur le plan biologique, l'activation des shsp conduit à protéger les cellules contre des stress physiques ainsi que contre l'action cytotoxique d'agents chimiques et de cytokines. Les shsp peuvent aussi influencer l'activité proliférative des cellules transformées. L'activité moléculaire des shsp reste cependant mal connue. L'objectif de ce travail a été de caractériser les modifications biochimiques subies par la petite protéine de stress humaine hsp27, ainsi que le rôle de cette protéine pendant la différenciation cellulaire et lors de traitements chimio thérapeutiques anticancéreux. Des expériences pratiquées sur la lignée cellulaire humaine hl-60 ont montre que la différenciation monocytaire et granulocytaire de ces cellules s'accompagne d'une augmentation de l'expression de la shsp humaine (hsp27) et de modifications biochimiques (phosphorylation et oligomérisation) de cette protéine. Une réduction partielle du taux d'hsp27, au moment de la différenciation, altère fortement la phase d'arrêt de la prolifération des cellules hl-60. Lors d'un traitement chimio thérapeutique par la doxorubicine, la surexpression de la protéine hsp27 peut être étroitement associée à un phénomène de résistance contre cet agent. La conception et l'utilisation de formes mutantes de la protéine hsp27 ont permis de montrer que la protection associée à hsp27 dépend de la capacité de la protéine a s'oligomériser mais reste indépendante de sa capacité à être phosphorylée. Au niveau moléculaire, hsp27 semble favoriser, de manière indirecte, la mise en place de mécanismes de détoxification et de défense des cellules contre l'action cytotoxique de la doxorubicine (réduction de l'accumulation de la dox et du fer, optimisation du système de détoxification lie au glutathion). Bien que la fonction moléculaire de la petite protéine de stress reste en grande partie controversée et mal définie, les données obtenues suite à ce travail tendent, à la lumière de certaines données bibliographiques, à accréditer une fonction de chaperon moléculaire exercée par hsp27, sous forme d'oligomères, en suggérant par ailleurs que la phosphorylation d'hsp27 régule activement l'état d'oligomérisation de la protéine.
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Stasia, Marie-José. "Purification, caractérisation de la protéine kinase C du neutrophile bovin et mise en évidence d'un substrat potentiel ayant les caractéristiques d'une protéine G de petite taille". Grenoble 1, 1990. http://www.theses.fr/1990GRE10041.
Testo completoAbstract (sommario):
Les neutrophiles de mammiferes contiennent une quantite de proteine kinase c (pkc) relativement importante. Les esters du phorbol (pma), dont la cible cellulaire est la pkc, induisent la phosphorylation de certaines proteines, une production massive d'ions superoxydes et l'exocytose de granules lysosomiaux dans le neutrophile. La pkc de neutrophiles bovins a ete purifiee a l'homogeneite a partir de cytosol, en trois etapes: chromatographies sur colonne echangeuse d'anions de52 cellulose, monoq et sur colonne d'affinite hydrophobe phenyl sepharose. D'apres son profil d'elution sur colonne d'htp, la pkc de neutrophiles bovins se comporte comme une isoforme de pkc de cerveau, codee par le gene gamma. Par immunotypage, la pkc de neutrophiles bovins contient les isoformes de type beta et zeta. Les acyl-coa a longue chaine mis en incubation avec la pkc, sont d'excellents inhibiteurs de cette enzyme. Ajoutes directement dans le milieu de dosage, ils activent la pkc. L'effet inhibiteur des acyl-coa est reserve par l'atp-mg. La pkc de neutrophiles bovins phosphoryle preferentiellement une proteine de 23 kda, localisee dans le cytosol de ces cellules. Cette proteine a ete purifee a homogeneite a partir de cytosol de neutrophiles bovins. Durant les premieres etapes de sa purification, la proteine de 23 kda est co-eluee avec la pkc et une proteine de 7 kda. Les proteines de 23 kda et de 7 kda fixent le ca#2#+. Seule la proteine de 23 kda fixe le gtpgammas. Le cytosol de neutrophiles bovins contient, en plus de la proteine de 23 kda fixant le gtpgammas, des proteines g appartenant vraisemblablement au groupe des proteines ras ou apparentees, de masse moleculaire egale a 24 kda et adp-ribosylees par l'exoenzyme c3 de la toxine botulinique. Par isoelectrofocalisation, ces proteines sont resolues en trois groupes principaux de phi 5,5-5,6 (comme la proteine rho c recombinante humaine), 5,8-6,1 et 6,3-6,5. Ce dernier
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Gross, Grégori. "Modification des voies de repliement d’une petite protéine riche en ponts disulfure : la toxine alpha de Naja nigricollis". Paris, Muséum national d'histoire naturelle, 2008. http://www.theses.fr/2008MNHN0010.
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Le repliement des protéines, dernière étape du processus d’expression de l’information génétique, demeure imparfaitement expliqué. Pendant ma thèse, j’ai étudié le repliement oxydant d’une petite protéine riche en ponts disulfure, la toxine de Naja nigricollis. J’ai pu montrer que l’addition d’un acide aminé dans une boucle de la structure entraîne un ralentissement global du repliement in vitro causé par une permutation des intermédiaires productifs. L’étude en RMN des intermédiaires de repliement a permis de proposer une explication structurale à cette modification de comportement cinétique. Par ailleurs, pour tester l’importance de l’aspect vectoriel du repliement in vivo, j’ai développé une méthode ayant pour but de vectoriser le repliement in vitro. J’ai pu montrer qu’il est possible grâce à des anticorps dirigés contre la toxine réduite d’inhiber son repliement oxydant, de lever cette inhibition et finalement de modifier sa voie de repliementProtein folding is the last stage of genetic expression. The mechanism by which proteins acquire their 3D structure remains poorly understood. During my project,. I showed that the addition of one residue in one loop of the structure of toxin from Naja nigricollis slows its oxidative folding process down in vitro. This decrease in the folding rate is due to a switch of productive pathway. NMR analysis of folding intermediates enabled me to hypothesize a structural explanation for this kinetic modification. Additionally, in order to test the influence of vectorial folding on the folding of a small disulfide-rich protein in vitro, I developed a method using antibodies raised against various parts of the reduced protein. My results showed that one of these antibodies is able to inhibit the oxidative folding of toxin . This inhibition is reversible. Most interestingly, the use of this antibody modifies the folding pathway
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Gross, Grégori. "Modification des voies de repliement d'une petite protéine riche en ponts disulfure : la toxine alpha de Naja nigricollis". Phd thesis, Museum national d'histoire naturelle - MNHN PARIS, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00364212.
Testo completoAbstract (sommario):
Le repliement des protéines, dernière étape du processus d'expression de l'information génétique, demeure imparfaitement expliqué. Pendant ma thèse, j'ai étudié le repliement oxydant d'une petite protéine riche en ponts disulfure, la toxine a de Naja nigricollis. J'ai pu montrer que l'addition d'un acide aminé dans une boucle de la structure entraîne un ralentissement global du repliement in vitro causé par une permutation des intermédiaires productifs. L'étude en RMN des intermédiaires de repliement a permis de proposer une explication structurale à cette modification de comportement cinétique. Par ailleurs, pour tester l'importance de l'aspect vectoriel du repliement in vivo, j'ai développé une méthode ayant pour but de vectoriser le repliement in vitro. J'ai pu montrer qu'il est possible grâce à des anticorps dirigés contre la toxine a réduite d'inhiber son repliement oxydant, de lever cette inhibition et finalement de modifier sa voie de repliement.
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Clément, Romain. "Influence de la petite protéine GTPasique Cdc42 sur la voie de sécrétion du canalCFTR dans des cellules épithéliales bronchiques". Thesis, Poitiers, 2012. http://www.theses.fr/2012POIT2281/document.
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La mucoviscidose est causée par des mutations du gène CFTR (p.Phe508del étant la plus fréquente). Celui-ci code pour la protéine CFTR qui constitue un canal chlorure exprimé à la face apicale des cellules épithéliales. Au niveau du reticulum endoplasmique (RE), le contrôle de qualité conformationnelle oriente la majorité du CFTR en cours de repliement vers une voie de dégradation. Une fraction limitée du WT-CFTR parvient cependant à se replier correctement et peut ensuite progresservers la surface cellulaire, contrairement au Phe508del-CFTR (qui est néanmoins fonctionnel). Lorsque des formes mutées sont exportées à partir du RE, grâce à des traitements correcteurs, elles sont alors instables à la membrane plasmique. Par ailleurs, il a été montré que l'organisation des microfilaments d'actine participe à l'ancrage du canal au cytosquelette et à sa stabilité. Or, la petite GTPase Cdc42 influence la dynamique de nucléation de l'actine fibrillaire. Au cours de nos travaux, nous avons testé l'implication de Cdc42 et de certains de ses effecteurs dans la régulation de WT-CFTR dans des cellules épithéliales bronchiques. Dans ce cadre, la fonction de la voie Cdc42 a été perturbée par des traitements pharmacologiques et par ARN interférence. Les résultats obtenus, principalement par biotinylation de surface, ont permis de proposer que (1) la protéine Cdc42 participe à ladégradation de formes mal repliées de CFTR dans les étapes précoces et tardives de la voie de sécrétion et (2) la voie Cdc42, par son implication dans l'organisation de l'actine F corticale, affecte l’ancrage du canal chlorure au cytosquelette et régule ainsi son recrutement dans des vésicules d'internalisationCystic Fibrosis is caused by CFTR gene mutations (p.Phe508del being the most frequently encountered). The CFTR protein functions as a chloride channel expressed at the plasma membrane of epithelial cells. Its productive folding in the endoplasmicreticulum (ER) is poorly efficient and unfolded proteins are therefore targeted to degradation. Nevertheless, a limited fraction of WT-CFTR acquires a native conformation and then progesses into the secretory pathway. In the case of Phe508del-CFTR, virtually all channels are degraded at this step except through corrector treatments. Under these conditions the mutant remains unstable at the plasma membrane (although it is functionnaly competent). Furthermore, it has been shown that fibrillar actin organization is involved in CFTR tethering to the cytoskeleton and channel stability. Moreover, the small GTPase Cdc42 promotes F actin nucleation. In the present study, we aimed at testing the involvement of Cdc42, and of some of its effectors, in WT-CFTR regulation in epithelial airway cells. In this context, Cdc42 pathway function was altered through pharmacological treatments or siRNAmediated depletions. Our results, mainly obtained via cell surface biotinylation assays, led us to propose that (1) Cdc42 is involved in misfolded CFTR degradation at early and late steps of the secretory pathway, and (2) Cdc42 pathway, through its F actin organization function, affects CFTR anchoring to the cytoskeleton and thus regulates its endocytosis
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Paleotti, Olivia. "Rôle de la petite protéine G Arf6 et de son facteur d'échange Efa6 dans l'endocytose dépendante de la clathrine". Nice, 2006. http://www.theses.fr/2006NICE4027.
Testo completoAbstract (sommario):
Les petites protéines G de la famille Arf sont des protéines impliquées dans les processus de transport vésiculaire et de réorganisation du cytosquelette d'actine. Les Arfs oscillent entre une forme dite " inactive ", liée au GDP et une forme dite " active ", liée au GTP. L'activation est catalysée par les facteurs d'échange (les Arf-GEFs) et l'inactivation par des protéines GAPs (GTPase Activating Protein). Dans le laboratoire, nous nous intéressons aux différentes fonctions cellulaires de l'isoforme Arf6 et de son facteur d'échange spécifique Efa6. Au cours de ma thèse, je me suis plus particulièrement intéressée au rôle d'Arf6 dans l'endocytose dépendante de la clathrine. Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs), une fois activés par leur ligand, sont désensibilisés par liaison à la β-arrestine puis internalisés par la machinerie d'endocytose. Au cours de ma thèse, j'ai cherché à définir le site d'interaction d'Arf6 sur la β-arrestine. Dans mon étude, je montre également que la β-arrestine interagit avec le facteur d'échange, Efa6. Par ailleurs, intrigués par le rôle d'Arf1 au niveau du Golgi, nous nous sommes intéressés à un rôle similaire d'Arf6 à la membrane plasmique. En effet, Arf1 recrute à la membrane golgienne les complexes adaptateurs à la clathrine AP-1, AP-3 et AP-4, pour former des vésicules recouvertes de clathrine impliquées dans le transport entre le réseau trans-Golgien et les endosomes. Le complexe AP-2, étant à l'inverse des autres APs localisé à la membrane plasmique, nous avons démontré biochimiquement une interaction entre Arf6 et le complexe AP-2. Nous avons établi que cette interaction était dépendante du GTP et spécifique de l'isoforme Arf6Arfs small G proteins are implicate in vesicular transport and actin reorganisation. They exist in two forms: an inactive form, bound to the GDP and an active form, bound to the GTP. Exchange factors activate Arfs and GAPs (GTPase Activating Protein) inactivate them. We worked on Arf6 and on its exchange factor Efa6 in cellular functions. During my PhD, I studied Arf6 in clathrin-dependant endocytosis. G protein-coupled receptors (GPCRs) are desensibilized by β-arrestins that link GPCRs to the endocytic machinery. We showed that Arf6 and Efa6 could both interact with β-arrestins. Moreover, Arf1 recruits the adaptator proteins (AP-1, 3 and 4) at the golgi membrane to form endocytic vesicles. We showed that Arf6 could recruit AP-2 complex at the plasma membrane in a GTP-dependent manner
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Delerue, Thomas. "Etude du rôle de la protéine Msp1p dans la dynamique mitochondriale et le maintien de l'ADNmt chez la levure Schizosaccharomyces pombe". Thesis, Toulouse 3, 2015. http://www.theses.fr/2015TOU30314.
Testo completoAbstract (sommario):
La dynamique mitochondriale est un processus qui correspond à un équilibre dynamique entre des forces de fusion et de fission qui s'exercent sur les membranes des mitochondries. Quand les forces de fission prédominent les mitochondries apparaissent fragmentées, à l'inverse quand les forces de fusion sont prépondérantes les mitochondries forment un réseau filamenteux et interconnecté. Les principaux acteurs qui contrôlent la dynamique mitochondriale sont de grandes GTPases conservées de la levure à l'homme. Dnm1p (DRP1) est impliquée dans la fission de la membrane externe. Fzo1p (MFN1-2) et Mgm1p/Msp1p (OPA1) sont impliquées dans la fusion respectivement de la membrane externe et interne. L'objet d'étude principal de mon équipe est la protéine Msp1p/OPA1. Mon équipe a montré que la perte de Msp1p chez la levure à fission S. pombe induit la fragmentation des mitochondries, la perte du génome mitochondrial (ADNmt) et conduit à la mort de cette levure petite négative qui ne peut tolérer l'absence d'ADNmt. Afin de mieux comprendre les différents rôles de Msp1p et leurs relations, j'ai recherché des suppresseurs génétiques et pharmacologiques de la létalité induite par la perte de Msp1p. Nous avons identifié des suppresseurs génétiques en supprimant le gène msp1+ par recombinaison homologue dans des levures de fonds génétiques différents. Dans toutes les souches utilisées, des mutations spontanées localisées dans un des 3 gènes codant des protéines de fission (dnm1+, fis1+, caf4+), ont été retrouvées. Ces mutations suppriment à la fois la fragmentation des mitochondries et la perte de l'ADNmt, suggérant que le rôle de Msp1p dans la stabilité de l'ADNmt est une conséquence de sa fonction fusogène. Grâce au criblage de chimiothèques, nous avons identifié 5 composés pharmacologiques capables de supprimer la létalité d'un mutant thermosensible de Msp1p. J'ai entrepris la caractérisation de deux d'entre eux. Le premier supprime à la fois la fragmentation et la perte d'ADNmt induites par l'inactivation de Msp1p et semble cibler la fission mitochondriale. Le second ne supprime que la perte de l'ADNmt, suggérant que la seule fonction essentielle de Msp1p est son rôle dans le maintien de l'ADNmt. Au cours de ces travaux je me suis également intéressé aux mécanismes moléculaires pouvant expliquer la petite négativité de S. pombe. En absence d'ADNmt, les levures petites positives sont viables car capables, contrairement aux levures petites négatives, de maintenir un potentiel de membrane mitochondrial. 6 allèles, nommés ptp et rzl, qui permettent à la levure S. pombe de vivre sans ADNmt ont été décrits il y a plus de 20 ans. Nous les avons identifiées par des approches gène candidat ou séquençage haut débit. Ces allèles correspondent à des versions mutées de gènes codant soit des sous-unités de l'ATP synthase soit des sous-unités du protéasome. Dans le premier cas, ceci nous permet d'impliquer un fonctionnement reverse de l'ATP synthase et du transporteur ADP/ATP dans la restauration du potentiel de membrane mitochondrial et donc dans l'acquisition de la petite positivité chez S. pombe. Dans le second cas, différents mécanismes potentiellement impliqués ont été proposés. L'identification des gènes ptp et rzl devrait permettre une meilleure compréhension du processus de petite positivité/négativité qui reste à ce jour assez obscur. Les suppresseurs génétiques et pharmacologiques capables de supprimer la perte d'ADNmt en supprimant ou non la fragmentation des mitochondries constituent d'excellents outils pour comprendre les mécanismes qui relient la dynamique mitochondriale à la perte de l'ADNmt. La mise en évidence de la conservation des effets des drogues identifiées chez la levure chez les mammifères pourrait avoir un intérêt thérapeutique. En effet, des mutations d'OPA1, l'homologue de Msp1p chez les mammifères, sont responsables d'une neuropathie optiqueMitochondrial dynamics corresponds to a dynamic balance between two antagonistic forces of fusion and fission, which act on mitochondrial membranes. When fission prevails mitochondria appear fragmented, conversely when fusion predominates mitochondria form a filamentous and interconnected network. The main actors that control mitochondrial dynamics are large GTPases conserved from yeast to human. Dnm1p (DRP1) is involved in the fission of the outer membrane. Fzo1p (MFN1-2) and Mgm1p/Msp1p (OPA1) are involved in the fusion of the outer and inner membrane respectively. My team is interested in the protein Msp1p/OPA1 and showed a few years ago that loss of Msp1p in the fission yeast S. pombe induces mitochondrial fragmentation, mitochondrial genome (mtDNA) depletion and cell death. As a " petite negative ", S. pombe cannot tolerate the absence of mtDNA. To better understand the various role of Msp1p and their relationship, we searched for genetic and pharmacological suppressors of the lethality induced by Msp1p inactivation. We identified genetic suppressors by deleting the msp1+ gene by homologous recombination in various genetic backgrounds. In all strains, we found spontaneous mutations located in one of the 3 genes encoding mitochondrial fission proteins (dnm1+, fis1+, caf4+). These mutations suppress not only mitochondrial fragmentation but also mtDNA loss, suggesting that the role of Msp1p in mtDNA maintenance is a consequence of its fusogenic function. Thanks to chemical libraries screening, we identified 5 pharmacological compounds able to suppress the lethality induced by a Msp1p temperature-sensitive mutant, and characterized two of them. The first one suppresses both mitochondrial fragmentation and mtDNA loss and appears to target mitochondrial fission. The second one suppresses only mtDNA loss, suggesting that mtDNA maintenance is the only essential function of Msp1p. During this work I was also interested in the molecular mechanisms that could explain why S. pombe is " petite negative ". In the absence of mtDNA, the " petite positive " yeasts can survive because, unlike the " petite negative " yeasts, they are able to maintain mitochondrial membrane potential. Six alleles, named ptp and rzl, which allow S. pombe to live without mtDNA were previously described 20 years ago. We identified them by candidate gene and high-throughput sequencing approaches. These alleles correspond to mutated versions of genes encoding either subunits of ATP synthase or subunits of the proteasome. In the first case, this allows us to involve the reverse functioning of the ATP synthase and the ADP/ATP carrier in the restoration of the membrane potential thus converting S. pombe into a " petite positive " yeast. In the second case, various potentially involved mechanisms are proposed. The identification of ptp and rzl genes should allow a better understanding of the " petite positive/negative " properties that remain today rather unclear. Genetic and pharmacological suppressors able to suppress mtDNA loss with or without mitochondrial morphology recovery, represent interesting tools to understand the mechanisms that link mitochondrial dynamics to mtDNA loss. Furthermore, showing that the effects of the compound that we identified in yeast are conserved in mammals may have a therapeutic value. Indeed, mutations in OPA1, the Msp1p homologous in mammals, are responsible for an optic neuropathy
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Paul, Catherine. "Étude des mécanismes moléculaires à la base des fonctions anti-apoptotique et tumorigénique de la petite protéine de stress Hsp27". Lyon 1, 2001. http://www.theses.fr/2001LYO10101.
Testo completoAbstract (sommario):
En réponse à divers stress environnementaux, les cellules accumulent des protéines de stress ou Hsp. Leurs fonctions protectrices, lors de stress thermique ou oxydant, sont maintenant bien caractérisées. Récemment, une fonction anti-apoptique a été attribuée à Hsp27, sans aucun mécanisme connu pour cette fonction. Mon travail de thèse a consisté à étudier les mécanismes moléculaires à la base des fonctions anti-apoptique et tumorigénique de Hsp27. La fonction protectrice de Hsp27 lors de traitements oxydants ou apoptiques a tout d'abord été précisée, in vitro comme in vivo, et s'est révélée être importante dans certains cas pathologiques tels que l'asthme. Par ailleurs, une partie des mécanismes responsables, in vitro, de la fonction anti-apoptique de Hsp27 a été découverte. En effet, Hsp27 inhibe l'apoptose en amont de la sortie du cytochrome c des mitochondries. Ce mécanisme dépend, dans certains cas de la fonction protectrice des petits oligomères phosphorylés de Hsp27 sur le cytosquelette d'actine. De plus, Hsp27, alors présente dans les oligomères de grande taille, inhibe également l'apoptose en aval de mitochondries. Enfin, les fonctions anti-apoptique et tumorigénique de Hsp27 ont pu être démontrées in vivo au sein de tumeurs. Ces fonctions nécessitent la formation de grands oligomères de Hsp27 mais la régulation de cet état d'oligomérisation diffère in vivo et in vitro. Ces résultats permettent de mieux appréhender la fonction anti-apoptique de la protéine de stress Hsp27 et soulignent l'importance de la régulation de son état biochimique pour ses fonctions protectrices.
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Le, Gallic Lionel. "Caractérisation génomique de la petite GTPase RhoG, régulation du promoteur et implication de la protéine dans la transmission du signal". Montpellier 2, 1996. http://www.theses.fr/1996MON20223.
Testo completoAbstract (sommario):
Rho g appartient a la famille rho des petites gtpases, famille de proteines est impliquee dans le controle de l'activite membranaire et de la polymerisation des fibres d'actine mais egalement dans la transmission du signal mitogene. La sequence du promoteur de rhog est de type g/c riche, il ne possede pas de boite tata. Nous avons etudie l'influence de diverses proteines impliquees dans des voies de transduction du signal mitogene aboutissant a la phosphorylation des erk (extracellular reguladed kinases) ou des jnk (c-jun kinase). Le promoteur complet de rhog est sous le controle a la fois des voies conduisant a l'activation des erk et a l'activation des jnk. Cependant l'inductibilite du promoteur par le serum est dependante de la voie jnk et pas de la voie erk. De facon etonnante cette induction dependante de jnk, est dependante de cdc42 et pas de rac. De plus rho g est capable d'induire l'activation des jnk.
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Carriou, David. "Etude dynamique et structurale de biomolécules par microscopie à force atomique HS-AFM : application à une petite protéine de choc thermique sHsp". Phd thesis, Université de Bourgogne, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00873331.
Testo completoAbstract (sommario):
La microscopie à force atomique (AFM) permet de visualiser la topographie d'échantillons organiqueset inorganiques à l'échelle atomique. Les innovations les plus récentes offrent désormais la possibilitéd'accéder aux propriétés nano-mécaniques des échantillons (élasticité, adhésion...). Son panel defonctionnalités permet de pallier aux besoins des nanotechnologies, tant dans les domaines de laphysique, de la chimie que de la biologie.Cependant, les besoins nécessaires à la compréhension des processus biologiques imposent aumicroscope à force atomique des vitesses d'acquisitions rapides, inférieures à la seconde par image. Leséquipements classiques n'offrent pas cette possibilité. C'est pour s'affranchir de ce verrou technologique,pour l'étude dynamique, qu'un prototype de microscope à force atomique à haute-vitesse a étédéveloppé (HS-AFM) en partenariat avec l'équipe du Professeur T. Ando à l'Université de Kanazawa(Japon). Il permet d'atteindre des vitesses de balayage identiques aux vitesses vidéos : 25-50 images/s, enmilieu liquide. Le dispositif est en perpétuelle amélioration : nouvelle boucle d'asservissement, domainesde balayage augmentés. La haute résolution est, quant à elle, assurée par des leviers miniaturisés munisde sur-pointes en carbone. Parallèlement à l'innovation du microscope en lui-même, des modulescomplémentaires ont été développés : module pousse seringue et module chauffant.Le potentiel de ce prototype, développé dans le cadre d'un programme ANR PNANO 2008 HSnanobio-Imaging, a été montré via l'étude d'une petite protéine de choc thermique : la protéine sHspLo18. Cette protéine, issue de la bactérie lactique Oenococcus oeni, offrait la possibilité d'étudier deschangements de degrés d'oligomérisation en fonction du pH, ainsi que le rôle chaperon et lipochaperonen cas de stress environnemental d'autres complexes biologiques. L'utilisation des techniques demicroscopie couplée à des études biochimiques sur ce modèle protéique a permis d'appréhender l'effetdes surfaces sur l'adsorption et la dynamique des complexes biologiques. L'interaction protéine - surfacea pu être approchée et s'avère utile au développement des capteurs à protéines
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Komla-Soukha, Isabelle. "Morphogenèse du virus de l' hépatite delta : interactions entre la petite protéine S-AgHBs de l' enveloppe du virus de l' hépatite B et la protéine L-AgHD du virus de l' hépatite delta". Paris 6, 2007. http://www.theses.fr/2007PA066104.
Testo completoAbstract (sommario):
Le virus de l’hépatite delta (HDV) est un satellite du virus de l’hépatite B (HBV) dont il utilise la protéine S-AgHBs pour la formation de ses virions. Nous avons étudié les mécanismes moléculaires entre celle-ci et la protéine L-AgHD de l’HDV nécessaire à l’assemblage des virions. Nous avons prouvé que les résidus W196, W199 et W201 de la protéine S-AgHBs et les résidus P201, P205 et P208 de la protéine L-AgHD étaient essentiels à la maturation HDV, sans révéler d’interaction directe entre ces deux protéines. D’autres résultats ont révélé que les protéines S-AgHBs des génotypes A à E, contrairement aux protéines de génotype F et G, étaient capables d’incorporer la protéine L-AgHD de génotype 1. Enfin, nous avons estimé qu’il y a quatre fois plus de protéines S-AgHBs que de protéines L-AgHD dans les particules formées de ces deux protéines. Une connaissance approfondie de ces interactions permettrait le développement d’approches thérapeutiques spécifiques de l’HDV.
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Smadja-Lamere, Nicolas. "Rôle de la petite GTPase Rho et de ses effecteurs dans le programme de mort cellulaire induit par la protéine E4ORF4 de l'adénovirus". Thesis, Université Laval, 2009. http://www.theses.ulaval.ca/2009/26177/26177.pdf.
Testo completo
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Smadja-Lamère, Nicolas. "Rôle de la petite GTPase Rho et de ses affecteurs dans le programme de mort cellulaire induit par la protéine E4ORF4 de l'adénovirus". Doctoral thesis, Université Laval, 2009. http://hdl.handle.net/20.500.11794/20778.
Testo completoAbstract (sommario):
La protéine E4orf4 de l'adénovirus de type 2 induit un mécanisme de mort cellulaire alternatif indépendant des caspases et qui résiste à l'oncogène Bcl-2. E4orf4 constitue donc un outil moléculaire puissant pour étudier de nouveaux effecteurs impliqués dans la mort cellulaire. À mon arrivée dans le laboratoire, il avait été démontré qu'E4orf4 usurpait l'activité des tyrosine kinases de la famille Src afin de réorganiser le cytosquelette d'actine et que ce processus était corrélé avec son activité cytotoxique. Par contre, la nature des modifications de la dynamique de l'actine ainsi que le mécanisme moléculaire impliqué étaient inconnus. L'hypothèse à la base de mes travaux est qu'E4orf4 désorganise le réseau d'actine en manipulant l'activité des Rho GTPases et que le débalancement de la dynamique de l'actine qui en résulte engage la cellule dans un programme de mort cellulaire alternatif. Mes travaux indiquent qu'E4orf4 active le sentier Src-RhoA-ROCK, ce qui stimule la contractilité cellulaire en activant la myosine II. L'activité de cette dernière est essentielle, car son inhibition bloque le programme de mort cellulaire induit par E4orf4. Par conséquent, mes travaux ont contribué à établir un lien fonctionnel entre la dynamique de l'actine et la mort cellulaire. De plus, mes résultats indiquent que la stimulation du sentier Src-RhoA -ROCK par E4orf4 contribue à activer la MAP kinase JNK qui est nécessaire pour phosphoryler la sérine 178 de paxilline. Mes résultats montrent que la phosphorylation de cette sérine de paxilline diminue sa mobilité, contribuant ainsi à stabiliser les plaques d'adhérence en aval d'E4orf4. En outre, la phosphorylation de la sérine 178 de paxilline est essentielle à l'activité cytotoxique d'E4orf4, car son iphibition interfère avec la réorganisaton du cytosquelette d'actine et la condensation nucléaire induites par E4orf4. Ainsi, mes travaux suggèrent que JNK coopère avec la myosine II pour perturber la dynamique de l'adhérence et de l'actine en aval d'E4orf4. En conséquence, je propose qu'E4orf4 induit l'axe de signalisation Src-RhoA-ROCK pour générer un stress mécanique via la coordination des dynamiques de l'adhérence et de l'actine qui culmine par la mort programmée de la cellule.
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Klein-Mohsen, Stéphanie. "Rôle de la petite protéine G ARF6 et de son facteur d'échange dans la mise en place et le maintien des jonctions serrées". Nice, 2005. http://www.theses.fr/2005NICE4030.
Testo completoAbstract (sommario):
La polarité est une caractéristique fondamentale des cellules épithéliales ou neuronales qui régit de très nombreuses fonctions biologiques. Dans les cellules différenciées comme les cellules épithéliales, cette polarité est matérialisée par trois domaines membranaires distincts : les domaines apicaux, latéraux et basaux dont les compositions lipidique et protéique sont différentes. Les jonctions serrées séparent le domaine apical du domaine latéral ; en empêchant les protéines et les lipides de diffuser d'un domaine à l'autre, elles contribuent au maintien de la polarité cellulaire. Elles forment d'autre part une barrière sélective régulant le passage de molécules à travers l'espace paracellulaire. Les jonctions serrées forment un échafaudage macromoléculaire complexe composé de protéines membranaires et cytoplasmiques liées au cytosquelette d'actine sous-jacent. Elles participent au maintien de l'adhérence cellule-cellule, au contrôle de la prolifération, de la différenciation et de la polarité cellulaire. ARF6 (ADP-ribosylation factor 6) appartient à la famille des petites protéines G monomériques de type Ras et son rôle dans l'endocytose et dans les réarrangements du cytosquelette d'actine est bien établi. ARF6 fonctionne à la manière d'un interrupteur biologique cyclant successivement entre un état dit inactif (catalysé par une protéine GTPase nommée GAP) et un état dit actif (catalysé par un facteur d'échange, GEF). Dans ce travail, nous avons établi que le facteur d'échange d'ARF6 participe à la régulation des réarrangements du cytosquelette d'actine requis pour la mise en place des jonctions serrées et plus généralement pour l'établissement de la polarité cellulaire. Cette régulation nécessite (1) la catalyse de l'échange GDP-GTP sur ARF6 et (2) un domaine spécifique du facteur d'échange, le domaine C-terminal, impliqué dans les réarrangements du cytosquelette d'actine indépendamment de son activité d'échange sur ARF6. Mon but était de mieux comprendre le rôle d'ARF6 dans ce processus. Or, ARF6 étant impliquée dans le trafic membranaire et dans la réorganisation de l'actine, il fallait déterminer la contribution de ces deux fonctions dans la mise en place des jonctions. Sur la base des études structurales et biochimiques d'ARF6, j'ai donc construit différents mutants d'ARF6 que j'ai exprimés de manière inductible dans des cellules épithéliales polarisées ; j'ai aussi établi une lignée inductible me permettant d'inhiber l'expression d'ARF6 via la technique du RNA interférence. J'ai étudié les propriétés biochimiques des mutants in vitro et observé leurs effets sur la morphologie, le trafic intracellulaire de récepteurs membranaires et dans la mise en place des jonctions serrées. Les études montrent que le cycle GDP-GTP d'ARF6 est important pour qu'ARF6 joue son rôle que ce soit dans le recyclage de protéines internalisées via une voie indépendante de la clathrine ou dans la mise en place des jonctions serrées. Cependant, ARF6 est nécessaire mais pas suffisant ; la réorganisation du cytosquelette d'actine et la mise en place des jonctions serrées nécessitent la coopération entre le domaine C-terminal du facteur d'échange d'ARF6 et le cycle d'ARF6Polarity is a fundamental characteristic of epithelial and neuronal cells and is critical for various biological functions. In differentiated cells, like epithelial cells, plasma membranes are functionally divided into apical, lateral and basal membrane domains which differ in the compositions of integral membrane proteins and lipids. Tight junctions look like a fence in the most apical part of the lateral membrane and are probably the morphological counterpart of a localized diffusion barrier. Moreover, they seal the intercellular space between adjacent cells to prevent the diffusion of solutes through this intercellular space. The transmembrane proteins constituting these tight junctions are linked to components of the cytoskeleton and establish maintenance of adhesion between neighboring cells. In addition, a growing number of cytoplasmic scaffolding proteins associated with these junctions are involved in regulating diverse processes such as transcription, cell proliferation and cell polarity. ARF6 (ADP-Ribosylation Factor 6), a member of the ARF family of Ras-related small G proteins, regulates endocytosis between the plasma membrane and endosomal compartments in non-polarized cells and initiates cortical actin rearrangements at the cell periphery. ARF6 cycles between two conformational states: an inactive GDP- and an active GTP-bound state. The GDP/GTP exchange is controlled by guanine nucleotide exchange factor proteins (GEF) and the hydrolysis of GTP controlled by GTPase activating proteins (GAP). In this work, we established that the exchange factor for ARF6 stimulates the polarized rearrangement of the actin cytoskeleton during the establishment of tight junction and cell polarity. This regulation requires the coordinated action of the catalytic domain of the exchange factor to promote ARF6 activation and its C-terminal region to control actin cytoskeletal reorganization. My goal was to better understand ARF6 contribution in this function. Indeed, ARF6 is involved in plasma membrane/endosomes trafficking and cortical actin reorganization: so what are the contributions of these two functions in tight junction formation? Structural and biochemical studies of ARF6 led me to construct ARF6 mutants stably expressed in epithelial cells under the control of a tetracycline-repressible transactivator. I also established an inducible cell line with a ARF6 siRNA to reduce ARF6 expression. I studied biochemical properties of these mutants and observed their effects on cell morphology, intracellular trafficking of membrane receptors and in formation of tight junction. Results show that ARF6 GDP-GTP cycle is important for ARF6 function in recycling of proteins internalized in a clathrin-independent pathway and in formation of tight junction. However, ARF6 is necessary but not sufficient: actin reorganization and tight junction formation require the coordinated action of the C-terminal domain of the exchange factor of ARF6 and ARF6 cycling
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Buosi, Vanessa. "Etudes structurale et dynamique de la petite protéine G ARF1 par RMNAnalyse de l'échange nucléotidique et des interactions avec le myristate et ARFGAP1". Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA112044.
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Arf1 est une petite protéine G qui joue un rôle d’interrupteur moléculaire, régulateur de la transduction du signal. Elle exige sous deux états structuralement très différents : lié au GPD (état inactif) ou au GTP (état actif) où Arf1 est liée à la membrane grâce à son hélice myristoylée. L’activation de Arf1 par son facteur d’échange suit une cascade d’évènements qui a été décrite par plusieurs structures cristallographiques. Cette activation entraîne un changement de conformation de la protéine, en présence de GTP, associé à un décalage de registre de deux résidus au niveau des feuillets β de l’interswitch. A l’heure actuelle, aucune donnée ne permet d’expliquer ce réarrangement. La première partie de ce travail a consisté à caractériser d’un point de vue structural et dynamique les formes GDP et GTP de Arf1 par RMN en solution. Dans un second temps, nous avons étudié l’interaction de Arf1 avec le myristate. Le dernier aspect a consisté en l’étude du complexe Arf1-ArfGAP1Arf1 is a small G protein that plays a molecular switch role, regulator of signal transduction. It exists in two different structural states : bound to GDP (the inactive state) or to GTP (the active state) where Arf1 is bound to the membrane through its myristoylated helix. Activation of Arf1, by its exchange factor, follows an ordered sequence of structural events, which have been pictured by crystallographic snapshots. This activation leads to conformational changes of the protein, in presence of GTP, associated with a two register shift of the interswitch β- strands. However, how Arf1 rearranges its central β sheet, is not explained by available data. The first part of this work consisted on the structural and dynamical characterizations of GDP and GTP forms of Arf1, by liquid state NMR. Secondly, we investigated the interaction of Arf1 with a myristate. Finally, we analyzed the Arf1-ArfGAP1 complex
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Dubroca, Caroline Monique Claire. "Etude de la mécanotransduction du tonus myogénique : voies de signalisation et implication physiopathologique". Paris 7, 2005. http://www.theses.fr/2005PA077065.
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Bellaye, Pierre-Simon. "Rôle de la petite protéine de choc thermique alphaB crystallin dans la fibrogénèse pulmonaire et son implication dans la voie de signalisation du transforming growth factor - béta1". Thesis, Dijon, 2013. http://www.theses.fr/2013DIJOMU06/document.
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La fibrose pulmonaire idiopathique (FPI) est de pronostic sombre et sans traitement efficace. Elle est caractérisée par un début sous pleural et la présence de myofibroblastes responsables de la synthèse excessive de la matrice extracellulaire. La voie de signalisation du Transforming Growth Factor (TGF)-β1, facteur clé de la genèse de la fibrose et sa progression, passe par les Smads, notamment Smad4. Le TGF-β1 induit la différenciation des fibroblastes pulmonaires et des cellules épithéliales et mésothéliales en myofibroblastes. AB-crystallin est une protéine de choc thermique surexprimée dans la fibrose du foie, du rein et la fibrose vasculaire. Elle peut être induite par le TGF-β1. Dans ce travail, nous avons étudié le rôle d’αB-crystallin dans la fibrose pleurale et pulmonaire. Nous montrons qu’αB-crystallin est surexprimée dans les poumons et la plèvre de patients atteints de FPI. In vivo, dans trois modèles de fibrose pulmonaire (bléomycine, surexpression de TGF-β1 ou d’IL-1β) les souris KO pour αB-crystallin sont protégées de la fibrose avec une inhibition de la voie du TGF-β. In vitro, dans les cellules épithéliales, mésothéliales ou les fibroblastes, αB-crystallin augmente la localisation nucléaire de Smad4. En interagissant avec TIF1γ, responsable de l’export nucléaire de Smad4, elle favorise la séquestration nucléaire de Smad4 et son activité pro-fibrosante. Au contraire, son inhibition permet la formation du complexe Smad4/TIF1γ et l’export nucléaire de Smad4 inhibant son activité. Ce travail montre l’importance d’αB-crystallin dans la fibrose pleuro-pulmonaire et son rôle sur la voie du TGF-. AB-crystallin pourrait être une cible thérapeutique de la FPIIdiopathic pulmonary fibrosis (IPF) has no effective current treatment. It is characterized by a sub-pleural onset and the presence of myofibroblasts, responsible for the excessive extracellular matrix synthesis. Transforming Growth Factor (TGF)-β1 is considered as the major profibrotic cytokine. Its signaling pathway occurs through the Smads proteins, including Smad4. TGF-β1 allows the differentiation of lung fibroblasts and epithelial and mesothelial cells into myofibroblasts. AB-crystallin is a small heat shock protein overexpressed in liver, renal and vascular fibrosis and can be induced by TGF-β1. In this study, we assessed the role of αB-crystallin in pleural and pulmonary fibrosis. We show that αB-crystallin is overexpressed in the lung and the pleura of IPF patients. In vivo, in three pulmonary fibrosis models (bleomycin, TGF-β1 or IL-1β overexpression) αB-crystallin KO mice are protected from fibrosis with an inhibition of the TGF-β pathway. In vitro, in epithelial and mesothelial cells or fibroblasts, αB-crystallin increases Smad4 nuclear localization. Interacting with TIF1γ, responsible for the nuclear export of Smad4, it promotes the nuclear sequestration of Smad4 and thus its profibrotic activity. Instead, αB-crystallin inhibition allows the formation of the Smad4/TIF1γ complex and promotes Smad4 nuclear export an profibrotic activity. This work shows the importance of αB-crystallin in pleuro-pulmonary fibrosis and its role on the TGF-β1 pathway. AB-crystallin appears as a putative therapeutic target for IPF
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Boulakirba, Sonia. "Étude des mécanismes moléculaires qui contrôlent l’interaction entre EFA6 et ses partenaires". Electronic Thesis or Diss., Nice, 2015. http://www.theses.fr/2015NICE4081.
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La petite protéine G Arf6 et son facteur d'échange EFA6 sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires tels que le remodelage du cytosquelette d’actine, le transport vésiculaire et mise en place de la polarité épithéliale. Elles jouent également un rôle dans la voie d'endocytose dépendante de la clathrine. Ce travail de thèse nous a permis d’identifier différents mécanismes régulant l’interaction d’EFA6 avec ses différents partenaires. Nous avons pu mettre en évidence une interaction directe entre le domaine N-BAR de l’endophiline et le domaine Sec7 d’EFA6. Nous avons démontré que la courbure membranaire était un facteur régulant cette interaction. EFA6 est capable d’interagir et de recruter l’endophiline sur une membrane lipidique plane alors qu’en présence de vésicules courbées le complexe protéique ne se forme pas. Nous observons également que l’endophiline stimule l’activité d’échange nucléotidique d’EFA6 sur Arf6. Dans un second temps nous avons démontré, dans une étude menée par le Dr Cherfils, que l’activité catalytique d’EFA6 était régulée par une boucle de rétrocontrôle négatif exercée spécifiquement par la protéine Arf6-GTP. Celle-ci induit une diminution de l’activité d’échange d’EFA6 probablement grâce à sa capacité à interagir avec le domaine PH-C-terminal d’EFA6. Enfin, nous avons mis en évidence un repli intramoléculaire entre le domaine C-terminal et le domaine PH d’EFA6 qui semble contrôler l’interaction de cette extrémité C-terminale avec différents partenaires dont la β-arrestine et de façon surprenante la protéine Arf6 dans sa forme inactiveThe small G protein Arf6 and its exchange factor EFA6 control numerous cellular processes such as actin cytoskeleton remodeling, vesicular transport and apico-basal cell polarity. They are also involved in clathrin-dependent endocytosis. In this work we identify different mechanisms by which EFA6 interaction with its various partners is regulated. We have highlighted a direct interaction between the N-BAR domain of endophilin and the Sec7 domain of EFA6. We demonstrated that this interaction is regulated by the membrane curvature. EFA6 interacts and recruits endophilin on a flat lipid membrane whereas the protein complex does not occur in the presence of curved vesicules. We showed that endophilin stimulates the nucleotidic exchange activity of EFA6 on Arf6. Next we demonstrated that the catalytic activity of EFA6 is regulated by a negative feedback loop specifically mediated by the Arf6-GTP. We observed in the presence of Arf6-GTP a decrease of EFA6 catalytic activity and we showed that this effect was due to an interaction between Arf6-GTP and PH-C-terminal domain of EFA6. Finally we demonstrated an intramolecular folding between the C-terminal domain and the PH domain of EFA6 that controls the interaction of the C-terminus domain with various partners including β-arrestin and surprisingly the inactive GDP form of Arf6
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Boulakirba, Sonia. "Étude des mécanismes moléculaires qui contrôlent l’interaction entre EFA6 et ses partenaires". Thesis, Nice, 2015. http://www.theses.fr/2015NICE4081/document.
Testo completoAbstract (sommario):
La petite protéine G Arf6 et son facteur d'échange EFA6 sont impliquées dans de nombreux processus cellulaires tels que le remodelage du cytosquelette d’actine, le transport vésiculaire et mise en place de la polarité épithéliale. Elles jouent également un rôle dans la voie d'endocytose dépendante de la clathrine. Ce travail de thèse nous a permis d’identifier différents mécanismes régulant l’interaction d’EFA6 avec ses différents partenaires. Nous avons pu mettre en évidence une interaction directe entre le domaine N-BAR de l’endophiline et le domaine Sec7 d’EFA6. Nous avons démontré que la courbure membranaire était un facteur régulant cette interaction. EFA6 est capable d’interagir et de recruter l’endophiline sur une membrane lipidique plane alors qu’en présence de vésicules courbées le complexe protéique ne se forme pas. Nous observons également que l’endophiline stimule l’activité d’échange nucléotidique d’EFA6 sur Arf6. Dans un second temps nous avons démontré, dans une étude menée par le Dr Cherfils, que l’activité catalytique d’EFA6 était régulée par une boucle de rétrocontrôle négatif exercée spécifiquement par la protéine Arf6-GTP. Celle-ci induit une diminution de l’activité d’échange d’EFA6 probablement grâce à sa capacité à interagir avec le domaine PH-C-terminal d’EFA6. Enfin, nous avons mis en évidence un repli intramoléculaire entre le domaine C-terminal et le domaine PH d’EFA6 qui semble contrôler l’interaction de cette extrémité C-terminale avec différents partenaires dont la β-arrestine et de façon surprenante la protéine Arf6 dans sa forme inactiveThe small G protein Arf6 and its exchange factor EFA6 control numerous cellular processes such as actin cytoskeleton remodeling, vesicular transport and apico-basal cell polarity. They are also involved in clathrin-dependent endocytosis. In this work we identify different mechanisms by which EFA6 interaction with its various partners is regulated. We have highlighted a direct interaction between the N-BAR domain of endophilin and the Sec7 domain of EFA6. We demonstrated that this interaction is regulated by the membrane curvature. EFA6 interacts and recruits endophilin on a flat lipid membrane whereas the protein complex does not occur in the presence of curved vesicules. We showed that endophilin stimulates the nucleotidic exchange activity of EFA6 on Arf6. Next we demonstrated that the catalytic activity of EFA6 is regulated by a negative feedback loop specifically mediated by the Arf6-GTP. We observed in the presence of Arf6-GTP a decrease of EFA6 catalytic activity and we showed that this effect was due to an interaction between Arf6-GTP and PH-C-terminal domain of EFA6. Finally we demonstrated an intramolecular folding between the C-terminal domain and the PH domain of EFA6 that controls the interaction of the C-terminus domain with various partners including β-arrestin and surprisingly the inactive GDP form of Arf6
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Manero, Florence. "Étude de deux voies de modulation de l'apoptose : l'inhibition de l'apoptose par la petite protéine de stress Hsp27 et la stimulation par des anticoagulants de l'apoptose dépendante du récepteur Fas". Lyon 1, 2003. http://www.theses.fr/2003LYO10092.
Testo completoAbstract (sommario):
J'ai étudié deux voies de modulation de l'apoptose. J'ai d'abord participé à l'étude des propriétés anti-apoptotiques de la protéine Hsp27, sous forme de gros oligomères, inhibe l'activation des caspases par le cytochrome c. Sous forme de petits oligomères et par la protection de l'actine dans certains cas, par un mécanisme indéterminé dans d'autres, Hsp27 peut aussi inhiber la translocation mitochondriale de la protéine pro-apoptotique Bid et la sortie du cytochrome c. Dans une seconde partie, j'ai montré que des anticoagulants stimulent l'induction de l'apoptose par un anticorps agoniste anti-Fas. Ce phénomène est accru dans des cellules sur-exprimant les protéines Hsp27 ou Bc12. La compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents nécessite d'autres études. Ces anticoagulants, combinés à des anticorps agonistes de Fas ou des ligands de mort, seraient de bons candidats pour développer des thérapies contre des maladies auto-immunes ou des cancers.
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Raoelijaona, Raivoniaina. "Compréhension des rôles des complexes Nob1/Pno1 et RPS14/Cinap dans la maturation cytoplasmique de la petite sous-unité ribosomique (pré-40S) chez les eucaryotes". Thesis, Bordeaux, 2019. http://www.theses.fr/2019BORD0221/document.
Testo completoAbstract (sommario):
Les ribosomes sont des complexes nucléoproétiques responsables de la traduction. Chez les eucaryotes, la biogenèse du ribosome est un processus complexe très régulé qui fait intervenir un nombre important de facteurs d’assemblages (~200). La construction d’un ribosome est initiée dans le nucléole puis continue dans le nucléoplasme et se termine dans le cytoplasme. La maturation cytoplasmique de la petite sous-unité ribosomale implique la dissociation séquentielle des facteurs d’assemblage tardifs et la maturation finale de l’ARNr 18S. Ce processus est catalysé par l’endonucléase Nob1 qui assure la coupure de l’extrémité 3’ du précurseur de l’ARNr 18S (pré-18S) aboutissant à sa forme mature. Ce mécanisme est coordonné par la protéine Pno1 qui est le partenaire de Nob1. Des informations détaillées sur l’architecture des particules pré-ribosomiques nous ont permis de mieux comprendre les différents intermédiaires de la biogenèse. Cependant, certains aspects fonctionnels comme la conformation adoptée par Nob1 pour assurer la coupure du site D du pre-18S reste encore flou. L’objectif de mon travail a été de mieux comprendre les aspects très tardifs de la maturation cytoplasmique du ribosome. Pour ce faire, nous avons redéfini l’organisation modulaire de l’endonucléase Nob1 chez les eucaryotes pour ensuite étudier son mode d’interaction avec son partenaire Pno1. Des tests fonctionnels in vitro ont été effectués pour étudier le rôle de Pno1 dans la régulation de la coupure par Nob1.Nos résultats nous ont permis de montrer que le domaine catalytique de Nob1 adopte une conformation atypique. En effet le domaine PIN est composé de deux fragments (res 1-104 and 230-255) séparé par une boucle interne qui est importante pour la reconnaissance avec son partenaire Pno1. Nos études nous ont également montré que Pno1 inhibe l’activité de Nob1 probablement en reconnaissant directement l’ARNr substrat, masquant ainsi le site de coupure de l’endonucléase. Ces résultats sont complémentaires et cohérents avec les données structurales de cryo-EM de la particule pré-40S humaine récemment publiées. En effet, Nob1 est dans une conformation incapable de couper le pré-ARNr puisque son domaine catalytique se retrouve à une distance d’environ 30Å de son ARN substrat. Ce phénomène implique donc des changements de conformations ou encore la nécessité de protéine accessoire pour déplacer certains facteurs. La protéine Cinap est impliqué dans la maturation de l’ARNr 18S. Nos études d’interaction avec les protéines localisées au niveau de la plateforme (à savoir RPS14, RPS26, le complexe Nob1/Pno1) ont permis de montrer que Cinap pouvait former un complexe tripartite avec l’endonucléase Nob1 et son partenaire Pno1. De plus, Cinap est capable de reconnaitre RPS26 dans un complexe RPS14-dépendant. Il est important de noter que RPS26 est un composant de la petite sous-unité qui remplace Pno1 dans le ribosome mature. De ce fait le recrutement de RPS26 au sein du pré-ribosome nécessite la dissociation de Pno1 et cet échange serait assurée par Cinap. Sur la base des travaux effectués, nous pouvons proposer un modèle de maturation où la formation du complexe Cinap/Pno1 induirait un changement de conformation permettant à Nob1 de reconnaitre son substrat et donc de catalyser la coupure du site D qui aboutit à la maturation de l’ARNr 18S et donc à la production de la sous-unité 40S matureRibosomes are translational machineries universally responsible of protein synthesis. In eukaryote, ribosome assembly is a complex and highly regulated process that requires coordinated action of more than 200 biogenesis factors. Ribosome assembly is initiated in the nucleolus, continues in the nucleoplasm and terminates in the cytoplasm. The cytoplasmic maturation events of the small ribosomal subunit are associated with sequential release of the late assembly factors and concomitant maturation of the pre-rRNA. During final maturation of the small subunit, the pre-18S rRNA is cleaved off by the endonuclease Nob1, which activity is coordinated by its binding partner Pno1. Detailed information on pre-ribosomal particle architectures have been provided by structural snapshots of maturation events. However, key functional aspects such as the architecture required for pre-rRNA cleavage have remained elusive. In order to better understand these late steps of cytoplasmic pre-40S maturation, we first redefine the domain organization of Nob1, then study its binding mode with Pno1 using different tools such as sequence analysis, structure prediction and biochemical experiments and, we then performed functional assay to elucidate the role played by Pno1 during the pre-18S rRNA maturation.Our results have shown that eukaryotic Nob1 adopts an atypical PIN domain conformation: two fragments (res 1-104 and 230-255) separated by an internal loop, which is essential for Pno1 recognition. We also found out that Pno1 inhibits Nob1 activity likely by masking the cleavage site. Our findings further support the recently published cryo-EM structure of the pre-40S, where Nob1 displays an inactive conformation. Moreover, 18S rRNA 3’-end cleavage has to happen and this implies structural rearrangement or requirement of some accessory proteins such as Cinap, an atypical kinase involved in pre-18S processing. Studying the interplay between proteins localized in the pre-40S platform (RPS14, RPS26, Nob1/Pno1 complex) has shown that Cinap is able to form a trimeric complex with Nob1 and its binding partner Pno1. Furthermore, Cinap can recognize RPS26 in a RPS14-dependent manner, which had already been studied with its yeast counterpart. It is important to note that RPS26 is the ribosomal protein replacing Pno1 in the mature ribosome. Our finding clearly suggests a mechanism where RPS26 recruitment to the ribosome requires Pno1 dissociation. This exchange would be carried out by Cinap. Therefore, we can suggest a simplified model as follow: upon binding with Pno1, the newly formed complex (Cinap/Pno1) will trigger a conformational change, which will allow the endonuclease Nob1 to reach its substrate (D-site) and perform its cleavage resulting in mature 18 rRNA generation
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Menetrey, Julie. "Etude structurale des petites protéines G : Rap2A dans un complexe non catalytique avec le GTP et Arf6 en complexe avec du GDP". Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2000. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00004186.
Testo completoAbstract (sommario):
Les petites protéines G sont des protéines capables de fixer du GDP ou du GTP, ce qui va induire des changements de conformation au sein de la protéine qui lui permettront d'interagir avec des partenaires cellulaires distincts, et ainsi de jouer un rôle "d'interrupteur moléculaire". Le cycle GDP/GTP des petites protéines G ne fonctionne pas seul, il est régulé par un facteur d'échange GDP/GTP (GEF) et une protéine activatrice de la GTPase (GAP). Les petites protéines G sont impliquées dans des processus cellulaires fondamentaux et divers, comme la différentiation et la prolifération cellulaire, l'organisation et la dynamique du cytosquelette, et les transports intracellulaires. Un certain nombre de structures de petite protéine G sont maintenant connues, et ont permis de définir le repliement général des petites protéines G et les changements de conformation au cours du cycle GDP/GTP. Le premier projet porte sur l'étude structurale par diffraction des rayons X de la petite protéine G Rap2A, homologue de l'oncogène Ras dans un complexe non catalytique avec le GTP. Cette étude a permis de mettre en évidence la présence d'une nouvelle interaction au niveau du site nucléotidique entre la tyrosine 32 et le phosphate gamma du GTP. Et, nous avons montré que les changements de conformation de Rap2A au cours de son cycle GDP/GTP sont caractérisés par deux transitions désordre/ordre. Le second projet porte sur l'étude structurale par diffraction des rayons X de la petite protéine G Arf6 en complexe avec du GDP. Cette étude a montré que deux protéines qui possèdent une forte homologie de séquence peuvent avoir des structures assez différentes pour être distinguées. Les principaux partenaires des formes GDP des petites protéines G sont les GEF, ce qui suggère une base structurale pour la spécificité des GEF. En conclusion, nous discutons des bases structurales qui permettent aux petites protéines G d'être distinguées les unes des autres.
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Viaud, Julien. "Conception de modulateurs des interactions protéine-protéine : application à la famille des petites protéines G de la famille Arf et leurs facteurs d'échange". Montpellier 1, 2007. http://www.theses.fr/2007MON13518.
Testo completoAbstract (sommario):
Les petites molécules qui induisent des complexes protéine-protéine non fonctionnels sont une alternative peu explorée par rapport aux inhiniteurs compétitifs pour l'inhibition de la fonction des protéines. Dans cette thèse, nous avons ciblé l'activation de la petite protéine G Arf1, par le domaine catalytique Sec7 de son facteur d'échange ARNO. Nous avons utilisé la structure cristallographique d'un complexe transitoire Arf1-GDP/ARNO, pour cribler par amarrage moléculaire quelques milliers de molécules. A l'issue des tests d'activité, nous avons identifié une molécule, appelée LM11, qui inhibe l'activation de Arf1 par ARNO. A l'aide de techniques de biophysiques et de biochimie, nous avons montré que LM11 agit selon un mécanisme non compétitif dans lequel l'inhibiteur vise la protéine Arf1-GDP et le complexe Arf1-GDP/ARNO en produisant un complexe non fonctionnel. D'autre part, nous avons montré que LM11 est actif au niveau cellulaire.
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Luton, Frédéric. "Régulation de la polarité épithéliale par EFA6, facteur d'échange d'Arf6, et le système ubiquitine-protéasome". Habilitation à diriger des recherches, Université de Nice Sophia-Antipolis, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00317619.
Testo completoAbstract (sommario):
Le bon fonctionnement de notre organisme repose sur de nombreux réseaux de communication intercellulaires (neurotransmetteurs, hormones, facteurs de croissance, lymphokines, molécules d'adhésion, etc.) prolongés par les voies de signalisation intracellulaires. Les signaux moléculaires sont des ligands reconnus par des récepteurs exprimés à la surface des cellules cibles. La fixation du ligand à son récepteur déclenche des voies de signalisation intracellulaires qui commandent la réponse fonctionnelle. Mes travaux scientifiques m'ont conduit à étudier diverses voies de signalisation intracellulaires qui seront évoquées dans cette HDR avec une emphase particulière sur les études les plus récentes.Les cellules de la réponse immune cellulaire, les lymphocytes T, reconnaissent leur antigène spécifique à l'aide d'un récepteur multi-protéique, le complexe TCR/CD3. Le contrôle de son expression de surface est essentiel car le nombre de récepteurs stimulés par l'antigène et la durée de cette interaction déterminent la réponse fonctionnelle. Au cours de ma thèse au Centre d'Immunologie de Marseille-Luminy, j'ai participé à l'étude des mécanismes qui contrôlent l'expression de surface du récepteur et son internalisation suite à l'interaction avec l'antigène. Ces travaux ont permis 1) de corroborer que l'expression de surface du complexe TCR/CD3 est dépendante de l'assemblage complet de toutes les sous-unités qui le composent, 2) et surtout d'aborder le lien entre voies de signalisation associées au complexe TCR/CD3 et son internalisation stimulées par la liaison d'un ligand spécifique.
Le récepteur aux poly-immunoglobulines (pIgR) exprimé à la surface des cellules épithéliales qui tapissent la cavité interne de nos organes transcytose les anticorps sécrétés dans le milieu basal vers le lumen. Ainsi, ce récepteur approvisionne-t-il continuellement les sécrétions mucosales en anticorps (pIgA et pIgM). La forte augmentation de la quantité d'anticorps produits en réponse à une infection nécessite un transport accru de ces anticorps vers les surfaces mucosales à protéger. Pendant mon stage post-doctoral à UCSF (University of California, San Francisco) j'ai contribué 1) à montrer que la liaison des pIgA au pIgR stimulait une voie de signalisation, 2) à décrire au niveau moléculaire le fonctionnement de cette voie de signalisation, 3) à montrer in vivo que cette voie de signalisation stimule fortement la transcytose des pIgAs.
Les épithéliums représentent une barrière à la pénétration d'agents pathogènes mais également une surface d'échange avec le milieu extérieur. Pour accomplir leurs fonctions les cellules épithéliales maintiennent un phénotype polarisé avec un coté orienté vers les tissus sous-jacents (pôle basal) et un autre tourné vers le milieu extérieur (pôle apical). Ces cellules doivent établir entre elles des contacts physiques pour maintenir la cohésion de l'ensemble du tissu qu'elles constituent. Les contacts cellulaires sont assurés par des molécules d'adhésion (E-cadhérine) qui se comportent comme des récepteurs couplés à des voies de signalisation transduisant notamment des signaux qui participent au maintien de la polarité épithéliale. Depuis mon arrivée à l'IPMC (Institut de Pharmacologie Moléculaire et Cellulaire), j'ai mis au jour une nouvelle voie de signalisation associée aux molécules de E-cadhérine qui comprend un facteur d'échange (EFA6) et son substrat la petite protéine G Arf6. Cette voie de régulation contrôle notamment la mise en place de la structure moléculaire, appelée jonction étroite, qui régule les échanges paracellulaires de l'épithélium et contribue à la polarité épithéliale. EFA6, connecté à deux voies de signalisation qui agissent de façon coordonnée, participe à l'organisation du cytosquelette d'actine qui soutient la jonction étroite. Par ailleurs, nous avons trouvé que le niveau d'expression d'EFA6 est étroitement régulé pendant le développement de la polarité. Cette régulation post-traductionnelle est assurée par la machinerie de dégradation cytosolique appelée système ubiquitine-protéasome. Nous avons identifié certains acteurs de cette voie de régulation et commencé de montrer son importance pour le développement et le maintien de la polarité épithéliale. Les résultats les plus récents pointent vers un rôle de ces protéines dans les cancers épithéliaux qui se caractérisent toujours par une perte de la polarité cellulaire.
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Raux, Brigitt. "Développement d'inhibiteurs d'interaction protéine-protéine ciblant les protéines à bromodomaines : implications en épigénétique et dans le développement de cancers". Thesis, Aix-Marseille, 2017. http://www.theses.fr/2017AIXM0521.
Testo completoAbstract (sommario):
Les protéines à bromodomaines (BCPs) sont notamment impliquées dans la régulation de la transcription de gènes et la signalisation cellulaire. Leur dérégulation conduit au développement pathologies, telles que les maladies inflammatoires, cardiovasculaires et plus particulièrement les cancers. Les BCPs sont capables de reconnaitre les lysines acétylées de protéines histones via leur module BromoDomaine(s) (BDs). Parmi les huit familles de BCPs, mon projet de thèse s’intéresse à la famille « BET ». Celle-ci, comprend quatre protéines constituées de deux BDs en tandem, formant deux sous-familles BD1 et BD2. L’architecture de la cavité centrale des BDs, qualifiée de « druggable », a permis l’émergence de ces protéines en tant que nouvelles cibles épigénétiques prometteuses. À ce jour, une vingtaine d’essais cliniques ont été initiés pour des molécules « pan-BET », inhibant l’ensemble des membres de cette famille. Cependant, l'inhibition « pan-BET » est problématique au niveau clinique puisqu’elle impacte de nombreuses voies de transcription et engendre l’apparition de cellules résistantes. Mon projet de thèse s’intègre au challenge actuel qui est de développer des inhibiteurs plus sélectifs, par exemple envers l’une des sous-familles BD1 ou BD2 ou plus idéalement envers un seul BD de la famille BET. Le développement de « sondes épigénétiques sélectives » ciblant des BDs de la famille BET, devrait permettre de décrypter leur rôle et leur mécanisme d’action dans les divers processus biologiques. L’identification de « candidat médicament » devrait aboutir à de nouvelles thérapies ciblées et de pallier les résistances liées à l’utilisation de molécules pan-BET inhibitricesBromodomain-containing proteins (BCPs) are especially involved in the regulation of gene transcription and cell signalling. Their dysregulation lead to the development of pathologies, such as inflammatory, cardiovascular diseases, and more particularly cancers. BCPs involved in the recognition of acetylated lysine of the histone tails, through their BromoDomain(s) module(s) (BDs). Among the eight families of BCPs, my thesis project focuses on the “BET” family. This family comprises four proteins which are composed of a tandem of two BDs each belonging to the BD1 or the BD2 subfamily. The architecture of the central cavity of the BDs, qualified as "druggable", allows the emergence of these proteins as new promising epigenetic targets. To date, about twenty clinical trials targeting different types of cancer have been initiated for "pan-BET" molecules that target all the members of this family. However, "pan-BET" inhibition is clinically problematic because it impacts many transcriptional pathways and causes the appearance of resistant cells. My thesis project is part of the current challenge is to develop more selective inhibitors, for example towards the BET-BD1 subfamily or the BET-BD2 subfamily or ideally towards one single BD inside the BET family. The development of such "selective epigenetic probes" targeting BET family BDs should allow deciphering their role and mechanism of action in various biological processes. Identifying "drug candidates" should lead to new targeted therapies and overcome the resistances related to the use of pan-BET molecules
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Guillemot, Jean-Claude. "Contribution à l'étude des petites protéines -G". Toulouse 3, 1995. http://www.theses.fr/1995TOU30216.
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L'adnc humain de d4-gdi a ete clone au laboratoire par soustraction de banque d'adnc entre lignees hematopoietiques et non hematopoietiques. Au niveau acides amines, ce gene montre une homologie de 68% avec rho-gdi, inhibiteur de la dissociation du gdp pour rho. La famille des proteines ras, les petites proteines g, se comporte de plusieurs sous-groupes: ras/raf, rab, tc4/ran et rho. L'analyse par northern du profil d'expression de d4-gdi nous a montre qu'il est exprime preferentiellement dans les cellules hematopoietiques. Afin d'etudier ce gene, nous en avons etabli une mutation nulle par recombinaison homologue dans des cellules embryonnaires souches de souris. Plusieurs laboratoires, dont le notre, ont decrit la possibilite d'obtenir une differenciation hematopoietique in vitro a partir de cellules es. Nous avons ainsi montre que d4-gdi n'est pas implique dans l'hematopoiese
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Mehlen, Patrick. "Les petites protéines de stress : des protéines qui contrôlent la mort cellulaire". Lyon 1, 1995. http://www.theses.fr/1995LYO10275.
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Ce travail de thèse a permis de mettre en évidence une fonction moléculaire des petites protéines de stress (shsp). Ces protéines, qui sont principalement connues pour protéger les cellules de la toxicité de stress environnementaux sont aussi impliquées dans d'autres phénomènes cellulaires. Ainsi, dans un premier temps, une étude biochimique, m'a conduit à mettre en évidence, en dehors de tout stress extérieur, de profondes modifications post-traductionnelles (phosphorylation, oligomérisation, changement de localisation) de ces protéines à la fois au cours du cycle cellulaire, de la différenciation cellulaire ou lors d'un traitement par la cytokine anti-tumorale tnf (tumor necrosis factor), événements cellulaires a priori pourtant bien différents. Cherchant alors le rôle de ces protéines dans de tels processus, j'ai démontré que la simple expression constitutive des shsp suffit pour conférer aux cellules une protection contre la mort cellulaire induite par le tnf dans les cellules tumorales en bloquant tant le processus apoptotique que nécrotique. De plus, j'ai clairement établi qu'une absence de ces shsp au cours de la différenciation cellulaire suffit pour faire avorter ce processus en provoquant un processus apoptotique. Ainsi les shsp, que ce soit face à un stress environnemental, face à l'action cytotoxique du tnf, ou lors de la différenciation, semblent jouer le rôle de protéines anti-mort cellulaire. Cherchant les bases moléculaires de cette fonction anti-mort, j'ai montré dans un premier temps, l'importance des modifications post-traductionnelles de ces protéines et en particulier de l'oligomérisation, dans cette fonction. Puis, j'ai observé que l'expression des shsp s'accompagne d'une réduction du niveau de radicaux libres oxygènes (rlo), molécule réactive et toxique pour la cellule, et parallèlement d'une forte augmentation de la quantité de glutathion réduit (gsh), molécule impliquée dans la régulation du taux de rlo. Or, j'ai montre que la relation gsh/shsp est essentielle pour la fonction protectrice des shsp et qu'elle pourrait passer par une liaison directe du gsh sur les shsp. Ainsi, les shsp pourraient représenter une nouvelle famille de protéines protégeant de la mort cellulaire en détoxifiant les radicaux libres via l'utilisation du glutathion.
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Guzzo, Mathilde. "Contrôle dynamique de la polarité chez Myxococcus xanthus : évolution et architecture d'un système chimiotactique modulaire". Thesis, Aix-Marseille, 2015. http://www.theses.fr/2015AIXM4078.
Testo completoAbstract (sommario):
La bactérie Myxococcus xanthus forme des structures multicellulaires appelées corps fructifères pour résister à des conditions de carence nutritive. La formation de ces structures implique un système chimiotactique particulier, le système Frz, qui régule le changement de direction des cellules, provoqué par la relocalisation simultanée des deux appareils de motilité (A) et (S) d’un pôle à l’autre de la cellule. Au cours de ma thèse, j’ai travaillé sur la connexion entre le système chimiotactique Frz et ses protéines cibles MglAB dans le contrôle de l’inversion de la polarité. L’axe de polarité des cellules est établi par MglA, une petite protéine G de la famille Ras, qui constitue un embranchement vers la régulation des deux appareils de motilité au pôle avant, et son inhibiteur MglB localisé au pôle arrière. Nous avons montré qu’en interagissant directement et spécifiquement avec le cytosquelette, MglA contrôle l’assemblage et le désassemblage de la machinerie de motilité A. Par une approche évolutive, nous avons élucidé l’architecture modulaire du système Frz et l’implication de quatre domaines régulateurs pour connecter le système Frz aux protéines MglAB, filtrer et amplifier le signal. Nous proposons un mécanisme d’inversion de la polarité dans lequel l’action indépendante de deux RRs à chaque pôle de la cellule perturbe les interactions entre une petite protéine G et son inhibiteur apparenté pour convertir un axe de polarité stable en un oscillateur biochimique. La régulation de la direction de mouvement chez M. xanthus pourrait donc constituer un cas émergent de couplage entre des régulateurs de type procaryotes et eucaryotesThe bacterium Myxococcus xanthus forms multicellular structures called fruiting bodies to resist to starvation conditions. Fruiting body formation implies a chemosensory-like system, the Frz system which regulates directional changes through the simultaneous pole-to-pole relocalization of two motility systems, (A) and (S). During my PhD, I have worked on the connection between the Frz chemosensory-like system and the downstream regulators MglA and MglB in the control of polarity inversion. The cell polarity axis is established by (i) a Ras-like small G protein, MglA, which constitutes a branch node in the regulation of A and S motility systems at the leading cell pole, and (ii) its cognate inhibitor MglB that localizes at the lagging cell pole. We showed that MglA interacts directly and specifically with the cytoskeleton to promote assembly and disassembly of the A-motility machinery. Using an evolutionary approach, we elucidated the modular architecture of the Frz system and the implication of four regulatory domains to (i) connect the Frz system to the MglAB proteins, (ii) filter and (iii) amplify the signal. We now propose a mechanism for polarity inversion in which the independent action of two response regulators at each cell pole perturbs the interactions between a small-G-protein and its cognate inhibitor to trigger the conversion of a stable polarity axis into a biochemical oscillator. The regulation of directional movement in M. xanthus is an interesting emergent coupling between prokaryotes and eukaryotes regulators
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Zeeh, Jean-Christophe. "Caractérisation biochimique et structurale d'inhibiteurs des facteurs d'échange des petites protéines G arf et Rho". Paris 11, 2008. http://www.theses.fr/2008PA112206.
Testo completoAbstract (sommario):
Les petites protéines G et les facteurs d’échange sont des cibles thérapeutiques potentielles dans de nombreuses pathologies. Leur inhibition reste un véritable défi du fait de la complexité biochimique et structurale de la réaction d’échange. C’est pourquoi il est critique d’identifier les « talons d’Achille » pour pouvoir ensuite guider la découverte de nouveau inhibiteurs. Une étape importante est de caractériser le mécanisme des inhibiteurs actuellement connus et identifier, puis éventuellement manipuler, leur spécificité. A ce jour, six inhibiteurs des facteurs d’échange sont connus. Dans ce travail, je me suis intéressé à la caractérisation biochimique et structurale de quatre des six inhibiteurs actuellement connus. J’ai démontré, en combinant les données biochimiques et structurales disponibles et en utilisant des analogues de la BFA et des mutants d’Arf et de Sec7, que la BFA possède une double spécificité. Cette spécificité peut être cartographiée à un seul acide aminé sur le domaine Sec7, mais elle semble dépendre de paramètres dynamiques chez Arf. J’ai ensuite participé à la caractérisation de LM11, découvert par criblage in silico. J’ai montré que LM11 inhibe l’activation des Arf dans la cellule et j’ai identifié deux résidus du domaine Sec7 et un D’Arf qui permettent de moduler l’inhibition par le LM11. Les constructions d’Arf et de Sec7 établies pour ces deux études m’ont permis d’entreprendre une étude approfondie du mécanisme et de la spécificité in vitro de la SecinH3, un inhibiteur chimique découvert en 2007 par déplacement d’aptamères. De façon remarquable, ces trois inhibiteurs ont des mécanismes différents et des spectres de spécificité croisés mais distincts. Mes travaux ont également porté sur l’inhibition par un inhibiteur peptidique d’un autre couple petite protéine G/GEF, RhoA et Tgat, impliqués dans un processus de cancer. Ces travaux suggèrent qu’ils devrait être possible, dans le futur de cibler avec spécificité un couple de petite protéine G/GEF d’intérêt thérapeutiqueSmall GTPases and exchange factors are potential therapeutic targets in many diseases. Their inhibition is a challenge because of the biochemical and structural complexity of the exchange reaction. It is therefore critical to identify “Achilles’ heel” that will help the discovery of new inhibitors. An important step is to characterize the inhibition mechanism and the specifity of known inhibitors. To date, six inhibitors of GEFs are known. In this work, I focused on the biochemical and structural characterization of four of them : BFA, LM11, SecinH3 and Tripa. In the first part of the work, I used Arf and Sec7 mutants and a BFA analogue to demonstrate the dual specificity of BFA for its GTPases and GEF targets. This specificity depends on a single Sec7 residue and may involve dynamics features of Arf. I was then involved in the characterization of LM11, an ArfGEF inhibitor discovered by in silico screening. I showed that LM11 inhibits Arf activation in cells and identified two residues in the Sec7 domain and one in Arf that are important for its activity. By using Arf and Sec7 constructs established for the BFA and LM11 studies. I went on to characterize the inhibition mechanism and specificity of SecinH3, an inhibitor of the cytohesin family of ArfGEFs discovery in 2007. Remarkably, we find that these three inhibitors act according to different mechanisms, and have different pattern of specificity for their Arf and ArfGEF targets. I finally studies the inhibition by an peptidic inhibitor of the activation of RhoA by an oncogenic RhoGEF called Tgat. These studies, altogether, suggest that GTPases and GEFs are suitable targets for inhibition, and that it should be possible to discovery inhibitors that target specific small GTPase/GEF pairs involved in diseases
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Douguet, Dominique. "Etude des interactions protéine-protéine et protéine-ligand par bio- et chimie-informatique structurale : Identification de petites molécules bio-actives". Habilitation à diriger des recherches, Université de Nice Sophia-Antipolis, 2007. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00320089.
Testo completoAbstract (sommario):
Mes recherches ont eu pour objectif de concilier deux aspects complémentaires de la bioinformatique structurale : la modélisation de la structure 3D des protéines et la modélisation des petites molécules modulatrices des premières. La connaissance de la structure tridimensionnelle des protéines est un élément déterminant pour la compréhension fine de leur mécanisme d'action et indispensable pour le développement d'approches thérapeutiques rationnelles. Ainsi, l'identification et l'analyse structurale des sites de fixation de leurs ligands (protéine ou petite molécule) permettent d'envisager la modulation de leur fonction biologique. Les interactions protéine-protéine ou protéine-ligand peuvent être prédites, par exemple, par des programmes d'amarrage (ou ‘docking').La modélisation par homologie permet d'obtenir un modèle tridimensionnel d'une protéine lorsque sa structure n'a pas été déterminée expérimentalement. Ma contribution dans ce domaine fut la réalisation du serveur @TOME avec le soutien de la GENOPOLE Languedoc-Roussillon (accessible à l'adresse http://bioserver.cbs.cnrs.fr). Ce serveur était le premier de ce type à avoir été développé en France. Le serveur @TOME rassemble et traite d'une manière automatique toutes les étapes nécessaires à la construction d'un modèle 3D d'une protéine. Cela inclut la reconnaissance du repliement, la construction des modèles protéiques et leur évaluation. Les résultats du CASP5 en 2005 (session internationale d'évaluation des méthodes de prédiction de la structure des protéines ; http://predictioncenter.llnl.gov/) ont montré que notre serveur utilisé en mode automatique propose des modèles très proches de la structure expérimentale lorsque l'identité de séquence avec la structure support est supérieure à 30%. Le serveur a été classé 26ième sur 187 groupes inscrits.
Dans un second temps, mes recherches m'ont permis de réaliser une base de données de complexes protéiques co-cristallisés, base fondatrice du projet DOCKGROUND. Ce projet de grande envergure, soutenu par le NIH depuis 2005, vise à établir un système intégré et dynamique de bases de données dédié à l'étude et à la prédiction des interactions entre protéines et permettre ainsi d'améliorer nos connaissances des interactions et de développer des outils de prédiction plus fiables. Ce travail a été effectué au sein de l'équipe du Pr. Ilya Vakser à l'Université de Stony Brook, NY, USA. Dans la réalisation de cette première base de données, un ensemble de programmes collectent, classent et annotent les complexes protéiques qui ont été co-cristallisés (données sur la séquence, la fonction, le repliement 3D, les particularités telles qu'une fixation à de l'ADN, ...). Ensuite, j'ai mis en œuvre une sélection dynamique des représentants des complexes contenus dans cette base. Les représentants sont essentiels pour éviter une surreprésentation de certaines familles de protéines. Cette base de donnée est accessible par Internet et est régulièrement mise à jour (http://dockground.bioinformatics.ku.edu). Le projet DOCKGROUND va être poursuivi par la réalisation de 3 autres bases de données qui s'ancreront sur la présente appelée ‘Bound-Bound'.
L'objectif principal de mes travaux est d'identifier de nouveaux composés bio-actifs afin de comprendre le fonctionnement de leur cible dans un contexte biologique. Les méthodes que j'utilise se basent sur la chémoinformatique, le criblage virtuel et le de novo ‘drug design'. Dans le cadre de ce dernier, j'ai mis au point un programme propriétaire LEA3D (‘Ligand by Evolutionary Algorithm' 3D). Le programme génère des petites molécules à partir de la combinaison de fragments moléculaires issus de drogues et de molécules ‘bio' (substrats ou produits de réactions enzymatiques). Le criblage virtuel basé sur la structure protéique et le de novo ‘drug design' par LEA3D, ont été appliqués avec succès à la thymidine monophosphate kinase (TMPK) de Mycobacterium tuberculosis dans le cadre d'une collaboration avec une équipe de chimistes et de biologistes de l'Institut Pasteur. De nouvelles familles d'inhibiteurs ont été identifiées dont un inhibiteur synthétique trois fois plus affin que le substrat naturel. Plusieurs publications et une demande de brevet couvrent les résultats de ces recherches. Dans la continuité de ces travaux, je m'intéresse maintenant, plus particulièrement, à développer des stratégies de criblages de fragments (molécules de petit poids moléculaire). Il a été montré que de petites chimiothèques contenant des petites molécules polaires sont plus efficaces pour identifier des touches. Ce travail doit être réalisé conjointement avec des criblages structuraux expérimentaux comme la RMN ou la diffraction des rayons X. Ces derniers se posent comme une alternative aux tests in vitro avec pour avantage de donner une information détaillée, au niveau atomique, des interactions entre le ligand et sa cible. S'ensuit une étape d'optimisation/maturation des touches en ligands plus élaborés et plus affins par l'utilisation d'outils de chémoinformatique.
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Gummel, Jérémie. "Structures et mécanismes de formation de complexes polyélectrolyte-protéine". Paris 11, 2006. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00120315.
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Les mécanismes régissant la formation de complexes constitués de chaînes polymères chargées (polyélectrolytes) et de protéines, rencontrés dans l’agro-alimentaire, la pharmacologie ou la biologie, mènent à des structures mal connues jusqu’ici. Nous les avons étudiées par Diffusion de Neutrons aux Petits Angles (DNPA), associée au marquage par deutériation du polymère et à la variation de contraste dans des mélanges eau lourde - eau légère. La protéine est le lysozyme (chargé positivement à pH < 11) et le polyélectrolyte le polystyrène sulfonate (PSS, toujours chargé négativement) ; le rapport des charges apportées ([-]/[+]) est un paramètre essentiel. Lorsqu’il est proche de 1, on obtient soit un gel de PSS réticulé par les protéines, qui contractent partiellement les chaînes de PSS, tout en les laissant en régime interpénétré (semi dilué), soit des globules denses (rayon ~10 nm) avec agrégation fractale à plus grande échelle lorsqu’après contraction les chaînes sont trop courtes et passent en régime désinterpénétré (dilué). Cette structure très bien définie a permis une étude fouillée: nous avons montré que le cœur des globules possède une charge nulle, que les espèces introduites en excès du point de vue électrostatique restent en solution, éventuellement dans des couronnes pour le PSS, et que leur taille finie est fixée par la force ionique. Une mesure spécifique de la localisation des contre-ions a prouvé qu’ils sont expulsés du cœur des complexes lors de leur formation. La conformation des chaînes au sein des complexes a été mesurée par marquage adapté. Enfin lorsque [-]/[+]>>1, un réseau transitoire fluide et limpide de protéines dénaturées par le PSS est obtenuThe mechanisms driving the formation of complexes made of charged polymeric chains (polyelectrolytes) and proteins, found in domains such as food engineering, pharmacology, or biology, lead to structures still poorly known. We studied them by Small Angle Neutron Scattering (SANS) and used deuterated polymer and contrast matching in solvents made of heavy water and light water. The protein is the lysozyme (positively charged at pH<11) and the polyelectrolyte is polystyrene sulfonate (PSS, always negatively charged). The ratio of charges brought ([-]/[+]) is an essential parameter. When it is close to 1, two structures can be obtained. One is a gel of PSS crosslinked by the proteins, that locally shrink the PSS chains but keep them in an entangled regime (semi-diluted). The other is made of dense globules (radius ~10 nm) with a fractal organisation at higher scale where the chains are too short and are in a disentangled regime (diluted) after being shrunk. This structure is very well defined and allows a deeper study: we have shown that the core of the globules has a null charge, that the species in excess in an electrostatic point of view stay in solution, possibly in a shell for the PSS chains, and that their size is fixed by the ionic strength. A specific measurement of the counterions has proved that they are ejected from the core of the complexes during their formation. The conformation of the chains inside the complexes has been measured using an adapted labelling. Finally when [-]/[+]>>1, a fluid and limpid transient network of proteins denatured by the PSS is obtained
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Valette, Nicolas. "Caractérisation fonctionnelle de petites protéines sécrétées chez les champignons lignolytiques". Thesis, Université de Lorraine, 2017. http://www.theses.fr/2017LORR0324/document.
Testo completoAbstract (sommario):
Durant ces dernières décennies, les systèmes enzymatiques de dégradation du bois sécrétés par les champignons ont fait l’objet de nombreuses études aboutissant à la caractérisation fonctionnelle et biochimique des enzymes extracellulaires majeures agissant directement sur le polymère. Cependant, les systèmes annexes associés au processus de dégradation n’ont à l’heure actuelle été que peu étudiés. En particulier, les systèmes de détoxication et de réponses des champignons au stress généré par le processus de dégradation ainsi que les mécanismes lui permettant de croître dans cet environnement hostile sont encore peu connus. Ce stress est majoritairement dû à la présence de radicaux et d’extractibles. Les extractibles sont des molécules issues du métabolisme secondaire de l’arbre qui sont synthétisés pour augmenter la durabilité du bois face aux attaques biotiques et abiotiques. Une analyse transcriptomique réalisée au laboratoire a mis en évidence la surexpression de gènes codant des petites protéines sécrétées (SSP) chez Phanerochaete chrysosporium lors d’une culture en présence d’extractibles de chêne. La fonction de ce type de protéines chez les champignons lignolytiques est inconnue. Mon projet de thèse a porté sur la caractérisation d’une de ces SSP (SSP1). Les résultats obtenus ont révélé des propriétés biochimiques atypiques pour cette protéine qui est capable de former une structure fibrillaire, notamment grâce à la présence d’un domaine C-terminal riche en alanine et glycine. De plus, nous avons pu montrer que cette protéine présentait une activité β-glucuronidase in vitro, qui est dépendante de son état d’oligomérisation. Une approche physiologique a également été abordée grâce à l’obtention de mutants knock-out de SSP de Podospora anserina. La caractérisation de ces mutants a montré un défaut de croissance en condition de stress oxydant et en présence de molécules perturbant l’intégrité de la paroi cellulaire. Enfin, une analyse in silico des orthologues de SSP1 a montré la présence de ce gène dans les génomes d’organismes saprophytes, ectomycorhiziens ou pathogènes suggérant un rôle indirect de cette protéine dans les processus de dégradation du bois, probablement en lien avec la gestion du stress associéDuring the last decades, the enzymatic systems involved in wood degradation have been intensively studied in fungi. This has led to functional and biochemical characterization of the main extracellular enzymes that are involved in the process. However, other systems associated to the degradation mechanisms have been poorly studied. In particular, the detoxification and stress response pathways allowing the fungus to grow in and resist the toxic conditions that are associated to the degradative process are still unknown. This stress is mostly due to the presence of radicals and extractives. Extractives are putative toxic compounds produced as secondary metabolites in tree to enhance wood durability against biotic and abiotic attacks. A transcriptomic analysis performed in the laboratory highlighted the up-regulation of genes coding for small secreted proteins (SSP) in Phanerochaete chrysosporium in presence of oak extractives. The functions of these SSP are unknown in lignolytic fungi. My PhD project was focused on the characterization of one of these SSP (namely SSP1) of P. chrysosporium. The biochemical data revealed atypical features for SSP1. Indeed, it is able to form fibrilar structure, thanks to an alanine-rich and glycine-rich C-terminal domain. Moreover, we have shown that this protein exhibits β-glucuronidase activity in vitro which is dependent on its oligomerization state. Physiological data were obtained thanks to the obtention of SSP knock-out mutants in Podospora anserina. These mutants have growth defect in oxidizing stress condition and in presence of cell wall-disruptive compounds. Finally, the in silico analysis of SSP1 orthologues revealed the presence of this gene in genomes of saprophytic, ectomycorrhizal or pathogenic fungi, suggesting an indirect role of this protein in wood degradation processes, probably linked to the associated stress
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Naissant, Bernina. "Rôles des petites protéines GTPase Rab11 dans l'interaction Hôtes/Parasites". Paris 6, 2009. http://www.theses.fr/2009PA066204.
Testo completo
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Mareuil, Fabien. "DaDiModO un algorithme génétique pour l'étude de protéines à domaines à l'aide de données de RMN et de SAXS : application à la protéine ribosomale S1 d'Escherichia Coli". Paris 7, 2008. http://www.theses.fr/2008PA077191.
Testo completoAbstract (sommario):
La compréhension des propriétés des macromolécules biologiques, en particulier des protéines, passe par la connaissance de leurs structures tridimensionnelles. Environ un millier de domaines différents suffisent à construire la plupart des protéines et il est estimé que la moitié des structures de ces domaines est résolue (Koonin et al. 2002). À terme, il sera possible d'obtenir au moins des modèles approchés de la structure des domaines composant une protéine. Mais il manquera toujours l'information sur le positionnement relatif des domaines. De ce fait, disposer d'un outil permettant de trouver ce positionnement à l'aide de données expérimentales rapides à acquérir est un enjeu important. Dans cette optique nous avons développé un algorithme permettant d'utiliser des données de RMN et de SAXS pour positionner les domaines d'une protéine multi-domaines. L'un des avantages de cet outil est de laisser toute liberté à l'utilisateur quant à la déformabilité des domaines. Nous avons validé notre méthode sur deux cas tests et ainsi montré que si la définition des domaines était suffisamment fine et les données expérimentales d'assez bonne qualité, on pouvait s'approcher de la solution structurale à moins de 1 À d'erreur. Nous avons ensuite utilisé notre méthode dans le cadre d'une étude structurale de deux fragment! de la protéine ribosomique S1, composée de six répétitions du domaine S1. Cette étude a porté su les fragments composés des domaines 3-4 et 4-5. La structure du domaine 4 a été déterminée Celles des domaines 3 et 5 ont été obtenues par modélisation par homologie. Notre étude nous permis de valider un modèle biologiquement pertinent pour le fragment 3-5To increase our Knowledge about the biological properties of macromolecules, especially proteins, it is necessary to know their three-dimensional structures. About one thousand of different domains are sufficient to build most proteins and it is estimated that half of these domain structures is determined (Koonin et al. 2002). Eventually, it will be possible to obtain close models of protein domain structures. However the information concerning the relative position of the domains will always be missing. Hence, having a tool that finds the relative position of domains by using experimental data easy to obtain is a major issue. For that purpose, we have developed an algorithm that uses NMR and SAXS data to position the domains of a multi-domain protein. The main advantage of this tool is to leave the user free to choose the deformability of the domains. We validated our method on two test cases and thus showed that when the definition of domains is accurate enough and the experimental data are of fairly good quality, our program could approach the structural solution with an error of less than 1 A. We have then applied our method to the structural study of two fragments of the ribosomal protein S1 which is composed of six repetitions of the S1 domain. This study focused on the fragment; made of domains 3-4 and 4-5. The structure of the domain 4 was determined by NMR. The domain: 3 and 5 were obtained by homology modelling. Our study allowed us to validate a biologically relevant model of the fragment 3-5
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Badilla, Lobo Adriana. "Characterization of a family of small proteins regulated by second messenger-binding riboswitches in Clostridioides difficile". Electronic Thesis or Diss., université Paris-Saclay, 2024. http://www.theses.fr/2024UPASL120.
Testo completoAbstract (sommario):
Clostridioides difficile est une cause majeure de diarrhée nosocomiale. La physiopathologie de C. difficile est régie par des réseaux de régulation complexes, incluant des mécanismes basés sur l'ARN tels que les riboswitches. Les riboswitches, situés dans la région 5' non traduite des ARNm, se lient à des ligands spécifiques, induisant des changements de conformation qui modulent l'expression du gène en aval. Chez C. difficile, 16 riboswitches répondent à la molécule de signalisation c-di-GMP. Le c-di-GMP est un régulateur contrôlant la transition d'un mode de vie planctonique libre à un mode de vie sessile associé à la régulation des facteurs de virulence. Plusieurs riboswitches à c-di-GMP régulent des gènes impliqués dans la formation des flagelles, l'assemblage des pili de type IV, le développement du biofilm, l'adhésion et la production de facteurs de virulence tels que les toxines chez C. difficile. De plus, le c-di-GMP inhibe la sporulation chez C. difficile, mais le mécanisme sous-jacent n'est pas connu.Nous avons caractérisé ici des riboswitches à c-di-GMP qui n'ont pas encore été étudiés. Nos analyses bioinformatiques ont révélé que 5 d'entre eux sont situés directement en amont de gènes codant des petites protéines (PPs) de 58 acides aminés (AA). De manière intéressante, un alignement de ces 5 protéines a montré qu'elles sont presque identiques en séquence. De plus, une recherche d'homologie a permis de découvrir 2 protéines supplémentaires de 60 AA, très similaires aux cinq premières, bien que leurs gènes ne soient pas précédés d'un riboswitch. Cette nouvelle famille de protéines est conservée dans toutes les souches de C. difficile, mais n'a pas d'homologues en dehors de l'espèce. Nous avons construit une version étiquetée d'une PP et l'avons détectée par immunoblotting de fractions cellulaires, confirmant sa nature protéique et révélant qu'elle est associée à la membrane.Des données de séquençage de l'ARN (RNA-seq) ont démontré que le c-di-GMP régule négativement l'expression des 5 gènes de PP en aval des riboswitches ainsi que des 2 gènes supplémentaires. Nous avons également observé que le c-di-AMP, un autre dinucléotide cyclique impliqué dans l'osmorégulation, réprime l'expression des 7 gènes. Des expériences de fusions transcriptionnelles entre la région promotrice d'une PP et un gène rapporteur ont confirmé que le c-di-GMP nécessite le riboswitch pour moduler l'expression des gènes en aval. En revanche, le c-di-AMP régule leur expression indépendamment du riboswitch en modulant l'activité du promoteur. Ainsi, le c-di-GMP et le c-di-AMP influencent l'expression des PP par des mécanismes distincts.Pour étudier le rôle des PP chez C. difficile, nous avons surexprimé l'une d'elles et comparé son transcriptome à celui de la souche sauvage. Cela a révélé l'induction de l'expression de plus de 100 gènes impliqués dans la sporulation dans la souche surexprimant la PP. Conformément à ces données, la surexpression de cette PP a conduit à un phénotype d'hypersporulation. En outre, la délétion des 7 gènes de PP (mutant Δ7) a entraîné une réduction de la sporulation, avec des phénotypes intermédiaires pour les souches où seuls certains gènes des PP ont été délétés. Le défaut de sporulation de Δ7 est similaire à celui d'une souche produisant des niveaux élevés de c-di-GMP, suggérant que l'impact du c-di-GMP sur la sporulation pourrait être médié par la régulation des PP. Pour tester cette hypothèse, nous avons créé un mutant Δ7 produisant de fortes concentrations de c-di-GMP. Le défaut de sporulation de cette souche était équivalent à celui du mutant Δ7 non affecté dans sa production de c-di-GMP, indiquant que les effets des délétions des PP et de la surproduction de c-di-GMP ne sont pas cumulatifs.Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que cette nouvelle famille de petites protéines est régulée à la fois par le c-di-GMP et le c-di-AMP et joue un rôle clé dans le contrôle de la sporulation chez C. difficileClostridioides difficile is the leading cause of nosocomial diarrhea in adults in industrialized countries. The pathophysiology of C. difficile is governed by complex regulatory networks, including RNA-based mechanisms like riboswitches. Riboswitches, located in the 5' untranslated region of mRNAs, bind specific ligands, inducing conformational changes that either promote or inhibit the expression of the downstream gene. In C. difficile, 16 riboswitches respond to the signaling molecule cyclic di-GMP (c-di-GMP). C-di-GMP acts as a second messenger and is recognized as a central regulator controlling the transition from a free planktonic to a sessile lifestyle associated with biofilm formation and virulence factor regulation. Several of the c-di-GMP-responding riboswitches have been well-studied in C. difficile and shown to regulate genes involved in flagella formation, type IV pili assembly, biofilm development, adhesion, and the production of virulence factors such as toxins. Moreover, c-di-GMP inhibits sporulation in C. difficile, but the underlying mechanism remains unclear.In this PhD work, we sought to characterize c-di-GMP-responding riboswitches that have not yet been studied. Our bioinformatics analyses revealed that 5 of them are located directly upstream of predicted genes encoding small proteins (SPs) of 58 amino acids. Interestingly, an alignment of these 5 proteins showed that they are almost identical in sequence. Moreover, a homology search uncovered two additional proteins of 60 amino acids, highly similar to the first five, though their genes are not preceded by a c-di-GMP riboswitch. This novel family of proteins is conserved across C. difficile strains but lacks homologs outside the species. We built a tagged version of one SP and detected it by immunoblotting of cell fractions, confirming its protein nature and revealing that it is primarily localized to the cell membrane.RNA sequencing (RNA-seq) data demonstrated that c-di-GMP negatively regulates not only the expression of the 5 SP genes downstream of the riboswitches but also the 2 additional genes. Unexpectedly, we also observed that c-di-AMP, another cyclic dinucleotide primarily involved in osmoregulation, repressed the expression of all seven genes. We performed reporter assays in different strain backgrounds to explore how these small proteins are regulated by both c-di-GMP and c-di-AMP. These experiments indicated that c-di-GMP required the riboswitch for modulation of downstream gene expression. In contrast, c-di-AMP regulated their expression independently of the riboswitch by modulating the promoter activity. Thus, c-di-GMP and c-di-AMP influence SP expression through distinct mechanisms.To investigate the role of these small proteins in C. difficile physiology, we overexpressed one SP and compared its transcriptome to that of the wild-type strain using RNA-seq. This revealed the upregulation of more than 100 genes involved in sporulation in the overexpressing strain. Consistent with these data, overexpression of this SP led to a hypersporulation phenotype. Furthermore, deletion of all 7 SP genes (Δ7 mutant) resulted in a significant reduction in sporulation, with intermediate phenotypes in strains where only some of the SP genes were deleted. Interestingly, the sporulation defect in the Δ7 mutant was mirrored in a strain producing elevated levels of c-di-GMP, suggesting that the impact of c-di-GMP on sporulation could be mediated by SP regulation. To test this hypothesis, we created a Δ7 mutant producing high concentrations of c-di-GMP. The sporulation defect in this strain was equivalent to that of the Δ7 mutant unaffected in its c-di-GMP production, indicating that the effects of SP gene deletions and c-di-GMP overproduction were not cumulative.Overall, our findings demonstrate that this novel family of small proteins is regulated by both c-di-GMP and c-di-AMP and plays a key role in controlling sporulation in C. difficile
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Mouaikel, John. "Caractérisation de la protéine Tgs1, l'hyperméthylase de la coiffe des petits ARN nucléaires". Montpellier 2, 2003. http://www.theses.fr/2003MON20070.
Testo completo
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Simon, Stéphanie. "Implications des petites protéines de stress dans les maladies dégénératives humaines". Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077061.
Testo completoAbstract (sommario):
Les petites protéines de choc thermique ou petites protéines de stress constituent la première ligne de défense de l'organisme vis à vis des stress, qu'ils soient liés à des processus environnementaux, physiologiques ou pathologiques. Il a été établi que des mutations dans les petites protéines de stress (αB-cristalline, αA-cristalline, Hsp22 et Hsp27) sont impliquées dans le développement de différentes pathologies dégénératives humaines telles que les myopathies myofibrillaires, les cardiomyopathies, les cataractes, les neuropathies distales des neurones moteurs et la maladie de Charcot-Marie-Tooth. Lors de ma thèse, j'ai effectué une recherche de mutation dans la séquence codante de l'αB-cristalline, sur une cohorte de plus de 80 patients. Je n'ai pas mis en évidence de mutation, mais j'ai identifié un polymorphisme dans le site donneur du site d'épissage alternatif de l'intron 2 du gène. D'autre part, mes résultats indiquent que les états de phosphorylation de l'αB-cristalline et d'Hsp27 sont modifiés en fonction de l'origine génétique des myopathies myofibrillaire. J'ai également mis en évidence le rôle crucial du résidu arginine en position 120 de l'aB-cristalline afin de conserver la structure quaternaire de la protéine, sa localisation et de maintenir son activité de type chaperon in vitro. Enfin, j'ai pu établir que les mutations pathologiques de l'αB-cristalline et d'Hsp22 entraînent des modifications dans leurs interactions avec les autres petites protéines de stress ce qui pourrait influer sur leurs pertes de fonctions in vivoSmall heat shock proteins or small stress proteins constitute the first defensive line against stress (environmental, physiologie or pathologie). Mutations in small stress proteins (αB-crystallin, αA-crystallin, Hsp22 or Hsp27) are associated with several human degenerative diseases as Myofibrillar Myopathies, Cardiomyopathies, Cataracts, distal Hereditary Motor Neuropathy and Charcot-Marie-Tooth disease. During my PhD, I screened a cohort of 80 patients for mutations in the αB-crystallin gene. No mutations were found but a polymorphism in a spicing site of intron 2 (donor site) was identified. On the other hand, my results indicate that the phosphorylation profile of αB-crystallin and Hsp27 are modified in function of the genetic origin in Myofibrillar Myopathies. I also established that the residue arginine in position 120 of αB-crystallin sequence has a crucial impact on the quaternary structure, the location and the in vitro chaperone-like activity of the protein. Finally, I have established that pathological associated mutations in αB-crystallin or Hsp22 lead to modified interactions of those proteins with the other small stress proteins. Those altered interactions could be implied in the in vivo loss of functions of the mutated proteins and so, in the development of the associated diseases
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Reymond, Philippe. "Les protéines RGK, des petites protéines G atypiques : caractérisation structurale et biochimique du cycle GDP/GTP de Rem2". Paris 6, 2012. http://www.theses.fr/2012PA066626.
Testo completoAbstract (sommario):
Les protéines RGK sont une famille de petites protéines G, impliquées notamment dans la morphologie et la migration cellulaires. Les protéines RGK possèdent de larges extensions en N- et C-terminus du domaine G minimal, capables de recruter différents partenaires. Ces protéines présentent aussi des substitutions aux positions clés pour la reconnaissance et l'hydrolyse du GTP comme le motif [DTAGQ] remplacé par un motif [DxWEx]. Ces éléments soulèvent plusieurs questions comme la capacité des protéines RGK à sentir la présence du GTP ou un possible changement conformationnel des régions Switch lors du cycle GDP/GTP. La détermination de la structure du domaine G des protéines RGK a mis en lumière le motif [DxWEx] comme pouvant être à l’origine de ces propriétés structurales atypiques. Objectifs – Ma thèse a consisté à compléter la caractérisation structurale des protéines RGK en étudiant leur liaison au GTP ; le rôle des extensions ; et l’interaction avec deux de ces partenaires, la Calmoduline et GMIP. Résultats – Nous avons montré que les extensions sont des régions désordonnées qui rendent l’étude des protéines RGK entières en solution difficile. Nous avons mené une étude des propriétés cinétiques du cycle GDP/GTP du domaine G de Rem2 sauvage et d’un mutant du motif [DxWEx], et avons déterminé la structure de Rem2 liée au GDP. Conclusion – Ce travail met en lumière la flexibilité des régions Switch en absence des extensions et suggère que le tryptophane du motif [DxWEx] est un élément important. Il provoque un réarrangement drastique du Switch I et l’empêche de venir se replier sur le nucléotide. Le début du Switch II est contraint à adopter une conformation particulièreRGK proteins are a family of small GTPases, mainly involved in the cellular morphology and migration. They possess large extensions in N- and C-terminus of the minimal G domain that are able to recruit different partners. RGK proteins show conserved substitutions at key positions for the recognition and hydrolysis of the GTP, as the [DTAGQ] motif replacing by a [DxWEx] motif. These elements raise several questions like the capacity of the RGK proteins to sense presence of the GTP or a possible conformational change of the Switch regions during the GDP/GTP cycle. Structure determination of the G domain of the RGK proteins highlights the [DxWEx] motif as the origin of these atypical structural properties. Goals – My thesis consisted to complete the structural characterization of the RGK proteins by studying the GTP binding ; the role of the extensions and the interaction with two of their partners, the Calmodulin and GMIP. Results – We highlighted that extensions are disordered regions which prevent the study of the full RGK proteins in solution. We studied kinetic properties of the GDP/GTP cycle of the G domain of Rem2 (wild type and a mutant of the [DxWEx] motif) and solved the structure of Rem2 bound to the GDP. Conclusion – This work highlights the flexibility of the Switch regions without their extensions and suggests that tryptophan of the [DxWEx] motif is an important feature. It causes a drastic rearrangement of the Switch I that cannot fold back on the nucleotide site and constrains the beginning of the Switch II to adopt a particular conformation
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Fortemaison, Nathalie. "Régulation et rôle des petites protéines G Rho dans la cellule thyroïdienne". Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 2004. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/211107.
Testo completoAbstract (sommario):
Les petites protéines G de la famille Rho sont des régulateurs importants de la fonction cellulaire. Elles lient les signaux extracellulaires à l'activation de diverses voies de signalisation telles que celles menant à la phagocytose, la mitogénèse, l'adhésion cellulaire, l'expression génique, Toutefois leur fonction principale est l'assemblage et l'organisation du cytosquelette d'actine. Ces GTPases fonctionnent comme des interrupteurs moléculaires, actifs lorsque liés au GTP et inactifs sous la forme liée au GDP. Le but de notre thèse est d'investiguer, dans les cellules thyroïdiennes de chien en culture primaire, l'implication des protéines de la famille Rho et de l'organisation du cytosquelette d'actine dans les actions diverses que la TSH exerce, via l'AMPc, sur la morphologie, la prolifération, la différenciation et la fonction des thyrocytes de chien en culture primaire.
Trois cascades conduisant à la mitogénèse coexistent dans la cellule thyroïdienne de chien: la voie de l'AMPc stimulée par la TSH ou la forskoline (activateur direct de l'adénylate cyclase), la voie des facteurs de croissance (tels que l'EGF, l'HGF) activant leur récepteur à activité tyrosine kinase et la cascade dépendante de la protéine kinase C activée par les esters de phorbol (TPA). Contrairement aux voies indépendantes de l'AMPc qui répriment l'expression des caractéristiques de différenciation, la cascade de l'AMPc stimule à la fois la prolifération, l'expression des gènes de l'état différencié et la fonction (iodation, formation d'H2O2, sécrétion hormonale).
Dans la cellule thyroïdienne de chien, les agents activant les cascades dépendantes et indépendantes de l'AMPc ont des effets différents sur l'organisation du cytosquelette d'actine. La TSH/AMPc et le TPA induisent une destruction des microfilaments d'actine et un "ruffling" membranaire, tandis que les autres agents (insuline, EGF, HGF, sérum) ne modifient pas le réseau de fibres d'actine (fibres de stress) présent dans les cellules quiescentes.
Parmi les protéines de la famille Rho, RhoA, Rac1 et Cdc42 sont les premières à avoir été identifiées et sont actuellement les mieux caractérisées. Nous montrons que la TSH, via l'AMPc, induit une diminution de la concentration de la forme active des protéines Rac1, Cdc42 et RhoA. En revanche, les autres agents mitogènes, tels que l'EGF et le TPA, qui activent des voies indépendantes de l'AMPc, n'affectent pas les taux de Rac1 et Cdc42 activés, mais augmentent le taux de RhoA-GTP. L'activation ou l'inactivation des protéines RhoA, Rac1 et Cdc42 est donc un nouvel élément distinguant les voies dépendantes et indépendantes de l'AMPc.
Grâce à deux toxines bactériennes, la toxine B qui inactive les protéines Rho et la toxine CNF1 qui au contraire les active, nous montrons que, dans les thyrocytes, celles-ci jouent un rôle critique dans l'organisation du cytosquelette, dans la transition G1-S, dans l'expression des gènes de différenciation Tg, ThOXs, NIS et TPO, mais pas dans la génération d'H2O2.
En effet, l'activité d'un ou plusieurs membres de cette famille est nécessaire à l'entrée des thyrocytes en phase S et à la phosphorylation de la protéine pRb, étape pré-requise à la transition G1-S. L'activation de ces protéines n'induit cependant pas, à elle seule, la prolifération. Nous mettons également en évidence l'existence d'un nouveau mécanisme par lequel ces protéines contrôleraient l'activité des complexes cycline D3-CDK4 indépendamment de leur assemblage. Par l'utilisation de la dihydrocytochalasine B, qui comme la toxine B via l'inactivation des Rhos, désorganise le cytosquelette, nous démontrons que l'intégrité de celui-ci n'est pas requise pour la progression des thyrocytes en phases G1 et S. L'inactivation des protéines Rho est par contre nécessaire à l'induction, par l'AMPc, de l'expression des gènes de différenciation incluant Tg, ThOXs, NIS et TPO, puisque ce processus est inhibé par la toxine CNF1. De plus, l'inactivation des Rhos par la toxine B, ainsi que le désassemblage des fibres de stress et du cytosquelette induit par la dihydrocytochalasine B, suffisent à imiter l'induction dépendante de l'AMPc de Tg et ThOXs, mais pas de NIS et TPO. La toxine B et la dihydrocytochalasine B imitent aussi l’effet de la voie TSH/AMPc sur l’accumulation de p27kip1. Enfin, nous montrons que l'augmentation de la production d'H2O2, nécessaire à la synthèse des hormones thyroïdiennes, ne requiert pas l'activité de la protéine Rac (ni des autres protéines de la famille Rho) alors que celle-ci joue un rôle déterminant dans la génération d'H2O2 dans le leucocyte.
Doctorat en sciences, Spécialisation biologie moléculaire
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