Tesi sul tema "Microenvironnement des cellules cancéreuses"

Les fibroblastes associés au cancer (CAF) constituent le type cellulaire le plus abondant du microenvironnement tumoral. In vivo, les tumeurs les plus agressives corrèlent avec un enrichissement en CAF et une matrice extracellulaire plus dense. En effet, les interactions dynamiques et réciproques entre les cellules cancéreuses et les CAF favoriseraient la progression tumorale. Cependant, les molécules impliquées dans ces interactions ainsi que leurs effets sur le devenir de la tumeur et sur le remodelage du microenvironnement sont mal connus. Or, mieux définir et comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans cette interaction est crucial afin de pouvoir développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Ainsi, nous avons étudié les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales dans le microenvironnement du cancer de la vessie. Les exosomes sont une classe de vésicules extracellulaires d’origine endocytique de 30 à 200 nm de diamètre. Ils sont sécrétés par tous les types cellulaires et constituent, entre autres, un moyen de communication intercellulaire en transportant protéines, lipides et ARN d’une cellule à l’autre. Les cellules cancéreuses sécrètent une grande quantité d’exosomes et ces derniers joueraient un rôle dans la modulation du microenvironnement tumoral, notamment en activant les fibroblastes sains en CAF. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de démontrer que les exosomes sécrétés par les cellules cancéreuses sont internalisés par les fibroblastes vésicaux sains et qu’ils favorisent la prolifération de ces derniers. De plus, les exosomes dérivés de cellules cancéreuses activent les fibroblastes sains en CAF grâce au TGFβ qu’ils contiennent. La neutralisation du TGFβ par des anticorps spécifiques confirme ces résultats. Une fois activés, les CAF augmentent la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses via une sécrétion soutenue de la molécule IL-6. D’ailleurs, le blocage de la voie de signalisation de l’IL-6 renverse les effets observés sur les cellules cancéreuses. Nous avons également démontré que les CAF diminuent la sensibilité des cellules cancéreuses à la mitomycine C. Enfin, les CAF remodèlent la matrice extracellulaire du microenvironnement tumoral notamment par une sécrétion accrue des protéines oncofétales ténascine C et EDA-fibronectine, ainsi qu’une activité LOX-1 et MMP augmentée. Par ailleurs, la matrice extracellulaire générée par les CAF favorise la transition épithéliomésenchymateuse des cellules urothéliales saines en inhibant le marqueur épithelial Ecadhérine au profit du marqueur mésenchymateux N-cadhérine. Ainsi, une communication étroite et complexe entre les cellules cancéreuses et les CAF favorise la progression tumorale. En secrétant des facteurs solubles à activité protumorale et des protéines de la matrice extracellulaire, les CAF favorisent la prolifération, l’invasion et la chimiorésistance des cellules cancéreuses. Globalement, nos travaux soutiennent l'idée que l’inhibition de la transdifférenciation des fibroblastes sains en CAF est une cible thérapeutique de choix dans le développement de nouveaux anticancéreux.
Les fibroblastes associés au cancer (CAF) constituent le type cellulaire le plus abondant du microenvironnement tumoral. In vivo, les tumeurs les plus agressives corrèlent avec un enrichissement en CAF et une matrice extracellulaire plus dense. En effet, les interactions dynamiques et réciproques entre les cellules cancéreuses et les CAF favoriseraient la progression tumorale. Cependant, les molécules impliquées dans ces interactions ainsi que leurs effets sur le devenir de la tumeur et sur le remodelage du microenvironnement sont mal connus. Or, mieux définir et comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans cette interaction est crucial afin de pouvoir développer de nouvelles cibles thérapeutiques. Ainsi, nous avons étudié les interactions entre les cellules cancéreuses et les cellules stromales dans le microenvironnement du cancer de la vessie. Les exosomes sont une classe de vésicules extracellulaires d’origine endocytique de 30 à 200 nm de diamètre. Ils sont sécrétés par tous les types cellulaires et constituent, entre autres, un moyen de communication intercellulaire en transportant protéines, lipides et ARN d’une cellule à l’autre. Les cellules cancéreuses sécrètent une grande quantité d’exosomes et ces derniers joueraient un rôle dans la modulation du microenvironnement tumoral, notamment en activant les fibroblastes sains en CAF. Les travaux présentés dans cette thèse ont permis de démontrer que les exosomes sécrétés par les cellules cancéreuses sont internalisés par les fibroblastes vésicaux sains et qu’ils favorisent la prolifération de ces derniers. De plus, les exosomes dérivés de cellules cancéreuses activent les fibroblastes sains en CAF grâce au TGFβ qu’ils contiennent. La neutralisation du TGFβ par des anticorps spécifiques confirme ces résultats. Une fois activés, les CAF augmentent la prolifération, la migration et l’invasion des cellules cancéreuses via une sécrétion soutenue de la molécule IL-6. D’ailleurs, le blocage de la voie de signalisation de l’IL-6 renverse les effets observés sur les cellules cancéreuses. Nous avons également démontré que les CAF diminuent la sensibilité des cellules cancéreuses à la mitomycine C. Enfin, les CAF remodèlent la matrice extracellulaire du microenvironnement tumoral notamment par une sécrétion accrue des protéines oncofétales ténascine C et EDA-fibronectine, ainsi qu’une activité LOX-1 et MMP augmentée. Par ailleurs, la matrice extracellulaire générée par les CAF favorise la transition épithéliomésenchymateuse des cellules urothéliales saines en inhibant le marqueur épithelial Ecadhérine au profit du marqueur mésenchymateux N-cadhérine. Ainsi, une communication étroite et complexe entre les cellules cancéreuses et les CAF favorise la progression tumorale. En secrétant des facteurs solubles à activité protumorale et des protéines de la matrice extracellulaire, les CAF favorisent la prolifération, l’invasion et la chimiorésistance des cellules cancéreuses. Globalement, nos travaux soutiennent l'idée que l’inhibition de la transdifférenciation des fibroblastes sains en CAF est une cible thérapeutique de choix dans le développement de nouveaux anticancéreux.
Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most abundant cell type of the tumor microenvironment. In vivo, aggressive tumors correlate with an enrichment of CAFs and a denser extracellular matrix. Indeed, the dynamic and reciprocal interactions between tumor cells and CAFs promote tumor progression. However, the molecules involved in these interactions, as well as their effects on the fate of the tumor and the remodeling of the microenvironment are poorly known. However, better define and understand the molecular mechanisms of this interaction is crucial to develop new treatments. Thus, we studied interactions between tumor cells and stromal cells in the microenvironment of bladder cancer. Exosomes are a class of extracellular vesicles with of endocytic origin measuring 30 to 200 nm in diameter. They are secreted by all types of cells and constitute, among others, a means of intercellular communication by transporting proteins, lipids and RNA from one cell to another. Cancer cells secrete a large amount of exosomes and these exert a role in the modulation of the tumor microenvironment, notably by activating healthy fibroblasts in CAFs. The work presented in this thesis has demonstrated that the exosomes secreted by cancer cells are internalized by vesical fibroblasts and promote their proliferation. In addition, exosomes derived from cancer cells activate healthy fibroblasts in CAFs using the TGFβ that they transport. The neutralization of TGFβ by specific antibodies confirms these results. Once activated, CAFs increase the proliferation, migration and invasion of cancer cells via a sustained secretion of the IL-6 molecule. Moreover, the blocking the IL-6 signaling pathway reverses the effects observed in cancer cells. We have also demonstrated that CAFs decrease the sensitivity of cancer cells to mitomycin C. Finally, CAFs remodel the extracellular matrix of the tumor microenvironment notably by an increased secretion of tenascin C and EDA-fibronectin oncofetal proteins, as well as a LOX-1 and MMP increased activity. In addition, the extracellular matrix generated by CAFs promotes the epithelio-mesenchymal transition of healthy urothelial cells by inhibiting the epithelial marker E-cadherin in favor of the mesenchymal marker N-cadherin. Thus, a close and complex communication between the cancer cells and the CAFs increases tumor progression. By secreting soluble factors with a pro-tumor activity and extracellular matrix proteins, CAFs promote the proliferation, invasion and chemoresistance of cancer cells. Overall, our work supports the idea that the inhibition of the transdifferentiation of healthy fibroblasts into CAFs is a therapeutic target of choice in the development of novel anticancer drugs.
Cancer-associated fibroblasts (CAFs) are the most abundant cell type of the tumor microenvironment. In vivo, aggressive tumors correlate with an enrichment of CAFs and a denser extracellular matrix. Indeed, the dynamic and reciprocal interactions between tumor cells and CAFs promote tumor progression. However, the molecules involved in these interactions, as well as their effects on the fate of the tumor and the remodeling of the microenvironment are poorly known. However, better define and understand the molecular mechanisms of this interaction is crucial to develop new treatments. Thus, we studied interactions between tumor cells and stromal cells in the microenvironment of bladder cancer. Exosomes are a class of extracellular vesicles with of endocytic origin measuring 30 to 200 nm in diameter. They are secreted by all types of cells and constitute, among others, a means of intercellular communication by transporting proteins, lipids and RNA from one cell to another. Cancer cells secrete a large amount of exosomes and these exert a role in the modulation of the tumor microenvironment, notably by activating healthy fibroblasts in CAFs. The work presented in this thesis has demonstrated that the exosomes secreted by cancer cells are internalized by vesical fibroblasts and promote their proliferation. In addition, exosomes derived from cancer cells activate healthy fibroblasts in CAFs using the TGFβ that they transport. The neutralization of TGFβ by specific antibodies confirms these results. Once activated, CAFs increase the proliferation, migration and invasion of cancer cells via a sustained secretion of the IL-6 molecule. Moreover, the blocking the IL-6 signaling pathway reverses the effects observed in cancer cells. We have also demonstrated that CAFs decrease the sensitivity of cancer cells to mitomycin C. Finally, CAFs remodel the extracellular matrix of the tumor microenvironment notably by an increased secretion of tenascin C and EDA-fibronectin oncofetal proteins, as well as a LOX-1 and MMP increased activity. In addition, the extracellular matrix generated by CAFs promotes the epithelio-mesenchymal transition of healthy urothelial cells by inhibiting the epithelial marker E-cadherin in favor of the mesenchymal marker N-cadherin. Thus, a close and complex communication between the cancer cells and the CAFs increases tumor progression. By secreting soluble factors with a pro-tumor activity and extracellular matrix proteins, CAFs promote the proliferation, invasion and chemoresistance of cancer cells. Overall, our work supports the idea that the inhibition of the transdifferentiation of healthy fibroblasts into CAFs is a therapeutic target of choice in the development of novel anticancer drugs.

L’objectif de ce travail était de démontrer que les cellules de glioblastomes sont capables de se différencier et de se dédifférencier en fonction de leur environnement, d’explorer les mécanismes biologiques qui sous-tendent ces transitions, et d’évaluer in vivo les capacités de différenciation à distance des CIG par les CIG-miR-302-367 via la sécrétion de microvésicules. A partir de plusieurs glioblastomes fraichement réséqués, nous avons caractérisé les cellules tumorales sur le plan phénotypique et fonctionnel pour l’état souche et différencié. Nous avons extraits et analysés les microvésicules des milieux de culture de 2 lignées de CIG-miR-302-367. Selon les principes de la thérapie cellulaire, des co-injections de CIG+CIG-miR-302-367 ont été réalisées dans le cerveau des souris. La majorité des cellules tumorales avaient un phénotype et étaient fonctionnellement différenciées. Après 48 heures de culture en milieu EGF, elles acquéraient les propriétés souches phénotypiques et fonctionnelles. Ce processus de dédifférenciation était réversible en 4 jours de culture en milieu sérum et inhibé par l’adjonction dans le milieu EGF d’un anti-EGFR (cétuximab), suggérant un rôle primordial de la voie EGF/EGFR/ERK. Les microvésicules produites par les CIG-miR-302-367 ont permis une baisse significative de la tumorigénicité des CIG in vivo, et une augmentation de la survie des souris. Le concept de plasticité cellulaire remet en cause les dogmes établis sur la hiérarchie tumorale unidirectionnelle. La déplétion tumorale en CIG, en les forçant à se différencier, est une stratégie thérapeutique innovante, qui peut s’envisager par une approche de thérapie cellulaire
There is great interest but little understanding in how cancer stem cells arise. Here we show that tumor cells exhibiting stem-like properties and expression of stemness(CD133) and pluripotency markers (SOX2, NANOG, OCT4), can arise from differentiated tumor cells that are isolated from human glioblastomas. These cells could transit from a more differentiated state that cannot self-renew to a self-renewing stem-like state upon EGF/EGFR signaling. This dedifferentiation process induced expression of pluripotency markers, and restored clonal and tumorigenic properties as well as resistance to temozolomide, the chemotherapy of reference. EGF/EGFR signaling including ERK activation was crucial for this cellular reprogramming. Interestingly, expression of pluripotency markers occurred before the cells re-entered the cell cycle, demonstrating that the cells have the capacity to change and reprogram before the cell division starts. Our findings support a model of tumor homeostasis in which tumor cells driven by environmental cues such as EGF, can spontaneously acquire stem-like properties contributing thus to the enrichment in tumor propagating cells

L’objectif de ce travail était de démontrer que les cellules de glioblastomes sont capables de se différencier et de se dédifférencier en fonction de leur environnement, d’explorer les mécanismes biologiques qui sous-tendent ces transitions, et d’évaluer in vivo les capacités de différenciation à distance des CIG par les CIG-miR-302-367 via la sécrétion de microvésicules. A partir de plusieurs glioblastomes fraichement réséqués, nous avons caractérisé les cellules tumorales sur le plan phénotypique et fonctionnel pour l’état souche et différencié. Nous avons extraits et analysés les microvésicules des milieux de culture de 2 lignées de CIG-miR-302-367. Selon les principes de la thérapie cellulaire, des co-injections de CIG+CIG-miR-302-367 ont été réalisées dans le cerveau des souris. La majorité des cellules tumorales avaient un phénotype et étaient fonctionnellement différenciées. Après 48 heures de culture en milieu EGF, elles acquéraient les propriétés souches phénotypiques et fonctionnelles. Ce processus de dédifférenciation était réversible en 4 jours de culture en milieu sérum et inhibé par l’adjonction dans le milieu EGF d’un anti-EGFR (cétuximab), suggérant un rôle primordial de la voie EGF/EGFR/ERK. Les microvésicules produites par les CIG-miR-302-367 ont permis une baisse significative de la tumorigénicité des CIG in vivo, et une augmentation de la survie des souris. Le concept de plasticité cellulaire remet en cause les dogmes établis sur la hiérarchie tumorale unidirectionnelle. La déplétion tumorale en CIG, en les forçant à se différencier, est une stratégie thérapeutique innovante, qui peut s’envisager par une approche de thérapie cellulaire
There is great interest but little understanding in how cancer stem cells arise. Here we show that tumor cells exhibiting stem-like properties and expression of stemness(CD133) and pluripotency markers (SOX2, NANOG, OCT4), can arise from differentiated tumor cells that are isolated from human glioblastomas. These cells could transit from a more differentiated state that cannot self-renew to a self-renewing stem-like state upon EGF/EGFR signaling. This dedifferentiation process induced expression of pluripotency markers, and restored clonal and tumorigenic properties as well as resistance to temozolomide, the chemotherapy of reference. EGF/EGFR signaling including ERK activation was crucial for this cellular reprogramming. Interestingly, expression of pluripotency markers occurred before the cells re-entered the cell cycle, demonstrating that the cells have the capacity to change and reprogram before the cell division starts. Our findings support a model of tumor homeostasis in which tumor cells driven by environmental cues such as EGF, can spontaneously acquire stem-like properties contributing thus to the enrichment in tumor propagating cells

Le microenvironnement, composé de différents éléments cellulaires et de la matrice extracellulaire, joue un rôle primordial dans le développement tumoral et la dissémination métastatique. Ainsi, l'étude de ces interactions cellulaires est importante pour que des thérapies ciblées luttent contre la chimiorésistance des cellules tumorales. Ce travail de thèse a pour but d'étudier le rôle du facteur de croissance IGF-I dans la chimiorésistance des cellules du cancer de l'ovaire et des leucémies myéloïdes présente au sein du microenvironnement.Dans un premier temps, nous avons mis en évidence que la chimiorésistance des cellules du cancer de l'ovaire, acquise grâce aux cellules hôtes (hospicells), est liée à la sécrétion de IGF-I par ces cellules. Nous avons également montré que IGF-I est impliqué dans la régulation de certains gènes ABC (MDR-1, MRP1, MRP2, et BCRP) via les voies de STAT3, Jak2, PI3K et ERK.Dans les leucémies myéloïdes, nous avons montré que IGF-I a un effet sur la prolifération des cellules tumorales. Il induit l'expression de la protéine P-gp ainsi que la chimiorésistance des cellules sensibles à la chimiothérapie. Nous avons également déterminé le rôle de IGF-I dans la résistance des cellules leucémiques en présence des hospicells. Ces dernières ont une activité hyperangiogénique in vivo, lié à l'HIF-1 et au VEGF, et inhibent les réponses immunes des lymphocytes T par production de NO.Nous avons déterminé le rôle crucial de MMP-9 dans la migration des cellules résistantes du cancer du sein exprimant la protéine P-gp et dans la formation d'un réseau tubulaire, suggérant un lien existant entre l'expression de P-gp et de MMP-9.

Le microenvironnement, composé de différents éléments cellulaires et de la matrice extracellulaire, joue un rôle primordial dans le développement tumoral et la dissémination métastatique. Ainsi, l’étude de ces interactions cellulaires est importante pour que des thérapies ciblées luttent contre la chimiorésistance des cellules tumorales. Ce travail de thèse a pour but d’étudier le rôle du facteur de croissance IGF-I dans la chimiorésistance des cellules du cancer de l’ovaire et des leucémies myéloïdes présente au sein du microenvironnement.Dans un premier temps, nous avons mis en évidence que la chimiorésistance des cellules du cancer de l’ovaire, acquise grâce aux cellules hôtes (hospicells), est liée à la sécrétion de IGF-I par ces cellules. Nous avons également montré que IGF-I est impliqué dans la régulation de certains gènes ABC (MDR-1, MRP1, MRP2, et BCRP) via les voies de STAT3, Jak2, PI3K et ERK.Dans les leucémies myéloïdes, nous avons montré que IGF-I a un effet sur la prolifération des cellules tumorales. Il induit l’expression de la protéine P-gp ainsi que la chimiorésistance des cellules sensibles à la chimiothérapie. Nous avons également déterminé le rôle de IGF-I dans la résistance des cellules leucémiques en présence des hospicells. Ces dernières ont une activité hyperangiogénique in vivo, lié à l’HIF-1 et au VEGF, et inhibent les réponses immunes des lymphocytes T par production de NO.Nous avons déterminé le rôle crucial de MMP-9 dans la migration des cellules résistantes du cancer du sein exprimant la protéine P-gp et dans la formation d’un réseau tubulaire, suggérant un lien existant entre l’expression de P-gp et de MMP-9
The microenvironment, composed of several cellular elements and extracellular matrix, plays an important role in tumor development and metastasis. Thus, the study of these interactions is important for cell targeted therapies fighting against chemoresistant tumor cells. This thesis aims to investigate the role of growth factor IGF-I in the chemoresistance of ovarian cancer cells and myeloid leukemia, present in the microenvironment.As a first step, we demonstrated that drug resistance of ovarian cancer cells gained by host cells (hospicells) is related to the secretion of IGF-I by these cells. We have also demonstrated that IGF-I is involved in the regulation of genes ABC (MDR-1, MRP1, MRP2, and BCRP) via STAT3, Jak2, PI3K et ERK signaling pathways.In myeloid leukemia, we have shown that IGF-I has an effect on cell proliferation. It induces the expression of P-gp protein and chemoresistance of cells sensitive to chemotherapy. We also determined the role of IGF-I in the resistance of leukemic cells in the presence of hospicells. These cells have an in vivo hyperangiogenic activity, related to HIF-1 and VEGF, and inhibit immune responses of T cells by NO production.We determined the crucial role of MMP-9 in resistant cells migration of breast cancer expressing P-gp protein and in the formation of a tubular network, suggesting a link between the expression of P-gp and MMP-9

Les cancers du sein ont la particularité de développer un microenvironnement tumoral important où les fibroblastes associés au cancer (CAF) jouent un rôle crucial dans la tumorigénèse via la sécrétion de différents facteurs de croissance, cytokines, protéases et composants de la matrice extracellulaire. Ces différents facteurs secrétés par les CAFs sont impliqués dans de nombreuses voies de signalisation suggérant que la reprogrammation des cellules cancéreuses par les CAFs peut affecter de nombreux gènes.Le séquençage des ARN messagers (RNAseq) de lignées cellulaires de cancer du sein cultivées en présence de milieux conditionnés de CAF, nous a permis d'identifier 372 gènes surexprimés in vitro par les facteurs sécrétés par les CAF et in vivo selon la teneur en cellules stromales des tumeurs mammaires. De façon inattendue, nous avons pu constater que les facteurs sécrétés par les CAF ainsi que le contenu en cellules stromales des tumeurs n'induisent pas de changements significatifs de méthylation de l'ADN mais activent de manière spécifique des gènes caractérisés par une signature méthylation. Différentes approches expérimentales, telles que l'inhibition de la méthylation de l'ADN, l'inhibition de l'expression de la protéine MBD2 (protéines de liaison à l'ADN méthylé) et des expériences d'immuno-précipitation de la chromatine (ChIP) ont permis de montrer l'implication de ces marques de méthylation et des protéines de liaison à l'ADN méthylé dans la réponse des cellules cancéreuses aux facteurs sécrétés par les CAFs. Ces résultats ont permis l'identification d'événements moléculaires impliqués dans la réponse des cellules tumorales aux signaux sécrétés par les cellules stromales dans les tumeurs mammaires mettant en lumière l'importance des marques épigénétiques dans la reprogrammation des cellules cancéreuses induites par les cellules stromales
Breast cancers develop in complex tissue environments where cancer associated fibroblasts (CAF) play a crucial role in tumorigenesis by secreting various growth factors, cytokines, proteases and extracellular matrix components. Soluble factors secreted by CAFs are involved in many pathways including inflammation, metabolism, proliferation, and epigenetic modulation suggesting that CAF-dependent reprograming of cancer cells affects a large set of genes. From RNAseq data obtained from breast cancer cell lines grown in presence of CAF-secreted factors, we identified 372 upregulated genes exhibiting an expression level positively correlated with the stromal content of breast cancer specimens. Furthermore, we observed that gene expression changes were not mediated through significant DNA methylation changes. Nevertheless CAF-secreted factors but also stromal content of the tumors remarkably activated specific genes characterized by a DNA methylation signature: hypermethylation at transcription start site (TSS) and shore regions. Experimental approaches (inhibition of DNA methylation, knockdown of MBD2, and ChIP assays) demonstrated the implication of DNA methylation and methyl DNA binding protein in the response of cancers cells to CAF-secreted factors. These data put in light the importance of epigenetics marks in the cancer cell reprogramming induced by stromal cell and indicate that the interpreters of the DNA methylation signal play a major role in the response of the cancer cells to the microenvironment

Les glioblastomes (GBM) sont des tumeurs astrocytaires au pronostic défavorable. L’échec des thérapies actuelles (chimio et radiothérapies) est principalement lié à la résistance des cellules souches cancéreuses (CSCs). Ces cellules ont besoin de communiquer en permanence avec leur microenvironnement pour leur survie et pour maintenir une niche favorable à leur développement. Le transfert de matériel entre les CSC, les cellules tumorales et le microenvironnement contribue à l’échappement thérapeutique. Des travaux récents révèlent l’importance des récepteurs aux neurotrophines TrkB et TrkC dans la survie et la croissance des CSC de GBM. Nos travaux préliminaires dans le cancer bronchique démontrent que les récepteurs aux neurotrophines sont transférés aux cellules du microenvironnement via les exosomes afin de les contrôler. Cependant, le mécanisme de diffusion de récepteurs oncogéniques à partir de CSC n’a jamais été étudié. Notre objectif principal était donc de déterminer l’implication des récepteurs des neurotrophines dans le transfert du phénotype agressif des CSC vers les cellules du microenvironnement afin de favoriser la résistance thérapeutique du glioblastome. Nos résultats ont permis d’établir un lien entre le stade de différenciation des cellules tumorales, l’expression des neurotrophines et leur interaction avec le microenvironnement tumoral via les exosomes. Le transfert de TrkB au sein des exosomes joue un rôle clé dans la progression tumorale du GBM et dans l’agressivité cellulaire. Néanmoins, le transfert des récepteurs aux neurotrophines via les exosomes pourrait également être impliqué dans les mécanismes de radiorésistance. Des études menées sur des cellules de GBM humain irradiées et traitées par des exosomes démontrent l’implication de ces derniers dans l’échappement thérapeutique. Parmi les cellules du microenvironnement ciblées par les exosomes, les CSM sont celles qui ont été les moins étudiées bien qu’elles possèdent un tropisme spécifique pour le GBM. Nos travaux démontrent que les exosomes de GBM modifient le phénotype des CSM et augmentent leurs capacités prolifératives et migratoires. La fonction exacte du transfert des récepteurs des neurotrophines devra être analysée dans ces différents modèles afin de préciser son importance dans la physiopathologie du glioblastome et sa progression. L’expression des récepteurs aux neurotrophines dans ces exosomes permet d’envisager leur utilisation en tant que biomarqueurs diagnostiques et/ou pronostiques dans le GBM. Mots clés : Glioblastomes, cellules souches cancéreuses, neurotrophines, TrkB, radiothérapie, cellules souches mésenchymateuses, exosomes
Glioblastoma are tumors derived from astrocytes with a dark prognosis. Current therapies fail to inhibit relapses due to radioresistant properties of cancer stem cells (CSC). Communication between CSC and their microenvironment is required for maintain “stem cells niche” and cell survival . The transfer of materials between CSC, tumor cells and microenvironment contributes to therapeutic resistance. In glioma, recent studies reveal the major role of TrkB and TrkC in survival of CSC. Our previous work, in lung cancer, have shown that neurotrophin receptors exhibits a control on microenvironment cells and angiogenesis through exosome transfer. However, similar mechanism of oncogenic receptor transfer from CSC has never been studied. Our main goal was to determine the involvement of neurotrophin receptors in the transfer of biological aggressiveness to microenvironment cells in order to promote therapeutic resistance in glioblastoma. Our findings suggest a relationship between cell differentiation status, expression of neurotrophin receptors and their interaction with the microenvironment through exosomes. TrkB-containing exosomes play a key role in the control of glioblastoma progression and cell aggressiveness. Mechanisms of radioresistance might also be dependent of the transfer of neurotrophin receptors through exosomes. Indeed, our results on irradiated human GBM cells and treated by exosomes demonstrate the involvement of exosome in radioresistance mechanisms. Although mesenchymal stem cells (MSCs) are considered as stromal components of glioblastoma, their communication with CSC, particularly through exosomes, remain largely undefined. Our results show that GBM-derived exosomes modify the phenotype of MSCs and increase their proliferative and migratory abilities. The putative function of neurotrophin receptors transfer should be analyzed in these models to determine their prime role in glioblastoma pathogenesis and progression. This finding suggest that the neurotrophin receptor expression in exosomes could be used as diagnostis and prognosis biomarkers of GBM

Le récepteur d’endocytose multifonctionnel LRP1 joue un rôle crucial dans la régulation de l’agressivité des cellules cancéreuses, le comportement des fibroblastes et l’angiogenèse. Dans le microenvironnement du cancer du sein, les fibroblastes associés au cancer (CAF) jouent un rôle clé dans la formation et le remodelage de la matrice extracellulaire et de la niche tumorale. Le rôle de LRP1, fortement exprimé dans les CAF, reste mal décrit quant à son influence sur le comportement des cellules endothéliales.Afin d’étudier l’impact de l’expression stromale de LRP1 sur l’angiogenèse, nous avons utilisé différents modèles cellulaires : des fibroblastes embryonnaires murins (MEF-1), des MEF-1 invalidés pour LRP1 (PEA-13) et des cellules CAF2 issus de cancer du sein, invalidées ou non pour LRP1 par interférence ARN. Nous avons utilisé des milieux conditionnés et des matrices dérivées de fibroblastes afin de simuler les effets angiogéniques des fibroblastes et des CAF sur des cellules endothéliales.Nos résultats montrent que l’invalidation de LRP1 dans les fibroblastes embryonnaires et les CAF mammaires entraîne des effets distincts sur des paramètres critiques des cellules endothéliales. L’expression de LRP1 dans les MEF-1 n’affecte pas les fonctions endothéliales, tandis que sa présence dans les CAF diminue les capacités angiogéniques et oriente les processus de remodelage de la matrice de manière défavorable à la migration endothéliale. Grâce à une analyse protéomique complète des plates-formes de signalisation de surface endothéliale régulées par les signaux issus des CAF, nous avons observé une expression différentielle de composés matriciels sécrétés, de récepteurs de surface et de protéines associées à la membrane en fonction de l’expression de LRP1 des cellules sécrétrices. L’analyse des milieux conditionnés de CAF2 a révélé des signaux angiocrines dépendants de LRP1, bien qu’aucune différence n’ait été détectée dans la composition en glycosaminoglycanes.En conclusion, l’expression de LRP1 dans les MEF n’a pas d’incidence sur les fonctions endothéliales alors que dans les CAF le récepteur réduit les capacités angiogéniques. L’identification de cibles modulées par LRP1 à la surface des cellules endothéliales permettra de décrypter les voies angiogéniques contrôlées par LRP1 dans le compartiment fibroblastique
The multifunctional endocytosis receptor LRP1 plays a crucial role in regulating cancer cell aggressiveness, fibroblast behavior and angiogenesis. In breast cancer microenvironment, cancer-associated fibroblasts (CAF) play a key role in formation and remodeling of the extracellular matrix and tumor niche. The role of LRP1, highly expressed in CAF, remains poorly described in terms of its influence on endothelial cell behavior.To study the impact of stromal LRP1 expression on angiogenesis, we used different cell models: murine embryonic fibroblasts (MEF-1), MEF-1 invalidated for LRP1 (PEA-13) and CAF2 cells derived from breast cancer, invalidated or not for LRP1 by RNA interference. We used conditioned media and fibroblast-derived matrices to simulate the angiogenic effects of fibroblasts and CAF on endothelial cells.Our results show that LRP1 invalidation in embryonic fibroblasts and mammary CAF results in distinct effects on critical endothelial cell parameters. LRP1 expression in MEF-1 does not affect endothelial functions, while its presence in CAF diminishes angiogenic capacities and directs matrix remodeling processes in a manner unfavorable to endothelial migration. Through a comprehensive proteomic analysis of endothelial surface signaling platforms regulated by CAF-derived signals, we observed differential expression of secreted matrix compounds, surface receptors and membrane-associated proteins as a function of LRP1 expression in secretory cells. Analysis of CAF2-conditioned media revealed LRP1-dependent angiocrine signals, although no differences were detected in glycosaminoglycan composition. In conclusion, LRP1 expression in MEFs has no impact on endothelial functions, whereas in CAFs the receptor reduces angiogenic capacities. The identification of LRP1-modulated targets on the surface of endothelial cells will enable us to decipher the angiogenic pathways controlled by LRP1 in the fibroblastic compartment

Une tumeur est une structure hautement organisée en 3D, intégrant des relations entre les cellules et avec son environnement. Le remodelage de l'environnement par la tumeur et sa croissance dans un environnement restreint induisent un déséquilibre de l'homéostasie tissulaire et l'accumulation d'un stress mécanique au niveau de la tumeur. Il a été montré que ce stress mécanique est un paramètre important du développement tumoral qui influence, entre autre, la migration et la prolifération des cellules tumorales. Un des aspects majeurs du contrôle de la prolifération cellulaire est la régulation du cycle cellulaire. De nombreuses études montrent que le déroulement de la mitose, étape de division du cycle cellulaire, est régulée par les propriétés mécaniques de l'environnement cellulaire. Cependant, l'impact des contraintes mécaniques sur la progression en mitose a essentiellement été étudié sur des modèles de culture en monocouche et les conséquences induites sur le développement tumoral sont encore méconnues. Dans ce contexte, l'objectif de mes travaux est d'étudier l'impact des contraintes mécaniques sur la division cellulaire, dans un modèle tumoral multicellulaire 3D, le sphéroïde. Ce modèle mime l'organisation multicellulaire et l'hétérogénéité cellulaire telles qu'elles existent in vivo dans des microrégions tumorales. Afin de mimer un environnement confiné, des microsdispositifs ont été fabriqués pour restreindre la croissance et contraindre mécaniquement les sphéroïdes. Ces conditions expérimentales nous ont permis de démontrer que la contrainte mécanique altère la division des cellules au sein des sphéroïdes. L'étude de la dynamique de progression en mitose de sphéroïdes contraints dans un dispositif en agarose adapté à l'imagerie en temps réel, a révélé un délai en prométaphase induit par la contrainte mécanique, probablement du à un défaut transitoire de mise en place du fuseau bipolaire et impliquant le cytosquelette d'actomyosine. Ce défaut ne semble pas induire un défaut d'orientation préférentiel de l'axe de division observé dans les sphéroïdes. De plus, ces résultats montrent qu'en condition de croissance en présence d'un stress mécanique, des traitements déstabilisant le cytosquelette d'actomyosine n'induisent pas d'altération de la mitose, suggérant que des voies de signalisation permettant d'éviter les erreurs de progression en mitose soient activées. L'ensemble de ces résultats suggèrent que la contrainte mécanique induite par la croissance progressive des sphéroïdes dans un environnement confiné ralentit la progression en mitose. Ce ralentissement peut être responsable d'erreurs de ségrégations des chromosomes induisant une augmentation de l'instabilité génétique et une hétérogénéité cellulaire. Cette hétérogénéité est caractéristique des tumeurs et souvent responsable de l'efficacité limitée des stratégies thérapeutiques actuelles. Les travaux réalisés viennent enrichir les connaissances de la réponse des cellules tumorales à leur environnement mécanique tel qu'il existe in vivo et ses conséquences sur le développement tumoral. Il permet aussi d'identifier les caractéristiques importantes des paramètres mécaniques à prendre en compte pour définir l'efficacité des traitements, et ouvre de nouvelles perspectives de thérapies antitumorales
A tumor micro-region consists of a heterogeneous cancer cell population organized in a 3D structure in which cell growth is influenced by interaction with the microenvironment. Changes in mechanical homeostasis within tissues are observed during tumor growth, leading to high pressure and tension forces within the growing tumor. Those changes in mechanical properties of the microenvironment participate to tumor development by influencing, amongst others, proliferation and migration of tumor cells. One important aspect of the control of proliferation is the regulation of the cell cycle. Many studies have demonstrated that mitosis progression, the division process of cell cycle, is not only biochemically regulated, but also mechanically regulated. However, the impact of mechanical cues on mitotic progression has essentially been documented using 2D monolayer-based models and very little is known about the consequences of mechanical stress on cell division within tumors. In this context, my goal was to investigate the impact of mechanical stress on cell division in MultiCellular Tumor Spheroids (MCTS), an in vitro model that mimics 3D cell organization and heterogeneity found in tumor microregions in vivo. We first induced mechanical stress on MCTS by restricting their growth in a confined environment. We demonstrated that mechanical stress impairs cell division. The study of the dynamics of mitosis progression within MCTS mechanically constrained in agarose, showed that mechanical stress induces a delay in prometaphase. This delay may be due to a transient defect in spindle assembly, and possibly implies actin filament dynamics. This defect in spindle assembly does not seem to induce a preferential orientation deviation of the division axis of cells within spheroids. Futhermore, we showed that in this mechanical stressed condition, drugs destabilizing the actomyosin cytoskeleton do not alter mitosis anymore, suggesting that signaling pathways could be activated and avoid aberrant mitosis progression. Altogether these results suggest that mechanical stress induced by progressive confinement of growing spheroid could slow down mitotic progression. However, a defect in mitosis progression could lead to chromosomes missegregation, responsible for increased genomic instability and cellular heterogeneity. This genetic heterogeneity characteristic of tumors is one of the major reasons for the limited efficiency of current therapeutic strategies. Mechanical stress might also induce the activation of specific pathways able to bypass the effect of certain drugs. This study paves the way for future research to a better understanding of the tumor cell response to mechanical cues similar to those encountered during in vivo tumor development. It could contribute to defining important characteristics of mechanical parameters of tumor on drug efficiency and open new perspectives in anti-tumor therapy

La transition cellulaire Mésenchymo-Amiboïde (MAT) est requise pour l'échappement métastasique, cependant elle n'a encore jamais été associée à une situation physiopathologique précise. PAI-1, l'inhibiteur de l'activateur du plasminogène de type-1, est une molécule du microenvironnement tumoral considérée comme facteur de mauvais pronostic et localisée en forte concentration autour des tumeurs les plus invasives. Nous montrons que, sous sa forme matricielle active, PAI-1 est capable d'entretenir, au cours du temps et de façon dose-dépendante, la morphologie amiboïde de cellules cancéreuses colorectales et mammaires, et que celle-ci est associée à une adhérence faible intégrines-indépendante, une migration de type amiboïde et à l'activation de la voie RhoA/ROCK-1/MLC-P. Le mécanisme moléculaire mis en jeu a partiellement été mis en évidence : nous montrons que l'immobilisation de PAI-1 et sa liaison à l'uPA sont indispensables, et nous suggérons la possibilité que le récepteur membranaire uPAR participe à la transmission de signaux maintenant la voie RhoA/ROCK-1/MLC-P active. La compatibilité des effets du PAI-1 matriciel vis-à-vis des principales voies de signalisation impliquées dans la régulation de la transition MAT est établie in silico grâce à une méthode fondée sur la modélisation de la dynamique des réseaux d'interactions. L'ensemble de ces résultats permet pour la première fois de caractériser une situation physiopathologique microenvironnementale favorable à la transition MAT ; et bien que la forme matricielle de PAI-1 n'ait pas encore livré tous ses secrets, elle semble être une cible thérapeutique intéressante.

Les intégrines sont des récepteurs hétérodimériques de surface cellulaire qui jouent un rôle essentiel dans la gestion des interactions cellule-cellule, lesquelles influencent ensuite des processus biologiques à plusieurs échelles tels que le comportement cellulaire, le remodelage de la matrice extracellulaire et la formation des tissus. Ces processus s'étendent de quelques millisecondes à plusieurs jours. Les méthodologies existantes pour étudier la fonction des intégrines à différentes échelles biologiques - des cellules individuelles aux tissus entiers - s'avèrent souvent chroniques et manquent de capacité pour cibler des interactions cellule-cellule spécifiques de manière aiguë.Pour remédier à cette limitation, nous avons conçu des cellules qui modifient rapidement leur comportement en régulant à la baisse la population de surface des intégrines α5β1 par le biais d'un processus d'endocytose médiée par la clathrine à chaud. Cette méthode innovante permet d'induire une internalisation spécifique des intégrines α5β1 et d'obtenir une régulation négative aiguë dans diverses lignées cellulaires en l'espace de 5 à 30 minutes. Nos résultats démontrent que cette internalisation induite des intégrines α5β1 entraîne une diminution de la surface cellulaire, favorise l'absorption de la fibronectine extracellulaire et réduit le taux de compaction des sphéroïdes tumoraux.Ce contrôle ciblé de processus à plusieurs échelles par la régulation négative rapide des intégrines α5β1 met en évidence l'utilité de l'endocytose à chaud en tant qu'outil puissant pour moduler de manière aiguë la biologie cellulaire. Notre approche offre une vitesse sans précédent dans l'ajustement du microenvironnement cellulaire, présentant de nouvelles avenues thérapeutiques et des stratégies innovantes pour l'ingénierie tissulaire en ciblant rapidement les interactions cellule-microenvironnement
Integrins are heterodimeric cell surface receptors that play a critical role in governing cell-cell interactions, which subsequently influence multiscale biological processes such as cell behaviour, extracellular matrix remodeling, and tissue formation. These processes span from milliseconds to several days. Existing methodologies to study integrin function across different biological scales—from single cells to whole tissues—often prove to be chronic and lack the capability to target specific cell-cell interactions acutely.To address this limitation, we engineered cells to rapidly alter their behavior by downregulating the surface population of α5β1 integrins through a process of hot-wired clathrin-mediated endocytosis. This innovative method enables inducible, specific internalization of α5β1 integrins, achieving acute downregulation across various cell lines within 5-30 minutes. Our findings demonstrate that this induced internalization of α5β1 integrins results in a decrease in cell area, promotes the uptake of extracellular fibronectin, and reduces the rate of tumor spheroid compaction.This targeted control of multiscale processes through the rapid downregulation of α5β1 integrins highlights the utility of hot-wired endocytosis as a potent tool for acutely modulating cell biology. Our approach offers unprecedented speed in tuning the cellular microenvironment, presenting novel therapeutic avenues and innovative strategies for tissue engineering by quickly targeting cell-microenvironment interactions

L’étiologie des cancers cutanées est liée à des mutations génétiques résultant de l’exposition aux rayonnements ultraviolets (UV) émis par le soleil. La propagation des cellules cancéreuses dépend aussi des interactions avec les cellules présentes dans le microenvironnement circulant, notamment des fibroblastes associés au cancer (FAC) et des cellules immunitaires. Xeroderma pigmentosum (XP) est une maladie génétique qui comprend 7 groupes de complémentation génétique (XP-A à XP-G). Les patients XP présentent une déficience du mécanisme de réparation des lésions de l’ADN provoquées par les UV. Ces patients sont susceptibles au développement précoce de très nombreux cancers cutanées. XP-C est le groupe de complémentation le plus représenté en Europe. Chez ces patients, les carcinomes spino-cellularies (CSC) sont plus fréquents que les carcinomes baso-cellulaires (CBC) (taux 5 : 1). Les CSC ont un potentiel métastatique plus élevé que les CBC. Des travaux précédents ont suggéré que la réponse immunitaire chez les patients XP pouvait être altérée, incluant un déficit de l’activité cytolytique des cellules Natural Killer (NK) et une diminution du nombre des lymphocytes T circulants.L’objectif central de cette thèse était, d’identifier des facteurs du microenvironnement impliqués dans la progression des cancer cutanées agressifs, en prenant comme modèle de susceptibilité au cancer, des cellules de patients XP-C. Une analyse transcriptomique comparant les fibroblastes WT et des patients XP-C a permis d’identifier que CLEC2A, un ligand activateur du récepteur NKp65 des cellules NK, est exprimé par les fibroblastes WT mais pas par les fibroblastes XP-C. Nos travaux ont pu montrer une diminution du niveau d’expression de CLEC2A au cours de la sénescence réplicative ; une absence dans les FAC et dans les CSC et que, des facteurs solubles secrétés para les CSC diminuent l’expression de CLEC2A. Ces résultats suggèrent que la perte de CLEC2A peut induire un déficit d’activation des cellules NK au sein du microenvironnement tumoral et dans les dermes des patients XP-C. Par la suite, nous avons élaboré un modèle de culture de peau 3D, dans lequel nous avons introduit des cellules NK, en présence ou absence d’anticorps bloquants CLEC2A. Ce modèle nous a permis de montrer que l’interaction CLEC2A/NKp65 régule l’invasion des CSC via un dialogue entre fibroblastes et cellules NK. Nos résultats suggèrent que l’expression de CLEC2A dans les fibroblastes WT contribue à la surveillance immunitaire dans la peau et que son absence, par des facteurs encore inconnus, favorise le développement des cancers agressifs chez les patients XP-C. CLEC2A peut être une cible dans le combat contre la progression des CSC
Skin cancer etiology is related to genetic mutations arising after ultraviolet (UV) sun exposure. The propagation of cancer cells is also dependent of a crosstalk with cells present in the surrounding microenvironment, mainly cancer associated fibroblasts (CAF) and immune cells. Xeroderma pigmentosum (XP) is a genetic disease that comprises seven groups of genetic complementation (XP-A to XP-G). XP patients present a default in the mechanism responsible for the repair of UV-induced DNA lesions. They are prone to develop skin cancers with high frequencies early in their life. XP-C is the most represented complementation group in Europe and in XP-C patients squamous cell carcinoma (SCC) are more frequent than basal cell carcinoma (BCC) (ratio 5:1). SCC have high metastatic potential compared to BCC. Previous studies suggested that the immune responses in XP patients could be altered with defects in their NK lytic activity and a decrease in the levels of circulating T lymphocytes. The main objective of this thesis was to identify microenvironment factors that could contribute to the progression of aggressive skin cancers using XP-C disease cells as a model of skin cancer susceptibility. Comparative transcriptomic analysis of WT and XP-C dermal patient’s fibroblasts revealed that CLEC2A, a ligand of the activating NK receptor NKp65 implicated in the activation of the innate immune system, is expressed in WT fibroblasts and absent in XP-C fibroblasts. Additional work showed that CLEC2A level is decreased in WT fibroblasts during replicative senescence, is absent in CAF and SCC, and is down regulated by soluble factors secreted by SCC cells. These results suggest that the loss of CLEC2A may induce a deficit of NK cell activation in the tumor microenvironment of SCC and in the dermis of XP-C patients. Elaboration of 3D skin culture models including NK cells and, in the presence or absence of blocking anti-CLEC2A antibody, allowed us to show that CLEC2A/NKp65 interaction regulates SCC cells invasion through a crosstalk between fibroblasts and NK cells. Our results suggest that the expression of CLEC2A in fibroblasts contributes to skin immune surveillance while, conversely, its absence under yet unidentified factors, favors the development of aggressive cancers in XP-C patients. CLEC2A could be a potential target in the fight against SCC progression

Les glioblastomes sont des tumeurs primaires du cerveau les plus malignes. L’identification des cellules souches cancéreuses de glioblastome (CSGs) a transformé notre vision globale des glioblastomes en révélant une hiérarchie cellulaire au sein de ces tumeurs. Les CSGs sont douées de propriétés d’auto-renouvellement, de différenciation et peuvent entrer en quiescence. Elles sont considérées comme les cellules entretenant les tumeurs, responsables de leur dissémination et des rechutes après traitement. La découverte des CSGs a conduit à un changement de paradigme dans le développement des thérapies anticancéreuses, avec la nécessité de cibler dans le traitement non seulement les cellules de la masse tumorale, mais aussi les CSGs. Un criblage différentiel de la chimiothèque Prestwick réalisé au laboratoire a permis d’identifier le bisacodyl comme une molécule présentant une cytotoxicité spécifique sur les CSGs en quiescence.Cette thèse présente un travail sur la caractérisation des CSGs, la compréhension du mode d’action du bisacodyl, ainsi que l’évaluation de son potentiel thérapeutique sur un modèle 3D in intro et des modèles in vivo
Glioblastomas are the most malignant primary brain tumors. The identification of glioblastoma stemcells (GSCs) has transformed our comprehension of those tumors by revealing a hierarchical organization. GSCs can self-renew, differentiate and enter into a quiescent state. They are considered as cells which fuel and as the main culprits of tumor relapse. The discovery of GSCs triggered a change in paradigm for cancer therapy. Indeed to gain in efficacy, therapies need to target, not only the cells forming the bulk of the tumor, but also GSCs particularly resistant and endowed with a high tumorigenic potential. Chemical screening of the Prestwick chemical library in our laboratory, unveiled bisacodyl with a specific activity on quiescent GSCs.This thesis presents work on the characterization of GSCs, study of the mode of action of bisacodyl on GSCs, as well as a preclinical evaluation of bisacodyl on a 3D model in vitro and animal models in vivo

L'environnement tumoral reste mal défini et cliniquement sous-utilisé, les agents tumoricides agissant directement sur les cellules tumorales. Cependant, il est admis que les cellules tumorales dépendent de leur environnement pour se développer au maximum. Ce projet de thèse s’est concentré sur la molécule « a proliferation inducing ligand » (APRIL) qui est impliquée dans la survie, la prolifération et la différenciation des cellules B. Son rôle pathologique a été investigué dans les lymphomes diffus à grandes cellules B (DLBCL) et les myélomes multiples (MM). Grâce à un modèle murin nous avons pu démontrer le rôle pro-tumoral direct d’APRIL dans les DLBCL. Chez les patients, APRIL est d’origine paracrine, produit par les cellules myéloïdes et ciblant les cellules tumorales. Son expression intra-tumorale est variable et un niveau élevé corrèle avec un mauvais pronostic. L’expression d’APRIL est dictée par des mécanismes chémotactiques. L’expression différentielle de certaines chémokines par les cellules tumorales influence le recrutement des cellules productrices d’APRIL. Nous avons également démontré qu’APRIL possède un mode de signalisation atypique dans les DLBCL. Les cellules ont besoin d’internaliser APRIL afin d’activer BCMA, un récepteur de signalisation qui est principalement exprimé de manière intracellulaire. Dans les MM, APRIL possède également un rôle pro-tumoral direct tel que démontré dans un modèle murin. Chez les patients, APRIL est d’origine paracrine et principalement exprimé par les cellules myéloïdes immatures. Malgré l’infiltration tumorale de la moelle osseuse, l’expression d’APRIL reste stable grâce au remodelage du microenvironnement. Un modèle murin nous a permis d’identifier une boucle autocrine basée sur l’interkeuline-6 qui permet la persistance des cellules myéloïdes immatures pendant le développement tumoral, fournissant une expression stable du facteur pro-tumoral APRIL. Globalement, nos travaux ont permis d’identifier APRIL comme un biomarqueur prédictif de la survie avec une valeur thérapeutique dans le DLBCL. La caractérisation des mécanismes moléculaires contrôlant l’expression différentielle d’APRIL ouvre des perspectives thérapeutiques pour son antagonisme. APRIL possède également une valeur thérapeutique dans le MM. La caractérisation de la source cellulaire d’APRIL et de l’interleukine-6, deux facteurs pro-tumorales pour le MM, nous a conduit à de nouvelles perspectives thérapeutiques
Tumor microenvironment remains largely ill-defined and clinically underused, as all currently used tumoricidal agents act directly on tumor cells. However it is well known that tumor cells depend on their environment to fully develop. This thesis project focused on the molecule “a proliferation inducing ligand” (APRIL) which is involved in B-cell survival, proliferation and differentiation. Its pathological role was investigated in diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) and in multiple myeloma (MM). Thanks to a murine model we have been able to demonstrate the direct pro-tumoral role of APRIL in DLBCL development. In patients APRIL is of paracrine origin, being produced by myeloid cells and acting on tumor cells. Intra-tumoral expression is variable and a high level of APRIL expression correlates with a poor prognosis. APRIL expression is controlled by chemotactic mechanisms. Differential expression of certain chemokines by tumor cells influence APRIL-producing cells recruitment. We also showed that APRIL has an atypical way of signaling in DLBCL. Tumor cells need to internalize APRIL in order to activate BCMA, a signaling receptor which is mainly expressed intracellularly. In MM, APRIL also possesses a direct pro-tumoral effect as demonstrated in a mouse model. In patients, APRIL is of paracrine origin and mainly expressed by immature myeloid cells. Despite tumor-cell infiltration into the bone marrow APRIL expression remains stable thanks to microenvironment remodeling. A mouse model allowed us to identify an autocrine loop based on interleukin-6 which allows persistence of immature myeloid cells during tumor development, providing a stable expression of the pro-tumoral factor APRIL. Globally, our work identified APRIL as a predictive biomarker with a therapeutic value in DLBCL. Characterization of molecular mechanisms controlling differential expression of APRIL opens new therapeutic perspectives by its antagonism. APRIL also possesses a therapeutic value in MM; characterization of the cellular source for APRIL and interleukin-6, two pro-tumoral factors in MM, has led us to new therapeutic perspectives

Une nouvelle théorie du cancer s’est récemment imposée dans la communauté scientifique. Selon cette dernière, les cancers se développeraient à partir d’une sous-population bien particulière de cellules cancéreuses, appelées « cellules souches cancéreuses » (CSC). Les partisans de la théorie des CSC soutiennent que les rechutes seraient causées par ces cellules, plus aptes à échapper aux thérapies classiques. En conséquence, ils soutiennent que l’élimination de toutes les CSC, dans un cancer donné, est nécessaire et suffisante pour guérir le patient. Dans cette thèse, je propose d’examiner cette stratégie thérapeutique de ciblage des CSC et je montre que sa capacité à guérir les cancers dépend de la façon dont on envisage la nature de la propriété souche. En effet, les cellules souches cancéreuses sont définies par la possession de la propriété souche, c’est-à-dire par leur capacité à s’auto-renouveler et à se différencier. Cependant, cette propriété elle-même reste obscure quant à sa nature. S’agit-il d’une propriété catégorique ou d’une disposition ? Une cellule non-souche (cancéreuse ou non) peut-elle acquérir la propriété souche et sous quelle condition ? En me basant sur une analyse de la littérature scientifique, je montre que quatre conceptions distinctes de la nature de la propriété souche sont aujourd’hui possibles et que, si la théorie des CSC est vraie, déterminer la nature exacte de la propriété souche est capital pour le traitement des cancers
A new theory of cancer has recently gained importance in the scientific community. According to this theory, cancers develop from a particular sub-population of cancer cells, named “cancer stem cells” (CSCs). The proponents of the CSC theory argue that relapses are caused by CSCs because they escape classical therapies. Consequently, they claim that eliminating all the CSCs of a given cancer is a necessary and sufficient condition to cure the patient. In this dissertation, I scrutinize this therapeutic strategy and I argue that its ability to cure cancers will depend on our understanding of the nature of stemness. Indeed, cancer stem cells are characterized by this property, that is, the capacity to self-renew and to differentiate. However, the nature of stemness is rather obscure. Is it a categorical property or a disposition? Can a non-stem cell (cancerous or not) acquire stemness, and under which conditions? On the basis of analysis survey of the scientific literature, I distinguish four possible concepts of the nature of stemness. I contend that if the CSC theory is true, determining the exact nature of stemness is essential for cancers treatments

L’ostéosarcome (OS) est la tumeur osseuse primitivemaligne la plus fréquente. Les cellules souchesmésenchymateuses (CSM) sont suspectées d’être àl’origine de l’OS. Nous avons émis l’hypothèse que desCSM avec des caractéristiques de cellules souchescancéreuses (CSC) pouvaient être impliquées dans ledéveloppement de l’OS, la résistance à lachimiothérapie et l’évolution métastatique.Nous avons isolé et cultivé des cellules dérivées d’OS(CDOS) à partir de fragments tumoraux et nous lesavons comparées aux propres CSM de moelle osseuse(CSMMO) de 6 malades.Les CDOS avaient la même morphologie et le mêmeprofil d’expression de récepteurs membranaires que lesCSMMO. Elles présentaient des capacités dedifférenciation ostéoblastique plus importantes que lesCSMMO. Le caryotype était normal dans les 6populations de CSMMO et dans 4 populations deCDOS. Les CDOS présentaient des caractéristiques deCSC, avec la formation de sphères en milieu semisolide, la diminution du métabolisme mitochondrial ennormoxie. Deux populations de CDOS présentaient desanomalies caryotypiques minimes. Il n’y avait pas deformation de tumeur chez la souris immunodéprimée(SCID). Dans les modèles de coinjection chez la sourisNude, 4 populations de CDOS soutenaient lacroissance tumorale de la lignée d’OS (MNNG-HOS).Les CDOS isolées n’étaient vraisemblablement pastumorales. Elles se présentaient plus comme descellules du microenvironnement, suspectées de souteniret moduler la croissance tumorale. Des étudescomplémentaires sont donc nécessaires pour identifierquels sont les facteurs stromaux influençant lacroissance de l’OS
Osteosarcoma (OS) is the most frequent primitivemalignant bone tumor. We hypothesised that someMSC with cancer stem cell (CSC) characteristics maybe involved in OS development, chemotherapyresistance and metastatic progression.Adherent cells from six human OS samples wereisolated after tumor dissociation and culture. They werenamed OS derived cells (OSDC) and were compared toown patient bone marrow mesenchymal stem cells(BMMSC). We tested MSC characteristics, CSCcharacteristics, and tumor growth support capacities inan induced human OS mouse model.OSDC had the same morphologic aspect andmembrane expression profile as BMMSC. They keptdifferentiation capacities toward osteoblastic lineageand to less extend toward adipogenic and chondrogeniclineage, with variability between different OSDCpopulations. Karyotype was normal for all 6 BMMSCand for 4 OSDC. OSDC showed CSC characteristics,with sphere formations in semi solid conditions,decrease of mitochondrial metabolism in normoxiacondition. Some minimal karyotype abnormalities werefound in 2 OSDC populations. However, no tumorformation was induced in immunocompromised mice(SCID). In coinjection mouse model, 4 out of 6 OSDCincreased tumor growth compared to osteosarcomacells (MNNG-HOS) alone.OSDC that were isolated from human OS samples didnot demonstrate own tumor properties. They are highlysuspected to be part of tumor microenvironment, ratherthan the tumor origin, and to support and modulate thetumor growth. More studies are necessary to identifywhich CDOS factors influence tumor growth suggestingnew stromal targets for combined therapy

L’altération génétique et/ou fonctionnelle de p53 est très répondue dans les cancers humains et est répertoriée dans plus d’un cas sur deux. Les traitements et molécules utilisés en chimiothérapie anticancéreuse induisent pour la plupart l’apoptose dépendante de p53 ce qui confère une résistance particulière aux tumeurs p53 déficientes. Nous avons développé des techniques se basant sur la vidéomicroscopie à haut débit et l’utilisation de cellules fluorescentesTP53+/+ et TP53-/- pour mettre en évidence des agents chimiques qui ciblent les cellules p53 déficientes. Nous avons identifié SP600125, un inhibiteur de kinases dont MPS1, Aurora A et Aurora B, et qui tue préférentiellement les cellules tumorales TP53-/- . Cette cytotoxicité sélective a été confirmée sur de nombreux modèles de cellules déficientes en p53 in vitro et in vivo sur des xénogreffes TP53+/+ et TP53-/- injectés à des souris nudes. Nous avons utilisé une autre molécule qui a un spectre d’inhibition semblable à SP600125, la reversine, et nous avons aussi trouvé qu’elle a une cytotoxicité sélective envers les cellules p53 déficientes.L’analyse vidéomicroscopique des cellules traitées nous révèle que la mort préférentielle des cellules P53 déficientes est intimement liée à un mécanisme de polyploïdisation. En effet, les cellules TP53-/- (contrairement à celles TP53+/+) traitées effectuent des mitoses aberrantes sans karyokinèse ni cytokinèse qui ne sont pas contrôlées par un arrêt du cycle cellulaire. Ces cellules succombent par catastrophe mitotique après activation de la voie mitochondriale de l’apoptose.Cette observation concorde avec le fait que l’inhibition des protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl-2 sensibilise les cellules traitées alors que l’inhibition des protéines BAX, APAF-1 et les caspases protège les cellules TP53-/- de l’effet cytotoxique de SP600125 et la reversine.Ces résultats nous permettent d’envisager ces drogues (ou dérivées) dans la prévention des cas de tumeurs pré malignes et/ou dans le traitement des cas de cancers p53 déficients
The genetic and/or functional alterations of p53 are highly prevalent in cancer and are reported for more than a half of all human cancers. Classic chemotherapy leads p53 mediated apoptosis conferring a drug resistance for p53 deficient cells. We developed in the laboratory a technique based on high-content videomicroscopy and fluorescent TP53+/+ and TP53-/- cells for the screening of molecules that targets p53 deficient cells. We discovered that SP600125, a kinase inhibitor, including MPS1, Aurora A and Aurora B, kills p53-deficient cells more efficiently than their p53-proficient counterparts. This selective cytotoxicity was confirmed in vivo in mice carrying p53-deficient and -proficient human xenografts. Than after we used an another inhibitor with a similar broad-spectrum kinase, reversine, and we found that this molecule have a selective toxicity for TP53-/- cells and this result was confirmed in vitro for both molecule.Videomicroscopy-based cell fate profiling revealed that the p53-deficient cell death is coupled to hyperploïdy mechanism. Indeed, TP53-/- (but not TP53+/+) undergo successive round of abortive mitosis and failed to arrest the cell cycle in response to treatment and cells became polyploidy and progressively succumbed to mitochondrial apoptosis. In line with this notion, the depletion of anti-apoptotic proteins of the BCL-2 family sensitized TP53-/- cells to the toxic effects of SP600125 and reversine. Moreover, the knockdown of BAX or APAF-1, as well as the chemical inhibition of caspases, limited the death of TP53-/- cells.Hence, SP600125 or reversine (and its analogues/derivatives) might be used for cancer chemoprevention (for eliminating pre-malignant cells that have inactivated p53) or chemotherapy of p53-deficient cancers

Une augmentation au moins transitoire de la ploïdie est un événement fréquent de l'oncogenèse. L'hyperploïdisation déclenche un stress du réticulum endoplasmique (RE) caractérisé par l'hyperphosphorylation du facteur d'initiation eucaryote 2α (eIF2α) qui induit l'exposition consécutive de la calréticuline à la surface cellulaire. La calréticuline exerce un effet « adjuvant » en tant que un signal "mange-moi", pour les cellules dendritiques, entrainant un contrôle immunitaire de la tumeur par les lymphocytes T CD8+. Nous avons étudié la possibilité que l'hyperploïdisation puisse également affecter l'antigénicité des cellules cancéreuses en modifiant l'immunopeptidome. Cependant, la vaccination avec des peptides candidats n’a pas réussi à induire des réponses inhibitrices de la croissance tumorale de cellules hyperploïdes in vivo. Nous concluons donc que l'hyperploïdie augmente principalement l'immunogénicité des cellules cancéreuses en affectant leur adjuvanticité (via l’expression de calréticuline) plutôt que leur antigénicité. Nous montrons de plus que des fibrosarcomes induits par méthylcholanthrène (MCA), développés dans des souris Rag2-/-γc-/- immunodéficientes (mais pas dans des souris sauvages), sont particulièrement hyperploïdes, en corrélation avec une teneur en ADN plus élevée, une augmentation de la surface nucléaire, ainsi que l'hyperphosphorylation de eIF2α,. De telles cellules forment des tumeurs dans les souris Rag2-/-γc-/- (dépourvues de cellules T, B et NK) ainsi que dans les souris Rag2-/- (dépourvues de lymphocytes T et B) sans différence entre les deux souches de souris, suggérant que l'absence de cellules B et T est suffisante pour que ces cellules prolifèrent. Pour mesurer ces paramètres, nous avons développé un outil d'analyse morphométrique applicable à l'immunohistochimie. Cet algorithme identifie et quantifie automatiquement la surface des noyaux et l'intensité de la phosphorylation de eIF2α dans une région d'intérêt périnucléaire. Des analyses comparatives ont validé la précision de cette méthode, qui peut être utilisée pour étudier la ploïdie et le stress du RE dans les cancers in situ
An at least transient increase of ploidy, usually by whole genome duplication, is a frequent event in oncogenesis. Hyperploidization triggers an endoplasmic reticulum (ER) stress characterized by the hyperphosphorylation of the eukaryotic initiation factor 2α (eIF2α), with leads to the exposure of calreticulin to the cell surface. Calreticulin is acting like an "adjuvant" effect as a "eat me" signal, for dendritic cells, ultimately eliciting immune control by CD8 + T lymphocytes. We investigated the possibility that hyperploidization might also affect the antigenicity of cancer cells by altering the immunopeptidome. However, vaccination with candidate peptides was unable to elicit tumor growth-inhibitory responses against hyperploid cells in vivo. We conclude that hyperploidy increases the immunogenicity of cancer cells mostly through their adjuvanticity (through calreticulin exposure) rather than their antigenicity. We also show that when developed in Rag2 - / - γc - / - immunodeficient mice (but not in WT mice) fibrosarcomas induced by methylcholanthrene (MCA) are particularly hyperploid, correlating with higher DNA content, increased nuclear surface, as well as the hyperphosphorylation of eIF2α. These cells are able to form tumors in Rag2 - / - γc - / - recipients (which lack T, B and NK cells) as well as in Rag2 - / - recipients (which only lack T and B lymphocytes) without any difference between the two strains, suggesting that the absence of B and T cells is enough to allow these cells to grow. To measure these parameters, we developed a morphometric analysis tool that is applicable to immunohistochemistry. This software automatically identifies and quantifies the surface of nuclei and the intensity of eIF2α phosphorylation within a perinuclear region of interest. Comparative analyzes validated the accuracy of this method, which can be used to investigate ploidy and ER stress in cancers in situ

La 4e de couverture indique : "Les mécanismes cellulaires et biologiques moléculaires qui gouvernent le processus de la consolidation osseuse restent imparfaitement élucidés. Le traumatisme fracturaire induit la mise en jeu d'une cascade de cytokines et facteurs de croissance qui influencent le comportement des acteurs cellulaires participant au processus de la consolidation osseuse. L'expression de cytokines ostéogéniques (BMP-2) et/ou angiogéniques (PDGF, VEGF) par les cellules présentes sur le site fracturaire en fonction des variations du microenvironnement local induit de complexes interactions cellulaires qui optimisent le processus de consolidation osseuse. Une meilleure connaissance de la biologie osseuse est le premier pas vers l'élaboration d'armes thérapeutiques nouvelles au service de la prise en charge des innombrables pathologies osseuses. L'utilisation potentielle des facteurs de croissance et cytokines ostéoinducteurs pour accélérer la consolidation osseuse, favoriser l'ostéointégration d'implants ou traiter les déficits en tissu osseux (ostéoporose) est un véritable challenge qui réunit le chercheur et le clinicien. "

La voie Fas-FasL est la voie majeure d'apoptose dont le rôle est indispensable pour l'homéostasie des cellules hématopoïétiques et la tolérance périphérique. Mon projet de thèse consiste à étudier le rôle de FasL dans la réponse anti tumorale, notamment le rôle de son expression sur les cellules myéloïdes, en l'occurrence les macrophages et les cellules myéloïdes suppressives.Les souris Fasl KO sont caractérisées par une accumulation des différentes populations de cellules hématopoïétiques dans les organes lymphoïdes périphériques. Cependant, elles ne développent pas de tumeurs spontanées. De façon intéressante, nos résultats montrent que lors qu'elles sont transplantées par les cellules tumorales, leur survie est significativement diminuée par rapport aux souris contrôles (Fasl fl/fl), ce qui suggère un rôle de FasL dans la réponse anti-tumorale. Une caractérisation fine de la répartition des cellules myéloïdes chez les souris Fasl KO porteuses de tumeur, montre une répartition différentielle des cellules Gr1+, par une accumulation des M-MDSC, dans la rate de ces souris. En plus, un enrichissement de l'infiltrat tumoral par les macrophages TAM chez les souris Fasl KO a été observé. Ces macrophages, indépendamment de génotype exècrent une forte activité d'arginase et iNOS et une inhibition de la prolifération des cellules T in vitro. Ainsi, la mortalité plus importante chez les souris Fasl KO pourrait, en partie, être associée à cet enrichissement des TAM dans l'infiltrat des souris déficientes en FasL.Afin de déterminer si cette accumulation des cellules myéloïdes immunosuppressives déficientes en FasL est spécifique d'un environnement tumoral ou le reflet d'un état inflammatoire, nous avons examiné le phénotype des macrophages dans un modèle d'inflammation induite par le thioglycollate. Les résultats montrent que les macrophages CD11b+F480+, recrutés sur le site de l'inflammation, lorsqu'elles sont déficientes en FasL, sur-expriment les gènes anti-inflammatoires comme IL-10, Arg1, CCL17. La caractérisation plus fine de cette population de macrophages a montré que la population responsable de ce phénotype suppressive est F480+CD115+IL-4R+. Chez les souris Fasl KO, le pourcentage des macrophages F480+CD115+IL-4R+ est significativement augmenté en comparaison avec les souris contrôles. L'analyse fonctionnelle de cette population CD115+ a montré que ces cellules, inhibent la prolifération et la production d'IFN- des cellules T activées. Ces caractéristiques fonctionnelles sont en faveur d'un phénotype anti-inflammatoire de ces macrophages, qui lorsqu'ils sont déficients en FasL, leur recrutement sur le site de l'inflammation est plus important.L'ensemble de ces résultats suggère que l'expression de FasL sur les cellules myéloïdes pourrait jouer un rôle dans leur polarisation vers un phénotype pro inflammatoire. Ainsi, ce travail pourrait apporter de nouvelles approches de levée de l'immunosuppression pour une immunothérapie efficace.

Au cours de leur maturation, les mégacaryocytes (MKs) de la moelle osseuse migrent de la niche ostéoblastique vers la niche vasculaire où ils se retrouvent en contact étroit avec les sinusoïdes médullaires. Les MKs matures forment alors de longues extensions cytoplasmiques à partir desquelles sont libérées les plaquettes directement dans la lumière du sinusoïde. Dans ce travail, nous avons comparé le rôle des cellules stromales et endothéliales combiné aux forces circulatoires sur la différenciation terminale des MKs et sur leur capacité à produire des plaquettes Les MKs humains issus des cellules CD34+ du sang de cordon ombilical ont été co-cultivées avec les cellules stromales ou endothéliales pendant 3 jours (J10-J13) ; les résultats montrent que les cellules stromales inhibent complètement la formation des proplaquettes et des plaquettes. Cette inhibition s'accompagne d'un développement important des membranes de démarcation et d'une diminution de l'apoptose des MKs. Au contraire, les cellules endothéliales favorisent la formation des proplaquettes. L'exposition des MKs co-cultivés avec les cellules endothéliales aux forces de cisaillement augmente fortement la production plaquettaire, comparée aux MKs témoins. En parallèle avec la fragmentation des proplaquettes, les noyaux polyploïdes se séparent sous l'effet déterminant du flux. En conclusion, ces résultats montrent un effet antagoniste des cellules stromales et endothéliales sur la production plaquettaire. Les forces circulatoires induisent aussi bien la fragmentation cytoplasmique que nucléaire des MKs
Bone marrow megakaryocytes (MKs), in order to achieve terminal maturation, migrate from the osteoblastic niche to the vascular niche, close to the medullary sinusoids. In order to release platelets, MKs extend cytoplasmic extensions in the lumen of the sinusoid followed by platelet release. Therefore, in the présent work, we have compared the role of stromal and endothelial cells combined with shear stress on MKs late differentiation and platelet production. MKs were grown from umbilical cord blood CD34+ cells and co-cultured with stromal or endothelial cells between day 10 and day 13 of culture. The results showed that stromal cells inhibited proplatelet and platelet formation from MKs, slowed down apoptosis while enhancing development of demarcation membranes. In contrast, when co-cultured with endothelial cells, MKs extended numerous and prominent proplatelets. When submitted to shear stress, they produced 4. 8 times more platelets compared with MKs cultured in the absence of endothelial cells. We have also examined the fate of MKs polyploid nuclei, grown from bone marrow CD34+ cells under high shear stress and found that nuclear lobes could separate in parallel with cytoplasm division; this was followed by proplatelet fragmentation. In conclusion, this study shows an antagonist effect of stromal and endothelial cells on human platelet production. It also shows that shear stress is able to induce nuclear as well as cytoplasmic MKs fragmentation, leading to a new anatomical concept of circulating and platelet shedding MKs subunits

La chromatine eucaryote, contenant l’ADN et de nombreuses protéines de liaison, subit une compaction dynamique et fonctionnelle à de multiples échelles, nécessaire pour la régulation de nombreux processus biologiques comme l’expression génique. Afin de définir et maintenir les fonctions cellulaires, les protéines de la régulation transcriptionnelle et de la régulation de la structure chromatinienne agissent de concert pour orchestrer les programmes d’expression génique des cellules. Les facteurs de transcription opèrent de manière combinée et hiérarchique au niveau de nombreux éléments régulateurs, dont le fonctionnement est complexe et intégré, capables de générer de larges boucles topologiques pour réguler spécifiquement un promoteur cible à un moment précis. Le co-activateur transcriptionnel Mediator sert de centre d’interprétation, en connectant physiquement les régulateurs de la transcription à la machinerie transcriptionnelle, pour générer une réponse calibrée. Le complexe de maintenance de la structure des chromosomes, Cohesin, est impliqué dans la formation et la stabilisation des connexions génomiques à l’échelle de nombreuses structures chromatiniennes tri-dimensionnelles dont la caractérisation fonctionnelle commence à être explorée. Ensemble, les facteurs de transcription, Mediator et Cohesin contrôlent l’expression des programmes responsables du maintien de l’identité cellulaire. Les cellules cancéreuses présentent de nombreuses dérégulations au niveau transcriptionnel, et donc un programme d’expression aberrant. Nous avons démontré que les mécanismes de régulation qui contrôlent les cellules cancéreuses sont conservés, et proposons une stratégie qui permette de révéler les facteurs clefs dans la progression tumorale. Nous avons appliqué cette stratégie à la problématique de la résistance endocrinienne dans la progression du cancer du sein hormono-dépendant. Les résultats obtenus suggèrent que le complexe transcriptionnel AP-1 pourrait être impliqué dans l’acquisition et/ou le maintien de la résistance, en réponse aux pressions de sélection induites par les traitements hormonaux. Nous proposons une adaptation progressive et agressive des cellules cancéreuses par re-hiérarchisation des facteurs clefs qui contrôlent sa croissance.
Human chromatin, that contain both DNA and numerous binding proteins, is the target of a dynamic and functional multi-scaled compaction, which leads to the regulation of biologic processes as gene expression. In order to define and maintain cellular functions, transcriptional and structural regulatory proteins act together to orchestrate the different genes expression programs. Transcription factors function in a combinatorial and hierarchical manner on regulatory elements within the genome, which are able to generate large topological loops to specifically regulate a target promoter in the right temporal frame. The general co-activator Mediator functions as a center for proper transduction of the transcriptional input, physically connecting regulatory proteins to the transcriptional machinery, to generate a calibrated biological response. Cohesin is implicated into the formation and stabilization of genomic connections at multi-scaled tri-dimensional resolution, which functional features are beginning to be elucidated. Together, transcription factors, Mediator and Cohesin control expression programs that enable the maintenance of cellular identities. Cancerous cells often show deregulations at the transcriptional level, which lead to aberrant expression programs. We demonstrated that regulatory mechanisms, controlling transcription in cancerous cells, obey to the same rules that in normal cells and are conserved, then enable the characterization of key transcription factors that drive cancer progression. We applied this discovery to hormonal resistance in breast cancers. Our results suggest that AP-1 family could be involved into the acquisition of this more aggressive phenotype, by transcriptionally bypassing the drug effects. We proposed that a model for aggressiveness in cancer cells could be through their adaptation to transcriptional treatments, leading to a modulation of key important transcription factors driving transcriptional programs within the cells.

La dégradation de la matrice extracellulaire (MEC) tient une place prépondérante dans l'invasion tumorale. La MEC des cellules cancéreuses est très riche en acide hyaluronique (AH). Notre but a été d'étudier le rôle de l'hyaluronidase, enzyme dégradant AH, dans l'invasion cancéreuse. Nous avons trouvé que les cellules cancéreuses humaines sécrétaient en culture de l'hyaluronidase active à pH acide et dépendante de la concentration protéique. L'activité hyaluronidase dans les métastases cérébrales était plus élevée par rapport à celle des tumeurs primaires. Les cellules dérivées de métastases produisent plus d'hyaluronidase que les cellules dérivées de tumeurs primaires. Un modèle de formation de métastases a été obtenu en injectant aux souris athymiques, par voie intrapéritonéale, des cellules humaines dérivées d'un cancer du sein (CAL 51). Le passage de CAL 51 du phénotype primaire au phénotype métastatique in vivo était caractérisé par une augmentation de sa capacité à produire l'hyaluronidase ainsi qu'AH et à exprimer les récepteurs d'AH. Une autre lignée (PC3) ne produisant pas d'hyaluronidase induisait moins de métastases que la lignée CAL 51. La lignée PC3 métastatique ne sécrétait pas non plus de l'hyaluronidase et sa production d'AH n'était pas augmentée par rapport à celle de la lignée PC3 primaire. PC3 métastatique exprimait moins de CD44 que la lignée CAL 51 métastatique. Nous avons incubé CAL 51 avec des oligosaccharides d'AH avant de les injecter aux souris afin de saturer les sites membranaires d'AH et d'inhiber leur fixation sur AH de la MEC. Cette étude préliminaire a montré que les fragments d'AH de 6 unités saccharidiques (AH6) réduisait la formation des métastases. En conclusion, nos résultats montrent que le potentiel invasif des cellules cancéreuses est lié à leur capacité à : 1- sécréter l'hyaluronidase et à augmenter cette production. 2- augmenter la production d'AH, indépendamment du taux produit au départ. 3- exprimer des sites de liaison d'AH.

Les propriétés biochimiques de la chromatine peuvent être modulées par l'incorporation de variants d'histones dans la chromatine. Le variant macroH2A contient un domaine amino-terminal typique de l'histone H2A, fusionné à un domaine appelé "domaine macro". A ce jour, trois protéines macroH2A ont été identifiées: macroH2A1.1 et macroH2A1.2 résultant d'un épissage alternatif et macroH2A2. Elles ont été majoritairement associées à la formation de l'hétérochromatine et à la répression transcriptionnelle. L'état de l'art montre ainsi une implication de macroH2A1 dans de nombreux mécanismes cellulaires tels que l'inactivation du chromosome X, la sénescence, le développement cellulaire, la régulation transcriptionnelle et les cassures double brin de l'ADN. Nombres de ces processus sont impliqués dans la formation de cancers, faisant de macroH2A1 un élément important à considérer. Son expression a d'ailleurs été corrélée au développement de nombreux cancers tel que ceux du poumon, du colon, de la peau ou du sein. De par les différences structurales, de liaisons à des ligands et les nombreuses controverses observées dans la littérature entre macroH2A1.1 et macroH2A1.2, il paraît essentiel d'étudier séparément chacun de ces deux variants sans pour autant négliger l'importance de leur interconnexion. Récemment, nous avons déterminé que le niveau d'expression de macroH2A1.1 corrélait spécifiquement avec les cancers du sein triple négatif (TNBC). Au niveau moléculaire, cette association se traduit par une corrélation positive entre le niveau d'expression de macroH2A1.1 et les caractéristiques moléculaires de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT). Dans ce contexte, le but de ma thèse a été d'identifier les propriétés biochimiques de macroH2A1.1 dans plusieurs modèles cellulaires du cancer du sein à l'aide d'un anticorps spécifiquement dirigé contre macroH2A1.1 produit au sein du laboratoire. L'ensemble de ce travail a permis l'identification d'une forme mono-ubiquitinylée de macroH2A1.1 sur sa lysine 123. Les outils techniques mis en œuvre ont également permis d'identifier cette forme modifiée en association avec les duplexes ARN : ADN. Les résultats présentés dans cette thèse permettront de mieux comprendre l'importance des modifications post-traductionnelles des variants d'histone et d'ouvrir un nouveau champ d'exploitation dans la définition des rôles de ce variant
Biochemical properties of chromatin can be modulated by incorporation of histone variants in chromatin. MacroH2A has a amino-terminal domain typical of a full-length H2A, fused to a "macro domain". To date, three macroH2A have been identified: macroH2A1.1 and macroH2A1.2 which are alternative spliced variants and macroH2A2. They have been principally associated to heterochromatin formation and transcriptional repression. State of art shows that macroH2A1 is associated to various cellular mechanisms such as chromosome X inactivation, senescence, cellular development, transcriptional regulation and DNA double strand breaks. Many of these processes are implicated in cancer formation, making macroH2A1 an important element to consider. Its expression has also been correlated to numerous cancer developments such as lung, colon, skin or breast. Due to the structural differences, links to ligands and controversy observed in the literature between macroH2A1.1 and macroH2A1.2, it seems essential to study separately these two variants without omit their interconnection significance. Recently, we have determined that macroH2A1.1 expression level correlated specifically with Triple Negative Breast Cancer (TNBC). At the molecular level, this combination results in a positive correlation between macroH2A1.1 expression level and molecular characteristics of Epithelio-Mesenchymal Transition (EMT). In this context, the aim of my thesis was to identify biochemical properties of macroH2A1.1 in many breast cancer cellular models using a specific antibody for macroH2A1.1 generated in the lab. All this work has allowed the identification of a mono-ubiquitinated form of macroH2A1.1 on its lysine 123. Technical tools implemented have also allowed to identify the modified form in association with RNA:DNA duplexes. The results presented in this thesis will allow to better understand the importance of post-translational modification of histone variant and to open a new operating field in the role definition for this variant

En voulant préciser le rôle du microenvironnement médullaire dans la mobilisation des cellules souches hématopoi͏̈étiques (CSH) hors de la niche hématopoi͏̈étique, nous avons découvert que la capacité de mobilisation des CSH était associée à un facteur génétique, le polymorphisme du gène SDF1, suggérant une implication de cette chimiokine dans le processus de mobilisation. Cependant nous n'avons pas constaté in vivo d'inversion du gradient de SDF-1 entre la moelle et le sang mais une corrélation entre les taux circulants de la protéase MMP-9 et la capacité de mobilisation. Nous avons montré in vitro que la sécrétion de SDF-1 par les cellules stromales médullaires était constitutive, contrairement aux cellules endothéliales, et n'était pas augmentée par le G- ou le GM-CSF. Le rôle des cellules stromales dans la mobilisation des CSH est probablement déterminant par leur capacité à produire seules MMP-9, surtout après stimulation par le G-CSF, cette production variant selon le génotype SDF1
The aim of the study was to assess the specific role of human bone marrow (BM) microenvironment in G-CSF-induced hematopoietic stem cell (HSC) mobilization from the hematopoietic niche to peripheral blood (PB). We showed, for the first time in humans, that ability to mobilize HSC is associated with a genetic factor, the SDF1 gene polymorphism, suggesting a significant role for this chemokine in the mobilization process. However, we did not find in vivo any reversion of the positive SDF-1 gradient between BM and PB but found a correlation between PB levels of MMP-9 and HSC mobilizing capacity. Moreover, we showed in vitro that stromal cells constitutively secreted SDF-1, contrary to endothelial cells, this secretion being not increased by G-CSF used for HSC mobilization. The role of stromal cells in HSC mobilization is probably crucial through their particular capacity to produce MMP-9, notably after G-CSF stimulation, this production being influenced by the SDF1 genotype

Les lymphomes pédiatriques les plus fréquents (30% des lymphomes) se caractérisent le plus souvent par l'expression des oncogènes à activité tyrosine kinase NPM-ALK ou TPM3-ALK (nucleophosmin- ou non-muscular tropomyosin 3- anaplastic lymphoma kinase). Au laboratoire, nous avons développé et caractérisé un modèle unique de lymphomes conditionnels (doxycycline dépendant) pour l'expression de ces oncogènes. Grâce à ces modèles, mes travaux de thèse ont permis de mettre en évidence que le VEGF, facteur clé de l'angiogenèse, était surexprimé dans ces lymphomes. Nous avons également montré que l'ARNm du VEGF est contrôlé par un microARN, miR-16 qui est sous-exprimé dans ce type de tumeurs. La réexpression de miR-16 dans des cellules ALK+ entraine une réduction de l'angiogenèse et de la croissance tumorale (Dejean et al. , Leukemia, 2011). Au diagnostic, les patients atteints de ce type de lymphome présentent une dissémination dans 70% des cas. Nous nous sommes intéressés aux facteurs responsables de l'infiltration lymphomateuse, en particulier au niveau de la peau qui est le site le plus souvent envahi. Nous avons montré que les cellules tumorales sécrètent in vitro une cytokine pro-inflammtoire, HMGB1. Nos résultats montrent que cette cytokine est capable d'induire l'hyper-production d'IL-8 par les kératinocytes via PAR2 et NF-?B. L'IL-8 étant une chimiokine pro-inflammatoire, elle est capable d'attirer des cellules de l'inflammation (neutrophiles et macrophages) et les lymphocytes tumoraux au niveau de la peau. Nous avons montré que l'inhibition d'HMGB1 entraine une réduction drastique des capacités invasives des lignées de lymphomes aussi bien in vitro qu'in vivo. Les kératinocytes activés par des facteurs solubles émanant de la tumeur primaire (dont HMGB1) constituraient alors un environnement favorable à l'infiltration de cellules tumorales. Cette étude pourrait être la première à mettre en évidence une niche pré-métastatique au niveau cutané dans les lymphomes ALK+ (Dejean et al. , manuscrit en préparation). Mes travaux de thèse ont montré que le microenvironnement et la sécrétion de facteurs solubles par les cellules tumorales jouent un rôle prépondérant dans l'évolution des lymphomes ALK+. Les lymphocytes tumoraux sont capables d'induire une angiogenèse et une inflammation à distance qui vont entrainer la croissance et la dissémination tumorales
The most frequent lymphoma in childhood is often charaterized by aberrant expression of oncogenes with tyrosine kinase activity: NPM- or TPM3-ALK (nucleophosmin- or non-muscular tropomyosin 3- anaplastic lymphoma kinase). In our laboratory, we developed and charatacterized a conditional mice model for ALK+ lymphoma (Tet-Off). With those models, my work highlighted the role of VEGF in ALK+ lymphoma angiogenesis. We show that VEGF mRNA can be negatively regulated by one microRNA, miR-16 which is underexpressed in thoses tumors, even in human samples. If miR-16 is reexpressed in ALK + cells, we can osbserve a dealy in tumor growth and a reduction of angiogenesis (Dejean et al. , Leukemia, 2011). Anaplasic large cell lymphoma is characterized by frequent extranodal dissemination (70% of cases) which is skin in most cases. We were then interested in identify solubles factors responsible of this epidermotropism. We show that ALK+ cells (cell lines and human samples) secrete a pro-inflammatory cytokine: HMGB1. Our results demonstrate that HMGB1 is able to induce hypersecretion of IL-8 by keratinocytes, via PAR2 and NF-?B activation. IL-8 is a chemokine which can attract cells with specific receptors (CXCR1 and CXCR2). ALK+ tumor cells, cell lines and human samples, express these two receptors. We also show that inhibition of HMGB1 lead to a drastic reduction of invasive abilities of ALK+ cells in vitro and in vivo. Skin, activated by soluble factors from primary tumor, would then constitute a favorable environment for lymphoma dissemination. This study would be the first to highlight the existence of a cutaneous premetastatic niche in anaplasic large cell lymphoma (Dejean et al. , manuscript in preparation). My thesis work demonstrates the importance of microenvironment and solubles factors from primary tumor to tumorigenesis. Lymphomatous cells are able to induce angiogenesis and distant inflammation to cause tumor growth and lymphoma dissemination

Des études menées sur des modèles animaux ont montré que le métabolisme oxydatif joue un rôle important dans l’hématopoïèse normale et leucémique via le contrôle de l’activation de p38 MAPK. Nous avons établi que les cellules CD34+CD38- médullaires humaines ont un très faible niveau d’H2O2 et une forte expression de GPX3, le gène codant l’enzyme antioxydante glutathion peroxydase-3 (GPx-3), un déterminant majeur du potentiel souche des cellules hématopoïétiques. De plus, la niche leucémique étant essentielle pour l’auto-renouvellement des cellules souches leucémiques, nous avons étudié, chez l’homme, le rôle des cellules souches/stromales mésenchymateuses (CSM) médullaires primaires, dans la régulation de l’axe GPx-3/H2O2/p38 MAPK des cellules leucémiques et avons montré que les CSM contrôlent cet axe dans les cellules leucémiques humaines KG1a en régulant l’expression de GPx-3. Ces résultats ont bénéficié du développement de deux méthodes originales, l’une quantifiant l’expression des gènes antioxydants par RT-qPCR (« antioxydogramme », brevet) et l’autre permettant une analyse en haute résolution du cycle cellulaire par cytométrie en flux
Studies in animal models have demonstrated that oxidative metabolism plays an important role in normal and leukemic hematopoiesis by controlling the p38 MAPK activation. We have established that the human bone marrow CD34+CD38- cells have a very low H2O2 level and express GPX3, the gene encoding for the antioxidative enzyme gluthathione peroxidase-3 (GPx-3) which is a major determinant of the stem cell potential of hematopoietic cells. As the niche is essential for the leukemic stem cell self-renewal, we have studied the role of human primary bone marrow mesenchymal stromal/stem cells (MSCs) in regulating the axis GPx-3/H2O2/p38 MAPK in human leukemic cells and we have shown that MSCs control this axis in human KG1a leukemic cells by regulating the expression of GPx-3. These results benefited from the development of two original methods, the first one quantifying the expression of by RT-qPCR of antioxidative genes (“antioxidogram”, patent) and the second one for high resolution analysis of the cell cycle by flow cytometry

L'identification des cellules souches cancéreuses (CSC) dans les tumeurs hématologiques et solides a conduit à de nombreuses études fondamentales et translationnelles. Les cellules cancéreuses présentent cependant une certaine plasticité. En effet, les cellules cancéreuses non souches (non-CSC) différenciées peuvent générer des CSC en réponse à divers stimuli. Ainsi, la radiothérapie (RT) entraîne l'induction de CSC à partir de non-CSC, in vitro. Cette reprogrammation pourrait participer aux résistances aux traitements et aux récidives. Malgré tout, les mécanismes à l'origine de la reprogrammation restent méconnus, et il paraît essentiel d'identifier des cibles pour prévenir l'apparition de CSC. Pendant ma thèse, j'ai montré que le milieu de non-CSC irradiées induit la reprogrammation en CSC mammaires. J'ai pu voir que la RT entraîne la sécrétion spécifique de chimiokines, dont CXCL1 et CCL5. Leur inhibition et le traitement par protéine recombinante ont permis de montrer l'implication de CXCL1, CCL5 et leurs récepteurs dans la reprogrammation in vitro. De plus, l'inhibition in vivo de CXCL1 et CCL5, combinée à la RT dans un modèle murin de xénogreffes induit une augmentation de la survie. Enfin, l'analyse transcriptomique des bases de données cliniques a démontré une corrélation entre l’expression des chimiokines et leurs récepteurs avec des signatures de CSC et de sous-types plus agressifs dans le cancer du sein, et une survie sans métastases diminuée. Mes résultats indiquent un rôle des chimiokines dans la reprogrammation de non-CSC en CSC et qu'elles peuvent constituer de nouvelles cibles thérapeutiques, en combinaison avec les traitements traditionnels
Cancer stem cells (CSCs) identification in hematologic and solid tumors has paved the way to many fundamental and translational studies. However, recent studies have highlighted cancer cells plasticity. Indeed, differentiated non-cancer stem cells (non-CSCs) can generate CSCs upon various stimuli. In particular, radiotherapy (RT) induces CSCs from non-CSCs, in vitro. This reprogramming could be involved in treatments resistance and recurrence risk. Nevertheless, reprogramming mechanisms remain unknown, and identification of new targets seems essential to prevent CSC emergence. During my PhD thesis, I have shown that media from irradiated non-CSCs induces mammary CSC reprogramming. I have demonstrated that RT lead to specific chemokines secretion, as CXCL1 and CCL5. Inhibition and recombinant proteins treatments allowed me to demonstrate the involvement of CXCL1, CCL5 and their receptors in in vitro reprogramming. Moreover, in vivo inhibition of CXCL1 and CCL5, combined with RT, lead to an increased survival, in a xenografted mouse model. Finally, transcriptomic analysis of chemokines and receptors expression from clinical databases has shown a correlation with signatures of CSCs and more agressive breast cancer subtypes, as well as a decreased metastasis-free survival. These findings denote the involvement of chemokines in non-CSCs reprogramming into CSCs in breast cancer, and the potential of chemokines to constitute new therapeutics targets, in combination with conventional anti-cancer treatments

Les tumeurs mammaires sont connues pour présenter une grande hétérogénéité intratumorale qui contribue à l’échec thérapeutique et à la progression de la maladie. L’origine de dette hétérogénéité s’explique principalement par l’organisation hiérarchique des tissus tumoraux où plusieurs sous-populations de cellules souches de cancer du sein (bCSC) sont capables de s’auto-renouveler et de maintenir l’architecture oligoclonale de la tumeur. Dans la mesure où les bCSC stimulent la croissance tumorale, résistent aux thérapies conventionnelles et initient le développement des métastases, il est indispensable de développer des thérapies spécifiques ciblant ces cellules. L’élaboration d’une telle stratégie nécessite la compréhension des propriétés moléculaires intrinsèques des bCSC. Pour mieux comprendre leur biologie, nous avons isolé les bCSC de différentes xénogreffes dérivées de tumeurs de patientes et établit leurs profil d’expression génique. Nous avons identifié un programme transcriptionnel pouvant être impliqué dans la réduction du stress réplicatif (SR) des bCSC . Nous avons montré que comparé aux non-bCSC, les bCSC présentent une sur-activation de la recombinaison homologue qui leur permet de réduire leur niveau de SR. Nous avons ensuite montré en réalisant un essai clinique que l’inhibition de cette voie permet de les sensibiliser à des agents génotoxique. Ces travaux identifient le SR comme le talon d’Achille des bCSC et mettent en évidence la recombinaison homologue comme cible potentielle pour sensibiliser les BCSC aux thérapies conventionnelles
Breast tumors are known to present a major intratumoral heterogeneity that contributes to therapy failure and disease progression. The origin of this cellular heterogeneity is mainly explained by a hierarchical organization of tumor tissues where several subpopulations of self-renewing breast cancer stem cells (bCSCs) sustain the long-term oligoclonal maintenance of the neoplasm. bCSCs drive tumor growth, resist to conventional therapies and initiate metastasis development. Thus, developing bCSC-targeting therapies is becoming a major challenge requiring the understanding of the unique molecular circuitry of bCSC as compared to non-bCSC. To better understand the biology of these cells, we isolated bCSCs from different patient–derived xenografts (PDXs), derived fom breast tumors, and established their gene expression profiles. We identified a bCSC core transcriptional program that may be implicated in the reduction of the replicative stress in CSC: overexpression of genes implicated in dNTP metabolism and homologous recombination (HR). Our results show that HR plays a major role in SR regulation of bCSC and that bCSC are more resistant to RS than non-bCSC, We realized a preclinical assay in PDX and showed that HR inhibition prevent bCSC expansion Cisplatin-induced, suggesting a sensitization of the bCSC to the chemotherapy. Our results identify replication stress as the Achilles’ heel of bCSC and highlights HR as potential targets for anti-bCSC therapy

L’autophagie est régulée par l’adhérence cellulaire. Dans les cellules adhérentes sur le collagène IV, l’autophagie basale est élevée mais non inductible par la carence, contrairement aux cellules adhérentes sur le collagène I qui présentent une autophagie basale faible mais inductible. Cette régulation dépend de l’activation de la protéine kinase FAK par l’adhérence des cellules au collagène IV. La survie à la carence nutritionnelle des cellules adhérentes sur le collagène IV ne dépend pas de l’autophagie. Nous avons également étudié le rôle de l’autophagie au cours de la migration : l’autophagie modifie le recyclage des intégrines en convergeant avec la voie d’endocytose et freine la migration des cellules. De plus, deux comportements différents au sein de notre population de cellules migrantes ont été décelés : les cellules situées en front de migration forment peu d’autophagosomes et présentent une faible activité pour la kinase mTOR comparativement aux cellules qui les suivent

Au cours du développement du cancer, la migration des cellules cancéreuse en 3D joue un rôle essentiel dans le processus de dissémination des métastases. L’étude de la migration cellulaire dans des matrices 3D ainsi que les conséquences induites sur cette matrice sont actuellement étudiées par plusieurs équipes de recherche. Notamment, la réorganisation de la matrice extracellulaire et plus précisément les déplacements des fibres de la matrice induits par les forces que la cellule exerce sont des études en plein essor. Nous avons étudié comment les cellules cancéreuses migrent dans des gels 3D en utilisant du collagène et de la fibronectine pour mimer la matrice extracellulaire des tissus. Nous avons utilisé un microscope confocal afin de visualiser le cytosquelette d’actine des cellules en fluorescence et les fibres de collagène en réflexion. Dans ce travail,nous avons utilisé différentes concentrations de collagène et des lignées cellulaires d’invasivités différentes. A partir des films 3D obtenus en microscopie, nous avons déterminé la vitesse et la persistance des cellules cancéreuses en fonction de leur invasivité et de la concentration de collagène. La vitesse augmente avec l’invasivité cellulaire et diminue avec l’augmentation de la concentration en collagène. La persistance ne dépend que de la concentration en collagène et décroit avec celle-ci. Nous avons également calculé les champs de déplacement des fibres de collagène à l’aide d’un programme de corrélation de volume. Nous avons pu étudier ces champs de déplacement en fonction du type de migration de la cellule, de l’invasivité cellulaire et de la concentration en collagène des gels. Nous avons montré que les normes de vecteurs de déplacement augmentent avec l’invasivité cellulaire et diminuent avec l’augmentation de concentration en collagène. Enfin, ces champs de déplacement nous ont permis de déterminer les étapes des migrations mésenchymateuse et amiboïde en 3D. Nous avons découvert 5 étapes pour la migration mésenchymateuse correspondant au repos de la cellule, à la création d’une extension membranaire, à l’adhésion de la cellule aux fibres, au détachement de l’arrière du corps cellulaire afin de permettre à la cellule de migrer et à la dissolution de l’adhésion cellule/fibre. 4 étapes ont été déterminées pour la migration amiboïde et correspondent au repos de la cellule, à la création d’une extension membranaire, au déplacement de la cellule en poussant sur son environnement et à la rotation de la cellule. Ces étapes associées à des champs de déplacement sont en accord avec la littérature et nous avons pu mettre en évidence de nouvelles étapes comme la rotation de la cellule dans la migration amiboïde.Ces résultats permettent de mieux comprendre comment se déroule la migration des cellules cancéreuses dans une matrice extracellulaire
3D migration of cancer cells plays an essential role in the dissemination of cells during metastasisin cancer. The behavior of cancer cells migrating in a 3D extracellular matrix and its consequences on themicroenvironment are still currently under investigation. The study of the reorganization of the extracellular matrixfibers and more precisely how the fibers move due to the forces that the cell exerts just start to be investigating.We studied how cancer cells migrate in 3D gels using collagen and fibronectin to mimic the extracellularmatrix. We used confocal microscopy to image the actin cytoskeleton of cells in fluorescence and fibers in reflectionover time. In our studies, we used different collagen concentrations and cell lines with different invasivities. Fromthese 3D movies, we determined cancer cell velocities and persistence as a function of collagen gel concentration aswell as cell invasiveness. The cells velocities increase with invasiveness and decrease with collagen concentration.As for persistence, it decreases with collagen concentration but it do not change with cells invasiveness. We alsocalculated the displacement field of the collagen using a volume correlation program. Using this information, westudied the fibers displacement induced by the cell depending on its migration type, its invasivity and the collagenconcentration. We showed norms of fibers deplacement vectors increase with cell invasiveness and decrease withcollagen concentration. Finally, the displacement fields enabled us to determine the migration steps of mesenchymaland amiboid migrations. We discovered 5 steps in mesenchymal migration : cell rest, creation of extension, adhesionof the cell to the fibers, detachment of the cell rear and dissolution of cell/fibers adhesions. 4 steps have beencharacterized in amiboid migration : cell rest, creation of extension, displacement of the cell by pushing on fibersand rotation of the cell. These steps associated with displacement fields are in agreement with litterature and wehighlighted new steps as the rotation of the cell in amiboid migration.Taken together these results enable us to better understand how the migration of cancer cells takes place in a3D matrix

Les cellules souches cancéreuses (CSC) représentent une sous-population de cellules tumorales à l’origine de l’hétérogénéité et de la croissance tumorale. Les CSC sont plus résistantes aux traitements, et à l’origine de la rechute et des métastases. L’identification des CSC constitue actuellement un enjeu majeur dans le développement de nouvelles thérapies ciblées pour inhiber la croissance tumorale et éradiquer le cancer. Dans ce travail, nous avons cherché à identifier, caractériser, et cibler les CSC dans l’adénocarcinome gastrique. Des modèles murins de xénogreffe de tumeurs primaires de patients atteints d'adénocarcinome gastrique hors cardia de types intestinal et diffus ont été développés, ainsi qu’un modèle de tumorsphere in vitro afin d’évaluer les capacités tumorigéniques de sous-populations tumorales. Nous avons identifié CD44 et l'aldéhyde déshydrogénase (ALDH) comme marqueurs d’enrichissement des CSC dans les 2 types d’adénocarcinomes gastriques, l’ALDH représentant un marqueur plus spécifique que CD44. Nous avons ensuite étudié l'effet de l’acide rétinoïque tout trans (ATRA), et nous avons montré que l'ATRA inhibe la formation et la croissance des tumorspheres in vitro ainsi que la croissance tumorale in vivo. Cet effet de l’ATRA passe par l’inhibition de l’expression des marqueurs souches et des capacités d'auto-renouvèlement des CSC. En conclusion, CD44 et ALDH sont des marqueurs de CSC dans les adénocarcinomes gastriques hors cardia de types intestinal et diffus, et le traitement par l’ATRA constituerait une stratégie commune de traitement pour cibler spécifiquement les CSC et inhiber la croissance tumorale dans ces deux types de cancer gastrique
Cancer stem cells (CSCs) are a subpopulation of tumor cells at the origin of the heterogeneity and growth of tumors. CSCs are more resistant to treatment, and are responsible for relapse and metastasis. The identification of CSCs is a major challenge for the development of new targeted therapies to inhibit tumor growth and eradicate cancer. In this work, we aimed to identify, characterize, and target CSCs in gastric adenocarcinoma. Mouse models of primary tumor xenografts from intestinal and diffuse type non-cardia gastric adenocarcinomas from patients were developed, as well as an in vitro tumorsphere assay, to assess the tumorigenic capacity of subpopulations of tumor cells. We identified CD44 and aldehyde dehydrogenase (ALDH) as CSC enrichment markers in the two types of gastric adenocarcinoma, ALDH representing a more specific marker than CD44. We then studied the effect of All-trans retinoic acid (ATRA), and showed that it inhibited the formation and growth of tumorspheres in vitro and tumor growth in vivo. This effect of ATRA is due to the inhibition of stem marker expression and the self-renewal capacity of CSCs. In conclusion, CD44 and ALDH are effective CSC markers in intestinal and diffuse type non-cardia gastric adenocarcinomas, and treatment with ATRA provides a common treatment strategy to specifically target CSCs and inhibit tumor growth in both subtypes of this gastric cancer

Le récepteur-canal P2X7 est fortement exprimé et est fonctionnel dans la lignée de cellules cancéreuses mammaires humaines hautement invasives MDA-MB-435s. L’activation de P2X7 par l’ATP extracellulaire est responsable de l'émission des prolongements cellulaires et l'augmentation de la migration cellulaire. En outre, l’activation de P2X7 augmente l’invasion cellulaire à travers la matrice extracellulaire et fait intervenir la libération de forme mature de cathepsines à cystéine dans le milieu extracellulaire. L’inhibition pharmacologique de P2X7 diminue l’invasivité des cellules cancéreuses dans un modèle de micrométastases chez le poisson zèbre. Nous avons également montré que l’émodine (1,3,8-trihydroxy-6-méthylanthraquinone) une anthraquinone isolée de Rheum officinale Baill (Rhubarbe chinoise) inhibe l’invasivité des cellules cancéreuses humaines via l’antagonisme de P2X7 et n’as pas d’effet sur les autres récepteurs P2X. Nos résultats démontrent un nouveau mécanisme entre la fonctionnalité de P2X7 dans les cellules cancéreuses et l’invasivité cellulaire, un paramètre clé dans la croissance tumorale et le développement des métastases. Ceci suggère également un rôle thérapeutique potentiel pour les antagonistes des P2X7
P2X7 receptor channel is highly expressed and fully functional in the highly invasive human breast cancer cell line MDA-MB-435s. Its activation by extracellular ATP is responsible for the extension of neurite-like cellular prolongations, and the increase in cell migration. Furthermore, P2X7 activation enhanced invasion through the extracellular matrix and was related to the increase of mature forms of cysteine cathepsins in the extracellular medium. Pharmacological targeting of P2X7 decreases cancer cell invasiveness in a zebrafish model of micrometastases. We also showed that emodin (1,3,8-trihydroxy-6-methylanthraquinone) an anthraquinone derivative originally isolated from Rheum officinale Baill (Chinese Rhubarb) inhibits human cancer cell invasiveness by specifically antagonizing the P2X7 and not the other members of the P2X family. Our results demonstrate a novel mechanistic link between P2X7 functionality in cancer cells and invasiveness, a key parameter in tumour growth and in the development of metastases. These results also suggest a potential therapeutic role for the newly developed P2X7 antagonists

Ce projet de thèse se focalise sur l’étude du potentiel rôle mécanosensible de PARP3 dans un modèle de cancer agressif, le glioblastome. PARP3 fait partie de la famille des poly(ADP-ribose) polymérases, une famille de 17 membres qui catalysent l’ajout d’un ou de plusieurs résidus d’ADP-ribose sur des protéines acceptrices. Il s’agit d’une protéine identifiée dans la réparation de cassures double-brins de l’ADN, dans la différenciation cellulaire mais également dans la progression tumorale. Dans ce travail, nous révélons que la disruption de PARP3 (Crispr/Cas9) dans un modèle cellulaire de glioblastome (lignée U373-MG) modifie différents processus cellulaires mécanosensibles (prolifération, adhésion, migration) et la structure du cytosquelette d’actomyosine et de lamines. Par RNAseq, nous montrons que la disruption de PARP3 altère l’expression transcriptionnelle de différents gènes relatifs à des éléments mécanosensibles (voies de signalisation, matrice extracellulaire). Par microscopie à force atomique et par test de digestion à la MNase, nous révélons respectivement que l’absence de PARP3 modifie la rigidité nucléaire et la compaction de la chromatine. Des expériences d’immunofluorescence, nous ont permis de définir PARP3 comme une protéine mécanosensible car sa localisation subcellulaire est dépendante de la rigidité du support de culture. Enfin, ce travail offre également un large panel de données (ATACseq, RNAseq, protéomique) permettant une approche mécanistique du rôle de PARP3 dans la mécanoréponse cellulaire
This thesis project focuses on studying the potential mechanosensitive role of PARP3 in an aggressive cancer model, the glioblastoma. PARP3 belongs to the poly(ADP-ribose) polymerase family, a family of 17 members that catalyze the addition of one or more ADP- ribose residues onto acceptor proteins. PARP3 plays a role in DNA double-strand breaks repair, in cell differentiation, but also in tumor progression. In this work, we reveal that disrupting PARP3 (Crispr/Cas9) in a glioblastoma cell model (U373-MG cell line) impacts various mechanosensitive cellular processes (proliferation, adhesion, migration) as well as the structure of the actomyosin and lamin cytoskeletons. RNAseq studies reveals that the absence of PARP3 alters the transcriptional expression of various genes related to mechanosensitive elements (signaling pathways, extracellular matrix). By atomic force microscopy and MNase digestion tests, we respectively reveal that the absence of PARP3 modifies nuclear rigidity and chromatin compaction. By immunofluorescence experiments, we show that PARP3 is a mechanosensitive protein since its subcellular localization depends on the stiffness of the culture substrate. Finally, this work also provides a wide range of data (ATACseq, RNAseq, proteomics) that permit to progress on the mechanistic role of PARP3 in the mechanoresponse of tumour cells

Les métastases sont une complication souvent irréversibles et fatales du cancer. L'adhérence et la migration des cellules cancéreuses sur et à travers l'endothélium vasculaire sont des étapes critiques du processus métastatique. Nous avons étudié le rôle des molécules d'adhérence, E sélectine et intégrines, ainsi que celui de la kinase SAPK2/p38 dans la régulation de l'adhérence et la migration transendothéliale des cellules HT-29 provenant d’un carcinome du colon. Le TNFα augmente fortement l'expression de la E-sélectine par les cellules endothéliales humaine HUVEC. Cet effet est indépendant de l'activation de SAPK2/p38 induit par le TNFα. L'adhérence des cellules HT-29 sur une monocouche de cellules HUVEC prétraitées au TNFα dépend de l'expression de la E-sélectine mais est indépendante de l'activité de SAPK2/p38 des cellules HUVEC et des cellules cancéreuses. Le blocage par des anticorps spécifiques des intégrines des cellules HT-29 révèle aussi la participation de l'intégrine β4 dans leur adhérence aux cellules HUVEC activées par le TNFα. L'adhérence par l’intégrine β4 est impliquée plus tardivement que l’adhérence par la E-sélectine. L'adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées mène à l'activation de SAPK2/p38 dans les cellules cancéreuses. De plus, une protéine chimérique de E-sélectine/Fc induit l'activation spécifique des kinases SAPK2/p38 et ERK des cellules HT-29. Ceci suggère que l'attachement des cellules HT-29 à la E-sélectine implique un récepteur fonctionnel et signalétique. Cependant, la liaison de la E-sélectine aux cellules HT-29 n’a pas conduit à la phosphorylation de l’intégrine β4, suggérant que ces deux événements ne sont pas liés signalétiquement. L’adhérence des cellules HT-29 aux cellules HUVEC activées implique également un facteur soluble non identifié. Ceci suggère que l’adhérence des cellules cancéreuses à l’endothélium est comparable à celle des lymphocytes, c’est-à-dire qu’elle implique l’utilisation séquentielle de sélectines, chimiokines et intégrines. Le blocage de l'augmentation de l'activité de SAPK2/p38 induite par l’adhérence des cellules HT-29 empêche leur migration transendothéliale. Nos résultats suggèrent que la régulation de la migration transendothéliale des cellules cancéreuses implique deux étapes essentielles: une interaction spécifique avec l'endothélium par l'utilisation séquentielle de molécules d'adhérence, telles que la E-sélectine et l’intégrine β4, et une augmentation du potentiel migratoire par l'activation médiée par l’adhérence de la voie SAPK2/p38.
Metastasis is a dreadful complication of cancer. Adhesion and migration of tumor cells on and through the vascular endothelium are critical steps of the metastatic process. We investigated the roles of the adhesion molecules E-selectin and integrins, as well as the role of the MAP kinase SAPK2/p38 (stress-activated protein kinase-2/p38), in modulating endothelial adhesion and transendothelial migration of HT-29 colon carcinoma cells. TNFα strongly increases the expression of E-selectin in human endothelial cells HUVEC. This effect is independent of the activation of SAPK2/p38 induced by TNFα. Adhesion of HT-29 cells on a monolayer of HUVEC pre-treated with TNFα is dependent on E-selectin expression but is independent of SAPK2/p38 activity of both HUVEC and tumor cells. Blocking the integrins from HT-29 cells (α2, α3, α6, αvβ5, β1 and β4) with specific antibodies reveals a role for β4 integrin in their adhesion to TNFα-treated HUVEC. The sequence of events showed that β4 integrin adhesion is involved later then E-selectin adhesion. The adhesion of HT-29 cells to TNFα-treated HUVEC leads to the activation of SAPK2/p38 in the tumor cells, as reflected by the increased phosphorylation of its downstream target, the actin polymerizing factor HSP27. Moreover, a recombinant E-selectin/Fc chimera induces the specific activation of SAPK2/p38 and ERK (extracellular signal-regulated kinases) in HT-29 cells, suggesting that the binding of E-selectin to HT-29 cells involves a functional and signaling receptor. However, the binding of E-selectin to HT-29 cells does not lead to phosphorylation of β4 integrin suggesting that the two adhesion events are not signalingly linked. The adhesion of HT-29 cells to TNFα-treated HUVEC also implicates a soluble unidentified factor. This indicates that the adhesion of cancer cells to the endothelium uses the same sequence as lymphocytes namely, selectins, chemokines and integrins. Blocking the adhesion-mediated increase of SAPK2/p38 activity of HT-29 cells inhibits their transendothelial migration. Overall, our results suggest that the specific regulation of transendothelial migration of tumor cells involves two essential steps: 1) adhesion to the endothelium by the sequential use of adhesion molecules, such as E-selectin and β4 integrin, 2) increased motogenic potential through adhesion-mediated activation of the SAPK2p38 pathway.

Le mélanome uvéal (MU) est la tumeur primaire intraoculaire la plus fréquente chez l’adulte. Divers traitements sont offerts afin d’obtenir un contrôle local de la tumeur. Malgré les interventions locales, 34% des patients développent des métastases fatales au foie moins de dix ans après le diagnostic initial. Les cellules stellaires hépatiques (CSH) sont des cellules quiescentes du foie, qui, une fois activées, se dédifférencient en myofibroblastes et produisent de la matrice extracellulaire (MEC). Les CSH sont des acteurs majeurs de la fibrose et ont été étudiées pour leur participation dans la pathogenèse des cancers primaires hépatiques et des cancers gastro-intestinaux métastatiques. Nous avons donc étudié les interactions entre les CSH et les cellules cancéreuses du mélanome uvéal (CCMU) en réalisant des cocultures en insert dans le but de mieux comprendre le phénomène de tropisme hépatique. Le profil d’expression des co-cultures CSH/CCMU a ensuite été comparé à celui des monocultures par profilage génique sur biopuces à ADN. Nous avons recensé de multiples gènes dont la transcription était dérégulée pour des acteurs de l’angiogenèse, de la MEC, de la prolifération et de la défense cellulaire. Nous nous sommes également intéressés à la sécrétion de 105 cytokines en réalisant des analyses protéomiques. Nous avons ensuite déterminé que la capacité de migration des CSH en présence de CCMU était plus efficace que celle des CSH en monoculture. Enfin, nous avons réalisé le premier modèle 3D de stroma du foie reconstruit avec des CSH grâce à la technique d’auto-assemblage du Centre LOEX. Nous avons observé une désorganisation matricielle importante lorsque les stromas ont été ensemencés avec des CCMU. Mes travaux représentent une avancée des connaissances sur le mélanome uvéal métastatique et son tropisme hépatique. Mon mémoire pourra guider d’autres projets visant à élucider les interactions entre les CCMU et les cellules du foie afin d’identifier une cible thérapeutique potentielle pour ralentir la croissance des métastases.
Uveal melanoma (UM) is the most common primary intraocular tumor in adults. Different treatments are offered in order to control the tumor locally. Despite local interventions, 34% of patients develop fatal metastases to the liver less than ten years after the initial diagnosis. Hepatic stellate cells (HSC) are quiescent cells of the liver, which, once activated, dedifferenciate into myofibroblasts and produce an extracellular matrix (ECM). HSCs are major players in fibrosis and have been studied for their role in the pathogenesis of primary liver cancers and metastatic gastrointestinal cancers. We thus studied the interactions between HSCs and uveal melanoma cells (UMCs) by realizing their co-culture in insert in order to better understand the hepatic tropism phenomenon. The gene expression profile of HSC/UMC cocultures was then compared to that of monocultures using DNA microarrays. Several genes that participate in the ECM synthesis, proliferation and host defense were found to be deregulated between these conditions. We also focused on the secretion of 105 cytokines by performing cytokine arrays. We then determined that the migration capacity of HSCs in the presence of UMCs was more efficient than that of HSCs grown in monoculture. Moreover, we produced the first 3D model of liver stroma with HSCs using the self-assembly method of the Centre LOEX. We observed an important disorganization of the ECM when stromas were seeded with UMCs. My work represents an advanced of knowledge on metastatic UM and its liver tropism. My master’s thesis can guide other projects to elucidate interactions between UMCs and hepatic cells in order to identify a potential therapeutic target on which we may act upon to slow down the growth of metastases.

Cellules souches cancéreuses sont une sous-population des tumeurs qui sont capables de renouveler et générer les cellules différentiés qui font partie de la majorité de la tumeur. La recherche dans ce domaine a montré que ces cellules sont moins susceptibles à la chimiothérapie et elles sont capables de récapituler la maladie après échapper traitement. Ici nous décrivons un modèle tumoral chez l’intestine de la Drosophila qui partage plusieurs caractéristiques de la biologie des mammifères en ce qui concerne les cellules souches intestinales et le cancer. Nous avons aussi développé des nouvelles techniques qui nous permettent de cribler des petites molécules in vivo qui peuvent avoir des effets dans la croissance de la tumeur d’une façon quantitative et en haut débit. Nous avons trouvé des drogues qui ciblent des voies de signalisation spécifiques qui ont été confirmées par manipulation génétique des ces cibles putatives. Nous avons aussi trouvé des drogues approuvées pour thérapie, ce qui donne support au fait que notre modèle peut aboutir dans la découverte des nouvelles drogues pour le traitement chez l’homme. Cependant, le plus important c’est que nous avons trouvé qu’une partie de ces drogues ont provoqué une réaction secondaire non attendue dans le tissu normal, stimulant une surproliferation des cellules souches à travers de la voie de réponse inflammatoire. Cet information est directement lié au fait que nous avons utilisé un modèle in vivo, où nous sommes capables de observer l’impact des petites molécules dans la communication entre cellules souches et son niche, ce qui ne serait pas possible dans les criblages in vitro

Les canaux ioniques sont des protéines transmembranaires connues pour leur rôle dans le fonctionnement des cellules excitables mais seulement impliquées depuis peu dans certaines propriétés cancéreuses. L'objectif général de cette thèse a été l'étude et la caractérisation électrophysiologique de différentes lignées de cellules cancéreuses mammaires et pulmonaires. Nous avons ainsi enregistré la fonctionnalité de canaux sodiques dépendants du voltage dans de nombreuses lignées de cellules invasives. Nous avons alors réalisé la caractérisation électrophysiologique, pharmacologique et moléculaire des canaux sodiques fonctionnels. Nous avons par ailleurs montré que l'activité de ces canaux régule les propriétés invasives des cellules cancéreuses. Cet effet est dû à la régulation de l'activité de certaines protéases matricielles. Nous avons montré que les protéases impliquées appartiennent à la famille des cystéine-protéases, et que les courants sodiques modulent leur sécrétion, via une modulation de l'homéostasie sodique intracellulaire
Ionic channels are transmembrane proteins well known for their role in excitable cells and recently involved in numerous cancerous properties. The aim of this thesis was to electrophysiologically study numerous breast and lung cancer cell lines. Indeed, we recorded the functionality of voltage-gated sodium channels in numerous cancer cell lines. We then performed the electrophysiological, pharmacological and molecular characterisations of these sodium channels. Moreover, we shown that the activity of these sodium channels is linked to the invasive properties of cancer cells. This effect is due to the regulation of extracellular matrix proteases. The involved proteases are cystein-proteases their secretion is controlled by sodium channels, through the modulation of the intracellular sodium homeostasis

Ce travail a pour but de mettre au point des nouvelles méthodes pour la recherche avancée sur les cellules souches et les cellules cancéreuses. Nous avons d'abord développé une méthode de patch pour la culture et la différentiation des cellules souches pluripotentes induites humain (hiPSCs) "hors sol". Ce patch de culture est constitué des monocouches de nanofibres réticulées de gélatine sur un support en nid d'abeilles pour assurer un minimum de contact de matériel exogène et un maximum de perméabilité. Puis, nous avons démontré la formation des tissues cardiaques et des neurones moteurs sur le patch, partis de colonies des hiPSCs en forme d'embryoïdes et de monocouches respectivement. Nous avons également développé un dispositif microfluidique avec filtre intégré pour isoler les cellules tumorales circulantes (CTCs), montrant une haute performance de capture en termes d'efficacité, de sélectivité et de viabilité cellulaire. Enfin, nous avons évalué l'effet de drogue anticancéreuse à la formation des sphéroïdes tumoraux en utilisant des multi-puits d'agarose micro-fabriqués. Tous ensembles, nous avons progressé dans la micro-ingénierie vers des applications à grande échelle
This work aimed to provide new tools and methods that can be used for advanced studies of stem cells and cancer cells. We first developed a patch method for off-ground culture and differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). The culture patch we proposed consists of crosslinked monolayer gelatin nanofibers on a honeycomb frame to ensure minimal exogenous material contact and maximum permeability. Then, we demonstrated the formation of cardiac tissue constructs and motor neurons on the patch, started from embryoid-body like and monolayer hiPSC colonies, respectively. We also developed a microfluidic device with integrated filter for isolation of circulating tumor cells (CTCs), showing high capture performances in terms of efficiency, selectivity and cell viability. Finally, we evaluated the anti-cancer drug effect on the formation of tumor spheroids by using microfabricated agarose multi-wells. All together, we progressed in micro-engineering toward large scale applications

Les cellules souches cancéreuses (CSC) sont une sous-population de cellules tumorales qui possèdent un fort pouvoir tumorigénique, métastatique, ainsi qu’une résistance élevée aux traitements de chimiothérapie et radiothérapie. Ainsi, les CSC sont considérées comme responsables de l’initiation, de la progression et des récidives des cancers. Des études récentes ont montré que le micro-environnement tumoral (MET) joue un rôle clé dans la régulation des CSC. Parmi les cellules du MET des cancers colorectaux se trouvent les cellules gliales entériques (CGE) qui sont essentielles au maintien des fonctions de l’épithélium digestif en situation physiologique. Cependant leur impact sur les processus de carcinogenèse colique est peu connu à ce jour. Ce travail de thèse a pour but de déterminer l’impact des CGE sur les fonctions des CSC et les processus de carcinogenèse associés. En combinant des approches in vitro et in vivo, nous avons montré que les cellules tumorales induisent l’acquisition d’un phénotype protumorigénique par les CGE via l’IL-1. Nous avons également mis en évidence que les CGE ainsi ‘activées’ par la tumeur stimulent la capacité des CSC à initier la formation de tumeurs via la sécrétion de PGE2, en activant des voies EP4/EGFR-dépendantes dans les CSC. Dans une deuxième étude, nous avons montré que les CGE stimulent la chimiorésistance des CSC en augmentant leur capacité à initier la formation de tumeurs en présence de 5-fluorouracil ou d’oxaliplatine via une voie ATM-dépendante. Ces travaux montrent que les CGE sont une composante clé du MET qui, une fois remodelée par la tumeur, stimule les CSC et ainsi favorise les processus de carcinogenèse colique associés
Cancer stem cells (CSC) are a subset of tumor cells thatpossess increased tumorigenic and metastatic abilities,as well as enhanced resistance to chemotherapy andradiotherapy. Thus CSC are considered as responsiblefor tumor initiation, metastasis and relapse. Compellingevidence have shown that the tumor microenvironmenttightly controls CSC functions. Among the cells of thecolorectal tumor microenvironment are enteric glial cells(EGC) that are potent regulators of barrier functions in ahealthy intestine. However, little is known about theimpact of EGC on colorectal carcinogenesis. Thereforethe main objective of my PhD project was to exploreEGC impact on CSC functions and associatedcarcinogenesis processes. Using in vitro and in vivoapproaches, we demonstrated that tumor cells activateEGC to acquire a pro-tumorigenic phenotype via therelease of IL-1. We also showed that tumor-activatedEGC increase CSC ability to initiate the formation of atumor via the production of PGE2 and the activation ofEP4/EGFR-dependent pathways in CSC. In a secondstudy, we demonstrated that EGC increase CSC abilityto give rise to tumors in the presence of 5- fluorouraciland oxaliplatin via an ATM-dependent pathway.Altogether our data demonstrate that EGC are a keycomponent of the tumor microenvironment that, onceactivated by the tumor, stimulates CSC and thuspromotes associated carcinogenesis

La neurotensine (NT) est un peptide qui peut agir autant en périphérie qu’au niveau du système nerveux central. Deux de ses récepteurs appartiennent à la famille des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G (NTSR1 et NTSR2) tandis que le troisième est un récepteur à un seul segment transmembranaire appartenant à la famille des récepteurs de type I (NTSR3 ou sortiline). La NT et le NTSR1 sont très impliqués dans la progression tumorale et sont surexprimés dans un très grand nombre de cancer. Les effets prolifératifs de la NT résultent de l’activation du NTSR1 qui peut transactiver le récepteur de l’Epidermal Growth Factor (EGF). Nous avons démontré que, dans les cellules HT29, des adénocarcinomes de colon humain, la NT ne transactive pas l’EGFR pour induire la prolifération cellulaire. Quant au NTSR3, il est impliqué dans l’adressage des protéines, la prolifération, la différentiation. . . De plus, une fois à la membrane plasmique, le NTSR3 peut être hydrolysé et libéré sous forme soluble dans le milieu extracellulaire (sNTSR3). Lors de ma thèse, j’ai déterminé que le sNTSR3 était une molécule biologiquement active puisqu’elle induit une libération rapide du calcium intracellulaire. Le sNTSR3 active des voies de signalisation intracellulaires comme le complexe FAK-Src, la PKCα et la voie Pi3K aboutissant à une augmentation de l’adhésion des cellules cancéreuses. Par ailleurs, le sNTSR3 augmente l’expression de la E-Cadhérine, l’espacement entre les cellules et potentialise les effets le l’EGF sur la prolifération cellulaire. Ces données nous indiquent que le sNTSR3 serait une molécule impliquée dans la progression tumorale
Neurotensin (NT) can act in periphery and in the central nervous system. Two of this receptors are G protein coupled receptors (NTSR1 and NTSR2) and the third, is a type I receptor with one transmembrane domain (NTSR3 or sortilin). NT and NTSR1 are both implicated in tumoral progression and there are overexpressed in a lot of cancer. NT induces proliferation of cancerous cells which are mediated by NTSR1 which may transactivate the Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR). We demonstrated that NT doesn’t transactivate the EGFR in HT29 cell line, a human adenocarcinoma of colon. NTSR3 is a multifunctional protein, is implicated in sorting of proteins, proliferation, differenciation… Moreover, once at the plasma membrane, NTSR3 can be hydrolysed and freed in a soluble form, in the extracellular medium (sNTSR3). During my PhD, I demonstrated that the sNTSR3 is an active molecule with a biological activity, as it induces the release of intracellular calcium. The sNTSR3 activates intracellular signaling like the complex FAK-Src, PKCα and Pi3K pathway, leading to an increase in cancerous cell adhesion. Furthermore, sNTSR3 increases E-Cadherin expression, space between cells and enhances the proliferation induced by EGF. Taken together, these results indicate that the soluble form of NTSR3 can be implicated in tumoral progression

Le facteur de transcription homéotique Cdx2 est un suppresseur de tumeurs et son expression est réduite de manière hétérogène dans les tumeurs coliques. Or, le cancer colorectal demeure un problème de santé publique par sa fréquence et sa gravité. Au travers de 3 sous-projets, cette thèse visait à comprendre le mode d'action de Cdx2. Premièrement, la cadhérine Mucdhl a été identifiée et caractérisée en tant que nouvelle cible de Cdx2 : Mucdhl inhibe la croissance des cellules cancéreuses coliques et s'oppose à l'activité de la -caténine. Deuxièmement, un effet inattendu de Cdx2 sur le cytosquelette et la rigidité cellulaire a été montré. Ceci pourrait expliquer comment Cdx2 intervient dans l'organisation structurale des entérocytes ou la migration. En parallèle, une lignée cellulaire rapportrice de l'expression de Cdx2 a été créé qui, après validation, sera un outil précieux pour l'étude des mécanismes moléculaires qui conditionnent l'hétérogénéité tumorale. Par la mise en évidence de nouvelles fonctions et cibles de Cdx2, cette thèse permet de mieux appréhender son rôle physiologique et son action de suppresseur de tumeurs dans l'intestin.

Le cancer du sein triple négatif (TNBC) représente entre 15-20% des cancers du sein et est l'un des types les plus agressifs. De plus, un sous-groupe de ces patientes est résistant à la radiothérapie (RT) et développe fréquemment une récidive hâtive de la maladie. Des études précédentes ont démontré que l’inflammation induite par la RT accélère la progression du cancer et le développement des métastases. Cette hypothèse a donc été validée dans un modèle pré-clinique de TNBC en implantant les cellules de carcinome de souris triple négatives D2A1 dans les glandes mammaires de la souris Balb/c. Premièrement, la tumeur primaire à été irradiée à une dose sous-curative une semaine post-implantation des cellules. En deuxième lieu, le tissu mammaire de la souris a été pré-irradié avant d'implanter les cellules cancéreuses afin de bien discerner l'effet du microenvironnement irradié sur celles-ci. Ces deux modèles ont mené à une augmentation significative des cellules tumorales circulantes ainsi que du nombre de métastases pulmonaires. Plusieurs molécules inflammatoires dont l'interleukine-1 bêta (IL-1β), l'interleukine-6 (IL-6) ou encore la cyclooxygénase 2 (COX-2) ont été identifiées comme facteurs clés impliqués dans la migration radio-induite des cellules cancéreuses du sein. Conséquemment, un inhibiteur large-spectre comme la chloroquine (CQ), entre autres utilisé comme traitement anti-malarien et anti-inflammatoire, a su prévenir ces effets secondaires associés à la RT. Étant donné que l'action de la CQ est peu sélective, une répression de l'expression de l'ARNm de la métalloprotéinase (MMP) de membrane de type 1 (MT1-MMP), une MMP de surface impliquée notamment dans la migration cellulaire, l'invasion tumorale et l'angiogenèse, a été réalisée afin d'éclaircir le mécanisme d'inhibition des métastases radio-induites. Cette répression de la MT1-MMP prévient la formation des métastases pulmonaires radio-induites, démontrant ainsi un des mécanisme important de l'invasion radio-induite. Ce résultat confirme donc l'importance de la MT1-MMP dans ce phénomène et son potentiel comme biomarqueur de prédiction de l'efficacité des traitements de RT, particulièrement chez les patientes atteintes de TNBC.