Letteratura scientifica selezionata sul tema "Marqueurs nitroxydes"

La première partie de ce mémoire décrit la synthèse d'une série de sept N-Aryl-C,C-dialkoxycarbonylnitrones (1-7), par condensation d'un carbanion dérivé du bromomalonate d'éthyle ou de méthyle sur un composé nitroso approprié. Les rendements en cétonitrones varient de 25 % à 85 %, en fonction de la nature du groupement aryle. La seconde partie concerne la conversion des cétonitrones 1-7 en nitroxydes selon trois mécanismes : le piégeage de radicaux, la réaction de Forrester-hepburn et le piégeage de SPIN inversé. Ces cétonitrones sont toutes de très bons pièges des radicaux carbones, mais sont inadaptées à la détection des radicaux hydroxyle et superoxyde. Lorsqu'elles ont été mises en oeuvre dans des réactions de Forrester-Hepburn avec toute une série d'agents nucléophiles, seuls quelques uns des nitroxydes attendus ont effectivement été détectés, et dans la majorité de cas un produit de décomposition paramagnétique a été observé. Le mécanisme de piégeage de SPIN inversé n'a été utilisé que pour convertir les cétonitrones en bitroxydes des BETA-FLUORES. Cinq de ces sept nitrones étudiées ont permis de réaliser cette conversion. Tous les nitroxydes dérivés des cétonitrones 1-7, quel que soit leur mécanisme de formation, ont été caractérisés par leur spectre de résonance paramagnétique électronique (RPE). Les signaux obtenus consistent principalement en un triplet, dû au couplage hyperfin entre l'électron non apparié et l'azote de la fonction aminoxyle, élargi ou démultiplié du fait de couplages hyperfins avec les protons du cycle aryle. Des signaux plus simples ont été obtenus à partir de nitrones portant des groupements substituants ou des deutériums sur le cycle aromatique

L'étude des biomolécules dans leur environnement natif, la cellule, est l'un des principaux objectifs de la biologie structurale au cours de la dernière décennie. Ainsi, nous assistons à un remarquable développement des approches dites « in-cell », comme la CryoET, FRET (Förster Resonance Energy Tranfer), RMN. Parmi elles, la technique de marquage de spin couplée à la spectroscopie de Résonance Paramagnétique Electronique (SDSL-RPE) présente des caractéristiques intéressantes et avantageuses permettant de sonder la dynamique des protéines à l'intérieur des cellules. En particulier, l’utilisation des sondes de type nitroxyde combine sensibilité élevée et absence de contraintes de taille de la biomolécule d'intérêt avec la capacité d'étudier les transitions structurales et les interactions protéines-protéines à température physiologique. Cependant, même si de nombreux efforts ont été faits pour adapter cette technique à des études structurales dans les cellules, des progrès restent à faire.Dans cette thèse, nous traitons des principales limitations de l’utilisation des nitroxydes dans un contexte cellulaire. Nous nous sommes concentrés sur la stabilité des marqueurs nitroxydes dans des milieux reducteurs et dans la cellule, sur l’incorporation des protéines marquées dans les cellules et la viabilité de ces cellules en vue de mesures par RPE. Grâce aux résultats obtenus dans cette partie méthodologique, nous avons pu étudier la dynamique structurale de deux protéines chaperons (NarJ et UreG) dans des cellules bactériennes. Ces avancées ont permis de comparer les données obtenues in-cell à celles obtenues in vitro ou dans un environnement mimant le milieu cellulaire
The study of biomolecules in their native environment has been one of the main goals of structural biology in the last decade. As a result, we are assisting to a remarkable increase of new "in-cell" approaches, like Cryo-ET, FRET and NMR. Among these approaches, Site-Directed Spin Labeling (SDSL) coupled to Electron Paramagnetic Resonance (EPR) spectroscopy shows competitive and advantageous features to capture protein dynamics inside cells. In particular, nitroxide-based SDSL-EPR combines the advantages of high sensitivity and the lack of size constraints on the biomolecule of interest with the ability to capture protein structural transitions and interactions at physiological temperature. Despite the methodological advancements of the technique that have allowed the community to obtain increasingly relevant results, progresses still need to be done.In this work, the main limitation of nitroxide-based SDSL-EPR has been addressed. In the first time, we focused on the development of delivery methods to introduce the labeled protein in bacterial cells. Next, the stability of nitroxide labels in reducing environments and in-cell has been assessed, monitoring in parallel the viability of the cells during the EPR measurements. Thanks to the results achieved in this methodological part, we were able to study the structural dynamics of two flexible chaperone proteins directly in bacterial cells: NarJ from Escherichia coli and UreG from Sporosarcina pasteurii. Finally, to go further in understanding the impact of the cellular environment on the protein dynamics, the data obtained in cellular context were compared with those obtained in vitro or in a cell-mimicking environment

Cette thèse porte sur le développement de nouvelles approches par marquage de spin suivi par spectroscopie RPE. Cette technique est bien adaptée pour suivre la dynamique structurale des protéines. Son principe repose sur l'insertion d'un radical nitroxyde, en un (ou plusieurs) site(s) choisi(s) d'une protéine et permet de sonder localement la structure de la protéine étudiée grâce aux différentes techniques de RPE (en onde continue et impulsionnelle).Dans une première partie, cette technique a été appliquée à la caractérisation de la dynamique structurale de l'IF1 de levure, un peptide inhibiteur de l'ATP-synthase. L'utilisation des spectroscopies de RPE et de dichroïsme circulaire a permis de montrer qu'IF1 de levure dimérise par sa partie médiane et que la partie C-terminale est désordonnée.La seconde partie est plus méthodologique et a pour but d'étudier et de caractériser un marqueur nouvellement synthétisé afin d'élargir les potentialités du marquage de spin. En effet, cette technique est notamment limitée par la faible diversité spectrale offerte par les sondes disponibles (trois raies). Le nouveau marqueur donne un spectre RPE à six raies grâce à la présence d'un noyau magnétique dans l'environnement du radical. Greffé sur une protéine modèle, nous avons montré que ce nouveau marqueur est tout autant capable de rendre compte de variations structurales qu'un marqueur classique. La superposition des signatures spectrales (trois raies + six raies) montre qu'il est possible de différencier les deux signatures spectrales et de sonder simultanément deux sites d'une protéine et de son partenaire
This thesis focuses on the development of new approaches for site-directed spin labeling followed by EPR spectroscopy. This technique is well suited to monitor the structural dynamics of proteins. The insertion of a nitroxide radical, in one (or several) selected site(s) of a protein, allows probing the structure of the protein using different EPR spectroscopy approaches (continuous wave and pulsed).In a first part, this technique has been applied to characterize the structural dynamics of the yeast IF1, an inhibitory peptide of the ATP-synthase. Using EPR and circular dichroïsm spectroscopies we showed that yeast IF1 dimerizes by its central part and that the C-terminal part remains disordered.The second part is more methodological and the aim is to study and characterize a newly synthesized spin label in order to expand the potential of site-directed spin labeling. In particular, the technique is limited by the poor spectral diversity offered by the available labels (three lines). The new label gives a six lines EPR spectrum thanks to the presence of a magnetic nucleus in the environment of the radical. Grafted on a model protein, we demonstrated that this new label is as able as classical ones to report on structural variations. The superposition of the spectral signatures (three lines + six lines) showed that it is possible to differentiate the two spectral signatures and to probe two sites of a protein and its partner simultaneously

Cette thèse porte sur le développement de nouvelles approches par marquage de spin suivi par spectroscopie RPE. Cette technique est bien adaptée pour suivre la dynamique structurale des protéines. Son principe repose sur l'insertion d'un radical nitroxyde, en un (ou plusieurs) site(s) choisi(s) d'une protéine et permet de sonder localement la structure de la protéine étudiée grâce aux différentes techniques de RPE (en onde continue et impulsionnelle).Dans une première partie, cette technique a été appliquée à la caractérisation de la dynamique structurale de l'IF1 de levure, un peptide inhibiteur de l'ATP-synthase. L'utilisation des spectroscopies de RPE et de dichroïsme circulaire a permis de montrer qu'IF1 de levure dimérise par sa partie médiane et que la partie C-terminale est désordonnée.La seconde partie est plus méthodologique et a pour but d'étudier et de caractériser un marqueur nouvellement synthétisé afin d'élargir les potentialités du marquage de spin. En effet, cette technique est notamment limitée par la faible diversité spectrale offerte par les sondes disponibles (trois raies). Le nouveau marqueur donne un spectre RPE à six raies grâce à la présence d'un noyau magnétique dans l'environnement du radical. Greffé sur une protéine modèle, nous avons montré que ce nouveau marqueur est tout autant capable de rendre compte de variations structurales qu'un marqueur classique. La superposition des signatures spectrales (trois raies + six raies) montre qu'il est possible de différencier les deux signatures spectrales et de sonder simultanément deux sites d'une protéine et de son partenaire
This thesis focuses on the development of new approaches for site-directed spin labeling followed by EPR spectroscopy. This technique is well suited to monitor the structural dynamics of proteins. The insertion of a nitroxide radical, in one (or several) selected site(s) of a protein, allows probing the structure of the protein using different EPR spectroscopy approaches (continuous wave and pulsed).In a first part, this technique has been applied to characterize the structural dynamics of the yeast IF1, an inhibitory peptide of the ATP-synthase. Using EPR and circular dichroïsm spectroscopies we showed that yeast IF1 dimerizes by its central part and that the C-terminal part remains disordered.The second part is more methodological and the aim is to study and characterize a newly synthesized spin label in order to expand the potential of site-directed spin labeling. In particular, the technique is limited by the poor spectral diversity offered by the available labels (three lines). The new label gives a six lines EPR spectrum thanks to the presence of a magnetic nucleus in the environment of the radical. Grafted on a model protein, we demonstrated that this new label is as able as classical ones to report on structural variations. The superposition of the spectral signatures (three lines + six lines) showed that it is possible to differentiate the two spectral signatures and to probe two sites of a protein and its partner simultaneously

Nous portons une attention particuliere sur le marquage par spin du d-glucose en position anomere, tant au plan de la synthese qu'au plan de la purification. Afin de travailler avec des composes enrichis selectivement en carbone-13, tout en utilisant un nitroxyle piperidinique et des groupes protecteurs esters, differents parametres sont controles au cours de cette mise au point. L'etude classique des deplacements chimiques et des constantes de couplages en resonance magnetique nucleaire est utilisee pour controler la plupart des produits synthetises. Mais cette technique est surtout utilisee pour mesurer les temps de relaxation longitudinaux d'un spin nucleaire (carbone-13 ou fluor-19), afin d'extraire la perturbation due a la presence de l'electron porte par la meme molecule. L'amplitude de cette perturbation, determinee de facon reproductible, nous permet d'obtenir une information sur la distance interspins. Cette quantite est egalement correlee a d'autres parametres experimentaux