Tesi sul tema "Ligands (biochimie) – Emploi en thérapeutique"

Les derives tricoordines de l'arsenic sont encore largement utilises en medecine humaine et veterinaire comme trypanocides et filaricides. Les arsenoxydes, d'abord utilises ont ete remplaces par leurs derives soufres moins toxiques, les dithiaarsanes. Bien que cette serie ait ete largement etudiee, les possibilites de modulations sont telles que de nombreuses molecules n'ont pas ete synthetisees ou evaluees comme antiparasitaires. L'emergence de souches resistantes aux produits actuels et la difficulte a trouver de nouvelles series actives justifie les recherches dans cette serie. La partie chimie de cette these decrit la synthese et les proprietes physicochimiques des arsenoxydes precurseurs et de dithiaarsanes cycliques (cycle a cinq, six ou huit chainons). Parmi eux, des derives fluorescents ont ete obtenus en vue d'etudier le mode d'action et la distribution des produits chez le parasite. Par ailleurs, cette etude a conduit a un nouveau procede de synthese industrielle du melarseneoxyde et a une methode de dosage de ce produit par hplc. La partie biologie decrit les resultats obtenus avec nos produits sur les filaires et les trypanosomes. In vitro, sur filaire molinema dessetae, on observe des activites interessantes, un des produits est mille fois plus actif que le melarsonyl potassique (trimelarsan) utilise comme reference. In vivo, sur trypanosoma brucei brucei chez la souris, la plupart des composes se montrent tres actifs et peu toxiques pour la souris, on observe des indices therapeutiques superieurs a mille. In vitro, des souches de trypanosomes resistants a des arsenicaux commerciaux montrent une resistance nulle ou tres faible a quatre de nos produits. La capacite a penetrer dans le parasite semble en grande partie responsable de cette difference

Le cuivre est un métal endogène et redox actif présent dans plusieurs protéines et enzymes essentielles à la vie et joue un rôle important dans différents processus biologiques. Cependant, son activité redox rend également le Cu potentiellement toxique car il peut favoriser la formation d'espèces réactives de l'oxygène (ROS). Ce comportement à double tranchant intéresse les chercheurs depuis longtemps et son exploitation est cruciale pour développer des complexes de Cu aux propriétés thérapeutiques. Dans ce travail de thèse, différents ligands pour la coordination du Cu ont été conçus et explorés dans deux contextes différents : le cancer et la maladie d'Alzheimer (MA). La première partie de cette thèse est consacrée à approfondir les connaissances relatives aux effets cytotoxiques produits par les complexes de Cu (C1, C2). Des études in vitro réalisées sur des lignées cellulaires normales (IMR-90, HUVEC) et cancéreuses (A2780, MCF-7) ont indiqué que C1 et C2 internalisaient les cellules et favorisaient la formation de ROS. La deuxième partie de la thèse évalue les capacités de chélation du Cu de L1 et L2 en tant qu'agents thérapeutiques potentiels pour la MA. Les données ont montré que L1 peut arrêter efficacement la production de ROS catalysée par Cu(I)/Cu(II) en présence et en l'absence de peptide Aβ16 et de zinc. Les données suggèrent que le rapport L1 : Cu joue un rôle important dans l'efficacité de L1 pour arrêter la production de ROS. L1 a été modifié avec succès sans altérer ses propriétés de chélation du Cu pour fournir une perméabilité à la barrière hémato-encéphalique
Copper is a versatile redox active endogenous metal that is present in many proteins and enzymes critical for life and plays important roles in different biological processes. However, its redox activity also renders Cu potentially toxic because it can promote the formation of reactive oxygen species (ROS). This double-edged sword behavior has interested researchers for long time and its harnessing is crucial to develop Cu complexes with unique biological, catalytic, diagnostic and therapeutic properties. In this Ph.D. thesis different ligands for Cu coordination have been designed and explored in two different contexts: cancer and Alzheimer disease (AD). The first part of this thesis is devoted to providing more insights into the cytotoxic effects produced by the Cu(II) complexes (C1, C2) of two ligands (L1, L2). Although the complexes showed weak interactions with DNA, in vitro studies performed in normal (IMR-90, HUVEC) and cancer cell lines (A2780, MCF-7) indicated that C1 and C2 internalize the cells and promote the production of ROS. While cytotoxic effects were not detected in MCF-7 cells, they were higher in A2780 than in normal cells. L1 and L2 were further modified to improve cytotoxicity. The second part of the thesis evaluates the Cu chelating abilities of L1 and L2 as potential therapeutic agents for AD. Data showed that L1 can arrest efficiently the generation of ROS catalyzed by Cu in presence and absence of Aβ peptide and zinc. Evidence suggests that the ratio L1:Cu plays an important role in the effectiveness of L1 to stop ROS production. L1 was successfully modified without altering its Cu chelating properties to provide blood-brain-barrier permeability

Les travaux qui font l'objet de cette these sont consacres a la mise au point d'une nouvelle serie de spiroarsoranes a ligands catecholamide, inclus ou non dans des structures macrocycliques. La presence d'une fonction amide et d'une molecule d'eau dans ces structures leur confere des caracteristiques physicochimiques particulieres. Une etude en resonance magnetique nucleaire dynamique de ces composes pentacoordines a permis la mise en evidence d'une labilite structurale qui se traduit par la mise en jeu de plusieurs formes en equilibre. Ceci est lie a l'intervention de plusieurs phenomenes dont la stereomutation, propre aux structures pentacoordines, l'isomerie cis/trans, imposee par la substitution du noyau phenyle des ligands, et le caractere de double liaison de la fonction carbone-azote amide. Du point de vue biologique, les spiroarsoranes ont deja montre de bonnes activites antiparasitaire, antifongique et antitoxoplasmique. Cette nouvelle serie, dont le but est d'ameliorer leurs performances, a permis de reveler une activite antifilarienne, in vitro, tres interessante, meilleure que celle des spiroarsoranes de premiere generation et celle du mel w pris comme reference lors des tests biologiques. Les tests de cytotoxicite, in vitro, realises sur des cellules buccale et hepatique, montrent que les produits les plus actifs restent peu toxiques comparativement au meme produit de reference

L’expression de l’information génétique est régulée par des facteurs de transcription. Parmi ces facteurs, le récepteur de la vitamine D (VDR) appartient à la famille des récepteurs nucléaires, activables par la fixation d’un ligand. La forme active de la vitamine D, le Calcitriol, est le ligand naturel du VDR et est impliqué dans de nombreuses fonctions biologiques telles que l’homéostasie du calcium et du phosphate, l’inflammation, la différenciation et la prolifération cellulaires et l’apoptose. Cependant, ses actions intrinsèques génomiques s’accompagnent d’effets hypercalcémiques non-génomiques qui limitent ses applications thérapeutiques. Dans l’objectif de dissocier les actions anti-tumorales du Calcitriol de ses effets hypercalcémiques pour des applications thérapeutiques, le challenge consiste à différencier précisément les acteurs de la voie non-génomique de ceux de la voie génomique. Précédemment, le résidu Leu337 du VDR de poisson-zèbre a été identifié comme jouant un rôle majeur dans l’adaptabilité du domaine de fixation du ligand. Une étude classique de mutagenèse a mis en évidence un résultat surprenant : le mutant VDR Leu337His abolit l’activité génomique du VDR en présence du Calcitriol mais présente une activité transcriptionnelle identique au récepteur sauvage en présence du ligand synthétique à double chaîne latérale Gemini. Mon travail de thèse a consisté à comprendre les bases structurales de cette sélectivité. Les résultats présentés montrent que tout comme les VDR sauvages humain et du poisson-zèbre, les VDR mutés de ces deux espèces se comportent de manière similaire en présence des ligands Calcitriol et Gemini en termes d’affinités de liaison et de transactivation. L’étude structurale a mis en évidence une interaction cruciale pour la stabilisation du ligand naturel. En revanche, la mutation Leu337His a un effet silencieux en présence du Gemini et de deux analogues du Gemini que nous avons étudiés. De plus, les résultats structuraux révèlent que les ligands à deux chaînes latérales sont moins sensibles aux modifications affectant le réseau de contacts entre les résidus de la poche et le ligand. Mes travaux de thèse ont permis d’établir les bases structurales et moléculaires pour la création d’un modèle animal original (souris génétiquement modifiée exprimant le VDR muté) qui permettra d’éteindre ou d’allumer le VDR nucléaire selon la présence de Calcitriol ou de Gemini, et ainsi de dissocier la voie génomique de la voie nongénomique induite par le Calcitriol. Ce travail de thèse s’inscrit dans une approche pluridisciplinaire, allant de l’atome à l’organisme et l’intégration de l’ensemble des données in vivo permettra une meilleure compréhension de la signalisation induite par l’hormone Calcitriol et le développement de nouveaux traitements hautement spécifiques
Genetic expression is regulated by transcriptional factors. Among them, the Vitamin D receptor (VDR) belongs to the superfamily of nuclear receptors which adopt their active conformation upon ligand binding. The active form of Vitamin D, Calcitriol is the natural ligand of VDR and plays important roles in several biological functions such as calcium and phosphate homeostasis, inflammation, cell differentiation and proliferation and apoptosis. However, its intrinsic genomic actions are accompanied by hypercalemic nongenomic effects which limit the use of Calcitriol in therapeutic treatments. To further dissociate the antitumor actions of Calcitriol from its hypercalcemic effects, the challenge is to decipher the mechanisms involved in the non-genomic pathway from those involved in the genomic one. Previously, we identified the Leu337 of zebrafish VDR as a key residue in the adaptability of the ligand binding domain. Then, a classical mutagenesis study stressed a surprising finding : the VDR Leu337His abolishes the genomic activity of VDR in presence of Calcitriol but not in presence of the synthetic double-chained Gemini ligand. The results of my thesis confirm that as for the wild-type human and zebrafish VDRs, both zebrafish VDR Leu337His and human VDR Leu309His behave similarly in presence of Calcitriol and Gemini in terms of ligand binding and transactivation. The structural study conducted in parallel emphasizes a crucial interaction for the stabilization of Calcitriol. In sharp contrast, the mutation Leu337His has a neutral incidence on the stabilization of Gemini and the two Gemini derivatives studied. Moreover, the structural findings reveal that double-chained ligands are less sensitive to structural modifications targeting the network of ligand/residues interactions. This study relates the structural and molecular basis for the design of an original animal model (knock-in-mice expressing the corresponding mutation Leu337His) which will allows us to switch on/off the nuclear VDR following the presence of Calcitriol or Gemini, and to gain insight into the non-genomic pathway induced by Calcitriol. My work enrolls a multi-disciplinary approach, from atomic structure to the organism and the integration of the in vivo data will provide us with a better understanding of the Calcitriol signalization and with the development of highly specific new treatments

Le present travail est consacre au developpement, en collaboration avec les laboratoires fournier, de sondes non-peptidiques originales tritiees et/ou photoactivables dans le cadre de l'etude cartographique du recepteur at#1 de l'angiotensine 2, plus particulierement de l'analyse topographique de son interaction avec les ligands peptidiques et non-peptidiques. La strategie suivie pour leur conception est: 1) synthese et etude des proprietes de liaison de 2 non-peptides trities: (#3h)lf7-0156 et (#3h)lf8-0129 qui ont de plus permis d'evaluer l'incidence de mutations du recepteur sur la reconnaissance des non-peptides, 2) synthese des 2 derives photoactivables non-radioactifs, susceptibles de marquer des zones distinctes du recepteur, demonstration de la superiorite de l'un des 2, lf13-0023, a marquer irreversiblement les sites recepteurs, 3) synthese de la sonde photoactivable tritiee (#3h)lf13-0023, demonstration de son aptitude a photomarquer le recepteur at#1 recombinant exprime dans les cellules cho, avec un rendement eleve (10%). Sont proposees des etapes de purification partielle des complexes covalents non-peptide/recepteur qui permettront leur fragmentation et la comparaison des profils de fragmentation avec ceux obtenus avec des sondes peptidiques ; la perspective est d'obtenir des informations directes en faveur ou a l'encontre de points d'interaction communs du recepteur avec les 2 types de ligands. Il est prevu d'integrer les donnees biochimiques et de mutagenese dirigee dans l'elaboration de modeles d'interaction des ligands peptidiques et non-peptidiques avec le recepteur at#1

Les rétinoïdes sont déjà utilisés en dermatologie. Mais c'est leur utilisation potentielle en tant qu'anti-cancéreux qui suscite actuellement un intérêt grandissant parmi les chercheurs et les cliniciens. Pour la recherche et le développement de ces produits, il est indispensable au préalable de bien connaître leur mécanisme d'action. Dans cette perspective, des modèles cellulaires ont été mis en place. La différenciation cellulaire et l'expression d'un enzyme, la transglutaminase de tissu, induites par l'acide rétinoïque ont été les deux réponses étudiées. La démonstration par la méthodologie anti-sens du rôle des récepteur de l'acide rétinoïque dans l'induction de ces réponses a d'abord été tentée. Des analogues de l'acide rétinoïque, des acides rétinobenzoïques, ont ensuite été synthétisés et testés sur ces modèles. Une différence de mécanisme d'action a alors été observée entre ces dérivés et l'acide rétinoïque sur la réponse transflutaminase de tissu. La protéine kinase C semble être à l'origine de cette différence et serait impliquée dans l'expression de l'enzyme induite par l'acide rétinoïque. Enfin, d'autres molécules interagissent avec les rétinoïdes au niveau de certaines réponses biologiques. C'est le cas des glucocorticoïdes qui répriment l'induction par les rétinoïdes de la transglutaminase de tissu. Cette régulation négative serait transcriptionnelle. D'autres lignées cellulaires possédant le récepteur des flucocorticoïdes n'expriment pas cette inhibition. Ceci serait peut-être en relation avec un contrôle transcriptionnel différent

Le récepteur de la cholécystokinine/gastrine (RCCK2) est (sur)exprimé dans de nombreux cancers et tumeurs endocrines. Par modélisation moléculaire, nous avons designé et modifié de nouveaux dérivés de la cholécystokinine ciblant ce récepteur. Ces dérivés ont été couplés à deux nouveaux chélateurs permettant de réaliser plusieurs modalités d'imagerie. Les évaluations in vitro et chez l'animal de ces radioligands peptidiques marqués à l'111indium ont révélé une meilleure fixation tumorale et une diminution significative de la fixation rénale comparé à un radioligand CCK de référence couplé au CHX-A''-DTPA. Les résultats supérieurs obtenus avec ces radioligands valident notre approche de drug design ainsi que l'intérêt des nouveaux chélateurs et indiquent que ces radiopharmaceutiques sont très prometteurs pour une utilisation en radiothérapie interne vectorisée
The cholecystokinin/gastrin receptor (RCCK2) is (over)expressed in various cancers and endocrine tumors. Via molecular modelling, we have designed and modified new cholecystokinin targeting RCCK2 derivatives. These derivatives were coupled to new multi-modality imaging chelators. In vitro and animal evaluations of these peptidic 111In-radioligands showed a better tumoral targeting and a significant renal fixation decrease compared to the CCK reference radioligand coupled to CHX-A''-DTPA. The results obtained with our radioligands validate the drug design concept and show that these radiopharmaceuticals seem to be promising for internal radiotherapy

Les immunoglobulines intraveineuses (IgIV) sont utilisées dans le traitement de maladies auto-immunes et inflammatoires depuis le début des années 1980. L’accroissement constant de la consommation des IgIV augmente les risques de pénuries de ce produit pour lequel il n’existe encore aucun substitut. La compréhension des mécanismes d’action complexes et controversés de cet agent thérapeutique permettrait de rationaliser son utilisation et de développer des substituts. Sachant que les IgIV sont capables d’interférer avec la présentation d’antigène et la réponse des lymphocytes T CD4, les travaux présentés se sont intéressés aux caractéristiques physicochimiques responsables de ces effets, de même qu’à l’élargissement de nos connaissances des effets des IgIV sur la présentation et la réponse des lymphocytes T CD8. Ces connaissances permettront d’établir des fondements scientifiques pour le développement de substituts. Nous avons montré dans un premier temps qu’une préparation d’IgIV rendue fortement cationique (cIgIV) était capable d’inhiber la présentation d’antigènes et la réponse subséquente des lymphocytes T CD4 in vitro. Ensuite, des essais ont permis de démontrer la possibilité d’utiliser les cIgIV avec une bio distribution améliorée dans le foie et la rate chez la souris, mais le potentiel thérapeutique amélioré dans un modèle de thrombocytopénie passive n’a pu être démontré. Le deuxième volet de cette thèse a permis de dévoiler la capacité des IgIV d’inhiber l’activation et l’expansion des lymphocytes T CD8 in vitro et chez la souris. De plus, nous avons fait la preuve de la capacité des IgIV d’inhiber la cytotoxicité en réduisant l’expression de la perforine et en bloquant certains récepteurs des cellules T. Ces résultats permettent d’améliorer notre compréhension du rôle des IgIV dans le traitement des maladies auto immunes grâce à leur interférence avec la génération et la cytotoxicité effectrice des lymphocytes T CD8.
Intravenous immunoglobulins (IVIg) are used in the treatment of many inflammatory and autoimmune diseases since the beginning of the 80s. The constant increase of their use exposes the users and the providers to important shortage risks. A better understanding of their complex mechanisms of action would help in developing potential substitutes. Knowing that IVIg are able to modulate the immune function of antigen presenting cells and the resulting CD4 T cell response, work presented here questioned the physicochemical characteristics of IVIg which could be related to these effects, as well as to the extension of their effect to the CD8 T cell compartment. In the first part of this thesis, we showed that cationized IVIg (cIVIg) was capable to inhibit in vitro antigen presentation. Next, we showed that cIVIg displayed an ameliorated bio distribution in mice, although the therapeutic potential of the preparation could not be demonstrated in a passive model of throbomcytopenia. The second part of this thesis revealed a novel capacity of IVIg in inhibiting the activation and expansion of CD8 T cells in vitro and in immunized mice. Furthermore, IVIg were shown to reduce cytotoxicity by decreasing the expression of perforin and by blocking some T-cell receptors (TCR). These results provide a better understanding of the beneficial effects of IVIg in treated patients by providing an interference with the generation and effector functions of CD8 T cells. Altogether, this thesis propose a physicochemical characteristic, the cationic state, on which a potential substitute to IVIg could be further developed, as well as a novel inhibitory effect of IVIg on the generation and cytotoxic functions of CD8 T cells, which could help create alternative therapy to the scarce and expensive IVIg preparation.

La voie de signalisation Hippo est un acteur important dans le contrôle de la taille des organes, la prolifération et différenciation cellulaire et l’apoptose. Elle consiste en une cascade de kinases qui a pour fonction principale de réguler la phosphorylation des co-activateurs YAP et TAZ afin de contrôler leur import nucléaire et leur interaction avec les facteurs de transcription TEAD1-4 (Transcriptional enhancer associate domain). La formation des complexes YAP/TAZ-TEAD1-4 induit l’expression de gènes jouant un rôle important dans de nombreux processus cellulaires tels que l'adhésion, la migration, la prolifération, la différenciation, la survie, l'apoptose et la sénescence des cellules. La surexpression de YAP, TAZ et TEAD dans de nombreux cancers justifient l’intérêt de ces complexes comme cibles thérapeutiques innovantes dans le traitement des cancers.Les structures cristallographiques des complexes YAP/TAZ-TEAD1-4 disponibles montrent trois interfaces d’interaction entre les deux protéines dont deux semblent essentielles. De plus, TEAD1-4 possèdent une poche interne hydrophobe contenant une cystéine pouvant être S-palmitoylée ou myristoylée. Cette acylation semble importante pour la stabilité de la protéine et une perte de cette modification post-traductionnelle affecte l’interaction YAP/TAZ-TEAD. Les protéines TEADs présentent donc plusieurs sites « druggable ».A partir des données antérieures, nous avons développé trois familles de molécules. La première est une exemplification d’un composé identifié précédemment par criblage virtuel comme ligand potentiel de l’interface 3. Les composés de la seconde famille de molécules se sont avérés être des ligands de l’interface 2 révélant, en se liant à TEAD, une poche cryptique inattendue. La troisième famille de molécules cible spécifiquement la poche interne de TEAD. Les molécules synthétisées ont été co-cristallisées avec TEAD2 et sept structures cristallographiques ont été obtenues avec des résolutions satisfaisantes. L’affinité de certains composés pour TEAD2 a été mesurées par résonance plasmonique de surface et thermophorèse à petite échelle. Finalement, l’activité biologique de nos molécules a été évaluée sur cellules HEK293T (TEAD-luciferase reporter plasmid) et sur cellules MDA-MB-231 (expression protéique des gènes cibles)
The Hippo signaling pathway is an important player in the control of organ size, cell proliferation, differentiation, and apoptosis. It consists of kinases cascade which regulate the phosphorylation of coactivators YAP and TAZ in order to control their nuclear import and their interaction with TEAD1-4 (Transcriptional enhancer associate domain). The formation of the YAP/TAZ-TEAD1-4 complexes leads to the expression of genes involved in cell adhesion, migration, proliferation, differentiation, apoptosis, and senescence. YAP, TAZ and TEAD are overexpressed in several cancers and targeting these YAP/TAZ-TEAD complexes appears as an innovative strategy for the cancer treatment.The available crystal structures of YAP/TAZ-TEAD1-4 complexes show three interfaces between both proteins, two of them are essential for maintaining the protein-protein interaction. In addition, TEAD1-4 possesses an internal hydrophobic pocket containing a cysteine which can be S-palmitoylated or myristoylated. This acylation seems to be important for the stability of the protein and the loss of this post-translational modification affects the YAP/TAZ-TEAD interaction. Therefore, TEAD1-4 present differents druggables sites which can be targeted.From previous results, we have prepared three series of molecules. In a first series, we examplified a compound which was previously identified through a virtual screening against interface 3. Compounds of the second series were found to be ligands of interface 2 and revealed the existence of a unexpected crytic site. The third series of molecules specifically targeted the internal pocket of TEAD. TEAD2 crystals were soaked with the new synthesized molecules and seven co-crystals with a satisfactory resolution were obtained. The affinity of some relevant compounds for TEAD2 was measured by surface plasmon resonance and microscale thermophoresis. Finally, the biological activity of our compounds was evaluated on HEK293T cells (TEAD-luciferase reporter plasmid) and MDA-MB-231 cells (protein expression of target genes)

Les venins sont des armes sophistiquées, utilisées par les organismes venimeux pour se défendre des prédateurs, ainsi que pour paralyser et tuer leurs proies. Mais dans la nature, le bien n’est jamais très loin du mal, les toxines venimeuses pouvant se révéler être des agents thérapeutiques efficaces. Les peptides de venins de fourmis ont donc été étudiés dans cette thèse afin de déterminer le potentiel de ces toxines pour la découverte de molécules thérapeutiques innovantes. A l’instar des autres venins d’insectes, les venins de fourmis restent peu étudiés, principalement en raison de la petite taille de ces insectes et des quantités limitées de venins disponibles. Cependant, les fourmis offrent l’avantage d’être des insectes sociaux très abondants dans tous les milieux terrestres. En collectant les venins de plusieurs individus, il est donc possible d’obtenir des quantités suffisantes de venin pour les analyses biochimiques et pharmacologiques.Afin d’assurer la reproductibilité des analyses, une identification taxonomique correcte est nécessaire. Dans cette optique, un outil de chimiotaxonomie a été développé durant cette thèse (permettant ainsi de regrouper les venins provenant de plusieurs colonies afin de compenser les faibles quantités de matériel biologique par individu ou par colonie).Ensuite, nous nous sommes intéressés aux facteurs écologiques impliqués dans la diversification des venins de fourmis. Pour cela, la toxicité et la composition des venins de fourmis ont été analysés en relation avec le polyéthisme, la spécialisation alimentaire et la spécialisation défensive.La diversité écologique des fourmis a amplement contribuée à la diversification des venins. En étudiant les venins de 82 espèces de fourmis, nous avons révélé la grande diversité structurale des toxines. Bien que la majorité des peptidomes sont composés par de petits peptides linéaires, des peptides structurés par des ponts disulfure ont été révélés dans de nombreux venins et constituent de nouvelles familles structurales de toxines.La purification de certains de ces peptides à ponts disulfure a permis leur caractérisation biochimique et l’évaluation de leur rôle biologique. Ainsi nous avons décrit un groupe de peptides neurotoxiques, baptisés les formicitoxines qui sont capables de bloquer les canaux calcium humains de type L. La commutatoxine est, quant à elle, un peptide avec un pont disulfure qui semble activer les récepteurs humains TRPV1 et TRPV3 et laisse supposer une implication dans l’induction de la douleur chez les mammifères.La grande diversité des peptides mise en évidence dans les venins, associée à la grande diversité écologique et taxonomique des fourmis, suggère que les venins de fourmis constituent un nouveau champ d’exploration prometteur pour la recherche de molécules thérapeutiques et insecticides. Les venins de fourmis s’ajoutent à la chimiothèque conséquente déjà représentée par les venins des autres animaux venimeux
Venoms are sophisticated weapons employed by venomous organisms to ward off predators, as well as to subdue and kill prey. However, in nature, good is never far from bad and venom toxins may prove to be efficient therapeutic agents. Ant venom peptides were investigated in the course of this thesis to evaluate their potential in the discovery of novel drugs. Like other insect venoms, ant venoms remain understudied, mainly due to the small size of individual ants and, so, the limited a mount of venom available. The ecological diversity of ants has largely contributed to venom diversification. By studying the venom peptidomes from 82 ant species, we have revealed the great structural diversity of the toxins. Although the majority of the peptidomes are comprised of small and linear peptides, peptides structured by disulfide bonds were also brought to light in numerous venoms and constitute novel structural classes of toxins. The purification of some of these disulfided peptides permitted their biochemical characterization and the assessment oft heir biological functions. The enormous peptide diversity revealed among venoms combined with the great ecological and taxonomical diversity of ants suggests that ant venoms constitute a promising new source in the search for both novel drugs and insecticides. Ant venom augments the vast bioactive molecules library represented by venoms from other venomous animals

Les modifications de protéines, qu’elles soient post-traductionnelles (PTMs) ou induites chimiquement, ont une influence considérable sur l'activité des protéines. Des méthodes de spectrométrie de masse (MS) HRMS, MS/MS CID et ETD, et de biochimie ont été développées pour la caractérisation structurale et cinétique de complexes protéine-ligand et de PTMs, dans le but de disséquer leur mécanisme et de concevoir des médicaments covalents contre des protéines liant des protéases, des kinases, ou l'ADN. La MS combinée avec des outils biochimiques a permis de séquencer l'inhibiteur de protéases grégline, et de détecter une PTM originale. De même, la transposase MOS1, modèle de l'intégrase du VIH pour la conception d'inhibiteurs, s'avère être à la fois acétylée et phosphorylée. Pour la lyase Abf2, une stratégie de piégeage, purification, protéolyse et hydrolyse ADN du complexe covalent Abf2-ADN, couplée à l’analyse MS, a été développée. Enfin, l’interaction entre le surpresseur de métastase hPEBP1 et la locostatine a été disséquée sur la protéine entière et par approche bottom-up. La locostatine s’hydrolyse en butyrate après fixation. Afin d’identifier le site ciblé par la locostatine, les conditions de réaction et de protéolyse ont été optimisées. La présence de réactions non spécifiques a conduit au développement 1) d'un modèle mathématique permettant de déterminer la fraction de liaison optimale pour discriminer le site spécifique des sites non-spécifiques, et 2) d'une méthode pour la quantification parallèle et exhaustive du degré de modification de tous les sites modifiés d'une protéine. Ces outils sont applicables aux ligands covalents de protéines et/ou à leurs PTMs
Protein modifications, whether post-translational (PTMs) or chemically induced, play a crucial role on the activity of proteins. Mass spectrometry (MS) techniques such as HRMS, CID/ETD MS/MS, and biochemistrybased methods for structural and kinetic characterization of protein-ligand complexes and PTMs have been developed. MS combined with several biochemical tools has been used to sequence the proteinase inhibitor gregline and to detect a novel PTM. A similar approach shows that the transposase MOS1, a model for the design of HIV integrase inhibitors, is both phosphorylated and acetylated. For the lyase Abf2, a strategy of trapping, purification, proteolysis, and DNA hydrolysis of the Abf2-DNA covalent complex, coupled to MS analysis, has been developed. Finally, the interaction between the metastasis suppressor hPEBP1 and locostatin was dissected. Upon binding to hPEBP1, locostatin undergoes hydrolysis. To identify the site targeted by locostatin, the conditions of reaction and proteolysis were optimized. The qualitative approach reveals the presence of non-specific reactions, leading to the development of 1) a mathematical model to determine the optimum bound fraction for discriminating the specific site from non-specific sites, and 2) a method for the parallel and exhaustive quantification of the degree of modification of all modified sites of a protein. These tools are widely applicable to covalent protein ligands and/or PTMs

En cancérologie, une des voies de recherche privilégiée consiste à cibler spécifiquement les cellules tumorales et entraîner leur apoptose. Dans ce cadre, les récepteurs à domaine de mort de la superfamille du TNF-R apparaissent comme cibles potentiels, en particulier DR5, un récepteur pro-apoptotique de TRAIL, ligand capable d’induire la mort sélective des cellules cancéreuses. L’analyse des structures cristallographiques du complexe TRAIL/DR5 révèle que le ligand TRAIL trimérique s’associe avec trois récepteurs DR5, ceci suggérant que la trimérisation de ces récepteurs soit le minimum requis pour induire un signal de mort. Deux séquences peptidiques, capables de fixer DR5 de manière spécifique, ont récemment été décrites dans la littérature. Nous avons étudié l’influence de la multimérisation (dimérisation, trimérisation, point de multimérisation) de ces peptides sur la liaison à DR5 et sur son activation. De manière intéressante, ces composés présentent une gamme d’affinités pour DR5 étendue et une capacité différentielle à déclencher « in vitro » et « in vivo » l’apoptose induite par le récepteur de mort DR5. Nous avons également évalué l’effet sur l’interaction avec DR5 de modifications du mode de cyclisation. Parallèlement à ce travail, nous avons exploré des stratégies alternatives se basant soit sur les structures atomiques de DR5 publiées (approche basée sur la structure), soit sur le criblage sur billes (approche combinatoire), dans l’idée d’identifier de nouveaux motifs de liaison à DR5. Enfin, nous avons développé une collection de sondes peptidiques de TRAIL dédiées à l’étude de la dynamique d’organisation du récepteur DR5 lors de son activation
In cancerology, a major challenge is to induce tumor-selective apoptosis. In this context, death receptors of the TNF-R superfamily represent potential targets, in particular DR5, a pro-apoptotic TRAIL receptor, since TRAIL ligang itself selectively kills cancer cells. Structural analyses of TRAIL/DR5 complexes revealed that TRAIL trimer binds to three receptors, suggesting that a trimeric receptor complex is the functional unit for signaling. Recently, small cyclic peptides capable of binding DR5 have been identified. In the present work, we synthesized and used these sequences to systematically study the effect of peptide multimerization (dimerization, trimerization, anchoring point) on DR5 binding and selective DR5-mediated death induction. Our results revealed that these compounds bound selectively to DR5 and competed with the binding of TRAIL. Furthemore, we showed that our divalent or trivalent ligands triggered a substantial DR5-dependent apoptic response « in vitro » and « in vivo ». To gain further insight into the requirements for peptide binding to DR5 and eventually improve their potency, modifications of the initial structure of the loop of one of these peptides were also investigated. In an additional part of this work, we also attempted the design of DR5-binding peptides based on X-ray crystallographic analysis of complexes between anti-hDR5 antibody fragments and DR5. Moreover, we validated an efficient on-bead assay which should allow for rapid discovery through combinatorial library screening of high-affinity DR5 peptides. Finally, we developped a collection of TRAIL probes as useful tools for elucidating DR5 activation at the molecular level

Les ions métalliques ZnII, CuII et FeIII interagissent avec le peptide b-amyloïde (Ab) dans la maladie d'Alzheimer. Ils participent à la précipitation d'A_ et à sa toxicité via la production d'H2O2. Une stratégie thérapeutique consiste à chélater ces ions métalliques par des ligands hétérocycliques reliés de façon covalente afin d'augmenter leur affinité pour ces ions. Parmi eux, la Cyclo-bi-Phen diminue les plaques amyloïdes de souris transgéniques modélisant la maladie d'Alzheimer. Une nouvelle série a été établie à partir du clioquinol, un ligand quinoléine actif in vitro et in vivo. Plus de 20 dérivés polyquinoléine ont été synthétisés et possèdent une forte affinité pour ZnII et CuII. Des tests in vitro sur Ab en présence d'ions métalliques ont révélé qu'ils inhibent la précipitation d'Ab et la production d'H2O2 par ces systèmes.

Le présent projet vise à analyser l'influence de la multivalence dans les interactions sucres-lectines. En collaboration avec des équipes externes, une étude par microscopie à force atomique (AFM) de l'interaction entre des ligands synthétiques de différentes valences et leurs lectines spécifiques a été entreprise. Dans le cadre de cette étude, une première caractérisation fondamentale de l'interaction sucre-lectine a été menée. Cette caractérisation concerne plus particulièrement l'influence de la multivalence sur les forces d'adhésion et la dynamique de l'interaction entre les ligands synthétiques multivalents et une lectine modèle, la lectine d'arachide PNA. Une seconde caractérisation, d'aspect plus appliqué, concerne l'utilisation des ligands synthétiques multivalents dans une approche thérapeutique antiadhésive pour le traitement des infections urinaires chroniques dues à Escherichia coli uropathogène (UPEC). Le caractère innovant des ligands (obtenus par une synthèse chimique rationnelle) ainsi que l'approche utilisée pour caractériser leurs interactions avec les lectines à l'échelle moléculaire par AFM témoigne de l'originalité du projet.

Les cancers, qu’il s’agisse de leucémies ou de tumeurs solides, sont le résultat de proliférations cellulaires anormales et non contrôlées au sein des tissus. Ces proliférations anarchiques sont le reflet d’une surexpression et/ou sur-activation de protéines intracellulaires engendrées par un événement oncogénique. Aujourd’hui encore il est donc nécessaire de trouver de nouvelles molécules à usage thérapeutique ciblant spécifiquement ces protéines. C’est dans ce contexte que les facteurs de transcription STAT5 constituent de véritables cibles de choix puisque ces protéines participent activement à la leucogénèse. L’implication directe des protéines STAT5 dans la génèse des leucémies a été démontrée par l’utilisation de formes mutées constitutivement active de STAT5. Les facteurs de transcription STAT5 jouent un rôle essentiel dans la voie de signalisation JAK/STAT. Cette voie aboutit à la régulation de grandes fonctions biologiques telles que la prolifération cellulaire, la différenciation cellulaire ou encore l’apoptose. L’objectif de ce projet consiste donc à cibler spécifiquement les protéines STAT5 dans le but de rétablir le processus de mort cellulaire et empêcher la prolifération des cellules cancéreuses. Les inhibiteurs spécifiques des protéines STAT5 sont sélectionnés selon la méthode SELEX qui permet d’isoler des ligands structurés de forte affinité pour la protéine. L’affinité et la spécificité de ces inhibiteurs, appelés aptamères, sont caractérisées à partir de modèles cellulaires de leucémies dépendant de l’activité des facteurs de transcription STAT5. Les aptamères sont aujourd’hui de véritables outils thérapeutiques en pleine évolution
Leukemias are due to abnormal cell proliferation, which is the result of intracellular over-expression or excessive activation of protein due to oncogenic event. Still today, it is necessary to find new therapeutic molecules, which specifically target these proteins. STAT5, via the JAK/STAT signaling pathway, controls fundamental cellular processes, including .cell survival, proliferation and differentiation. To struggle against tumorigenesis, JAK/STAT signaling pathway has to be inhibited. The aim of this project is to target specifically STAT5 factors to restore healthy signal transduction. We generated aptamers by an iterative in vitro selection. Aptamers are short-structured single strand DNAs or RNAs that bind with high affinity and specificity to their target. Once STAT5B recombinant proteins are produced, they are subjected to SELEX process. The number of rounds depends on various parameters. After seven rounds, two sequences are retrieved. The specificity and affinity of these aptamers are assessed by fluorescent immunoassays. Binding affinity and kinetics of interaction are characterized by SPR. Aptamer anti proliferative effects are determined by evaluation of the growth of cells depending on STAT5. Finally, we developed several .assays aiming at understanding the mechanism of an aptamer action on STAT5B such as phosphorylation measurement and EMSA. Aptamers are now emerging therapeutic tools; they exhibit significant advantages relative to protein therapeutics

Le cancer de la vessie est le deuxième cancer urologique après le cancer de la prostate. Le développement de nouveaux agents anticancéreux est nécessaire pour le traitement de cette maladie complexe, car, en dépit d'un large éventail de traitements, aucune augmentation de la survie des patients n'a été observée. - Les effets du GW501516, un agoniste de PPARbeta/delta, n'ont jamais été explorés dans des cellules cancéreuses de la vessie. Nous montrons qu'un traitement par 25 µM de GW501516, pendant 24 h, induit la mort cellulaire par apoptose de cellules dérivées d'un carcinome urothélial invasif mais pas de cellules dérivées d'un cancer urothélial "de bon pronostic". Une stimulation de courte durée par 25 µM de GW501516 induit une augmentation du taux d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) qui est associée à une phosphorylation de la protéine de survie Akt. L'apoptose induite par le GW501516 est concomitante à une diminution de l'expression d'une molécule d'adhérence, la cadhérine N qui est une protéine transmembranaire impliquée dans la progression tumorale. Pour la première fois dans un modèle de carcinome, nous montrons que la cadhérine N est la cible d'un clivage protéolytique, libérant des fragments solubles qui peuvent être biologiquement actifs. Le GW501516 module ce clivage à des temps qui précèdent la mort cellulaire. En effet, le GW501516 régule l'expression de protéases telles que ADAMIO à l'origine du clivage de la cadhérine N. - Les fragments de la cadhérine N pourraient intervenir dans les processus de survie ou de mort cellulaires. Par conséquent, cette étude novatrice ouvre le débat quant à la portée thérapeutique du GW501516 dans le traitement du cancer
Bladder cancer is the most common cancer of the genitourinary tract worldwide and accounts for 5% of ail cancer deaths in human. Despite of a wide range of treatments, no substantial improvement in survival of patients with advanced-stage or metastatic disease has been achieved. The development of nove! effective chemotherapeutic agents is required for the treatment ofthis aggressive disease. Anticancer action of GW501516, an agonist of PPARbeta/delta, has never been investigated in bladder tumor cells. Our results indicated that a 24h treatment by 25 µM of GW501516 induced cell death through both extrinsic and intrinsic apoptotic pathways in T24 cells, derived from an undifferentiated high grade carcinoma but not in RT4 cells, derived from a low grade papillary tumor. GW501516 induced also an early up-regulation of ROS production which was associated with an increase ofphosphorylated Akt level, implicated in cell survival. Apoptosis induced by GW501516 is concomitant with a decrease of N-cadherin expression which is a cell adhesion molecule implicated in tumor progression. For the first time in carcinoma mode!, we showed that N-cadherin was cleaved by proteases, leading to the release of soluble fragments which could be biologically active. Our results indicated that GW501516 modulates N-cadherin cleavage before cell death through the regulation of protease expression such as ADAM l O. N-cadherin fragments could be implicated in cell survival or cell death. By inducing apoptosis of urothelial cancer ce lis and by modulating N-cadherin shedding, GW501516 could be a potential efficient chemotherapeutic drug for bladder cancer through endovesical instillations