Tesi sul tema "Levures non-Saccharomyces"

Les levures non-Saccharomyces, naturellement présentes dans les moûts, peuvent impacter positivement ou négativement la qualité des vins. Depuis quelques années, l’utilisation de cultures mixtes comme starters, associant une souche de Saccharomyces cerevisiae et une souche d’une autre espèce est proposée aux œnologues. C’est le cas du couple S. cerevisiae/Torulaspora delbrueckii. L’étude des interactions entre la souche T. delbrueckii Zymaflore Alpha et S. cerevisiae Zymaflore X5, de la société Laffort, a été réalisée. Les fermentations alcooliques ont été effectuées dans un réacteur à double compartiment permettant la séparation physique des levures tout en conservant l’homogénéité du milieu de culture. Les résultats ont mis en évidence que la séparation impacte la croissance des deux souches suggérant l’existence d’interactions de type cell-cell contact entre ces deux souches. Si une grande majorité de praticiens utilise désormais les levures sélectionnées, certains ont fait le choix de favoriser les populations autochtones de levures S .cerevisiae et de levures non-Saccharomyces. L’incidence de deux facteurs de l’environnement a été étudié sur un mélange de cinq espèces de non-Saccharomyces (T. delbrueckii, Metschnikowia spp., Candida zemplinina, Hanseniaspora uvarum, Pichia kluyveri) et de deux souches de S. cerevisiae (une à phase de latence courte, une à phase de latence longue) en cultures pures et en mélange. L’inoculation de la souche de S. cerevisiae à phase de latence longue dans un moût saturé en CO2 permet de stimuler les levures non-Saccharomyces d’intérêt (T. delbrueckii/P. kluyveri) tout en inhibant les espèces indésirables (H. uvarum, C. zemplinina)
Non-Saccharomyces yeasts, naturally found in grape must, can impact wine quality positively or negatively. In recent years, the use of mixed cultures as starters (association of S. cerevisiae species and other species) such as the couple Saccharomyces cerevisiae/Torulaspora delbrueckii is proposed to winemakers. Interactions between these two species have been studied with two commercial strains, T. delbrueckii Zymaflore Alpha and S. cerevisiae Zymaflore X5 (Laffort). Alcoholic fermentations were carried out in a fermentor with double compartment allowing a physical separation of yeasts and preserving the homogeneity culture medium. The results highlighted that the physical separation impacts the growth of both strains, suggesting interactions of type cell-cell contact between these two strains. If a large majority of winemakers use selected yeasts strains, some of them chose to favor native yeasts, S. cerevisiae species and non- Saccharomyces species. The impact of two environmental factors was investigated on five non-Saccharomyces species (T. delbrueckii, Metschnikowia spp., Candida zemplinina, Hanseniaspora uvarum, Pichia kluyveri) and two strains of S. cerevisiae (one with short fermentation lag phase, one with long fermentation lag phase), in pure and mixed cultures. The inoculation with S. cerevisiae with a long fermentation lag phase in a must saturated with CO2 allowed to stimulate some of non-Saccharomyces which present an interest in winemaking (T. delbrueckii/P. kluyveri) and inhibit the undesirable ones (H. uvarum, C. zemplinina)

L'utilisation des levures en industrie est indissociable de sa transformation à l'état déshydraté. Le procédé de séchage provoque un certain nombre de dysfonctionnements dans les cellules de levure qui affectent leur fonctionnalité et leur viabilité. Afin de protéger les levures au cours de la déshydratation, des additifs alimentaires sont souvent utilisés comme les émulsifiants et les antioxydants. Cependant, les levures sont capables de produire naturellement des substances protectrices, telles que le glutathion (GSH) et le tréhalose (TRE). Dans ce contexte, trois souches non-Saccharomyces (NS) appartenant aux genres et espèces Torulaspora delbrueckii, Metschnikowia pulcherrima et Lachancea thermotolerans ont été étudiées. En effet, malgré leur intérêt pour de multiples applications agro-alimentaires, leurs mécanismes de résistance à la déshydratation associés à la synthèse de GSH et de TRE sont à l’heure actuelle méconnus. Cette investigation peut permettre à terme la formulation de nouvelles souches de levure NS sous forme sèche, sans aucuns additifs. Dans un premier chapitre, l’impact de la déshydratation de la levure « modèle » Saccharomyces cerevisiae en lit fluidisé pré-pilote a été corrélé à la synthèse du GSH et du TRE. Ainsi, il a été possible d’élucider les effets de la modulation de la composition du milieu de culture afin d'optimiser la conservation des cellules avant, pendant et après la déshydratation. Dans un deuxième chapitre, les conditions précédemment définies ont été appliquées aux levures NS afin de comprendre les effets de la déshydratation sur leur fonctionnalité. Cette étude a démontré que le GSH joue un rôle important dans la protection des levures NS, en fonction des conditions de culture et de déshydratation utilisées. Dans un troisième chapitre, certains phénomènes de résistance à l'oxydation des trois souches NS ont été étudiés. Il a été clairement démontré que la sensibilité des cellules à l’attaque oxydante dépend des conditions de culture-déshydratation et est inhérente à la souche étudiée. Enfin, dans un quatrième chapitre, une étude approfondie au niveau biochimique de la souche de levure la plus sensible, L. thermotolerans, a été réalisée par la micro-spectroscopie infrarouge avec rayonnement synchrotron. Les cellules cultivées en GSM, milieu favorisant la synthèse du glutathion, en plus de présenter une meilleure viabilité, montrent une plus grande intensité dans les bandes spectrales des lipides CH2 et CH3, associées à la fluidité de la membrane plasmique. Par ailleurs, les cellules cultivées en milieu TSM, milieu favorisant la synthèse du tréhalose, présentent une dénaturation plus élevée des protéines marquée par une intensité plus élevée des pics de feuillet β, et une intensité plus élevée des groupements C=O (oxydes lipidiques) corrélée à la peroxydation lipidique. Ces deux phénomènes expliquent la diminution de la viabilité obtenue sur cette souche lors de sa déshydratation. Les connaissances fondamentales acquises dans le cadre de cette étude seront utiles pour obtenir de nouvelles souches de levures déshydratées sans additifs et à hautes performances. Elles contribuent également à l’amélioration des méthodes de formulation et de déshydratation actuellement utilisées en industrie
The use of yeasts in industry is inseparable from their ability to be produced and dehydrated. This dehydration process causes various dysfunctions in yeast cells that affect their functionality and viability. In order to protect yeasts from dehydration, food additives are often used as emulsifiers and antioxidants. However, yeasts are able to produce naturally protective substances, such as glutathione (GSH) and trehalose (TRE). In this context, three non-Saccharomyces (NS) strains, belonging to the different genera and species Torulaspora delbrueckii, Metschnikowia pulcherrima and Lachancea thermotolerans, were studied in this thesis. Despite the great interest aroused by their multiple agro-food applications, their dehydration resistance mechanisms associated with the synthesis of GSH and TRE, are currently unknown. This study is ultimately aimed at the formulation of new NS yeast dried strains without any food additives. In a first chapter, the impact of the “reference yeast” Saccharomyces cerevisiae dehydration in a pre-pilot fluidized bed has been correlated with the synthesis of GSH and TRE. It was possible to modulate the culture medium composition in order to optimize cell preservation before, during and after dehydration. In a second chapter, the previously defined conditions were applied to NS yeasts strains in order to understand the effects of dehydration on their microbial functionality. This study demonstrated that GSH plays an important role in NS yeasts protection, depending on the culture and dehydration conditions. In a third chapter, some oxidation resistance phenomena of the three NS strains were studied. It was clearly demonstrated that the susceptibility of cells to oxidative attack was dependent on culture-dehydration conditions and was yeast strain-dependent. Finally, in a fourth chapter, an in-depth biochemical study of the most dehydration-sensitive yeast strain, L. thermotolerans, was performed by synchrotron FTIR micro-spectroscopy. Cells grown in GSM (medium favoring the production of GSH), besides showing a better viability, showed a greater intensity in the spectral bands of lipids CH2 and CH3, associated with the plasma membrane fluidity. In addition, TSM grown cells (TSM is a medium favoring the production of TRE) exhibited a higher protein denaturation, suggested by the intensity of β-sheet peaks, and C=O (lipid oxides) bands correlated with lipid peroxidation. These data can explain the decreased of viability of this strain during production-dehydration process. The fundamental knowledge acquired in this study will be useful to obtain new dehydrated yeast strains without additives and with high performance. It will be useful also to improve the formulation and dehydration methods currently used in industry

Etude des interactions entre les levures non-saccharomyces et Saccharomyces cerevisiae. Cette étude a pour objectif de décrire les changements du profil aromatique du vin du vin d'une part et de réduire le pourcentage d'alcool d'autre part. Pour cela, la maîtrise des levures non-Saccharomyces est nécessaire. Ainsi, les principales molécules aromatiques seront dosées en fonction des conditions de cultures (culture pure - culture séquentielle) et leurs conséquences sur les propriétés organoleptiques seront évaluées. En parallèle, leur besoins en sucre, azote, oxygène et vitamines seront déterminés dans la perspective de diminuer le pourcentage d'alcool dans les vins
Study of the interaction between the non-Saccharomyces yeast and Saccharomyces cerevisiae. This study aims to describe changes in the flavor profile of the wine on one hand and reducing percentage of alcohol on the other hand. For this, control of non-Saccharomyces yeast is required. Thus, the main aromatic molecules must be measured according to the conditions of cultures (pure culture - sequential culture) and their effects on the organoleptic properties will be evaluated. In parallel, their sugar, nitrogen, oxygen and vitamins requirements will be determined to decrease the percentage of alcohol in the wine

Chez S. Cerevisiae, les gènes SUP45 et SUP35 codant respectivement eRF1 et eRF3 sont essentiels. Nous avons isolé 16 mutants viables ayant une mutation faux sens ou non sens dans le gène SUP45. Toutes les mutations faux sens sont localisées dans la région de la protéine eRF1 qui reconnaît le codon STOP, elles n'altèrent ni le faux de la protéine, ni son interaction avec eRF3. Toutes les mutations non sens conduisent à un phénotype de suppression omnipotente et à la viabilité (testée dans 3 souches différentes). Pour tous ces mutants, la quantité d’eRF1 est réduite par rapport à la souche sauvage et elle est corrélée à la perte d'efficacité de la terminaison de la traduction. De plus, la quantité de certaines tRNA qui ont la capacité potentielle de lire des codons de terminaison était plus élevée chez ces mutants, ce qui pourrait expliquer le phénomène de translecture.

Cette thèse se rapporte à l'étude des levures présentes dans la niche écologique «raisin-vin». La dynamique et l'identité des levures non-Saccharomyces pendant la macération pré-fermentaire et pendant la fermentation alcoolique dans les moûts du Bordelais ont été observées dans des conditions de production réelle et à l'échelle du laboratoire. 26 espèces non-Saccharomyces ont été placées dans une collection représentant la diversité levurienne non-Saccharomyces présente pendant les premières étapes de la vinification. De plus, nous avons évalué l'influence de facteurs externes sur le développement et la diversité des levures non-Saccharomyces pendant la macération pré-fermentaire à froid: température, moment d'addition de Levures Sèches Actives et oxygène. Dans une approche descriptive du fonctionnement de l'écosystème levurien, nous avons mis en lumière plusieurs types d'interactions entre Saccharomyces cerevisiae et les levures non-Saccharomyces. Par ailleurs, l'étude de l'incidence de différentes espèces non-Saccharomyces sur la libération de composés volatils, notamment les thiols, dans les vins blancs est présentée. Ce travail propose également l'utilisation de la PCR en temps réel pour la détection et le suivi, au sein de l'écosystème, de Issatchenkia orientalis, Candida zemplinina, Metschnikowia pulcherrima, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora spp. Et Sacchoromyces
This thesis observed the yeasts present in the ecological niche of "wine must". The dynamics and identity of non-Sacchoromyces yeasts during the cold maceration and alcoholic fermentation of grape must were investigated under real production conditions and laboratory scale in the Bordeaux region. Furthermore, we studied the impact of three oenological parameters (temperature management, timing of dried yeast addition and oxygen) on the development and diversity of non-saccharomyces yeasts during cold maceration. Twenty-six different non-Saccharomyces species were placed in a collection representing the non-Saccharomyces yeast diversity during initial steps in wine making. In addition several types of interaction between non-,Saccharomyces yeast and Saccharomyces cerevisiae were revealed. The impact of several non-Saccharomycesyeasts on wine aromatic properties was revealed by studying their capacity to contribute to the grapefruit and box tree aroma in white wines. This work also proposes specific detection and observation of Issatchenkia orientalis, Candida zemplinina Metschnikowia pulcherrima, Torulaspora delbrueckii, Hanseniaspora spp. And Saccharonryces by quantitative PCR in the ecosystem

L'utilisation de souches de levures sélectionnées pour réaliser la FA est une pratique très répandue en œnologie. Après le développement de l'utilisation de levains de souche pure de Saccharomyces, l'innovation est aujourd'hui dans la mise en œuvre de levains mixtes de Saccharomyces et de non-Saccharomyces qui permettent de diversifier les produits finaux obtenus. La problématique réside dans l'existence d'interactions entre les souches rendant difficile la maîtrise de la fermentation. T. delbrueckii présente dans la flore indigène du mout de raisin est une des levures non-Saccharomyces les plus appropriées pour entrer dans la composition de ces levains mixtes. En effet, elle présente une bonne capacité fermentaire et peut permettre d'augmenter la complexité aromatique du vin ou encore de réduire son acidité volatile. L'objectif de ce travail était d'étudier les interactions pendant la FA entre des souches sélectionnées pour l'oenologie : une T. delbrueckii et une S. cerevisiae. Pour cela des expériences ont été réalisées dans des milieux synthétiques simulant le moût de raisins blancs. Le comportement des souches pures a tout d'abord été caractérisé. Il a été montré que la souche S. cerevisiae avait de meilleures performances fermentaires d'un point de vue cinétique que la souche T. delbrueckii. Toutefois, T. delbrueckii a montré des capacités acceptables pour épuiser les sucres et surtout a permis d'obtenir des profils aromatiques différents. Le comportement vis-à-vis de l'oxygénation des moûts de ces deux levures est assez semblable, T. delbrueckii étant cependant beaucoup plus sensible à ce paramètre que S. cerevisiae. L'interaction entre ces deux levures a ensuite était étudiée dans un bioréacteur à membrane sous anaérobie stricte dans différentes conditions : composition en azote assimilable du milieu et stratégie d'inoculation. Il a été clairement mis en évidence que T. delbrueckii était affectée par la présence de S. cerevisiae. Le type d'interaction soupçonné est celui d'amensalisme lié à l'excrétion par S. cerevisiae d'un constituant toxique pour T. delbrueckii. Dans ces conditions, la stratégie d'inoculation recommandée est l'ensemencement séquentiel des levures : T. delbrueckii en début de fermentation, puis l'ajout de S. cerevisiae 48 h après. Ceci permet à T. delbrueckii de se développer et d'exprimer son potentiel aromatique avant que S. cerevisiae ne soit introduit pour assurer une fin rapide de la fermentation. Toutefois, nous avons montré que même dans ces conditions, l'implantation de T. delbrueckii n'était pas garantie car, le moût n'étant pas stérile, une présence, même faible, de S. cerevisiae dans la flore naturelle peut inhiber sa croissance. Par ailleurs, il a été mis en évidence que dans les mouts à faible teneur en azote initial, ce constituant pouvait être épuisé au moment de l'inoculation de S. cerevisiae. Dans ces conditions, S. cerevisiae ne peut se développer et l'achèvement de la fermentation est alors problématique
The use of the selected yeast strains to realize the alcoholic fermentation is very prevalent practice in vinification. After the development of utilization of the preparation of pure Saccharomyces cerevisiae strain, the innovation is now to apply the mixte starter cultures of Saccharomyces and non-Saccharomyces that allow to diversifying the obtained final products. The problem resides in the existence of interactions between the strains giving the difficulty to controle the fermentation. Torulaspora delbrueckii present in the indigenous flora of the grape must is one of the most appropriate non-Saccharomyces yeasts to enter in the composition of these multistater cultures. In fact, this strain has been presented a good fermentative capacity and could allow to increasing not only the aromatic complexity of wine, but also to reducing its volatile acidity. The objective of our work is to study the interactions during the alcoholic fermentation between the selected strains for enology: one T. delbrueckii and one S. cerevisiae. For this reason, the experiments were realized in the synthetic mediums simulated to the white grape must. The behaviours of the pure strains were firstly characterized. It was shown that the S. cerevisiae strain had the best fermentative performances, a critical point in comparaison with the T. delbrueckii strain. Nevetheless, T. delbrueckii showed the acceptable capacities to exhaust the sugars and especially to allow us to obtain the different aromatic profiles to that of S. cerevisiae. The behaviour via the oxygenation to the musts of these two yeasts is enough close, T. delbrueckii being however much more sensible to that parameter than . cerevisiae. The interactions between these two yeasts were then studied in a membrane bioreacteur under strict anaerobie in different conditions: composition in assimilable nitrogen of the medium and strategy of inoculation. It has been clearly demonstrated that T. delbrueckii has been affected by the presence of S. cerevisiae. The suspected type of this interaction is the amensalism one bound to a toxic compound excreted by S. cerevisiae. In these conditions, the recommended inoculation strategy is the sequential culture of these yeasts: T. delbrueckii at the beginning of the fermentation, then the addition of S. cerevisiae after 48 h. This allows T. delbrueckii to develop and express its potentiel of aromatic production before the S. cerevisiae is introduced to assure a rapid finish of the fermentation. However, we showed that even in these conditions, T. delbrueckii growth has been not guaranteed because of, since the must is not sterilized, a presence even small of S. cerevisiae in the natural flore can inhibite the croissance of the former. It has been also demonstrated that in the must with low intitial nitrogen content, this compound could be exhausted at the moment of the S. cerevisiae inoculation. In these conditions, S. cerevisiae can not develop and the achievement of the fermentation is yet problematic

La principale motivation de ce travail est l'étude de l'application de la commande non linéaire géométrique à un réacteur biologique pour la production de Saccharomyces cerevisiae. Ce procédé conduit en mode semi-continu possède un comportement extrêmement non linéaire. Pour l'application de la commande, un modèle mathématique du procédé est nécessaire ; dans ce but, on utilise un modèle physiologique pour la croissance de la levure. Le modèle décrit les trois phases de production de la biomasse qui sont: la fermentation du glucose, la respiration de l'éthanol et la respiration du glucose. Le procédé fonctionne d'abord en mode discontinu, en boucle ouverte, puis en mode semi-continu, en boucle fermée. Les deux techniques de commande non linéaire géométrique, la linéarisation exacte entrée/sortie et la linéarisation exacte entrée/état, ont été appliquées à la poursuite d'une trajectoire de référence. La sortie considérée est la concentration en glucose dans le réacteur. Ces techniques de commande sont basées sur la connaissance de toutes les variables d'état du procédé. Dans notre cas, tous les états ne sont pas disponibles comme mesures et l'utilisation d'un observateur d'état a été indispensable. Le filtre de Kalman étendu (EKF) a été utilisé dans sa version continue/discrète. Pour l'application de l'EKF, trois stratégies ont été développées pour tenir compte de différentes périodes d'échantillonnage et de retards des variables de mesures disponibles. Les résultats ont été obtenus par simulation et par expérimentation. L’implantation sur un bioréacteur pilote a été effectuée et la technique de commande non linéaire a montré en général d'excellents résultats

Le premier objectif de cette thèse est d'étudier la composante fongique du microbiote des ruminants, en particulier celui des vaches laitières. Pour cela, le mycobiote intestinal de vaches laitières a été ciblé selon deux régimes alimentaires saisonniers différents, un régime hivernal et un régime estival, permettant de mettre en évidence l'impact de l'alimentation et de la saison sur le mycobiote intestinal. L'analyse de la beta-diversité a montré un mycobiote différent selon le type d'alimentation. En effet, les vaches ont reçu une alimentation estivale en pâturage et une alimentation hivernale qui est composée de foins, d'ensilage de maïs et d'herbe et de concentré de production. Les indices d'alpha-diversité (Simpson inverse, Chao1, uniformité de Simpson) démontrent une plus grande richesse, une diversité et une uniformité du mycobiote avec l'alimentation estivale, et une chute de ces mêmes paramètres lors de l'alimentation hivernale. Dans notre analyse, nous avons remarqué que le genre Geotrichum est présent chez tous les ruminants de cette étude en hiver et compose la majorité du mycobiote (abondance relative moyenne de 65%). Une seconde étude a permis de mettre en évidence un mycobiote composé d'une unité taxonomique opérationnelle (OTU) appartenant à la famille des Dipodascaceae, présente dans tous les compartiments du tractus gastrointestinal (rumen, colon, rectum). L'OTU n'a pas pu être identifiée plus profondément, mais il est à noter que le genre Geotrichum appartient à la famille Dipodascaceae. L'analyse de la beta-diversité de ces mêmes échantillons a été réalisée, après extraction de l'ADN avec 3 kits (MN, ZQ et ZM) et l'analyse des profils mycobiotiques a pu mettre en évidence des différences entre le profil obtenu en utilisant l'ADN extrait avec un kit commercial recommandé pour les analyses des microbiotes (ZM), et les profils obtenus avec les deux autres kits (MN et ZQ). Le deuxième objectif de cette thèse porte sur la recherche de levures non-Saccharomyces comme souches probiotiques pour les ruminants. Le criblage d'une collection de 431 levures non-Saccharomyces pour leurs propriétés inhibitrices contre des bactéries à Gram-positif et à Gram négatif a permis de montrer que 71 souches ont au moins une activité inhibitrice contre une de ces cibles. Toutefois, pour la suite de cette thèse, 6 levures non- Saccharomyces ont été sélectionnées : ICVY060, LAN55, ICVY061, ICVY062, ICVY063 et ICVY064, en raison de leur spectre d'activité in vitro contre des pathogènes du ruminant, en conditions aérobie et anaérobie à 30°C et 39°C. A noter que deux souches ICVY060 et LAN55 ont montré le plus large spectre d'activité contre toutes les bactéries cibles. Enfin, ces 6 souches se sont avérées être non cytotoxiques, non hémolytiques, sensibles aux principaux antifongiques utilisés en clinique et survivent relativement mieux in vitro que le probiotique Saccharomyces cerevisiae CNCM-I-1077 dans des conditions mimant l'abomasum. D'autres tests tels que les propriétés de surface, ou encore leur impact sur l'expression des gènes codant les protéines de jonctions cellulaires intestinales ont été réalisés
The first objective of this thesis was to study the fungal component of ruminant microbiota, particularly in dairy cows. To this end, we targeted the intestinal mycobiota of dairy cows differently fed and considering also the impact of the seasonality. Therefore, the analysis of beta-diversity showed a different mycobiota, depending on the type of feed received. The cows were fed with a summer pasture diet and a winter diet constituted of hay, corn and grass silage and production concentrate. The alpha diversity indices (Simpson inverse, Chao1, Simpson uniformity) unveiled a greater richness, diversity and uniformity of mycobiota with summer feeding, and a noticeable decrease in these parameters with winter feeding. In our analysis, we found that Geotrichum genus was present in all ruminants in this study in winter, leading to the highest relative abundance 65%. A second study revealed a mycobiota composed of an operational taxonomic unit (OTU) belonging to the Dipodascaceae family and present in all compartments of the gastrointestinal tract (rumen, colon, rectum). The OTU could not be further identified, but it should be noted that the Geotrichum genus belongs to the Dipodascaceae family. Analysis of the beta-diversity of these same samples was carried out after DNA extraction using 3 different kits, and analysis of the mycobiotic profiles revealed differences between the profile obtained using DNA extracted with a commercial kit recommended for microbiota analysis (ZM), and the profiles obtained with the other two kits (MN and ZQ). The second objective was to screen and characterize a collection of non-Saccharomyces yeasts for their probiotic trends and design a potential application in the animal production, particularly in ruminants. Following a screening of a collection of 431 non-Saccharomyces yeasts for their inhibitory activity against Gram-positive target bacteria and Gram-negative bacteria, 71 strains showed inhibitory activity against at least one of the target bacteria. Nonetheless, we considered 6 non-Saccharomyces yeasts (ICVY060, LAN55, ICVY061, ICVY062, ICVY063 and ICVY064) due to their spectrum of activity in vitro against ruminant pathogens, under both aerobic and anaerobic conditions and prevailing temperatures of 30°C and 39°C. Two strains, ICVY060 and LAN55, showed the broadest spectrum of activity by inhibiting all targeted bacteria. Of note, these strains were characterized for their resistance to conditions mimicking those prevailing in the animal abomasum and intestine compartments, with better survival rate in the in vitro abomasum conditions. Finally, all these strains resulted to be safe as non-cytotoxic, non-hemolytic activity was registered and were also sensitive to the main antifungal agents of clinical use. Further analyses, such as their surface properties or their impact on membrane integrity by studying the expression of genes encoding cell junction proteins were established

Le comportement stationnaire et dynamique de la voie haute de la glycolyse est étudié dans des extraits acellulaires de levure. Le système centré sur le cycle PFK/FDPase contient la pyruvate kinase, l'adénylate kinase et la phosphoglucose isomérase. Le système réactionnel opère dans des conditions thermodynamiques ouvertes maintenues par une alimentation en continu en substrats (le glucose 6-phosphate, l'ATP et le PEP). Pour des conditions expérimentales particulières, des modifications de la charge énergétique d'entrée peuvent provoquer des transitions entre les états stationnaires qui sont réversibles (comme il apparaît dans les phénomènes classiques d'hystérèse) ou qui sont irréversibles (le système n'est plus capable de retourner à l'état initial). A partir du même modèle qualitatif, une variation de la charge énergétique d'entrée provoque l'apparition de branches non-connectées. Dans de telles structures liées à la bistabilité, aucune transition entre les deux branches stables coexistantes n'est possible, définissant des états stationnaires non-équivalents. Les différentes transitions peuvent avoir des implications biologiques en relation avec des commutations, l'adaptation et des phénomènes de mémoire.

Cette investigation anthropologique touche aux types de relations qu'entretiennent les scientifiques, et plus particulièrement les biologistes, avec ceux que l'on a coutume de nommer leurs "objets de recherche". Partant du constat que l'usage de catégories comme la rationalité ou l'objectivité, ou encore les dichotomies sujet/objet et nature/culture ne peuvent que nuire à un rendu de l'expérience scientifique qui tienne compte de ce qui importe réellement aux chercheurs, cette thèse se déploie autour d'un laboratoire et de l'observation minutieuse des interactions entre les deux espèces dominantes qui le définissent : l'Homme et la levure Saccharomyces cerevisiae, et interroge ainsi sous un autre angle des notions comme le réductionnisme, l'objectivité ou encore l'universalité des connaissances produites par les sciences occidentales
This anthropological investigation concerns the types of relationships between scientists, and more specifically biologists, with those actually called their “research object”. From the assessment that the use of categories such as rationality or objectivity, or the dichotomies subject/object and nature/culture can only be prejudicial to a rendition of the scientific experiment which considers what really matters to the researchers, this PhD takes place around a laboratory and around meticulous observation of the interactions between the two prevailing species which define it : the Man and the Saccharomyces cerevisiae yeast, and question therefore with a different perspective notions such as reductionism, objectivity or universality of knowledge made from western sciences

Les travaux accomplis au cours de cette thèse au Laboratoire de Colloïdes et Matériaux Divisés résultent d'une volonté de développer et d'utiliser des outils physico-chimiques pour la compréhension de problématiques biologiques. Nous avons choisi comme objet d'étude ce champignon unicellulaire extraordinaire qu'est la levure Saccharomyces cerevisiae. En particulier nous nous sommes intéressés à la fermentation alcoolique à travers la mesure d'un des paramètres du métabolisme : l'énergie de maintenance. Les résultats obtenus s'articulent autour de deux réalisations principales. *** Développement d'un outil de mesure original : Nous avons mis au point un système physico-chimique qui permet de mesurer la polymérisation ou la dépolymérisation au sein de microréservoirs de quelques dizaines de picolitres . Le principe repose sur l'osmose, c'est-à-dire la di usion, à travers une membrane semi-perméable, de solvant entre des réservoirs qui possèdent des potentiels chimiques di érents. Pour réaliser ce système nous avons fabriqué un réseau de gouttes d'émulsion inverse qui constituent des microréservoirs dans lesquels nous avons encapsulé les levures. Les gouttes ont été organisées en un réseau bi-dimensionnel qui nous a permis de suivre des cinétiques de croissance sur un grand nombre d'échantillons (haut débit). Nous avons alors élaboré une nouvelle formulation de l'émulsion afin de rendre les gouttes adhésives entre elles. Ceci nous a permis d'imposer les dimensions et les propriétés de transport à l'intérieur des membranes semi-perméables ainsi formées entre les gouttes en contact. Nous avons alors démontré qu'en imposant des potentiels chimiques constants dans le réseau de gouttes, nous pouvions suivre, à travers l'évolution de leur volumes, la cinétique de processus de polymérisation (création de biomasse dans le cas de la levure) et de dépolymérisation (dans le cas de la lyse enzymatique) qui ont lieu dans des réservoirs. *** Mesure directe de l'énergie de maintenance : Nous avons utilisé notre outil pour mesurer la consommation du glucose par S. cerevisiae lors de la fermentation alcoolique en milieu anaérobie. Nous avons ainsi distingué deux comportements suivant que les cellules se divisent ou qu'elles sont en phase stationnaire. Nous avons développé un modèle qui nous a permis d'expliquer les comportements observés en fonction des paramètres expérimentaux (concentration en sucre, transport) et du métabolisme de la levure. Nous nous sommes alors rendu compte qu'en imposant le réactif limitant nous pouvions mesurer l'énergie de maintenance, c'est-à-dire l'énergie qui n'est pas utilisée pour la division cellulaire. Nous avons enfin mesuré le taux de consommation de glucose pour trois souches différentes. Nous avons ainsi montrer qu'il était possible d'identifier des souches selon leur capacité à métaboliser le glucose. Nous nous sommes alors interrogés sur la possibilité de cribler à haut débit des souches capables de métaboliser des sucres différents. Aussi, nous pouvons envisager, pour augmenter la taille de la librairie à trier, une approche 3D. Les gouttes sont collectées dans une seringue dans laquelle le mûrissement entre les gouttes se produit. Elles sont alors réinjectées dans un microsystème contenant une centaine de zones de tri. Avec un débit d'injection des gouttes de 10kHz, sachant qu'une goutte sur 10 contient une levure, on peut alors cribler une librairie de 108 individus différents en moins de 30 minutes. *** Au total : Le principe de mûrissement des gouttes développé dans cette thèse peut s'appliquer à tout processus qui se traduit par une modification du nombre d'espèces osmotiquement actives. On peut donc envisager de l'utiliser pour un champ vaste d'applications telle que la recherche de nouvelles enzymes de protéolyse. Enfin, nous aimerions attirer l'attention du lecteur sur l'aspect statistique de cette méthode. Elle offre la possibilité d'étudier des processus de sécrétion ou d'assimilation de plusieurs milliers d'individus isolés. Ainsi, des questions telles que la variabilité entre individus vont pouvoir être abordées.

Chez Saccharomyces cerevisiae, le complexe de transcription HAP contrôle l’équilibre de fermentation/respiration. Il se compose de quatre sous-unités. Les sous-unités ScHap2/3/5, qui sont nécessaires à l’interaction avec l’AND, sont exprimées en permanence. ScHAP4, qui contient le domaine d'activation de la transcription, est réprimé par le glucose. Il est conservé uniquement dans le motif 16 aa N-terminal, essentiel pour l'interaction avec le complexe ScHap2/3/5. Au cours de la transition diauxique ScHap4 active l’expression des gènes respiratoires. Dans la levure méthylotrophe Hansenula polymorpha, on a identifié deux homologues potentiels de ScHap4: HpHap4-A et HpHap4-B, abritant le motif N-terminal du ScHap4. Ces deux homologues rétablissent la déficience respiratoire du mutant Sc∆hap4 et activent l'expression ScCYC1. Nous avons montré que HpHAP4-A est l'orthologue fonctionnel du ScHAP4 et qu’il est impliqué dans la régulation positive des gènes respiratoires chez l’aérobe obligatoire H. Polymorpha. HpHAP4-B, contenant en outre le motif de l’interaction avec l’ADN bZIP, est impliqué dans la réponse au déficit de fer et au stress oxydatif. L'expression de ces deux homologues dans leur hôte est régulée par une source de carbone et par une concentration de fer qui agissent en sens inverse. HpHap4-B est en mesure d'atténuer la sensibilité au stress oxydatif des mutants delta yap1 de S. Cerevisiae et de H. Polymorpha. Cette thèse met en lumière la caractérisation physiologique des mutants Hpdeltahap4-A, Hpdeltahap4-B et Hpdeltayap1 et montre les effets régulateurs de HpHap4-A et HpHap4-B dans le système hétérologue S. Cerevisiae et dans le système natif H. Polymorpha
In Saccharomyces cerevisiae heteromeric transcriptional complex HAP controls the fermentation/respiration shift. Genes ScHAP2/3/5 encoding CCAAT-binding core subunits are constitutively expressed. ScHAP4, containing the transcriptional activation domain is repressed by glucose and is conserved only in 16 aa N-terminal motif essential for ScHap2/3/5 interaction. During diauxic shift ScHAP4 promoter is released from glucose repression and ScHap4 via interaction with ScHap2/3/5 complex activates the respiratory genes. In Hansenula polymorpha two ScHap4 homologues HpHap4-A and HpHap4-B harboring the conservative N-terminal ScHap4 motif were identified. Both of them allay Sc delta hap4 mutant respiratory deficiency and activate the expression of ScCYC1. We report that HpHAP4-A is the functional orthologue of ScHAP4 and regulates positively the respiratory genes in obligate aerob H. Polymorpha. HpHAP4-B, containing additionally DNA-binding domain of bZIP type, is involved in iron deficit and oxidative stress response. The expression of these genes in H. Polymorpha is regulated by carbon source and iron in opposite manner pointing at their different functional role. HpHap4-B alleviates the sensitivity of both S. Cerevisiae and H. Polymorpha deltayap1 mutants to oxidative stress. A set of experiments was performed to characterize the mutants with deleted HpHAP4-A, HpHAP4-B and HpYAP1. The HpHap4-A and HpHap4-B transcription regulatory effect in heterologous S. Cerevisiae and native H. Polymorpha systems are studied. The interplay of N-terminal conserved motif of ScHap4 and bZip of the YAP family proteins may be important during evolution of transcriptional regulatory network

La caractérisation phénotypique de l’espèce Torulaspora delbrueckii en conditions œnologiques, à partir de l’étude d’un grand nombre de souches, a permis de mettre en évidence une grande variabilité au sein de cette espèce. En effet, les souches de T.delbrueckii présentent des différences au niveau des durées de phase de latence et de fermentation, des capacités biotiques mais aussi des productions d’éthanol (maximum 12% vol.). Cette variabilité se retrouve également pour la production d’acidité volatile, de glycérol et de certains arômes. Ce travail confirme les faibles productions d’acidité volatile et de glycérol de cette espèce et met en évidence une réponse au stress osmotique différente de celle de l’espèce Saccharomyces cerevisiae. Au final, l’espèce T. delbrueckii présente une grande « pureté » de fermentation et produit peu de composés indésirables comme le sulfure d’hydrogène, les phénols volatils, l’acetoïne, l’acétaldéhyde et le diacétyle. La réalisation de co-inoculations T. delbrueckii / S. cerevisiae sur moûts liquoreux, permet une réduction systématique de l’acidité volatile des vins, en comparaison à une fermentation pure de l’espèce S. cerevisiae, quelque soit la souche de T. delbrueckii utilisée. De plus, la souche T. delbrueckii OXT1 1//2 a permis de complexifier la composition aromatique d’un moût sec issu du cépage Sauvignon blanc (esters fermentaires +25%, phényl-2-éthanol +51% et thiols volatils +31%). Enfin, la mise au point d’un fermenteur à double compartiment, avec une séparation physique des levures tout en conservant l’homogénéité du milieu de culture, a permis d’aborder l’étude des interactions entre ces 2 espèces. Des inhibitions de type « cell-cell contact » ont ainsi été mises en évidence
The phenotypic characterization of Torulaspora delbrueckii species in enological conditions, using a large number of strains, showed up a wide variability within this species. Indeed, the strains of T. delbrueckii present different fermentative capacities for lag phase and fermentation durations, biotic capacities and ethanol production (up to 12 % vol.). This phenotypic variability is also obtained for the production of volatile acidity, glycerol and certain aroma compounds. This work confirms the low productions of volatile acidity and glycerol of this species and reveals an osmotic stress response distinct from that of Saccharomyces cerevisiae. Finally, the T. delbrueckii species presents a high fermentation purity and produces low levels of undesirable compounds like hydrogen sulfide, volatile phenols, acetoin, acetaldehyde and diacetyl. The realization of co-inoculations T. delbrueckii / S. cerevisiae on high sugar must, allows a systematic reduction of the volatile acidity of wines, in comparison to a pure fermentation of S. cerevisiae. Moreover, co-inoculation with the T. delbrueckii strain OXT1 1 // 2 allowed the increase of aromatic complexity of a Sauvignon blanc dry wine (esters + 25%, 2-phenylethanol +51 % and volatile thiols + 31 %). At last, the development of a fermentor with double compartment allowing a physical separation of yeasts and preserving the homogeneity of culture medium, allowed us to approach the study of yeast interactions. Inhibitions of type “cell-cell contact” have been demonstrated

Les effets de différentes activités anthropiques (vignoble, cuverie) sur les populations fongiques du raisin au vin ont été étudiés. Afin de caractériser ces effets, il était nécessaire d’avoir accès à la diversité globale des populations (pyroséquençage et IR-TF) mais également à la diversité intraspécifique (IR-TF). La spectroscopie a ainsi été validée pour sa capacité à caractériser la population globale et à discriminer les souches pour trois espèces de levures non-Saccharomyces (NS). Pour la première fois, il est démontré que la baie de raisin constitue une source limitée pour les levures NS alors que la cuverie semble constituer une source importante; l’air étant un vecteur important de dissémination de ces levures. De plus, la persistance et la réimplantation des levures NS dans le moût l’année suivante ont été démontrées. Les activités anthropiques étudiées modifient la diversité fongique. Une biodiversité plus faible pour les raisins de la modalité biologique a été mesurée pour les 3 millésimes considérés. Les populations fongiques sont ensuite fortement remaniées par l’étape de pressurage/clarification et l’influence de la flore de cuverie est confirmée. L’ajout de SO2 modifie les dynamiques des populations et favorise la domination de l’espèce S. cerevisiae. L’analyse chimique non-ciblée des vins montre pour la première fois que ces derniers peuvent être discriminés à la fin de la fermentation alcoolique en fonction de la protection phytosanitaire, que ces fermentations aient eu lieu en présence ou non de SO2. Ainsi, l'existence dans les vins de signatures de diversité chimique et microbiologique liées au mode de protection au vignoble est mise en évidence
The effects of different anthropogenic activities (vineyard, winery) on fungal populations from grape to wine were studied. To characterize these effects, it was necessary to access to the overall diversity of populations (pyrosequencing and spectroscopy FT-IR) but also to intra-specific diversity (FT-IR). Spectroscopy FT-IR has been validated for their ability to characterize the global population and to discriminate the strains for three species of non-Saccharomyces yeasts (NS). For the first time, it is shown that the grape berry is a limited source for NS yeasts while the winery seems to be a significant source; the air is an important vector for dissemination of these yeasts. In addition, persistence of NS yeast strains from year to year in the winery has been demonstrated. The studied anthropogenic activities modify the fungal diversity. Thus, lower biodiversity of grapes from organic modality was measured for the three vintages considered. The pressing / clarification step revises strongly fungal populations and the influence of the winery flora is confirmed. The addition of SO2 changes the population dynamics and favors the dominance of the species S. cerevisiae. The non-targeted chemical analysis shows, for the first time, that these wines can be distinguished at the end of the alcoholic fermentation (with or without SO2) depending on plant protection. Thus, the existence in wines of chemical and microbiological signatures associated with vineyard protection mode is highlighted

La grande diversité des composés d’arômes naturels produits par les levures est aujourd’hui décrite comme une option particulièrement intéressante du fait des métabolismes variés présents chez ces microorganismes et leur capacité à produire un large panel de composés organiques volatils (COVs). Parmi les levures non Saccharomyces citées dans la littérature, la levure Saprochaete suaveolens (anciennement connue sous le nom de Geotrichum fragrans) se distingue des autres levures aromatiques pour sa haute productivité en COVs tant du point de vue qualitatif que quantitatif. S. suaveolens est notamment très prometteuse pour sa production en esters α-insaturés à haute valeur ajoutée, qui sont rarement retrouvés dans les bouquets aromatiques des souches levuriennes à l’instar du tiglate d’éthyle, et produits industriellement par voie synthétique pour le marché des arômes. Le métabolisme aromatique de S. suaveolens peut ainsi être perçu comme un modèle pour la production de COVs par les levures. Cette étude avait pour objectif de mieux caractériser et de valoriser la production d’arômes par une souche sauvage de S. suaveolens à l’aide de trois approches. La première approche est basée sur l’utilisation des connaissances du métabolisme aromatique de S. suaveolens pour développer une méthode de criblage permettant de sélectionner des souches de levure sauvages productrices de COVs, notamment sous forme d’esters α-insaturés. La seconde approche a consisté à optimiser la production d’arômes chez S. suaveolens en générant et en sélectionnant des mutants surproduisant des esters insaturés par mutagénèse UV. La dernière approche a permis d’évaluer le pouvoir aromatisant de la levure S. suaveolens en condition de fermentation brassicole. Globalement, les résultats de ces travaux ont montré que notre modèle basé sur le métabolisme de S. suaveolens a permis d’isoler de nouvelles souches de levures productrices d’esters α-insaturés à partir d’échantillons prélevés sur les déjections d’animaux sauvages en Afrique du Sud. Par ailleurs, l’approche mutagénique a permis de démontrer la possibilité d’améliorer très significativement la production de COVs chez S. suaveolens grâce à l’inactivation de l’une des enzymes clées de son métabolisme aromatique, à savoir l’enoyl-CoA hydratase. Enfin, des essais de fabrication de bière ont clairement montré que la levure S. suaveolens possède un pouvoir aromatisant particulièrement appréciable dans le cadre de fermentations mixtes de moûts réalisées en condition industrielle en présence de la levure Saccharomyces cerevisiae
The huge diversity of natural aroma compounds produced by yeast is described as an option particularly interesting because of the various metabolisms occurring in these microorganisms and their ability of producing a large panel of volatile organic compounds (VOCs). Among the non-Saccharomyces yeast cited in the literature, the yeast Saprochaete suaveolens (former known as Geotrichum fragrans) is distinguishable from the others aromatic yeasts for its high productivity in VOCs both from a quantitative and qualitative point of view. S. suaveolens is notably very promising for its production in high valuable α-unsaturated esters such as ethyl tiglate, which are rarely refund in the aromatic bouquet of yeast strains and which are industrially produced by synthetical way for the aroma market. Aromatic metabolism of S. suaveolens could therefore be seen as a modele for VOCs production by yeast. This study aimed at better characterizing and valorizing the aroma production by a wild strain of S. suaveolens by three approaches. First approach is based on the use of the knowledges on aromatic metabolism of S. suaveolens to develop a screening method allowing the selection of natural VOCs producing wild strains, notably under form of α-unsaturated esters. The second approach consisted in optimizing the aroma production by S. suaveolens while generating and selecting mutants overproducing unsaturated esters via UV mutagenesis. The last approach allowed evaluating the aromatization power of S. suaveolens in brewery fermentation condition. Globally, results of these works have shown that our model based on S. suaveolens metabolism allowed isolating news α-unsaturated esters producing strains from samples taken from dejections of wild animals in South-Africa. Moreover, the mutagenic approach allowed demonstrating the possibility of very significantly increasing the overall VOCs production of S. suaveolens thank to the inactivation of a key-enzyme of its aromatic metabolism, namely the enoyl-CoA hydratase. Finally, beer making trials clearly showed that S. suaveolens posseses an aromatizing power particularly appreciable in the context of mixed fermentation of musts carried out in industrial conditions in the presence of the yeast Saccharomyces cerevisiae

Les protéines de la famille L7Ae sont les constituants de nombreuses RNP essentielles. Chez les vertébrés, les particules snoRNP C/D et H/ACA sont impliquées dans la biogenèse des ribosomes, la UsnRNP U4 dans l'épissage des pré-ARNm, le complexe télomérase dans la réplication des télomères, et les mRNP SECIS dans la traduction des sélénoprotéines. Comme c'est le cas pour la majorité des RNP eucaryotes, leur assemblage, sous forme d'entités fonctionnelles, ne constitue pas un processus autonome et requiert l'intervention de facteurs spécialisés. En basant notre étude sur l'assemblage des snoRNP C/D, dans l'organisme modèle Saccharomyces cerevisiae, et en utilisant des approches de biologie moléculaire, de biochimie et de génétique, nous avons entrepris de caractériser ces événements. Nos travaux ont contribué à identifier un ensemble de protéines, agissant de façon coordonnée au sein d'une machinerie conservée entre la levure et l'homme. Cette dernière est composée de deux principales sous-unités : (i) Rsa1p/NUFIP, une protéine plate-forme, qui interagit avec certaines protéines de la famille L7Ae et facilite l'assemblage des RNP, (ii) le complexe R2TP (Rvb1p/TIP49, Rvb2p/TIP48, Pih1p/PIH1, Tah1p/SPAGH), qui pourrait opérer des remodelages conformationnels nécessaires à la formation des RNP matures. En plus de ces acteurs centraux, d'autres facteurs sont apparus intimement liés à ce mécanisme. La protéine Hit1p/TRIP3, interagit notamment avec Rsa1p/NUFIP et s'est avéré requise pour assurer sa stabilité chez la levure. La chaperonne HSP90, dont le rôle est prédominant chez l'homme, exerce son activité sur certains constituants des RNP. Enfin, la protéine Bcd1p/BCD1 pourrait être associée à cette machinerie dans le cadre spécifique de l'assemblage des snoRNP C/D
The L7Ae family proteins are essential components of many RNPs. In vertebrates, C/D and H/ACA snoRNPs are involved in ribosome biogenesis, the U4 snRNP in pre-mRNA splicing, the telomerase complex in telomeres replication, and mRNP SECIS in selenoproteins translation. Like most eukaryotic RNPs, assembly in functional entities is not an autonomous process and requires the intervention of specialized factors. Basing our study on the assembly of C/D snoRNP in the model organism Saccharomyces cerevisiae, and using approaches of molecular biology, biochemistry and genetics, we undertook to decipher these mechanisms. Our work has helped to identify a set of proteins, acting in a coordinated manner within a machinery conserved between yeast and human. This machinery consists of two major subunits: (i) Rsa1p/NUFIP, a platform protein that interacts with some proteins of the L7Ae family and facilitates the RNPs assembly, (ii) the R2TP complex (Rvb1p/TIP49, Rvb2p/TIP48, Pih1p/PIH1, Tah1p/SPAGH), which could induce conformational remodeling necessary for the formation of mature RNPs. In addition to these key players, other factors appeared closely linked to this mechanism. The Hit1p/TRIP3 protein interacts with Rsa1p/NUFIP and is required to ensure its stability in yeast. HSP90 chaperone, whose role is predominant in human, operates on some components of the RNPs. Finally, the Bcd1p/BCD1 protein is associated specifically with this machinery during C/D snoRNPs assembly

La protéine Bcd1 est un facteur nucléaire essentiel à la viabilité cellulaire de la levure Saccharomyces cerevisiae. Il est décrit comme requis pour assurer la stabilité des snoRNA à boîtes C/D. Ces petits ARN non codants s’assemblent à un jeu de 4 protéines invariables pour former les snoRNP à boîtes C/D qui sont des acteurs cruciaux de la biogenèse des ribosomes. En effet, quelques-unes de ces particules participent aux mécanismes assurant la maturation du précurseur des ARN ribosomiques et la grande majorité des autres particules sont des catalyseurs de la modification par 2’-O-méthylation des riboses. Bcd1p n’est pas présente au sein des particules matures, mais fait partie de ses facteurs d’assemblage, au même titre que les sous-complexes Rsa1p:Hit1p et R2TP (Rvb1p:Rvb2p:Tah1p:Pih1p). Notre analyse de différents fragments de Bcd1p a dans un premier temps montré que sa région N-terminale (résidus 1 à 96) suffit à lui conférer son caractère essentiel. Cette région comprend un domaine à double doigt à zinc de la famille zf-HIT, également présent chez un autre facteur d’assemblage des snoRNP à boîtes C/D, la protéine Hit1. Nous avons résolu la structure 3D en solution de ces doigts à zinc et montré que ce sont des modules d’interaction avec les protéines Rvb1/2. Dans un second temps nous avons identifié la région C-terminale (résidus 120 à 303) de la protéine Bcd1 comme étant suffisante pour interagir avec la chaperonne d’histone Rtt106p. La structure 3D en solution de ce domaine a été déterminée par RMN. Différentes approches de cinétique d’échange hydrogène/deutérium et d’expériences de cross-link suivies par des analyses par spectrométrie de masse, des expériences de titrage par RMN et de SAXS nous ont permis d’obtenir des informations sur les surfaces d’interaction de chacune de ces deux protéines. Un fragment, défini à partir des données de RMN de Bcd1p libre, nous a permis d'obtenir des cristaux du complexe Bcd1p:Rtt106p ouvrant la perspective de résoudre sa structure 3D par diffraction aux rayons X. De plus, des études fonctionnelles ont débuté visant à déterminer l’importance de la formation de ce complexe sur la biogenèse des snoRNP à boîtes C/D et l’impact de Bcd1p sur l’interaction entre Rtt106p et les nucléosomes
The protein Bcd1 is a nuclear factor essential for the cellular viability of the yeast Saccharomyces cerevisiae. It is described as required to ensure box C/D snoRNA stability. These small non-coding RNAs associate with an invariable set of 4 proteins to form the box C/D snoRNPs that are crucial players in ribosome biogenesis. Indeed, some of these particles participate in mechanisms for the maturation of the ribosomal RNA precursor (prerRNA) and the vast majority of the other particles are catalysts of 2’-O-methylation of riboses. Bcd1p is not present in mature particles, but is one of the assembly factors in addition to the Rsa1p:Hit1p and R2TP (Rvb1p:Rvb2p:Tah1p:Pih1p) sub-complexes. Our analysis of the different Bcd1p fragments has firstly shown that the essential function of Bcd1p relies on its N-terminal region (residues 1 to 96). It comprises a double zinc finger domain from the zf-HIT family, also present in another box C/D snoRNP assembly factor, the protein Hit1. We solved the 3D solution structure of these two zinc fingers and showed that these are modules for the interaction of Bcd1p with the Rvb1/2 proteins. Secondly, we identified the C-terminal region (residues 120 to 303) of Bcd1p as being sufficient to interact with the histone chaperone Rtt106p. The 3D solution structure of this domain of Bcd1p was determined by NMR. Different approaches of hydrogen/deuterium kinetic exchange and cross-link experiments followed by mass spectrometry analysis, NMR titration, and SAXS allowed us to obtain information about the interaction surfaces on each of the two proteins. A fragment defined from NMR data on the free Bcd1p allowed us to obtain crystals of the Bcd1p:Rtt106p complex, opening the perspective to solve its 3D structure by X-ray diffraction. Furthermore, functional studies started in order to determine the importance of this complex formation in box C/D snoRNP biogenesis and the impact of Bcd1p on the interaction of Rtt106p with nucleosomes