Letteratura scientifica selezionata sul tema "Interaction membranaire"

L’accumulation et la toxicité (aigüe) des métaux dissous chez plusieurs organismes aquatiques peuvent être prédites adéquatement à l’aide du modèle du ligand biotique (MLB), même si quelques exceptions existent. Lors d’expositions chroniques aux métaux, des interactions physiologiques complexes entre les organismes et les métaux essentiels et non essentiels modulent le taux de transport des métaux et leur toxicité. La présente revue de littérature aborde les récentes avancées en chimie de l’environnement, en biologie moléculaire et en physiologie cellulaire touchant aux mécanismes de régulation du transport membranaire des métaux essentiels chez le phytoplancton eucaryote et leurs impacts sur l’accumulation et la toxicité d’un métal habituellement non essentiel, le cadmium. Cette revue évalue finalement la possibilité d’inclure des éléments de physiologie algale dans la présente version du MLB afin d’améliorer le potentiel de ce modèle à prédire l’accumulation et la toxicité des métaux pour des expositions chroniques. Les résultats disponibles dans la littérature suggèrent que l’inclusion des rétroactions négatives et positives des métaux sur les paramètres cinétiques (Vmax : vitesse maximale de transport transmembranaire; KM : affinité des transporteurs pour le métal) des multiples systèmes de transport membranaire des métaux a le potentiel d’améliorer les prédictions de l’accumulation et de la toxicité des métaux à long terme chez le phytoplancton. Le développement d’un MLB capable de prédire adéquatement la toxicité chronique des métaux dans des conditions physicochimiques variables représentatives de celles retrouvées en milieu naturel bénéficiera des avancées récentes et futures en toxicologie, biologie et chimie de l’environnement. Ces connaissances pourraient permettre à long terme d’atteindre l’objectif ambitieux d’un MLB capable de réaliser des prédictions fiables à l’intérieur de milieux naturels complexes de différentes compositions chimiques.

Les podosomes sont des microdomaines membranaires riches en actine, en interaction directe avec la matrice extracellulaire. Des câbles d’acto-myosine les assemblent en réseau pour former une superstructure cellulaire aux fonctions versatiles. Extensivement décrits in vitro, les podosomes se dessinent comme des acteurs majeurs de processus physiologiques spécifiques. Les détails de leur intervention in vivo restent à préciser. Le microenvironnement ayant un effet prépondérant dans l’acquisition de leurs caractéristiques morphologiques et fonctionnelles, leur rôle ne peut être abordé que dans un contexte cellulaire particulier. Nous nous focaliserons ici sur trois processus impliquant ces structures et discuterons les propriétés des podosomes exploitées dans ces situations.

Abstract Dans ce travail, nous avons étudié la rétention du bleu de méthylène (BM), du chrome hexavalent Cr(VI) et de l'acide éthylène diamine tétracétique (EDTA) par une membrane ZnAl2O4−TiO2. Les résultats obtenus ont montré que cette membrane présente une charge résiduelle qui dépend fortement du pH. L'effet de la pression et de la concentration sur le taux de rejet des espèces filtrées est étudié. La rétention des espèces ioniques est due à un mécanisme fondé sur les interactions électrostatiques entre les charges portées par la membrane et les ions. Le taux de rejet du BM diminue avec l'augmentation du pH, une situation qui provoque une diminution progressive de la charge positive de la membrane. Dans le cas du Cr(VI) et de l'EDTA, un pH alcalin est favorable pour une bonne rétention car la charge membranaire devient moins positive, le chrome est sous forme de CrO42− et l'EDTA apparaît sous ses formes les plus anioniques. L'effet de la pression sur le taux de rejet des solutés a montré que la contribution convective domine aux fortes pressions et conduit à des rétentions maximales du fait que le flux convectif du solvant Jv augmente et vient diluer le perméat.

Les effets de la supplémentation en lipides des rations pour vaches laitières sont récapitulés, en particulier pour ce qui concerne l’efficacité énergétique, la production laitière, le bilan énergétique et les variations de poids vif et d’état corporel. La supplémentation lipidique ne modifie pas le gain de poids vif ou d’état corporel après le pic de lactation mais tend à accroître la perte de poids vif en début de lactation, malgré l’accroissement du bilan énergétique calculé. La supplémentation lipidique tend à accroître le dépôt des lipides corporels chez le ruminant en croissance. Elle diminue la synthèse de novo d’acides gras dans les tissus adipeux, sans changer l’activité de la lipoprotéine lipase ni la capacité d’estérification totale des acides gras in vitro. La libération basale d’acides gras libres par le tissu adipeux in vitro, et les réponses lipolytiques beta- adrénergiques, sont accrues par les acides gras polyinsaturés protégés. La supplémentation en lipides accroît le dépôt des lipides corporels chez le porc en croissance lorsqu’il est dans un environnement chaud ou à la neutralité thermique. Chez la truie en lactation, elle accroît l’ingestion d’énergie et la sécrétion des lipides du lait, tout en diminuant la perte de poids vif. La supplémentation lipidique diminue la synthèse de novo d’acides gras et la libération basale de glycérol par le tissu adipeux de porc, et tend à accroître les réponses lipolytiques beta-adrénergiques simultanément à un accroissement de la fluidité membranaire et à une diminution de l’activité de la phosphodiestérase. Les lipides corporels sont accrus chez les rongeurs qui reçoivent des régimes enrichis en lipides, mais de façon moins marquée avec les lipides riches en acides gras polyinsaturés. L’activité de la lipoprotéine lipase du tissu adipeux est diminuée. La synthèse d’acides gras dans le foie est fortement diminuée par les acides gras polyinsaturés, et de façon moindre dans les tissus adipeux. La réponse beta-adrénergique de la lipolyse des tissus adipeux est diminuée, l’estérification est augmentée, et une résistance à l’insuline apparaît, en particulier avec les acides gras saturés. Il existe d’importantes interactions entre la supplémentation des rations en lipides, l’espèce animale et l’état physiologique. Les acides gras ingérés sont orientés prioritairement vers la mamelle pendant la lactation, ce qui explique la faible réponse des tissus adipeux, en particulier chez les ruminants où la supplémentation en lipides n’augmente que faiblement l’ingestion d’énergie.

L’enveloppe des bactéries à Gram négatif est composée de plusieurs polysaccharides dont certains, comme le peptidoglycane et les lipopolysaccharides, sont essentiels à leur survie et sont impliqués dans les interactions entre ces bactéries et leur environnement (e.g. résistance à des agents antimicrobiens et reconnaissance par le système immunitaire de l’hôte). La biosynthèse de ces polymères nécessite la translocation de leurs sous-unités à travers la membrane interne, ce qui requiert un lipide "porteur", l’undécaprényl phosphate (C55-P). Ce lipide est formé par la déphosphorylation de son précurseur, l’undécaprényl pyrophosphate (C55-PP), qui est lui-même généré par synthèse de novo ou par un recyclage. Chez Escherichia coli, les protéines membranaires BacA, YbjG, PgpB et LpxT présentent une activité C55-PP phosphatase et participe donc de façon redondante au recyclage du C55-P. Pour mieux comprendre le rôle physiologique spécifique de ces protéines dans la biogénèse de l’enveloppe, notre travail a porté sur l’étude des mécanismes d’action, de la fonction et de la régulation de deux de ces enzymes, PgpB et LpxT.L’activité de la protéine PgpB a été caractérisée in vivo et in vitro afin de mieux comprendre son rôle et sa capacité à participer à deux voies métaboliques essentielles, le recyclage du C55-P et la biosynthèse du phosphatidylglycérol. Nous avons mis en évidence des résidus d’acides aminés qui étaient essentiels à la catalyse des deux substrats naturels et d’autres qui n’avaient pas le même rôle dans l’hydrolyse des deux substrats, nous permettant de proposer des mécanismes différenciés. En outre, des données calorimétriques ont montré que PgpB pouvait être grandement stabilisée par la liaison d’un substrat. Hypothétiquement, le changement structural sous-jacent serait susceptible de libérer de l’énergie mobilisée pour le flip du produit à travers la membrane. La protéine LpxT est responsable d’une modification constitutive des lipopolysaccharides en transférant le phosphate libéré du C55-PP sur la partie lipide A. Dans certaines conditions de stress, l’activité de LpxT est spécifiquement inhibée par un petit peptide (PmrR) pour permettre à d’autres modifications de s’opérer. Nous avons montré que la modification catalysée par LpxT était déterminante pour permettre à E. coli de résister aux acides biliaires et de coloniser efficacement le tractus intestinal de l’hôte. LpxT constitue ainsi un point de contrôle clé chez E. coli pour résister à différent agents antimicrobiens qui ciblent les lipopolysaccharides mais qui possèdent des propriétés physico-chimiques opposées. En outre, nous avons montré que LpxT et PmrR formaient un complexe stable mais que de façon inattendue, cette liaison n’inhibait pas l’activité phosphotransférase de l’enzyme in vitro. Nous proposons que PmrR inhibe l’activité de LpxT in vivo en modifiant sa capacité à interagir avec ses partenaires de la voie de biosynthèse des lipopolysaccharides. La biogénèse des polymères de l’enveloppe est absolument nécessaire à la survie des bactéries et les modifications structurales de ces éléments sont autant de stratégies plus ou moins spécifiques qui participent au fitness et à un mode de vie particulier des bactéries. Les C55-PP phosphatases qui participent activement à ces processus constituent ainsi autant de cibles potentielles intéressantes pour la conception de nouveaux antibiotiques
The bacterial cell envelope is composed of many polysaccharides such as the peptidoglycan and the lipopolysaccharides (LPS) that are required for survival and are involved in the interactions that the bacteria establish with their surroundings, including antimicrobial resistance and host immune system recognition. The biosynthesis of these polymers requires the translocation of the sugar sub-units across the plasma membrane, which implies an essential lipid carrier, the undecaprenyl phosphate lipid (C55-P). This lipid is generated by the dephosphorylation of its precursor, C55-PP, itself arising from either de novo synthesis or recycling. The Escherichia coli bacterial species possesses four membrane proteins (BacA, YbjG, PgpB and LpxT) exhibiting a C55-PP phosphatase activity, which all contribute redundantly to C55-P recycling. To highlight the specific physiological role of these enzymes in the cell wall biogenesis, our work was focused on the characterization of the mechanism of action, the function and the regulation of two of these phosphatases, PgpG and LpxT.The PgpB activity was characterized both in vivo and in vitro to decipher its role and ability to participate in two essential metabolic pathways, the C55-P recycling and the phosphatidylglycerol biosynthesis. We identified essential residues of PgpB involved in the hydrolysis of both natural substrates, C55-PP and PGP, and some others that function differently in the hydrolysis of these two lipids, allowing us to propose different reaction mechanisms for this enzyme. In addition, calorimetric data showed that substrate binding greatly stabilized the PgpB protein. Hypothetically, the underlying structural change would release energy allowing translocation of the lipid across the membrane. LpxT is responsible for a constitutive modification of the LPS by transferring the phosphate released from C55-PP to lipid A. Under certain environmental stresses, the LpxT activity is specifically inhibited by a small peptide (PmrR), thereby allowing other modifications of the lipid A structure to take place. We showed that the LpxT-dependent modification accounts for bile acids resistance in E. coli and is critically important for E. coli colonization in the host’s gut. LpxT constitutes a key critical control point in E. coli to resist different antimicrobial agents with opposite physical-chemical properties but which all target the LPS. In addition, we demonstrated that PmrR forms a stable complex with LpxT, but unexpectedly, this binding did not inhibit the phosphotransferase activity of the enzyme in vitro. We propose that PmrR inhibits LpxT activity in vivo by modulating its ability to interact with its protein partners that are involved in LPS biosynthesis. The biogenesis of cell wall polymers is essential for bacterial survival and structural changes in these components participate more or less specifically to the fitness and particular lifestyles of bacteria. The C55-PP phosphatases which participate actively in these processes therefore constitute interesting potential targets for new antibiotics design

Les membranes biologiques, qui compartimentent les différents éléments du vivant, jouent un rôle essentiel dans les processus biologiques comme la signalisation, le transport, la transmission du message nerveux, etc. Envisagées comme des fluides à deux dimensions, l’étude de leurs propriétés physiques peut nous aider à comprendre certains mécanismes biologiques. Ce travail de thèse s’est intéressé à la mobilité des molécules au sein des membranes, et notamment à deux paramètres essentiels, la viscosité membranaire, et la diffusion latérale. Après avoir optimisé la technique de recouvrement de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) au microscope confocal, nous avons étudié la mobilité des molécules au sein de deux types de membranes modèles in vitro : la phase éponge d’un surfactant non-ionique (C12E5) et les vésicules géantes unilamellaires (GUVs) lipidiques. 1) La phase éponge (ou L3) : après avoir déterminé son diagramme de phase et montré que les protéines membranaires restent actives dans cette phase, nous avons mesuré la mobilité de protéines par recouvrement de fluorescence après photoblanchiment sur un motif à franges (FRAPP). Cela nous a permis d’obtenir les constantes d’association de protéines de la pompe d’efflux OprM-MexAB, impliquée dans la résistance aux antibiotiques de la bactérie Pseudomonas aeruginosa. Ces interactions dépendent très fortement du degré de confinement de chacune des protéines. 2) Les GUVs : après avoir développé une méthode simple de formation des GUVs, au sein desquelles les protéines membranaires restent actives, nous avons mesuré la diffusion des lipides par FRAP, et montré que dans certaines conditions, ils se déplacent en groupe, ce qui permet d’expliquer la diversité des résultats de la littérature. En mesurant la viscosité membranaire par imagerie microscopique du temps de vie de fluorescence (FLIM), nous avons également montré qu’elle ne se déduit pas nécessairement des modèles hydrodynamiques de diffusion
Biological membranes, which divide the elements of life, are a key factor in biological processes such as signaling, transport, transmission of an nerve impulse, etc. Seen as two-dimensional fluids, the study of their physical properties could help us understand some unsolved biological mechanisms. This work focused on molecule mobility within membranes, and specifically on two essential parameters: membrane viscosity and lateral diffusion. After optimizing the Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) technique on confocal microscopes, we studied the mobility of molecules within two types of in vitro model membranes: the sponge phase made of a non-ionic surfactant (C12E5) and the giant unilamellar lipidic vesicles (GUVs). 1) Sponge phase (or L3) : after having established its phase diagram and shown that membrane proteins stay active in this phase, we measured protein mobility by Fluorescence Recovery After fringe Pattern Photobleaching (FRAPP). This allowed us to obtain the association constants of the proteins of the efflux pump OprM-MexAB involved in the resistance to antibiotics of the bacteria Pseudomonas aeruginosa. These interactions heavily depend on the degree of confinement of each protein. 2) GUVs : after having developed a simple method for the formation of GUVs, in which membrane proteins stay active, we measured the lipid diffusion by FRAP. We showed that, under certain conditions, they can move together, which explains the diversity of results in the literature. By measuring membrane viscosity by Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM), we also showed that viscosity should not be necessarily deduced from hydrodynamic diffusion models

Le recyclage de récepteurs et de lipides vers la membrane plasmique, est un processus finement régulé, essentiel pour l’homéostasie de la membrane plasmique et pour la migration cellulaire. Il requière l’intervention des petites GTPases de la famille Rabs et leurs effecteurs. La protéine MICAL-L1, effecteur de plusieurs Rabs, comme Rab 8, 11, 13 et 35, a été impliquée dans le recyclage vers la membrane plasmique. Dans cette étude, nous avons identifié une nouvelle interaction entre MICAL-L1 et la PACSINE3, une protéine à domaine F-BAR capable de façonner les membranes intracellulaires et qui contribue à la génération d’endosomes de recyclage tubulaires. MICAL-L1 est nécessaire pour la localisation de la PACSINE3 au niveau des membranes des endosomes. La perturbation du complexe MICAL-L1/PACSINE3 affecte le recyclage du récepteur de la transferrine (TfR) vers la membrane plasmique. Le complexe MICAL-L1/PACSINE3 est associé à des longs tubules membranaires contenant la transferrine comme cargo. La dynamique de ségrégation et de détachement des cargos Tf à partir des tubules contenant MICAL-L1 et PACSINE3, suggère que ce complexe contrôle le tri/adressage des endosomes de recyclage vers la membrane plasmique. Notre travail révèle un nouveau mécanisme de régulation de la voie de recyclage vers la surface cellulaire
The recycling to the plasma membrane of receptors and lipids is tightly regulated and is essential for PM homeostasis, adhesion and cell migration. It requires small GTPase Rab proteins and their effectors. The MICAL-L1 protein, an effector of several Rabs including Rab 8, 11, 13 and 35, has been shown to play an important role in the recycling. Here, we report a novel interaction between MICAL-L1 and the BAR domain containing protein PACSIN3/Syndapin3 that contributes to generate tubular recycling endosomes. MICAL-L1 is required for the localization of PACSIN3 to endosomal membranes. Importantly, disruption of MICAL-L1/PACSIN3 interaction promotes the transferrin receptor (TfR) delivery back to the plasma membrane. The MICAL-L1/PACSIN3 complex accumulates in elongated tubules that contain transferrin carriers. The dynamic of transferrin positive endosomes segregation from MICAL-L1/PACSIN3 tubules suggests that MICAL-L1/PACSIN3 complex controls TfR recycling endosomes delivery to the plasma membrane. Our data provide novel mechanistic insights on the dynamical regulation of the plasma membrane recycling pathway

La connaissance de la conformation membranaire d'un neuropeptide peut apporter des informations importantes sur le modele recepteur-peptide ainsi que sur la relation structure-activite. Nous avons utilise une technique de resonance magnetique nucleaire (rmn), le noe transfere (trnoe), qui nous permet de determiner la conformation de peptides dans des liposomes. Ces experiences ont ete effectuees en presence de liposomes perdeuteries. Pour cela, nous avons du mettre au point la synthese totale de differentes classes de phospholipides perdeuteries: la phosphatidylcholine, le phosphatidylglycerol, l'acide phosphatidique et la phosphatidylethanolamine. Les tachykinines, une famille de neuropeptides impliques dans un multitude d'effets physiologiques, ont ete choisies pour les etudes par rmn. Des agonistes specifiques de deux des recepteurs des tachykinines ont ete etudies en solution aqueuse et en presence de liposomes: la substance p et le senktide (analogue actif de la neurokinine b) pour les recepteurs nk-1 et nk-3 respectivement. L'utilisation de la rmn 2d a permis d'attribuer les spectres protons des peptides et de demontrer, qu'ils ne possedent aucune conformation preferentielle dans l'eau. Par contre, les deux peptides se structurent en presence de membranes. Les conformations membranaires de la substance p et du senktide ont pu etre determinees a partir des spectres trnoe en deux dimensions en combinaison avec des calculs de la geometrie de distances. Ces structures ont ete comparees avec des donnees de la litterature et nous avons discute leur signification biologique

Les CPP (Cell Penetrating Peptides) sont des peptides ayant des capacités de pénétration et de transport dans les cellules. Il s’agit de peptides constitués de moins de 30 acides aminés possédant généralement un caractère cationique en raison de la forte occurrence de résidus basiques et parfois amphipathique. Toutefois, cette internalisation s'effectue de manière non sélective quelle que soit la lignée cellulaire. On distingue deux grands mécanismes pour l’entrée des CPP dans les cellules : l’endocytose et la translocation. L’endocytose fait appel à la machinerie cellulaire tandis que la translocation implique une perturbation transitoire de la bicouche lipidique. Quelle que soit la voie d’entrée empruntée, le processus d'internalisation requiert toujours comme première étape une interaction avec des partenaires membranaires à la surface des cellules, à savoir des lipides et des glycosaminoglycanes (GAG). Cependant, le mécanisme d’internalisation des CPP fait l’objet de nombreux débats au sein de la communauté scientifique. L’objectif de ce travail de thèse a été de conférer des clés permettant de mieux appréhender le mécanisme d’internalisation. Il s’est agi dans un premier temps d’étudier l’implication des GAG dans le mécanisme d’internalisation. Pour étudier ce point, des peptides chimères constitués d’une séquence de reconnaissance d’un type de GAG et d’une séquence CPP ont été conçus. La quantification de l’internalisation a été réalisée dans différentes lignées cellulaires dont la composition en GAG ainsi que leur proportion à la surface varient très fortement. La contribution du Trp dans les interactions des CPP a également été étudiée. Pour étudier ce point, les trois résidus Trp de la séquence RW9 (RRWWRRWRR-NH2) ont été substitués par d’autres acides aminés ou par des analogues de Trp aux propriétés physico-chimiques variées. Enfin, le dernier axe de cette thèse s’est attaché au développement d’une nouvelle technique de quantification de l’internalisation des CPP localisés dans le cytosol à température physiologique, basée sur la complémentation de protéines luminescentes
CPPs (Cell Penetrating Peptides) are peptides with cell penetration and transport faculties. These peptides, containing less than 30 amino acids, are generally cationic due to the high occurrence of basic residues and sometimes amphipatic. However, this internalization is non-selective, whatever the cell line. There are two main mechanisms for CPPs uptake: endocytosis and translocation. Endocytosis relies on cellular machinery, while translocation involves transient disruption of the lipid bilayer. Whatever the route of entry, the first step in the internalization process is always an interaction with membrane partners on the cell surface, namely lipids and glycosaminoglycans (GAGs). However, the mechanism of CPP internalization is the subject of much debate in the scientific community. The aim of this thesis was to provide keys for a better understanding of the internalization mechanism. The first step was to study the involvement of GAGs in the internalization mechanism. To investigate this point, chimeric peptides containing a GAG recognition sequence and a CPP sequence were designed. Quantification of internalization was carried out in different cell lines with variations in GAG composition and proportion. The contribution of Trp to CPP interactions was also investigated. To do so, the three Trp residues in the RW9 sequence (RRWWRRWRR-NH2) were substituted by other amino acids or by Trp analogues with different physico-chemical properties. Finally, the last part of this thesis focused on the development of new techniques for cytosolic CPPs quantification at physiological temperature, based on the complementation of luminescent proteins

La toxine diphtérique (DT), agent responsable de la diphtérie, est une toxine produite par une bactérie, Corynebacterium diphtheriae. Elle est composée de trois domaines : un domaine catalytique (C), un domaine de translocation (T) et un domaine de liaison au récepteur (R). Après liaison à un récepteur cellulaire, la DT est internalisée par endocytose. Dans l’endosome, l’acidification du pH conduit à un changement de conformation du domaine T qui s'insère dans la membrane de l'endosome et participe à la translocation vers le cytosol du domaine catalytique, toxique pour la cellule. À pH acide, le domaine T adopte un état partiellement replié, caractéristique de l'état molten globule : maintien des structures secondaires, rupture des interactions tertiaires, et exposition au solvant de zones hydrophobes organisées. Cet état est compétent pour s'associer aux membranes. Nous avons montré qu’à mesure que le pH décroît, la protonation d’histidines déclenche la formation de l’état molten globule et la liaison à la membrane. De pH 7 à pH 4, des interactions hydrophobes puis électrostatiques sont séquentiellement requises entre le domaine T et la membrane pour aboutir à un état inséré et fonctionnel. Ces deux types d’interactions impliquent des régions distinctes. La première étape correspond à la liaison du domaine T aux membranes par interactions hydrophobes. L’acidification progressive du milieu conduit dans une seconde étape à une réorganisation structurale du domaine T, contrôlée par une balance d'interactions électrostatiques attractives et répulsives entre les hélices N-terminales amphiphiles et la membrane. Cette étape aboutit à l’acquisition d’une structure insérée, compétente pour transloquer le domaine catalytique dans le cytosol de la cellule. Nous utilisons le domaine T comme une ancre membranaire afin d’accrocher des protéines solubles à la surface de cellules. Cette technique permet de modifier leur surface, et ainsi de manipuler leurs fonctions de signalisation, de liaison, de reconnaissance ou de stimulation. Une des applications possibles est la conception de vaccins contre le cancer. Nous avons donc fusionné une cytokine, le Flt3-Ligand, en position N-terminale du domaine T. Nous montrons que cette technique permet de moduler la communication entre cellules, notamment par des contacts directs entre les cellules porteuses de la cytokine et les cellules cibles portant le récepteur correspondant
The diphtheria toxin (DT), secreted by Corynebacterium diphtheriae, is a protein responsible for the major symptoms of diphtheria. The toxin is organized in three specialized domains: a catalytic domain, a translocation domain and a receptor binding domain. During the intoxication of a cell, the diphtheria toxin binds to a cell surface receptor, is internalized and reaches the endosome. The translocation domain (T) from the toxin interacts with the membrane of the endosome in response to the acidic pH found in this compartment. This process drives then the passage of the catalytic domain of the toxin in the cytoplasm. At acidic pH, the T domain undergoes a conformational change and adopts a partially folded state with characteristics of a molten globule state: it preserves native-like helices, looses tight packing of side chains and exposes hydrophobic clusters to the solvent. This state is competent for membrane interaction. We have found that, as the pH decreases, protonation of histidines was required for the formation of this molten globule state and membrane interaction. The interaction of the T domain with the membrane involves at least two steps. Firstly, the binding at the membrane surface involves hydrophobic interactions of the C-terminal region. Secondly, penetration into the membrane correlates with the reorganization of the N-terminal region in the membrane and is mainly driven by electrostatic interactions. This step leads to a functional inserted state. We used the T domain as a protein membrane anchor for soluble proteins. Attaching proteins to the surface of cells may have applications in biotechnology and cell engineering. Modifying cell surface should allow changing cell signalling, cell adhesion, cell recognition or cell stimulation. One application is the design of anti-cancer vaccines by attachment of cytokines. We have fused the Flt3-ligand to the N-terminus of T domain. We show that this method allows us to modify cell growth by direct contacts between cells

Les membranes cellulaires sont des systèmes complexes composés de lipides variés qui interagissent avec les protéines pour accomplir une fonction. Leur adressage spécifique dans la cellule est crucial pour le fonctionnement cellulaire. Les vésicules COP (coat protein) sont impliquées dans leur transport dans les premières étapes de la voie de sécrétion. Récemment, une interaction très spécifique a été identifiée entre le domaine transmembranaire de la protéine p24 (p24TMD) abondante dans la membrane des vésicules COP et la sphingomyéline C18:0. Cette spécificité a été identifiée dans le cas d’interaction protéine-protéine et protéine-acide nucléique comme impliquée dans la régulation de fonctions cellulaires, C’est pourquoi nous avons décidé d'étudier sur cette interaction. A cet effet, le p24TMD a été obtenu par synthèse chimique et sa structure étudiée par RMN du solide en présence de la sphingomyèline avec pour but ultime de comprendre la fonction
Cell membranes are complex systems composed of variety of lipids that interacts with proteins to trigger cellular function. The delivery of these lipids to the right compartment is crucial for cells to work efficiently. The coat protein (COP) complex vesicles are involved in lipids traffic in the early stages of the secretory pathway. Recently, a highly specific interaction has been found between the transmembrane domain of p24 protein (p24TMD) abundant in COPI membrane and sphingomyelin C18:0. As such highly specific interaction have been reported for protein-protein and protein-nucleic acid interactions to be involved in regulation of cell functions, we decide to investigate this specific interaction. The p24TMD was obtained chemically and investigated by solid state NMR in presence of sphingomyelin with the ultimately goal to understand the function behind

La phospholipase D (PLD) est une enzyme qui catalyse l'hydrolyse des phospholipides, elle participe ainsi au remodelage des membranes biologiques. Deux protocoles de mesure de l'activité PLD de Streptomyces chromofuscus ont été mis au point. L'une est basé sur l'utilisation d'un substrat chromogène hydrosoluble : le bis(paranitrophényl)phosphate. Ce substrat a permis de distinguer les facteurs influençant l'activité enzymatique et ceux permettant la localisation de la PLD à la surface des membranes phospholipidiques. L'autre protocole de dosage de l'activité PLD que nous avons développé est basé sur l'utilisation des monocouches de Langmuir. Cette technique permet de déterminer les propriétés physique des membranes lipidiques. Ainsi, nous avons mis en évidence un lien entre l'activité PLD et la rhéologie de la membrane phospholipidique constituant son substrat naturel. Cette technique a aussi permis de définir les propriétés interfaciales de cette enzyme. Ces protocoles ont été mis au point afin de proposer des outils d'analyse de l'activité de PLD plus complexes comme celles de mammifère. Dans la deuxième partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à une activité PLD PIP2- dépendante de cellule eucaryote. Les enzymes responsables de cette activité ne sont pas faciles à purifier et présentent des régulations très fines et complexes. De plus, la membrane plasmique des cellules eucaryotes possède des microdomaines lipidiques dont la composition et les propriétés physiques sont particulières. Nous avons alors recherché une activité PLD PIP2-dépendante au sein des microdomaines préparés à partir de cerveau de porc. Cette activité enzymatique est fortement impliquée dans la signalisation lipidique, sa localisation au sein de ces structures pourrait être liée à sa régulation. Les résultats obtenus ont soulevé plusieurs interrogations sur la signification d'un enrichissement en activité PLD PIP2-dépendante dans les microdomaines