Tesi sul tema "Incorporation de protéines membranaires"
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Coutable, Angelique. "Incorporation de protéines membranaires produites par un système d'expression protéique acellulaire dans des bicouches lipidiques planes". Thesis, Toulouse, INSA, 2014. http://www.theses.fr/2014ISAT0042/document.
Abstract (sommario):
Les protéines membranaires intégrales jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’intégrité cellulaire (transports d’ions et de nutriments, transduction de signal, interaction cellule-cellule). Afin de les étudier, ces protéines doivent être produites in vitro. La production classique de ces protéines membranaires intégrales dans des microorganismes présente de nombreuses difficultés liées à leur structure complexe mais aussi à des problèmes de toxicité, empêchant la production de nombre d’entre elles. En outre, pour être produites efficacement, ces protéines ont besoin d’un environnement amphiphile. Dans cette thèse, afin de pallier à ces difficultés, nous avons d’une part utilisé un système d’expression protéique acellulaire, non affecté par la physiologie des cellules vivantes. En outre, nous avons choisi de les intégrer dans des bicouches lipidiques planes reconstituées artificiellement. Dans une première partie, nous avons mis au point l’intégration d’une protéine membranaire intégrale formant un pore, l’alpha hémolysine, dans une bicouche lipidique supportée. Certaines protéines nécessitant un espace plus important de part etd’autre de la membrane, nous avons, dans une seconde partie, développé une bicouche lipidique espacée et ancrée par fusion de liposomes sur des surfaces d’or. Nous démontrons qu’il est possible d’y incorporer des protéines membranaires de type Aquaporine Z sous certaines conditions. Dans une troisième partie, dédiée à la formation de membranes biomimétiques utilisant des molécules lipidiques provenant d’Escherichia coli, nous montrons que la modification de la composition membranaire ne semble pas avoir d’incidence sur l’incorporation de protéines. Enfin, dans une dernière partie, nous avons réalisé des premiers essais d’insertion de protéines membranaires, de type alpha hémolysine, dans des bicouches suspendues afin de montrer que ces protéines produites par le système d’expression acellulaire sont fonctionnellesIntegral membrane proteins play an essential role in the cell integrity preservation (transport of nutrients and ions, signal transduction, cell-cell interaction). In order to study these proteins, they have to be produced in vitro. Classical production of integral membrane proteins in microorganisms present many difficulties associated with their complex structure and also toxicity problems, preventing production of many of them. Moreover, to be efficiently produced, these proteins require an amphiphilic environment. In order to overcome these difficulties, we used a cell-free protein expression system, unaffected by the physiology ofliving cells. In addition, we chose to integrate them into artificial planar lipid bilayers. In a first part, we have developed the integration of an integral membrane protein forming a pore, the alpha hemolysin, in a supported lipid bilayer. Some proteins require more space on each side of the membrane, therefore in a second part, we have developed a tethered lipid bilayer membrane by liposome fusion on gold surfaces. We demonstrate that it is possible to incorporate membrane protein Aquaporin Z under certain conditions. The third part is dedicated to the formation of biomimetic membranes using lipid molecules from Escherichiacoli, we show that the membrane composition do not affect the protein incorporation. Finally, we have tested alpha hemolysin membrane proteins insertion in suspended lipid bilayers membranes to show that these proteins produced by the cell-free expression system are functional
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Kazanji, Mirdad. "Étude de la protéine majeure de surface des sporozoïtes d'"Eimeria falciformis" : purification à l'aide d'anticorps monoclonaux, caractérisation immunologique et biochimique : induction d'une protection par voie orale après incorporation dans des ISCOMs". Paris 12, 1993. http://www.theses.fr/1993PA120025.
Abstract (sommario):
Des anticorps monoclonaux (acmo) ont ete obtenus par immunisation de souris avec des broyats de sporozoites d'e. Falciformis. Comme un nombre important d'entre eux reconnaissaient une proteine de masse molaire 27kda a la surface du sporozoite, cette proteine a ete appelee proteine majeure de surface du sporozoite d'e. Falciformis (p27). Cette proteine a ete purifiee par immunoaffinite a l'aide d'un des anticorps monoclonaux (d14. 5) et d'autres acmo ont ete obtenus contre la molecule purifiee. L'etude de la reconnaissance de la p27 par les differents acmo en elisa competitifs ou dans le systeme biacore a permis la definition sur la molecule de deux epitopes distincts dont l'un est vraisemblablement repetitif. Les deux epitopes retrouves sur la proteine p27 sont des epitopes communs a des proteines de masse molaire 25kda des deux especes de coccidies de poule, e. Tenella et e. Acervulina. Dans les trois types de sporozoites, ces epitopes sont retrouves a la surface des sporozoites, mais aussi dans les globules refringents. Cette proteine qui possede une activite esterase-lipase et qui est ancree dans la membrane par une ancre gpi est capable de stimuler la transformation lymphoblastique de cellules de ganglions mesenteriques provenant d'animaux infectes. Elle est de plus la cible de reactions de lyse de sporozoites par les phagocytes. Par la suite cette proteine a donc ete utilisee pour declencher une immunite intestinale en incorporant l'antigene dans des iscoms et en l'administrant par voie orale. La proteine administree ainsi induit d'une part une immunite locale (humorale et cellulaire). Elle induit d'autre part l'acquisition par les souris d'une protection contre une infection ulterieure contre le parasite
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Tian, Meilin. "Structure-function studies of membrane proteins by site-specific incorporation of unnatural amino acids". Thesis, Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066166.
Abstract (sommario):
Les protéines membranaires comme les récepteurs, les canaux ioniques et les transporteurs possèdent des rôles cruciaux dans les processus biologiques tels que la signalisation physiologique et les fonctions cellulaires. La description dynamique et fonctionnelle des structures protéiques est fondamentale pour comprendre la plupart des processus concernant les macromolécules biologiques. L'incorporation, dans des protéines, d'acides aminés non naturels (Uaas) possédant des propriétés physiques ou chimiques spécifiques fournit un puissant outil pour définir la structure et la dynamique de protéines complexes. Ces sondes permettent le suivi et la détection en temps réel de la conformation des récepteurs et des complexes de signalisation. Les approches d'expansion du code génétique ont permis l'incorporation d'Uaas servant de sondes dans des protéines avec une précision moléculaire. L'expansion héréditaire du code génétique peut permettre d'étudier la biologie des protéines de manière systémique.Avec cette stratégie, des Uaas capables de photopontage ont été utilisés pour étudier la relation structure/fonction des Protéines G Couplées aux Récepteurs (GPCR), telles que l'identification de la liaison du ligand ou des interactions protéine-protéine, en détectant les changements dynamiques avec les Uaas spectroscopiques et l'étiquetage bioorthogonal. Sur la base d'applications relativement bien établies d'Uaa dans les GPCR, ici, les analyses fonctionnelles sont combinées à l'incorporation génétique d'un Uaa photosensible spécifique au site, p-azido-L-phénylalanine (AzF) dans d'autres protéines membranaires, pour détecter la protéine, les changements conformationnels et les interactions protéiques. Contrairement à d’autres molécules photosensibles qui permettent aux protéines de répondre à la lumière, l'insertion des Uaas directement dans la chaine d’acides aminés offre des possibilités uniques pour le photo-contrôle de la protéine. Les aspects dynamiques de l'allostérie sont plus difficiles à visualiser que les modèles structuraux statiques. Une stratégie photochimique est présentée pour caractériser la dynamique des mécanismes allostériques des récepteurs NMDA neuronaux (NMDAR). Ces récepteurs appartiennent à la famille des canaux ioniques activés par le glutamate et portent la transmission synaptique excitatrice rapide associée à l'apprentissage et à la mémoire. En combinant le balayage AzF et un test fonctionnel résistant à la lumière, nous avons pu apporter des éléments permettant de mieux comprendre la dynamique des interfaces NTD (N-Terminal Domain des NMDAR) ainsi qu’un nouveau mécanisme de régulation allostérique, améliorant notre compréhension de la base structurale du mécanisme d’activation et de modulation des récepteurs NMDA.Outre l'incorporation de l’Uaa photopontant AzF dans les récepteurs neuronaux pour détecter l'effet fonctionnel, AzF a été appliqué pour piéger des interactions faibles et transitoires entre protéines dans un transporteur d'acides aminés LAT3, impliqué dans le cancer de la prostate. Les techniques de dépistage ont été établies en appliquant un photo-cross-linker positionné dans la protéine pour examiner les interactions entre LAT3 et les interacteurs inconnus et fournir des indices d'identification des partenaires de liaison.Dans l'ensemble, ce travail dévoile de nouvelles informations sur la modulation allostérique de l'activité du récepteur NMDA et sur les interactions protéines-protéines.. Les résultats pourraient fournir de nouvelles informations structurales et fonctionnelles et guider le dépistage de composés thérapeutiques pour des maladies associées au dysfonctionnement de ces protéines membranairesMembrane proteins including receptors, channels and transporters play crucial roles in biological processes such as physiological signaling and cellular functions. Description of dynamic structures and functions of proteins is fundamental to understand most processes involving biological macromolecules. The incorporation of unnatural amino acids (Uaas) containing distinct physical or chemical properties into proteins provides a powerful tool to define the challenging protein structure and dynamics. These probes allow monitoring and real-time detection of receptor conformational changes and signaling complexes. The genetic code expansion approaches have enabled the incorporation of Uaas serving as probes into proteins with molecular precision. Heritable expansion of the genetic code may allow protein biology to be investigated in a system-wide manner.With this strategy, photocrosslinking Uaas have been used to study GPCR structure/function relationship, such as identifying GPCR-ligand binding or protein-protein interactions, detecting dynamic changes with spectroscopic Uaas and bioorthogonal labeling. Based on relatively well-established applications of Uaa in GPCRs, here, functional assays are combined with the site-specific genetic incorporation of a photo-sensitive Uaa, p-azido-L-phenylalanine (AzF) into other membrane proteins, to probe protein conformational changes and protein interactions. Unlike photo-sensitive ligands that enable proteins in response to light, the site-specific insertion of light-sensitive Uaas facilitates directly light-sensitive proteins. Dynamic aspects of allostery are more challenging to visualize than static structural models. A photochemical strategy was presented to characterize dynamic allostery of neuronal NMDA receptors (NMDARs), which belong to the ionotropic glutamate receptor channel family and mediate the fast excitatory synaptic transmission associated with learning and memory. By combining AzF scanning and a robust light-induced functional assay the dynamics of NMDAR N-terminal domain (NTD) interfaces and novel allosteric regulation mechanism were uncovered, improving our understanding of the structural basis of NMDAR gating and modulation mechanism.Besides incorporation of photo-cross-linker AzF into neuronal receptors to detect the functional effect, AzF was used to trap transient and weak protein-protein interactions in an amino acid transporter LAT3, which is critical in prostate cancer. Screening technique was established by applying genetically encoded photo-cross-linker to examine interactions between LAT3 and unknown interactors and provide clues to identify the binding partners.Overall, the work reveals new informations about the allosteric modulation of channel activity and proteins interactions. These light-sensitive proteins facilitated by site-specific insertion of light-sensitive Uaas enable profiling diversity of proteins. The results will provide novel structural and functional information and may guide screening of therapeutic compounds for diseases associated with malfunctioning of these membrane proteins
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Lanrezac, André. "Interprétation de données expérimentales par simulation et visualisation moléculaire interactive". Electronic Thesis or Diss., Université Paris Cité, 2023. http://www.theses.fr/2023UNIP7133.
Abstract (sommario):
L'objectif de l'approche des simulations moléculaires interactive (Interactive Molecular Simulations - IMS) est d'observer en direct la dynamique conformationnelle d'une simulation moléculaire en cours. Le retour visuel instantané permet un suivi instructif ainsi que l'observation des changements structurels imposés par la manipulation de l'IMS par l'utilisateur. J'ai mené une étude approfondie des connaissances pour rassembler et synthétiser l'ensemble des recherches qui ont développé l'IMS. La dynamique moléculaire interactive (Interactive Molecular Dynamics - IMD) est l'un des premiers protocoles IMS qui a posé les bases du développement de cette approche. Mon laboratoire de thèse s'est inspirée de celle-ci pour développer le moteur de simulation BioSpring basé sur le modèle de réseaux élastique. Ce modèle permet de simuler la flexibilité de grands ensembles biomoléculaires et ainsi potentiellement révéler des changements à longue échelle de temps qui ne seraient pas facilement saisis par la dynamique moléculaire. Ce moteur de simulation ainsi que le logiciel de visualisation UnityMol, développé par le biais du moteur de jeu Unity3D, et liés par l'interface de communication MDDriver ont été étendus pour les faire converger vers une suite logicielle complète. Le but est de fournir à un expérimentateur, qu'il soit expert ou profane, une boîte à outils complète pour modéliser, afficher et contrôler interactivement l'ensemble des paramètres d'une simulation. L'implémentation particulière d'un tel protocole, basé sur une communication formalisée et extensible entre les différents composants, a été pensée pour pouvoir facilement intégrer de nouvelles possibilités de manipulation interactive et des jeux de données expérimentales qui s'ajouteront aux contraintes imposées à la simulation. L'utilisateur peut donc manipuler la molécule d'intérêt sous le contrôle des propriétés biophysiques intégrés dans le modèle simulé, tout en ayant la possibilité de piloter à la volée les paramètres de simulation. Aussi, un des objectifs initiaux de cette thèse était d'intégrer la gestion des contraintes d'interaction ambigües du logiciel d'amarrage biomoléculaire HADDOCK directement dans UnityMol, rendant possible l'utilisation de ces mêmes contraintes à une variété de moteurs de simulations. Un axe principal de ces recherches était de développer un algorithme de positionnement rapide et interactif de protéines dans des membranes implicite tiré d'un modèle appelé Integrative Membrane Protein and Lipid Association Method (IMPALA) développée par l'équipe de Robert Brasseur en 1998. La première étape consistait à effectuer une recherche approfondie des conditions dans lesquelles les expériences ont été réalisées à l'époque, afin de vérifier la méthode et de valider notre propre implémentation. Nous verrons qu'elle ouvre des questions intéressantes sur la manière dont on peut reproduire les expériences scientifiques. L'étape finale qui conclue cette thèse était le développement d'une nouvelle méthode universelle d'interaction lipide-protéine, UNILIPID, qui est un modèle d'incorporation interactif de protéines dans les membranes implicites. Elle est indépendante de l'échelle de représentation, peut être appliquée à des niveaux tout atomes, gros-grains jusqu'au niveau d'un grain par acide aminé. La représentation de la dernière version Martini3[6] ainsi qu'une méthode d'échantillonnage Monte-Carlo et de simulation de dynamique des corps rigides ont été spécialement intégrés à la méthode, en plus de divers outils de préparation de systèmes. En outre, UNILIPID est une approche versatile qui reproduit précisément des termes d'hydrophobicité expérimentaux pour chaque acide aminé. En plus de membranes implicites simples, je décrirai une implémentation analytique de membranes doubles ainsi qu'une généralisation à des membranes de forme arbitraire, toutes deux s'appuyant sur des applications inéditesThe goal of Interactive Molecular Simulations (IMS) is to observe the conformational dynamics of a molecular simulation in real-time. Instant visual feedback enables informative monitoring and observation of structural changes imposed by the user's manipulation of the IMS. I conducted an in-depth study of knowledge to gather and synthesize all the research that has developed IMS. Interactive Molecular Dynamics (IMD) is one of the first IMS protocols that laid the foundation for the development of this approach. My thesis laboratory was inspired by IMD to develop the BioSpring simulation engine based on the elastic network model. This model allows for the simulation of the flexibility of large biomolecular ensembles, potentially revealing long-timescale changes that would not be easily captured by molecular dynamics. This simulation engine, along with the UnityMol visualization software, developed through the Unity3D game engine, and linked by the MDDriver communication interface, has been extended to converge towards a complete software suite. The goal is to provide an experimenter, whether an expert or novice, with a complete toolbox for modeling, displaying, and interactively controlling all parameters of a simulation. The particular implementation of such a protocol, based on formalized and extensible communication between the different components, was designed to easily integrate new possibilities for interactive manipulation and sets of experimental data that will be added to the restraints imposed on the simulation. Therefore, the user can manipulate the molecule of interest under the control of biophysical properties integrated into the simulated model, while also having the ability to dynamically adjust simulation parameters. Furthermore, one of the initial objectives of this thesis was to integrate the management of ambiguous interaction constraints from the HADDOCK biomolecular docking software directly into UnityMol, making it possible to use these same restraints with a variety of simulation engines. A primary focus of this research was to develop a fast and interactive protein positioning algorithm in implicit membranes using a model called the Integrative Membrane Protein and Lipid Association Method (IMPALA), developed by Robert Brasseur's team in 1998. The first step was to conduct an in-depth search of the conditions under which the experiments were performed at the time to verify the method and validate our own implementation. We will see that this opens up interesting questions about how scientific experiments can be reproduced. The final step that concluded this thesis was the development of a new universal lipid-protein interaction method, UNILIPID, which is an interactive protein incorporation model in implicit membranes. It is independent of the representation scale and can be applied at the all-atom, coarse-grain, or grain-by-grain level. The latest Martini3 representation, as well as a Monte Carlo sampling method and rigid body dynamics simulation, have been specially integrated into the method, in addition to various system preparation tools. Furthermore, UNILIPID is a versatile approach that precisely reproduces experimental hydrophobicity terms for each amino acid. In addition to simple implicit membranes, I will describe an analytical implementation of double membranes as well as a generalization to arbitrarily shaped membranes, both of which rely on novel applications
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Sénicourt, Lucile. "Etudes des protéines membranaires TSPO". Thesis, Paris 6, 2016. http://www.theses.fr/2016PA066308/document.
Abstract (sommario):
Les TSPO forment une famille ancienne et hautement conservée à travers l’évolution de protéines à 5 domaines transmembranaires, que l’on retrouve aussi bien chez les animaux que les plantes, ou encore les bactéries. La TSPO animale (ou TSPO1), la plus étudiée des TSPO à ce jour, se trouve majoritairement dans les tissus stéroïdiens où sa fonction précise est controversée. Chez certaines espèces animales, il existe une isoforme, la TSPO2, localisée dans la membrane plasmique des globules rouges alors que la TSPO1 est mitochondriale. La fonction de la TSPO2 n’est pas bien caractérisée. La TSPO végétale, localisée dans le réticulum endoplasmique, possède une extension N-terminale que n’ont pas les TSPO animale et bactérienne. Elle semble être impliquée dans la régulation du stress, tout comme la TSPO bactérienne. Les études structure/fonction des différentes TSPO réalisées dans ce travail ont nécessité leur production par voie recombinante car elles sont naturellement peu abondantes.Nous avons produit la TSPO1 murine marquée 15N,13C par surexpression dans la bactérie E. coli. Puis la protéine purifiée en détergent (SDS et DPC) a été étudiée par différentes techniques (CD, fluorescence, RMN). L’ajout du ligand spécifique de la TSPO1, le PK11195, stabilise une conformation en DPC ce qui a permis en 2014 la résolution de sa structure, par RMN du liquide, par une équipe allemande. Afin d’étudier la TSPO1 dans un environnement plus proche de sa membrane native, nous l’avons reconstituée dans des liposomes DMPC/DMPE et étudiée par RMN du solide. Les 1ers résultats sont encourageants et ouvrent une nouvelle approche expérimentale pour la détermination de sa structure en présence et, plus particulièrement, en absence de ligand. La surexpression de la TSPO2 humaine dans la bactérie E. coli s’est avérée difficile et nous avons dû la réalisée par système acellulaire (cell-free). Les quantités obtenues par cette méthode permettent d’envisager le développement futur des études des relations structure/fonction.La production et la purification du Nter de la TSPO d’A. thaliana marqué 15N,13C ont permis la détermination de sa structure par RMN du liquide. Son interaction avec des lipides chargés mise en évidence par les études RMN, suggère une nouvelle fonction de l’AtTSPO dans le trafic lipidiqueTSPO are five-transmembrane domain proteins that form a protein family highly conserved throughout evolution and that are found in animals as well as in plants and bacteria.Animal TSPO (referred to as TSPO1), the most studied TSPO, is highly expressed in tissues involved in steroid biosynthesis where its precise role remains controversial. In some animal species the presence of a less characterized TSPO isoform, TSPO2, has been reported. TSPO2 was found to be located in the plasma membrane of red blood cells whereas TSPO1 is located in mitochondrial outer membrane. Plant TSPO, which is located in the endoplasmic reticulum, possesses an N-terminal extension that is absent in bacterial and animal TSPO. This TSPO, along with the bacterial TSPO, seems to be involved in stress regulation.The structural and functional studies of TSPO proteins conducted in this work required their production through recombinant expression because they are naturally non-abundant proteins.We made use of E. coli to produce the recombinant 15N,13C-labelled mouse TSPO1. Then the protein purified in detergent was studied through several methods (CD, fluorescence, NMR). High-affinity binding of PK11195 to TSPO1 stabilizes a conformation in DPC, which made possible the structure determination of the protein in solution by NMR by a German team. We have incorporated TSPO1 into DMPC/DPME liposomes in order to provide a native-like environment and we then studied it by solid-state NMR. Preliminary results are encouraging and open up a new approach for TSPO1 structure determination in presence or in absence of ligand.Human TSPO2 overexpression in E. coli proved to be difficult and we therefore use the cell-free method. The amounts we obtained by this method allows us to consider future developments of structurefunction relationship studies.Production and purification of 13C,15N labelled N-terminal of A. thaliana TSPO have made it possible to determine its structure by liquid state NMR. Interaction of this peptide with charged lipids revealed by NMR, suggests a new fonction of AtTSPO in lipid trafficking
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Vernhet, Laurent. "Incorporations comparées de l'acide arachidonique, de l'acide 12 (s)-hydroxyeïcosatetraenoïque, 15 (s)-hydroxyeïcosatetraenoïque et de l'acide eïcosapentaenoïque dans les phospholipides membranaires des cellules épitheliales hépatiques non-transformées et spontanement transformées : effets sur les signaux impliquant des phospholipases et sur la croissance cellulaire". Rennes 1, 1995. http://www.theses.fr/1995REN1B034.
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Sidore, Marlon. "Etude de l'énergétique de l'assemblage des protéines membranaires". Thesis, Aix-Marseille, 2018. http://www.theses.fr/2018AIXM0547/document.
Abstract (sommario):
Les protéines membranaires occupent en moyenne 50% de la masse des membranes cellulaires. Cependant, certaines membranes spécialisées peuvent avoir de 20 à 90% de leur masse en protéines. Dans ce cadre, l'importance de l'assemblage des protéines membranaires dans des complexes cohérents, dynamiques et fonctionnels n'est plus à démontrer.Mon projet s'inscrit dans la compréhension des forces qui mènent à l'assemblage des protéines membranaires. J'utilise pour cela le modèle de l'Aquaporine Z (AqpZ) d'Escherichia coli. En premier lieu, j'ai mis en oeuvre une approche de dynamique moléculaire gros grains avec des forces de biais adaptatifs pour étudier les relations entre orientations de deux monomères d'AqpZ. Il existe, de façon surprenante, des forces se propageant à longue distance vraisemblablement par les lipides qui biaisent les orientations relatives entre les protéines.Un deuxième axe de mon travail est l'étude des enrichissements lipidiques autour de l'AqpZ native ou mutée, à différentes distances, avec l'utilisation d'une membrane complexe rendant compte de la diversité lipidique de la membrane interne d'E.coli. Dans cette analyse, la cardiolipine est enrichie à proximité de la protéine. Enfin, j'ai construit un système contenant 125 monomères d'AqpZ dans une membranes simple ou complexe, qui représentent 50% en masse en protéines. Ce système m'a permis de questionner l'évolution spontanée d'un tel système encombré, mais aussi le devenir des forces à longue distance et des lipides enrichis à la surface de la protéine dans ce contexteMembrane proteins represent on average 50% of the mass of cellular membranes. However, specialized membranes can have from 20 to 90% of their mass in proteins. In this context, the importance of the assembly of membrane proteins in coherent, dynamic and functional complexes isn't to be proven anymore. The goal of my project is to understand the different forces that lead to the assembly of membrane proteins. For this aim, I am using the Aquaporin Z (AqpZ) model protein from Escherichia coli, which is studied in our laboratory. First, I use a coarsed grain molecular dynamics approach with adaptive biasing forces to study the relations between orientations of two AqpZ monomers. Surprisingly, there are forces propagating at long distance, presumably by the lipids which in turn bias the relative orientations between the proteins. The second axis of my work is the study of lipid enrichments around native or mutated AqpZ, at different distances, with the use of a complex membrane accounting for the lipid diversity of the inner membrane of E.coli. In this analysis, cardiolipin is enriched near the protein. Finally, I built a system containing 125 AqpZ monomers in a simple or complex membrane, which represents 50% protein by weight. This system allowed me to examine the spontaneous evolution of such a crowded system, but also to investigate the fate of the long distance forces and the lipid enrichments at the protein surface in this context
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Dancourt, Julia. "La voie de biosynthèse de l'oligosaccharide lié au dolichol : caractérisation moléculaire de pathologies associées et stratégies d'identification de nouvelles protéines impliquées". Paris 5, 2005. http://www.theses.fr/2005PA05N27S.
Abstract (sommario):
La N-glycosylation est la modification secondaire majoritaire des protéines membranaires et secrétées. Elle débute par l'assemblage d'un oligosaccharide lié au dolichol (OLD) précurseur sur la membrane du réticulum endoplasmique. Certaines déficiences dans la voie de biosynthèse de l'OLD sont associées à un groupe de pathologies appelé "congénital disorders of glycosylation" (CDGs) de type I. Les CDGs I, dont 12 sous-types sont connus à ce jour, sont des maladies autosomiques récessives rares se manifestant par des atteintes multisystémiques sévères. Ce rapport expose le diagnostic moléculaire de deux nouveaux cas de CDG I, dont un représente la description princeps du CDG Ih. L'étude des CDG I amène de nombreuses questions à propos de la compréhension globale du phénomène de N-glycosylation. Ce rapport présente donc aussi un aspect plus fondamental : la découverte d'une nouvelle glycosyltransférase de la voie de biosynthèse de l'OLD ; ALG13/ALG14, ainsi que la synthèse d'une sonde d'affinité pour l'identification d'un transporteur impliqué dans le métabolisme des oligosaccharides libres, permettront. .N-glycosylation is the major modification of membrane and secretory proteins. It starts by the assembly of a dolichol-linked oligosaccharide (DLO) on the endoplasmic reticulum membrane. Deficiencies of the DLO biosynthetic pathway are associated with a group of diseases called type I "congenital disorders of glycosylation" (CDGs I), of which 12 subtypes are descibed so far. They are rare autosomic recessive diseases, characterized by severe multisystemic symptoms. This thesis reports the molecular diagnosis of two new CDG I cases, one of which comprises the first CDG Ih description. The study of CDG I raises several questions concerning the general understanding of N-glycosylation. With this in mind, this thesis deals with more fundamental aspects of this the pathway as it details the discovery of a new glycosyltransferase involved in DLO biosynthesis.
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Touret, Nicolas. "Etude des relations structure-fonction de l'échangeur Na+ / H+ (NHE-1)". Nice, 2001. http://www.theses.fr/2001NICE5614.
Abstract (sommario):
L'isoforme 1 de l'échangeur Na+/H+, qui est exprimée de façon ubiquitaire dans l'organisme, fait partie d'une famille de protéines membranaires qui catalyse, grâce au gradient électrochimique du sodium, l'échange électroneutre d'un proton intracellulaire contre un sodium extracellulaire. Cette protéine est impliquée dans la régulation du pH intracellulaire et du volume cellulaire, mais est aussi responsable de certaines situations pathologiques. Ce transporteur est constitué de deux domaines fonctionnels distincts sur lesquels mes travaux de thèse ont été menés. Le domaine en N-terminal, correspondant à la région transmembranaire de l'échangeur, est suffisant pour catalyser l'échange des cations. L'utilisation de techniques de sélection génétique, basées sur la résistance de cellules à des acidifications intracellulaires, nous a permis d'isoler des clones cellulaires exprimant des formes mutées de cette protéine. Nous avons mis en évidence le rôle important de plusieurs résidus, dans le quatrième segment transmembranaire, engagés dans le site de fixation du sodium. La seconde partie de mon travail concerne le domaine cytoplasmique de l'échangeur qui est impliqué dans la régulation de son activité par des cascades de signalisation. La surexpression de ce domaine cytoplasmique atténue l'activation de l'échangeur Na+/H+ et d'un canal chlorure par les facteurs de croissance. Cette inhibition semble également provoquer un retard dans l'induction du cycle cellulaire par ces facteurs mitogéniques. Cette protéine serait un outil biochimique intéressant pour caractériser ces voies de signalisation et identifier leurs cibles.
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Melnikov, Igor. "Méthodes de diffraction pour la cristallographie des protéines membranaires". Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2017. http://www.theses.fr/2017GREAV041/document.
Abstract (sommario):
Dans cette étude, les aspects méthodologiques pour la production de structures cristallines à haute résolution des protéines membranaires ont été combinés et rapportés ici, ainsi que leur implication pour le cas biologique concret d'étude structurale des principes de fonctionnement de l'histidine kinase transmembranaire.Dans la cristallographie de rayons X, les échantillons de cristaux de protéines varient selon les tailles, les formes et les capacités de diffraction. Pour pouvoir collecter les données de diffraction de la manière la plus efficace, l'échantillon de cristaux doit être correctement caractérisé dans chaque cas particulier. L'analyse raster par rayons X est considérée comme la technique la plus viable pour le faire et dans ce contexte, une méthode d'analyse des échantillons de cristaux pour la cristallographie des protéines est présentée ici, qui est basée sur la technique de balayage des mailles par rayons X développée à l'ESRF. La méthode estime les positions, les tailles et la qualité de la diffraction de chaque cristal dans la zone scannée qui pourrait être plus utile pour la conception rationnelle du processus de collecte de données. La performance de la méthode est démontrée sur plusieurs échantillons de cristaux de protéines.Un autre goulot d'étranglement dans la production des structures cristallines des protéines est un problème de phase communément connu. Les techniques les plus répandues pour traiter la structure qui ne peut pas être résolue avec le remplacement moléculaire sont les techniques de mise en phase expérimentales basées sur SAD ou MAD. Cela implique l'incorporation de divers diffuseurs anormaux à la structure cristalline. Dans la liste des diffuseurs disponibles, les halogénures se distinguent surtout principalement par leur faible toxicité et leur facilité de manipulation, mais en même temps leur capacité à produire un signal anormal. Le protocole de cryo-trempage des cristaux de protéines dans des solutions contenant des halogénures s'est avéré efficace sur les structures protéiques solubles. Dans l'étude actuelle, ce protocole a été testé sur quatre structures cristallines différentes des protéines membranaires. Les résultats présentés indiquent et soutiennent de manière expérimentale que l'iodure pourrait être facilement et efficacement utilisé pour résoudre le problème de phase dans le cas des structures de cristaux de protéines membranaires.Le capteur histidine kinases est l'un des récepteurs transmembranaires les plus communs présents dans tous les royaumes de la vie. La compréhension des principes de signalisation transmembranaire de l'histidine kinases sensorielle est une question fondamentale qui reste actuellement sans réponse. Pour arriver à l'idée de quels changements structurels fournissent la transmission du signal à travers la membrane lipidique dans ce travail, la structure cristalline de la construction tronquée de l'histidine kinase NarQ d'Escherichia coli – un capteur de nitrates/nitrites – qui contient le capteur périplasmique, les hélices transmembranaires et le domaine HAMP au niveau du côté cytoplasmique a été déterminée dans les états lié à un ligand et l'apo muté. Les structures présentées fournissent un aperçu des changements de conformation qui se produisent dans le domaine transmembranaire et dans le domaine HAMP en aval pendant la transduction du signal induite par le ligand. L'avancement de la recherche structurelle a été grandement renforcé par l'implication des résultats méthodologiques présentés dans ce travail. Cet impact et, en particulier, les résultats prospectifs de ce travail aux disciplines méthodologiques et appliquées de la biologie structurale et de la cristallographie des rayons X en particulier sont discutésIn this study the methodological aspects for producing high-resolution crystal structures of membrane proteins were combined and reported here as well as their implication for the concrete biologically-relevant case of structural investigation of transmembrane histidine kinase working principles.In X-ray crystallography protein crystal samples vary in sizes, shapes and diffracting abilities. To be able to collect the diffraction data in the most efficient way the crystal sample should be properly characterised on-axis in every particular case. Raster X-ray scan has been found to be the most viable technique to do so and in this context a method of crystal sample analysis for protein crystallography is presented here which is based on the X-ray mesh scan technique developed at the ESRF. The method estimates the positions, sizes and quality of diffraction of each crystal in the scanned area which could be further useful for the rational design of the data collection process. The performance of the method is demonstrated on several protein crystal samples.Another bottleneck in production of crystal structures of proteins is in commonly known phase problem. The most widespread techniques to deal with the structure that cannot be phased using molecular replacement are SAD or MAD-based experimental phasing. This implies incorporation of various anomalous scatterers to the crystal structure. In the list of available scatterers halides are particularly stood out mostly because their low toxicity and easiness of handling but at the same time their capability of producing anomalous signal. The protocol of cryo-soaking of the protein crystals in halide-containing solutions has shown to be successful on soluble protein structures. In the current study this protocol was tested on four different crystal structures of membrane proteins. The presented findings state and further support experimentally that iodide could be easily and successfully used for addressing the phase problem in the case of membrane protein crystal structures.Sensor histidine kinases are ones of the most common transmembrane receptors present in all kingdoms of life. The understanding of transmembrane signalling principles of sensor histidine kinases is a fundamental question that currently remains unanswered. In order to get to the idea of which structural changes provide the transmission of the signal across the lipid membrane in this work the crystal structure of the truncated construct of the histidine kinase NarQ of Escherichia coli – a sensor of nitrates/nitrites – which contains periplasmic sensor domain, transmembrane helices and HAMP domain at the cytoplasmic side was determined in the ligand-bound and mutated apo states. The presented structures provide an insight on the conformational changes occurring in the transmembrane domain and in the downstream HAMP domain during the ligand-induced signal transduction. The progress of the structural investigation was greatly enhanced by the involvement of the methodological findings presented in this work. This impact and as well the prospective outcomes of this work to both methodological and applied disciplines of structural biology and X-ray crystallography in particular are discussed
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Mawoussi, Kodjo. "Effet de l'encombrement des protéines sur la diffusion des lipides et des protéines membranaires". Thesis, Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066541/document.
Abstract (sommario):
La diffusion latérale des lipides et des protéines transmembranaires est essentielle pour les fonctions biologiques. Dans le contexte cellulaire, la fraction surfacique des protéines membranaires est élevée, atteignant environ de 50 à 70% selon le type de membrane. La diffusion se fait donc dans un milieu très encombré. Le but de ce travail est d'étudier in vitro l'effet de l'encombrement des protéines sur la diffusion des protéines et des lipides. Jusqu'à présent, les mesures de diffusion latérale ont généralement été réalisées à faible densité de protéines, et l'effet de l'encombrement des inclusions membranaires ou des protéines membranaires a été peu étudié expérimentalement. Nous avons utilisé une méthode de suivi de particules uniques (SPT) pour suivre les trajectoires de la pompe à protons Bactériorhodopsine (BR) et de lipides marqués avec des quantum dots au bas de vésicules unilamellaires géantes (GUVs) en fonction de la fraction de surface totale (Ф) de BR reconstituée dans la membrane constituée par ailleurs de 1,2-Dioleoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DOPC)Lateral diffusion of lipids and transmembrane proteins is essential for biological functions. In the cellular context, the surface fraction of membrane proteins is high, reaching approximately 50 to 70% depending on the membrane type. Therefore, diffusion occurs in a very crowded environment. The aim of this work is to study in vitro the effect of protein crowding on their own diffusion and on those of the surrounding lipids. So far, lateral diffusion measurements generally have been carried out at low protein density, and the effect of proteins crowding has not been much studied experimentally. We used a single particle tracking (SPT) method to track the trajectories of the Bacterorhodopsin (BR) proton pump and of lipids labeled with quantum dots at the bottom of giant unilamellar vesicles (GUVs) as a function of the total surface fraction (Ф) of BR reconstituted in 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) membrane
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Arce, Lopera Jaime. "Les protéines membranaires, leurs hélices et leur repliement : analyses sur les structures expérimentales connues". Aix-Marseille 2, 2007. http://theses.univ-amu.fr.lama.univ-amu.fr/2007AIX22049.pdf.
Abstract (sommario):
Les protéines membranaires résident dans un milieu anisotrope et hétérogène. Cet environnement peut être divisé en plusieurs zones et exerce divers effets qui ont des conséquences sur la structure des protéines membranaires. J'ai donc créé et analysé un base de données de structures de protéines membranaires avec une annotation adaptée qui va audelà de celle couramment pratiquée. Après avoir valider l'approche d'annotation des différents éléments structurels, j'ai pu montrer que chacun de ces éléments ont des biais de composition caractéristiques qui découlent vraisemblablement de l'environnement. Par ailleurs, un examen de l'organisation du faisceau d'hélices dans notre base de données nous montre qu'il est difficile d'appréhender les interactions individuelles des hélices. C'est pourquoi j'ai développé Ptuba, un logiciel qui fait des projections des hélices, afin de concentrer, accumuler ou modifier l'information provenant de plusieurs sources pour faire en sorte qu'elle devienne plus compréhensible et donc exploitable. Le modèle à deux étapes propose que le réseau d'interactions entre hélices transmembranaires est le moteur principal de l'assemblage des protéines membranaires. J'ai testé cette hypothèse avec une analyse énergétique de notre base de données. Il en résulte que le modèle fonctionne dans le cas des interactions au sein d'une même chaîne mais pas vraiment dans les cas d'interactions entre chaînes. Cette différence vient d'un biais de population des interactions. Bien que les interactions entre hélices transmembranaires sont composées de deux types d'interactions distincts, j'ai mis en évidence que c'est la proportion relative de chaque type d'interaction et non leur nature qui est différente dans le cas des interactions entre chaînes. Cette analyse de la nature et assemblage des différents éléments structurels qui composent les protéines membranaires améliore notre compréhension de la stabilité des protéines membranaires et peut être servira à des efforts de prédiction d'annotation ou de structureMembrane proteins function in an anisotropic and heterogeneous environment. This environment can be divided in several distinct zones which have different influences on the structure of membrane proteins. Therefore, I created and analysed a database of membrane proteins of known structure annotated beyond usual standards. After validating the structural annotation, I show that the different structural elements that constitute these proteins display marked composition biases that probably derive from the environment's influence. An exam of the helix bundle organisation in our database is enough to see that understanding each individual interaction between helices is difficult. That is why I created Ptuba, a program to project the helices, in order to concentrate, accumulate or modify information from many sources to render it more comprehensible and thus useable. The two step model establishes that the network of interactions between transmembrane helices drive the assembly of membrane proteins. I tested this hypothesis by the analysis of interaction energies between elements in our database. The result is that this model works for interactions within chains but not for interactions between chains. The reason behind this difference is a population bias in the type of interactions involved. In fact, although two different types of interactions exist, it is not their nature but the relative population of these interactions that gives rise to the difference in interactions between chains. This analysis of the nature and assembly of different structural elements in membrane proteins improves our comprehension of the stabilty of these proteins and could evently be used in annotation or structure prediction methods
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Huon, de Kermadec Yann. "Les nanodisques comme outil pour l'étude de protéines membranaires intégrales". Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015GREAV025/document.
Abstract (sommario):
Les protéines membranaires représentent environ 2/3 des cibles thérapeutiques. Le développement de nouveaux médicaments est toutefois limité par l'absence de données structurales pour de nombreuses protéines. Les protéines membranaires s'avèrent en effet difficiles à manipuler et à maintenir en solution ce qui complique leur étude structurale. Les protéines sont en général solubilisées grâce à des surfactants comme les détergents, les amphipols, les hémifluorés et les peptergents. Il est aussi possible de les étudier dans des conditions plus physiologiques en les insérant dans des membranes lipidiques telles que des liposomes, des bicelles, ou des nanodisques.Les nanodisques sont des particules protéolipidiques autoassemblées, composées de protéines d'assemblages et de lipides, qui constituent un système de membranes modèles très prometteur permettant de solubiliser des protéines membranaires dans un milieu dépourvu de détergent. D'autres avantages sont aussi la variabilité de la constitution en lipides et l'accessibilité des deux côtés de la membrane.Dans le cadre de ma thèse, j'ai mis au point l'insertion de plusieurs protéines membranaires en nanodisques afin de permettre leur caractérisation fonctionnelle, biophysique et structurale. Nous avons en particulier étudié le transporteur ABC BmrA impliqué dans la résistance aux antibiotiques et cherché à identifier les changements conformationnels de la protéine en nanodisques par microscopie électronique. Les interactions de la protéine YedZ, un homologue de NADPH oxydases, avec ses partenaires solubles potentiels ont été étudiés par différentes méthodes telles que le pontage chimique, la résonance plasmonique de surface et la spectrométrie de masse native. En parallèle, le mécanisme d'assemblage des nanodisques a été investigué. Une interaction entre les protéines d'assemblages et des cations divalents a été mise en évidence. Cette interaction a un effet sur l'oligomérisation de la protéine d'assemblage mais également sur l'homogénéité des nanodisques. Ces observations nous ont permis d'améliorer les conditions de préparation des nanodisques, condition déterminante pour le succès de nombreuses approches structurales. Nous avons pu en particulier explorer la possibilité de cristalliser ces particules en vue d'études cristallographiquesMembrane proteins represent around 2/3 of therapeutic targets. However, the development of new drugs is hampered by the lack of structural data for many proteins. Membrane proteins are indeed difficult to handle and to maintain stable in solution, which complicates their study by structural methods. Proteins are usually stabilized by surfactants like detergents, amphipols, hemifluorinated compounds and peptergents. It is also possible to study those proteins in an environment mimicking their native conditions by incorporating them in lipid membranes such as liposomes, bicelles or nanodiscs.Nanodiscs are self-assembled proteolipidic particles, composed of a scaffold protein and lipids. This technology is a top-notch model membrane system, which provides a detergent free environment to study membrane proteins in solution. Further advantages are the possibility to vary the lipid composition and the accessibility of the incorporated protein from both sides of the membrane.During my PhD project, I have achieved the insertion of several membrane proteins into nanodiscs for functional, biophysical and structural characterizations. In particular, we have studied Bmra, an ABC transporter involved in multidrug resistance and tried to identify the conformational changes of the protein in nanodiscs by electron microscopy. The interaction of YedZ, a NADPH oxidase homologue, with potential soluble partners has been studied by various methods such as cross-linking, surface plasmon resonance and native mass spectrometry. In parallel, the mechanism of nanodiscs assembly has been investigated. An interaction between the scaffold protein and divalent cations has been revealed. This interaction influences the oligomerization of the scaffold protein but also the nanodiscs homogeneity. Those observations allowed us to improve the preparation of the nanodiscs, which was an essential step torward the success of many structural approaches. In particular, we were able to explore their accessibility to protein crystallography
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Gassart, Aude de. "Bases moléculaires du tri des protéines membranaires dans les exosomes". Montpellier 2, 2004. http://www.theses.fr/2004MON20160.
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Espesset, David. "Formation du canal ionique de la colicine A et inhibition par la protéine d'immunité : une affaire d'hélices transmembranaires". Aix-Marseille 1, 1995. http://www.theses.fr/1995AIX11033.
Abstract (sommario):
La colicine a est une toxine produite par des enterobacteries et active sur des souches apparentees. Son mode d'action peut etre divise en trois etapes: la reception a la surface de la bacterie-cible, la translocation a travers l'enveloppe de cette bacterie, et la formation, dans la membrane cytoplasmique, d'un pore ionique dependant du potentiel electrique. Chacune de ces etapes est assuree par un domaine structural distinct dans la molecule de colicine, et c'est le domaine c-terminal qui porte l'activite letale ; c'est egalement ce domaine qui est reconnu et inactive dans la membrane interne par la proteine d'immunite, qui est le second partenaire en jeu dans ces recherches. Cette these presente l'etude de la facon dont la colicine a s'insere dans la membrane cytoplasmique des bacteries-cibles, soit pour les tuer, soit pour y etre en quelque sorte capturee par la proteine d'immunite. Apres la presentation de l'etendue actuelle des connaissances liees au couple colicine/immunite, ainsi que sur les aspects ayant trait a l'interaction d'une proteine avec une structure membranaire: exportation, machinerie de translocation, assemblage, stabilite, en insistant particulierement sur l'aspect fonctionnel plus que structural, la seconde partie sera reservee a l'analyse des resultats obtenus, dans le cadre de l'activite letale de la colicine a et de celle, protectrice, de la proteine d'immunite ; ces resultats sont classes dans l'ordre suivant: premierement, les relations structure-fonction des proteines d'immunite ; deuxiemement, le mode d'insertion membranaire du domaine c-terminal de la colicine a in vivo ; et troisiemement, l'interaction directe entre colicine et proteine d'immunite
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Kossinova, Olga. "Insights into the selenocysteine incorporation mechanism in mammals". Strasbourg, 2011. http://www.theses.fr/2011STRA6221.
Abstract (sommario):
L'acide aminé sélénocystéine est codé par UGA qui agit généralement comme un codon stop. Une machinerie spécialisée est utilisée pour incorporer cet acide aminé dans les sélénoprotéines qui implique une structure en tige-boucle, appelée SECIS, et des protéines. L'une d’elles est SBP2, SECIS Binding Protein 2. Pour mieux comprendre ce mécanisme et identifier de nouveaux partenaires de l'élément SECIS, deux stratégies ont été développées. 1/ identification des contacts de l’élément SECIS avec le ribosome par des pontages covalents. Dans ce but, j’ai construit des ARN messagers modèles, l’élément SECIS contenant des agents pontants. Après action des UV, il s’avère que SBP2 est liée au SECIS dans les complexes 48S et 80S de pré-translocation. Lorsque la formation de la liaison peptidique est bloquée par l’anisomycine, l’élément SECIS n’est plus lié à SBP2 mais à des protéines ribosomiques, SBP2 étant présente dans le complexe. L'interprétation est la suivante. Pendant la transpeptidation, SBP2 est associée au ribosome mais ensuite SBP2 le quitte et se lie au SECIS à l'étape de pré-translocation. 2/ Le site de liaison de SBP2 sur la sous-unité 60S n’avait pas encore été localisé. Les complexes SBP2-40S, 60S-SBP2 et 80S-SBP2 ont été soumis aux diépoxybutane ou 2-iminothiolane. Nous avons montré que SBP2 se lie à la sous-unité 60S uniquement et que l'ARNr 28S contribue davantage au site de liaison que les protéines ribosomiques. Pour identifier cette région de l’ARNr 28S, les radicaux hydroxyles ont été employés et nous avons montré que SBP2 réside sur le côté solvant de la sous-unité 60S, à proximité du site AThe amino acid selenocysteine is encoded by a UGA triplet which acts generally as a stop codon. A specialized machinery is used to incorporate this amino acid into selenoproteins, involving a specific stem-loop, termed SelenoCysteine Insertion Sequence (SECIS), and some protein factors. One of those is the SECIS Binding Protein 2 (SBP2), which is necessary for ribosome recognition of the UGA as the Sec codon. Using synthetic selenocysteine mRNAs and translational inhibitors, several steps of mRNA translation were analyzed. The data obtained allowed us to propose the following mechanism for selenocysteine insertion : during the transpeptidation step of elongation, SBP2 is bound to the ribosome; however, after transpeptidation, SBP2 leaves the ribosome and binds the SECIS in the pre-translocation step. We showed earlier that SBP2 binds specifically to the purified human 60S but not to the 40S ribosome subunits but the actual location was unknown. The SBP2•40S, SBP2•60S and SBP2•80S complexes were thus studied using crosslinking reagents. SBP2 did not crosslink to the 40S subunit in either the 40S•SBP2 or 80S•SBP2 complexes, correlating with the binding data. However, SBP2 crosslinks to the 60S subunit in either the free state or in the 80S ribosome. I next showed that the 28S rRNA contributes more to the crosslink than ribosomal proteins. This led us to use hydroxyl radical footprinting to study the molecular environment of SBP2 on the ribosome. According to the probing data, the binding of SBP2 to the human 60S subunit protects 2 helices in expansion segment 7 of the 28S rRNA. I proposed that the SBP2 binding site is located in the vicinity of the L7/L12 stalk
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La, Fuente Veronica de. "Participation au projet de séquençage du génome de Bacillus subtilis 168 : séquençage et analyse d'une région chromosomique de 11 kb". Poitiers, 1995. http://www.theses.fr/1995POIT2302.
Abstract (sommario):
Dans le cadre du projet international de sequencage du genome de bacillus subtilis, la region sur la carte genetique comprise entre 314 (gerb) et 333 (sacxy) a ete attribuee a l'institut pasteur. Dans un premier temps, nous avons utilise la technique de marche sur le chromosome et deux segments d'adn adjacents a une region comprenant le locus spoof, ont ete clones chez escherichia coli. Puis, nous avons applique une methode permettant de fragmenter, de facon aleatoire, un des segments d'adn et la collection de sous-fragments a ete sequencee suivant la technique decrite par sanger. L'analyse de la sequence nucleotidique ainsi obtenue a conduit a l'identification de dix phases ouvertes de lecture (orfs), dans cette region. Les sequences proteiques deduites ont ete comparees avec celles contenues dans les banques de donnees. Nous avons trouve que l'une de ces orfs presente des similitudes tres significatives avec des genes codant pour des abc-transporteurs et une autre est similaire a des genes eucaryotiques codant pour des acyl-coa deshydrogenases. Dans un deuxieme temps, nous avons effectue l'analyse fonctionnelle de certains genes presents dans la region sequencee de b. Subtilis. Nous avons montre que les genes sequences, lorsqu'ils sont deletes, ne sont pas essentiels pour la survie des bacteries. Le gene ebr, qui confere la resistance au bromure d'ethidium, etait localise au voisinage des genes de la region sequencee. Nous avons alors cherche a savoir si ce gene correspondait a celui de l'abc-transporteur. L'experience montre que le marqueur ebr n'est pas localise dans la region gerb-sacxy, comme l'indiquait la carte genetique, mais semble situe a 216 sur le chromosome de b. Subtilis. Enfin, une experience de fusion transcriptionnelle avec le gene presume de l'acyl-coa deshydrogenase a conduit aux observations suivantes: l'acide palmitique et l'acide stearique sont des acides gras capables d'activer l'expression du gene de l'acyl-coa deshydrogenase ; un phenomene de repression catabolique est observe lorsque le glucose est present dans le milieu. Nous avons identifie un site cre (catabolite-responsive element) probablement implique dans la repression catabolique du gene de b. Subtilis
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Meyer, Thomas. "Caractérisation électrochimique et spectroscopique de protéines membranaires immobilisées sur des nanomatériaux". Thesis, Strasbourg, 2015. http://www.theses.fr/2015STRAF004/document.
Abstract (sommario):
Le domaine de la bioénergétique concerne l’étude des échanges et des transformations de l’énergie au sein des organismes vivants. Cette thèse propose une étude électrochimique et spectroscopique de protéines issues de la chaine respiratoire, les oxydases terminales, afin de comprendre l’influence de différentes propriétés de ces enzymes (potentiels des cofacteurs, dépendance pH…) sur leur mécanisme réactionnel. La première partie de ce travail décrit le développement d’une méthode d’immobilisation permettant de conserver l’intégrité et l’activité de ces enzymes. Cette technique a d’abord été utilisée pour étudier l’inhibition de la cytochrome aa3 oxydase de P. denitrificans et a permis de mettre en avant l’importance du transfert de protons sur la réaction de réduction de l’oxygène. Une deuxième étude propose de comparer deux isoformes de la cytochrome cbb3 oxydase dont aucune différence n’a été observée à ce jour. La spectroscopie IRTF couplée à l’électrochimie montre l’implication de résidus acides différents au cours de la réaction d’oxydoréduction suggérant des différences mécanistiques. La dernière partie propose une étude comparative d’oxydases terminales de différents types et met en perspective l’influence des potentiels relatifs des hèmes sur la réaction de réduction de l’oxygèneThe field of bioenergetics concerns the study of exchange and transformation of energy in living organisms. This manuscript proposes an electrochemical and spectroscopic study of the fourth complex of the respiratory chain, the terminal oxidases. The aim of this study was to understand the influence of some properties of these enzymes (potential of the cofactors, pH dependency…) on the catalytic mechanism. The first part describes an immobilization procedure which retains the protein activity and structure. This procedure has been applied for the study the inhibition of the proton pathways of cytochrome aa3 oxidase from P. denitrificans and shows the importance of proton transfer on the oxygen reduction. In a second study, two isoforms of cytochrome cbb3 oxidase were compared. No differences were observed between them until now. Our electrochemically induced FTIR spectroscopy study suggests the implication of different acidic residues during the redox reaction implying differences in the mechanism of these enzymes. The last part deals with the comparison of terminal oxidases of different types and shows the influence of the relative order of the midpoint potentials of the hemes on the oxygen reduction
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Basit, Hajra. "Interfaces fonctionnelles pour l'immobilisation de protéines membranaires : concept, caractérisation et applications". Phd thesis, Université de Grenoble, 2011. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00685163.
Abstract (sommario):
Cette thèse est consacrée au développement d'assemblages supramoléculaires, qui miment la nature amphiphile des membranes cellulaires. A cette fin, des bicouches lipidiques supportées (SLB) ont été conçues pour l'insertion de la FhuA (protéine de membrane externe d'E. coli). L'interaction de FhuA présente dans la SLB, avec le pb5 (la protéine du bactériophage T5) a ensuite été étudiée par QCM-D. De plus, des bicouches lipidiques suspendues (tBLM) ont été construites sur des monocouches auto-assemblées (SAM) d'un nouveau thiol d'ancrage. Dans cette étude, la formation de tBLM a été minutieusement étudiée par différentes techniques telles que la QCM-D, l'AFM et l'EIS, afin de déduire le rôle du thiol d'ancrage dans le processus de formation de tBLM. En outre, un amphipol biotinylé (B-PCApol), a été employé pour l'immobilisation des protéines membranaires, par exemple la FhuA et de l'intégrine avß3 (humain) sur des surfaces contenant la streptavidine. Avec leurs assemblages respectifs, la constante de dissociation du complexe FhuA-pb5 a été déterminée, tandis que les interactions de l'intégrine avec vitronectine (son ligand naturel) ont été étudiées par SPR. La dernière partie de cette thèse est dédiée à l'étude d'événements de reconnaissance biomoléculaire entre une lectine (ConA) et des sucres multivalents présentés sur un châssis moléculaire, RAFT.
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Remeeva, Alina. "Développement des nouvelles approches pour nano volume cristallisation des protéines membranaires". Thesis, Grenoble, 2013. http://www.theses.fr/2013GRENY001.
Abstract (sommario):
Une nouvelle méthode pour la cristallisation des protéines membranaires (MP) de bicouches amphiphiles interconnectés (IAB) a été récemment mise au point. Dans cette approche protéines cristallisées directement des membranes et il est supposé que la cristallisation est conduite principalement par les propriétés de la mésophase lipidique dans son ensemble, mais pas par des caractéristiques individuelles des détergents. Le détergent joue un rôle de modulateur de ces propriétés. L'application de ce procédé de cristallisation de la vaste gamme des protéines membranaires est très prometteuse car il facilite considérablement la cristallisation. Cependant, il faut effectuer un certain nombre d'expériences pour chaque nouvelle protéine membranaire afin de déterminer les paramètres optimaux de la mésophase lipidique pour la protéine. Pour ce faire avec des quantités limitées de protéines membranaires, en particulier des protéines humaines, qui sont généralement très difficiles à produire en quantité suffisante, l'application des systèmes robotisés de cristallisation à haut débit pour la nano volume cristallisation pourrait être la seule solution. L'objectif principal de ce travail est le transfert de l'approche actuelle pour la cristallisation des protéines membranaires de l'IAB sur les volumes nano. Pour ce faire une grande variété d'expériences cristallisations a été effectuée pour différentes protéines membranaires. Les faits, qui influent des résultats de cristallisation, ainsi que des informations structurelles obtenues ont été analysées avec soin. Il a été démontré que les gros cristaux de protéines membranaires différents adaptés pour cristallographie aux rayons X peuvent être reproductible obtenu par nano volume cristallisation. Le premier chapitre «Introduction» comprend une description générale des protéines membranaires, des approches différentes pour la cristallisation des protéines membranaires, leurs avantages et leurs limites. La vue d'ensemble des protéines membranaires, qui sont étudiés dans ce travail, les informations disponibles et les problèmes non résolus sont présentés. Le deuxième chapitre présente les matériaux et les méthodes utilisées dans l'étude. Le troisième chapitre «Résultats et discussions» est décrit les résultats obtenus et leur interprétation. Pour commencer, la nano volume cristallisation de l'IAB de la bactériorhodopsine et la comparaison avec l'approche présent de cristallisation est présenté. Nano volume cristallisations en présence d'amphiphiles fluorés et les poloxamères ont été effectuées pour la première fois et décrit en détails. L'application de l'approche du nano volume cristallisation du complexe de la rhodopsine sensorielle II de Natronomonas pharaonis avec son transducteur apparenté et les protéines du complexe avec une mutation importante dans le transducteur, ce qui élimine l'action des protéines, est présenté. Résultats de nano volume cristallisation pour un autre complexe de deux protéines membranaires - triple mutant de la bactériorhodopsine, qui fonctionne comme un transducteur de signal, avec transducteur de Natronomonas pharaonis sont décrits. Halorhopsin de Natronomonas pharaonis a également été cristallisé par la nouvelle approche et de cristallisation résultats sont présentés. La première structure de protéine membranaire - enzyme cytidine-5'-triphosphate: inositol-1-phosphate cytidylyltransférase / di-myo-inositol-1 ,3-phosphate-1-phosphate synthéase de hyperthermophiles Archaeoglobus fulgidus a été résolu en utilisant des cristaux obtenus par nano volume cristallisation. Détails de la structure, l'importance et le mécanisme proposé de l'action enzymatique sont discutées. Les conclusions finales ainsi que les perspectives de la méthodique développées sont donnés dans le dernier chapitre de la thèseA new method for crystallization of membrane proteins (MPs) from interconnected amphiphilic bilayers (IAB) was recently developed. In this approach proteins crystallized directly from the membranes and it is postulated that crystallization is driving mostly by the properties of the lipidic mesophase as a whole but not by individual features of the detergents. The detergent plays a role of the modulator of these properties. Application of this crystallization method to the wide range of MPs is very promising since it dramatically facilitates crystallization. However, one needs to perform a number of screening experiments for each new MP to determine the optimal parameters of the lipidic mesophase for certain protein. To do so with limited amounts of MPs, especially human proteins, which are usually very difficult to produce in sufficient amount, the application of the high throughput robotic systems for nano volume crystallization could be the only solution. The major goal of this work is the transfer of the present approach for large scale crystallization of MPs from IAB to the nano volumes. To do so a large variety of crystallizations experiments were carried out for different MPs. The facts, which influence the crystallization results, as well as structural information obtained were carefully analyzed. It was demonstrated that large crystals of different MPs suitable for X-ray crystallography can be reproducibly obtained using this nano volume crystallization method. The first chapter “Introduction” includes a general description of MPs, different approaches for crystallization of MPs, their advantages and limitations. The overview of membrane proteins, which are studied in this work, the information available and unsolved problems are presented. The second chapter presents the materials and methods used in the study. The third chapter “Results and Discussions” describes the results obtained and their interpretation. To begin with, nano volume crystallization from IAB of bacteriorhodopsin and the comparison with large scale crystallization approach is presented. Detailed nano volume crystallizations in the presence of fluorinated surfactants and poloxamers were performed for the first time and described in details. The application of nano volume approach for the crystallization of the complex of sensory rhodopsin II from Natronomonas pharaonis with its cognate transducer and the proteins complex with important mutation in the transducer, which eliminates the action of the proteins, is presented. Nano volume crystallization results for another complex of two MPs – triple mutant of BR, which operates like a signal transductor, together with transducer from Natronomonas pharaonis are described. A light-driven chloride pump halorhopsin from Natronomonas pharaonis was also crystallized by new approach and crystallization results are presented. The structure of new MP – bifunctional enzyme cytidine-5′-triphosphate:inositol-1-phosphate cytidylyltransferase/ di-myo-inositol-1,3-phosphate-1-phosphate synthase from hyperthermophiles Archaeoglobus fulgidus was solved using the crystals obtained by nano volume crystallization from IAB. Structure details, significance and proposed mechanism of the enzymatic action are discussed. The final conclusions as well as the perspectives of the developed methods are given in the last chapter of the thesis
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Rivoyre, Matthieu de. "Expression et purification de protéines membranaires mammifères impliquées dans des pathologies". Nice, 2006. http://www.theses.fr/2006NICE4062.
Abstract (sommario):
À l’interface entre la cellule et le milieu extérieur, les protéines membranaires ont un rôle indispensable au fonctionnement cellulaire. Elles jouent un grand nombre de fonctions et peuvent être impliquées dans des pathologies graves. La connaissance de ces protéines membranaire peut permettre de mieux comprendre de nombreux phénomènes biologiques et pathologiques et leur localisation, accessible, en fait de bonne cibles thérapeutique. La connaissance de la structure des protéines apporte une quantité d’information très importante sur leur fonctionnement. À ce jour si plusieurs dizaines de milliers de structures de protéines solubles ont pu être résolues, moins de deux cents structures de protéines membranaires sont connues. Cette différence provient des difficultés à produire des protéines membranaires pures et stables en quantités nécessaires à la détermination des structures tridimensionnelles. Les conditions d’expression des protéines membranaires est très variables en fonction de la protéine. Notre équipe de recherche s’intéresse au développement de stratégies pour l’expression hétérologue et la purification de protéines membranaires impliquées dans des pathologies humaines dans le but d’en étudier la structure et les relations structurefonction et par une approche protéine. Dans cette thèse sont présentés les résultats obtenus sur l’expression et la purification des récepteurs humains de la voie de signalisation Hedgehog, Patched et Smoothened, dont le disfonctionnement est mis en cause dans de nombreux cancers mais également dans des maladies neuro-dégénératives. Ces protéines ont pu être exprimées dans différents systèmes hétérologues : les levures Saccharomyces cerevisiae et Pichia pastoris et dans les Cellules S2 de drosophile. Nous avons pu mettre en évidence que Smoothened était exprimé sous sa forme native dans les levures et qu’il était possible de la purifier et la produire dans l’optique d’une étude structurale à partir de Pichia pastoris (de Rivoyre et al, FEBS letters, 2005). Patched et Smoothened ont également pu être exprimé stablement et fonctionnellement par des clones de cellules S2. Ce système qui permet la purification de ces protéines s’est également avéré très intéressant pour une étude comparative du fonctionnement des protéines humaines et des protéines de drosophile (de Rivoyre et al, JBC, 2006)Membrane-bound proteins play a significant role in cell function due to their position in between the cell and the external medium. These proteines are for this reason, involved in a number of human diseases. Knowing membrane-bound proteins will allow us to better understand several biological and pathophysiological functions. Furthermore, their localisations make them interesting therapeutic targets. Knowing the structure of proteins gives a tremendous amount of information on their functions. To date, even if several thousands structures of soluble proteins have been solved; only less than two hundred structures of membrane-bound proteins are known. This important difference is partly due to the fact that membrane-bound proteins are difficult to obtain pure in a stable conformation in order to determine their three-dimensional structures. Recombinant expression of membrane-bound proteins has a high variability depending on the nature of the protein studied. Our research team is therefore interested in the development of recombinant expression and purification strategies of membrane-bound proteins involved in numerous human diseases, in order to study their functions but also to establish structurefunction relationships. My thesis work has focused on the expression and the purification of human receptors of the Hedgehog pathway, Patched and Smoothened. Alteration of these two proteins is known to be involved in numerous cancers but also in some neurological diseases. These two proteins have been expressed in two different systems : yeast cells Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris and also in drosophila cells S2. We have been able to show that the protein Smoothened is expressed in Pichia pastoris in its native conformation in yeast cells an dit is therefore possible to purify it in order to perform structural studies. Patched and Smoothened have also been stably and functionaly expressed in S2 cells. This system is also interesting to perform comparative studies between drosophila and human proteins
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Costes, Florence. "Analyse physico-chimique de glycolipides utilisés pour l'étude de protéines membranaires". Toulouse 3, 1995. http://www.theses.fr/1995TOU30193.
Abstract (sommario):
Du fait de leur caractere generalement non denaturant vis a vis des materiaux biologiques, les tensioactifs derives de sucres sont largement utilises en recherche fondamentale pour l'extraction et la purification des proteines membranaires amphiphiles, etape essentielle pour la determination de leur structure et de leur role. Nous avons envisage de comparer les proprietes tensioactives de nouveaux amphiphiles a ceux utilises a present dans ce domaine, ainsi que leur mode d'agregation. Des syntheses simples, sans protection et deprotection du sucre, nous ont permis de synthetiser les tensioactifs suivants: les n-alkylamino-1-deoxy-1-lactitols, les n-acetyl n-alkyllactosylamines, les n-alkyllactobionamides. Afin d'etudier le mode d'agregation dans l'eau de ces tensioactifs, nous avons tout d'abord effectue une analyse conformationnelle de la n-acetyl n-alkyllactosylamine par rmn #1h et #1#3c, et par modelisation moleculaire. Nous avons ensuite entrepris l'etude de la micellisation de tous ces tensioactifs en mesurant les concentrations micellaires critiques par tensiometrie, et le nombre d'agregation des micelles formees par plusieurs methodes: fluorescence statique, fluorescence dynamique et diffusion des neutrons et des rayons x. Cette derniere technique permet aussi de preciser la forme de ces micelles. De plus, les phases cristal-liquide formees en milieux concentres par ces tensioactifs ont ete mises en evidence par diffraction des rayons x et observation au microscope optique. Le comportement de ces glycolipides dans l'eau a ete compare a celui de tensioactifs homologues utilises pour l'extraction de proteines membranaires: le dodecylmaltoside et l'hecameg. Tous ces composes presentent des proprietes tensioactives comparables. Les micelles formees sont soit des micelles spheriques, soit des ellipsoides aplatis mis en evidence pour la premiere fois, soit des micelles filamenteuses. Enfin, la reactivite et la stabilite d'une proteine membranaire extrinseque, la lipoxygenase de soja, en milieu aqueux, en presence de ces amphiphiles ont ete etudiees. Ces derniers se sont reveles de bons agents emulsionnants de l'acide gras, comparables au tween 20. La plupart affectent moins l'activite de l'enzyme au cours du temps que le tween 20. En premiere analyse, la forme des micelles apparait comme un parametre important
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Köhler, Sebastian. "Etude de bicouches lipidiques amarrées destinées à l'incorporation de protéines membranaires". Thesis, Université Grenoble Alpes, 2020. http://www.theses.fr/2020GRALS023.
Abstract (sommario):
Cette thèse a pour but l’étude de la structure des membranes lipidiques bicouches attachées, qui sont des bicouches lipidiques greffées chimiquement sur une surface plane. Ces systèmes, comparés à d'autres systèmes de membranes modèles, présentent une stabilité accrue, mais leur structure est plus complexe, nécessitant une étude approfondie. La structure des bicouches lipidiques attachées est fortement influencée par l'architecture moléculaire des composés utilisés pour greffer la bicouche lipidique à la surface. Cette thèse porte sur l’étude de deux systèmes d'attache des bicouches lipidiques. Le premier système est une bicouche lipidique attachée à une surface d’or utilisant une seule chaîne alkyle pour ancrer la membrane. Le second système utilise une structure moléculaire synthétique semblable à un lipide pour ancrer la membrane et lie à une surface de silicium par chimie du silane. Cette thèse a trois objectifs pour ces systèmes d'attache: (i) étudier les bicouches attachées avec des fractions élevées de cardiolipine lipidique, (ii) étudier la structure des membranes attachées sur une surface via l’utilisation de différentes molécules de greffage, et (iii) étudier l'incorporation de la protéine membranaire NhaA dans ces systèmes. Le lipide cardiolipine a une structure unique contenant quatre chaînes d'acides gras. Cela conduit à des propriétés intéressantes des bicouches le contenant ainsi qu'à une interaction avec plusieurs protéines membranaires. Nous avons étudié la structure des membranes captives avec des fractions de cardiolipine élevées pouvant atteindre 80%. Les deux systèmes d'attache pourraient être utilisés pour former des bicouches lipidiques avec des fractions élevées de cardiolipine. En comparaison, le cardiolipine est généralement présent dans les membranes naturelles à de faibles fractions de l’ordre de 10%. La nanostructure des membranes avec différentes fractions de cardiolipine a été structurellement caractérisée par réflectométrie neutronique, et leurs propriétés électrophysiologiques ont été étudiées par spectroscopie d'impédance électrochimique. Ces membranes attachées de cardiolipine ont montré une structure très condensée avec de hautes propriétés d'étanchéité électrique. Ces résultats sont importants pour d'autres utilisations technologiques des bicouches lipidiques captives. Enfin, l'incorporation de la protéine membranaire NhaA dans de tels systèmes membranaires a été étudiée. NhaA a été incorporée avec succès dans les deux systèmes d'architecture d'attache à des fractions élevées sans perturber de manière significative la structure bicouche lipidique attachée. Cela fait des membranes attachées contenant des quantités élevées de cardiolipine un système de membrane modèle prometteur pour l'incorporation de protéinesThis thesis investigates the structure of tethered lipid bilayer membranes, which are lipid bilayers chemically grafted to a planar surface. Compared to other model membrane systems they show increased stability, but have a higher complexity in structure, which requires thorough investigation. The structure of tethered lipid bilayers is strongly influenced by the molecular architecture of the grafting molecules. Within the framework of this thesis, two different types of tether architecture were investigated. The first was a lipid bilayer tethered to a gold surface and using a single alkyl chain to anchor the membrane, while the second used a synthetic lipid-like molecular structure and was bound to a silicon surface by silane chemistry. Three main objectives for those systems were pursued: (i) to investigate tethered bilayers with high fractions of the lipid cardiolipin, (ii) to investigate the structural differences between tethered membranes having different surface grafting molecules, and (iii) to investigate the incorporation of the membrane protein NhaA into these systems. Cardiolipin has a unique structure characterized by four fatty acid chains, which leads to interesting effects on bilayer structure, as well as interaction with several membrane proteins. Tethered membranes with high cardiolipin fractions of up to 80 % were structurally characterized by neutron reflectometry, and their electrophysiological properties were investigated by electrochemical impedance spectroscopy. In both tethered bilayer architectures, cardiolipin containing membranes showed a very condensed structure with high electrical sealing properties. Differences in tether architecture mainly affected the structure of the water-filled sub-membrane space. The tethered bilayers grafted to a gold surface showed very low water content below the membrane, while the sub-membrane space of bilayers grafted to a silicon surface was highly hydrated. Finally, NhaA was successfully incorporated into both tether architecture systems at high fractions without damaging the tethered lipid bilayer structure significantly. This makes tethered membranes containing elevated amounts of cardiolipin a promising model membrane system for protein incorporation and offers possibilities for further technological uses of tethered lipid bilayers
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Ramus, Claire. "Développements de méthodes d'analyses protéomiques différentielles pour l'étude des protéines membranaires". Université Joseph Fourier (Grenoble), 2005. http://www.theses.fr/2005GRE10051.
Abstract (sommario):
L'étude de la dynamique d'expression des protéines, étude qui est indispensable pour appréhender les grands mécanismes de fonctionnement de la machinerie cellulaire, nécessite la mise au point de techniques d'analyses protéomiques différentielles. De par leur implication dans de très nombreux processus cellulaires, les protéines membranaires font l'objet d'études particulièrement attrayantes. Le laboratoire ayant acquis depuis plusieurs années une expertise dans le domaine de l'analyse des protéines membranaires, nous avons entrepris de développer différentes méthodes d'analyses protéomiques différentielles des protéines membranaires : - le marquage isotopique différentiel des protéines à l'aide de réactifs chimiques de type ICAT a tout d'abord été adapté à l'analyse d'une protéine membranaire modèle (ANT -1). La stratégie choisie, qui consiste notamment à réaliser le marquage en présence de concentrations élevées de SDS et d'urée, a été ensuite appliquée à l'analyse quantitative de fractions membranaires de thylacoïdes et de cellules souches murines. La mise en évidence d'un marqueur membranaire des cellules souches murines totipotentes valide cette stratégie. - l'analyse quantitative des protéines à l'aide peptides trypsiques marqueurs a également été exploitée dans le cadre d'une étude approfondie portant sur les protéines membranaires localisées dans l'enveloppe des chloroplastes de plantules d'Arabidopsis thaliana sauvage et mutante (délétion d'un transporteur hypothétique IE18). La mise au point de ces différentes méthodes a également contribué à évaluer les performances des nouveaux logiciels dédiés aux analyses protéomiques quantitativesStudy of the dynamic protein expression, which is essential for the understanding of cellular functions and mechanisms, requires the development of differential proteomic strategies. The involvement of membrane proteins in numerous essential cellular processes makes their targeted anaIysis particularly interesting. In order to specifically study membrane proteins, over the last few years, proteomics approaches have been developed and are now routinely used in our laboratory. Relying on this experience we undertook the developmer of dlfferent strategies for the quantitative analysis of these previously enriched membrane proteins. - Firstly, clfferential isotopic labeling of proteins using chemical reagents such as ICAT was adapted to the study of a model membrane protein (ANT -1). The optimised strategy, involving labeling proteins in the presence of high concentrations of ses and urea, was then applied to the quantitative analysis of thylakoid membrane preparations or of membrane fractions obtained from murine embryonic stem ceIIs. The identification of a membrane protein specifically expressed in totipotent stem cells fully validates our strategy. - During the course of the extensive study of the Arabidopsis thaliana chloroplast envelope membrane, a quantitative protein analysis wa! also carried out using synthetic trypsic peptides. This strategy was applied to compare the protein expression patterns of envelope proteins from wild type and mutant plants, the latter being caracterised by the deletion of the gene coding for the hypothetical lE18 translocator. This work allowed the evaluation of new quantitative software modules currently developed in the laboratory
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Furois-Corbin, Sylvie. "Contribution à l'étude théorique des biopolymères : acides nucléiques et protéines membranaires". Paris 6, 1987. http://www.theses.fr/1987PA066384.
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Khao, Jonathan. "Les protéines membranaires : perturbations de l'environnement et conséquences sur leur assemblage". Thesis, Aix-Marseille 2, 2011. http://www.theses.fr/2011AIX22098.
Abstract (sommario):
Dans leurs membranes natives, les protéines membranaires peuvent former des assemblages multimériques impliqués dans un grande variété de processus biologiques, de la transduction du signal à la structuration d'organelles. Leur agrégation est influencée par relations qu'elles entretiennent avec la membrane. Au cours de cette thèse, j'étudie l'influence mutuelle des protéines membranaires et de leur environnement au moyen de simulations numériques. L'étude d'un un complexe peptide-détergent modèle a révélé la présence d'une compétition entre deux forces : la cohésion entre les détergents maintenant la structure micellaire, et les interactions adhésives à certaines surfaces peptidiques. L'équilibre entre ces forces conduit à une frustration du système et à l'exposition de surfaces hydrophobes au solvant, expliquant les phénomènes d'agrégations observées expérimentalement. Ces résultats montrent l'importance de la topologie des surfaces du peptide dans l'organisation du complexe. Pour caractériser l'influence de la composante protéique sur les amphiphiles, un estimateur d'entropie configurationelle des chaînes grasses a été développé. Les mesures réalisées sur 15 systèmes membranaires gros grains montrent que la capacité des protéines à apparier l'épaisseur hydrophobe membranaire à la leur est le facteur principal responsable des variations entropiques. Cependant, au delà des simples contributions de l'épaisseur hydrophobe protéique, la diversité des comportements observés dans la première couche de lipides au contact avec la protéine montre bien un rôle de la topologie dans la modulation des interactions. Les variations observées à plus longues distances semblent alors être un facteur clé dans les interactions entre protéines membranaires. Dans le cadre d'une collaboration, la description d'un membranaire par microscopie à force atomique haute vitesse a permis de caractériser le paysage énergétique des interactions entre protéines membranaires. En combinant ces résultats avec ceux obtenus par simulations de dynamiques moléculaires, des chemins basses énergies on pu être identifiés et soulignent de nouveau l'importance des lipides dans l'organisation et la dynamique des agrégats protéiques. L'ensemble de ces données permettent alors de mieux comprendre l'influence mutuelle entre les protéines et les amphiphiles constituant leur environnement et les phénomènes d'agrégation protéiques dans un contexte biologique et expérimentalIn their native membranes, membrane proteins can form multimeric assemblies implicated in a wide range of biological processes, from signal transduction to organelle structure. Their aggregation is influenced by the relations they have with the membrane. Through this thesis, I study the mutual influence between membrane proteins and their environment using numerical simulations. The study of a model protein detergent complex has revealed the presence of two competing forces : cohesion between detergents maintaining the micellar structure, and adhesive interactions to certain peptide surfaces. The balance between these forces leads to a certain frustration of the system, and to the exposure of hydrophobic surfaces to the solvent, explaining phenomena observed experimentally. These results show the importance of peptide surface topology on the organization of the complex. To characterize the influence of the protein component on amphiphiles, a configuartional entropy estimator has been developed. Measures realized on 15 coarse grained membrane systems show that the protein ability to match the membrane hydrophobic thickness to its own is the main factor responsible for entropic variations. However, beyond the simple contributions of protein hydrophobic width, the variety of behaviors in the first shell of lipids show a role of proteins in interaction modulation. Variations observed at longer ranges then seem to be a key factor in the interactions between membrane proteins. In the context of a collaboration, the description of a membrane plane by high speed atomic force microscopy allowed to characterize the energetic landscape of interactions between membrane proteins. By combining these results with those obtained by coarse grained molecular dynamics simulations, low energy paths have been identified and underly the importance of lipids in the organization and dynamics of proteins aggregates. All these data allow to further understand the mutual influence between proteins and amphiphiles constituting their environment and the aggregations phenomena in a biological and experimental context
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Tricottet, Viviane. "Méthodes immunoenzymatiques ultrastructurales avant inclusion : applications à la détection de protéines intracellulaires de protéines liées aux membranes et de protéines extracellulaires". Paris 5, 1990. http://www.theses.fr/1990PA05P611.
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Raffy, Sophie. "Approche biophysicochimique de l'électroinsertion de protéines membranaires au niveau de bicouches lipidiques". Toulouse 3, 1995. http://www.theses.fr/1995TOU30234.
Abstract (sommario):
L'insertion d'une proteine membranaire solubilisee ne possedant qu'un seul fragment transmembranaire, la glycophorine a, dans la membrane de vesicules multilamellaires de dppc est obtenue en soumettant le melange lipide/proteine a une modulation de potentiel electrique transmembranaire. Les conditions electriques necessaires a l'insertion de la glycophorine sont directement correlees a celles qui permettent de permeabiliser la bicouche lipidique. Des preuves experimentales de l'electroinsertion ont ete fournies par l'utilisation de methodes physico-chimiques et biochimiques. Une perturbation localisee au niveau de la tete polaire des phospholipides permet une trans-insertion spontanee de la glycophorine a travers la bicouche lipidique. L'etude au niveau de systemes plus complexes (lecithine, dppc additionnes de cholesterol, phosphatidylserine, stearylamine et cellules d'ovaires d'hamster chinois) a permis de raffiner la description du processus. L'electroinsertion du fragment c terminal de la colicine a formant un canal ionique activable a ete realisee sur des liposomes puis sur les cellules cho. Le maintien de la fonctionnalite de ce fragment apres son electroinsertion dans la membrane de cellules cho tend a montrer que l'electroinsertion de proteine dans une bicouche lipidique est obtenue suite a une reorganisation locale de la matrice lipidique
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Boeuf, Julien. "Caractérisation des GASP, une nouvelle famille de protéines impliquées dans le trafic intracellulaire des récepteurs couplés aux protéines G". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 2008. https://publication-theses.unistra.fr/public/theses_doctorat/2008/BOEUF_Julien_2008.pdf.
Abstract (sommario):
Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent une vaste famille de protéines située à la surface de la cellule et assurent la communication entre les cellules de notre organisme. Ce sont des cibles thérapeutiques privilégiées, mais leur stimulation prolongée conduit à des adaptations, en particulier le développement de la tolérance. La tolérance, qui peut se définir comme une baisse de l’efficacité d’un composé au cours du temps, est bien connue des cliniciens dans le cas de traitements prolongés de nombreuses pathologies avec des médicaments ayant pour cibles les RCPG. La compréhension des mécanismes impliqués dans ces phénomènes adaptatifs constitue ainsi un défi majeur qui pourrait conduire au développement de nouveau traitement visant à limiter la tolérance. C’est dans ce contexte que nous avons récemment identifié une nouvelle famille de protéines interagissant avec les RCPG. Cette famille, appelée GASP, aurait une fonction importante dans la dégradation des RCPG, phénomène considéré comme un élément clé du développement de la tolérance in vivo. Durant ma thèse, je me suis intéressé aux régions des GASP et des RCPG cruciales pour l’interaction de ces deux types de protéines, identifiant ainsi un nouveau motif d’interaction protéine-protéine et développant un petit peptide capable d’inhiber cette interaction. Je me suis également intéressé à l’interaction de GASP-1 et -2 avec le récepteur muscarinique M1 à l’acétylcholine, et ses conséquences sur la dégradation de ce récepteur, montrant ainsi pour la première fois l’implication des GASP dans la régulation du trafic intracellulaire des RCPG à recyclage rapide. Finalement, j’ai exploré le rôle physiologique de GASP-1 à l’aide d’un modèle animal déficient en cette protéine. Dans un premier temps, les mécanismes adaptatifs, comportementaux et biochimiques, liés à la consommation de cocaïne ont été étudiés, montrant une diminution de l’effet hyperlocomoteur de la cocaïne chez les animaux mutants. Ces animaux présentent également une difficulté à acquérir un comportement d’autoadministration de la cocaïne qui s’accompagne d’une baisse de la densité en récepteurs dopaminergiques et muscariniques dans le striatum. Dans un deuxième temps, la régulation des rythmes circadiens a été étudiée et bien qu’aucune différence en terme de régulation du rythme de veille-éveil n’ait été décelée entre les animaux sauvages et mutants, une interaction entre les GASP et les protéines horloges Period conduisant à la modification de leur profil de localisation subcellulaire a pu être mise en évidenceG protein-coupled receptors (GPCRs), one of the most important family of proteins, are distributed at the plasma membrane and are implicated in cell communication. They represent major targets for pharmaceutical drugs and their function is tightly regulated. Recently, we identified a novel family of proteins interacting with GPCRs. This family, called GASP, could have an important function in the proteolysis of the GPCRs, which is considered as a key feature of the regulation of GPCR activity. My PhD work focused on the domains of GASPs and GPCRs that are critical for the interaction between these two kinds of proteins, identifying a novel protein-protein interaction motif and designing and developing a small peptide capable of preventing this interaction. I also focused on the interaction between GASP-1 and -2 and the acetylcholine muscarinic M1 receptor, and the consequences of this interaction on the proteolysis of this receptor, showing for the first time the implication of GASPs in the intracellular trafficking of fast recycling GPCR. Finally, I studied the physiological role of GASP-1 using transgenic animals deficient in this protein. These mice showed notably alteration in behavioral and biochemical adaptive mechanisms related to acute and prolonged administration of cocaine. The regulation of the circadian rhythms was also assessed. Despite the lack of difference in terms of sleep-activity rhythm between wild-type and mutant mice, an interaction between the GASPs and the PER clock proteins, that leads to the modification of their subcellular distribution, was observed
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Fourel, Didier. "La porine OmpF d'Escherichia Coli : assemblage et fonctions". Aix-Marseille 3, 1992. http://www.theses.fr/1992AIX30028.
Abstract (sommario):
La membrane externe des bacteries a gram negatif protege la cellule des agressions de l'environnement. Elle est constituee de lipides et de proteines. Les porines representent une classe majeure des proteines de l'enveloppe bacterienne, leur role etant d'assurer le passage des nutriments vers l'interieur de la cellule. A l'aide de sondes immunologiques, nous avons etudie l'assemblage de la porine ompf qui est synthetisee dans le cytoplasme sous forme d'un precurseur. Le peptide signal est ensuite clive et le monomere libere est tres rapidement insere dans la membrane externe sous forme d'un trimere etroitement associe au lipopolysaccharide. Au cours de ce phenomene, une etape intermediaire fait intervenir un trimere transitoire instable. A l'aide de proteines hybrides et de mutants ponctuels obtenus par mutagenese chimique, nous nous sommes interesses a la fonction recepteur de ompf. La porine est utilisee par des toxines bacteriennes, les colicines a et n, comme point d'entree dans la cellule. Les regions et acides amines participant au site recepteur ont ete definis. Avec les memes outils, nous avons aborde la topologie de la porine dans la membrane, determine les sites et acides amines participant aux epitopes, ainsi que les regions impliquees au cours de l'assemblage. Nous avons, par consequent, defini le role de regions impliquees dans l'assemblage et la fonction de la porine ompf
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Pozza, Alexandre. "Surexpression hétérologue et purification du transporteur membranaire ABCG2 : mécanisme d'interaction avec des substrats et des inhibiteurs spécifiques". Lyon 1, 2007. http://www.theses.fr/2007LYO10327.
Abstract (sommario):
ABCG2 est un demi-transporteur ABC impliqué dans le phénotype de résistance à de multiples drogues des cellules cancéreuses. Notre but est de comprendre le mécanisme de transport et d’interaction avec des inhibiteurs spécifiques. Après des tentatives infructueuses en bactérie, ABCG2 a été surexprimée sous forme fonctionnelle dans le système cellules d’insecte/baculovirus. L’effet de certains inhibiteurs sur l’activité ATPasique de la protéine a été étudié, ainsi que leur fixation sur le transporteur purifié. Cela a permis de mettre en évidence un mécanisme d’inhibition différent pour un même inhibiteur entre les formes sauvage et mutée R482T du transporteur. La différence dans le spectre des substrats transportés induite par la mutation n’est pas due à la fixation, mais plus probablement à la translocation membranaire des substrats. La protéine recombinante apparaît sous forme de deux bandes dont la différence est probablement de nature conformationelleABCG2 is an ABC half-transporter involved in multidrug resistance of cancer cells. Our aim is to understand the mechanism of transport and of interaction with specific inhibitors. After some unsuccessful attempts in bacteria, ABCG2 was functionally overexpressed with the insect cells/baculovirus system. The effects of some inhibitors on ATPase activity were studied, as well as the capacity of binding to the purified transporter. This allowed to bring evidence for a different inhibition mechanism for the same inhibitor between the wild-type and R482T mutant of the transporter. The difference in transport-substrate spectrum induced by the mutation is not due to binding, but more likely related to membrane translocation. The recombinant protein appears as two bands, the difference of which is probably of conformational origin
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Al-Dabbagh, Bayan. "Etude de deux enzymes paralogues MraY et WecA impliquées dans la biosynthèse de la paroi bactérienne, membres d’une famille de protéines membranaires Polyprényl-phosphate n-acétyl-hexosamine 1-phosphate transférases". Paris 11, 2008. http://www.theses.fr/2008PA112091.
Abstract (sommario):
L’enzyme mray catalyse la premiere etape membranaire de la biosynthese du peptidoglycane. Elle est essentielle à la viabilite de la bacterie, ce qui fait de cette enzyme une cible privilegiee pour la recherche de nouveaux antibiotiques. La topologie membranaire de mray a ete determinee. Elle est composee de 10 segments transmembranaires, 4 sequences periplasmiques, et 5 sequences cytoplasmiques contenant de nombreux residus invariants. Une partie de ce travail de these a concerne la cartographie du site actif de la translocase mray et l’etude de son mecanisme catalytique. Pour cela, dix-neuf proteines mutantes de mray de bacillus subtilis ont ete produites par mutagenese dirigee des residus invariants. Les plasmides portant ces mutations ont ete testes par complementation fonctionnelle in vivo. Quatorze proteines mutantes, qui n’assurent pas la complementation d’une souche mutante mray thermosensible, ont alors ete purifiees a homogeneite et leur analyse enzymatique a ete effectuee. Les etudes d’activite a differents ph suggerent l’implication du residu d98 dans la deprotonation de l’undecaprenyl-phosphate (c55-p) pendant la catalyse. L’activite enzymatique des proteines mutantes a differentes concentrations de mg2+ a ete determinee. Les resultats suggerent l’implication des residus d174, d177 et h45 dans la fixation du mg2+. L’etude du mecanisme catalytique de l’enzyme mray a ete entreprise. Les resultats de nos experiences supportent l’hypothese selon laquelle la formation du lipide i s’effectuerait selon un mecanisme catalytique en une etape, a savoir l’attaque directe d’un oxyanion du phosphate de l’undecaprenyl-phosphate sur le phosphate ß du substrat nucleotidique. Un autre volet de ce travail a ete consacre a l’etude de la transferase membranaire weca, paralogue de mray et membre de la meme famille d’enzymes, les polyprenyl-phosphate n-acetyl-hexosamine 1-phosphate transferases. Pour la premiere fois, nous avons reussi la surproduction, l’extraction des membranes et la purification a homogeneite de cette enzyme. Sa caracterisation biochimique a egalement ete effectuee. Une partie importante de cette these concerne l’etude et la recherche de nouveaux antibiotiques. Sur la base de la structure de la liposidomycine, un inhibiteur naturel de mray, de nouveaux composes ont ete synthetises. Les effets de ces derniers sur l’activite enzymatique de mray ont ete analyses. Une inhibition interessante a ete observee avec un de ces composes avec une ic50 de 0,58 mm. La derniere partie de cette these concerne l’etude de l’interaction entre les intermediaires lipidiques de la biosynthese du peptidoglycane et un nouveau lantibiotique produit par bacillus claucii, baptise claucine. Ce travail a ete realise par des approches de biophysique. Nous avons montre que les lipides i et ii sont des cibles de ce nouveau lantibiotique. En revanche, l’undecaprenyl-phosphate, l’udp-murnac-pentapeptide ou son analogue pyrophospho-murnac-pentapeptide n’interagissent pas avec la claucineThe mray transferase is an integral membrane protein that catalyzes an essential step of peptidoglycan biosynthesis, namely the transfer of the phospho-n-acetylmuramoyl pentapeptide motif onto the undecaprenyl phosphate carrier lipid. It belongs to a large superfamily of eukaryotic and prokaryotic prenyl sugar transferases. Nineteen polar residues located in the five cytoplasmic segments of mray appeared as invariants in the sequences of mray orthologues. A certain number of these invariant residues were found to be conserved in the whole superfamily. To assess the importance of these residues in the catalytic process, site-directed mutagenesis was performed using the bacillus subtilis mray as a model. Fourteen residues were shown to be important for mray activity by an in vivo functional complementation assay using a constructed conditional mray mutant strain. The corresponding mutant proteins were purified and biochemically characterized. None of these mutations did significantly affect the binding of both the nucleotidic and lipidic substrates, but the kcat was drastically reduced in almost all cases. The important residues for activity appeared to be distributed in all the cytoplasmic segments, indicating that these five regions contribute to the structure of the catalytic site. Our data show that the d98 residue which is invariant in the whole superfamily should be involved in the deprotonation of the lipid substrate during the catalytic process. The effects of magnesium (required for mray activity) on the activity of the wild-type and mutant proteins were tested. Moreover, our results suggest the involvement of h45, d174 and d177 residues in the binding of the metal ion. We also studied the catalytic mechanism of mray. Based on our present results, we here propose a reaction proceeding via a single displacement mechanism. In this “one-step” mechanism, the oxyanion of the undecaprenyl-phosphate attacks the β phosphate of the nucleotidic substrate leading to the formation of lipid i and the liberation of ump. During this thesis, we were also interested in studying the weca transferase, an integral membrane protein, paralogue of mray. In this thesis and for the first time, the weca protein was overproduced and purified to near homogeneity in milligram quantities. Its kinetic parameters and biochemical characterization were determined. Another aspect of our work concerned the research of new antibacterial drugs. Indeed, mray, an essential integral membrane protein is a promising potential target to be exploited for new antibacterial discovery. Based on the structure of the liposidomycin, a natural inhibitor of mray, new compounds were synthesized. Their effects on the enzymatic activity of mray were analyzed. In the case of one compound, an important inhibition was observed with an ic50 of 0. 58 mm. In the last part of this manuscript we investigated the specificity of interaction of a new type a lantibiotic, termed claucin, isolated from bacillus claucii with the lipid precursors of the peptidoglycan biosynthesis. Our data show that these lipid intermediates are the targets of this new lantibiotic. However, no interaction was observed when undecaprenyl-phosphate, udp-murnac-pentapetide and its analogue the pyrophosphate-murnac-pentapeptide were tested
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Lazrak, Tarik. "Renforcateurs membranaires : etude structurale et evolution biochimique". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1987. http://www.theses.fr/1987STR13167.
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Nicolas, François. "Les entérocytes humains peuvent trier les protéines apicales avant leur polarisation". Aix-Marseille 3, 1994. http://www.theses.fr/1994AIX30074.
Abstract (sommario):
En utilisant la lignee d'adenocarcinome colique humain ht-29 dans son etat non polarise, nous avons montre l'existence d'un tri entre l'antigene carcino-embryonnaire (ace) et la dipeptidyl-peptidase iv (dpp iv). En microscopie electronique sur coupes congelees, on observe que l'ace s'accumule dans un compartiment forme de petites vesicules independantes a l'ecart des voies de degradation et d'endocytose. La dpp iv, proteine transmembranaire, est dirigee vers la membrane plasmique et ne se rencontre a l'interieur des cellules que dans les corps multi-vesiculaires. Le compartiment vesiculaire ou s'accumule l'ace se reduit considerablement durant la polarisation de la cellule. Ces deux proteines etant ancrees differement dans les membranes, nous avons recherche l'influence du mode d'ancrage sur l'accumulation. Deux isoformes de la proteine thy-1 ont ete transfectees dans les cellules ht-29 non polarisees. La forme de thy-1 ancree par un segment transmembranaire se trouve exclusivement localisee sur la membrane plasmique. La forme de thy-1 ancree par un lien glycosyl-phosphatidyl-inositol s'accumule avec l'ace dans ce petit compartiment vesiculaire que nous proposons d'appeler compartiment gpi. Ce compartiment pourrait etre un compartiment d'accumulation des proteines glypiees en l'absence de la membrane apicale des cellules
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Mehmood, Shahid. "Caractérisation structurale de protéines membranaires par échange hydrogène/deutérium spectrométrie de masse". Phd thesis, Université de Grenoble, 2012. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00767335.
Abstract (sommario):
Des exporteurs " ATP-Binding Cassette " (ABC) sont connus pour être responsables de la résistance contre un large spectre d'agents antibiotiques ou chimiothérapeutiques chez les bactéries et les cellules de mammifères. L'échange hydrogène / deutérium associé à la spectrométrie de masse (HDX-MS) a été utilisé pour caractériser les changements conformationnels de deux exporteurs ABC bactériens, BmrA et BmrC/BmrD, en présence et en absence de nucléotide. Les cinétiques locales d'HDX ont montré la nature hautement dynamique des domaines intra-cellulaires (ICDs) dans la forme apo, ce qui n'était pas attendu d'après les structures cristallographiques aux rayons X des protéines homologues. Dans la conformation ouverte vers l'extérieur (" outward facing "), domaines fixant les nucléotides (NBDs) interagissant, le mouvement des ICDs sont largement réduits pour les deux transporteurs. Les cinétiques d'HDX MS dans la conformation " outward facing " ont été déterminées en appliquant cette technique sur des mutants incapables d'hydrolyser les nucléotides et sur la forme sauvage inhibée au vanadate. La dynamique des NBDs, en particulier pour les régions qui interagissent au cours de l'hydrolyse de l'ATP, a été aussi diminuée dans la conformation " outward facing " comparativement à celle ouverte vers l'intérieur. L'ajout de différents agents connus pour être transportés par des transporteurs ABC n'a pas affecté la dynamique des NBDs. Par ailleurs, nous avons aussi appliqué l'HDX MS à la protéine GLIC, un homologue procaryote d'un " ligand-gated ion channel " pentamérique (pLGIC). Les cinétiques locales d'HDX sont en plein accord avec la structure cristallographique disponible et le changement de pH révèle des différences de deutération dans les régions d'interaction des sous-unités.
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Majjaj, Samira. "Caractérisation d'anticorps monoclonaux dirigés contre des protéines membranaires induites par l'IFN-a". Doctoral thesis, Universite Libre de Bruxelles, 1998. http://hdl.handle.net/2013/ULB-DIPOT:oai:dipot.ulb.ac.be:2013/212079.
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Lebaupain, Florence. "Développement de l'utilisation des tensioactifs fluorés pour la biochimie des protéines membranaires". Paris 6, 2007. http://www.theses.fr/2007PA066348.
Abstract (sommario):
Ce travail porte sur l’étude de plusieurs tensioactifs (TA) per- et hémifluorés pour la manipulation de protéines membranaires (PM). Nous décrivons les propriétés physico-chimiques de ces TA, leur comportement vis-à-vis de membranes biologiques ou artificielles et leurs aptitudes à maintenir en solution des PM modèles d’origine, de structure et de fonction différentes (cytochrome b6 f, bactériorhodopsine (BR) et domaine transmembranaire de OmpA), en comparaison avec les conditions de manipulation en détergents classiques. Dans certaines conditions, lorsque la BR est transférée dans une solution contenant du TA à tête TAC, il est possible d’isoler 3 oligomères de la BR. Une forme de BR bleue monomérique est obtenue en présence de C6F-TAC. Nous avons caractérisé ces complexes et étudié plus en détails la BR bleue. Nous avons en parallèle étudié 2 applications biochimiques possibles des TA fluorés : la renaturation (BR et tOmpA) et la synthèse in vitro (canal mécanosensible MscL et BR).
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Taïb, Nada. "Etude par dynamique moléculaire des protéines membranaires dans un milieu lipidique cohérent". Bordeaux 1, 2007. http://www.theses.fr/2007BOR13468.
Abstract (sommario):
La compréhension des processus biologiques dans les membranes protéolipidiques est un défi majeur car les protéines membranaires représentent 2/3 des cibles des drogues actuelles et elles sont essentielles au fonctions importantes de la cellule. L'étude structurale des protéines membranaires étant par essence difficile et la connaissance des événements à un niveau moléculaire est rare. Nous proposons donc une étude par dynamique moléculaire qui grâce à son approche atomique nous a permis de disséquer les caractéristiques structurales : hélicité, orientation, rayon de gyration. . . , la dynamique et le comportement des protéines appelées SNARE impliquées dans la fusion membranaire au niveau des neurones. Nous nous sommes intéressés à l'étude des domaines transmembranaires, juxtamembranaires et cytosoliques de ces protéines dans différents environnements : eau, octanol et bicouche lipidique de DMPC.
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Sulaeman, Sheiam. "Rôle des protéines membranaires dans l'adaptation de Campylobacter à son environnement alimentaire". Nantes, 2011. http://www.theses.fr/2011NANT2097.
Abstract (sommario):
Campylobacter est aujourd'hui reconnu comme étant la cause majeure d'entérites bactériennes d'origine alimentaire dans le monde. Véhiculé par les aliments, ce pathogène microaérophile est capable de traverser la chaîne alimentaire, surmontant ainsi l'air ambiant qui lui est, en principe, fatal. Il doit donc développer des stratégies de survie pour atteindre le tube digestif de l'Homme. Nous avons tenté d'identifier certaines de ces stratégies, en testant sa capacité à adhérer aux surfaces inertes, ainsi qu'en étudiant le rôle des protéines membranaires dans son adaptation aux conditions oydantes. A l'aide d'une technique innovante, nous avons montré une forte variabilité intra et inter-espèces dans l'aptitude à adhérer aux surfaces de Campylobacter. Nous avons également observé une différence d'adhésion en fonction de l'environnement avec une plus forte adhésion lorsque ce pathogène était soumis à des conditions oxydantes. Une étude des sousprotéomes membranaires de C. Jejuni a permis de mettre en évidence la sur-expression de protéines impliquées dans l'adhésion aux surfaces biotiques et abiotiques ainsi que dans la virulence. Enfin, une étude complémentaire du complexome membranaire, par 2D-BN/SDS-PAGE, nous a permis d'identifier des entités fonctionnelles intervenant dans le transport des molécules et la virulence de C. JejuniCampylobacter is known to be the major cause of bacterial foodborne illness worldwide. As a foodborne microaerophilic micro-organism, this pathogen can survive transitionally throughout the food processing, surpassing the lethal ambient air. Consequently, this pathogen has to develop adaptation strategies to reach the human gut. In this study, we have explored adaptation strategies of Campylobacter by testing its capability to adhere to inert surfaces and also the role of membrane proteins under oxidative conditions. Using an innovative technique, we have demonstrated a high intra and inter-species variability in the adhesion capability to inert surfaces of Campylobacter. Different adhesion capability was also observed as a function of the environment with a higher adhesion in oxydative conditions. A subproteomic analysis on each of the two membrans of C. Jejuni indicated that some proteins involved in adhesion to biotic and abiotic surfaces and in virulence were over-expressed. Finally, an additional study of the membrane complexome, using 2D-BN/SDS-PAGE, identified functional entities involved in the molecule transport and the virulence of C. Jejuni. Taken together, these data indicate that this pathogen modifies its biological and physiological characteristics in the conditions out of its natural habitat which favours its persistence in food environment sensu lato and enhance its virulence factors
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Renaudin, Xavier. "Rôle de FANCA dans la régulation de la neddylation de protéines membranaires". Thesis, Paris 11, 2014. http://www.theses.fr/2014PA112187.
Abstract (sommario):
Le but de cette thèse était d’identifier de nouveaux substrats au complexe FANC Core,déficient dans l’Anémie de Fanconi, une pathologie génétique rare. Cette maladie estcaractérisée par un phénotype hétérogène associant une pancytopénie à des malformationscongénitales et une prédisposition accrues aux leucémies myéloïdes aigues.L’anémie de Fanconi est causée par la mutation biallélique dans un des seize gènesFANC. Les protéines produites par ces gènes participent à une même voie moléculaireimpliquée dans la signalisation des dommages de l’ADN. Huit de ces protéines forment lecomplexe FANC Core, une E3 ubiquitine ligase, dont les seuls substrats à ce jour sontFANCD2 et FANCI.Dans le but d’identifier de nouveaux substrats du complexe FANC Core, j’ai réalisé uneanalyse protéomique après immunoprécipitation des peptides modifiés par l’ubiquitine ou parles ubiquitin-like NEDD8 et ISG15. Cette expérience a été faite dans des cellules déficientespour la voie FANC, mutées sur les gène FANCA ou FANCC et comparée à des cellulescorrigées par l’expression de ces gènes.Cette analyse révèle que FANCD2 et FANCI sont les seules cibles du complexe FANCCore en réponse à des dommages de l’ADN.Néanmoins, je montre l’existence d’autres protéines qui sont modifiées d’une manièreFANCA dépendante. Ces protéines sont pour la grande majorité des protéines membranairesou associées aux membranes cytoplasmiques. Parmi celles-ci, j’ai pu déterminer que lerécepteur aux chimiokines, CXCR5, était modifié d’une manière FANCA dépendante parl’ubiquitin-like NEDD8. Cette modification impacte sur la localisation de la protéine à lamembrane et à des conséquences sur la migration des cellules.J’ai aussi montré que FANCA participe d’une manière similaire à la régulation de lalocalisation membranaire d’autres protéines comme APLP2.Ainsi, il est proposé par ce travail un rôle de la protéine FANCA en dehors du complexeFANC Core et en dehors de la réparation des dommages à l’ADN. Comment la protéineFANCA participe à la régulation du trafic des protéines membranaires reste un point nonrésolu à ce jourThe aim of this thesis was to find new substrates of the E3-ubiquitin ligase activity of theFANC Core complex, mutated in the rare genetic disorder Fanconi Anemia. This disease ischaracterized by bone marrow failure, developmental abnormalities and predisposition tocancer. Eight of the 16 known FANC proteins participate in the FANCcore nuclear complex,which has E3 ubiquitin-ligase activity and monoubiquitinates FANCD2 and FANCI inresponse to replication stress.In this thesis, I used mass spectrometry to compare cellular extracts from FANC Corecomplex deficient FA-A and FA-C cells to their ectopically corrected counterparts after agenotoxic stress.FANCD2 and FANCI appear to be the only true direct targets of the FANCcore complex.However, I also identified other proteins that undergo post-translational modifications throughFANCA- or FANCC-specific direct or indirect mechanisms that are independent of theFANCcore complex. The majority of these potential FANCA or FANCC target proteinslocalize to the cell membrane.Finally, I demonstrated that (a) the chemokine receptor CXCR5 is a neddylated protein; (b)FANCA, surprisingly, appears to modulate CXCR5 neddylation through a currently unknownmechanism; (c) CXCR5 neddylation is involved in the targeting of this receptor to the cellmembrane; and (d) CXCR5 neddylation stimulates cell migration/motility.I also confirmed that the role of FANCA in neddylation is not restrict to CXCR5 but also to,at least, one other protein, APLP2.My work has uncovered a new signaling pathway that is potentially involved in the rarehuman syndrome Fanconi Anemia and in cell motility and has highlighted a potential newfunction for the FANCA protein independant of the FANC Core complex and of a genotoxicstress
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Muller, Benjamin. "Création d'une banque de scFv-phages ciblant des protéines hydrophiles ou membranaires". Thesis, Montpellier 1, 2014. http://www.theses.fr/2014MON13511.
Abstract (sommario):
Actuellement, 60% des médicaments sur le marché ont pour cible des protéines membranaires. Toutefois, l'étude de ces protéines membranaires reste un challenge de par leur structure particulière (domaines transmembranaires hydrophobes et domaines extra- et intra-cellulaires hydrophiles), mais également par leur faible expression sur les cellules.L'entreprise Ciloa, dans laquelle j'ai effectué ma thèse, a développé une technologie brevetée, qui permet d'exprimer à la surface des exosomes, des vésicules membranaires de tailles comprises entre 30 et 100nm, des protéines membranaires natives, grâce à un peptide d'adressage, le DCTM. Cette technologie possède de nombreux domaines d'applications, comme le criblage de médicaments, le développement de vaccins ou encore le développement d'anticorps monoclonaux.L'objectif de ma thèse a été, dans un premier temps, de mettre en place l'outil exosomes recombinants grâce à la technologie de Ciloa et dans un deuxième temps, d'utiliser ces outils pour le développement d'anticorps, grâce aux exosomes recombinants.Ainsi, j'ai d'abord mis au point différentes techniques de caractérisation des exosomes recombinants (ELISA), et également participé à la mise en place de différents protocoles de production et de purification, en fonction leur utilisation. Une fois ces outils optimisés, j'ai pu les utiliser pour le développement d'anticorps. J'ai testé en parallèle deux méthodes de production d'anticorps, une méthode classique, l'hybridation lymphocytaire après immunisation de souris BALB/c, et une méthode plus récente, le criblage d'une banque de scFvs par phage display.L'hybridation lymphocytaire a permis la production d'hybridomes, dont les anticorps ont été criblés sur exosomes, par ELISA. Dans le cadre du criblage par phage display, j'ai participé au développement d'une banque de scFvs, basée sur le modèle du 13R4, dont nous avons modifié les longueurs de boucles des différents CDRs, notamment le CDRH3, afin de cibler les épitopes faiblement accessibles des protéines membranaires. Les sélections de scFvs ont été effectuées sur exosomes recombinants, exprimant des protéines membranairesNowadays, more than 60% of marketed drugs target membrane proteins. However, their study still represents a challenge, essentially due to their particular 3D-structure (hydrophobic transmembrane domains and hydrophilic extra- and intra-cellular domains), but also to their low expression level in cells.Ciloa, the start-up company in which I realized my PhD, has developed a patented technology that enables to express native membrane proteins on exosomes, membrane vesicles of 30 to 100nm, using a pilot peptide called DCTM (for Cytosolic Domain of TransMembrane). This technology displays a lot of different applications, in different domains such as drug screening, vaccines development or monoclonal antibodies (mAbs) development.The purpose of my PhD research was, first, to set up the recombinant exosomal tool using Ciloa's innovative technology, and then to use this tool to develop monoclonal antibodies.Thus, at the beginning of my PhD, I set up exosomal characterization technics, such as ELISA, and I also took part in the setup of several production and purification protocols, depending of the use of exosomes. Once these tools had been optimized, I was able to use them to develop mAbs. I tested two methods, one classical, the generation of hybridoma after Balb/c mice immunizations, and a more recent technology, the screening of scFvs library by phage display.Therefore, I obtained hybridoma and was able to screen the derived antibodies by ELISA on exosomes. Concerning the phage display technology, I took part in the development of a new scFvs library, based on the 13R4 scaffold, of which we changed the CDRs lengths, mostly the CDRH3, in order to target epitopes with low accessibility, such as the one of membrane proteins. The library screening was realized on recombinant exosomes
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Muller, Benjamin. "Création d'une banque de scFv-phages ciblant des protéines hydrophiles ou membranaires". Electronic Thesis or Diss., Montpellier 1, 2014. http://www.theses.fr/2014MON13511.
Abstract (sommario):
Actuellement, 60% des médicaments sur le marché ont pour cible des protéines membranaires. Toutefois, l'étude de ces protéines membranaires reste un challenge de par leur structure particulière (domaines transmembranaires hydrophobes et domaines extra- et intra-cellulaires hydrophiles), mais également par leur faible expression sur les cellules.L'entreprise Ciloa, dans laquelle j'ai effectué ma thèse, a développé une technologie brevetée, qui permet d'exprimer à la surface des exosomes, des vésicules membranaires de tailles comprises entre 30 et 100nm, des protéines membranaires natives, grâce à un peptide d'adressage, le DCTM. Cette technologie possède de nombreux domaines d'applications, comme le criblage de médicaments, le développement de vaccins ou encore le développement d'anticorps monoclonaux.L'objectif de ma thèse a été, dans un premier temps, de mettre en place l'outil exosomes recombinants grâce à la technologie de Ciloa et dans un deuxième temps, d'utiliser ces outils pour le développement d'anticorps, grâce aux exosomes recombinants.Ainsi, j'ai d'abord mis au point différentes techniques de caractérisation des exosomes recombinants (ELISA), et également participé à la mise en place de différents protocoles de production et de purification, en fonction leur utilisation. Une fois ces outils optimisés, j'ai pu les utiliser pour le développement d'anticorps. J'ai testé en parallèle deux méthodes de production d'anticorps, une méthode classique, l'hybridation lymphocytaire après immunisation de souris BALB/c, et une méthode plus récente, le criblage d'une banque de scFvs par phage display.L'hybridation lymphocytaire a permis la production d'hybridomes, dont les anticorps ont été criblés sur exosomes, par ELISA. Dans le cadre du criblage par phage display, j'ai participé au développement d'une banque de scFvs, basée sur le modèle du 13R4, dont nous avons modifié les longueurs de boucles des différents CDRs, notamment le CDRH3, afin de cibler les épitopes faiblement accessibles des protéines membranaires. Les sélections de scFvs ont été effectuées sur exosomes recombinants, exprimant des protéines membranairesNowadays, more than 60% of marketed drugs target membrane proteins. However, their study still represents a challenge, essentially due to their particular 3D-structure (hydrophobic transmembrane domains and hydrophilic extra- and intra-cellular domains), but also to their low expression level in cells.Ciloa, the start-up company in which I realized my PhD, has developed a patented technology that enables to express native membrane proteins on exosomes, membrane vesicles of 30 to 100nm, using a pilot peptide called DCTM (for Cytosolic Domain of TransMembrane). This technology displays a lot of different applications, in different domains such as drug screening, vaccines development or monoclonal antibodies (mAbs) development.The purpose of my PhD research was, first, to set up the recombinant exosomal tool using Ciloa's innovative technology, and then to use this tool to develop monoclonal antibodies.Thus, at the beginning of my PhD, I set up exosomal characterization technics, such as ELISA, and I also took part in the setup of several production and purification protocols, depending of the use of exosomes. Once these tools had been optimized, I was able to use them to develop mAbs. I tested two methods, one classical, the generation of hybridoma after Balb/c mice immunizations, and a more recent technology, the screening of scFvs library by phage display.Therefore, I obtained hybridoma and was able to screen the derived antibodies by ELISA on exosomes. Concerning the phage display technology, I took part in the development of a new scFvs library, based on the 13R4 scaffold, of which we changed the CDRs lengths, mostly the CDRH3, in order to target epitopes with low accessibility, such as the one of membrane proteins. The library screening was realized on recombinant exosomes
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Levy, Aurore. "Palmitoylation et trafic des protéines neuronales apparentées à la stathmine". Paris 6, 2010. http://www.theses.fr/2010PA066300.
Abstract (sommario):
A travers leur capacité à réguler la dynamique des microtubules, les phosphoprotéines apparentées à la stathmine (les stathmines membranaires) tiennent des rôles spécifiques dans la formation et la maturation du système nerveux, en particulier la stathmine 2 (SCG10) dans la croissance axonale et la stathmine 3 (SCLIP) dans le branchement neuritique. L’ensemble de ces protéines est localisé au Golgi et à des vésicules qui sont accumulées au cône de croissance. La palmitoylation de deux cystéines conservées présentes dans leur domaine d’adressage N-terminal est responsable de cette localisation membranaire. Avec l’objectif de mieux comprendre l’interconnexion entre la localisation et les fonctions des stathmines membranaires, nous avons disséqué les mécanismes impliqués dans leur palmitoylation et leur trafic. Ainsi, nous avons montré, par des approches biochimiques et de biologie cellulaire sur des neurones en culture, que la palmitoylation des stathmines membranaires a lieu au Golgi et tient une place centrale dans leur localisation et leur trafic au sein des voies d’exocytose. Nous avons également identifié les enzymes (DHHC2, 3, 7, 15, et 21) potentiellement responsables de cette palmitoylation et montré qu’elles étaient capables de stabiliser l’ancrage membranaire préalablement établi probablement par liaisons électrostatiques. Ainsi, à travers son caractère réversible et régulable, la palmitoylation permet aux stathmines de cycler entre le cytosol et leurs membranes spécifiques en réponse à des signaux extracellulaires. Cette régulation permet le transport de leurs partenaires vers des lieux qui nécessitent une régulation de la dynamique des microtubules, notamment lors de la différenciation neuronale
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Duval, Caroline. "Elaboration de dérivés du pullulane à amphiphilie contrôlée : Application à l'extraction de protéines membranaires intégrales". Rouen, 2002. http://www.theses.fr/2002ROUES003.
Abstract (sommario):
Les protéines membranaires intégrales très hydrophobes étant insolubles dans l'eau, l'emploi d'agents tensioactifs est nécessaire à leur purification et leur caractérisation en solution aqueuse. Parmi les tensioactifs récemment développés, des polymères amphiphiles synthétiques, les amphipols, présentent des potentialités intéressantes. Leur substitution par des biopolymères amphiphiles à propriétés similaires semblant très attractive, nous avons cherché à mettre au point des polysaccharides hydrophobiquement modifiés, capables d'extraire et de solubiliser des protéines membranaires dans des conditions non dénaturantes. Le polysaccharide choisi est le pullulane: hydrosoluble, flexible, sa modification chimique est bien maîtrisée. .Study of integral membrane proteins is of great importance for the understanding of cellular mechanisms, such as photosynthesis, respiration, or bacterial resistance to antibiotics. Those highly hydrophobic proteins are water insoluble; surfactants are thus necessary for their handling in aqueous solutions. Among surfactants recently developed for this use, amphiphilic polymers called amphipols display interesting potential. Amphiphilic biopolymers with similar properties would be particularly attractive. Therefore, we tried to develop hydrophobically-modified polysaccharides able to extract integral membrane proteins and to make them soluble, under non-denaturing conditions. Pullulan is a water-soluble, flexible polysaccharide. Its chemical modification is well controlled. A set of amphiphilic pullulan derivatives with moderate molar mass ( " 30 000 g. Mol-1) was prepared. Carboxymethyl groups were first introduced (0,2 to 1,2 per anhydroglucose unit) to favor water-solubility of amphiphilic derivatives. Large extents (up to 48%) of alkyl (C8 to C12) and 3-phenylpropyl hydrophobic chains were then grafted through amide or ester linkages. Amphiphilic carboxymethylpullulans display surface-active properties. Hydrophobic microdomain formation was evidenced in aqueous solution. According to the samples studied, various aggregation phenomena were observed. Some amphiphilic carboxymethylpullulans are actually able to extract membrane proteins from their lipid surrounding. Comparison of their capacities led to identify C4?18C10d (pullulan with 18% decyl groups and 91% ungrafted carboxymethyl groups) as the most efficient sample. The effect of this amphiphilic biopolymer on protein activity is similar to that of a mild detergent
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Belleannée, Clémence. "Analyse protéomique de la membrane du spermatozoïde et de son milieu environnemant au cours de la maturation épididymaire". Tours, 2006. http://www.theses.fr/2006TOUR4016.
Abstract (sommario):
Chez les mammifères, les spermatozoïdes ne sont fécondants qu’après leur transit dans l’épididyme où ils subissent des modifications biochimiques sous contrôle du milieu environnant. Ces modifications concernent essentiellement des protéines de surface peu connues car minoritaires. Chez le verrat, la mise au point d’une technique de marquage et de purification des protéines de surface a permis d’identifier par nano-LC/MS/MS plus de 170 composés. L’analyse différentielle de ces protéines par diverses approches quantitatives (electrophorèse 1D-2D, iTRAQ) en fonction des régions épididymaires a permis l’identification de nouveaux marqueurs de maturation. Cette approche a également été appliquée chez le cheval et le taureau pour une étude comparative. Chez le taureau, l’analyse des protéines présentes (protéome) et sécrétées (sécrétome) dans les différentes régions épididymaires, nous a permis d’identifier de nouvelles protéines luminales dont le rôle dans la maturation des spermatozoïdes est encore inconnu. Ces résultats ouvrent des perspectives de caractérisation individuelle de protéines candidates en relation avec l’acquisition de la fertilitéMammalian spermatozoa acquire the ability to fertilize ovocyte during their transit throught epididymis where they are submitted to biochemical modifications under environmental control. These modifications mainly concern sperm surface proteins which are minor coumpounds. In boar, we developped a methodology based on labeling, differencial extraction and purification of sperm surface proteins which allowed identification by nano-LC/MS/MS of more than 170 compounds. By the help of quantitative approaches (1D-2D electrophoresis, iTRAQ) comparative analysis of these proteins in successive epididymal regions ensured identification of biomarkers of maturation. Sperm surface proteins were caracterized in two other species: bull and horse. Thanks to analysis of remaining (proteome) and secreted (secretome) proteins in bovine fluid from different epididymal regions, new luminal proteins were identified. All together these results open perspectives in individual caracterization of proteins related to epididymal maturation and/or fertility
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Teboul, David. "Approches structurales de la protéine translocatrice TSPO par microscopie électronique". Paris 6, 2011. http://www.theses.fr/2011PA066733.
Abstract (sommario):
La protéine translocatrice TSPO exprimée dans la membrane mitochondriale externe des eucaryotes y importe le cholestérol comme précurseur des stéroïdes et sels biliaires. Notre projet consiste à déterminer sa structure par cristallisation en membrane et analyse par microscopie électronique. La cristallogenèse vise à favoriser les interactions interprotéiques dans une bicouche. Partant d’une protéine solubilisée en détergent en présence de lipides, le détergent est éliminé et de nombreuses conditions ont été testées pour obtenir des cristaux. Lors de l’optimisation des paramètres de cristallisation en solution (ratio lipides/protéine, conditions physicochimiques…) seuls des protéoliposomes non cristallins de plusieurs centaines de nanomètres, riches en TSPO, ont été observés. Une nouvelle approche de cristallisation sous une mononocouche lipidique fonctionnalisée a été tentée. Vu que la présence de détergents déstabilise les monocouches, des lipides fluorés moins sensibles aux détergents ont été testés. Des mesures de tension de surface, d’ellipsométrie et de microscopie à l’angle de Brewster ont permis le suivi des effets des détergents, de l’adsorption de la TSPO et des lipides. Des images de la TSPO liée à une monocouche de lipides carbonés montre des objets circulaires et creux au centre. Leur analyse en particules isolées a donné deux formes moyennes, mais la résolution actuelle ne permet pas de déterminer s’il s’agit de conformations ou d’orientations différentes de la protéine en membrane. Les perspectives d’obtention d’une structure de la TSPO par cristallisation bidimentionnelle sont discutées (orthologues, ligands, cocristallisation)
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Rajas, Fabienne. "Étude des espèces moléculaires impliquées dans l'association des lysosomes et endosomes aux microtubules". Lyon 1, 1993. http://www.theses.fr/1993LYO1T086.
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Chirivino, Dafne. "Rôle de l’ezrine dans l’endocytose et la stabilité des récepteurs de type tyrosine kinase". Paris 11, 2009. http://www.theses.fr/2009PA112281.
Abstract (sommario):
L’ezrine appartient à la famille des protéines ERM. Ces protéines assurent la liaison entre la membrane plasmique et le cytosquelette d’actine. L’ezrine est impliquée dans le trafic de protéines membranaires, cependant sa fonction dans ce processus n’est pas connue à ce jour. Des cribles doubles hybrides utilisant l’ezrine comme appât ont permis l’identification de protéines impliquées dans le transport de protéines membranaires. Nous avons étudié la fonction de l’interaction de l’ezrine avec la sous unité Vps11 du complex HOPS et WWP1, une ubiquitine ligase de type E3. Le complexe HOPS orchestre la fusion de compartiments intracellulaires car il coordonne les activités des protéines Rab et SNARE. Nous avons étudié comment l’interaction de l’ezrine avec Vps11 régule le transport du récepteur de l’EGF vers la voie de dégradation par les lysosomes. Nous avons montré que cette interaction promeut la maturation des endosomes et qu’elle est nécessaire au transport du récepteur à l’EGF des endosomes précoces aux tardifs ainsi participant à la régulation de la dégradation du récepteur à l’EGF. WWP1 a été impliquée dans la régulation et la dégradation des récepteurs aux facteurs de croissance ainsi que des facteurs de transcription. Nous avons montré que l’interaction entre l’ezrine et WWP1 induit l’ubiquitylation de l’ezrine sans toutefois entraîner sa dégradation. Nous avons montré que l’interaction de l’ezrine avec WWP1 stabilise le récepteur c-Met. Nos résultats indiquent que l’ezrine participe au contrôle de la dégradation des récepteurs de type tyrosine kinase en régulant l’assemblage de complexes multiprotéiques impliqués dans le transport et l’ubiquitylation des protéinesEzrin is a member of the ERM protein family, which provides a regulated linkage between the plasma membrane and the actin cytoskeleton. Ezrin has been involved in the trafficking of membrane proteins however its function in this process is as of yet unknown. Two-hybrid screens performed with ezrin as baits led to the identification of proteins involved in membrane protein transport. We analyzed the function of ezrin association with two new interactors: the HOPS complex subunit Vps11 and the E3 ubiquitin ligase WWP1. Vps11 is a member of the tethering HOPS complex that coordinates Rab and SNARE functions during vesicular fusion along the endocytic pathway. We have investigated the role of ezrin/Vps11 interaction in the endocytosis of the EGF receptor. We have shown that the interaction between ezrin and the HOPS complex promotes endosome maturation and is necessary for EGF receptor transport from early to late endosomes, therefore participating in the regulation of EGFR endocytosis and degradation. WWP1 is an E3 ubiquitin ligase of the Nedd4 family. A role for WWP1 was identified in the regulation and degradation of growth factors receptors and transcription factors. We have shown that Ezrin/WWP1 interaction results in ezrin ubiquitylation, but is not involved in regulating ezrin degradation. Rather, we were able to show that this ubiquitylation likely mediates protein interaction and that the binding between ezrin and WWP1 promotes c-Met receptor stabilization. Altogether our results indicate that ezrin participates in the control of tyrosine kinase receptor degradation by regulating the assembly of multimeric complexes involved in protein trafficking and ubiquitylation
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Mekpoh, Flavien. "Signalisation Nodal à courte et longue distance chez l'oursin Paracentrotus lividus : rôles potentiels de Cripto, d'Univin et d'une modification post-traductionnelle". Paris 6, 2012. http://www.theses.fr/2012PA066664.
Abstract (sommario):
Le TGF-beta Nodal joue un rôle essentiel au cours du développement de nombreux organismes. Dans l'embryon d'oursin, Nodal agit en amont d'une cascade de régulations génétiques contrôlant la régionalisation de l'ectoderme le long de l'axe dorso-ventral. Nodal est exprimé très tôt dans l'ectoderme présomptif ventral où son activité est requise pour la spécification de l'ectoderme ventral et dorsal. Dans ce contexte, tout indique que Nodal agit à courte distance, limitée par son antagoniste Lefty. Cependant, de récentes études ont montré que Nodal joue également un rôle sur la régionalisation des précurseurs du mésoderme au pole végétatif de l'embryon, domaine éloigné du territoire d'expression de Nodal. Au cours de ma thèse, j'ai tenté de clarifier les mécanismes par lesquels Nodal signale à distance chez l'oursin en analysant les rôles de deux facteurs susceptibles de moduler l'activation de la voie de signalisation Nodal. Le premier facteur est Cripto, une protéine membranaire de la famille des EGF-CFC qui, chez les vertébrés, agit comme un corécepteur de Nodal et qui est en même temps la cible de l'antagoniste de Nodal: Lefty. En outre, nous avons analysé le rôle du ligand TGF-beta, Univin, un orthologue de Vg1/GDF1, et l'effet d'une modification post-traductionnelle de Nodal sur sa capacité à signaler à distance. Pris dans leur ensemble, les résultats de ces études suggèrent que des partenaires tels que Cripto ou Univin, mais aussi les modifications post-traductionnelles telles que des glycosylation, peuvent potentialiser l'activité du signal Nodal et donc jouer un rôle majeur dans la régulation de la signalisation Nodal à distanceTGF-beta family member Nodal plays essential roles in the development of many organisms. In the sea urchin embryo, Nodal acts upstream of gene regulatory network controlling the regionalization of the ectoderm along the dorsal-ventral axis. Nodal is expressed very early in the presumptive ventral ectoderm where its activity is required for specification of the ventral and dorsal ectoderm. In this context, there is evidence that Nodal activity is limited to the ectoderm by its antagonist Lefty. However, recent studies have shown that Nodal also plays a role in the regionalization of the mesoderm precursors in vegetative pole of the embryo, territory distant from Nodal expression domain. In my thesis, I have attempted to clarify the mechanisms by which Nodal signals over long range, using the sea urchin, by analyzing the roles of different factors that modulate the activity of the Nodal signaling pathway. The first factor is Cripto, a membrane protein of the EGF-CFC family. In vertebrates, Cripto acts as a coreceptor for Nodal, which is also the target of the Nodal antagonist: Lefty. In addition, we analyzed the role of TGF-beta ligand, Univin, an ortholog of Vg1/GDF1, and the effect of post-translational modification of Nodal on its ability to signal over long-range. Taken together, results of these studies suggest that partners such as Cripto or Univin, but also post-translational modifications such as glycosylation, may potentiate the activity of Nodal signaling and therefore play a major role in regulating Nodal long-range signaling
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Medina, Emmanuelle. "Identification du réseau moléculaire associé à la protéine CRUMBS : Implication pour sa fonction dans la morphogenèse des cellules épithéliales chez la drosophile". Aix-Marseille 2, 2003. http://www.theses.fr/2003AIX22018.