Tesi: "Enzymologie structurale"

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Contet, Alicia. "Caractérisation biochimique et biophysique des deux cytidylyltransférases de Plasmodium falciparum, enzymes clés du métabolisme des phospholipides". Thesis, Montpellier, 2015. http://www.theses.fr/2015MONTS085.

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Abstract (sommario):

Le paludisme est causé par l'infection et la destruction des érythrocytes par les parasites protozoaires appartenant au genre Plasmodium. Au cours de son développement dans l'érythrocyte,Plasmodium falciparum requiert la biosynthèse massive de membranes dont les principaux constituants lipidiques sont des phospholipides. La phosphatidylcholine (PC) et la phosphatidyléthanolamine (PE) représentent à elles deux environ 80 % des lipides membranaires et l'inhibition de leur biosynthèse est létale pour le parasite. La PC et la PE sont synthétisées par le parasite, principalement via les voies de novo dépendantes de la CDP-choline et de la CDP-éthanolamine (ou voies de Kennedy) en utilisant respectivement la choline et l'éthanolamine comme précurseurs. Ces travaux de thèse se focalisent sur les deux enzymes CTP:phosphocholine etCTP:phosphoéthanolamine cytidylyltransférase (PfCCT et PfECT, respectivement), catalysant les étapes limitantes des voies de Kennedy. Chez Plasmodium, les CCT et ECT possèdent deux domaines cytidylyltransférases (CT) portant l'activité catalytique, séparés par une longue région de liaison. Pour la CCT, cette duplication est retrouvée seulement chez trois organismes, tous faisant partie du phylumdes Apicomplexes : Babesia, Theileria et Plasmodium, alors que la présence de deux domaines CT estune caractéristique retrouvée chez toutes les ECT étudiées à ce jour. La première partie de ce travail de thèse concerne la caractérisation biochimique et l'inhibition la PfCCT Nous avons montré que les deux domaines CT de la PfCCT sont actifs à l'inverse de la PfECT pour laquelle seul le domaine CTN-terminal est catalytiquement actif. A la suite d'un criblage virtuel basé sur la structure de l'enzyme,nous avons identifié un composé princeps capable d'inhiber l'activité de la PfCCT in vitro, la synthèse de PC et la croissance parasitaire. Ce premier composé actif (haut µM) représente une base pour l'optimisation future de nouveaux composés plus efficaces. Dans la deuxième partie de cette thèse,nous avons déterminé le mécanisme catalytique, la spécificité de liaison des ligands et l'organisation structurale de la PfECT grâce à la combinaison d'approches biochimiques et biophysiques. L'ensemble des résultats présentés dans ce manuscrit apportent un éclairage important concernant le fonctionnement de ces deux cibles potentielles et constituent des étapes essentielles à l'élaboration d'une approche thérapeutique
Malaria is caused by the infection and destruction of red blood cells by protozoan parasitesbelonging to the genus Plasmodium. During its intra-erythrocytic development, Plasmodiumfalciparum requires massive biosynthesis of membranes which are mainly composed of phospholipids.Phosphatidylcholine (PC) and phosphatidylethanolamine (PE) together represent about 80% of thetotal membrane lipids and inhibition of their biosynthesis leads to parasite death. PC and PE aresynthesized by the parasite's machinery mainly through the de novo CDP-choline and CDPethanolamine(Kennedy) pathways using respectively choline and ethanolamine as precursors. Thisstudy focuses on the rate limiting steps of these pathways catalyzed by CTP:phosphocholine andCTP:phosphoethanolamine cytidylytransferases (PfCCT and PfECT, respectively). In Plasmodiumspecies, both CCT and ECT contain two catalytic cores (CT domains) separated by a long linker.Interestingly, for CCT this feature is found only in three organisms, all from the phylum ofApicomplexa: Babesia, Theileria and Plasmodium, whereas the presence of two CT domains is ageneral feature in all ECTs known so far. The first part of this work consists in the biochemicalcharacterization of PfCCT and the investigation of its druggability. We showed that both PfCCT CTdomains are active and display similar kinetic parameters while only the N-terminal CT domain wasactive in PfECT. Subsequent to an in silico structure-based screening of compounds libraries, weidentified a PfCCT inhibitor able to inhibit PC synthesis as well as P. falciparum growth in vitro in thehigh µM range. This compound represents a first step toward the optimization of future more potentcompounds. In the second part of this study, we investigated the catalytic mechanism of PfECT anddeciphered its interactions with its ligands using biochemical, biophysical and structural approaches.Collectively, these results bring new insights into the biochemical and structural properties of thesetwo keys enzymes of the phospholipid metabolism in P. falciparum and pave the way for their futuredevelopment as potential drug target

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Bou, Nader Charles. "Structural and Functional characterization of flavoenzymes involved in posttranscriptional modification of tRNA". Thesis, Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066205/document.

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Abstract (sommario):

La modification posttranscriptionnelle des acides ribonucléiques (ARNs) est une étape de maturation conservée dans tous les domaines du vivant. Mes travaux de thèse ont porté sur la caractérisation fonctionnelle et structurale de flavoenzymes impliquées dans la modification des ARN de transfert (ARNt) : les dihydrouridines synthases (Dus) dictant la formation de dihydrouridine via la flavine mononucléotide (FMN) et TrmFO responsable de la méthylation en C5 de l'uridine 54 via la flavine adénosine dinucléotide (FAD) ainsi que le methylènetétrahydrofolate. Afin d'élucider le mécanisme de TrmFO, nous avons élaboré une apoenzyme grâce à une simple mutation qui est efficacement reconstituée in vitro. Nous avons chimiquement synthétisé l'intermédiaire catalytique qui consiste en un FAD-iminium comportant un methylène sur le N5 de l'isoalloxazine. Cette espèce synthétique a été caractérisée par spectrométrie de masse et absorption UV-visible. La reconstitution de TrmFO avec cette molécule restore l'activité in vitro sur un ARNt transcrit prouvant le rôle du FAD comme agent méthylant via une méthylation réductrice. Dus2 réduit spécifiquement U20 et est constituée d'un Dus domaine néanmoins, chez les mammifères un double-stranded RNA-binding domaine (dsRBD) est présent. Afin de comprendre la fonction de cette organisation modulaire, nous avons montré que seule l'enzyme sauvage est active contrairement aux domaines isolés. Nous avons résolu les structures cristallographiques des deux domaines suggérant une redistribution des charges positives en surface. Ce dsRBD dicte la reconnaissance de l'ARNt en se fixant à la tige acceptrice/Tpsi. Ceci est régulé par une extension N-terminal, mis en évidence par des mutations, des titrations RMN ainsi qu’une structure cristallographique en complexe avec un ARN de 22 nucléotides. Ce travail illustre l’acquisition d’un dsRBD au cours de l’évolution dont la fonction est étendu à la reconnaissance des ARNts
Posttranscriptional modification of ribonucleic acids (RNAs) is a crucial maturation step conserved in all domains of life. During my thesis, I have brought structural and functional insights on flavoenzymes involved in transfer RNA (tRNA) modifications: dihydrouridine synthase (Dus) responsible for dihydrouridine formation using flavin mononucleotide (FMN) and TrmFO responsible for C5 methylation of uridine position 54 relying on flavin adenosine dinucleotide (FAD) and methylenetetrahydrofolate. To elucidate the chemical mechanism of TrmFO we designed an apoprotein via a single mutation that could be reconstituted in vitro with FAD. Furthermore, we chemically synthesized the postulated intermediate active species consisting of a flavin iminium harboring a methylene moiety on the isoalloxazine N5 that was further characterized by mass spectrometry and UV-visible spectroscopy. Reconstitution of TrmFO with this molecule restored in vitro activity on a tRNA transcript proving that TrmFO uses FAD as a methylating agent via a reductive methylation.Dus2 reduces U20 and is comprised of a canonical Dus domain however, mammals have an additional double-stranded RNA-binding domain (dsRBD). To bring functional insight for this modular organization, we showed that only full length human Dus2 was active while its isolated domains were not. tRNA recognition is driven by the dsRBD via binding the acceptor and TΨ stem of tRNA with higher affinity then dsRNA as evidenced by NMR. We further solved the X-ray structures for both domains showing redistribution of surface positive charges justifying the involvement of this dsRBD for tRNA recognition in mammalian Dus2. This was attributed to a peculiar N-terminal extension proven by mutational analysis and an X-ray structure of dsRBD in complex with 22-nucleotide dsRNA. Altogether our work illustrates how during evolution, Dus2 enzymes acquired an engineered dsRBD for efficient tRNA binding via a ruler mechanism

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Moissonnier, Loïck. "Etude fonctionnelle et structurale du transporteur de multiple drogues, BmrA, en condition d’équilibre et en temps résolu. Caractérisation structurale de BmrA en liposome par cryoEM". Electronic Thesis or Diss., Lyon 1, 2024. http://www.theses.fr/2024LYO10213.

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Abstract (sommario):

Selon l’organisation mondiale de la santé, la résistance aux antibiotiques est un problème majeur pour l’humanité en raison de l’émergence de bactérie multi-résistantes. L’émergence de ces résistances chez les bactéries provient du fait qu’elles sont capables de mettre en place de nombreuses stratégies pour empêcher les antibiotiques de fonctionner. En particulier, la première ligne de défense de ces bactéries est la surexpression de transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette) qui expulsent les antibiotiques en dehors de la cellule bactérienne, diminuant leurs concentrations sous leurs seuils de cytotoxicité. Plus de 50 ans d’étude sur ces transporteurs ont permis à la communauté scientifique d’établir un mécanisme global, notamment grâce à l’acquisition de structures 3D de plus en plus nombreuses. Ceci a été intimement lié par l’évolution technologique et méthodologique de la biologie structurale ces dernières années avec notamment l’émergence de la cryoEM. Plus les connaissances avancent plus les questions deviennent précises, et il demeure toujours de nombreuses questions sur la compréhension de leur fonctionnement. Dans le cadre de mon projet, j’ai étudié BmrA, l’un de ces transporteur ABC exprimé chez Bacillus subtilis qui lui confère une résistance à la cervimycine C, un antibiotique sécrété par Streptomyces tendae son compétiteur naturel dans le même biotope. De plus, ce transporteur est capable de fixer et de transporter une grande variété de molécules dont de nombreux antibiotiques en adoptant à la fois une conformation prenant en charge le ligand (IF, conformation ouverte vers l’intérieur de la cellule), et une conformation ouverte vers l’extérieur de la cellule (OF) pour le relarguer. Cette capacité de manipuler plusieurs molécules reste une question très discutée, surtout dans la compréhension du mécanisme de transport au niveau moléculaire. Au cours de ma thèse, j’ai participé à une étude d’enzymologie structurale sur un mutant inactif E504A en présence de ligands (Rhodamine 6G, Hœchst 33342) afin d’améliorer les connaissances sur ce mécanisme. Ces ligands jouent un rôle d’effecteur allostérique sur la fixation d’ATP de BmrA, impactant la transition entre les conformations IF et OF. La résolution de plusieurs structures 3D par cryoEM a été réalisé en variant la concentration d’ATP. Une analyse de la flexibilité de chacune de ces conformations a mis en lumière les réarrangements moléculaires que BmrA peut adopter pour assurer sa poly-spécificité. De plus, j’ai apporté de nombreuses informations fonctionnelles en ce qui concerne le couplage entre le transport du ligand et l’activité ATPasique de ce transporteur. La deuxième partie de mes travaux repose sur l’étude de la transition conformationnelle se produisant chez BmrA après la fixation d’ATP à l’aide de techniques dites « en temps résolu ». L’objectif a été de suivre ces changements conformationnels au cours du temps grâce à la fluorescence intrinsèque de BmrA couplée à la cryoEM. J’ai développé et optimisé les conditions expérimentales pour réaliser cette étude, et notamment acquis des informations cinétiques et dynamiques sur des mutants ainsi que la protéine sauvage.Enfin, la dernière partie du manuscrit a consisté à reconstituer BmrA dans un environnement amphipathique plus natif que les détergents afin d’acquérir sa structure 3D par cryoEM. J’ai optimisé ce protocole de reconstitution pour obtenir le meilleur échantillon possible à déposer sur grille. Au cours de ce processus, j’ai caractérisé la formation du protéoliposome à chaque étape du protocole en l’observant par cryoEM. Grâce à cette étude, j’ai pu obtenir les premières classes 2D de BmrA en bicouche lipidique. En conclusion, cette thèse offre une nouvelle façon d’étudier la relation structure-fonction des protéines en développant des outils et une méthodologie d’enzymologie structurale pour visualiser la dynamique de ce transporteur ABC, ainsi qu’une première approche pour l’étudier en liposome
According to the World Health Organization, antibiotic resistance is a major problem for humanity due to the emergence of multiresistant bacteria. The emergence of these resistances in bacteria is due to their ability to implement numerous strategies to prevent antibiotics from working. In particular, the first line of defense of these bacteria is the overexpression of ABC (ATP-Binding Cassette) transporters, which expel antibiotics out of the bacterial cell, reducing their concentrations below their cytotoxic thresholds. Over 50 years of study on these transporters have enabled the scientific community to establish a global mechanism, particularly thanks to the increasing acquisition of 3D structures. This has been closely linked to the technological and methodological evolution of structural biology in recent years, especially with the emergence of cryoEM. As knowledge advances, the questions become more precise, and many questions remain about understanding their functioning. As part of my project, I studied BmrA, one of these ABC transporters expressed in Bacillus subtilis, which confers resistance to cervimycin C, an antibiotic secreted by Streptomyces tendae, its natural competitor in the same biotope. Additionally, this transporter is capable of binding and transporting a wide variety of molecules, including many antibiotics, by adopting both a conformation that takes up the ligand (IF, inward-facing conformation) and an outward-facing conformation (OF) to release it. This ability to handle multiple molecules remains a highly debated question, especially in understanding the transport mechanism at the molecular level. During my Ph.D., I participated in a structural enzymology study on an inactive E504A mutant in the presence of ligands (Rhodamine 6G, Hoechst 33342) to improve knowledge of this mechanism. These ligands act as allosteric effectors on the ATP binding of BmrA, impacting the transition between IF and OF conformations. The resolution of several 3D structures by cryoEM was achieved by varying the concentration of ATP. An analysis of the flexibility of each of these conformations highlighted the molecular rearrangements that BmrA can adopt to ensure its polyspecificity. Moreover, I provided numerous functional insights regarding the coupling between ligand transport and the ATPase activity of this transporter. The second part of my work focused on studying the conformational transition occurring in BmrA after ATP binding using so-called "time-resolved" techniques. The objective was to monitor these conformational changes over time using the intrinsic fluorescence of BmrA coupled with cryoEM. I developed and optimized the experimental conditions to conduct this study, particularly acquiring kinetic and dynamic information on mutants as well as the wild-type protein. Finally, the last part of the manuscript involved reconstituting BmrA in a more native amphipathic environment than detergents to obtain its 3D structure by cryoEM. I optimized this reconstitution protocol to obtain the best possible sample for grid deposition. During this process, I characterized the formation of the proteoliposome at each stage of the protocol by observing it with cryoEM. Thanks to this study, I was able to obtain the first 2D classes of BmrA in a lipid bilayer. In conclusion, this thesis offers a new way to study the structure-function relationship of proteins by developing structural enzymology tools and methodology to visualize the dynamics of this ABC transporter, as well as a first approach to studying it in liposomes

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Kubiak, Xavier. "Etude fonctionnelle et structurale d'arylamine N-acetyltransferases atypiques chez Legionella pneumophila et Bacillus cereus". Paris 7, 2012. http://www.theses.fr/2012PA077080.

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Abstract (sommario):

Les arylamine N-acétyltransférases (NATs) sont des enzymes du métabolisme des xénobiotiques ayant un rôle essentiel dans la biotransformation de composés de type aminé aromatique (polluants, médicaments, pré-carcinogènes, etc. ). La structure tridimensionnelle des NATs caractérisées révèle des caractéristiques structurales communes, dont une triade catalytique Cys-His-Asp strictement conservée. Legionella pneumophila et Bacillus cereus sont deux bactéries pathogènes constituant un problème majeur de santé publique. L pneumophila est l'agent étiologique de la légionellose, une pneumopathie sévère, tandis que B. Cereus est responsables de très nombreuses intoxications alimentaires. Ces deux organismes sont ubiquitaires respectivement des milieux aquatiques et des sols, niches qui représentent des lieux d'exposition à des aminés aromatiques. Ces travaux de thèse révèlent l'existence chez L, pneumophila et B, cereus de NATs aux propriétés atypiques en comparaison des isoformes connues à ce jour. L'étude des séquences de NATs issues de trois souches cliniques de L pneumophila montre l'existence d'une hétérogénéité génétique inhabituelle qui affecte les propriétés catalytiques et structurales des trois variants enzymatiques. L'étude in vivo d'une souche delétée du gène nat révèle l'existence d'une voie de détoxication NAT-dépendante des aminés aromatiques chez L. Pneumophila. Chez B. Cereus, nous avons identifié une nouvelle isoforme NAT dont la triade catalytique contient un glutamate au lieu de Paspartate canonique. Nos résultats montrent contre toute attente que cette isoforme est active et correctement repliée. La résolution de la structure 3D de cette nouvelle isoforme révèle une grande similarité de topologie et d'orientation de la triade avec celles de NATs classiques. L'ensemble de ces données suggère l'existence d'une diversité fonctionnelle et structurale bien plus importante que prévue au sein de cette famille d'enzyme
Arylamine N-acetyltransferases (NATs) are xenobiotic metabolizing enzymes involved in the biotransformation of a wide range of aromatic amine chemicals (pollutants, drugs, pre-carcinogens). The 3D structure of NATs has been recently solved and all NATs characterized to date share the same structural features, including a strictly conserved Cys-His-Asp catalytic triad. Legionella pneumophila and Bacillus cereus are two bacterial pathogens that constitute a public health issue both in France and in the world. L. Pneumophila is the etiologic agent of legionellosis, a severe pneumonia, while B, cereus is responsible for a high number of foodborne intoxications. These two organisms are ubiquitous of aquatic environments and soils, respectively, which provide a risk of exposure to aromatic amine compounds. Our work is focused on L. Pneumophila and B. Cereus NAT isoforms that exhibit atypical features compared to isoforms characterized so far. The study of NATs sequences from three clinical strains of L. Pneumophila reveals several amino acid variations between strains. This unusual sequence heterogeneity leads to variations in catalytic and structural properties in the three variants. The characterization of a nat knock-out strain reveals that L pneumophila possesses in vivo a NAT-dependent detoxification pathway of aromatic amines chemicals. We also demonstrate the existence of a new NAT isoform in B. Cereus that lacks the canonical catalytic triad. Indeed, (BACCR)NAT3 has a glutamate instead of an aspartate at the catalytic position. Against ail expectations this isoform is active and correctly folded. Interestingly, the 3D structure of the enzyme has been solved and shows a classic NAT fold and catalytic triad geometry compared to classical NAT enzymes. Taken together, these results suggest a greater functional and structural diversity than expected in this enzyme family

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Bou, Nader Charles. "Structural and Functional characterization of flavoenzymes involved in posttranscriptional modification of tRNA". Electronic Thesis or Diss., Paris 6, 2017. http://www.theses.fr/2017PA066205.

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Abstract (sommario):

La modification posttranscriptionnelle des acides ribonucléiques (ARNs) est une étape de maturation conservée dans tous les domaines du vivant. Mes travaux de thèse ont porté sur la caractérisation fonctionnelle et structurale de flavoenzymes impliquées dans la modification des ARN de transfert (ARNt) : les dihydrouridines synthases (Dus) dictant la formation de dihydrouridine via la flavine mononucléotide (FMN) et TrmFO responsable de la méthylation en C5 de l'uridine 54 via la flavine adénosine dinucléotide (FAD) ainsi que le methylènetétrahydrofolate. Afin d'élucider le mécanisme de TrmFO, nous avons élaboré une apoenzyme grâce à une simple mutation qui est efficacement reconstituée in vitro. Nous avons chimiquement synthétisé l'intermédiaire catalytique qui consiste en un FAD-iminium comportant un methylène sur le N5 de l'isoalloxazine. Cette espèce synthétique a été caractérisée par spectrométrie de masse et absorption UV-visible. La reconstitution de TrmFO avec cette molécule restore l'activité in vitro sur un ARNt transcrit prouvant le rôle du FAD comme agent méthylant via une méthylation réductrice. Dus2 réduit spécifiquement U20 et est constituée d'un Dus domaine néanmoins, chez les mammifères un double-stranded RNA-binding domaine (dsRBD) est présent. Afin de comprendre la fonction de cette organisation modulaire, nous avons montré que seule l'enzyme sauvage est active contrairement aux domaines isolés. Nous avons résolu les structures cristallographiques des deux domaines suggérant une redistribution des charges positives en surface. Ce dsRBD dicte la reconnaissance de l'ARNt en se fixant à la tige acceptrice/Tpsi. Ceci est régulé par une extension N-terminal, mis en évidence par des mutations, des titrations RMN ainsi qu’une structure cristallographique en complexe avec un ARN de 22 nucléotides. Ce travail illustre l’acquisition d’un dsRBD au cours de l’évolution dont la fonction est étendu à la reconnaissance des ARNts
Posttranscriptional modification of ribonucleic acids (RNAs) is a crucial maturation step conserved in all domains of life. During my thesis, I have brought structural and functional insights on flavoenzymes involved in transfer RNA (tRNA) modifications: dihydrouridine synthase (Dus) responsible for dihydrouridine formation using flavin mononucleotide (FMN) and TrmFO responsible for C5 methylation of uridine position 54 relying on flavin adenosine dinucleotide (FAD) and methylenetetrahydrofolate. To elucidate the chemical mechanism of TrmFO we designed an apoprotein via a single mutation that could be reconstituted in vitro with FAD. Furthermore, we chemically synthesized the postulated intermediate active species consisting of a flavin iminium harboring a methylene moiety on the isoalloxazine N5 that was further characterized by mass spectrometry and UV-visible spectroscopy. Reconstitution of TrmFO with this molecule restored in vitro activity on a tRNA transcript proving that TrmFO uses FAD as a methylating agent via a reductive methylation.Dus2 reduces U20 and is comprised of a canonical Dus domain however, mammals have an additional double-stranded RNA-binding domain (dsRBD). To bring functional insight for this modular organization, we showed that only full length human Dus2 was active while its isolated domains were not. tRNA recognition is driven by the dsRBD via binding the acceptor and TΨ stem of tRNA with higher affinity then dsRNA as evidenced by NMR. We further solved the X-ray structures for both domains showing redistribution of surface positive charges justifying the involvement of this dsRBD for tRNA recognition in mammalian Dus2. This was attributed to a peculiar N-terminal extension proven by mutational analysis and an X-ray structure of dsRBD in complex with 22-nucleotide dsRNA. Altogether our work illustrates how during evolution, Dus2 enzymes acquired an engineered dsRBD for efficient tRNA binding via a ruler mechanism

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Nusbaum, Julien. "Caractérisation structurale et fonctionnelle de la peptide déformylase du phage Vp16T". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS510/document.

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Abstract (sommario):

Les protéines en cours de synthèse subissent des modifications très précoces de leur extrémité N-terminale, dès lors que celle-ci émerge du tunnel de sortie du ribosome. La première modification est l’excision de la méthionine initiatrice, assurée par une méthionine aminopeptidase (MetAP), précédée de sa déformylation par une enzyme peptide déformylase (PDF) chez les bactéries et dans les mitochondries et chloroplastes. Ce processus est ubiquitaire et essentiel, et a été décrit dans tout le règne du vivant. Chez les bactéries, les PDFs de type 1B se fixeraient au ribosome à proximité de l’extrémité du tunnel de sortie du peptide naissant, via son hélice α C-terminale. Or des analyses métagénomiques récentes ont révélé la présence insoupçonnée de gènes codant des PDFs putatives chez des virus marins. De manière inattendue, toutes les PDF virales présentent des séquences C-terminales très courtes et dépourvues de l’hélice α3. L’identification de ces PDFs atypiques soulève alors de nouvelles questions quant à leur possible interaction au ribosome et à leur fonction biologique. L’objectif de ma thèse a donc été de réaliser la caractérisation complète et intégrée de la peptide déformylase du bactériophage Vp16T, dont la séquence est l’une des plus courtes connues à ce jour. J’ai montré que le phage Vp16T code une protéine active, in vivo et in vitro, et qu’elle peut se lier au ribosome malgré l’absence d’hélice α C-terminale. La caractérisation structure-fonction de Vp16PDF a révélé des caractéristiques uniques qui pourraient alors expliquer sa fonction au cours de la réplication du phage. Ainsi j’ai montré que l’expression de Vp16PDF chez E. coli modifie la structure de l’enveloppe, induit l’accumulation d’agrégats et finalement inhibe la croissance bactérienne. De plus, l’étude de souches bactériennes mutantes a montré que Vp16PDF interfère spécifiquement avec le repliement et l’adressage de protéines membranaires. Cette dernière fonction pourrait permettre de déstabiliser la membrane de l’hôte et ainsi favoriser la libération des particules virales
Being synthesized proteins undergo very early changes in their N-terminal end, since it emerges from the outlet channel of the ribosome. The first modification is the excision of the initiator methionine, provided by a methionine aminopeptidase (MetAP), preceded by its deformylating enzyme peptide deformylase (PDF) in bacteria and in mitochondria and chloroplasts. This process is ubiquitous and essential, and has been described in the kingdom of life. In bacteria, Type 1B PDFs would bind to the ribosome near the end of the outlet tunnel of the nascent peptide via its C-terminal helix α. But recent metagenomic analyzes revealed the unexpected presence of genes encoding putative PDFs in marine viruses. Unexpectedly, all viral PDF have very short C-terminal sequences and lacking the α3 helix. The identification of these atypical PDFs then raises new questions about their possible interaction with ribosome and their biological function. The aim of my thesis was therefore to achieve the complete and integrated characterization of peptide deformylase bacteriophage Vp16T, the sequence is one of the shortest known to date. I showed that the phage Vp16T code an active protein in vivo and in vitro, and can bind to the ribosome despite the absence of the C-terminal helix α. The structure-function characterization Vp16PDF revealed unique features that could then explain its function in the replication of the phage. Thus I have shown that expression in E. coli Vp16PDF modifies the envelope structure, induces accumulation of aggregates and ultimately inhibits bacterial growth. In addition, the study of mutant bacterial strains showed that Vp16PDF specifically interfere with the folding and addressing of membrane proteins. This latter function could help destabilize the membrane of the host and thereby promote release of viral particles

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Bazeille, Nicolas. "Caractérisation structurale et fonctionnelle de l’hélicase du syndrome de Bloom et analyse de la toxicité du cadmium sur cette enzyme". Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA112340.

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Abstract (sommario):

La double hélice d’ADN est une structure stable qui assure à la fois la sauvegarde et la transmission de l’information génétique. Pour accéder à cette information, une vaste famille d’enzymes multifonctionnelles appelées hélicases réalise la séparation des bases complémentaires de l’ADN. Certaines de ces hélicases sont associées chez l’homme à des syndromes de prédisposition au cancer. C’est le cas du syndrome de Bloom (BS), une maladie génétique à transmission récessive qui se traduit par une augmentation de l’instabilité génétique mais où aucun phénomène d’haplo-insuffisance ou de dominance négative n’est constaté chez les porteurs hétérozygotes. On reconnait pourtant que la protéine du syndrome de Bloom (BLM) adopte une structure multimérique in vitro mais sans que l’expression chez certains hétérozygotes d’une enzyme inactive ne soit considérée comme un facteur à risque. Pour expliquer ce paradoxe, nous avons étudié la structure de l’enzyme BLM et constater qu’elle fonctionne sous la forme d’un monomère, un résultat nouveau qui justifie mieux pourquoi ces formes inactives n’influence pas le degré de prédisposition au cancer. D’autre part, la toxicité cadmium est susceptible d’avoir un lien direct avec l’inactivation de l’hélicase BLM car les cellules exposées au cadmium présentent des analogies avec celles des patients atteints du syndrome de Bloom. Effectivement, nous avons observé qu’in vitro, de faibles concentrations de cadmium réduisent les activités de cette hélicase en induisant son oligomérisation. Ces travaux apportent des informations nouvelles sur le mécanisme moléculaire de l’hélicase BLM et soulignent son importance dans le maintien de l’intégrité du génome
The DNA double helix is a stable structure that ensures both the protection and transmission of genetic information. To access this information, a large family of multifunctional enzymes called helicases performs the separation of complementary bases of DNA. Some of these helicases in humans are associated with cancer predisposition syndromes. This is the case of Bloom syndrome (BS), a recessive genetic disease that results in an increase in genetic instability but where no phenomenon of haploinsufficiency or dominant negative is found in carriers heterozygotes. Yet we recognize that the Bloom syndrome protein (BLM) adopts a multimeric structure in vitro, but the expression among some heterozygotes of an inactive enzyme is not considered as a risk factor. To explain this paradox, we studied the structure of the BLM and find that it works as a monomer, a new result which justifies why most inactive forms does not influence the degree of cancer predisposition. On the other hand, cadmium toxicity is potentially linked to the inactivation of the BLM helicase as cells exposed to cadmium present analogies with those of patients with Bloom syndrome. Indeed, we observed in vitro, that low concentrations of cadmium reduce helicase activity by promoting its oligomerization. These studies provide new information on the molecular mechanism of the BLM helicase and emphasize its importance in maintaining genome integrity

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Reymann, Jean-Marc. "Aldose reductase de cristallin de porc : enzymologie et structure". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1993. http://www.theses.fr/1993STR13085.

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Abstract (sommario):

L'aldose reductase (ar) est un enzyme qui catalyse la reduction par le nadph du glucose en sorbitol, et dont l'inhibition chez les sujets diabetiques presente un interet pharmacologique. Une revue faisant le point des connaissances acquises sur l'ar depuis sa decouverte jusqu'a nos jours est exposee. Une procedure originale et performante de l'isolement de l'ar a partir de cristallin de porc est decrite. Le developpement d'une autre forme de l'enzyme resultant de l'oxydation de l'ar au cours de la purification et du stockage est mis en evidence. Les resultats d'etudes biochimiques et cristallographiques suggerant l'existence in vivo de l'ar sous la forme holo-enzyme sont presentes. La formation d'oligomeres est montree dans le cas de la forme apo-enzyme de l'ar, la forme (native) holo-enzyme etant de nature strictement monomerique. Des cristaux d'ar sous la forme apo- et holo-enzyme sont obtenus. La structure tridimensionnelle de l'ar de cristallin de porc est resolue a partir de l'analyse aux rayons x de ces cristaux. La connaissance de cette structure devrait aider a la conception d'inhibiteurs beaucoup plus specifiques de l'ar que ceux actuellement disponibles

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Rahman, Pour Rahman. "Enzymology and structural enzymology of dye-decolorizing peroxidases and a primary study of encapsulin". Thesis, University of Warwick, 2015. http://wrap.warwick.ac.uk/73395/.

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Abstract (sommario):

The aim of this project is to provide a detailed comparative study in enzymology of dye-decolorising peroxidases, DyP, from Pseudomonas fluorescens and from Thermobifida fusca, a thermophile bacterium. Another objective is a primary study of encapsulin, a recently discovered icosahedral nanocompartment protein from Rhodococcus jostii Rha1. Three peroxidase genes from P. fluorescens and one from T. fusca were cloned, expressed, and their products were purified and the enzymes kinetically characterized with different substrates, lignin model compounds and lignocellulose. In addition, encapsulin has been purified, its assembly/disassembly under different pH conditions was studied and finally, its presence or absence in the extracellular fraction of R. jostii investigated. DyP type peroxidases from Gram-positive bacteria have been studied recently and showed oxidation activity toward Mn (II) and lignin model compounds. Gram-negative pseudomonads, also show activity for lignin oxidation and contain DyP-type peroxidase genes. P. fluorescens Pf-5 contains three DyP-type peroxidases (35, 40 and 47 kDa). In this study each of them was overexpressed in Escherichia coli, purified, and characterised by different substrates, Kraft lignin and lignocellulose. Each of the aforementioned enzymes shows activity for oxidation of most of the substrates, but the 35 kDa DyP1B and 40 kDa DyP2B enzymes show activity for oxidation of Mn (II). Only in the presence of Mn (II) and hydrogen peroxide, incubation of finely powdered lignocellulose with DyP1B leads to the release of a low molecular weight lignin fragment that was identified by mass spectrometry as a ß-aryl ether lignin dimer that contains one G unit and one H unit bearing a benzylic ketone. A mechanism for releasing of the -aryl ether lignin dimer fragment from the lignin molecule via oxidation is proposed. A DyP-type peroxidase enzyme from the thermophilic cellulose degrader Thermobifida fusca was investigated for its catalytic ability for lignin oxidation. TfuDyP was found to oxidise a ß-aryl ether lignin model compound, forming an oxidised tetramer. A crystal structure of TfuDyP was determined, to 1.7 Å resolution, which was found to contain a diatomic oxygen ligand bound to the heme centre, hydrogen-bonded to active site residues Asp-203 and Arg-315. For three amino acid residues present in distal heme pocket, site directed mutagenesis was performed and the effect of each mutation on enzyme activity was measured by three different substrates. Recently DyPB peroxidase from Rhodococcus jostii RHA1 has been recognised as a bacterial lignin peroxidase enzyme. The dypB gene is next to a gene that encodes an encapsulin protein that previously was shown in Thermotoga maritima to assemble and form into a nano-compartment comprised of 60-subunits. DyPB protein contains a C-terminal sequence motif that is supposed to lead the protein to the encapsulin nanocompartment. In this study, R. jostii RHA1 encapsulin gene was overexpressed in R. jostii RHA1, and the encapsulin protein was extracted as a high molecular weight native assembly (Mr >106 kDa). It was shown that by treatment of the purified nanocompartment at pH 3.0, it is able to be denatured to form a low molecular weight species and most importantly it is able to be re-assembled to form the native nanocompartment at pH 7.0. Dynamic light scattering showed that DyPB peroxidase in vitro could be assembled with encapsulin in a monomeric state to form an assembly of encapsulated DyPB in similar size and shape compared to the encapsulin-only nanocompartment. By using a nitrated lignin UV-Vis assay method, it was shown that the assembled complex of DyPB-encapsulin exhibited enhanced lignin degradation activity per mg DyPB present, compared with native DyPB. The stoichiometry of encapsulin/µmol DyPB in the assembled complex was measured, 8.6 mol encapsulin/mol DyPB, that was comparable to the predicted value of 10 obtained from the crystal structure.

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Jansson, Anna. "Structural enzymology of the biosynthesis of polyketide antibiotics /". Stockholm, 2004. http://diss.kib.ki.se/2004/91-7349-916-1/.

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Wittenborn, Elizabeth Charlotte 1988. "Structural enzymology of bacterial carbon fixation and storage". Thesis, Massachusetts Institute of Technology, 2017. http://hdl.handle.net/1721.1/112446.

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Abstract (sommario):

Thesis: Ph. D. in Biological Chemistry, Massachusetts Institute of Technology, Department of Chemistry, 2017.
Cataloged from PDF version of thesis. Vita.
Includes bibliographical references.
As concerns about sustainable energy and climate change grow, there has been an ever growing interest in understanding how Nature sequesters and uses carbon. In this thesis, I present X-ray crystal structures of two central players in bacterial carbon fixation and storage: carbon monoxide dehydrogenase (CODH) and polyhydroxyalkanoate synthase (PhaC). CODH is a key component of the Wood-Ljungdahl pathway of carbon fixation, catalyzing the reversible reduction of CO₂ to CO, and has garnered interest as a possible tool in environmental remediation and biofuels production. Practical challenges to applications of CODH include oxygen sensitivity of the catalytic metallocluster cofactors and incomplete assembly of the active site metallocluster in heterologous systems. To address these pitfalls, I have determined crystal structures of the CODH from Desulfovibrio vulgaris revealing that a solvent-exposed iron-sulfur cluster in the enzyme is a critical contributor to irreversible oxidative damage and that damage can be avoided through variations in cluster type at this position. In a separate series of crystal structures, I have also visualized dramatic conformational dynamics within the unique Ni-Fe-S cluster active site of CODH that could play a role in cluster stability and assembly as well as in avoidance of oxidative degradation. By providing a better understanding of oxygen sensitivity and cluster assembly, we hope to increase the feasibility of using CODH in practical applications. PhaC catalyzes the polymerization of hydroxyalkyl-coenzyme A substrates as a means of carbon storage in many bacteria. The resulting polymers can be used to make biodegradable materials with properties similar to those of thermoplastics or elastomers and are an environmentally friendly alternative to traditional petroleum-based plastics. To provide insight into the mechanism of hydroxyalkanoate polymerization, I have determined the first crystal structure of the catalytic domain of PhaC. The structure reveals the molecular architecture of the active site including key amino acid interactions that play likely roles in facilitating catalysis, as well as putative substrate entrance and product egress channels. This work lays the foundation for further biochemical and structural characterization of PhaC, and for engineering efforts for the production of cost-effective and environmentally sustainable materials.
by Elizabeth Charlotte Wittenborn.
Ph. D. in Biological Chemistry

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Carletti, Eugénie. "Études biochimiques et structurales d'enzymes interagissant avec les toxiques organophosphorés". Grenoble 1, 2009. http://www.theses.fr/2009GRE10035.

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Abstract (sommario):

Les enzymes réagissant avec les organophosphorés (OP) ont le potentiel de constituer les principes actifs des futures contre-mesures médicales destinées à protéger et à traiter l'homme contre l'agression OP. Les travaux réalisés au cours de cette thèse visent à 1) déterminer les facteurs permettant l'amélioration des propriétés des phosphotriesterases bactériennes, en vue de leur utilisation comme bioépurateurs catalytiques des OP; 2) approfondir les connaissances sur le mécanisme d'inhibition et de vieillissement des cholinestérases (ChEs), en particulier la butyrylcholinestérase humaine qui présente l'intérêt d'être le premier bioépurateur stoechiométrique proposé comme alternative au prétraitement actuel de l'intoxication organophosphorée. La phosphotriestérase bactérienne (PTE) hydrolyse la liaison phosphoester des OP. L'avantage de la PTE par rapport aux ChE s, est son activité catalytique élevée vis-à-vis des OP. C'est un bon candidat pour la décontamination et la protection cutanée. Cependant les difficultés d'expression et de production de l'enzyme entravent son développement. L'étude présentée dans cette thèse, permet de réévaluer les propriétés catalytiques de l'enzyme exprimée en présence de différents cations métalliques et une meilleure compréhension des problèmes d'expression rencontrés avec la PTE. PEGylée ou encapsulée dans des liposomes, la PTE pourrait être administrée à l 'homme et améliorer considérablement l'efficacité du traitement des intoxications OP. Les ChEs sont les principales cibles physiologiques des OP. Malgré les progrès réalisés ces vingt dernières années, la prophylaxie et le traitement de l'intoxication par les OPs neurotoxiques restent imparfaits. En particulier, les réactivateurs (oximes) utilisés comme antidotes contre l'intoxication organophosphorée, sont peu efficaces sur les cholinestérases inhibées par le tabun. Les études biochimiques et cristallographiques réalisées dans cette thèse montrent que cette résistance est principalement due à des facteurs électroniques propres au tabun et à des interactions particulières avec les résidus du site actif des ChEs. De plus, nous avons établi que la réaction secondaire de «vieillissement» correspondait à une O-déalkylation du groupement ethoxy de l'adduit phosphoramidate lié à la sérine catalytique, et non pas à une déamination, comme proposé jusqu'à présent. La déalkylation conduit à la formation d'un pont salin entre l'histidine protonée du site catalytique et l'oxyanion du composé OP déalkylé. À ce stade, la régénération de l'activité par réactivation par les oximes n'est plus possible. La connaissance du mécanisme d'inhibition et de déalkylation de la BChE et l'AChE phosphorylées par le tabun et des phosphoramidates analogues du tabun, en particulier la résolution de la structure cristallographique des conjugués non vieillis et vieillis, sont une base structurale essentielle à la conception de nouveaux réactivateurs plus efficaces. Les données structurales obtenues vont aussi permettre d'optimiser par modélisation moléculaire, des mutants de ChEs capables de se régénérer spontanément et/ou plus facilement réactivables par les oximes. De tels mutants pourraient alors être utilisables comme bioépurateurs pseudo-catalytiques.

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Boulé, Jean-Baptiste. "Étude enzymologique et structurale de la Terminal déoxynucléotidyl Transférase (TdT) murine". Paris 6, 2002. http://www.theses.fr/2002PA066050.

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Batson, Sarah. "Structural enzymology of peptidoglycan biosynthetic D-amino acid dipeptide ligases". Thesis, University of Warwick, 2010. http://wrap.warwick.ac.uk/3117/.

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Abstract (sommario):

This thesis describes approaches to further understand the structure and enzymology of D-Ala-D-Ala ligases (DDL) and those ligases with altered second substrate specificity, which confer glycopeptide antibiotic resistance. DDL is an essential enzyme in the biosynthetic pathway of the bacterial cell wall peptidoglycan. The approaches described are based primarily on the previous transition state mimic; VanA and EcDdlB, co-crystal structures. Active site mapping of VanA by site directed mutagenesis yielded VanA mutants that were expressed and purified for kinetic studies. The active site mapping of VanA supports the predictions about catalysis from the X-ray structure of VanA, but failed to identify a catalytic base. Additionally, the first enzymatic characterisation of a VanD ligase was performed. This analysis revealed that VanD4 ligase is a less efficient D-Ala-D-Lac ligase, and selected for a wider variety of second substrates in comparison to VanA. EcDdlB was expressed in E.coli, purified and crystallised. Three structures of EcDdlB have been solved to 1.4-1.7Å resolutions, representing a product inhibition complex, a ternary complex, and a D-cycloserine inhibited complex. Based upon the latter EcDdlB structure, we propose a novel suicide-substrate mechanism for the Dcycloserine mediated inhibition of DDLs, involving phosphorylation of D-cycloserine. Future studies will validate this mechanism. Finally, contributions towards rational design of EcDdlB and VanA inhibitors have been made. This work has significantly increased knowledge in the field of DDL enzymes, progressing towards the exploitation of these targets for antibiotic development. The deposition of PDB files of three new EcDdlB structures will provide the tools for further rational based drug design campaigns against EcDdlB. The novel mechanism of Dcycloserine inhibition may also have implications for the further development of inhibitors of DDLs.

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Frank, R. A. W. "Structural enzymology of 2-oxo acid dehydrogenases : symmetry and multiplicity". Thesis, University of Cambridge, 2004. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.599175.

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Abstract (sommario):

The 2-oxo acid dehydrogenase multienzyme complexes are found in all the taxonomic domains of life and are compared of three different component enzymes (E1, E2,and E3). Multiple copies of E1 and E3 assemble with E2 en masse generating a particle that eclipses the ribosome (509 MDa). The molecular basis and function of multiplicity and symmetry within these complexes was investigated using the E. coli 2-oxoglutarate dehydrogenase (OGDH, EC 1.2.4.2) and B. stearothermophilus pyruvate dehydrogenase (PDH, EC 1.2.4.1) multienzyme complex. The protein-protein interactions and subunit stoichiometry of the E. coli OGDH multienzyme complex were investigated by limited proteolysis and re-assembly of the recombinant enzyme components (E1, EC 1.2.4.2; E2, EC 2.3.1.61; and E3, EC 1.8.1.4) in vitro. Only four E1 homodimers are able to associate with the E2 24-mer, suggesting that E1-E2 assembly is limited by the available space around the E2 core, rather than the number of binding sites. The four E1 may bind as a tetrahedron about E2, which would be consistent with the cubic symmetry of the core. Cleaving 77 residues from the N-termini of an E1 homodimer inhibits binding to the core domain of E2. In contrast, E3 associates to the peripheral subunit binding domain (PSBD) of E2 and the number of E3 homodimers bound to the E2 complex is also limited to around four despite the availability of 24 PSBD in each E2 complex. The low number of peripheral E1 and E3 components bound to E2 marks the OGDH multienzyme complex apart from all other 2-oxo acid dehydrogenase multienzyme complexes that can be saturated with E1 or E3. Furthermore, the E1 and E3 from many other 2-oxo acid dehydrogenase multienzyme complexes compete for binding to E2, whereas in the E coli OGDH multienzyme complex, the association of E1 and E3 with E2 is non-competitive, which is consistent with their mutually exclusive sites of association on E2. Thus homogenous holo-complexes of E1-E2-E3 were assembled in vitro, each containing 4 E1, 4 E3 and 24 E2.

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Fitzsimmons, Sara Ann. "Enzymology and structure-activity relationships of quinoxaline bioreductive cytotoxins". Thesis, University of Glasgow, 1995. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.295320.

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Larsson, Forsell Pontus. "Studies on the structure, function and expression of phospholipase A₂ /". Stockholm, 1998. http://diss.kib.ki.se/1998/91-628-3220-4/.

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Pelissier-Combescure, Marie-Cécile. "Etudes structurales et fonctionnelles de deux enzymes impliquées dans le métabolisme des sucres chez les bactéries". Aix-Marseille 1, 2009. http://www.theses.fr/2009AIX11049.

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Abstract (sommario):

Les enveloppes bactériennes sont riches en structures polysaccharidiques qui participent au maintien de la forme des bactéries, à leur protection et à leur pouvoir pathogène. La biosynthèse de ces structures essentielles aux bactéries repose en grande partie sur la disponibilité des différents monosaccharides qui les composent. Le travail présenté dans ce document décrit l’étude structurale et fonctionnelle de deux enzymes bactériennes qui participent au métabolisme des sucres chez les bactéries et contribuent à leur approvisionnement en monosaccharides. La GDP-mannose pyrophosphorylase (GMP) est responsable de l’activation du mannose sous forme de GDP-mannose, une étape nécessaire à l’incorporation de résidus mannose dans les polysaccharides. La GMP, présente aussi bien chez les procaryotes que les eucaryotes, possède des propriétés différentes selon les organismes, notamment en ce qui concerne sa spécificité de substrat. La caractérisation structurale de la GMP de T. Maritima nous a révélé les bases de sa spécificité et a ainsi permis d’élaborer des hypothèses sur les différences fonctionnelles observées entre plusieurs homologues. La N-acétyl-mannosamine-6-phosphate 2-épimérase (NanE) intervient dans la voie de dégradation de l’acide sialique chez certaines bactéries. Cette voie a une importance particulière pour les bactéries entériques puisqu’elle permet à ces pathogènes d’utiliser l’acide sialique des mucines intestinales comme seule source de carbone. La résolution de la structure de NanE de C. Perfringens constitue un premier pas vers la compréhension de son mécanisme catalytique et pourrait à terme être exploitée pour concevoir de nouveaux antibiotiques
In bacteria, polysaccharides constitute key compounds of the cell wall. They are essential for bacteria and notably contribute to their shape, protection and virulence. The biosynthesis of polysaccharides is strongly dependant on the monosaccharidic unit blocks availability. The present work describes the functional and structural study of two bacterial enzymes involved in sugar metabolism and monosaccharides supply. The GDP-mannose pyrophosphorylase (GMP) activates mannose through GDP-mannose, a required step for the incorporation of mannose residues into polysaccharides. Although well conserved from bacteria to humans, the GMP enzyme exhibits different substrate specificity depending on the organism. The structural characterization of the GMP from T. Maritima reveals the bases for its substrate specificity and brings hypotheses regarding functional differences observed in several GMP homologues. The N-acetyl-mannosamine-6-phosphate epimerase (NanE) is part of the sialic acid degradation pathway in bacteria. This pathway is of great importance for enteric bacteria that can use sialic acid from the intestinal tract as sole carbon source. The structure determination of NanE from C. Perfringens is the first step towards the understanding of the catalytic mechanism of this prokaryotic enzyme. Ultimately, this structure could give rise to the design of new antibiotics against pathogenic bacteria of the intestinal tract

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Coen, Jeremy Jonathan Francis. "Structural and electronic determinants of azo dye oxidation by horseradish peroxidase isoenzyme C". Thesis, University of Sussex, 1999. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.341542.

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Fisher, Michael B. "The enzymology and mechanisms of cytochrome P450-catalyzed aliphatic desaturation /". Thesis, Connect to this title online; UW restricted, 1998. http://hdl.handle.net/1773/8158.

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Tsekoa, Tsepo L. "Structure, enzymology and genetic engineering of Bacillus sp. RAPc8 nitrile hydratase". Thesis, University of the Western Cape, 2005. http://etd.uwc.ac.za/index.php?module=etd&amp.

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Abstract (sommario):

Microbial nitrile hydratases are important industrial enzymes that catalyse the conversion of nitriles to the corresponding amides. A thermostable, cobalt-type Bacillus sp. RAPc8 microbial nitrile hydratase was cloned and expressed in E.coli. In this study the primary aim was to determine the molecular structure of Bacillus sp. RAPc8 microbial nitrile hydratase.

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Brisson, Lydie. "Relations structure-fonction de l'ACC oxydase et de l'anthocyanidine synthase : analogies et différences". Aix-Marseille 3, 2010. http://www.theses.fr/2010AIX30060.

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Abstract (sommario):

L'anthocyanidine synthase (ANS) et l'oxydase de l'acide 1-aminocyclopropane-l-carboxylique (ACCO) sont deux oxydases à fer(ll) non-hémique, membres de la superfamille structurale des cupines. Bien que l'ACCO n'utilise pas de cofacteur 2-oxoglutarate (20G) pour son activité, elles sont toutes deux apparentées à la famille des oxygénases dépendantes du 20G. L'ACCO catalyse la production d'éthylène à partir de l'ACC et nécessite, outre le dioxygène, l'ascorbate et l'hydrogénocarbonate. L'ANS oxyde in vivo les leucoanthocyanidines en anthocyanidines et requière in vitro la présence d'ascorbate, de dioxygène et de 20G. Les deux enzymes ont été produites dans des systèmes recombinants d' E. Coli, puis purifiées. Leurs paramètres cinétiques ont été déterminés mais l'étude de l'ANS a nécessité davantage de travaux de mise au point car elle reconnaît in vitro plusieurs substrats qui aboutissent chacun à l'obtention de plusieurs produits différents. L'étude cinétique a été complétée par la modélisation moléculaire dans le but de comprendre leur mécanisme et de proposer des sites potentiels de fixation de leurs effecteurs. Plus particulièrement, les deux enzymes requièrent la présence d'ascorbate in vitro pour leur activité et nous nous sommes attachés à comprendre le rôle et le site d'interaction de ce cofacteur. Les résultats indiquent que l'hydrogénocarbonate interagit avec la Lys158, l'Arg300 de l'extrémité C-terminale et l'Arg244 ainsi que la Ser246 du motif RXS. Il interagit également avec l'ACC, favorisant ainsi sa fixation et probablement la catalyse. L'utilisation des analogues phosphonate de l'ACC confirme le modèle de fixation proposé et nous avons pu proposer un mécanisme séquentiel aléatoire pour l'ACCO, en regard de l'ACC, l'hydrogénocarbonate et l'ascorbate. Ce dernier semble se fixer à l'entrée d'un canal allant de la surface de l'enzyme vers le fer. Un tel canal est présent dans l'ANS. Les paramètres cinétiques de cette dernière ont pour la première fois été déterminés avec la dihydroquercétine comme substrat. L'ascorbate, qui se lie à l'ANS dans le canal d'accès au fer, semble nécessaire à l'activité enzymatique. L'étude de ces deux enzymes ouvre de nouvelles perspectives au sein du laboratoire, notamment l'étude plus globale de la réactivité autour du métal. Nous envisageons en effet de moduler celle-ci par mutagénèse dirigée pour aboutir à l'obtention de nouvelles activités à partir notamment de l'ANS
Anthocyanidin synthase (ANS) and aminocyclopropane carboxylic acid oxidase (ACCO) are two non-heme containing oxidases that belong to the structural superfamily of cupines. Although ACCO does not use 2-oxoglutarate (20G) as a cofactor, both enzymes are associated to the 20G dependent oxygenases. ACCO catalyzes the production of ethylene from ACC and needs, besides oxygen, ascorbate and hydrogenocarbonate. ANS oxidizes in vivo leucoanthocyanidins to anthocyanidins and requires in vitro the presence of ascorbate, dioxygen and 20G. Both enzymes were produced in recombinant E. Coli systems, then purified. Their kinetic parameters were determined but the study of ANS has required more intensive optimisation work since it recognizes in vitro several substrates that each lead to several different products. The kinetic study has been completed by molecular modeling to understand their mechanism and to highlight potential binding sites for each effector. Particularly, both enzymes require ascorbate in vitro for activity and we have investigated the role as well as possible binding sites for this cofactor. The results indicate that hydrogenocarbonate interacts with Lys158, Arg300 from C-terminal part, and Arg244 and Ser246 from the RXS motif. It also interacts with ACC, favoring thus its binding and probably the catalysis. The use of phosphonate analogs of ACC confirms the binding model proposed and we were able to propose a sequential random mechanism for ACCO, with respect to ACC, hydrogenocarbonate and ascorbate. The latter seems to bind at the entrance of a canal going from the surface of the protein to the iron. Such a canal is present in ANS. The kinetic parameters of the latter were for the first time determined with dihydroquercetin as a substrate. Ascorbate, that binds to ANS in the canal, seems to be necessary for enzymatic activity. The study of these two enzymes opens new perspectives in the laboratory, including more comprehensive study of the reactivity around the metal ion. We plan to modulate the activity by mutagenesis to obtain new activities, especially from ANS

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Park, Kee Choon. "Enzymatic activity, microbial diversity, and weed seed banks in soils receiving different organic amendments and the biological fertilizer EM(tm) /". free to MU campus, to others for purchase, 2004. http://wwwlib.umi.com/cr/mo/fullcit?p3164535.

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Abstract (sommario):

Thesis (Ph.D.)--University of Missouri-Columbia, 2004.
(tm) after EM in title is for Trademark symbol. Typescript. Vita. Includes bibliographical references (leaves 120-142). Also available on the Internet.

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Darmon, Amélie. "Etudes structurales et fonctionnelles du domaine CTD de l'ADN Gyrase de Mycobacterium tuberculosis". Paris 7, 2013. http://www.theses.fr/2013PA077189.

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Abstract (sommario):

L'ADN gyrase est l'unique topoisomérase de type II présente chez M. Tuberculosis. De ce fait elle constitue l'unique cible des fluoroquinolones dans le traitement de la tuberculose. Il s'agit d'un hétérotétramère d'environ 350 kDa assemblées à partir de deux sous unités (A et B). Chaque sous-unité est constituée de deux domaines structuraux, un domaine de coupure-ligation de l'ADN (DCL) et un domaine CTD, pour la sous-unité A, un domaine ATPase et un domaine TOPRIM pour la sous-unité B. Les fluoroquinolones sont des antibiotiques clefs pour le traitement des tuberculoses à bacilles multirésistant, c'est-à-dire résistant au moins à l'isoniazide et à la rifampicine. Des souches ultrarésistantes (XDR), résistantes au fluoroquinolones et aux aminosides, apparaissent dans le monde, y compris en France où elles représentent 10 % des tuberculoses multiresistantes. Ces souches XDR inquiètent la communauté internationale car elles sont difficiles à traiter et sont à l'origine de 65 à 100 % de décès. A l'heure actuelle plusieurs programmes scientifiques à l'échelle mondiale sont en cours pour tenter d'optimiser l'efficacité des fluoroquinolones dans le traitement de la tuberculose, en particulier dans le but de raccourcir la durée du traitement. Le laboratoire y contribue directement en orientant une partie de ses recherches à la compréhension des mécanismes de résistance aux quinolones chez M. Tuberculosis. Un second axe concerne un aspect plus fondamental et vise à une meilleure compréhension à l'échelle atomique du mode de fonctionnement des topoisomérases de type II en général, mais aussi des spécificités de l'ADN gyrase de M tuberculosis, liées notamment à sa caractéristique de topoisomérase de type II unique dans cet organisme. Dans ce contexte, le projet de thèse à consister à étudier d'un point de vue structural par cristallographie des rayons X et fonctionnel, le domaine CTD de l'ADN gyrase de M. Tuberculosis. Nous avons résolu la structure cristallographique du domaine CTD à une résolution de 1. 4 À. L'analyse de la séquence du domaine CTD a permis de révéler une caractéristique inédite : la présence d'un second motif GyrA-box. Ce second motif GyrA-box est situé d'un point de vue structural au niveau de la pale 5 du repliement de type ,l3-pinwheel. Les études fonctionnelles menées en collaboration avec l'équipe d'Alexandra Aubry (Pitié-Salpêtrière) ont permis de montrer que ce second motif GyrA-box joue un rôle essentiel dans l'activité de décaténation de l'ADN gyrase de M tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis possesses only one type IIA DNA topoisomerase, DNA gyrase, in contrast to most other bacteria which also possess DNA topoisomerase IV. It has been shown previously that die unique M tuberculosis type IIA DNA topoisomerase is functionally a hybrid enzyme, exhibiting the classical activity of DNA gyrase for supercoiling, but enhanced relaxation, cleavage and decatenation activities close to those of topoisomerase IV. Functional differences between the two type IIA DNA topoisomerases are thought to be specified by a C-terminal DNA binding domain (CTD) which controls DNA recognition. To explore the molecular mechanism responsible for the hybrid functions of the M. Tuberculosis DNA gyrase, we conducted a series of sequence analyses and structural and biochemical experiments with the isolated GyrA CTD and the holoenzyme. While the CTD displayed a global structure similar to that of bona fide GyrA and ParC paralogs, it harbors a second key motif similar in all respects to that of the GyrA-box. Biochemical assays showed that the canonical GyrA-box is responsible for DNA supercoiling and also relaxation, whereas the second GyrA-box-like motif (GyrA-box-1) is responsible for the enhanced decatenation activity of M. Tuberculosis DNA gyrase. Our results suggest that the mechanistic originality of M tuberculosis DNA gyrase depends largely on the particular DNA path around the CTD which is allowed for by the presence of eyrA-box-1. They reveal how the M tuberculosis DNA gyrase operates in detail, and provide also, through phylogenetic exploration of the entire Corynebacterineae suborder, new and broader insight into the functional stuctural and functional studies of the mycobacterium tuberculosis DNA gyrase C-terminal domain

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Favrot, Lorenza. "Structure and Enzymatic Characterization of Mycobacterium tuberculosis Transferases". University of Toledo / OhioLINK, 2014. http://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=toledo1404588587.

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Gilchrist, Derek S. "Structure and mechanism of DNA gyrase from divergent bacterial species". Thesis, University of Liverpool, 1997. http://ethos.bl.uk/OrderDetails.do?uin=uk.bl.ethos.484289.

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Moore, Robert Goodwin Douglas C. "Towards the understanding of complex biochemical systems the significance of global protein structure and thorough parametric analysis /". Auburn, Ala, 2009. http://hdl.handle.net/10415/1766.

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Lindenberger, Jared J. "Structural and Enzymatic Studies of Essential Enzymes in Mycobacterium tuberculosis". University of Toledo / OhioLINK, 2015. http://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=toledo1438270398.

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Picard, Martin. "Etudes structurales et fonctionnelles de l' ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique (SERCA1A) : effets des conditions de cristallisation sur la conformation de l' ATPase-Ca2+". Paris 6, 2005. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011390.

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Chen, Z. (Zhijun). "Characterization of the 2-enoyl thioester reductase of mitochondrial fatty acid synthesis type II in mammals". Doctoral thesis, University of Oulu, 2008. http://urn.fi/urn:isbn:9789514289804.

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Abstract (sommario):

Abstract A data base search using the amino acid sequence of Saccharomyces cerevisiae Etr1p, the last enzyme of mitochondrial fatty acid synthesis type II (FAS II), revealed a highly similar human protein, NRBF-1. Expression of NRBF-1 in a yeast etr1Δ strain rescued its respiratory deficiency. NRBF-1 resides in mitochondria in cultured HeLa cells. The recombinant NRBF-1 is enzymatically active, reducing 2E-enoyl-CoAs to acyl-CoAs in an NADPH-dependent manner. Altogether, our data showed that NRBF-1 is a mitochondrial 2-enoyl-CoA reductase/2-enoyl thioester reductase (MECR/ETR1), the human functional counterpart of yeast Etr1p. In addition, MECR was also isolated from bovine heart. It turns out that mammals contain a mitochondrial FAS II pathway, in addition to cytoplasmic FAS I. To investigate the functional mechanism of MECR/ETR1 at the molecular level, the protein was crystallized and the crystal structure determined. The apo-structure of MECR/ETR1 contains two sulfates in the nucleotide binding site and the domain arrangement resembles the NADPH-containing holo-structure of yeast Etr1p. The predicted mode of NADPH-binding and kinetic data suggest that Tyr94 and Trp311 play critical roles in catalysis. A pocket was found in the structure extending away from the catalytic site that can accommodate fatty acyl chains up to 16 carbons. An acyl carrier protein (ACP) binding site was also suggested. To study the physiological function of mouse Mecr, two lines of transgenic mice overexpressing Mecr were generated. The Mecr transgenic mice developed cardiac and mitochondrial abnormalities. The phenotyping was carried out using echocardiography, heart perfusion, histology, and endurance testing. Our results suggest Mecr plays a role in mitochondrial and heart function. Therefore, inappropriate expression of the genes of FAS II may result in the development of cardiomyopathy.

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Henry, Luc. "Studies on enzymes mechanism and selectivity using synthetic substrate analogues". Thesis, University of Oxford, 2012. http://ora.ox.ac.uk/objects/uuid:21234b44-3778-46c6-9a08-9351f6411f4e.

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Abstract (sommario):

Organic chemistry is a valuable tool for studying enzyme mechanisms. Upon incubation with a specific enzyme, synthetic substrate analogues labeled with heavy atoms or carrying extra functional groups can provide mechanistic insights. In the present work, new compounds were synthesised in order to study the mechanism and substrate selectivity of two enzymes: human γ-butyrobetaine hydroxylase and bacterial carboxymethylproline synthase. γ-Butyrobetaine hydroxylase (BBOX) is an Fe(II) and 2-oxoglutarate (2OG)-dependent oxygenase that catalyses the stereospecific hydroxylation of γ-butyrobetaine, the final step of L-carnitine (L-Car) biosynthesis in mammals. Substrate analogues were synthesised to probe BBOX specificity in vitro. Some of those unnatural substrates were oxidised by BBOX and the products identified using a range of analytical techniques. 3-(2,2,2-Trimethylhydrazinium)propionate (THP) is a clinically used BBOX inhibitor. Under standard assay conditions, THP was oxidised by BBOX. NMR studies have identified the products of this reaction to be malonic acid semialdehyde, formaldehyde, dimethylamine and 3-amino-4-(methylamino)butanoic acid. The formation of 3-amino-4-(methylamino)butanoic acid suggests that BBOX can catalyse a Stevens type rearrangement involving N-N bond cleavage and C-C bond formation. The proposed structures and mechanisms were confirmed by mass spectrometric and NMR analyses using [¹³C]-labeled THP as well as synthetic standards of both enantiomers of 3-amino-4-(methylamino)butanoic acid. Although the structure of the rearrangement product was confirmed, the stereochemistry remains unknown. Altogether, these studies revealed the unprecedented nature of a BBOX-catalysed C–C bond formation reaction upon THP oxidation and may inspire the design of improved inhibitors for BBOX and other 2OG oxygenases. Pectobacterium carotovorum CarB and Streptomyces cattleya ThnE are two carboxymethylproline synthases (CMPS) that catalyse an early step in carbapenem antibiotics biosynthesis. CMPS produces (2S,5S)-carboxymethylproline (t-CMP) from malonyl-CoA and L-glutamate semi-aldehyde. L-Glutamate semi-aldehyde exists in equilibrium with L-5-hydroxyproline and L-pyrroline-5-carboxylate in solution (collectively abbreviated L-GHP). Because of the high stereoselectivity of t-CMP formation and the growing interest in novel carbapenem antibiotics, CMPS is potentially an interesting biocatalyst. A series of L-GHP analogues were synthesised and tested as CMPS substrates in an attempt to produce unnatural t-CMP derivatives enzymatically. Methyl-substituted L-GHP analogues were accepted by CMPS and the t-CMP products could be further carried through to the corresponding bicyclic carbapenams using CarA, a β-lactam synthetase. These results demonstrate the versatility of the early carbapenem biosynthetic pathway and the possibility of introducing structural diversity using synthetic substrate analogues. A crystal structure of S. cattleya ThnE was obtained in complex with L-proline and coenzyme A, giving the first insight into substrate binding. This structural information will potentially allow further rational mutagenesis studies aiming to broaden the range of unnatural L-GHP analogues accepted by CMPS.

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Albenne, Cécile. "Ingénierie rationnelle de l'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea : de la structure tri-dimensionnelle aux bases moléculaires de la catalyse". Toulouse, INSA, 2002. http://www.theses.fr/2002ISAT0036.

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Abstract (sommario):

L'amylosaccharase de Neisseria polysaccharea (AS) est une transglucosidase de la famille 13 des glycoside-hydrolases qui utilise le saccharose pour synthétiser un homopolymère de type amylose et glucosyler très efficacement des accepteurs tels que le glycogène. L'obtention et l'analyse de complexes enzyme : substrat couplée à des expériences de mutagénèse dirigée, nous ont permis de montrer que la spécificité vis-à-vis du saccharose est conférée par des résidus du sous-site -1 (Asp144, Arg509, Tyr147 et Phe250). Les résidus du sous-site +1 (Asp394 et Arg446) assurent un positionnement correct des molécules acceptrices et sont responsables de la spécificité de synthèse mais aussi de rupture des liaisons a-1,4. En effet, nous avons révélé la capacité de l'AS à disproportionner efficacement les maltooligosaccharides de DP > 4, la présence d'un sous-site +4 fort (Arg415), associé à des sous-sites +1, +2 et +3 faibles (résidu Arg226 gênant), réduisant fortement l'accès au site actif des plus petites molécules. Une analyse approfondie des réactions catalysées en présence de saccharose seul nous a ensuite permis de démontrer que la formation du polymère résulte d'une élongation non-processive des maltooligosaccharides produits par l'AS, du côté de leur extrémité non-réductrice. Alors que les produits < DP4 sont accumulés du fait d'une fixation défavorable au niveau des sous-sites +1 à +3, la glucosylation des longues chaînes repose sur un arrimage performant au niveau de différents sites positionnés à la surface de l'enzyme. Enfin, un site secondaire, non catalytique, de fixation du saccharose a été révélé et pourrait être responsable du comportement cinétique atypique de l'AS, via de possibles modifications conformationnelles. Une étude de modélisation moléculaire a été initiée pour explorer l'éventualité d'une voie de passage pour le saccharose entre le site secondaire et le site actif. La modélisation a également permis de proposer une solution d'arrimage du glycogène, révélant une complémentarité de forme entre l'enzyme et cet accepteur
Amylosucrase from Neisseria polysaccharea (AS) is a transglucosidase from family 13 of glycoside-hydrolases which uses sucrose to synthesize an amylose-like polymer and elongates acceptor molecules as glycogen. Enzyme-substrate complexe analyses associated to site directed mutagenesis experiments allowed us to show that residues of subsite -1 are responsible for the specificity towards sucrose (Asp144, Arg509, Tyr147, Phe250). Residues of subsite +1 (Asp394, Arg446) ensure a correct positionning of acceptor molecules and are responsible for the specificity of synthesis but also of cleavage of the a-1,4 linkage. Indeed, we have showed that AS is able to disproportionate efficiently maltooligosaccharides of DP > 4. A strong subsite +4 (Arg415), associated to weak subsites +1, +2 and +3 (Arg226), reduce the accessibility of small molecules to the active site. A deep analysis of the reactions catalysed from sucrose led us to demonstrate that polymer synthesis result from the non-processive elongation of maltooligosaccharides synthesised by AS, at the non-reducing end. Opposed to compounds of DP < 4 which are accumulated because of a weak binding at subsites +1, +2 and +3, longer molecules are efficiently glucosylated thanks to a strong binding at different sites situated on the surface of the enzyme. A non-catalytic sucrose binding site has been identified and should be responsible for the atypical kinetic behavior of AS, via conformationnal movements. A molecular modelling study was initiated to explore the trajectory of sucrose between this secondary sucrose binding site and the active site. Molecular modelling was also used to propose a solution of docking of glycogen, which reveal a groove complementary to a branch of glycogen on the surface of the enzyme

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Carayon, Kévin. "Étude des paramètres structuraux et cinétiques caractérisant les interactions intégrases rétrovirales / ADN et l'étape de 3'-processing". Phd thesis, École normale supérieure de Cachan - ENS Cachan, 2008. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00363674.

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Abstract (sommario):

L'intégration de l'ADN viral dans le génome des cellules hôtes est une étape obligatoire du cycle de réplication des rétrovirus. L'intégrase (IN) catalyse le processus global d'intégration en deux étapes distinctes et consécutives. La première des deux réactions, le 3'-processing, consiste en une coupure spécifique d'un dinucléotide au niveau des deux extrémités 3'-OH de l'ADN viral. L'IN transfère ensuite de manière concertée ces deux extrémités au sein de l'ADN cible. Nous avons, par des techniques basées sur l'anisotropie de fluorescence, caractérisé les paramètres structuraux et cinétiques du 3'-processing catalysé par l'IN du VIH-1. Nous avons montré d'une part que cette activité dépend de la taille des complexes IN / ADN. Nous avons trouvé que le dimère d'IN est la forme multimérique la plus active tandis que les complexes de haut poids moléculaire sont relativement peu efficaces. D'autre part, la structuration du domaine N-ter joue un rôle clé dans l'assemblage coopératif de ce dimère en présence de Mg2+ comme cofacteur cationique. Ce rôle n'est pas essentiel en présence de Mn2+. L'étude de l'IN de PFV-1, un spumavirus, plus soluble, nous a permis de mettre en évidence une reconnaissance préférentielle de l'extrémité processée de l'ADN viral par cette IN, cette propriété n'avait jamais été observée pour l'IN du VIH-1 car elle était masquée par sa propension à l'agrégation. Nous avons également montré que ces deux IN rétrovirales réalisent le 3'-processing suivant un mécanisme catalytique lent de type « single turn-over ».

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Chakraborti, Subhendu. "Structural enzymology of human senescence marker protein 30 (SMP30) insights into the gluconolactonase mechanism and role of metal ions /". Access to citation, abstract and download form provided by ProQuest Information and Learning Company; downloadable PDF file, 201 p, 2009. http://proquest.umi.com/pqdweb?did=1891590551&sid=1&Fmt=2&clientId=8331&RQT=309&VName=PQD.

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Topalis, Dimitrios. "Structure et spécificité de la thymidylate kinase du virus de la vaccine : vers une stratégie antipoxvirus". Paris 6, 2008. http://www.theses.fr/2008PA066372.

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Abstract (sommario):

La thymidylate kinase du virus de Vaccine (VaccTMPK) présente une spécificité de substrat plus étendue que celle de son homologue humain. Elle est capable de catalyser la phosphorylation de TMP, dUMP mais surtout du dGMP. Les paramètres cinétiques obtenus pour le TMP sont proches de ceux de la TMPK humaine (kcat = 2 s-1 ; KM = 20 µM). Les données cristallographiques de l’enzyme virale liés au TDP montre que VaccTMPK adopte le même repliement que l’enzyme humaine avec une association orthogonale des sous-unités, probablement due à un défaut de compaction au niveau du domaine à NMP. Cette singularité permet à l’enzyme de lier des susbtrats plus volumineux comme le dGMP et le 5-bromo-vinyl-dUMP et s’accompagne d’une stabilité moins grande comme l’indiquent les expériences de microcalorimétrie. Dans le cadre de la recherche de nouveaux substrats antipoxvirus de VaccTMPK, une série de phosphonates analogues du dUMP, composés d’une partie acyclique de 3, 4 ou 5 carbones à la place du désoxyribose, ont été testés pour leur réactivité avec les TMPK virale et humaine. De plus, un groupement méthyle-, halogène- ou aryl- est ajouté en position C5 de la base. Les dérivés methylés ou halogénés, des séries allyl- et pentenyl-, sont substrats des TMPKs alors que les dérivés substitués par un aryl- ne le sont pas. D’autre part, une série d’analogues alkylés et oxydés de dGMP a été testés pour leur réactivité avec VaccTMPK et la GMPK humaine. Ils sont tous substrats des deux enzymes sauf le O6-Me-dGMP qui est spécifiquement phosphorylé par VaccTMPK

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Fansler, Sarah J. "Using enzymes to link soil structure and microbial community function in a prairie chronosequence". Online access for everyone, 2004. http://www.dissertations.wsu.edu/Thesis/Summer2004/S%5FFansler%5F041404.pdf.

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Eriani, Gilbert. "Aminoacyl-tRNA synthétases et tRNA : études fonctionnelles, structurales et génétiques d'une famille de molécules essentielles pour l'expression du code génétique". Habilitation à diriger des recherches, Université Louis Pasteur - Strasbourg I, 2001. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00266855.

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Abstract (sommario):

Depuis 1991, année de mon recrutement au CNRS, mon activité de recherche est centrée sur l'étude d'une famille d'enzymes intervenant dans la biosynthèse protéique : les aminoacyl-tRNA synthétases. Mon travail s'est articulé autour de l'étude de leur organisation fonctionnelle et de la compréhension des bases moléculaires de la reconnaissance spécifique entre ces enzymes et leurs substrats. Des approches multidisciplinaires (biologie moléculaire, biochimie, cristallographie aux rayons X, enzymologie et génétique) ont été mises en œuvre pour une exploration globale de ces problèmes. Nous avons pu progresser dans la connaissance de deux enzymes modèles : l'aspartyl-tRNA synthétase et l'arginyl-tRNA synthétase, deux enzymes appartenant respectivement à la classe II et à la classe I des aminoacyl-tRNA synthétases. Nous avons localisé les sites de fixation des différents substrats, proposé des mécanismes catalytiques et sélectionné in vivo des variants d'aminoacyl-tRNA synthétases et de tRNAs aux propriétés de reconnaissance modifiées.

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Nankai, Hirokazu. "Enzymology and genetics of xanthan-degrading system and X-ray crystal structure of xanthan lyase in Bacillus sp. GL1". Kyoto University, 2002. http://hdl.handle.net/2433/149526.

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Picard, Martin. "ETUDES STRUCTURALES ET FONCTIONNELLES DE L'ATPASE-CA2+ DU RETICULUM SARCOPLASMIQUE (SERCA1A). EFFETS DES CONDITIONS DE CRISTALLISATION SUR LA CONFORMATION DE L'ATPASE-CA2+". Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2005. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011390.

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Abstract (sommario):

L'ATPase-Ca2+ du réticulum sarcoplasmique est une protéine membranaire dont plusieurs conformations ont été résolues par cristallographie des rayons X. Ces structures ont été précieuses pour l'interprétation de nos études fonctionnelles sur le rôle du domaine A et de la boucle L6-7 de l'ATPase. Mais nous avons montré que les conditions de cristallisation aboutissent parfois à des structures paradoxales : la présence de concentrations importantes de Ca2+ pendant la cristallisation en présence d'AMPPCP conduit l'ATPase à adopter une conformation probablement différente de sa structure moyenne en solution; de même, dans les conformations de l'ATPase proches de l'état phosphorylé «E2P», les inhibiteurs généralement utilisés pour stabiliser l'ATPase bloquent de façon artéfactuelle l'ouverture des sites Ca2+ vers la lumière du réticulum. Nous avons tenté de comprendre les avantages et inconvénients de divers polymères amphiphiles conçus pour stabiliser en solution les protéines membranaires.

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Williams, Simon-Peter. "Studies of enzyme kinetics and aspects of enzyme structure in vivo using NMR and molecular genetics". Thesis, University of Oxford, 1992. http://ora.ox.ac.uk/objects/uuid:d8baa574-a5d4-45a2-95a2-c141fbf8d277.

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Abstract (sommario):

A quantitative understanding of metabolic control depends on a knowledge of the enzymes involved. The extrapolation of studies in vitro to the intact cell is controversial because the intracellular environment is relatively poorly characterised, particularly with respect to the interactions between weakly-associated enzymes. There is a clear need to study enzymes directly in the cell, yet there are few suitable techniques. Metabolites have been very successfully studied in cells by the non-invasive technique of nuclear magnetic resonance (NMR). NMR studies of enzymes in the cell have, however, been prevented by difficulties in assigning the resonances from the many proteins within the cell. A method for studying a specific enzyme in the cell has been developed, using Saccharomyces cerevisiae and phosphoglycerate kinase (PGK) as a model system. Using an inducible expression system, PGK was synthesised in the cell without significant synthesis of other proteins. With 5-fluorotryptophan in the growth medium, fluorine-labelled PGK was formed in situ. Fluorine is an excellent label for NMR since it is absent from most cells and has a high receptivity to NMR detection. ¹⁹ F NMR was used to study PGK in the intact cell. Comparisons with measurements in vitro showed that PGK was exposed to only a small fraction of the total intracellular [ADP], implying some form of compartmentalisation. The NMR relaxation properties observed in vivo and in vitro were compared with theoretical predictions. This showed that PGK was not part of a complex in the cell and that the viscosity of the cytoplasm, relative to water, was c. 4 at 30 °C. Fluorine-labelled pyruvate kinase and hexokinase have also been prepared; the spectra of these proteins in vitro are responsive to their ligands, and further work will study these proteins in vivo. NMR techniques were also applied to study the kinetics of PGK in the cell. PGK and GAPDH catalyse an ATP↔P_i exchange which is near-equilibrium in wild-type cells. ³¹P magnetisation transfer experiments in genetically manipulated cells showed that the reaction becomes unidirectional if the PGK activity is reduced by 95 %. Net flux is reduced by less than 30 %. In low-PGK cells, the ATP↔P_i exchange from oxidative phosphorylation can be isolated from that of glycolysis, facilitating direct measurements of the P:O ratio. In the cells studied, the P:O ratio was 2 to 3.

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Reed, Andrew J. "A Structural and Biochemical Investigation of Human DNA Polymerase Beta". The Ohio State University, 2018. http://rave.ohiolink.edu/etdc/view?acc_num=osu1543317539427082.

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Ducasse-Cabanot, Stéphanie. "MabA, β-cétoacyl-ACP réductase de mycobactérium tuberculosis : propriétés fonctionnelles et structurales et inhibition par l'antibiotique antituberculeux isoniazide". Toulouse 3, 2002. http://www.theses.fr/2002TOU3A201.

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Schmitzberger, Florian Johannes. "Structural studies of two enzymes of pantothenate biosynthesis in Escherichia Coli". Thesis, University of Cambridge, 2004. https://www.repository.cam.ac.uk/handle/1810/264125.

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Abstract (sommario):

Pantothenate (vitamin B5), which is the invariable metabolic precursor to coenzyme A, is synthesized from L-aspartate and alpha-ketoisovalerate in a converging four-step process in bacteria. Here, structural studies of two enzymes of pantothenate biosynthesis in Escherichia coli, L-aspartate-alpha-decarboxylase and ketopantoate hydroxymethyltransferase, are described. Ketopantoate hydroxymethyltransferase catalyzes the transfer of a hydroxymethyl group on to alpha-ketoisovalerate, assisted by the cofactor 5,10-methylene-5,6,7,8-tetrahydrofolate. In order to determine the mode of cofactor binding to the protein, ketopantoate hydroxymethyltransferase was crystallized in the presence of two 5,10-methylene-5,6,7,8-tetrahydrofolate analogues and alpha-ketoisovalerate. X-ray diffraction patterns, collected on the in-house X-ray diffraction data collection facility, extended to 4.0 Angstroem. Unit cell dimensions derived from these diffraction patterns indicate an asymmetric unit with one decameric enzyme. A detailed comparative structural analysis of the fold of ketopantoate hydroxymethyltransferase was carried out. Based on this investigation it was possible to assign the enzyme to the phosphoenolpyruvate/pyruvate enzyme superfamily. Furthermore, similarities in the mode of ligand binding to the catalytic magnesium, as well as differences in the mechanisms between the enzymes within this superfamily could be delineated. In common with a small, but widely distributed, group of mechanistically-related enzymes, L-aspartate-alpha-decarboxylase is translated as an inactive pro-enzyme, which self-processes at a specific site. In this process of intra-molecular protein maturation a covalently bound pyruvoyl cofactor is formed. A fast purification system for eight L-aspartate-alpha-decarboxylase mutants was established that allows production of large amounts of enzyme. In order to gain insights into the molecular mechanism of self-processing, crystallographic studies were carried out. Several of the purified mutants have been crystallized. X-ray diffraction data from glycine 24 to serine and serine 25 to threonine mutants were collected, to a maximum resolution of 1.26 Angstroem. The respective crystal structures were solved by molecular replacement. Along with the structures of an unprocessed, native precursor form of L-aspartate-alpha-decarboxylase and a serine 25 to alanine mutation, the structure models were refined and evaluated, and the models deposited in the Protein Data Bank. Analysis of these four structures together with four other L-aspartate-alpha-decarboxylase mutant structures revealed specific conformational constraints on the self-processing mechanism. Threonine 57 and a water molecule could be identified as catalytic elements, most likely essential for acid-base catalysis, and stabilization of the oxyoxazolidine intermediate in the self-processing reaction. A molecular mechanism for self-processing in L-aspartate-alpha-decarboxylase, largely based on the threonine 57 and a water molecule, is proposed. The differences in the structures of the cleavage site of the serine 25 to alanine and serine 25 to threonine mutants, relative to the structure of the unprocessed native precursor, suggest that molecular models of the cleavage site and mechanisms, based solely on serine to alanine and serine to threonine mutants, may lead to erroneous interpretations of the mechanism. On comparison with other self-processing systems, particularly, glycosylasparaginase, remarkable parallels in the structural features of the environment of the cleavage site were identified.

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Mathieu, Cécile. "Structure et régulation de la glycogène phosphorylase cérébrale". Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2016. http://www.theses.fr/2016USPCC159/document.

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Abstract (sommario):

La glycogène phosphorylase (GP) est l'enzyme clé de la mobilisation du glycogène dans les cellules. Chez l'homme, cette enzyme est retrouvée sous trois isoformes dont une cérébrale (GPc). Ces trois enzymes allostériques sont régulées à la fois par fixation d'effecteurs, et par phosphorylation. Cependant, bien que très similaires, la GPc présentent des caractéristiques de régulation qui lui sont propres. Par ailleurs, la GPc possède dans sa séquence plusieurs résidus cystéines réactifs suggérant que celle-ci peut être soumise à une régulation par les espèces réactives de l'oxygène (EROs). L'objectif de ce travail a donc été d'étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires de la régulation de la GPc. Dans un premier temps, nous avons déterminé la structure de la GPc jusqu'à présent inconnue. Ces analyses ont permis de mettre en évidence les bases structurales de la régulation de la GPc par ses effecteurs allostériques. Nous nous sommes ensuite intéressés à la régulation de cette enzyme par le H2O2. Grâce à des approches de biochimie et de biologie cellulaire, nous avons montré que le H2O2 induit la formation d'un pont disulfure intramoléculaire au niveau du site de fixation de l'AMP, empêchant l'activation de cette enzyme par son effecteur allostérique. Cette régulation, spécifique de la GPc, permet un contrôle de la glycogénolyse par phosphorylation uniquement, en condition oxydante. Enfin, nous avons mis en évidence la capacité de composés environnementaux électrophiles (pesticides) à détourner la régulation redox de la GPc, conduisant à une altération du métabolisme du glycogène et pouvant ainsi participer au développement de pathologies neurodégénératives
Glycogen phosphorylase (GP) is the key enzyme for glycogen mobilization in cells. I human, this enzyme is found as three isoforms : liver GP (lGP), muscle GP (mGP) and brain GP (bGP). These three enzymes are allosteric enzymes, regulated by both the binding of allosteric effectors and phosphorylation. However, despite GPs are highly similar, bGP display distinguishing features. In addition, highly reactive cysteine residues are found in the primary sequence of bGP, suggesting that this enzyme might be regulated by reactive oxygen species (ROS). As a consequence, we investigated the molecular and cellular regulation of the bGP. First, we determined the crystal structure of this enzyme, so far unknown. These data revealed the structural bases of bGP regulation by its allosteric effectors, leading to the activation and the inactivation of the enzyme. We then focused on the regulation of bGP by H2O2, a model of ROS. Using biochemical and cellular approaches, we showed that H2O2 induces the formation of an intramolecular disulfide bond in the AMP binding site of the enzyme, avoiding its regulation by the allosteric effectors, without affecting its regulation by phosphorylation. Under oxidative condition, this regulation, unique to the brain form of GP, allows a control of the glycogenolysis through phosphorylation only. Finally, we demonstrated that electrophilic compounds from the environment (pesticides) might divert the redox regulation of bGP, leading to the alteration of glycogen metabolism which could participate to the development of neurodegenerative diseases

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Lee, Gui-in. "Structure and dynamics of the receptor kinase interacting FHA domain of kinase associated protein kinase from arabidopsis". Free to MU campus, others may purchase, 2003. http://wwwlib.umi.com/cr/mo/fullcit?p3100058.

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Garcia, Pardo Javier. "Structural and functional characterization of regulatory metallocarboxypeptidases: Studies on human carboxypeptidases D and Z, and the transthyretin-like domain". Doctoral thesis, Universitat Autònoma de Barcelona, 2015. http://hdl.handle.net/10803/319703.

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Abstract (sommario):

Las metalocarboxipeptidasas (MCPs) son enzimas zinc-dependientes que hidrolizan amino ácidos del extremo C terminal en proteínas y péptidos. La primera MCP en ser identificada fue la carboxipeptidasa A1 (CPA1), una enzima pancreática que hidroliza residuos C terminales hidrofóbicos. En las décadas siguientes después del descubrimiento de la CPA1, docenas de MCPs adicionales han sido descritas en diferentes tejidos y fluidos extrapancreaticos, comprendiendo un amplio rango de funciones fisiológicas que van desde la digestión de los alimentos hasta la producción de neuropéptidos y hormonas peptídicas o el procesamiento selectivo de la tubulina. La presente tesis tiene como objeto profundizar en el conocimiento de la estructura y función biológica de dos MCPs reguladoras. Para este propósito, se aplicaron un amplio espectro de aproximaciones bioquímicas con el fin de elucidar la actividad biológica de las carboxipeptidasas D y Z humanas. Además, se decidió estudiar por primera vez la estructura y funciones de los dominios tipo transtiretina (TTL) que se encuentran en todos los miembros de esta subfamilia de proteasas, escogiéndose como ejemplo el primer dominio TTL perteneciente al primer dominio catalítico de la carboxipeptidasa D humana (denominada en este trabajo como h-TTL). En el primer capítulo se describe la formación de estructuras amiloides bajo condiciones fisiológicas por el dominio h-TTL, y se descubre que el motivo de plegamiento transtiretina monomérico tiene una propensión inherente a agregar, dada la presencia de elementos estructurales amiloidogénicos preformados. El mecanismo de agregación que se describe en este trabajo para una proteína nativa monomérica tipo transtiretina, también se ha encontrado en diversas proteínas globulares, inicialmente solubles y asociadas con enfermedades conformacionales que se generan por la deposición de agregados, pudiendo ser un hecho genérico para motivos de plegamiento que muestren elementos amiloidogenicos preformados en sus estructuras, esencialmente hojas β. El segundo capítulo muestra la estructura cristalográfica resuelta a súper alta resolución de la h-TTL descrita en el primer capítulo. La información derivada del presente estudio podría facilitar el conocimiento del papel biológico de los dominios TTL encontrados en todos los miembros de la subfamilia M14B, pudiendo ser utilizada como una herramienta interesante para analizar en detalle las propiedades estructurales y los mecanismos de plegamiento de estos dominios. El tercer capítulo comprende la caracterización de la especificidad de sustrato de la carboxipeptidasa D humana, utilizando una combinación de diferentes aproximaciones peptidómicas cuantitativas. Esta enzima única con múltiples centros catalíticos, podría estar implicada en el procesamiento de neuropéptidos y factores de crecimiento. Por lo tanto, el estudio de su mecanismo de acción es de especial relevancia para el campo de la biomedicina. En el cuarto capítulo se describe el desarrollo de un método simple y barato para mejorar la producción proteica de carboxipeptidasas que presentan afinidad por heparina usando células de mamífero, cogiendo como ejemplo el caso de la carboxipeptidasa Z. La proteína purificada mediante este sistema es enzimáticamente activa y puede ser utilizada para estudios estructurales y funcionales de alto rendimiento. En el último capítulo se utilizan diferentes aproximaciones peptidómicas cuantitativas para caracterizar la especificidad de sustrato de la carboxipeptidasa Z humana. Además, en este trabajo se presenta el modelado de su dominio catalítico, así como el de su dominio tipo frizzled, con el fin de analizar su papel en la vía señalización de Wnt.
Metallocarboxypeptidases (MCPs) are zinc-dependent enzymes that cleave single amino acids from the C termini of proteins and peptides. The first MCP to be identified was carboxypeptidase A1 (CPA1), a pancreatic enzyme that removes C-terminal hydrophobic residues. In the ensuing decades since the discovery of CPA1, dozens of additional MCPs have been found in different extra-pancreatic tissues and fluids, comprising a wide range of physiological roles ranging from digestion of food to the production of neuropeptides and peptide hormones and the selective processing of tubulin. The present thesis has the aim to gain insights into the knowledge of the structure and biological functions of two regulatory MCPs. For this purpose, we applied a wide range of biochemical approaches to elucidate biological activities of human carboxypeptidases D and Z. Furthermore, we decided to study for the first time the structure and roles of the transthyretin-like (TTL) domains found in all members of this subfamily of proteases, taking as example the first TTL domain belonging to the first catalytic domain of human carboxypeptidase D (termed here as h-TTL). The first chapter describes the amyloid formation under physiological conditions by h-TTL and unravels that the monomeric transthyretin fold has an inherent propensity to aggregate due to the presence of preformed amyloidogenic structural elements. The aggregation mechanism described in this work for a natively monomeric transthyretin-like protein, is being found also in a number of initially soluble globular proteins associated with protein deposition diseases and might be in fact quite generic for folds displaying preformed amyloidogenic elements in their structures, essentially β-sheets. The second chapter presents the crystal structure solved at ultra-high resolution of the h-TTL described in the first chapter. The information derived in the present study might facilitate the understanding of the biological roles of the TTL domains found in M14B subfamily members and would be an interesting tool to analyze in detail the structural properties and the folding mechanisms of these domains. The third chapter comprises the characterization of the substrate specificity of human carboxypeptidase D by using a combination of quantitative peptidomic approaches. This unique enzyme with multiple catalytic sites might be implicated in the processing of neuropeptides and growth factors. Thereby, the study of its mechanism of action is of significant importance for biomedicine. The fourth chapter describes de development of a simple and inexpensive method to improve protein production of heparin-affinity carboxypeptidases using mammalian cells, taking as example the case of carboxypeptidase Z. The purified protein is enzymatically active and can be used for high-throughput functional and structural studies. The fifth chapter applies several quantitative peptidomic approaches to characterize the substrate specificity of the human carboxypeptidase Z. Furthermore, this work provides the modelling of its catalytic domain, as well as of their frizzled-like domain, in order to analyze their role in Wnt signaling.

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Couvineau, Pierre. "Études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée de cibles thérapeutiques potentielles impliquées dans la régulation de l'équilibre hydrique et des fonctions cardiovasculaires". Thesis, Sorbonne Paris Cité, 2017. http://www.theses.fr/2017USPCB133/document.

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Abstract (sommario):

Ces travaux de thèse s'articulent autour de deux projets : les études structure-fonction de l'aminopeptidase A, d'une part, et celles du récepteur de l'apéline, d'autre part. I/ L'aminopeptidase A (APA, EC 3.4.11.7) est une aminopeptidase monozinc membranaire qui, dans le cerveau, produit l'angiotensine (Ang) III à partir de l'Ang II. L'Ang III est l'un des principaux peptides effecteurs du système rénine-angiotensine cérébral qui exerce un effet stimulateur tonique sur le contrôle central de la pression artérielle chez le rat hypertendu. Ainsi le blocage de l'APA par un inhibiteur spécifique et sélectif, l'EC33 ou sa prodrogue, le RB150, normalise la pression artérielle dans deux modèles expérimentaux d'hypertension artérielle (HTA). L'APA constitue une cible thérapeutique potentielle pour le traitement de l'HTA qui justifie le développement de nouveaux inhibiteurs de cette enzyme plus puissants et plus sélectifs que l'EC33 et avec un profil pharmacodynamique et pharmacocinétique amélioré par rapport au RB150. Pour cela, nous avons construit un modèle tridimensionnel (3D) de l'APA sur la base de la structure cristallographique de l'APA humaine récemment publiée. Nous avons ensuite validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée en démontrant l'implication, d'un résidu du sous-site S1 dans la spécificité de substrat acide de l'APA et de deux résidus formant le sous-site S2' interagissant avec le résidu P2' acide d'inhibiteurs tripeptidiques précédemment développés dans le laboratoire.II/ L'apéline est le ligand naturel du récepteur orphelin humain APJ (ApélineR), un récepteur à sept domaines transmembranaires couplé aux protéines G. L'apéline et son récepteur sont impliqués dans le maintien de l'équilibre hydrique et des fonctions cardiovasculaires. L'ApélineR constitue une cible thérapeutique potentielle dans le traitement de l'insuffisance cardiaque et des rétentions hydriques. Etant donné que la demi-vie de l'apéline dans la circulation sanguine est de l'ordre de la minute, l'objectif est de développer des analogues de l'apéline métaboliquement stables. Pour développer de tels composés, nous avons entrepris de comprendre comment l'apéline se lie à son récepteur et comment elle l'active. Dans ce but, nous avons construit un modèle 3D de l'ApélineR basé sur la structure cristallographique du récepteur aux chimiokines, CXCR4. Nous avons validé ce modèle par des études structure-fonction par modélisation moléculaire et mutagénèse dirigée. Nous avons identifié à la surface du récepteur, les résidus acides des boucles extracellulaires qui interagissent avec les résidus basiques de l'apéline. Nous avons ensuite développé des analogues de l'apéline-17 (K17F) métaboliquement stables par deux stratégies différentes. Premièrement, nous avons substitué chacun des résidus de l'apéline par son énantiomère de la série D ou par un acide aminé synthétique. Deuxièmement, nous avons ajouté une chaîne fluoroalkyle à l'extrémité N-terminale de l'apéline. Ces deux stratégies ont permis d'obtenir plusieurs composés dont les plus actifs sont le P92 et le LIT01-196 qui conservent des propriétés pharmacologiques identiques à celles de K17F et qui présentent une demi-vie plasmatique largement supérieure à celle du peptide endogène. Ces deux analogues se sont révélés particulièrement actifs in vivo avec une capacité à diminuer la pression artérielle et à réduire la sécrétion de vasopressine dans le sang conduisant à une augmentation de la diurèse aqueuse. Les modèles 3D validés de l'APA et de l'ApélineR seront utilisés pour des campagnes de criblage in silico de chimiothèques virtuelles afin de découvrir de nouveaux inhibiteurs de l'APA et des agonistes de l'ApélineR qui pourraient conduire à terme à de nouveaux candidats-médicaments. Ces composés pourraient être utiles pour le traitement de l'HTA et de l'insuffisance cardiaque
The doctoral work was divided in two parts, one on the structure-function studies of aminopeptidase A, and the second one, on those of the apelin receptor. I/ Aminopeptidase A (APA) is a membrane bound monozinc aminopeptidase which generates, in the brain, angiotensin (Ang) III from Ang II. Ang III is one of the main effector peptides of the brain renin-angiotensin system, which exerts a tonic stimulatory action on the control of blood pressure in hypertensive rats. Thus, the blockade of brain APA by a specific and selective inhibitor, EC33 or its prodrug, RB150, normalizes blood pressure in two animal models of arterial hypertension (HTA). APA constitutes a potential therapeutic target for the treatment of HTA that justifies the development of more potent and selective APA inhibitors than EC33, with enhanced pharmacodynamic and pharmacokinetic profiles when compared to RB150. With this aim, we built a three dimensional (3D) model of APA based on the recently published crystal structure of human APA. We validated this model by structure-function studies combining molecular modeling and site-directed mutagenesis demonstrating the crucial role of one residue in the S1 subsite responsible for substrate specificity of APA for N-terminal acidic amino-acid residues and two other residues constituting the S2' subsite of APA involved in the binding of the P2' acidic residue of tripeptidic inhibitors, previously developed in the laboratory. II/ Apelin is the endogenous ligand of the human orphan receptor named APJ (ApelinR), a G protein-coupled receptor. Apelin and ApelinR are involved in the control of body fluid homeostasis and cardiovascular functions. ApelinR constitutes a potential therapeutic target for the treatment of heart failure and water retentions. Given that apelin half-life in the blood circulation is in the minute range, we aimed to develop potent metabolically stable apelin analogs.. In this context, it is necessary to understand how apelin binds to ApelinR and how it is activated. To do so, we build a 3D model of ApelinR based on the crystal structure of the chemokine receptor, CXCR4. We validated this model by structure-function studies by molecular modeling and site-directed mutagenesis. We showed that apelin interacts with the receptor through interactions between the basic residues of the peptide and the acidic residues of the ApelinR, located in the extracellular loops. ,We then developed metabolically stable apelin-17 (K17F) analogs following two different strategies. First, we substituted each residue of K17F by its D-isomer or a synthetic amino-acid. Secondly, we added a fluoroalkyl chain at the N-terminal part of K17F. These two strategies allowed to significantly improve plasma half-life of the modified peptides for several hours without modifying their pharmacological properties as compared to K17F. Two apelin metabolically stable analogs, P92 and LIT01-196, were found to have significantly higher in vivo activity than K17F with a strong capacity to decrease blood pressure and to inhibit vasopressin release in the blood stream inducing an increased aqueous diuresis. These new validated 3D models will be now used to perform in silico screening of virtual chemical libraries to discover new APA inhibitors and ApelinR agonists that could ultimately lead to new drug candidates. These compounds could be useful for the treatment of HTA and heart failure

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Zephyr, Jacqueto. "Robust Drug Design Strategies and Discovery Targeting Viral Proteases". eScholarship@UMMS, 2021. https://escholarship.umassmed.edu/gsbs_diss/1157.

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Abstract (sommario):

Viral proteases play crucial roles in the life cycle and maturation of many viruses by processing the viral polyprotein after translation and in some cases cleaving host proteins associated with the immune response. The essential role of viral proteases makes them attractive therapeutic targets. In this thesis, I provide an introductory summary of viral proteases, their structure, mechanism, and inhibition, while the breadth of this thesis focuses on the Hepatitis C virus (HCV) NS3/4A and Zika virus (ZIKV) NS2B/NS3 viral proteases. HCV NS3/4A protease inhibitors (PIs) have become a mainstay in combination therapies. However, drug resistance remains a major problem against these PIs. In this thesis, I applied insights from the HCV substrate envelope (SE) model to develop strategies for designing PIs that are less susceptible to resistance. Also, I used the HCV NS3/4A protease as a model system to decipher the molecular mechanism and role of fluorination in HCV PIs potency and drug resistance. The drug design strategies described in this thesis have broad applications in drug design. The ZIKV is an emerging global threat, and currently, with no treatment available. In this thesis, I described the discovery, biochemical and antiviral evaluation of novel noncompetitive quinoxaline-based inhibitors of the ZIKV NS2B/NS3 protease. The inhibitors are proposed to interfere with NS2 binding to NS3, thereby preventing the protease from adopting the closed and active conformation. The inhibitors from this work will serve as lead compounds for further inhibitor development toward the goal of developing antivirals.

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Cançado, Fabiane Chaves. "Bases moleculares do efeito do pH na atividas catalítica de duas lisozimas digestivas de Musca domestica (Diptera)". Universidade de São Paulo, 2008. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-22122008-094319/.

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Abstract (sommario):

Lisozimas são enzimas que fazem parte do mecanismo de defesa contra bactérias, no entanto lisozimas com função digestiva também são encontradas no trato digestivo de vertebrados e no intestino médio de insetos. As lisozimas digestivas de insetos são do tipo c e assim compartilham semelhanças estruturais e mecanísticas com a lisozima da clara de ovo de galinha (HEWL). Entretanto, para desempenhar sua função digestiva, as lisozimas de insetos apresentam algumas propriedades particulares entre as quais se destaca um pH ótimo mais ácido em relação às lisozimas não-digestivas. Para elucidar as bases moleculares dessa diferença no pH ótimo, duas lisozimas digestivas (lisozima 1 AAQ20048 e lisozima 2 AAQ20047) da larva de Musca domestica (mosca Diptera Cyclorrhapha), clonadas em Pichia pastoris e purificadas, foram caracterizadas estruturalmente e cineticamente com o substrato sintético (MUQ3) e natural (cápsulas de Micrococcus lysodeikticus). Foi observado que o efeito do pH na atividade das lisozimas 1 e 2 sobre o MUQ3 é uma curva com formato de sino e pH ótimo mais ácido que o da HEWL. Essas curvas foram reflexos da diminuição simultânea dos valores de pKas do nucleófilo e do doador de prótons. Estruturas cristalográficas das lisozimas digestivas de Musca domestica foram obtidas a 1,9 Å e análise comparativa com a estrutura terciária da HEWL revelou resíduos de aminoácidos no ambiente do nucleófilo (N46) e do doador de prótons (S106 e T107) que podem estar envolvidos na modulação das constantes de ionização dos resíduos essenciais à catálise. Esses resíduos foram substituídos via mutagênese sítio-dirigida por D, V e A respectivamente e três mutantes simples (N46D, S106V e T107A) e um triplo (N46DS106V- T107A) foram produzidos e purificados. Caracterização revelou que as contribuições individuais da N46, S106 e T107 foram pequenas e próximas do limite de detecção da técnica utilizada. Por outro lado, o conjunto dos 3 aminoácidos foi responsável pelo pH ótimo ácido frente ao substrato sintético, elevando os valores de pKas do nucleófilo e doador de prótons para valores muito semelhantes ao da HEWL. Diferentemente, essa tripla mutação não foi suficiente para elevar o pH ótimo da lisozima 2 sobre cápsulas de Micrococcus lysodeikticus para valores próximos àqueles de HEWL, sugerindo que as bases moleculares do pH ótimo frente ao substrato natural e sintético são diferentes. Uma comparação estrutural entre lisozima 1 e HEWL sugere que os resíduos de aminoácidos carregados na superfície dessas lisozimas sejam importantes para determinação do pH ótimo. A investigação dessa hipótese foi feita substituindo 5 aminoácidos neutros e 1 ácido, via mutagênese sítio-dirigida, por resíduos básicos. A caracterização do mutante sêxtuplo revelou um aumento significativo nos valores de pH ótimo da lisozima 1, indicando que a redução da basicidade da superfície das lisozimas digestivas é determinante para seus pHs ótimos ácidos.
Lysozymes are enzymes that are part of the defence mechanism against bacteria, however lysozymes with digestive function are also found in the digestive tract of vertebrates and in the insect midgut. The digestive lysozymes from insects are c type, so they share similar structural and mechanistic characteristics with hen egg-white lysozyme (HEWL). However, to perform their digestive function, insect lysozymes present some particular properties among them a more acidic pH optimum than that of non-digestive lysozymes. To elucidate the molecular basis of this pH optimum difference, two digestive lysozymes (lysozyme 1 AAQ20048 and lysozyme 2 AAQ20047) from Musca domestica larvae (housefly Diptera Cyclorrhapha), cloned in Pichia pastoris and purified, were structurally and kinecticly characterized with synthetic (MUQ3) and natural (lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus) substrates. It was observed that the pH effect on the activity of lysozymes 1 and 2 upon MUQ3 is a bell shaped curve exhibiting a more acidic pH optimum than that of HEWL. These curves result from simultaneous decrease of pKas values of the nucleophile and proton donor. Crystallographic structures of these digestive lysozymes from Musca domestica were obtained at 1.9 Å and comparative analysis with the terciary structure of HEWL revealed amino acid residues in the catalytic nucleophile (N46) and proton donor environment (S106 and T107) that may be involved in the modulation of ionization constants of those catalytic residues. N46, S106, and T107 were replaced via site-directed mutagenesis by D, V and A respectively and three simple (N46D, S106V and T107A) and one triple (N46D-S106V-T107A) mutants were produced and purified. Their characterization revealed that the individual contributions of N46, S106 and T107 were small and close to the detection borderline of the technique utilized. On the other hand, a set of these 3 amino acids was responsible by acidic pH optimum upon synthetic substrate, increasing the pKas values of nucleophile and proton donor to similar values to that of the HEWL. Differently, this triple mutation was not enough to increase the pH optimum of lysozyme 2 upon lyophilized cells of Micrococcus lysodeikticus to values close to those of HEWL, suggesting that the molecular bases of pH optimum upon natural and synthetic substrates are different. A structural comparison between lysozyme 1 and HEWL suggests that the charged amino acid residues on the surface of these lysozymes are important for pH optimum determination. The investigation of this hypothesis was done replacing 5 neutral and 1 acidic amino acids, via site-directed mutagenesis, by basic residues. The characterization of this mutant revealed a significant increase in the pH optimum values of lysozyme 1, suggesting that the reduction of basicity on the surface of the digestive lysozymes is a important factor in the determination of their acidic pH optimum.

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Mas, y. Mas Sarah. "Etudes structurales et biochimiques de la γ-kétol réductase chloroplastique d'Arabidopsis thaliana : caractérisation d’une nouvelle classe de « Medium chain dehydrogenase/reductase » impliquée dans la détoxification". Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015GREAV015/document.

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Abstract (sommario):

Sous l'effet du stress oxydatif, la production des espèces réactives de l'oxygène (ERO) est accrue. Les ERO peuvent réagir avec différentes molécules biologiques dont les acides gras polyinsaturés libres ou provenant des lipides membranaires engendrant la formation d'hydroperoxydes d'acides gras. Dans le chloroplaste, ces molécules sont sujettes à de nombreuses modifications enzymatiques ou chimiques aboutissant à la formation d'oxylipines. Les oxylipines participent à la signalisation cellulaire (précurseurs de la voie du jasmonate par exemple), à la défense de la plante (activité antimicrobienne par exemple). Certaines de ces molécules très réactives et toxiques doivent être métabolisées en des produits moins réactifs, par des réactions d'oxydoréduction par exemple.La ceQORH (chloroplast envelope Quinone OxydoReductase Homolog) et IEP32 (Inner Envelope Protein 32) d'Arabidopsis thaliana sont des oxydoréductases chloroplastiques impliquées dans la détoxification de la plante. Elles sont transportées au travers de l'enveloppe du chloroplaste sans clivage de leur peptide de transit par une voie d'import alternative à la voie TOC/TIC (Translocon at the Outer envelope membrane of Chloroplasts et Translocon at the Inner envelope membrane of Chloroplasts). Ces particularités ont fait de la ceQORH et d'IEP32 des enzymes intéressantes à étudier.IEP32 a été purifiée et cristallisée. Les structures de la ceQORH sous forme apo, liée au NADPH et liée au NADP+ et à des inhibiteurs ont été déterminées en utilisant la cristallographie aux rayons X. Leur analyse a permis de mettre en évidence que la ceQORH existe sous différents états oligomériques dans les conditions expérimentales utilisées. Ces observations ont été confirmées par des expériences d'ultracentrifugation analytique. La ceQORH est une enzyme monomérique qui lie le NADPH par l'intermédiaire de son domaine de Rossmann . Le site catalytique, large et hydrophobe, permet à la ceQORH d'accommoder et de réduire un grand nombre de substrat dont le motif commun est la présence d'une fonction alcène en α, β d'un groupement carbonyle. Les constantes d'efficacité et d'affinité étant meilleures pour les γ-kétols que pour les quinones, nous proposons que la ceQORH soit renommée « γ-kétol réductase ».Mots clefs : chloroplaste - Medium chain dehydrogenase/reductase - γ-kétol réductase - oxylipines - oligomérisation - inhibition - cristallographie aux rayons X - ultracentrifugation analytique
Under the influence of the oxidative stress, the production of the Reactive Oxygen Species (ROS) is increased. These compounds can react with various biological molecules like free polyunsaturated fatty acids or derived from lipids producting hydroperoxides of fatty acids. In chloroplast, these molecules are subject to numerous enzymatic or chemical modifications resulting in oxylipins. Oxylipins participate in cell signaling (precursors of the way of the jasmonate for example), or in the defense of the plant (antimicrobial activity). However some of them are very reactive and toxic so they are metabolized in less reactive molecules by oxidoreduction reactions.The ceQORH (chloroplast envelope Quinone OxydoReductase Homolog) and IEP32 (Inner Envelope Protein 32) of Arabidopsis thaliana are chloroplast oxidoreductases involved in the plant detoxification. They are transported through the envelope of the chloroplast without cleavage of their transit peptide by an alternative import pathway of TOC/TIC (Translocon at the Outer envelope membrane of Chloroplasts and Translocon at the Inner envelope membrane of Chloroplasts). In order to better understand their roles, we studied their enzymatic properties and structures.IEP32 was purified and crystallized. The structures apo-ceQORH and bound to the NADPH/ NADP + with inhibitors were determined using X-ray crystallography. The analysis allowed us to show that ceQORH exists under different oligomerization states what was confirmed by results of analytical ultracentrifugation. The NADPH binding to the Rossmann fold induces the monomerization. The catalytic site is large and hydrophobic allowing to ceQORH to reduce many α, β-unsaturated carbonyls of various chain lengths. CeQORH was shown to reduce with high efficiency the reactive double bond of γ-ketols that's why we propose to rename ceQORH by “γ- ketol reductase”.Keywords: chloroplast – Medium chain dehydrogenase/reductase – γ-ketol reductase – oxylipins – oligomerization state – inhibition – X-ray crystallography – analytical ultracentrifugation

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Tesi sul tema "Enzymologie structurale"

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