Tesi sul tema "Dosage génétique"

La compensation de dose est le processus qui permet d’égaliser le niveau d’expression des gènes liés au X entre les mâles et les femelles. Chez la Drosophile, ce processus a lieu par le doublement de la transcription des gènes grâce à la fixation du complexe de compensation de dose sur le chromosome X des mâles. Chez les femelles, la traduction de l’ARN msl-2, codant pour une sous unité du complexe, est réprimée par la protéine SXL empêchant ainsi la formation du complexe. Pour élucider les mécanismes moléculaires de cette répression, des expériences de traduction in vitro ont permis la mise en évidence d’une région requise pour l’inhibition de msl-2 reconnue par UNR, un co-facteur de SXL, préalablement identifié comme impliqué dans le mécanisme de répression de la compensation de dose chez les femelles. L’étude in vivo d’un mutant hypomorphe de UNR a montré qu’une partie de msl-2 était transcrite chez les femelles mutantes, capable ainsi de former le complexe de compensation sur les sites d’affinité des chromosomes X. Curieusement, l’ensemble des membres du complexe était cependant faiblement recruté sur le chromosome X des mutants mâles dont la chromatine était anormalement relaxée. En inactivant la fonction de UNR par RNAi sur des cellules mâles en culture, ces phénotypes ont été reproduits sans que la distribution des composants du complexe ne soit perturbée. Ces résultats ont permis de découvrir une nouvelle fonction pour UNR chez la Drosophile qui, en participant à l’inhibition de la compensation de dose par la répression de msl-2 chez les femelles, agit de manière opposée chez les males en contribuant à l’assemblage du DCC sur le chromosome X
Dosage compensation is the process by which the expression levels of X-linked genes are equalized between males and females. In Drosophila, binding of the dosage compensation complex to the single X chromosome of males causes a twofold increase of gene expression levels on this chromosome, thereby achieving the same level of expression as in females. In female flies, in contrast, the complex cannot be assembled because of the translational repression of one of its subunits, MSL2, by the binding of the female specific protein, SXL, to its RNA untranslated region. To understand the molecular mechanisms of msl-2 translational repression, in vitro translation experiments have identified a region necessary for msl-2 inhibition where UNR, a SXL co-factor, can indeed bind, highlighting its importance for dosage compensation repression in female flies. Strong evidence in support of such a function for UNR was provided by an in vivo study of a UNR hypomorphic mutant. Despite the low levels of MSL2 in mutant females, they were sufficient for the assembly and binding of the dosage compensation complex on the X “high affinity sites”. Curiously, in mutant males, the complex was weakly recruited to the single X chromosome where X chromatin was highly decondensed. RNAi inactivation of UNR in cultured male cells reproduced this phenotype without affecting the distribution of the complex components suggesting a major role for UNR in dosage compensation in males effected through chromatin regulation. Taken together, these observations uncover dual, sex-specific functions of UNR in X chromosome dosage compensation: repressing msl-2 expression in female flies while promotion DCC recruitment in males

La méiose est un processus essentiel pour le maintien de la fertilité mais aussi la création de diversité par la génération de nouvelles combinaisons alléliques via les cross-overs (CO). Récemment, de plus en plus d’éléments insistent sur l’importance du dosage des protéines méiotiques dans la régulation de la formation des CO. Allant dans ce sens, j’ai étudié pendant ma thèse l’effet dosage de la protéine méiotique HEI10 sur la formation du nombre de CO, chez 2 Brassicacées allopolyploïdes : le colza et la cameline, présentant respectivement 5 et 3 copies d’HEI10. J’ai ainsi pu montrer qu’HEI10 est indispensable à la formation des CO de classe I chez la cameline ainsi que confirmer son effet dosage. Des résultats inattendus ont été obtenus pour de faibles doses d’HEI10, insistant sur l’apport des espèces polyploïdes pour de telles études. J’ai aussi travaillé sur la génération de lignées inductrices d’haploïdes, outils utiles pour l’étude de la recombinaison homéologues, chez ces 2 espèces en générant des lignées mutées dmp
Meiotic regulation is an essential process not only for maintaining fertility, but also for creating diversity through the generation of new allelic combinations via cross-overs (CO). Recently, more and more evidence has emerged in support of the importance of meiotic protein dosage in the regulation of CO formation. With this in mind, during my thesis, I studied the effect of meiotic protein HEI10 dosage on CO formation in 2 allopolyploid Brassicaceae: rapeseed and camelina, with carry 5 and 3 copies of HEI10 respectively. I was thus able to show that HEI10 is essential for the formation of class I CO in camelina, and to confirm its dosage effect. Unexpected results were shown for low doses of HEI10, emphasizing the contribution of polyploid species for such studies. I also worked on the generation of haploid-inducing lines, useful tools for the study of homoeologous recombination, in these 2 species by generating dmp mutated lines

Les anomalies de dosage génique, ou aneusomies, dues à des amplifications, des duplications ou des délétions de segments chromosomiques sont à l'origine de nombreuses maladies ou syndromes génétiques. Dans un souci d'efficacité, nous avons choisi de nous tourner vers une approche nouvelle : l'hybridation génomique comparative sur puces à ADN ou array-CGH. Les puces contiennent des marqueurs de la région chromosomique d'intérêt et sont hybridées simultanément avec les ADN d'un individu contrôle et d'un patient portant l'anomalie chromosomique marqués par deux fluorochromes. Le rapport du signal d'hybridation entre les ADN contrôle et du patient est calculé au niveau de chaque marqueur et l'étendue de la zone concernée par l'aneuploidie peut être définie. Nous avons mis en oeuvre et optimisé cette technique dans la caractérisation de délétions de patients atteints du syndrome de Rubinstein-Taybi en utilisant différents types de marqueurs permettant d'augmenter la résolution de la technique
Genomic abnormalities, such as deletions, duplications or amplifications of chromosome segments are responsible for a number of genomic disorders. Array-CGH, a recent technology, seems very appropriate to identify these aberrations. Array-CGH microarrays contain various genomic fragments derived from the studied locus, as well as other control loci that are hybridized with genomic DNA from a patient and from a reference, labeled with distinct fluorochromes. Fluorescence intensity ratios between test and reference labeled DNA are calculated for each fragment and the length of the aberration could thus be defined. We used and optimized this technology to identify deletions in Rubinstein-Taybi patients, with different kinds of targets to increase the resolution of array-CGH

La consommation excessive d'alcool présente des risques élevés pour l'individu et pour la société ; elle est fréquemment associée à une augmentation du risque d'accidents, d'actes de violence, et peut également conduire à court et/ou à long terme à de graves maladies et à des problèmes sociaux. Dès lors, l'utilisation de marqueurs fiables permettant de détecter une consommation excessive d'alcool, ponctuelle ou chronique, s'avère nécessaire pour prévenir des conséquences néfastes de l'abus d'alcool. L'éthylglucuronide (EtG) est un marqueur d'alcoolisation utilisé en toxicologie clinique (alcoologie) et médicolégale. Par rapport aux marqueurs indirects d'alcoolisation (CDT, γ-GT), ce métabolite mineur de l'éthanol est très spécifique et est quantifiable dans diverses matrices biologiques. La production d'EtG est catalysée par des enzymes de la famille des UDP-glucuronosyl-transférases (UGT). Cependant, les UGT impliquées dans la glucuronoconjugaison de l'éthanol, ainsi que les sources potentielles de variabilité interindividuelle de la production d'EtG, sont encore mal connues. Nos travaux ont ainsi consisté à (1) développer et valider une méthode de dosage de l'EtG dans différentes matrices biologiques par chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse en tandem, (2) identifier les UGT humaines impliquées dans la glucuronoconjugaison de l'éthanol et étudier la contribution relative de chaque isoforme active au niveau hépatique, (3) étudier l'impact de substances fréquemment utilisées par les consommateurs d'alcool sur la production d'EtG in vitro, (4) étudier l'impact de polymorphismes génétiques fonctionnels des UGT sur la production hépatique d'EtG, et enfin (5) évaluer l'impact de la consommation de cannabis et d'autres drogues sur la production d'EtG à l'aide de prélèvements post-mortem. Ces travaux ont notamment permis de montrer que (1) l'éthanol est glucuronoconjugué principalement par le foie, puis dans une moindre mesure par les reins et par l'intestin, (2) les UGT1A9 et 2B7 sont les deux enzymes majoritairement impliquées dans la glucuronoconjugaison de l'éthanol, quel que soit l'organe considéré, (3) la morphine, la codéine, la nicotine et la cotinine n'entraînent aucune modification des taux de production d'EtG in vitro ; le lorazépam et l'oxazépam augmentent légèrement cette production (p = 0,2 et 0,065, respectivement) ; le cannabidiol inhibe la glucuronoconjugaison de l'éthanol par un mécanisme non-compétitif (CI50 = 1,17 mg/L; Ki = 3,1 mg/L), alors que le cannabinol augmente cette glucuroconjugaison de manière concentration-dépendante (p <0,05), (4) les SNP c.-900G>A affectant l'UGT2B7 et IVS1+399T>C affectant l'UGT1A9 augmentent légèrement la production d'EtG in vitro. Enfin (5) le rapport des concentrations sanguines EtG/éthanol apparaît significativement plus élevé chez des co-consommateurs de cannabis et/ou d'autres drogues que chez des consommateurs d'alcool seul. L'ensemble de ces résultats démontre l'existence de plusieurs facteurs pouvant potentiellement influencer la production d'EtG et devraient donc être pris en considération lors de l'interprétation de sa concentration in vivo.

Chez les mammifères femelles, le processus d’inactivation du chromosome X (XCI) assure la compensation de dose entre les deux sexes. Chez la souris, l’inactivation du X est établie de manière aléatoire dans l’épiblaste au stade blastocyste et peut être récapitulée in vitro dans les cellules souches embryonnaires. L’ARN non-codant Xist, exprimé à partir du centre d’inactivation du X (Xic), est le régulateur principal de ce processus. Il décore en cis le chromosome choisi pour être inactivé et initie la répression de ses gènes. Ainsi, de manière remarquable, les deux chromosomes X sont traités différemment pendant l’initiation de la XCI malgré leur homologie de séquence et leur localisation au sein d’un même noyau. De manière remarquable, ce processus implique le traitement différentiel de deux chromosomes homologues au sein d’un même noyau, avec des changements d’environnements nucléaires et chromatiniens entre le X actif et le X inactif. Il a été proposé que la localisation nucléaire pourrait jouer un rôle important dans l’initiation de l’expression monoallélique des gènes, non seulement pour l’initiation de la XCI mais aussi pour des processus tels que l’exclusion allélique dans les cellules lymphoides. Par exemple, l’association de loci avec des compartiments hétérochromatiques nucléaires et l’association en trans de loci homologues pourraient être impliquées dans la régulation des gènes monoalléliques. Ainsi, j’ai utilisé le système bactérien TetR/TetO afin d’analyser le rôle de l’organisation nucléaire du chromosome X et du Xic dans l’initiation de la XCI. J’ai pu montrer que si le recrutement des protéines de fusion TetR-LaminB1 ou -Cbx5 au niveau de la cassette TetO insérée dans le Xic permet la répression des gènes à proximité, cet évènement n’est pas toujours accompagné d’une relocalisation nucléaire. De plus, l’association forcée du Xic avec la périphérie nucléaire (TetR-LaminB1) n’a pas d’influence sur le choix du chromosome X à inactiver. Enfin, si la relocalisation des deux Xic à la périphérie nucléaire induit une réduction des évènements d’association en trans entre les deux loci, elle n’a pas d’effet sur l’initiation de l’inactivation. En résumé, ces résultats suggèrent que l’organisation nucléaire du chromosome X et du Xic et l’association des Xic en trans ne sont pas des facteurs déterministes pour le choix et l’initiation de la XCI, mais pourraient être le résultat des changements d’expression des gènes liés à l’X au cours de la différenciation des cellules souches ainsi que de l’augmentation de l’expression de Xist.Enfin, j’ai également analysé le rôle de la protéine CTCF, qui a été proposée pour être importante dans l’organisation structurale du génome, dans le contexte du Xic et de l’initiation de l’inactivation. Ainsi, le recrutement de CTCF au niveau de cassette TetO insérée dans le Xic induit localement une réduction mineure des interactions en cis et la répression des gènes du Xic, à l’exception de Xist dont l’expression est augmentée. Pour autant, la présence ectopique de CTCF n’a pas d’incidence majeure sur l’organisation générale du Xic
X-chromosome inactivation (XCI) ensures dosage compensation in female mammals. Random XCI is established in the epiblast of female mouse embryos and can be recapitulated in vitro in differentiating embryonic stem cells (ESCs). The major regulator of XCI is the long non-coding RNA Xist, which is expressed from the X-inactivation center (Xic), covers the chromosome in cis and initiates gene silencing. During XCI, the two X chromosomes are treated very differently, despite their homology and the fact that they reside in the same nucleus. Nuclear localization has been hypothesized to play a role in monoallelic gene regulation, not only during XCI but also in other contexts. For example, association with heterochromatin and homologous trans interactions (“pairing”) have been implicated in the establishment of monoallelic gene expression in lymphoid cells and transient pairing has been suggested to participate in symmetry breaking during random XCI. Using the bacterial tetO/tetR system to alter the subnuclear localization and environment of one or both Xics, we have tested the function of subnuclear localization and trans interactions between the Xic loci during initiation of XCI. Using stable expression and reversible binding of TetR fusion proteins (e.g. LaminB1, Cbx5) we show that binding of these proteins can induce local gene repression and chromatin changes, although this is not always associated with subnuclear relocalization. We further show that the forced association of the Xic with the nuclear envelope, does not impact on the choice-making process during XCI. In particular, tethering both Xics to the nuclear lamina during early ESC differentiation resulted in a substantial reduction of homologous pairing events, but had no obvious impact on the onset of random, monoallelic Xist expression. Taken together, our results suggest that nuclear localization and trans interactions of the Xic may be downstream events rather than causal in the regulation of the XCI process.Furthermore, we recruited CTCF, a protein suggested to be involved in structural organization of the genome, to the Xic using the tetO/tetR system. Upon binding of CTCF the overall structure of the Xic remained unaltered though few cis interactions appeared to be weakened, which was accompanied by gene repression in the Xic. Surprisingly, the only upregulated gene in the Xic was Xist in ESCs and during differentiation, which demonstrates that the induced minor changes of cis interactions might impact on gene regulation in the Xic

Les altérations les plus fréquentes et les plus caractéristiques du syndrome de Down (SD) sont les troubles de l'apprentissage et la dysmorphie crâniofaciale (CF). Le phénotype CF comprend des dimensions réduites de la tête, une brachycéphalie, une région orbitale médio-latérale réduite, une largeur bizygomatique réduite, un petit maxillaire, une petite mandibule et une variabilité individuelle accrue. Jusqu'à présent, les mécanismes cellulaires et moléculaires qui sous-tendent ce phénotype CF restent inconnus. Cette thèse, utilisant un nouveau panel de modèles de rats et de souris, a proposé de nouveaux gènes candidats pour le phénotype SD-CF. Nous avons confirmé le rôle de Dyrk1a dans la brachycéphalie du neurocrâne et identifié le surdosage du facteur de transcription Ripply3 pour le raccourcissement de la face médiane par la sous-régulation de Tbx1, un autre facteur de transcription impliqué dans des phénotypes similaires trouvés dans le syndrome de DiGeorge. Nous avons défini de nouveaux gènes sensibles au dosage responsables des malformations du SD-CF, et de nouveaux modèles ont été proposés pour sauver le phénotype SD-CF. Ces nouvelles connaissances pourraient également permettre de mieux comprendre les phénotypes cérébraux et cardiovasculaires spécifiques observés chez les mutants Tbx1 et les modèles de DS
The most frequent and distinctive alterations found in Down syndrome (DS) are learning disability and craniofacial (CF) dysmorphism. The CF phenotype includes reduced head dimensions, brachycephaly, reduced mediolateral orbital region, reduced bizygomatic breadth, small maxilla, small mandible, and increased individual variability. Until now, the cellular and molecular mechanisms underlying this CF phenotype remain unknown. This thesis, using a new panel of rats and mice models proposed new candidate genes for the DS-CF phenotype. We confirmed the role of Dyrk1a in neurocranium brachycephaly and identified the overdosage of the transcription factor Ripply3 for midface shortening through the downregulation of Tbx1, another transcription factor involved in similar phenotypes was found in Di George Syndrome. We defined new dosage-sensitive genes responsible for DS-CF malformations, and new models were proposed to rescue the DS-CF phenotype. This new knowledge may also lead to insights for specific brain and cardiovascular phenotypes observed in Tbx1 mutants and DS models

Les nématodes à galles (Meloidogyne spp.) sont des pathogènes cosmopolites extrêmement polyphages. L’emploi de la majorité des nématicides chimiques étant désormais interdit, la meilleure alternative repose sur l’utilisation de gènes majeurs de résistance (gènes R). Cependant, il existe un risque de contournement de ceux-ci et les ressources génétiques en termes de gènes R sont limitées. Une gestion qui permette de pérenniser l’utilisation de ces ressources d’intérêt agronomique est donc primordiale. Me1 et Me3 sont deux gènes R à large spectre du piment actuellement utilisés dans les programmes de sélection. La confrontation vis-à-vis de M. incognita de différents génotypes possédant l’un de ces deux gènes a montré que (1) le fond génétique de la plante joue un rôle clé sur l’efficacité de ces gènes R, (2) il n’existe pas d’effet du dosage d’allèles pour ces gènes R. Suite à ces résultats, une recherche de loci à caractère quantitatif (QTLs) a été réalisée afin d’identifier et de localiser des facteurs de résistance partielle susceptibles d’expliquer les différences observées entre les différents fonds génétiques. L’étude de tels facteurs vis-à-vis de M. incognita, M. arenaria et M. javanica, les trois principales espèces de nématodes à galles, a mis en évidence quatre nouveaux QTLs. Tous sont regroupés sur le chromosome P1 du piment, sauf un efficace vis-à-vis de M. javanica situé sur le chromosome P9. C’est la première fois que des facteurs de résistance aux nématodes à galles sont localisés sur le chromosome P1. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives quant à la création de nouvelles variétés avec un potentiel accru en termes de résistance aux Meloidogyne
Root-knot nematodes (RKNs), Meloidogyne spp., are extremely polyphagous plant parasites worldwide. Since the use of most chemical nematicides is being prohibited, genetic resistance is an efficient alternative way to protect crops against these pests. However, nematode populations proved able to breakdown plant resistance, and genetic resources in terms of resistance genes (R-genes) are limited. Sustainable management of these valuable resources is thus a key point of R-gene durability. In pepper, Me1 and Me3 are two dominant major R-genes, currently used in breeding programs to control M. arenaria, M. incognita and M. javanica, the three main RKN species. Challenging these two genes in different genetic backgrounds against M. incognita demonstrated that (1) the efficiency of the R-genes in reducing the reproductive potential of RKNs is strongly affected by the plant genetic background, (2) the allelic status of the R-genes has no effect on nematode reproduction. According to these first results, a QTL analysis was performed to identify and to localize partial resistance factors against RKNs which could explain the differences observed between the genetic backgrounds. Focusing on M. incognita, M. arenaria and M. javanica, four new major QTLs were localized. They are all regrouped on pepper chromosome P1 except one QTL efficient against M. javanica, which was located on pepper chromosome P9. The cluster on chromosome P1, regrouping most of the newly discovered resistance factors, is described for the first time with respect to RKN resistance. As a conclusion, this work should contribute to the breeding of new pepper varieties with a high level of resistance against RKNs

Les nématodes à galles (Meloidogyne spp.) sont des pathogènes cosmopolites extrêmement polyphages. L’emploi de la majorité des nématicides chimiques étant désormais interdit, la meilleure alternative repose sur l’utilisation de gènes majeurs de résistance (gènes R). Cependant, il existe un risque de contournement de ceux-ci et les ressources génétiques en termes de gènes R sont limitées. Une gestion qui permette de pérenniser l’utilisation de ces ressources d’intérêt agronomique est donc primordiale. Me1 et Me3 sont deux gènes R à large spectre du piment actuellement utilisés dans les programmes de sélection. La confrontation vis-à-vis de M. incognita de différents génotypes possédant l’un de ces deux gènes a montré que (1) le fond génétique de la plante joue un rôle clé sur l’efficacité de ces gènes R, (2) il n’existe pas d’effet du dosage d’allèles pour ces gènes R. Suite à ces résultats, une recherche de loci à caractère quantitatif (QTLs) a été réalisée afin d’identifier et de localiser des facteurs de résistance partielle susceptibles d’expliquer les différences observées entre les différents fonds génétiques. L’étude de tels facteurs vis-à-vis de M. incognita, M. arenaria et M. javanica, les trois principales espèces de nématodes à galles, a mis en évidence quatre nouveaux QTLs. Tous sont regroupés sur le chromosome P1 du piment, sauf un efficace vis-à-vis de M. javanica situé sur le chromosome P9. C’est la première fois que des facteurs de résistance aux nématodes à galles sont localisés sur le chromosome P1. Ce travail ouvre de nouvelles perspectives quant à la création de nouvelles variétés avec un potentiel accru en termes de résistance aux Meloidogyne
Root-knot nematodes (RKNs), Meloidogyne spp., are extremely polyphagous plant parasites worldwide. Since the use of most chemical nematicides is being prohibited, genetic resistance is an efficient alternative way to protect crops against these pests. However, nematode populations proved able to breakdown plant resistance, and genetic resources in terms of resistance genes (R-genes) are limited. Sustainable management of these valuable resources is thus a key point of R-gene durability. In pepper, Me1 and Me3 are two dominant major R-genes, currently used in breeding programs to control M. arenaria, M. incognita and M. javanica, the three main RKN species. Challenging these two genes in different genetic backgrounds against M. incognita demonstrated that (1) the efficiency of the R-genes in reducing the reproductive potential of RKNs is strongly affected by the plant genetic background, (2) the allelic status of the R-genes has no effect on nematode reproduction. According to these first results, a QTL analysis was performed to identify and to localize partial resistance factors against RKNs which could explain the differences observed between the genetic backgrounds. Focusing on M. incognita, M. arenaria and M. javanica, four new major QTLs were localized. They are all regrouped on pepper chromosome P1 except one QTL efficient against M. javanica, which was located on pepper chromosome P9. The cluster on chromosome P1, regrouping most of the newly discovered resistance factors, is described for the first time with respect to RKN resistance. As a conclusion, this work should contribute to the breeding of new pepper varieties with a high level of resistance against RKNs

La doxycycline est l’une des molécules recommandées par l’OMS en prophylaxie pour les voyageurs dans les zones d’endémie palustre, en particulier dans les zones de multirésistance. Une étude récente avait suggéré que les isolats de P. falciparum présentaient différents niveaux de sensibilité à la doxycycline et que l’augmentation du nombre de copies de deux gènes, pfmdt ou pftetQ, pouvait être associée à une baisse de sensibilité.Le premier objectif de ce travail a consisté à valider ce modèle à partir d’un nouvel échantillonnage d’isolats africains. Le second objectif était d’évaluer le nombre de copies de ces deux gènes sur des isolats originaires de Thaïlande. Le troisième objectif a consisté à rechercher d’autres sources de résistance en investiguant le polymorphisme des gènes codant l’ARN ribosomal plasmodial potentiellement impliqués dans la résistance in vitro à la doxycycline.Les résultats nous ont permis de confirmer que le nombre de copies des gènes pfmdt ou pftetQ pouvait être impliqué dans la résistance in vitro à la doxycycline en Afrique. Les résultats concernant les isolats Thaï n’ont pas permis de corréler le nombre de copies des gènes pfmdt et pftetQ au phénotype CI50. Ces éléments montrent que ce mécanisme de résistance seul est insuffisant pour expliquer la résistance à la doxycycline ; les résultats sont en faveur d’une résistance médiée par plusieurs gènes.La recherche de points de mutation sur le gène pfssrRNA codant pour la petite sous-unité ribosomale de l’ADN plasmodial n’a pas abouti. D’autres cibles moléculaires sont en cours d’étude pour expliquer les mécanismes de résistance de P. falciparum à la doxycycline
Doxycycline is currently one of the recommended chemoprophylactic regimens for travellers visiting malaria-endemic, particularly in countries with a high prevalence of resistance to chloroquine and multiresistance. A previous study suggested that increased pfmdt or pftetQ copy number could be associated with a lower susceptibility to doxycycline.The first aim of this study was to validate the pre-established model involving these two molecular markers with other African isolates. The second was to evaluate these markers in P. falciparum isolates coming from a multiresistance area in Thaïland. The third was to investigate the eventual association between the polymorphism in genes encoding ribosomal rRNA and in vitro resistance to doxycycline.The results confirm that pfmdt or pftetQ copy numbers should be involved in in vitro susceptibility to doxycycline in African P. falciparum isolates. The results concerning the Thai isolates indicate that there is no correlation between the pfmdt and pftetQ genes copy numbers and the belonging to the high doxycycline IC50 phenotype; this implies that this mechanism of resistance is not enough by itself to explain resistance to doxycycline; it augurs that the resistance to doxycycline should be controlled by multiple genes, and that these genetic markers could be continent-dependent. The search for points of mutation in isolates from the different doxycycline IC50 phenotypic groups has not resulted with pfssrRNA. Other therapeutic targets are being considered to explain P. falciparum resistance to doxycycline

La thrombose coronaire est au centre de la physiopathologie des syndromes coronariens aigus et le traitement antiagrégant plaquettaire par aspirine et clopidogrel joue un rôle majeur dans la prise en charge thérapeutique de ces syndromes. Nous présentons dans ce travail six études clinico-biologiques centrées sur le syndrome coronarien aigu et son traitement antiplaquettaire. La première étude apporte de nouvelles données sur l'impact de l'âge sur la réactivité plaquettaire sous clopidogrel. La deuxième étude s'est intéressée aux déterminants cliniques, angiographiques et génétiques de la thrombose de stent dans une étude cas témoin multicentrique (123 thromboses et 246 témoins). La troisième étude est une étude de phase IV qui s'est intéressée à la mesure de la réactivité plaquettaire en utilisant trois tests biologiques différents dans une population non sélectionnée de patients traités par prasugrel, une nouvelle thiénopyrididine. La quatrième étude s'est intéressée dans une population de sujets sains exposés au tabagisme passif, aux effets de la législation interdisant le tabagisme dans les lieux publics sur les paramètres d'hémostase incluant les propriétés visco-élastiques du caillot de fibrine, la réactivité plaquettaire et inflammation. La cinquième étude est une étude clinique randomisée (ABOARD) dont l'objectif était de préciser le délai optimal pour la réalisation d'une coronarographie dans les syndromes coronariens aigus sans sus-décalage de ST. La sixième étude s'est intéressée aux complications hémorragiques des traitements antiplaquettaires et antithrombotiques dans l'étude ABOARD
Coronary thrombosis plays a central role in acute coronary syndromes and the combination of aspirin and clopidogrel are a mainstay therapy for these syndromes. We present in this work six studies "clinico-biological projects " focused on acute coronary syndrome and antiplatelet agents. The first study provides new datas on the impact of age on platelet reactivity in response to clopidogrel. The second study examined the clinical, angiographic and genetic determinants of stent thrombosis in a multicenter case control study (123 cases and 246 controls). The third study is a phase IV study, which was focused on the measurement of platelet reactivity using three different biological tests in an unselected population of patients treated with prasugrel, a new thienopyrididine. The fourth study examined a population of healthy subjects exposed to second-hand smoking, the effects of legislation prohibiting smoking in public places on the parameters of haemostasis including viscoelastic properties of fibrin clot, platelet reactivity and inflammation. The fifth study was a randomized clinical trial (ABOARD) and the objective of the study was to determine the optimal timing to realize angiography in acute coronary syndromes without ST segment elevation. The sixth study was concerned with hemorrhagic complications of antithrombotic therapies in the ABOARD study

La thrombose coronaire, un phénomène de coagulation pourtant physiologique, va entraîner, de part la brutalité de son apparition dans un espace confinée -l'artère coronaire- une anoxie aiguë et des dommages myocardiques irréversibles dont les conséquences à court et à long terme peuvent être catastrophiques en terme de morbi-mortalité. Parmi les cinq « projets clinico-biologiques » présentés ici, le premier est la première observation ex-vivo chez l'homme de la dynamique de composition du thrombus responsable de l'occlusion intracoronaire lors d'un infarctus du myocarde. Le second, est un projet princeps démontrant qu'il existe un impact de la transfusion de globule rouge sur la réactivité plaquettaire et apporte des réponses quand à la physiopathologie de l'effet délétère rapporté associé à cette thérapeutique. Le troisième est une étude génétique sur les déterminants de l'architecture et la fonction du réseau de fibrine composant le thrombus et valide le concept de l'existence d'une résistance pharmacogénétique à la fibrinolyse chez certains patients. La quatrième étude est une étude pharmacologique concernant la variabilité de la réponse au traitement par le clopidogrel et démontre l'utilité de l'augmentation de la dose afin de surmonter la mauvaise réponse de certain patients et d'améliorer leur pronostic. Enfin, la cinquième étude porte sur la validation d'un test biologique rapide de mesure de l'activité anticoagulante obtenue par l’énoxaparine dans le but d'optimiser et d'individualiser la prise en charge des patients devant subir une revascularisation par angioplastie percutanée des artères coronaires occluses par une thrombose
Coronary thrombosis, a coagulation phenomenon yet physiological, lead, because of the brutality of his appearance in a confined space -the coronary artery- to an acute anoxia and irreversible myocardial damage whose consequences in the short and long term can be catastrophic in terms of morbidity and mortality. Among the five "clinico-biological projects" presented here, the first observation is the first ex-vivo study in human of the dynamics of composition of the thrombus responsible for the occlusion during intracoronary myocardial infarction. The second project is a princeps study demonstrating that there is an impact of red blood cells transfusion on platelet reactivity and provides answers on the pathophysiology of the reported harmful effects associated with this therapy. The third is a study on genetic determinants of the architecture and fonction of the network of fibrin, a major component of the thrombus and validates the concept of the existence of pharmacogenetic résistance to fibrinolysis in some patients. The fourth study is a pharmacological study on the variability of response to treatment by clopidogrel and demonstrates the usefulness of increasing the dose to overcome the poor response of some patients and improve their prognosis. Finally, the fifth study concerns the validation of a rapid biological test for measuring the anticoagulant activity obtained with enoxaparin in order to optimize and individualize the care of patients undergoing percutaneous revascularization with angioplasty of occluded coronary arteries

L'hadronthérapie est une modalité d'irradiation récente particulièrement attractive. Les ions, par leur profil caractéristique de dépôt de dose dans la matière et leur efficacité biologique accrue, sont des particules parfaitement adaptées pour le traitement du cancer. C'est une modalité émergente et les travaux de recherche et de développement qui en font l'objet se poursuivent de manière soutenue. Cependant, il n'existe à ce jour aucun outil permettant de quantifier pour le patient le gain clinique associé aux améliorations proposées, comme l'apport d'une gantry par exemple. Nous proposons dans ce travail de concevoir un module de planification inverse du traitement pour un but prospectif. Détachée des contraintes usuelles de précision et de temps de calcul, notre méthode d'optimisation se base sur un algorithme génétique afin d'approcher d'une solution globale vis-à-vis d'un grand nombre de paramètres balistiques (champs d'irradiation libres) et en associant les diverses régions d'intérêt dosimétrique. La stratégie d'optimisation retenue est progressivement complexifiée afin de prendre en compte de manière efficace les différents enjeux de la planification. La robustesse du plan vis-à-vis des incertitudes inhérentes au traitement, primordiale en hadronthérapie, est évaluée. Dans toutes les situations testées, il apparaît que l'inclusion dans l'optimisation de paramètres habituellement fixés manuellement permet une amélioration de la qualité de traitement. Nous proposons au terme de cette étude un outil prospectif d'optimisation au réglage simple et capable de mener des études comparées sur la pertinence de nouvelles modalités d'irradiation.

Les technologies bipolaires jouent des rôles primordiaux dans les systèmes spatiaux soumis à des conditions radiatives. Dans un environnement ionisant, le courant de base des transistors bipolaires augmente et le gain en courant diminue. L'augmentation de la recombinaison dans la région de déplétion base-émetteur est le mécanisme principal responsable de l'accroissement du courant de base. Pour une même dose totale, de nombreuses technologies bipolaires se dégradent plus à faible débit de dose qu'à fort débit ce qui soulève un problème au niveau du durcissement. Des méthodes de prédiction de la réponse faible débit de dose, utilisant les moyens disponibles en laboratoires, telle que les irradiations en températures, ont données des résultats prometteurs pour l'identification de technologies montrant une augmentation de la dégradation à faible débit de dose. Cependant, aucun test s'appliquant à toutes les technologies bipolaires n'a été identifié. C'est dans ce cadre que s'inscrit notre travail de thèse. Ce travail consiste à étudier et à améliorer les méthodes de test actuelles dans le but d'établir un unique test applicable à toutes les technologies bipolaires. En se basant sur un travail expérimental, une explication physique des phénomènes se produisant au cours d'irradiations à températures élevées a été donnée et un modèle de dégradation a été développé. A partir de l'observation des résultats obtenus, une nouvelle approche du test de composants est proposée. Cette approche est basée sur la commutation d'un fort débit de dose vers un faible débit
Bipolar technologies play a variety of important roles in space systems where they are exposed to radiation. In an ionizing environment, the base current of bipolar transistors increases and the current gain decreases. Increased recombination in the emitter-base depletion region is the main mechanism responsible for the increased base current. Many bipolar technologies degrade more at low dose rates than at high dose rates for a given total dose what is a difficult hardness assurance challenge. Methods of predicting the low-dose-rate response using laboratory dose rates, including irradiation at high temperature, have been reasonably successful at identifying technologies that suffer from ELDRS, but it is still difficult to identify a single test for all bipolar technologies. The aim of this work is then to investigate and improve the present methods in order to establish a sigle test for all bipolar technologies. Based on experimental results, physical explanation of phenomena occurring during elevated temperature irradiations has been proposed and a model of degradation has been expanded. From the observation of all the obtained results, a new approach of the device testing, based on the switching from high dose rate to low dose rate has been proposed

La lignee cellulaire d'epinard g20 necessite une source de carbone organique pour croitre, en culture aerees, les celules perdent leur chlorophylle. En condition d'oxygene limitant, les chloroplastes se differencient et grace a l'oxygene produit par photosynthese, les cellules deviennent capables d'utiliser le sucre du milieu. Des cultures photomixotrophes, dont la croissance est dependante du fonctionnement des chloroplastes, ont ete ainsi etablies. Un protocole de mutagenese aux uv et de selection en milieu liquide ont ete mis au point pour obtenir des lignees resistantes a la streptomycine; ces lignees restent chlorophyliennes en presence de l'antibiotique, presentent une croissance ralentie, suggerent une action de l'antibiotique sur le fonctionnement mitochondrial. L'hybridation moleculaire des adn cellulaires a diverses sondes de genes plastidiaux revele l'evolution des teneurs cellulaires en transcrits de ces genes, et met en evidence le role preponderant du "gene-dosage" dans le controle de cette evolution (transformation des chloroplastes en amyloplastes)

Les méthodes de décontamination biologique des sols présentent des avantages qui contribuent à leur développement. Elles sont en effet peu chères, ne destructurent pas le sol et semblent applicables même à de faibles concentrations de polluants. Bien souvent, le suivi d'un tel processus s'effectue par dosage analytique de la quantité de polluant restant dans le sol. Mais, la disparition du composé initial ne peut pas préjuger de l'innocuité du processus de bioepuration sur l'environnement. Dans ce contexte, la collaboration de techniques chimiques biologiques et ecotoxicologiques parait nécessaire afin d'obtenir une idée de l'efficacité de la décontamination du sol. Pour ce travail, un modèle de microcosmes contaminés par du 4-chlorobiphényle a été choisi. Deux souches bactériennes du genre Pseudomonas ont été utilisées, la souche B4 isolée de sédiments de Seine contamine par les PCB pour sa capacité à dégrader le biphényle, et CBS3, souche environnementale qui dégrade le 4-chlorobenzoate. Trois parties sont développées dans cette étude : la caractérisation de la souche B4 a permis de démontrer sa capacité à dégrader les monochlorobiphényles, les 2,2'- et 4,4'-dichlorobiphényles, les 2,4,4'- et 2,2'5-trichlorobiphényles et le 2,2',3,4,5-pentachlorobiphényle. La reconnaissance de ces molécules semble être codée par le cistron bphA1 dont la séquence est intermédiaire entre celle des souches de référence LB400 et KF707 qui dégradent des chlorobiphényles. Chez la souche B4, contrairement à d'autres souches connues, un plasmide pourrait être impliqué dans les voies de dégradation du biphényle. Dans un deuxième temps, des outils moléculaires ont été élaborés pour la détection et la quantification des souches Pseudomonas sp. B4 et CBS3 dans les sols par pcr compétitive. Deux compétiteurs ont été construits en insérant un fragment de 20 paires de bases soit dans le gène bphC de la souche b4 soit dans le gène codant pour la 4-chlorobenzoate déshalogénase de la souche CBS3. Enfin, des études de dégradation du 4-chlorobiphényle ont été menées en microcosmes. Le processus de biodégradation est suivi par PCR quantitative, par des dénombrements microbiologiques, par des dosages analytiques et grâce aux tests écotoxicologiques. Quand la souche B4 est introduite seule dans les microcosmes, malgré une disparition rapide du 4-chlorobiphényle, la toxicité du sol reste élevée vis-à-vis des vers de terre et de l'orge utilisés comme bio-indicateurs. Cette toxicité résiduelle est dûe à l'accumulation dans le microcosme de 4-chlorobenzoate, métabolite final de la voie de dégradation du 4-chlorobiphényle par la souche B4. Seule, l'introduction d'une bactérie, Pseudomonas sp. CBS3, capable de minéraliser le 4-chlorobenzoate, permet une détoxification du sol.

Les anticorps monoclonaux ont révolutionné le traitement de nombreuses pathologies. Cependant, leur pharmacocinétique (PK) et l’influence de leur concentration sur la réponse clinique restent mal connues. Nous avons étudié les sources de variabilité interindividuelle de la PK du cetuximab, un anticorps anti- EGFR, ainsi que l’influence de l’exposition à cet anticorps sur la réponse. Nous avons validé une méthode ELISA de dosage du cetuximab. Dans un modèle murin, nous avons étudié l’absorption pulmonaire du cetuximab. Nous avons étudié la PK du cetuximab chez un patient hémodialysé. Nous avons décrit la PK du cetuximab chez des patients traités pour cancer colorectal métastatique, à l’aide d’un modèle combinant des éliminations d’ordre 0 et 1. Enfin, nous avons identifié la clairance globale du cetuximab, paramètre pouvant être estimé précocement par la concentration résiduelle à J14, comme un facteur influençant la survie sans progression des patients. Nos travaux montrent qu’une description de la PK d’un anticorps par approche compartimentale permet d’identifier les sources de variabilité et d’étudier l’impact de la PK sur la réponse clinique
Monoclonal antibodies have profoundly modified the treatment of many diseases. However, their pharmacokinetics (PK) and the influence of their concentrations on the clinical response are poorly known. We studied the sources of the interindividual variability of PK of cetuximab, an anti-EGFR, and the influence of the exposure to this antibody on the response. We validated an ELISA technique to measure cetuximab concentrations. We studied the pulmonary absorption of cetuximab in a murine model. We studied cetuximab PK in a hemodialysed patient. In metastatic colorectal cancer patients, we described cetuximab PK with the help of a model combining zero- and first-order eliminations. Finally, we identified the global clearance of cetuximab, a parameter which can be estimated by residual concentration on day 14, as a factor influencing progression-free survival of the patients. Our work shows that the description of the PK of an antibody by compartmental approach allows to identify sources of variability and to study the impact of PK on the clinical response

Le risque potentiel de cancer induit par les irradiations mammographiques est sujet de santé publique majeur, d’intérêt médical et scientifique. Le but de ce travail a été de quantifier les cassures double-brin (CDB) de l’ADN en conditions exactes d’irradiations mammographiques. Cette quantification a été effectuée sur des cellules épithéliales mammaires non transformées issues de biopsies échoguidées en tissu sain en utilisant l’immunofluorescence de la protéine histone H2AX phosphorylée (γH2AX), avant, 10 min et 24 h après irradiation . Deux populations de patientes ont été incluses dans l’étude 19 sans antécédent familial de cancer du sein et/ou de l’ovaire (faible risque, FR) et 11 à haut risque identifié par le généticien avec ou sans mutation (haut risque, HR). En effet, les gènes mutés suppresseurs de tumeurs (BRCA1, BRCA2, CHK2, ATM, p53, PTEN) sont également impliqués dans la signalisation et/ou réparation des CDB. Spontanément, les patientes HR ont montré significativement plus de CDB spontanées que les LR. Trois effets radiobiologiques majeurs ont été mis en évidence : 1) Un effet de la dose, plus important chez les HR ; 2) Une augmentation significative du nombre de foci γH2AX entre 10 min et 24 h après irradiation ; 3) Un effet de répétition de dose, plus marqué chez les HR. Ces constatations devraient conduire à la ré-évaluation des séquences de dépistages mammographiques dans les populations où le bénéfice en terme de mortalité n’a pas été prouvé, comme dans la tranche d’âge des 40-49 ans et dans la surveillance des patientes où sont recommandées de façon annuelle IRM et mammographie dès l’âge de 30 ans ou 35 ans, les hauts risques et les femmes aux antécédents d’irradiation thoracique dans l’enfance, l’adolescence ou jeune adulte. Une seule incidence mammographique en dépistage pourrait être préconisée en dépistage dans l’attente de travaux radiobiologiques complémentaires évaluant la carcinogenèse éventuelle des irradiations mammographiques
The potential risk of cancer induced by radiation mammography is a major public health issue, medical and scientific interest. The purpose of this study was to quantify the double-strand break (DSB) DNA in exact terms of mammographic radiation. This quantification was performed on untransformed mammary epithelial cells from ultrasound-guided biopsies in healthy tissue using fluorescent protein phosphorylated histone H2AX (γH2AX) before, 10 min and 24 h after irradiation. Two patient populations were included in the study : 19 with no family history of breast cancer and/or ovarian cancer (low risk, LR) and 11 high-risk identified by the geneticist with or without mutation (high risk, HR). Indeed, mutated tumor suppressor genes (BRCA1, BRCA2, CHK2, ATM, p53, PTEN) are also involved in signaling and/or repair of DSBs. Spontaneously, patients showed significantly higher HR of DSBs that spontaneous LR. Three major radiobiological effects were highlighted : 1) A dose low effect, higher in HR; 2) A significant increase in the number of γH2AX foci from 10 min to 24 h after irradiation; 3) An effect of repeated doses more pronounced in HR. These findings should lead to re-evaluate mammographics procedures in screnning in populations where the benefit in term of mortality has not been proved, as women with high familial risk, in the age of group of 40-49 years, and in women treated with chest radiation for childhood, adolescent, or young adult cancer. A single mammographic view could be indicated. Further works assessing the possible carcinogenesis effects of mammographic irradiations will be necessary

Commercialisées depuis 1996, les plantes génétiquement modifiées produisant une toxine insecticide (toxine Cry) dérivée de Bacillus thuringiensis et appelées plantes Bt ciblent certains Lépidoptères ou Coléoptères ravageurs. Au fil des ans, les surfaces cultivées en plantes Bt sont de plus en plus importantes et contrôlent de larges populations d'insectes. Pour limiter le risque de développement de populations résistantes, une stratégie agricole appelée 'Haute Dose / Zone Refuge' est actuellement recommandée aux Etats-Unis par l'Environmental Protection Agency. Cette stratégie préventive nécessite la plantation d'une 'zone refuge' composée de plantes non-Bt utilisables par le ravageur ciblé et plantée à proximité de la 'zone Bt' qui synthétise une haute dose de toxine Cry.

Mon projet de recherche s’inscrit dans le cadre de l’évaluation de l'efficacité de cette stratégie et s’articule en deux phases :une phase expérimentale et une phase théorique. La première se concentre sur la caractérisation en laboratoire de l'impact des toxines Cry sur la biologie d'un ravageur. Cette phase constitue un support au volet théorique :la mise au point d’un modèle mathématique évaluant l'efficacité de la stratégie HD/R. L'originalité de ce projet repose entre autre sur l'interactivité entre ces deux volets.

Volet expérimental. Impact des toxines Cry sur la biologie de Plodia interpunctella. Nous évaluons séparément l'impact d'une gamme de concentrations de deux toxines Cry (CryXX et CryYY) sur une série de paramètres comportementaux et biologiques d'un insecte commun des denrées stockées: Plodia interpunctella (Hübner) (Lepidoptera :Pyralidae). Ces paramètres sont sélectionnés car leur variation pourrait avoir un impact sur l'efficacité de la stratégie HD/R dans le contrôle de la résistance. Il est donc pertinent de les quantifier pour intégrer dans le modèle des ordres de grandeur réalistes et générer des résultats qui ne sont pas uniquement basés sur des spéculations théoriques.

Volet théorique A. Efficacité de la stratégie HD/R pour des plantes Bt synthétisant une ou deux toxines simultanément. La stratégie 'HD/R' a été développée pour prévenir la résistance envers les plantes Bt synthétisant une seule toxine. Or, depuis 2003, de nouvelles variétés de coton Bt synthétisant simultanément deux toxines Cry sont commercialisées (BollgardII® et WidestrikeTM). Nous évaluons, grâce au modèle que nous avons développé, l'efficacité de cette stratégie lors d'une utilisation exclusive de plantes Bt synthétisant une ou deux toxines.

Volet théorique B. Impact du ralentissement du développement des insectes sur les plantes Bt sur l'efficacité de la stratégie HD/R. Le volet expérimental met en évidence un allongement de la durée du développement des larves se nourrissant sur une diète contaminée en toxine Cry. Ce ralentissement induit une séparation temporelle entre l'émergence des adultes de la zone Bt et de la zone refuge et perturbe une hypothèse principale de la stratégie HD/R: le croisement aléatoire entre adultes, indépendamment du génotype et de la zone d'origine. Dans ce troisième chapitre, nous étudions l'impact de la perturbation du croisement aléatoire sur l'efficacité de la stratégie HD/R. Nous testons également deux options pour optimiser la stratégie en cas d'asynchronie: l'utilisation de plantes Bt synthétisant une faible concentration en toxine (atténuant le décalage entre l'émergence des adultes) ou l'augmentation de la taille de la zone refuge (favorisant la survie des individus porteurs d'allèle de sensibilité et donc optimisant la dilution de la résistance à la génération suivante).

Ce travail s'intègre dans une problématique actuelle et utilise des outils de biologie théorique (théories de la dynamique et de la génétique des populations) ainsi que le développement d'un modèle mathématique. Il apporte des éléments de réponse et de réflexion sur l'optimisation de la gestion de la résistance des insectes mais c'est aussi une illustration de la complémentarité entre la biologie expérimentale et théorique.

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On the market since 1996, genetically modified plants synthesizing an insecticidal toxin (Cry toxin) stemmed from Bacillus thuringiensis, called Bt plants, target several insect pests (Lepidoptera or Coleoptera). Bt crops cover increasingly larger areas and control important pest populations The Insect Resistance Management Strategy (IRM) strategy currently recommended in the U.S.A. to limit the development of resistant populations is the High Dose / Refuge zone (HD/R) strategy. This pre-emptive strategy requires a refuge zone composed by non-Bt plants, usable by the target insect and in close proximity of the Bt zone synthesizing a high toxin concentration.

My research project contributes to the effectiveness assessment of this HD/R strategy. It is structured on two main parts: an experimental, and a theoretical section. The first part characterizes the impact of Cry toxins on the biology of an insect pest. It is the basis of the theoretical part: the implementation of a mathematical model, which evaluates the effectiveness of the HD/R strategy.

The originality of this project is based on the interactivity of these two components.

Experimental section. Impact of the Cry toxins on the biology of Plodia interpunctella. We assess the impact of a range of concentrations of two Cry toxins (CryXX et CryYY) on several behavioural and biological parameters of a common pest of stored products: Plodia interpunctella (Hübner) (Lepidoptera :Pyralidae). These parameters are selected because their variation could influence the effectiveness of a HD/R strategy. So, it is important to quantify these parameters so that realistic values can be integrated in our model. The results of the model are thus not based on theoretical assumptions alone.

Theoretical section A. Effectiveness of a HD/R strategy with Bt plants synthesizing one or two toxins. Initially, the HD/R strategy has been developed to limit the resistance towards Bt plants synthesizing one toxin. However, since 2003, new Bt cotton varieties synthesize two toxins simultaneously (BollgardII® et WidestrikeTM). We assess, with our model, the effectiveness of this strategy for Bt plants synthesizing one or two toxins.

Theoretical section B. Impact of the slowing down of the insect development reared on Bt plants on the effectiveness of the HD/R strategy. The experimental part demonstrates that larvae reared on a Bt diet have a protracted development duration. The consequence of this is a temporal separation between adult emergence in the two zones (Bt zone and refuge zone). This could affect the main assumption of the HD/R strategy, i. e. random mating independently of the genotype and of the native zone. In this third chapter, we study the impact of random mating disruption on the effectiveness of a HD/R strategy. We test two options to optimise the strategy in case of asynchrony: the use of Bt plants synthesizing a lower toxin concentration (limiting emergence asynchrony) or increasing the refuge zone size (favouring the survival of insect carrying one or two susceptible allele and thus optimising the dilution of resistance at the next generation).

This work is applied to a current issue. It uses some of the tools of theoretical biology (theories of population dynamics and population genetics) and develops a mathematical model. It provides some responses and some elements of thought about insect resistance management. It is also an illustration of the complementarity between experimental and theoretical biology.

Doctorat en Sciences
info:eu-repo/semantics/nonPublished

L'exposition aux rayonnements ionisants est une composante inévitable de la vie moderne. Il est bien établi qu'il existe une grande variabilité inter-individuelle de la radiosensibilité chez les individus sains et chez des patients atteints de cancer. Cependant, les mécanismes impliqués dans l'hétérogénéité des réponses biologiques radio-induites ne sont pas encore bien compris, et une approche biologique permettant d’établir de façon fiable le niveau de radiosensibilité reste à développer. Dans cette thèse, nous avons étudié l'ampleur et l'impact de la radiosensibilité individuelle chez les individus sains dans les contextes de dosimétrie d'urgence et de radiothérapie. Nous avons également examiné les différents rôles des télomères dans la prédiction de la radiosensibilité individuelle et des risques pour la santé humaine à long terme (spécifiquement, en ce qui concerne les maladies cardiovasculaires et/ou les cancers) après irradiation. Tout d'abord, dans le contexte de la dosimétrie dans le cas d'une situation d'urgence (lorsqu’il est nécessaire d’estimer rapidement la dose d’irradiation reçu par un individu), nous avons démontré que l'impact de la radiosensibilité individuelle peut être négligeable en utilisant des mesures globales de fluorescence de γH2AX via cytométrie en flux dans des fibroblastes humains et des lymphocytes à 4 heures après exposition ; cette méthode peut être un outil de biodosimétrie efficace et rapide qui peut aider au tri des personnes irradiées dans une situation d'urgence basées sur les niveaux individuels d'exposition. Dans un second temps, nous avons étudié l'ampleur et l'influence de la radiosensibilité individuelle sur l'induction d'aberrations chromosomiques après une irradiation de 2 Gy de rayons γ, correspondant à une fraction de radiothérapie conventionnelle, dans les lymphocytes d'individus sains. Pour ces analyses, nous définissons la radiosensibilité individuelle par rapport à la fréquence des cassures double-brin (CDB) radio-induite, qui ont été calculées à partir de la quantification des aberrations chromosomiques visualisées par hybridation in situ des télomères et centromères (TC-FISH). Ce marquage améliore et simplifie la technique « gold standard » de dosimétrie biologique (la quantification des chromosomes dicentriques). Nous avons également estimé la radiosensibilité individuelle à l’irradiation carbone, ions lourds utilisés en radiothérapie, et l'efficacité biologique relative (EBR) des ions carbone par rapport à une irradiation γ. Nous avons fourni des courbes dose-réponse pour ces deux types d’irradiations en fonction de la fréquence des CDB radio-induite par exposition à une gamme de doses. De plus, nous avons estimé l'EBR d'un troisième type de rayonnement également utilisé en radiothérapie d'ions lourds (protons) par rapport à une irradiation γ, et nous avons comparé la radiosensibilité individuelle de ces trois types d'irradiation avec énergies différentes. Ensuite, nous avons évalué les rôles des télomères et de leur maintien pour la prédiction de la radiosensibilité individuelle. Nous avons constaté que la longueur moyenne des télomères, en combinaison avec leurs modifications radio-induites, peuvent être un bon prédicteur de la radiosensibilité individuelle. Enfin, nous avons montré comment les télomères pourraient être liés à des risques sanitaires à long terme après une irradiation: nous avons démontré que le raccourcissement des télomères pouvait être un nouveau facteur de prédiction de maladies cardiovasculaires après radiothérapie, et nous avons discuté par la suite, les télomères comme des acteurs clés dans le processus de cancérogenèse radio-induite. En conclusion, nous proposons un modèle présentant la façon dont les télomères pourraient jouer un rôle crucial dans ces deux pathologies radio-induite, et nous délibérons des relations entre le maintien des télomères, les effets biologiques radio-induites, et la radiosensibilité individuelle
Exposure to ionizing radiation (IR), from both natural and man-made sources, is an inevitable part of modern life. It is well established that there are considerable inter-individual variations in sensitivity to IR among healthy individuals and cancer patients. However, the mechanisms involved in the heterogeneity of biological responses to IR are not well understood, and a reliable biodosimetric and clinical approach to measure and rank radiosensitivity remains to be established. In this thesis, we study the extent and impact of individual radiosensitivity in healthy individuals in the contexts of emergency dosimetry and radiotherapy, and we explore the roles of telomeres in the prediction of individual radiosensitivity and long-term human health risks following IR exposure (specifically, cardiovascular diseases and/or cancer). First, in the context of dosimetry in the event of an emergency situation (when rapid dose estimates of each individual in an irradiated population are needed), we demonstrate that the impact of individual radiosensitivity can be negligible using global cellular measurements of γH2AX fluorescence via flow cytometry in human fibroblasts and lymphocytes at 4 hours post-irradiation; this method could be an effective and rapid biodosimetry tool that can aid in the medical triage of irradiated individuals in an emergency setting based on individual levels of exposure. Second, we study the extent and influence of individual radiosensitivity on the induction of chromosomal aberrations following a routinely administered dose of 2 Gy during conventional fractionated photon radiotherapy (γ-rays) in lymphocytes of healthy individuals. For these analyses, we define individual radiosensitivity based on the frequency of IR-induced DNA double strand breaks (DSBs), which were calculated from the scoring of chromosomal aberrations visualized with telomere/centromere-fluorescence in situ hybridization (TC-FISH). This TC-FISH staining of metaphasic chromosomes enhances the “gold standard technique” of biodosimetry (the dicentric chromosome assay) with the visualization of telomeres and centromeres and thereby provides improved simplicity and sensitivity to the classical cytogenetic assay. We also compare individual radiosensitivity following γ-irradiation to that following carbon irradiation, an up-and-coming ion species currently being used in heavy ion radiotherapy. We provide dose response curves for both γ- and carbon irradiations based on the calculated frequency of IR-induced DNA DSBs at a range of doses, and estimate the relative biological effectiveness (RBE) of carbon irradiation relative to γ-irradiation. We then estimate the RBE of a third type of IR also frequently used in heavy ion radiotherapy (proton beams) in comparison to γ-irradiation, and compare individual radiosensitivity to each of these three types of IR with different IR energies. Third, we evaluate the roles of telomeres and telomere maintenance in the prediction of individual radiosensitivity; we find that inherent mean telomere length in combination with the IR-induced change in mean telomere length may be a strong predictor of individual radiosensitivity. Finally, we show how telomeres could be linked to long-term health risks following IR exposure: we demonstrate that telomere shortening could be a new prognostic factor for cardiovascular disease following radiotherapy, and discuss how telomeres could be key players in the process of radiation-induced carcinogenesis. In conclusion, we deliberate the relationships between telomere maintenance, radiation effects, and individual radiosensitivity, and propose a model of how telomeres could play crucial roles in the development of cardiovascular diseases and the process of IR-induced carcinogenesis

Le but principal de la radiobiologie est de quantifier l'effet des radiations ionisantes sur les organismes vivants. Géneéralement dérivée d'observations relatives à des expositions élévées, la quantification des risques aux faibles doses et débits de dose fait aujourd'hui l'objet de recherches intensives. Le présent travail envisage trois situations radiologiques différentes, chacune caractérisée par l'exposition chronique d'organismes vivants à de faibles doses et faibles débits de dose. Au Kazakhstan, certaines populations humaines et animales subissent depuis 1949 une exposition radiologique due aux tests nucléaires et à leurs retombées. Après un demi-siècle d'exposition chronique, on observe une fragilisation de l'ADN des lymphocytes humains. Cette instabilité du génome pourrait fournir un terrain favorable au développement de cancers et en expliquer la fréquence accrue dans ces régions par rapport au reste du pays. Les rongeurs sauvages du polygone d'essais nucléaires présentent des anomalies des têtes de spermatozoi͏̈des, des anomalies chromosomiques et des cassures simples brins de l'ADN qui révèlent l'effet délétère de l'exposition aux radiations, selon une relation dose-effet de type supra linéaire. L'exposition expérimentale de deux générations des rats sur un site français à fond d'irradiation élevé montre également qu'une irradiation chronique mixte γ et α (radon inhalé) de quelques dizaines de mGy affecte l'intégrité du matériel génomique. Le test des comètes nous permet de suggérer l'existence d'un phénomène de sensibilisation héréditaire, qui s'exprimerait pour les cellules médullaires, les lymphocytes et les macrophages alvéolaires des jeunes animaux. Nos observations confirment la nécessité de quantifier le risque des faibles expositions tant pour l'être humain que pour l'environnement. Le test des comètes se révèle comme un indicateur biologique adéquat.

Les progrès thérapeutiques en oncologie pédiatrique ont permis une amélioration des taux de survie qui dépassent aujourd’hui 80%. De façon à augmenter les taux de guérison et diminuer les complications et séquelles des traitements, des efforts collaboratifs internationaux ont permis le développement de protocoles thérapeutiques stratifiés sur les facteurs pronostiques majeurs incluant des facteurs biologiques tumoraux issus des analyses moléculaires et notamment génomiques. Cependant, si les traitements utilisés prennent de plus en plus en compte la biologie tumorale, leur adaptation aux facteurs individuels reste marginale. La thèse ici présentée cherche à mieux comprendre comment les caractéristiques tumorales et individuelles des patients modifient l’efficacité et la toxicité des thérapeutiques anticancéreuses utilisées en oncologie pédiatrique.Plusieurs travaux ont été réalisés :1- Etude de l’impact pronostique des facteurs tumoraux : évaluation de l’impact pronostique de la décroissance du marqueur tumoral alphafoetoprotéine (AFP) dans les tumeurs germinales malignes de l’enfant et de l’adolescent traitées par chimiothérapie ; 2- Etude de l’impact pronostique des facteurs constitutionnels : (i) évaluation de l’effet du sexe sur l’efficacité et la toxicité des agents alkylants ; (ii) évaluation de l’impact pronostique de polymorphismes génétiques de gènes impliqués dans le métabolisme du méthotrexate sur l’efficacité et/ou la toxicité du méthotrexate haute dose dans le traitement de l’ostéosarcome ;3- Etude des facteurs de risque de toxicité tardive : analyse de la de toxicité auditive sévère dans la cohorte des survivants à long terme de cancers pédiatriques (FCCSS)
Therapeutic advances in pediatric oncology have improved survival rates reaching over 80%. In order to increase cure rates and decrease complications and treatment sequelae, international collaborative efforts led to the development of therapeutic trials stratified on major prognostic factors including biological factors. However, treatment adaptation to individual patient characteristics remains marginal.In this thesis, our objective was to better understand how somatic (tumor-related) and constitutional (patient-related) characteristics could modify efficacy and toxicity of anticancer therapies used in pediatric oncology. Several works were performed: 1- Prognostic analysis of tumor markers: assessment of the alpha-foetoprotéine (AFP) decline prognostic value in childhood malignant germ cell tumors; 2- Prognostic analysis of constitutional factors: (i) assessment of the interaction between gender and type of alkylating agents on efficacy and acute toxicity; (ii) assessment of the efficacy and toxicity impact of genetic polymorphisms in patients with osteosarcoma treated with high-dose methotrexate; 3- Risk factors analysis of long-term toxicities: analysis of severe ototoxicity in the French Childhood Cancer Survivors Study (FCCSS)

Le syndrome de Down (SD), ou Trisomie 21, est l'aneuploïdie la plus fréquente chez l'humain. Le désordre génomique est tel qu'aucun traitement unique ne peut pallier à tous les symptômes (retard mental, troubles moteurs...). C'est pourquoi l'utilisation de modèles murins permet d'étudier l'impact de régions partielles du Hsa21 dans l'apparition des déficits. Mon projet de thèse s'est orienté sur un locus télomérique encadré par les gènes Abcg1 et U2af1. Mes recherches se sont focalisées sur deux modèles, Ts1Yah et Ms2Yah, dédiés à cette région. L'étude de ces lignées, combinées à d'autres modèles transgéniques, a montré la contribution de l'intervalle génique dans l'optimisation de l'apprentissage locomoteur. Dans un deuxième temps, le gène Cbs, candidat à la perte de fonction de mémoire, a permis de mettre en évidence un sauvetage fonctionnel dans une expérience à effets de doses. Cette découverte ouvre la voie à de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Le but de cette thèse fut d’étudier l’influence de l’environnement sur l’évolution des génomes de baculovirus. Nous avons d’abord caractérisé génétiquement la population naturelle d’AcMNPV par séquençage haut-débit et établi par des bioessais la sensibilité de 4 espèces hôtes au virus. Ensuite, une évolution expérimentale de 10 cycles fut mise en place sur les 4 espèces hôtes, à partir d’une population naturelle d’AcMNPV. Elle nous a permis de caractériser phénotypiquement et génotypiquement les lignées de 10ème génération. Cette expérience nous a montré des trade-off de virulence pour chaque lignée : pour augmenter leur virulence pour l’hôte sur lequel elles ont évolué, les lignées ont perdu en potentiel adaptatif généraliste. De plus, la diversité intra-populationnelle a diminué pour toutes les lignées en fonction de la sensibilité des hôtes. Enfin, en corrélant tous ces résultats nous avons mis en évidence des positions spécifiques du génome, impliquées dans l’adaptation à l’hôte
The purpose of this thesis was to study the influence of the environment on the evolution of baculovirus genomes. We first genetically characterised the AcMNPV natural population by high-throughput sequencing and established the susceptibility of 4 hosts to the virus by bioassays. Then, the AcMNPV natural population was subjected to experimental evolution on the 4 host species for 10 cycles. The 10th generation of the evolved viral lines were then phenotypically and genotypically characterised. This experiment showed a virulence trade-off for each line: to increase their virulence to the host on which they evolved, the lines have lost generalist adaptive potential. Furthermore, intra-population diversity decreased for all the lines regardless of host susceptibility. Lastly, by correlating all these results we found specific genome positions involved in host adaptation

Introduction : Bien que la pratique de l’usage de la warfarine se soit améliorée au cours de la dernière décennie, aucune recommandation claire basée sur le dosage de l’amiodarone n’a été jusqu’à maintenant standardisée, ce qui représente un grand obstacle pour les cliniciens. La warfarine a un index thérapeutique étroit nécessitant un suivi régulier et un ajustement individuel de la posologie, ceci afin de déterminer la dose thérapeutique, tout en prévenant les effets secondaires qui pourraient être fatals dans certains cas. La variabilité interindividuelle de la réponse à la warfarine dépend de plusieurs facteurs, dont l’âge, le sexe, le poids, l’alimentation et l’interaction médicamenteuse, mais ceux-ci n’expliquent que partiellement les différences de sensibilité à la warfarine. Les polymorphismes des gènes CYP2C9 et VKORC1 jouent un rôle important dans la réponse à la warfarine et expliquent jusqu’à 50% de la variabilité des doses. L’utilisation d’antiarythmiques telle l’amiodarone peut accentuer considérablement l’effet de la warfarine et nécessite généralement une diminution de 30 à 50% de la dose de la warfarine. Aucune étude à ce jour n’a tenté de déterminer l’utilité du génotypage des polymorphismes des gènes CYP2C9 et VKORC1 chez les patients sous traitement combiné de warfarine et amiodarone. Objectif : Notre étude a pour objectif tout d’abord de déterminer si des facteurs génétiques influencent la première dose de stabilisation de la warfarine chez les patients en FA après l’introduction de l’amiodarone. Nous allons également tenter de confirmer l’association préalablement rapportée entre les facteurs génétiques et la première dose de stabilisation de warfarine dans notre population à l’étude. Méthodes : Un devis de cohorte rétrospective de patients qui fréquentaient la clinique d'anticoagulothérapie de l’Institut de cardiologie de Montréal entre le 1er janvier 2007 et le 29 février 2008 pour l’ajustement de leur dose selon les mesures d'INR. Au total, 1615 patients ont été recrutés pour participer à cette étude de recherche. Les critères de sélection des patients étaient les patients avec fibrillation auriculaire ou flutter, ayant un ECG documenté avec l'un de ces deux diagnostics et âgé de moins de 67 ans, en raison d’une moindre comorbidité. Les patients souffrant d’insuffisance hépatique chronique ont été écartés de l’étude. Tous les patients devaient signer un consentement éclairé pour leur participation au projet et échantillon de sang a été pri pour les tests génétiques. La collecte des données a été effectuée à partir du dossier médical du patient de l’Institut de cardiologie de Montréal. Un formulaire de collecte de données a été conçu à cet effet et les données ont ensuite été saisies dans une base de données SQL programmée par un informaticien expert dans ce domaine. La validation des données a été effectuée en plusieurs étapes pour minimiser les erreurs. Les analyses statistiques utilisant des tests de régression ont été effectuées pour déterminer l’association des variants génétiques avec la première dose de warfarine. Résultats : Nous avons identifié une association entre les polymorphismes des gènes CYP2C9 et VKORC1 et la dose de la warfarine. Les polymorphismes génétiques expliquent jusqu’à 42% de la variabilité de dose de la warfarine. Nous avons également démontré que certains polymorphismes génétiques expliquent la réduction de la dose de warfarine lorsque l’amiodarone est ajoutée à la warfarine. Conclusion : Les travaux effectués dans le cadre de ce mémoire ont permis de démontrer l’implication des gènes CYP2C9 et VKORC1 dans la réponse au traitement avec la warfarine et l’amiodarone. Les résultats obtenus permettent d’établir un profil personnalisé pour réduire les risques de toxicité, en permettant un dosage plus précis de la warfarine pour assurer un meilleur suivi des patients. Dans le futur, d’autres polymorphismes génétiques dans ces gènes pourraient être évalués pour optimiser davantage la personnalisation du traitement.
Background: Although the practice of the use of warfarin has improved during the last decade, no clear recommendation based on the determination of Amiodarone has been standardized until now, which is a major obstacle for clinicians. Warfarin has a narrow therapeutic index requiring regular monitoring and an individual dose ajustement, to this determines the therapeutic dose, while avoiding the side effects that could be fatal in some cases. The interindividual variability to the Warfarin depends on several factoring age, sex, weight, food and drug interactions but they only partially explain the differences in sensitivity to Warfarin. The polymorphisms of the genes CYP2C9 and VKORC1 play an important role in the response to the Warfarine and explain 50% of the variability of doses.The use of antiarrhythmic Amiodarone can greatly enhancethe effect of Warfain and generally requires a reduction of 30-50% of the dose of Warfarin. No study to date has attempted to determine the utility of genotyping polymorphisms of CYP2C9 and VKORC1 in patients on combination therapy of Warfarin and Amiodarone. Objectives: Our study aims to first determine if genetic factors influence the first dose stabilization of Warfarin in patients with AF after the introduction of Amiodarone. We will also attempt to confirm the previously reported between genetic association and the first dose of Warfarin stabilization in our study population. Methods: A retrospective cohort of all patients who frequent the clinic Warfarin of Montreal Heart Institute between 01/01/2007 and 02/30/2008 for the adjustment of their INR. The total of 1615 patients were recruited. The criteria for selection were patients with atrial fibrillation or flutter, with ECG documented with one of these tow diagnostic and younger than 67 years because of reduced morbidity. Patients with chronic liver disease were excluded from the study. All patients had to sign an informed consent for their participation in the project to which they contributed 15 ml of blood for genetic testing. Data collection was conducted from the patient's medical record of the Montreal Heart Institute. A data collection form was designed for this purpose and the data were then entered into a SQL database programmed by a computer expert in this field. Data validation was performed in several steps to minimize errors. Statistical analysis using regression tests were conducted to determine the association of genetic variants with the first dose of Warfarin. Results: We identified an association between polymorphisms of the genes CYP2C9 and VKORC1 and warfarin dose. Genetic polymorphisms to explain 42% of the variability in dose of Warfarin. We also demonstrated that genetic polymorphisms explain the reduction in the dose of Warfarin when Amiodarone is added to Warfarin. Conclusion: Our Work in the context of this thesis have shown the involvement of CYP2C9 and VKORC1 genes in response to treatment with Warfarin and Amiodarone. The results are used to create a personalized profile to reduce the risk of toxicity, enabling a more accurate dosing of warfarin for better monitoring of patients. In the future, other genetic polymorphisms in these genes could be evaluated to optimize the value of personalised therapy.