Tesi sul tema "Diffuse glioma"

Les gliomes diffus de bas grade (DLGG) sont des tumeurs gliales de grade II qui affectent principalement les jeunes adultes. Elles sont caractérisées par une croissance lente et une activité mitotique réduite. Cependant, ces tumeurs diffusent et envahissent le cerveau sain via les vaisseaux sanguins et les fibres nerveuses. Après plusieurs années de croissance lente, ces tumeurs peuvent évoluer vers des glioblastomes, des tumeurs cérébrales très agressives dont la survie médiane moyenne est alors de 12 à 15 mois après le diagnostic. La caractérisation cellulaire des DLGG est encore limitée ce qui nuit à la recherche d’un traitement à un stade précoce. Dans ma thèse de doctorat, je me suis focalisée sur la caractérisation de 'hétérogénéité cellulaire des DLGG mutés pour IDH1. En effectuant une analyse d'immunofluorescence sur des astrocytomes et oligodendrogliomes de grade II, j'ai identifié deux sous-populations cellulaires largement non chevauchantes et exprimant respectivement les facteurs de transcription SOX9 et OLIG1. Ces cellules s’apparentent à des cellules de type astrocytaire et oligodendrocytaire et expriment des marqueurs moléculaires distincts. Les cellules SOX9 expriment APOE, KCNN3, CRYAB et ID4, tandis que les cellules OLIG1 expriment préfentiellement PDGFRA, SOX8, MASH1 et SOX4. Par ailleurs, j’ai montré que les cellules SOX9 présentent une activation particulière des voies de signalisation, notamment Notch, BMP et leurs cibles en aval. Pour étudier le rôle de la voie de signalisation Notch dans la formation de ces 2 sous-populations tumorales, j'ai purifié par tri magnétique les cellules tumorales à partir d'échantillons de gliomes fraîchement réséqués et j'ai surexprimé le domaine intracellulaire Notch (NICD), une forme active de Notch. J’ai ainsi montré que cette activation augmentait l’expression des marqueurs cellulaires associés aux cellules SOX9+ et une baisse de ceux associés aux cellules OLIG1+. J'ai ensuite étendu ces analyses à une lignée cellulaire anaplasique dérivée d'un patient et mutée pour IDH1. Ces résultats indiquent un rôle clé de la signalisation Notch dans la régulation de la plasticité des cellules tumorales. Des expériences similaires pour étudier l'activation de la signalisation BMP (bone morphogenetic protein) n'ont pas montré d'effet notable sur la plasticité. Néanmoins, le traitement des cellules par des membres de la famille BMP a fortement augmenté l’expression de CRYAB, un marqueur associé à SOX9, et a diminué l’expression de OLIG1 et OLIG2. En conclusion, j'ai identifié deux sous-populations tumorales non chevauchantes dans des gliomes diffus de bas grade et j'ai démontré le rôle déterminant de la voie de signalisation Notch dans leur formation. Ces résultats permettront de mieux comprendre l'hétérogénéité tumorale dans les DLGG et de concevoir de nouvelles stratégies thérapeutiques contre ces tumeurs
Diffuse Low-Grade Gliomas (DLGG) are WHO grade II glial tumors affecting younger adults. They are characterized as silent, slow growing tumors with fewer mitotic activities. However, they diffuse and invade the healthy brain via blood vessels and nerve fibers. These, over a period of years develop to malignant Glioblastoma, aggressive brain tumors where patients have an average medial survival of 12-15 months after diagnosis. Ill-defined phenotypic and cellular diversity of DLGG poses serious limitation to treatment and prevention at the early stage.In my PhD thesis, I aimed to address this limitation by characterizing the cellular heterogeneity in IDH1-mutated DLGG. By performing immunofluorescence analysis on grade II astrocytoma and oligodendroglioma, I have identified two largely non-overlapping cellular subpopulations expressing SOX9 and OLIG1 transcription factors, which represent astrocyte-like and oligodendrocyte-like cells, respectively. Upon further investigation, I have shown that these subpopulations express distinct molecular markers. Sox9 cells are associated with APOE, KCNN3, CRYAB and ID4, while Olig1 cells showed strong correlation with the expression of PDGFRA, SOX8, MASH1, and SOX4. In addition, the sox9 cells show a particular activation of signaling pathways including Notch, BMP and their downstream targets.To ascertain the role of Notch signaling in regulating the formation of these tumoral subpopulations, I used magnetic sorting of tumor cells from freshly resected glioma samples and overexpressed Notch Intracellular Domain (NICD), an active form of Notch. Increased Notch activation resulted in an upregulation of Sox9- and downregulation of Olig1-associated cell markers. I have then extended these analyses on one anaplastic IDH1 mutated patient derived cell line which reproduced similar gene expression profile confirming the robustness of the role of Notch signaling in regulating the plasticity of the cells. Parallel experiments performed by activation of Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling on IDH1 mutated cell line did not show a prominent effect on the plasticity. Nevertheless, BMP signal activation highly upregulated CRYAB, a SOX9 related marker and downregulated OLIG1 and OLIG2.In conclusion, I have identified two non-overlapping tumor subpopulations in diffuse low-grade gliomas and demonstrated the deterministic role of Notch signaling pathway in their formation. I believe that these findings would aid in better understanding tumoral heterogeneity in DLGG and be extended in designing new therapeutic strategies against these tumors

Diffuse midline gliomas (MLG) are primary brain tumours arising from thalamus, hypothalamus, brainstem, cerebellum or spinal cord, mainly occurring in children. In adults, less than 10% of diffuse gliomas arises in midline structures and recent works suggested that this subset of tumours may present with phenotypic and molecular characteristics differing from both pediatric MLG and adult supratentorial gliomas. Circumscribed gliomas (CG) are low-grade tumours but may progress to anaplasia. They have lower genetic complexity than diffuse gliomas and could be better candidate for targeted therapies, when complete surgical resection is not feasible. Unravelling the genomic landscape of MLG and CG will better define the prognostic value of molecular biomarkers and identify new therapeutic strategies that could improve patient care. Adult patients with diagnosis of MLG and CG were retrospectively identified from «Maggiore della Carità» Hospital and GH Pitié-Salpêtrière (Paris). Mutation analysis was performed by Sanger sequencing of the major hot-spots: IDH1, IDH2, H3F3A, HIST1H3B, FGFR1, TERT promoter. FISH analyses of NTRK1-2-3 rearrangements were performed by break-apart probes on tissue microarray of MLG cases. We identified 116 (French) and 47 (Italian) patients. The two cohorts showed a lower percentage of H3F3A mutations (20% vs 33%), the mutation was not associated to a worse prognosis. FGFR1 mutations were identified in 18% of cases and are restricted to MLG. NTRKs analysis in the Italian cohort showed NTRK1 translocations in 15% of cases. We reported a high rate of FGFR1 mutations in optic nerve pilocytic astrocitomas and the presence of alternative BRAF activating mutations (Thr599_Val600insThr and Val600_Lys601>Glu). Our finding of frequent and potentially targetable FGFR1 and BRAF mutations and NTRK1 translocations have important therapeutical implications in the current context of clinical trials, and further reinforces the need for molecular analyses.

Les gliomes diffus de bas grade sont des tumeurs cérébrales des jeunes adultes. Dans cette thèse, nous nous intéressons à la segmentation et à la modélisation de ces tumeurs. Dans la première partie du manuscrit, nous étudions la segmentation des gliomes diffus de bas grade à base de différentes méthodes manuelles et semi-automatiques. La délimitation de ces tumeurs peut être problématique en raison de leur caractère très infiltrant et inhomogène. En pratique clinique, le suivi des gliomes diffus de bas grade repose sur l'estimation du volume tumoral, soit par une segmentation suivie d'une reconstruction logicielle, soit par la méthode des trois diamètres. Pour la segmentation, elle est manuelle et est exécutée par des praticiens sur des IRM en pondération FLAIR ou T2. La méthode des trois diamètres est rapide mais s'avère difficile à implémenter dans le cas de gliomes diffus de bas grade très infiltrants ou en post-traitement. La solution par segmentation manuelle et reconstruction logicielle du volume est chronophage mais demeure plus précise en comparaison de la méthode des trois diamètres. Nous étudions ici la reproductibilité de la segmentation manuelle avec le logiciel OsiriX en réalisant un test subjectif dans le Living Lab PROMETEE de TELECOM Nancy. Les résultats de cette étude montrent que ni la spécialité du praticien ni le nombre d’années d’expérience ne semblent impacter significativement la qualité de la segmentation. Nous comparons par ailleurs les résultats obtenus à ceux d'un deuxième test où nous appliquons la méthode des trois diamètres. Enfin, nous explorons deux algorithmes de segmentation semi-automatique basés, respectivement, sur les contours actifs et sur la méthode des level set. Même si la segmentation automatique semble être une voie prometteuse, nous recommandons aujourd’hui l’utilisation de la segmentation manuelle du fait notamment du caractère diffus des gliomes de bas grade qui rend le contour complexe à délimiter. La seconde partie du manuscrit est consacrée à la modélisation des gliomes diffus de bas grade eux-mêmes ou, plus exactement, à la modélisation de l'évolution du diamètre tumoral en phase de chimiothérapie. La prise en charge thérapeutique des patients atteints de ces tumeurs inclut en effet souvent une chimiothérapie. Pour ce travail, nous nous intéressons à la chimiothérapie par Témozolomide en première ligne de traitement. Une fois le traitement entamé, les praticiens aimeraient déterminer l'instant optimal d'arrêt de traitement. Nous proposons une modélisation statistique du diamètre tumoral sous chimiothérapie. Cette modélisation s'appuie sur des modèles de régression linéaire et exponentielle. Elle permet de prédire le diamètre tumoral à partir d'un jeu de données d'apprentissage et d'alerter le clinicien sur l'état d'évolution du diamètre sous traitement. Nous espérons que ces modèles pourront un jour être utilisés comme un outil dans la planification de la chimiothérapie en milieu clinique
Diffuse low-grade gliomas are brain tumors of young adults. In this thesis, we focus on the segmentation and on the modeling of these tumors. In the first part of the manuscript, we study the segmentation of diffuse low-grade gliomas based on different manual and semi-automatic methods. The delineation of these tumors can be problematic because of their very infiltrating and inhomogeneous nature. In clinical practice, the monitoring of diffuse low-grade gliomas is based on the estimation of tumor volume, obtained either through a segmentation followed by a software reconstruction or through the three diameters method. As for the segmentation, it is manual and it is performed by practitioners on FLAIR-weighted or T2-weighted MRI.The three diameters approach is fast but it is difficult to implement in the case of highly infiltrating diffuse low grade gliomas or after a treatment. The manual segmentation and software-based volume reconstruction solution is time-consuming but it remains more accurate in comparison with the three diameters method. We investigate in this work the reproducibility of the manual segmentation with the OsiriX software by performing a subjective test in the Living Lab PROMETEE in TELECOM Nancy. The results of this study show that neither the practitioners' specialty nor their number of years of experience seem to have a significant impact on the quality of the segmentation. We also compare the results to those of a second test where we apply the three diameters method. Finally, we explore two semi-automatic segmentation algorithms which are, respectively, based on active contours and on the level set method. Even if automatic segmentation seems to be a promising avenue, we recommend for now the use of manual segmentation because of the diffuse nature of low-grade gliomas, which makes the tumor's contours complex to delineate. The second part of the manuscript is dedicated to the modeling of diffuse low-grade gliomas themselves or, to be more precise, to the modeling of the evolution of the tumor's diameter during chemotherapy. The therapeutic management of patients with these tumors often includes indeed chemotherapy. For this work, we focus on Temozolomide chemotherapy in first-line treatment. After the beginning of the treatment, the practitioners would like to determine the optimum time of discontinuation. We propose a statistical modeling of tumor diameter under chemotherapy. This modeling is based on linear and exponential regression models. It can predict the tumor diameter from a set of training dataset and can alert the clinician on the state of change in diameter under treatment. We hope that these models will, eventually, be used as a tool in the planning of chemotherapy in a clinical environment

Diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) is a highly aggressive type of glial brain tumour found in the pons region of the brainstem. DIPG accounts for about 10% of childhood central nervous system tumours and the prognosis for these children is poor. Resistance to radiation, the only current available therapy for DIPG, is one of the biggest challenges. This resistance could be due to the plasticity of DIPG cells, allowing them to rapidly adapt in response to different conditions. Preliminary RNA sequencing analyses of patient tumours identified the expression of ion channel genes including the GABA family. It is known that ion channels regulate tumour plasticity in other cancers and as such we aimed to investigate and characterise the role of ion channels in DIPG. This study aimed to validate the mRNA and protein expression of the GABA-A receptors associated with ligand-gated chloride channels, in DIPG patient-derived cell lines. The results of the study validated mRNA expression of the GABA-A receptor subunits using semi-quantitative and quantitative RT-PCR. Protein expression of three of the most highly expressed subunits (GABRA2, GABRA4, and GABRA5) was also demonstrated using western blotting and immunocytochemistry. Furthermore, a drug screen and titration showed that some GABA-A receptor modulators significantly inhibited proliferation of DIPG cells. This work confirmed that GABA-A subunits are expressed in DIPG cells and that blocking these ion channels inhibits DIPG cell proliferation. These findings form the foundation for future studies that will investigate GABA-A receptor drugs as potential treatments for DIPG using preclinical models.

Biomarkers for the classification, clinical management and prognosis of pediatric brain tumors (ependymoma and high grade glioma, (HGG)) are lacking. To address this, biomarkers were developed and explored in view of classification, prognostication, target identification and prediction of the efficacy of treatment for patients with such tumors.We show that overexpression of neuronal markers distinguishes supratentorial from infratentorial ependymoma, and among the former higher immunoexpression of neurofilament 70 (NEFL) is correlated with better progression free survival (PFS). Tenascin-C (TNC) is significantly overexpressed in infratentorial ependymoma. A multi-institutional European ependymoma collaboration group was established and analyses were performed in a pediatric cohort of 250 patients, where immunohistochemistry (IHC) for TNC showed to be a robust marker of poor overall survival (OS) and PFS, particularly among children under 3 years, this being further validated in an independent cohort. Techniques and scoring performed in different laboratories were highly reproducible. IHC for NEFL and TNC could be used for prognostication of pediatric ependymoma.The analysis of putative predictive markers for the response to targeted therapies in pediatric HGG in the setting of a clinical trial with the anti-EGFR agent erlotinib was performed by IHC and fluorescent in situ hybridization. The frequent loss of PTEN in diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) and the confirmation of the biological singularity of the certain subgroups (expressing EGFR, displaying oligodendroglial differentiation) which seem to be associated with better response to erlotinib have helped our group to establish the design of the next Phase III protocol for this disease at our institution. We report mutations in PI3KCA constituting the first identification of oncogene mutations in some DIPG, which further highlight their biological heterogeneity. Further studies are needed to define the interaction between PTEN loss, EGFR overexpression, oligodendroglial differentiation, PI3KCA mutations and other recent findings such as PDGFRA/MET gains/amplification and TP53 mutations in these heterogeneous lesions and their relationship to the outcome of patients under new targeted therapies for this largely fatal disease.This thesis has allowed us to explore the molecular pathology in the context of biology and clinical setting of pediatric brain tumors.

Les gliomes diffus de bas grade sont des tumeurs cérébrales des jeunes adultes. Dans cette thèse, nous nous intéressons à la segmentation et à la modélisation de ces tumeurs. Dans la première partie du manuscrit, nous étudions la segmentation des gliomes diffus de bas grade à base de différentes méthodes manuelles et semi-automatiques. La délimitation de ces tumeurs peut être problématique en raison de leur caractère très infiltrant et inhomogène. En pratique clinique, le suivi des gliomes diffus de bas grade repose sur l'estimation du volume tumoral, soit par une segmentation suivie d'une reconstruction logicielle, soit par la méthode des trois diamètres. Pour la segmentation, elle est manuelle et est exécutée par des praticiens sur des IRM en pondération FLAIR ou T2. La méthode des trois diamètres est rapide mais s'avère difficile à implémenter dans le cas de gliomes diffus de bas grade très infiltrants ou en post-traitement. La solution par segmentation manuelle et reconstruction logicielle du volume est chronophage mais demeure plus précise en comparaison de la méthode des trois diamètres. Nous étudions ici la reproductibilité de la segmentation manuelle avec le logiciel OsiriX en réalisant un test subjectif dans le Living Lab PROMETEE de TELECOM Nancy. Les résultats de cette étude montrent que ni la spécialité du praticien ni le nombre d’années d’expérience ne semblent impacter significativement la qualité de la segmentation. Nous comparons par ailleurs les résultats obtenus à ceux d'un deuxième test où nous appliquons la méthode des trois diamètres. Enfin, nous explorons deux algorithmes de segmentation semi-automatique basés, respectivement, sur les contours actifs et sur la méthode des level set. Même si la segmentation automatique semble être une voie prometteuse, nous recommandons aujourd’hui l’utilisation de la segmentation manuelle du fait notamment du caractère diffus des gliomes de bas grade qui rend le contour complexe à délimiter. La seconde partie du manuscrit est consacrée à la modélisation des gliomes diffus de bas grade eux-mêmes ou, plus exactement, à la modélisation de l'évolution du diamètre tumoral en phase de chimiothérapie. La prise en charge thérapeutique des patients atteints de ces tumeurs inclut en effet souvent une chimiothérapie. Pour ce travail, nous nous intéressons à la chimiothérapie par Témozolomide en première ligne de traitement. Une fois le traitement entamé, les praticiens aimeraient déterminer l'instant optimal d'arrêt de traitement. Nous proposons une modélisation statistique du diamètre tumoral sous chimiothérapie. Cette modélisation s'appuie sur des modèles de régression linéaire et exponentielle. Elle permet de prédire le diamètre tumoral à partir d'un jeu de données d'apprentissage et d'alerter le clinicien sur l'état d'évolution du diamètre sous traitement. Nous espérons que ces modèles pourront un jour être utilisés comme un outil dans la planification de la chimiothérapie en milieu clinique
Diffuse low-grade gliomas are brain tumors of young adults. In this thesis, we focus on the segmentation and on the modeling of these tumors. In the first part of the manuscript, we study the segmentation of diffuse low-grade gliomas based on different manual and semi-automatic methods. The delineation of these tumors can be problematic because of their very infiltrating and inhomogeneous nature. In clinical practice, the monitoring of diffuse low-grade gliomas is based on the estimation of tumor volume, obtained either through a segmentation followed by a software reconstruction or through the three diameters method. As for the segmentation, it is manual and it is performed by practitioners on FLAIR-weighted or T2-weighted MRI.The three diameters approach is fast but it is difficult to implement in the case of highly infiltrating diffuse low grade gliomas or after a treatment. The manual segmentation and software-based volume reconstruction solution is time-consuming but it remains more accurate in comparison with the three diameters method. We investigate in this work the reproducibility of the manual segmentation with the OsiriX software by performing a subjective test in the Living Lab PROMETEE in TELECOM Nancy. The results of this study show that neither the practitioners' specialty nor their number of years of experience seem to have a significant impact on the quality of the segmentation. We also compare the results to those of a second test where we apply the three diameters method. Finally, we explore two semi-automatic segmentation algorithms which are, respectively, based on active contours and on the level set method. Even if automatic segmentation seems to be a promising avenue, we recommend for now the use of manual segmentation because of the diffuse nature of low-grade gliomas, which makes the tumor's contours complex to delineate. The second part of the manuscript is dedicated to the modeling of diffuse low-grade gliomas themselves or, to be more precise, to the modeling of the evolution of the tumor's diameter during chemotherapy. The therapeutic management of patients with these tumors often includes indeed chemotherapy. For this work, we focus on Temozolomide chemotherapy in first-line treatment. After the beginning of the treatment, the practitioners would like to determine the optimum time of discontinuation. We propose a statistical modeling of tumor diameter under chemotherapy. This modeling is based on linear and exponential regression models. It can predict the tumor diameter from a set of training dataset and can alert the clinician on the state of change in diameter under treatment. We hope that these models will, eventually, be used as a tool in the planning of chemotherapy in a clinical environment

Le diagnostic du gliome infiltrant du tronc cérébral (GITC) chez les enfants est l'un des plus éprouvants en oncologie pédiatrique. Malgré de nombreux essais cliniques explorant divers traitements, le pronostic reste sombre, la plupart des patients succombant entre 9 et 11 mois après le diagnostic. Les mutations génétiques clé associées au GITC incluent H3K27M, ACVR1 et TP53. Chaque mutation a des caractéristiques distinctes, poussant les médecins à suggérer des thérapies personnalisées, soulignant l'importance d'une détection précise des mutations pour guider le traitement. Situées dans la région cruciale du tronc cérébral, les tumeurs GITC présentent des risques significatifs liés à la biopsie en raison de potentiels dommages neurologiques. L'IRM est une méthode indispensable pour le diagnostic de ces tumeurs, évaluant leur extension et permettant de mesurer l'évolution de la maladie au cours de la thérapie. Une prédiction des mutations, combinée à l'identification des patients survivant plus de deux ans, pourrait améliorer la thérapie proposée à ces patients. Dans ce contexte, la radiomique transforme les images en vastes sources de données, extrayant des caractéristiques comme la forme et la texture pour aider à la prise de décision. L'objectif de cette thèse est de prédire les principales mutations génétiques et d'identifier les survivants à long terme, en mettant l'accent sur la normalisation des images et l'applicabilité des modèles radiomiques. Notre étude a utilisé une base de données rétrospective de l'Institut Gustave Roussy, comprenant les données IRM de 80 patients et leurs données cliniques respectives. Les données d'IRM ont mis en évidence des problèmes pour les études radiomiques, tels que l'inhomogénéité du champ de biais et l'effet "scanner". Pour répondre à ces défis, un pipeline de normalisation d'images IRM a été mis en place, et les caractéristiques radiomiques ont été harmonisées par la méthode ComBat. Pour faire face au problème de modalités manquantes dans l'ensemble de données, une stratégie multi-modèles a été employée, conduisant à 16 modèles distincts reposant sur diverses combinaisons de caractéristiques radiomiques et cliniques. Cette approche a ensuite été rationalisée en une méthode multimodale, réduisant le nombre de modèles à cinq, après une phase de sélection de caractéristiques indépendantes. Les résultats de l'approche multimodale se sont avérés être prometteurs. Cette stratégie multimodale a été essentielle pour identifier les patients survivant plus de deux ans et a été complétée par l'approche ICARE pour une analyse de survie détaillée
The diagnosis of diffuse intrinsic pontine glioma (DIPG) in children stands as one of the most harrowing within pediatric oncology. Despite numerous clinical trials exploring various treatments, the prognosis remains bleak, with most patients succumbing between 9 to 11 months post-diagnosis. Key gene mutations linked to DIPG include H3K27M, ACVR1, and TP53. Each mutation has distinct characteristics, leading physicians to suggest tailored therapies, underscoring the importance of accurate mutation detection in guiding treatment. Located in the crucial region of the brainstem, the pons, DIPG tumors pose significant biopsy risks due to potential neurological damage. Hence, MRI could become a primordial diagnostic tool for these tumors, assessing their spread and gauging therapy responses. Its use to predict accurate gene mutation, and identify long-term survivors, could enhance patient care significantly. Within this framework, radiomics transforms images into vast data sources, extracting features like shape and texture to aid decision-making. The objective of this thesis is to refine mutation prediction and pinpoint long-term survivors, emphasizing image normalization and the applicability of radiomic models. Our study utilized a retrospective database from Gustave Roussy Institute, encompassing 80 patients MRI data and their respective clinical data. These MRI images highlighted issues in radiomic studies, such as bias field inhomogeneity and the "scanner effect". To address these challenges, a dedicated MR image normalization pipeline was implemented, and radiomic features underwent ComBat harmonization. Given the dataset's missing modalities, a multi-model strategy was employed, leading to 16 distinct models based on various radiomic and clinical feature combinations. This approach was then streamlined into a multi-modal method, reducing the number of models to five. The results from the ensemble of these models proved to be the most promising. This multi-modal strategy incorporated a feature selection phase, pinpointing the most pertinent features. Additionally, this method was applied to identify long-term survivors and was complemented by the ICARE framework for a nuanced survival analysis output

Contexte : Les gliomes diffus sont les tumeurs primitives malignes du système nerveux central les plus fréquentes. Certains présentent une mutation du gène codant pour l'isocitrate déshydrogénase 1 ou 2 (IDH) qui leur confère la néo-activité de transformer l'alpha-cétoglutarate (α-KG) produit par l'enzyme non mutée en D-2hydroxyglutarate (D-2HG). L'accumulation de cet oncométabolite entraîne l'inhibition compétitive des dioxygénases dépendantes de l'α-KG, incluant la famille TET (Ten Eleven Translocase) des ADN hydroxylases, et les JmjC/KMDs histone déméthylases, qui conduit elle-même à l'hyperméthylation des histones et de l'ADN des cellules tumorales. Les macrophages et microglies associés aux tumeurs (TAMs) sont des cellules myéloïdes très abondantes dans les gliomes, dont le phénotype et la réponse immunitaire sont déterminés par l'ontogenèse et le microenvironnement. Les TAMs présentent des caractéristiques différentes en fonction du statut IDH du gliome, mais les mécanismes de régulation sous-jacents restent largement méconnus. Le D-2HG relargué dans le microenvironnement par les cellules de gliomes IDH-mutants (IDH-m) pourrait influencer le phénotype et la fonction de ces TAMs. Nous avons émis l'hypothèse que le D-2HG pourrait modifier l'épigénome des TAMs, comme dans le cas des cellules tumorales.Matériel et méthodes : Nous avons comparé le méthylome (puce EPIC de méthylation) et le transcriptome des TAMs (CD11B+ isolés par tri cellulaire activé par magnétisme) de 25 gliomes IDH-m et 11 gliomes IDH-wildtype (IDH-wt), ainsi que de tissu cérébral contrôle non tumoral. Pour déterminer les effets directs du D-2HG sur la microglie, nous avons mis au point des cultures primaires de microglie humaine obtenues à partir d'une chirurgie de gliome ou d'épilepsie. Nous avons d'abord dosé le D-2HG dans la microglie traitée par D-2HG par spectrométrie de masse par chromatographie en phase liquide (LC-MS) afin d'évaluer l'entrée du métabolite dans ces cellules, et avons évalué l'activité enzymatique de TET. Nous avons exposé ou non des cellules microgliales au D-2HG pendant 14 jours et analysé leur méthylome et leur transcriptome. Les ratios de 5mC/5hmC ont été analysés à une résolution de base unique. Nous avons évalué la réponse transcriptomique et la respiration mitochondriale après stimulation au LPS de la microglie pré-traitée par D-2HG. Enfin, nous avons analysé par snRNA-seq le transcriptome microglial d'un échantillon apparié de gliome IDH-m avant et après traitement par l'inhibiteur d'IDH-m ivosidenib, qui diminue les concentrations intratumorales de D-2HG.Résultats : Nous montrons que les cellules myéloïdes CD11B+ des gliomes IDH-m humains présentent une hyperméthylation de l'ADN principalement au niveau des enhancers. Cette hyperméthylation est liée à une diminution de l'expression des gènes impliqués dans les réponses inflammatoires et le métabolisme glycolytique, et à l'inactivation des facteurs de transcription qui régulent la réponse microgliale aux stimuli environnementaux. L'exposition prolongée de la microglie primaire humaine au D-2HG inhibe l'oxydation de 5mC médiée par TET, ce qui entraîne une accumulation réduite des niveaux globaux de 5hmC. Nous avons observé des rapports 5mC/5hmC élevés, en particulier au niveau d'enhancers spécifiquement actifs dans ces cellules. Conformément à la modulation des enhancers, la microglie traitée au D-2HG présente une capacité pro-inflammatoire réduite et une augmentation de la phosphorylation oxydative. À l'inverse, la diminution des niveaux de D-2HG après traitement par ivosidenib chez un patient atteint de gliome IDH-m est associée à la restauration de l'expression génique liée à l'activation microgliale.Conclusion : Nos résultats fournissent une base mécanistique de l'état hyporéactif de la microglie dans les gliomes IDH-m et élargissent le concept selon lequel les oncométabolites peuvent perturber la fonction des cellules immunitaires du microenvironnement tumoral
Background: Diffuse gliomas are the most common primary malignant tumors of the central nervous system. A subset of these tumors harbors mutations in the genes encoding isocitrate dehydrogenase 1 or 2 (IDH), which confer a neo-activity that converts alpha-ketoglutarate (α-KG) produced by the wildtype enzyme into D-2-hydroxyglutarate (D-2HG). The accumulation of this oncometabolite competitively inhibits α-KG-dependent dioxygenases, including the TET (Ten Eleven Translocase) family of DNA hydroxylases and the JmjC/KDM family of histone demethylases. This ultimately leads to hypermethylation of both histones and DNA in tumor cells. Tumor-associated macrophages and microglia (TAMs) are abundant myeloid cells in gliomas, with their phenotype and immune responses shaped by ontogeny and the tumor microenvironment. The characteristics of TAMs differ depending on the IDH status of the glioma, yet the regulatory mechanisms underlying these differences remain poorly understood. D-2HG released by IDH-mutant (IDH-m) glioma cells into the microenvironment may affect the phenotype and function of TAMs. We hypothesized that D-2HG may influence the epigenome of TAMs, as in the case of tumor cells.Materials and Methods: We compared the bulk DNA methylome (Methylation EPIC array) and transcriptome of TAMs (CD11B+ cells purified via magnetic-activated cell sorting) from 25 IDH-mutant (IDH-m) and 11 IDH-wildtype (IDH-wt) gliomas, as well as control tissues. To experimentally assess the direct effects of D-2HG, the oncometabolite produced and released by IDH-m glioma cells, we used primary cultures of human microglial cells obtained from glioma or epilepsy surgeries. We first measured D-2HG levels in D-2HG-treated microglia using liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm metabolite uptake, and evaluated TET enzymatic activity. Bona fide IDH-m and IDH-wt cells were used as external controls. Microglia were exposed to D-2HG for 14 days, after which we analyzed their DNA methylome and transcriptome. Ratios of 5mC/5hmC were examined at single-base resolution. We evaluated the transcriptomic response and the mitochrondrial respiration after LPS stimulation of microglia pre-treated with D-2HG. Lastly, we performed single-nuclei RNA sequencing (snRNA-seq) on microglial cells from a paired IDH-m glioma sample, before and after treatment with the IDH-m inhibitor ivosidenib, known to reduce intratumoral D-2HG levels.Results: Our analysis revealed that CD11B+ myeloid cells in human IDH-m gliomas exhibit DNA hypermethylation predominantly at distal enhancers. This hypermethylation is associated with decreased expression of genes involved in inflammatory responses and glycolytic metabolism, as well as the inactivation of transcription factors critical for microglial response to environmental stimuli. Prolonged exposure of primary human microglia to D-2HG inhibited TET-mediated 5mC oxidation, leading to reduced global 5hmC accumulation. High 5mC/5hmC ratios were particularly prominent at lineage-specific enhancers. Consistent with this altered enhancer landscape, D-2HG-treated microglia demonstrated diminished proinflammatory capacity and enhanced oxidative phosphorylation. Conversely, depletion of D-2HG following ivosidenib treatment in an IDH-m glioma patient was associated with the restoration of microglial gene expression related to activation.Conclusion: Our findings provide mechanistic insight into the hyporesponsive state of microglia in IDH-m gliomas and support the concept that oncometabolites, such as D-2HG, can disrupt the function of immune cells in the tumor microenvironment

Comprendre comment le cerveau humain engendre les formes les plus élaborées de comportements est profondément lié à nos connaissances générales sur son organisation anatomique et fonctionnelle. Jusqu'à récemment encore, on pensait que les fonctions cognitives n'étaient rien d'autre que le sous-produit de l'activité neurale de régions corticales discrètes et hyper-fonctionnalisées. Les découvertes majeures obtenues ces dix dernières années dans le champ de la neuro-imagerie, et plus particulièrement de la connectomique, invitent cependant à complexifier nos représentations sur les liens qu'entretiennent structures et fonctions cérébrales. Le cerveau semble en effet être organisé en systèmes neurocognitifs complexes, hautement distribués et plastiques. C'est dans cet esprit qu'a été réalisé ce travail de thèse dont l'ambition première a été de repenser les modèles actuels de la cognition sociale, et en particulier ceux ayant trait à la fonction de mentalisation, à travers l'étude comportementale des patients porteurs d'un gliome diffus de bas-grade. Cette tumeur neurologique rare constitue un excellent modèle physiopathologique en vue du démasquage des structures maîtresses des systèmes cognitifs complexes, en ce qu'elle induit des phénomènes majeurs de réorganisation fonctionnelle, et s'infiltre préférentiellement le long de la connectivité axonale associative. Des corrélations anatomo-cliniques ont été réalisées suivant une approche topologique classique (analyse de groupe en régions d'intérêt, cartographie voxel-based lesion-symptom, stimulation électrique corticale intra-opératoire) mais également hodologique (degré de déconnection des faisceaux d'association, stimulation électrique de la connectivité axonale). Les résultats principaux de nos différents travaux nous permettent de jeter les premières bases d'un modèle à double voie dynamique (plastique) et hodotopique (contraint par la réalité anatomique) de l'organisation anatomo-fonctionnelle des processus de mentalisation. Spécifiquement, une voie dorsale, interconnectant le aires corticales fronto-pariétales « miroirs » via le système périsylvien de substance blanche associative (faisceau arqué et faisceau longitudinal supérieur latéral), sous-tendrait les processus perceptifs de « bas-niveau » nécessaires à l'identification préréflexive des états mentaux ; une voie cingulo-médiane, interconnectant les régions préfrontales médiales et rostro-cingulaires aux régions pariétales postérieures médiales via le faisceau cingulaire, sous-tendrait les processus de «haut-niveau » nécessaires aux inférences mentalistiques conscientes. Ces découvertes constituent une avancée substantielle en neurosciences sociales, ont des implications importantes pour la prise en charge clinique des patients, et peuvent permettre de mieux comprendre certaines psychopathologies caractérisées à la fois par un trouble de la mentalisation et des anomalies structurales de la connectivité associative (troubles du spectre autistique)
Understanding how the brain produces sophisticated behaviours strongly depends of our knowledge on its anatomical and functional organization. Until recently, it was believed that high-level cognition was merely the by-product of the neural activity of discrete and highly specialized cortical areas. Major findings obtained in the past decade from neuroimaging, particularly from the field of connectomics, prompt now researchers to revise drastically their conceptions about the links between brain structures and functions. The brain seems indeed organized in complex, highly distributed and plastic neurocognitive networks. This is in this state of mind that our work has been carried out. Its foremost ambition was to rethink actuals models of social cognition, especially mentalizing, through the behavioural study of patients harbouring a diffuse low-grade glioma. Because this rare neurological tumour induces major functional reorganization phenomena and migrates preferentially along axonal associative connectivity, it constitutes an excellent pathophysiological model for unmasking the core structures subserving complex cognitive systems. Anatomo-clinical correlations were conducted according to both a classical topological approach (region of interest analyses, voxel-based lesion-symptom mapping, intraoperative cortical electrostimulation) and a hodological approach (degree of disconnection of associative white matter fasciculi, intraoperative axonal connectivity mapping). The main results of our different studies enable us to lay the foundation of a dynamic (plastic) and hodotopical (connectivity) dual-stream model of mentalizing. Specifically, a dorsal stream, interconnecting mirror frontoparietal areas via the perisylvian network (arcuate fasciculus and lateral superior longitudinal fasciculus), may subserve low-level perceptual processes required in rapid and pre-reflective identification of mental states; a cingulo-medial stream, interconnecting medial prefrontal and rostro-cingulated areas with medial posterior parietal areas via the cingulum, may subserve higher-level processes required in reflective mentalistic inferences. These original findings represents a great step in social neuroscience, have major implications in clinical practice, and opens new opportunities in understanding certain pathological conditions characterized by both mentalizing deficits and aberrant structural connectivity (e.g. autism spectrum disorders)

Le gliome infiltrant du tronc cérébral est une tumeur gliale pédiatrique de très mauvais pronostic. La survie médiane des patients varie entre 9 et 12 mois. Son aspect typique en imagerie permet le diagnostic sans confirmation histologique mais a limité la compréhension de la physiopathologie de ces tumeurs pendant plusieurs années. L'identification des mutations des histones H3 K27M comme identité moléculaire des gliomes infiltrants du tronc cérébral définit cette tumeur comme une entité unique en 2012 et la sépare des autres tumeurs cérébrales. Il y a deux variantes des histones H3 à l’origine des tumeurs, la variante H.3.1 et la variante H3.3 qui forment deux sous-groupes présentant des phénotypes et des pronostics différents. L'objectif de cette thèse était d'utiliser les techniques d'imagerie multimodale pour mieux comprendre la physiopathologie des gliomes infiltrants du tronc cérébral, en observant l'évolution des effets des différents traitements à différents temps. Nous avons tout d'abord montré une augmentation des index de perfusion associée à une diminution de l'oedème lésionnel en post- radiothérapie. Puis nous avons décrit en imagerie le phénomène de pseudo-progression. Ce phénomène, qu’il ne faut pas prendre pour une vraie progression tumorale, est caractérisé par une augmentation du volume et du rehaussement tumoral associé à une augmentation importante des index de perfusion. Le ratio d’augmentation du flux sanguin lésionnel dans les suites de la radiothérapie permet identifier une pseudo-progression avec une sensibilité et une spécificité élevées. Ces 2 groupes de patients (sans et avec pseudo-progression) ont un comportement en imagerie très différents en fin de vie. Nous avons ensuite comparé les paramètres d'imagerie aux données histologiques pour mieux appréhender les deux types de mutation d'histones. Les tumeurs H3.1 présentent plus d'oedème, plus de nécrose et une perfusion moins élevée. Les tumeurs H3.3 ont une perfusion plus élevée et moins d'oedème. La valeur du volume sanguin lésionnel est positivement corrélée à la charge tumorale. L’imagerie multimodale est essentielle dans le suivi et la compréhension des mécanismes physiopathologiques des DIPG. Elle devra être incluse dans les protocoles de recherches (efficacité des nouvelles chimiothérapies ciblées et nouvelles techniques d’application, modèles murins, radiomics, corrélation avec les nouvelles quantifications histologiques) dans le but d’avancer puis un jour de guérir ces petits patients
Diffuse Intrinsic Pontine Glioma is a pediatric tumor with very poor prognosis. Median survival is 9-12 months. Its typical MRI appearance allows for diagnosis without histological confirmation, but has limited understanding its pathophysiology for years. DIPGs molecular identity identified as histone H3K27M mutations in 2012 defined them as a separate entity. Two subgroups with different phenotypes and prognoses are associated with mutations in one of the two variants H3.1/H3.3 of histone H3. The aim of this thesis was to use multimodal imaging techniques to better understand the pathophysiology of DIPG, by observing the evolution of the effects of different treatments over time. 1st, we showed an increase in perfusion indices associated with decreased edema after radiotherapy. Secondly, we have described the phenomenon of pseudo-progression in MRI, an increase in tumor volume and enhancement associated with a significant increase in perfusion index. This shouldn’t be confused with true tumor progression. The ratio of increase in lesion’s blood flow after radiotherapy has high sensitivity and specificity to identify pseudo-progression. 3rd, we compared the imaging parameters with the histological data to better understand the differences between the histone mutations. The mutated tumors H3.1 have more edema, more necrosis and a lower perfusion. While mutated H3.3 tumors have a higher tumor burden. Tumor burden is positive correlated to lesion blood volume. Multimodal imaging is essential in monitoring and understanding the physiopathological mechanisms of DIPG. It should be included in the research protocols in order to advance and then one day to cure these small patients

Les découvertes récentes en neuropsychologie ont permis de passer d’une conception localisationniste à une conception en réseaux dynamiques du fonctionnement cérébral. Cette révolution conceptuelle, d’un cerveau immuable à remodelable, a été étayée par l’étude des patients porteurs d’un gliome de bas grade, une tumeur primaire associée à des phénomènes majeurs de plasticité cérébrale. Toutefois, on ne sait pas actuellement si cette neuroplasticité peut s’étendre aux fonctions de haut-niveau, celles qui participent à la conscience qu’ont les individus d’eux-mêmes. L’objectif de ce travail de thèse était d’évaluer dans quelle mesure les résections chirurgicales de gliomes affectent les processus métacognitifs et les traits de personnalité, en utilisant des méthodes de corrélations anatomo-fonctionnelles qui s’appuient sur la localisation lésionnelle et les déconnexions cérébrales. Dans un premier temps, nous avons montré que des résections frontales, unilatérales et bilatérales, n’induisaient pas de trouble métaperceptif, alors que le cortex préfrontal est supposé être central dans la métacognition. De même, nos résultats suggèrent que des résections chirurgicales massives n’affectent que très peu les traits de personnalité. Néanmoins, quelques traits comme la schizotypie positive et des troubles du comportement, comme l’anosognosie, étaient associés à l’atteinte de certains faisceaux de substance blanche
Recent findings in the field of neuropsychology have allowed to move from a localized to a dynamic network approach of brain functions. This paradigmatic shift, from a static to a reshaping brain, has been supported by the investigation of patients with low-grade glioma, a neurological tumor known to trigger processes of compensation and rescue of brain functions. However, it is currently unestablished whether this neuroplastic compensation may extend to higher-order cognitive functions, specifically those involved in self-consciousness. By using both anatomo-functional correlational methods based on lesions localization and structural disconnection approach, the purpose of this work was to assess the extent to which the neurosurgical resections of low-grade glioma affect metacognitive processes and personality traits. First, we showed that frontal lobectomies, both unilateral and bilateral, did not induce metaperceptive impairments despite the established role of the prefrontal cortex in metacognition. Likewise, our results suggest that massive surgical resections did not significantly affect personality traits. However, some of them such as positive schizotypy, and a few behavioral modifications, such as anosognosia, were found to be associated with the disruption of some white matter bundles

La mentalisation, ou la capacité d’élaborer des hypothèses sur les états mentaux d’autrui, a fait l’objet de nombreuses études durant les 20 dernières années dans le champ des neurosciences sociales. Toutefois, les bases neurales de cette fonction particulièrement complexe restent mal comprises, notamment en termes de connectivité structurale. Récemment, une organisation anatomo-fonctionnelle en double voie a été proposée. Selon ce modèle, les aspects réflexifs, inférentiels, de la mentalisation seraient sous-tendus par le faisceau cingulaire. Les aspects préréflexifs, identificatoires, seraient médiés, quant à eux, par le complexe faisceau arqué/partie latérale du faisceau longitudinal supérieur (FLS). L’objectif général de ce travail est d’apporter des données originales sur l’organisation anatomo-fonctionnelle du réseau neural impliqué dans la mentalisation basée sur les visages. Pour ce faire, nous avons utilisé comme modèle physiopathologique d’étude le gliome diffus de bas grade. Cette tumeur cérébrale primitive s’avère particulièrement intéressante pour l’étude du rôle de la substance blanche dans la cognition et ce pour deux raisons : (i) les cellules tumorales se propagent préférentiellement le long des fibres blanches ; (ii) l’exérèse chirurgicale est souvent réalisée en condition éveillée avec cartographie fonctionnelle peropératoire pour permettre d’identifier, et ainsi de préserver, les structures fonctionnelles, notamment de substance blanche.Dans une première étude, grâce aux stimulations électriques peropératoires, nous avons pu identifier un vaste réseau cortico-sous-cortical impliqué dans la mentalisation. L’analyse des déconnexions induites par les stimulations de la substance blanche nous a permis de mettre clairement en évidence, et ce pour la première fois, le rôle du faisceau occipito-frontal inférieur (FOFI) tout en confirmant celui du FLS. Dans une deuxième étude, en utilisant des techniques de cartographie lésionnelle chez des patients ayant été opérés, nous avons démontré que les troubles permanents, non compensables, de la mentalisation étaient expliqués par l’atteinte du faisceau arqué. Enfin, dans une dernière étude, en combinant l’imagerie par résonance magnétique fonctionnelle de repos (IRMfr) et les sites corticaux démasqués pendant la chirurgie, nous avons pu générer de véritables cartographies fonctionnelles du réseau cortical de la mentalisation, très similaires à celles observées en imagerie fonctionnelle classique.De façon générale, nos découvertes suggèrent que la mentalisation basée sur les visages reposerait sur l’intégrité d’au moins deux faisceaux associatifs de substance blanche. Elles permettent également de valider l’utilisation combinée de l’IRMfr et des stimulations corticales en tant qu’approche originale pour cartographier les réseaux neurocognitifs.En plus de ces considérations fondamentales, nos résultats ont des implications cliniques, notamment pour la cartographie fonctionnelle peropératoire. Ils permettent en outre de mieux comprendre les pathologies cérébrales caractérisées par un trouble de la mentalisation et une atteinte des voies de substance blanche
Mentalizing, or the ability of human beings to make assumptions about other people’s mental states, has been the subject of many studies over the last 20 years. The neural bases and especially the white matter connectivity of this complex cognitive function is still poorly understood. Recently, an anatomo-functional organization into two neural pathways has been proposed. According to this model, it is assumed that the reflective, inferential aspects of mentalizing is underpinned by the cingulum. The reflexive, identificatory aspects of mentalizing are thought to be mediated, for their part, by the arcuate fascicle and the lateral part of the superior longitudinal fascicle. The main purpose of this scientific work is to provide original data on the anatomo-functional organization of the neural network involved in the face-based mentalizing. We used as a pathophysiological study model diffuse low-grade gliomas. These primary brain tumors are particularly interesting for the study of the functional role of the white matter for two reasons: (i) the tumor cells propagate preferentially along the white matter fibers; (ii) the surgical resection is often performed in awake condition with intraoperative functional mapping to identify, and thus to preserve functional structures, including the white matter.In our first study, using intraoperative electrical stimulation, we were able to identify a large cortico-subcortical mentalizing network. The analysis of the disconnections induced by the stimulation of the white matter allowed us to clearly highlight, for the first time, the role of the inferior fronto-occipital fascicle. We also confirmed the already established role of the superior longitudinal fascicle in mentalizing. In a second study, using lesion mapping analyses in patients operated on for a diffuse low-grade glioma, we demonstrated that the long-term, non-compensatory mentalizing deficit was explained by the involvement of the arcuate fascicle. Finally, in a third study combining resting-state functional MRI and the cortical sites unmasked during surgery, we were able to identify a large cortical mentalizing networks, which were very similar to those identified by classical task-based functional imaging.In general, our findings suggest that the face-based mentalizing would require the integrity of at least two associative white matter fascicles. They also validate the combined use of resting-state functional MRI and direct cortical stimulations as an original approach to map neurocognitive networks.In addition to these fundamental considerations, our results have also clinical implications, especially regarding the intraoperative functional mapping. They also provide a better understanding of brain pathologies characterized by both mentalizing deficit and white matter impairment

La caractérisation moléculaire multidimensionnelle des tumeurs et des tumeurs gliales en particulier est une étape importante pour l’identification de biomarqueurs (diagnostique, pronostique, théranostique et/ou de prédisposition), pour l’identification de cibles thérapeutiques et pour une meilleure compréhension de l’oncogénèse moléculaire.Nos travaux ont permis de confirmer et de consolider certaines données de la littérature comme par exemple : (i) la valeur pronostique favorable de la codélétion 1p/19q, (ii) la valeur pronostique favorable de la mutation IDH, (iii) le caractère mutuellement exclusive des mutations TP53 et de la codélétion 1p/19q et (iv) la rareté des altérations génétiques du PDGFRA dans les gliomes de bas grade (GDBG). De manière plus originale, nous avons identifié plusieurs sous-groupes génomiques de GDBG pertinents sur le plan clinico-biologique, notamment au sein des GDBG non 1p/19q codélétés : (i) 19q-délété ; (ii) 11p-délété, (iii) 7-gagné, (iv) 19-gagné et (v) inclassés. La perte du bras chromosomique 19q annule la valeur pronostique favorable de la mutation IDH dans les GDBG non 1p/19q codélétés. Nous avons également identifié des mutations géniques originales dans les GDBG (i.e. mutation TEP1 et RNF40) qui renforcent le rôle des télomères et du remodelage de la chromatine au sein des GDBG.Enfin, nous nous sommes concentrés sur la caractérisation des GDBG 11p-délétés qui sont de phénotype majoritairement astrocytaire et de moins bon pronostic. Ces GDBG surexpriment des gènes des cellules immunitaires (les GIM -Glioma infiltrating microglia-, les macrophages de type 1, les macrophages de type 2) et sont infiltrés par des cellules macrophagiques et microgliales. Ce microenvironnement dérégulé peut constituer une cible thérapeutique au sein des GDBG 11p-délétés. En conclusion, nos travaux participent à la dissection clinico-moléculaire des GDBG et à préciser la biologie d’un sous-type de GDBG caractérisé la perte du bras chromosomique 11p
Multildimensional molecular characterization of tumors and more specifically of gliomas is of pivotal importance to identify: (i) new biomarkers (i.e. diagnostic, prognostic, theranostic or predisposing), (ii) new therapeutic targets and (iii) to improve our understanding of molecular oncogenesis.Our work has confirmed and consolidated previous data published in the literature, for example that: (i) 1p/19q co-deletion is associated with better prognosis, (ii) IDH mutation is associated with better prognosis, (iii) TP53 mutations and 1p/19q codeletion are mutually exclusive and (iv) PDGFRA is rarely altered, at genomic level, in low-grade gliomas (LGG).More originally, we have identified several genomic groups, with clinical and biological relevances, in LGG and more specifically in LGG without 1p/19q co-deletion: (i) 19q-deleted, (ii) 11p-deleted, (iii) 7-gained, (iv) 19-gained and (v) unclassified. Interestingly, 19q deletion abrogates the positive prognostic value of IDH mutation in LGG without 1p/19q codeletion.We have also identified new recurrent somatic gene mutations in LGG (i.e. TEP1 and RNF40 mutations), supporting the critical role of telomeres and chromatin remodelling in LGG.Finally, we have characterized further 11p-deleted LGG that exhibit mostly astrocytic phenotype and poor prognosis. This subgroup includes LGG overexpressing genes of inflammatory/immune cells (GIM -Glioma infiltrating microglia-, M1 macrophages and M2 macrophages) and infiltrated by macrophagic/microglial cells. This peculiar microenvironment detected in 11p-deleted LGG might be used as a therapeutic target. In conclusion, our work participates to characterize clinico-biological portrait of LGG and to describe a singular genomic subgroup of LGG characterized by 11p loss

Le gliome infiltrant du tronc cérébral est une tumeur rare, non opérable et inéluctablement fatale. En raison du manque de ressource biologique disponible, aucun progrès dans la compréhension de la biologie de ces tumeurs n’a été fait jusqu’à ces dernières années, laissant la radiothérapie pour seul traitement efficace, et seulement transitoirement. Enfin, grâce à la mise en place de collecte d’échantillons de gliomes infiltrant du tronc cérébral au diagnostic ou à l’autopsie, un nombre sans précédent d’analyses biologiques et génomiques a pu être mené et améliorer la connaissance de ces tumeurs. Si ces études ont montré que ces gliomes pédiatriques étaient bien différents de ceux de l’adulte, elles ont aussi fait apparaître la présence d’anomalies génétiques récurrentes spécifiques de ces tumeurs sous-tentorielles. Ainsi le Platelet-Derived Growth Factor Receptor Alpha (PDGFRα) est apparu comme cible prédominante dans ces tumeurs compte tenu des nombreuses anomalies génétiques constatées. La recherche d’un médicament efficace pouvant inhiber cette voie nous a conduit à évaluer l’effet du dasatinib qui est un inhibiteur multi-ciblé. Nous en rapportons ici l’efficacité in vitro sur de nouvelles lignées cellulaires de gliomes infiltrants du tronc cérébral établies à partir de biopsies stéréotaxiques réalisées au diagnostic. Sachant néanmoins que les thérapies ciblées restent peu efficaces en clinique quand elles sont utilisées seules, nous mettons en évidence l’intérêt de combiner le dasatinib avec un inhibiteur de MET, 2ème oncogène fréquemment amplifié dans ces tumeurs. D’autre part, une stratégie originale de criblage médicamenteux a été mise en œuvre. Celle-ci a permis de définir de manière fonctionnelle de nouveaux médicaments potentiellement efficaces dans les gliomes infiltrants du tronc cérébral, incluant les inhibiteurs d’Histone deacetylases (HDAC), les inhibiteurs des Cyclin-Dependent Kinases (CDK) ou encore les inhibiteurs du protéasome. Enfin par la technique de séquençage génome-entier, de nouvelles anomalies génétiques jamais rencontrées dans aucun autre cancer ont été détectées. Parmi celles-ci se trouvent des mutations d’histone H3K27M dont la fréquence élevée (80%) suggère leur rôle fondamental dans la genèse de ces tumeurs. Des mutations activatrices d’ACVR1/ALK2 ont été également mises en évidence. Celles-ci représentent désormais de nouvelles cibles à explorer.Ce travail de thèse rapporte la recherche de nouvelles cibles thérapeutiques d’une part, via une approche exploratoire par criblage médicamenteux et recherche d’anomalies génétiques par séquençage « génome-entier », et d’autre part, via une approche de validation préclinique sur le plan des thérapies ciblées de type inhibiteurs de tyrosine-kinases
Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a rare, unresectable and universally fatal tumor. Due to the lack of available material, no improvements have been made in the knowledge of the biology of this tumor until recent years, leaving radiotherapy as the only efficient treatment, and only transiently. Recently, the effort engaged for collecting samples in this disease at the diagnosis or at the autopsy resulted in an unprecedented number of analyses consequently improving our knowledge in DIPG. Those studies bring evidences for their differences with adult gliomas, but also with other pediatric supratentorial glioma showing specific genomic alterations. Thus, Platelet-Derived Growth Factor Receptor Alpha (PDGFRα) appeared to be one of the major target given its frequent aberrations found in those tumors. Investigating an effective drug to inhibit this pathway led us to evaluate the effect of dasatinib, which is known as a multi-targeted inhibitor. We report here the in vitro efficacy of dasatinib on new cell lines of DIPG developed from stereotaxic biopsy at diagnosis. Because therapies are largely inefficient in the clinic when they are used as a monotherapy, we bring out our interest on combining dasatinib with an inhibitor of MET, which is the 2nd most common amplified oncogene in these tumors.Additionally, an innovative strategy of pharmacological screening has been successfully tested. New drugs, potentially efficient in DIPG, have been fonctionnaly-defined, including Histone deacetylase inhibitors (HDACi), Cyclin-Dependent Kinases inhibitors (CDKi) and proteasome inhibitors as well.Finally, by using whole genome sequencing (WGS), we have been able to discover new genetic abnormalities, never encountered before in other cancers. Among those, mutations of histone H3K27M with a high frequency of 80% were found, suggesting that they have a fundamental role in tumors genesis. Moreover, ACVR1/ALK2 activating mutations have been identified as well. And this gene now represents a new target to explore. This work reports the research of new therapeutic targets through an exploratory approach using drug screening and WGS on the one hand, and on the other hand through a preclinical validation approach in terms of targeted therapies with tyrosine-kinases inhibitors

L’épidémiologie et les facteurs de risque des gliomes diffus de bas grade (GDBG, ou gliomes diffus de grade II OMS) sont à ce jour mal connus. Ce travail de thèse s’est intéressé à décrire les caractéristiques épidémiologiques (taux d’incidence, données démographiques) et à rechercher, dans la littérature et par nos travaux, des arguments en faveur de facteurs de risque environnementaux, fonctionnels et moléculaires. Epidémiologie descriptive : l’analyse d’une série exhaustive de cas incidents de GDBG diagnostiqués entre 2006 et 2011, à l’échelle nationale, a permis de déterminer l’incidence des GDBG dans leur ensemble (incidence standardisée sur la population française : 0,775/105 personnes-années) et pour chacun de leurs sous-types histologiques définis par la classification 2007 de l’OMS. Facteurs de risque environnementaux : nous avons pu mettre en évidence des différences significatives dans la distribution géographique des gliomes diffus de grade II et III OMS en France métropolitaine, avec une incidence plus élevée dans le Nord-Est et le centre de la France. Cette hétérogénéité semble en faveur de facteurs de risque environnementaux, même s’il n’existe à ce jour aucun facteur de risque environnemental démontré dans les GDBG. Facteurs de risque biologiques : notre travail a permis de démontrer l’existence d’une dichotomie sur le plan moléculaire entre les GDBG de topographie frontale, plus fréquemment mutés IDH et codélétés 1p19q, et les GDBG temporo-insulaires, moins fréquemment mutés IDH et codélétés 1p19q, suggérant des voies de gliomagénèse différentes pour ces deux patterns tumoraux. Facteurs de risque fonctionnels : enfin, comme le montrent les données de la littérature, il existe deux arguments principaux en faveur de facteurs de risque fonctionnels dans les GDBG. D’une part, ces tumeurs présentent des localisations intracérébrales spécifiques et distinctes des autres gliomes, et impliquent préférentiellement les zones dites « fonctionnelles ». D’autre part, des modifications macroscopiques cérébrales ont été rapportées en lien avec l’apprentissage d’une tâche ou une expertise particulière. Les mécanismes microscopiques qui sous-tendent ces modifications sont encore incertains mais une implication (directe ou indirecte) des cellules gliales, semble probable, ce qui pourrait faire le lit de la gliomagénèse. Peu d’études se sont intéressées jusqu’à présent aux corrélations entre les activités du sujet et le risque de GDBG, et nous proposons donc, dans les suites de ce travail de thèse, une étude cas-témoins en ce sens. En conclusion, même s’il n’existe à ce jour aucun facteur de risque démontré de GDBG, certains éléments bibliographiques, et les travaux de cette thèse, suggèrent l’implication de facteurs environnementaux, fonctionnels et biologiques dans la genèse des GDBG
The epidemiology and risks factors of diffuse low-grade gliomas (DLGG, or WHO grade II diffuse gliomas) are yet poorly known. This thesis aimed at describing the epidemiology (incidence rates, demographic data) and at looking for arguments in favor of environmental, functional and molecular risk factors, in the literature and by our works. Descriptive epidemiology: The analysis of an exhaustive series of incident cases of DLGG diagnosed between 2006 and 2011 allowed the determination of DLGG incidence (incidence rate standardized on the French population: 0,775/105 person-years) as well as that of each histological subtype described by the 2007 WHO classification. Environmental risk factors: We were able to demonstrate significant differences in the geographical distribution of WHO grade II and III diffuse gliomas in metropolitan France, with higher incidence rates in the North-East and Center regions. This heterogeneity stands in favor of environmental risk factors, even though there is to date no proven environmental risk factor for DLGG. Biological risk factors: Our work demonstrated the existence of a clear dichotomy, regarding molecular biology, between frontal DLGG, more frequently IDH-mutated and 1p19q codeleted, and temporo-insular tumors, less frequently IDH-mutated and 1p19q codeleted, suggesting different gliomagenesis pathways for these two patterns of tumors. Functional risk factors: Finally, data from the literature provide two main arguments in favor of the existence of functional risk factors in DLGG. First, the intra-cerebral location of these tumors is specific and distinct from that of other gliomas, with a preferential implication of “functional” areas. Second, macroscopic intra-cerebral changes have been reported following training on specific tasks, or in relation with a specific expertise. The microscopic mechanisms that underlie these modifications are uncertain but an implication (direct or indirect) of glial cells seems probable, and could favor gliomagenesis. To date, only few studies have investigated the correlation between the subject’s activity and the risk of DLGG. We thus propose, following this thesis, a case-control study to further investigate this issue. In conclusion, even though there is no demonstrated risk factor for DLGG, data from the literature, and conclusions from the present work, suggest the implication of environmental, functional and biological factors in DLGG genesis

Le Gliome Diffus de Bas Grade (GDBG) est défini par l’OMS comme une tumeur primitive du système nerveux central et représente 15% de toutes les tumeurs gliales confondues. Un GDBG croît lentement, et finit inévitablement par se transformer en un gliome de grade III, bien plus agressif, qui mène finalement au décès du patient. Trois types de traitements sont disponibles : La chirurgie, la chimiothérapie et la radiothérapie. Aujourd’hui, les médianes de survie rapportées dans les études sont de 10 à 15 ans. Malheureusement, le pronostic du GDBG est très variable, l’écart-type de la survie totale étant élevé, et certains patients ne survivant que quelques années. Dans le cadre de la prise en charge du GDBG au CHRU de Nancy, la chimiothérapie est un des traitements les plus utilisés et on observe des réponses très variables tant en intensités, qu’en durées ainsi qu’en terme de profils de réponses. C’est dans ce contexte que se situe le travail de thèse. Il concerne l’étude de la réponse à la chimiothérapie et consiste à développer des outils d’aide à la décision pour le neuro-oncologue dans le suivi des patients. La première partie de mon travail de thèse se concentre donc sur le choix de la méthode de volumétrie. On peut ensuite caractériser la courbe de réponse volumique selon l’intensité de réponse. La seconde partie de ce travail concerne la modélisation de la réponse à l’aide de techniques d’apprentissage statistique. De nombreuses variables explicatives (épidémiologiques, génétiques sont à prendre en compte dans cette étude, dont une nouvelle variable nommée ESVR, qui est une mesure permettant de quantifier le phénotype infiltrant des GDBG. Les méthodes d’analyse factorielle et de machine learning permettent dans un premier temps de définir les variables qui portent le plus d’information. Les analyses exploratoires des données révèlent une redondance de l’information parmi certains facteurs génétiques et épidémiologiques. Les modèles montrent une plus grande influence des variables quantitatives sur la réponse à la chimiothérapie, comparé aux variables qualitatives. Une discussion sera menée sur l’importance des variables utilisées dans la prédiction de la réponse à la chimiothérapie. La finalité de la thèse est de produire un ensemble de règles qui permettront aux cliniciens d’anticiper, avant l’administration du traitement, son effet sur le volume tumoral ce qui permettra un choix de stratégie thérapeutique plus éclairé qu’aujourd’hui
Diffuse Low-Grade Glioma (DLGG) is defined by the WHO as a primary tumour of the central nervous system and represents 15% of all glial tumours combined. A DLGG grows slowly, and inevitably evolve into a much more aggressive (grade III) glioma, which eventually leads to the death of the patient. Three types of treatment are available: surgery, chemotherapy and radiotherapy. Today, the median survival rates reported in studies varies from 10 to 15 years. Unfortunately, the prognosis for DLGG is highly variable, with a high standard deviation of total survival, and some patients are surviving only a few years. Within the framework of DLGG management at Nancy University Hospital, chemotherapy is one of the most widely used treatments and there are very variable responses in terms of intensity, duration and response profiles. The thesis work is located in this context. It concerns the study of the response to chemotherapy and consists in developing decision-making tools for the neuro-oncologist in the follow-up of patients. The first part of this thesis work therefore focuses on the choice of the volumetric method. The volume response curve can then be characterised in terms of response intensity. The second part of this work concerns response modelling using statistical learning techniques. Many explanatory variables (epidemiological, genetic) are under study. A new variable called ESVR, which is an original measure allowing us to quantify the infiltrating DLGG phenotype, will also be used. The factorial analysis and machine learning methods initially make possible to define the variables that provide the most information. Exploratory analyses of the data reveal a redundancy of information among certain genetic and epidemiological factors. The models show a greater influence of quantitative variables on the response to chemotherapy compared to qualitative variables. A discussion is finally produced on the importance of the variables used in the prediction of the response to chemotherapy. The aim of this thesis is to produce a set of rules which will enable clinicians to anticipate, before administering the treatment, its effect on tumour volume, which will allow a more advised choice of therapeutic strategy than possible nowadays

Due to their capital diagnostic, prognostic and therapeutic implications, molecular markers have become essential for the management of patients with diffuse gliomas. Among them, IDH mutations have special importance, as they allow to classify diffuse gliomas, they are predictive of prolonged survival and increased sensitivity to alkylating agents and can be targeted by specific inhibitors. IDH-mutant diffuse gliomas deeply differ from IDH-wildtype diffuse gliomas in terms of molecular profile, prognosis and treatment, as different are the pathways of gliomagenesis and progression in the two groups. In the first section of the thesis, we explored the association between 25 glioma risk loci and tumor genotype in a large cohort of glioma patients for whom we disposed of both germline and tumor DNA. Our study confirmed that IDH-mutant and IDH-wildtype gliomas are associated with different susceptibility loci and that certain germline risk loci associate with distinct molecular groups, suggesting a direct involvement in their pathogenesis. In the second section of the thesis, we assessed the performance of two different techniques for the noninvasive detection of IDH mutations. The first technique is based on the identification of IDH1 mutations from the analysis of tumor-derived extracellular vesicles circulating in plasma, a procedure generally referred to as “liquid biopsy”. The second technique is based on the detection of 2-hydroxyglutarate, a metabolite that reflects the presence of IDH mutations, using in vivo magnetic resonance spectroscopy. While the experiments of liquid biopsy posed major challenges due to the limited amount of tumor-derived material circulating in plasma, magnetic resonance spectroscopy proved an overly sensitive and specific technique for the diagnosis and follow-up of patients with IDH-mutant gliomas. In the third section of the thesis, we focused on three rare subsets of IDH-wildtype gliomas with the aim to better characterize their genetic profile, define their prognosis, and assess the prevalence of actionable alterations. We identified different mutational and immunological signatures in high- and low-grade gliomas associated with type 1 neurofibromatosis, we identified recurrent FGFR1 mutations in midline gliomas and frequent FGFR3-TACC3 fusions in low-grade astrocytomas lacking IDH mutations, observations that pave the way to the experimentation of novel therapeutic approaches for these rare tumor types. In the fourth and last section of the thesis, we analyzed the response to targeted treatment in a cohort of adult patients with recurrent or disseminated BRAF-mutant gliomas. The substantial response rate observed in our study encourages the use of RAF/MEK inhibitors in BRAF-mutant gliomas and emphasizes the importance of screening for this rare but actionable alteration.

Le traitement des DMG altérés H3 K27, n’ayant pas connu d’amélioration au cours de ces 50 dernières années, figure parmi les plus grands défis de la neuro-oncologie pédiatrique. En 2012, a été découverte une mutation spécifique de l’histone 3 (oncohistone), dite H3.3 K27M, présentant une prévalence très élevée (70-80% des cas) dans les DMG. Bien que l’impact épigénétique de cette mutation ait été décrit, des études demeurent nécessaires afin de mieux comprendre son rôle dans le phénotype agressif et la réponse aux thérapies des cellules DMG. Afin d’étudier précisément l’impact de la mutation H3.3 K27M sur le phénotype des cellules de DMG,nous avons développé et caractérisé des modèles cellulaires isogéniques complémentaires de gliome pédiatrique de haut grade induits et invalidés pour l’oncohistone. À l’aide de ces modèles, nous souhaitions élucider l’impact de H3.3 K27M sur la biologie des cellules de DMG et leur réponse aux traitements anti-cancéreux, notamment la radiothérapie, unique traitement de référence actuel pour la prise en charge des DMG. Par la caractérisation de nos lignées cellulaires de gliomes pédiatriques sustentoriels induites pourH3.3 K27M, nous avons montré que l’oncohistone impacte la réponse aux radiations ionisantes et à certaines thérapies ciblées de manière dépendante du contexte cellulaire.Sur la base de ce constat, nous avons pris le parti de caractériser les impacts biologiques de l’oncohistone dans un contexte cellulaire plus pertinent de DMG. En ce sens, nous avons établi des modèles cellulaires knock-out pour H3.3 K27M et les avons caractérisés comparativement à leurs lignées cellulaires parentales mutées. Par des caractérisations omiques (transcriptomique et protéomique) et du métabolisme cellulaire de ces modèles, nous avons notamment identifié un impact de la mutation H3.3 K27M sur le métabolisme lipidique des cellules DMG. De surcroit, dans des modèles de sphéroïdes 3D, cette modification du métabolisme lipidique associée à l’oncohistone semblait conditionnée par des facteurs du microenvironnement encore à l’étude.D’autre part, une approche fonctionnelle par criblage pharmacologique nous a permis d’identifier des dépendances à certaines voies de réparation des dommages à l’ADN spécifiquement associées à la mutationH3.3 K27M. De plus, la caractérisation radiobiologique de nos modèles, actuellement en cours, indique une radiosensibilité associée à H3.3 K27M, corrélant avec une diminution de l’efficacité de réparation de l’ADN postirradiation. Au-delà de cet impact sur la réparation des dommages à l’ADN, notre criblage pharmacologique a également révélé une sensibilité exacerbée à certains composés de la famille des glycosides cardiaques induite par H3.3 K27M. Ce résultat apparaît particulièrement intéressant au regard de nos données transcriptomiques montrant un enrichissement en gènes impliqués dans les cardiomyopathies et l’homéostasie ionique parmi les gènes différentiellement exprimés en présence de l’oncohistone. Dans ce contexte, nous avons entrepris l’étude des processus moléculaires et biologiques sous-jacents à cette différence de sensibilité gouvernée parH3.3 K27M.In fine, nous avons utilisé nos modèles cellulaires isogéniques pour montrer que l’oncohistoneH3.3 K27M entraîne des modifications du métabolisme lipidique des cellules de DMG. Ces changements métaboliques pourraient rendre les cellules de DMG altérés H3 K27 plus susceptibles au déclenchement de certaines voies de morts cellulaires (e.g. ferroptose) et affecter la réponse à certaines thérapies. De plus, H3.3K27M semble induire des sensibilités spécifiques, notamment à la radiothérapie et aux glycosides cardiaques [...]
H3K27-altered DMG treatment is one of the most significant challenges in pediatric neuro-oncology,with no improvement in patient survival over the past 50 years. In 2012, it was shown that DMGs harbor a specific histone 3 mutation (oncohistone) called H3.3 K27M with a very high prevalence (70-80% of cases). Although theH3.3 K27M impact on the epigenetic landscape has been well described, studies are needed to understand betterits role in DMG cells’ aggressiveness and response to therapies.To study the H3.3 K27M mutation impact on DMG cell phenotypes precisely, we developed andcharacterized pediatric high-grade glioma isogenic cellular models induced and knock-out for the oncohistone.Using these models, we aimed to decipher the oncohistone impact on DMG cell biology and response to anticancertherapies, including radiation therapy, the only current standard of care for DMGs. Characterization of our H3.3 K27M-induced pediatric supratentorial glioma cell lines reveals that the oncohistone affects the response to ionizing radiations and specific targeted therapies in a cellular context-dependentway. Based on these results, we settled to characterize oncohistone biological impacts in a more relevant cellular context of DMG. In that sense, we established H3.3 K27M knock-out cellular models and characterized them regarding their parental DMG H3.3 K27M mutated cell lines. Through omic (transcriptomic and proteomic)and cell metabolism characterizations of these models, we notably showed the H3.3 K27M mutation impact on DMG cells’ lipid metabolism. In 3D spheroid models, this H3.3 K27M-induced lipid metabolism rewiring appeared conditioned by microenvironment factors still under investigation.On the other hand, a functional pharmacological screen identified H3.3 K27M-driven dependencies tospecific DNA repair pathways. In addition, ongoing radiobiological characterization of our models indicates anH3.3 K27M-associated radiosensitivity correlating with a decrease in DNA repair efficiency following ionizingradiations. Beyond this DNA repair impact, our pharmacological screen also revealed an H3.3 K27M-relatedsensitivity to cardiac glycoside drugs. This result makes sense with our transcriptomic data showing enrichmentin genes involved in cardiomyopathies and ion homeostasis among differentially expressed genes with theoncohistone. In this context, we began unraveling the molecular and biological processes underlying thisH3.3 K27M-driven effect.Finally, we used our isogenic cellular models to show that the H3.3 K27M oncohistone drives lipidmetabolism modifications. These metabolic changes could prime H3K27-altered DMG cells to specific regulatedcell death pathways (e.g., ferroptosis) and affect the response to certain therapies. Moreover, the H3.3 K27Mseems to drive specific sensitivities, notably to radiation therapy and cardiac glycoside drugs. Understanding the underlying molecular mechanisms governing these H3.3 K27M-associated Achille heels could highlight newinsights into the oncohistone role in DMG cells and provide rationales for developing new therapeutic strategies

Les gliomes sont les principales tumeurs primitives du cerveau affectant environ 4000 nouveaux patients par an en France. La moitié des gliomes est détectée au stade avancé de glioblastome (grade IV) tandis que 15% des tumeurs sont diagnostiquées au stade II de gliomes diffus dit de bas grade. Ces tumeurs affectent des patients jeunes et présentent des mutations caractéristiques, notamment une mutation pour l’enzyme IDH1 communément retrouvée dans les glioblastomes secondaires. Ces tumeurs de bas grade sont traitées par une chirurgie, idéalement en condition éveillée mais du fait de leur nature diffuse, la partie résiduelle progressera inexorablement vers un stade III ou IV avec une survie globale entre 5 ans et 15 ans après diagnostique. La progression tumorale est hautement variable et non prédictible d’un patient à l’autre. Des foyers de progression tumorale chez 20% des patients atteints de gliome diffus de bas grade ont été identifiés. Ces foyers montrent une densité cellulaire plus élevée ainsi qu’un Ki67 augmenté. Mon travail de thèse aura consisté à étudier les modifications cellulaires et moléculaires associées à ces foyers de progression tumorale. À partir du profil ARN des foyers et des territoires adjacents, j’ai pu mettre en évidence par des techniques haut-débit la baisse d’expression significative de gènes dans les foyers notamment de AGXT2L1/ETNPPL, carboxypeptidase E, EDNRB, SFRP2. J’ai émis l’hypothèse que SFRP2 et ETNPLL pourraient s’opposer à la prolifération cellulaire et que leur diminution dans les foyers ouvrirait la voie à la transformation tumorale. Une corrélation inverse entre la quantité d’ETNPPL enzyme et la survie de patients atteints d’hépatocarcinomes a été publiée. En limitant la quantité de précurseurs de phospholipides dans la cellule, ETNPPL pourrait agir comme un frein en s’opposant à la prolifération et de fait, sa diminution dans les foyers de transformation des gliomes pourrait lever cette inhibition. Mes travaux auront été innovants tant dans leur approche comparative des différents compartiments tumoraux pour chaque patient étudié et auront révélés ETNPPL comme corrélé à la gliomagenèse et potentielle cible thérapeutique
Gliomas are the main primary brain tumours affecting around 4000 new patients in France each year. Half of gliomas are detected in the advanced stage of glioblastoma (grade IV) while 15% of tumours are diagnosed in stage II (diffuse low-grade gliomas-DLGG). These tumors affect young patients and bear characteristic mutations, including a mutation for the enzyme IDH1 commonly found in secondary glioblastomas. These low-grade tumours are treated by surgery, ideally in awake condition but due to their diffuse nature, the residual part will progress inexorably to stage III or IV with overall survival between 5 and 15 years after diagnosis. Tumor progression is highly variable and unpredictable from one patient to another. Foci of tumor progression have been identified in 20% of patients with DLGG. These foci show a higher cell density and an increased Ki67. My thesis work consisted in studying the cellular and molecular changes associated with tumor progression. From the RNA profile of the foci and adjacent territories, I was able to highlight through high-throughput techniques significant decrease in gene expression in the foci, particularly of AGXT2L1/ETNPPL, carboxypeptidase E, EDNRB, SFRP2. I hypothesized that SFRP2 and ETNPLL could oppose cell proliferation and that their decrease would pave the way for tumor transformation. An inverse correlation between the amount of ETNPPL and the survival of patients with hepatocarcinoma has been published. By limiting the amount of phospholipid precursors in the cell, ETNPPL could act as a brake against proliferation and indeed, its decrease in glioma transformation foci could remove this inhibition. My PhD work will have been innovative in the comparative approach of the different tumors’ compartments for each patient studied and will have revealed ETNPPL as correlated to gliomagenesis and as potential therapeutic target

Les gliomes diffus de bas grade (GBG) sont des tumeurs cérébrales primaires. Après une phase de croissance lente, ils évoluent en gliomes de haut grade, entrainant une issue fatale. Ce sont des tumeurs très diffuses donc difficiles à traiter. Une meilleure connaissance de ces tumeurs pourrait permettre de les guérir ou, à défaut, d'optimiser les traitements. Nous avons étudié la croissance des GBG grâce à un modèle mathématique simple, ce qui nous a amené à spéculer (i) qu'ils surviennent à l'adolescence, (ii) que l'âge de la tumeur au moment du diagnostic peut être calculé facilement et (iii) que la vitesse de croissance est un facteur pronostique important. Cette dernière prédiction concorde avec les observations cliniques. Pour vérifier ce modèle spatial, nous avons caractérisé quantitativement des tissus de biopsies étagées de GBG humains, en particulier la présence d'œdème. L'analyse de ces données microscopiques étaie l'idée que l'œdème est à l'origine de l'anomalie de signal IRM en séquence T2. Pour prendre en compte ce résultat nouveau, nous avons incorporé l'œdème au modèle initial comme conséquence de la présence de cellules tumorales. Ce modèle permet d'expliquer la longue décroissance du rayon tumoral pendant des dizaines de mois après la radiothérapie : les cellules tumorales désormais moins nombreuses, le drainage de l'œdème devient prédominant. Ce modèle, qui ne comprend que trois paramètres libres, a été validé grâce à des données cliniques sur une vingtaine de patients
Diffuse low-grade gliomas (LGG) are primary brain tumors. After a slow growth, they evolve to high-grade gliomas, resulting into death. These tumors are very diffuse, thus diffîcult to treat. A better knownledge of them could allow to cure them or, failing that, to optimize treatments. We studied the growth of LGG with a simple mathematical model, which led us to speculate (i) that they arise in adolescence, (ii) that the age of the tumor at diagnosis can be calculated easily, and (iii) that the growth rate is an important prognostic factor. This last prediction is consistent with clinical observations. To test this spatial model, we have quantitatively characterized biopsy tissues of human LGG, particularly the presence of edema. The microscopic analysis of these data underpins the idea that edema is the cause of the abnormality seen on T2-weighted MR imaging. To take this new result into account, we have incorporated edema into the initial model as a consequence of the presence of tumor cells. This model helps explain the long decay of the tumor radius for tens of months after radiation therapy: as tumor cells become less numerous, drainage of the edema becomes predominant. This model, which has only three free parameters, has been validated thanks to clinical data from twenty patients

Les gliomes diffus de bas grade (GBG) sont des tumeurs cérébrales primaires. Après une phase de croissance lente, ils évoluent en gliomes de haut grade, entrainant une issue fatale. Ce sont des tumeurs très diffuses donc difficiles à traiter. Une meilleure connaissance de ces tumeurs pourrait permettre de les guérir ou, à défaut, d'optimiser les traitements. Nous avons étudié la croissance des GBG grâce à un modèle mathématique simple, ce qui nous a amené à spéculer (i) qu'ils surviennent à l'adolescence, (ii) que l'âge de la tumeur au moment du diagnostic peut être calculé facilement et (iii) que la vitesse de croissance est un fac- teur pronostique important. Cette dernière prédiction concorde avec les observations cliniques. Pour vérifier ce modèle spatial, nous avons caractérisé quantitativement des tissus de biopsies étagées de GBG humains, en particulier la présence d'œdème. L'analyse de ces données micro- scopiques étaie l'idée que l'œdème est à l'origine de l'anomalie de signal IRM en séquence T2. Pour prendre en compte ce résultat nouveau, nous avons incorporé l'œdème au modèle initial comme conséquence de la présence de cellules tumorales. Ce modèle permet d'expliquer la longue décroissance du rayon tumoral pendant des dizaines de mois après la radiothérapie : les cellules tumorales désormais moins nombreuses, le drainage de l'œdème devient prédominant. Ce mo- dèle, qui ne comprend que trois paramètres libres, a été validé grâce à des données cliniques sur une vingtaine de patients.

Tout ce qui vit, naît, se nourrit, se reproduit et meurt. Pour le cerveau, la question se complexifie car à la survie des neurones s'ajoute le coût de l'activité cérébrale. La question de la gestion énergétique pour les neurones est particulière car les cellules de notre cerveau évoluent de manière concertée et non par compétition. On sait avec l'imagerie médicale que l'usine neuronale ne fonctionne pas uniquement grâce au glucose ; elle utilise d'autres apports énergétiques tels que le lactate ou le glutamate pour soutenir sa production. Lorsqu'une tumeur apparaît, elle change le métabolisme énergétique pour survivre et soutenir sa propre croissance. En particulier, les cellules cancéreuses se fournissent en lactate et choisissent leur substrat préféré en fonction de l'oxygène disponible. La modélisation mathématique des substrats énergétiques est un outil de choix pour décrire et prédire de tels flux. Coupler ces modèles à des données issues de l'IRM et de la SRM permet d'améliorer la prise en charge du patient présentant un gliome.Cette thèse propose l'approche de plusieurs dynamiques en substrat dans le cerveau sain et gliomateux en se basant sur des systèmes d'équations : échanges locaux en lactate (EDO, système lent-rapide), échanges globaux en substrats (EDO), cycle glutamate/glutamine (EDR) et échanges en lactate en dimensions supérieures (EDP). Ces modèles sont expliqués, décrits grâce aux mathématiques et permettent l'élaboration de simulations ajustées selon des données patient ou issues de la littérature.L'énergie est nécessaire au maintien de la vie. Mais si votre voisin consomme une partie de vos ressources, pouvez-vous encore espérer survivre ?
Everything that lives is born, eats, reproduces and dies. For the brain, the question is more complex because neurons have to survive and to support brain activity. Energy management is also particular because brain cells evolve together with no competition. Thanks to medical imaging, we know that neurons do not consume only glucose. They can use others energetic substrates such as lactate and glutamate as a power source.When a tumor appears, it changes the energetic metabolism to survive and support its own growth. In particular, cancer cells like to consume lactate. They also choose their favorite substrate based on the available oxygen. Modeling of energy substrates is useful to describe and predict energetic kinetics and changes. Mathematical models could get with clinical and medical results to describe, explain or predict low grade glioma dynamics. They can help to characterize and quantify a tumor evolution, then leading to improve their therapeutical management. Exchanges between mathematics and MRI (and MRS) enable to get accurate data and to build suitable mathematical models.This thesis deals with several approaches of substrates dynamics in healthy and gliomatous brains. These researches are based on systems of equations. We model local lactate exchanges (ODE, fast-slow systems), global substrates exchanges (ODE), glutamate/glutamine cycle (RDE) and local lactate exchanges in higher dimensions (PDE). We describe, analyze and give simulations of these models. Simulations are fitted on patient MRI data or literature data. Energy is necessary to live. But if your neighbor consumes a part of your resources, can you still survive ?
Tutto ciò che vive nasce, si nutre, si riproduce e muore. Per il cervello, la questione è più complessa perché i neuroni devono sopravvivere e sostenere l'attività cerebrale. La gestione energetica cerebrale è particolare anche perché le cellule cerebrali evolvono insieme, senza concorrenza. Inoltre, grazie alle immagini mediche, sappiamo che i neuroni non consumano solo del glucosio ma usano altri substrati energetici come il lattato o il glutammato.Quando un tumore si stabilisce, cambia il metabolismo energetico del cervello per sopravvivere e sostenere la propria crescita. In particolare, cellule tumorali consumano del lattato e scelgono il loro substrato preferito basandosi all'ossigeno disponibile.La matematica, e in particolare l'elaborazione di modelli matematici può aiutarci a ottimizzare i dati disponibili, che possono essere, di volta in volta, delle proprietà cellulare o delle lastre MRI o MRS. La modellizzazione dei substrati energetici potrebbe descrivere, spiegare o prevedere le dinamiche energetiche nel cervello.Questa tesi tratta di diversi approcci della dinamica dei substrati nei cervelli sani e gliomatosi. Queste ricerche si basano su sistemi di equazioni. Modellizziamo scambi locali di lattato (ODE, sistemi fast-slow), scambi globali di substrati (ODE), ciclo glutammato/glutammina (RDE) e scambi locali di lattato in dimensioni superiori (PDE). Descriviamo, analizziamo e diamo simulazioni di questi modelli. Le simulazioni sono adeguate su dati MRI paziente o dati di letteratura.Per vivere, l’energia è una necessità. Ma se i Suoi vicini consumassero le Sue risorse, riuscirebbe ancora a sopravvivere ?

Les gliomes infiltrants du tronc cérébral (DIPG) sont les tumeurs cérébrales pédiatriques les plus sévères. Le traitement standard, la radiothérapie, n’est efficace que transitoirement et la réponse est hétérogène. L’objectif du projet est de définir les mécanismes de radiorésistance.Tout d’abord, la réponse in vitro à l’irradiation de modèles cellulaires de DIPG dérivés de biopsies au diagnostic a été évaluée et nous avons identifié les mutations de TP53 comme principal facteur de radiorésistance. Ce résultat a été validé in vitro à l’aide de 4 lignées isogéniques TP53WT et TP53KD. Puis, nous avons montré au niveau clinique qu’une mutation de TP53 est un biomarqueur de non-réponse à la radiothérapie. A l’aide d’un crible d’ARN interférence, nous avons identifié différentes kinases essentielles à la survie des cellules de DIPG à l’irradiation. L’inhibition de CHK1 augmente la réponse à l’irradiation spécifiquement dans les cellules TP53MUT et pourrait être considérée comme une nouvelle approche thérapeutique en combinaison avec la radiothérapie. Enfin, des modèles cellulaires résistants à l’irradiation ont été mis en place pour étudier la rechute ainsi que des outils pour modéliser les processus moléculaires de résistance et d’échappement à la radiothérapie par suivi unicellulaire de la dynamique clonale des cellules tumorales par marquage RVB.Ces résultats vont plus loin dans la compréhension de la radioresistance des DIPG. Nous avons démontré qu’une altération de TP53 est un marqueur théranostic de prédiction de radioresistance et nous avons identifié de nouvelles opportunités thérapeutiques en combinaison avec la radiothérapie pour le traitement de cette maladie pédiatrique qui demeure incurable
Diffuse intrinsic pontine gliomas (DIPG) are the most severe pediatric brain tumours. Though accepted as the main therapeutic, radiotherapy is only transiently efficient and not even in every patient. We previously identified a heterogeneous response to radiotherapy at diagnosis (Castel et al., 2015). The aim of the project was to define the mechanisms of radioresistance.First, we assessed in vitro response to ionizing radiations in a collection of DIPG cellular models derived from treatment-naïve biopsies and we uncovered TP53 mutation as the main driver of increased radioresistance. We validated this finding in 4 isogenic pairs of DIPG cells with TP53WT and TP53KD. Then, we demonstrated with an extended cohort of 73 DIPG patients that mutated TP53 patients had a poor response to radiotherapy. Using a kinome-wide synthetic lethality RNAi screen, we further identified target genes that can sensitize TP53MUT DIPG to ionizing radiations. CHK1 inhibition increases response to radiation specifically in TP53MUT cells and could be considered as a new therapeutic approach in this setting. Finally, we established in vitro radioresistant DIPG cells to study tumour relapse and we developed tools to model post-radiotherapy relapse through the study of clonal dynamics using single cell RGB marking.In all, this results go further in the understanding of the DIPG radioresistance. We demonstrated that a TP53 alteration is a theranostic marker to predict radioresistance and we opened new therapeutic opportunities in combination with radiotherapy for the treatment of this pediatric disease, which remains incurable

The introduction of molecular criteria into the classification of diffuse gliomas has added interesting practical implications to glioma management. This has created a new clinical need for correlating imaging characteristics with glioma genotypes, also known as radiogenomics or imaging genomics. Whilst many studies have primarily focused on the use of advanced magnetic resonance imaging (MRI) techniques for radiogenomics purposes, conventional MRI sequences still remain the reference point in the study and characterization of brain tumours. Moreover, a different approach may rely on diffusion-weighted imaging (DWI) usage, which is considered a “conventional” sequence in line with recently published directions on glioma imaging. In a non-invasive way, it can provide direct insight into the microscopic physical properties of tissues. Considering that Isocitrate-Dehydrogenase gene mutations may reflect alterations in metabolism, cellularity, and angiogenesis, which may manifest characteristic features on an MRI, the identification of specific MRI biomarkers could be of great interest in managing patients with brain gliomas. My study aimed to evaluate the presence of specific MRI-derived biomarkers of IDH molecular status through conventional MRI and DWI sequences.

L'objectif principal de cette thèse est la modélisation, compréhension et segmentation automatique de tumeurs diffuses et infiltrantes appelées Gliomes Diffus de Bas Grade. Deux approches exploitant des connaissances a priori de l'ordre spatial et anatomique ont été proposées. Dans un premier temps, la construction d'un atlas probabiliste qui illustre les positions préférentielles des tumeurs dans le cerveau est présentée. Cet atlas représente un excellent outil pour l'étude des mécanismes associés à la genèse des tumeurs et fournit des indications sur la position probable des tumeurs. Cette information est exploitée dans une méthode de segmentation basée sur des champs de Markov aléatoires, dans laquelle l'atlas guide la segmentation et caractérise la position préférentielle de la tumeur. Dans un second temps, nous présentons une méthode pour la segmentation de tumeur et le recalage avec absence de correspondances simultanés. Le recalage introduit des informations anatomiques qui améliorent les résultats de segmentation tandis que la détection progressive de la tumeur permet de surmonter l'absence de correspondances sans l'introduction d'un à priori. La méthode est modélisée comme un champ de Markov aléatoire hiérarchique et à base de grille sur laquelle les paramètres de segmentation et recalage sont estimés simultanément. Notre dernière contribution est une méthode d'échantillonnage adaptatif guidé par les incertitudes pour de tels modèles discrets. Ceci permet d'avoir une grande précision tout en maintenant la robustesse et rapidité de la méthode. Le potentiel des deux méthodes est démontré sur de grandes bases de données de gliomes diffus de bas grade hétérogènes. De par leur modularité, les méthodes proposées ne se limitent pas au contexte clinique présenté et pourraient facilement être adaptées à d'autres problèmes cliniques ou de vision par ordinateur.

Tese de mestrado, Oncobiologia, Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2019
Os gliomas são os tumores primários mais frequentes do Sistema Nervoso Central, representando 50% de todos os casos de tumores cerebrais. Incluem, entre outros, os astrocitomas (AT) e os oligodendrogliomas (OLG). Uma designação comum para estes tumores, quando se localizam num ou mais lobos cerebrais, na região supratentorial é a de gliomas difusos e atingem, caracteristicamente, jovens adultos. Esses dois tipos de gliomas são considerados de baixo grau e são infiltrativos, de crescimento lento. Os gliomas de baixo grau – grau II, pela Organização Mundial de Saúde – tem uma forte tendência para a progressão maligna, para gliomas anaplásicos (grau III, pela OMS) e até glioblastomas secundários (grau IV, pela OMS), o que, muitas vezes, ocorre após alguns anos, geralmente, entre cerca de 4 a 5. Muitas vezes, após uma resseção cirúrgica de gliomas de baixo grau, as células neoplásicas deixadas no cérebro podem originar um tumor recidivante, que muitas vezes se transforma em glioma de alto grau, com prognóstico variável a longo prazo e uma taxa de sobrevida de entre 5 a 8 anos. A nova classificação da OMS, no que diz respeito a Tumores do Sistema Nervoso Central, revista em 2016, introduziu parâmetros moleculares como mutações IDH, co-deleções de 1p/19q e perdas de ATRX, agrupando os tumores em categorias de acordo com seus perfis genéticos, além dos padrões histológicos usados até então. Sendo assim, é possível classificar os gliomas difusos em astrocitomas, IDH mutantes; oligodendrogliomas, IDH mutantes e 1p/19q co-deletados; astrocitomas IDH wild-type; glioblastomas IDH mutantes; glioblastomas IDH wild-type; oligodendrogliomas sem outras especificações; astrocitomas sem outras especificações; oligoastrocitomas sem outras especificações e glioblastomas sem outras especificações. Os critérios usados para definir o grau de anaplasia dos gliomas, definidos pela OMS, são polimorfismo nuclear e hipercromasia, índice mitótico, proliferação endotelial da microvascularização tumoral e necrose do parênquima tumoral. Estes critérios permitem aos patologistas classificar os gliomas difusos em diferentes graus de malignidade, desde grau II, o menos maligno, até aos graus III e IV, os mais malignos, dos quais o glioblastoma é o mais comum. As alterações moleculares no processo de tumorigénese levam à ativação de oncogenes ou à inativação de genes supressores de tumor. Alguns dos marcadores genéticos de grande relevância no processo de tumorigénese e na determinação do tipo e grau de anaplasia dos gliomas difusos são o 1p/19q (co-deleção), o EGFR, o PTEN e o CDKN2A. A presença de mutação do ATRX ajuda ao diagnóstico dos AT com IDH mutante, distinguindo-os dos OLG. Os AT anaplásicos com mutações combinadas no ATRX e no IDH têm melhor prognóstico do que os que só têm a mutação do IDH. As mutações no codão 132 do gene IDH ocorrem cedo e a uma frequência elevada em AT, OLG de graus II e III, e em glioblastomas secundários desenvolvidos a partir de AT. Os objetivos deste estudo são comparar o perfil imunohistoquímico e as alterações citogenéticas encontradas em 16 casos de doentes com cirurgia a gliomas primários de baixo grau, e a recidiva de grau mais elevado, resultando num total de 32 amostras – 18 oligodendrogliomas, 10 astrocitomas, 3 oligoastrocitomas e 1 gliossarcoma; avaliar e quantificar as alterações e identificar subpopulações baseadas em marcadores, nas amostras de tumores de ambas as cirurgias. Para isso, obtiveram-se lâminas de imunohistoquímica e fizeram-se blocos de Tissue Micro Arrays, dos quais se obtiveram lâminas para Hibridação In Situ por Fluorescência. As proteínas estudadas foram GFAP, IDH1, KI-67, ATRX e Olig-2, e os genes foram CDKN2A, p53, EGFR, PTEN, 1p e 19q. Realizou-se a técnica de imunohistoquímica para os marcadores IDH, ATRX e GFAP, posteriormente fotografados no microscópio ótico, e analisados com programa Image-J (plugin Colour Deconvolution). Às áreas de interesse foram-lhes atribuídas cores secundárias (cada uma associada a um marcador) e as imagens resultantes foram sobrepostas originando áreas de cores primárias. Foi calculado o rácio de pixéis de cada cor de interesse. Realizou-se igualmente a técnica de imunohistoquímica para os marcadores Olig-2 e KI-67, também fotografados no microscópio ótico e analisados no programa Image-J (plugin ImmunoRatio). Realizou-se ainda Hibridação in situ de fluorescência, para analisar os genes CDKN2A, p53, EGFR, PTEN, 1p e 19q, em lâminas de Tissue Micro Array, que foram fotografadas no microscópio de fluorescência e analisadas no programa Image-J (plugin Cell Counter para contagem dos núcleos). Este estudo incluiu 18 oligodendrogliomas, 10 astrocitomas, 3 oligoastrocitomas e 1 gliossarcoma. A análise foi feita inicialmente para os marcadores individuais e, em seguida, para as subpopulações definidas, baseadas na classificação actual de gliomas difusos. Nenhuma das amostras estudadas apresentou deleção do gene supressor tumoral PTEN. O estudo de EGFR mostrou amplificação em apenas 6 das 32 amostras, sendo 4 exclusivamente nas recidivas e 1 exclusivamente num tumor primário de baixo grau. O p53 estava mutado em 6 das 32 amostras estudadas, sendo que 4 desses 6 tumores com mutação eram recidivas. Analisando as alterações de primários para recidivas, encontraram-se 4 casos com p53 wild-type no primário e mutação nas recidivas e 1 caso que manteve a mutação em ambos os grupos. O CDKN2A estava deletado no primário e na recidiva em simultâneo, em apenas 1 caso. 6 casos tinham deleções nos primários e apenas 3 tinham deleções nas recidivas. A expressão de KI-67 apresentou valores mais elevados nas recidivas do que nos primários. Relativamente à expressão de Olig-2, observou-se o contrário, sendo os valores mais elevados nos primários do que nas recidivas. Não se encontraram diferenças major nas três subpopulações estudadas (IDH1mut/ATRXloss, IDH1mut/ATRX/1p/19q co-deletadas e IDH1wt) entre as amostras de tumores primários e as suas respectivas recidivas. Descobriram-se mais células tumorais IDH1mut/ATRXloss em recidivas (9799±24384) do que em primários (5053±10116), e mais células tumorais IDH1- em primários (671939±180448) do que nas recidivas (609653±284091). Contudo, estas diferenças não foram muito evidentes. Células IDH1mut/ATRX/1p/19q co-deletadas foram encontradas em apenas um dos dezasseis casos estudados. As proteínas e genes estudados cobrem a maioria das principais vias de sinalização molecular que levam ao desenvolvimento de carcinomas. Contudo, a ausência de variações muito evidentes entre os dois grupos comparados (primário e respetiva recidiva) indica que poder-se-á não estar a estudar os marcadores mais relevantes para esta evolução. Outros marcadores que poderão ser relevantes são o PDGF e o Ras. O PDGF é um agente mitogénico de células mesenquimais, incluindo células gliais e já foi associado a glioblastomas (vias PI3k/AKT e Ras-Raf-Mek-Erk). O gene Ras foi o primeiro oncogene humano a ser identificado e sabe-se que está mutado em cerca de um terço dos carcinomas. Estes são apenas dois exemplos de outras moléculas que podem ser estudadas nos gliomas. Este estudo é um passo noutra direcção, no que diz respeito aos marcadores biológicos em gliomas. Os resultados obtidos levantam variadas questões face aos marcadores estudados e oferecem uma série de sugestões de outros a considerar; e, uma vez que não há bibliografia de suporte, seria interessante continuar a estudar esta linha de progressão tumoral do primário para a recidiva. O objetivo não seria apenas caracterizar subgrupos histológicos de gliomas do ponto de vista genético e molecular mas também, e acima de tudo, tentar compreender a evolução do tumor primário e os mecanismos e ferramentas biológicas presentes no próprio, que lhe permite recidivar com um nível de malignidade superior. Se se conseguir prever estas transformações no tempo, poder-se-á tentar controlar a progressão da doença logo desde o momento do diagnóstico.
The most frequent primary tumors of the Central Nervous System are gliomas, representing 50% of all brain tumor cases, which include, among others, astrocytomas and oligodendrogliomas. Those two types of gliomas, considered low-grade gliomas, are infiltrative and slow-growing. Low-grade gliomas (World Health Organization grade II) have a strong tendency for malignant progression to anaplastic gliomas (World Health Organization grade III) and even secondary glioblastomas (World Health Organization grade IV), which often takes place after a few years, usually about 4 to 5. Indeed, after a surgical resection of LGG, cancerous cells left in the brain can give rise to a recurrent tumor, often transformed in a high-grade glioma, with variable long-term prognoses and a survival rate between 5 to 8 years. The new World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System, revised in 2016, introduced molecular parameters, such as IDH mutations, 1p/19q co-deletions and ATRX losses, for grouping tumors into categories according to their genetic profiles besides the histologic patterns used until then. The aim of this study is to compare immunohistochemical profile and cytogenetic changes in 16 cases with two different surgeries from the same patient, treated for recurrences, evaluate and quantify those changes and identify marker based subpopulations in tumour samples from both surgeries. The proteins studied were GFAP, IDH1, KI-67, ATRX and Olig-2, and the genes were CDKN2A, p53, EGFR, PTEN, 1p and 19q. We did not found major differences in the populations we studied (IDH1mut/ATRXloss, IDH1mut/ATRX/1p/19q co-del and IDH1wt) between primaries and their relapses. However, differences were found in Ki-67, Olig-2, EGFR and CDKN2A between the two groups studied (primary tumors and relapses). All proteins and genes studied cover most of the main pathways that lead to cancer development, which may lead us to think that we are looking at the wrong set of markers. We found some results that suggest it should be interesting to continue this type of research of comparing primary tumors with their own relapses, and try to understand what makes tumors relapse in a much more aggressive form, in order to control the progression of the disease right in the moment of the diagnosis.

Gliomas are brain tumors that present with neurological symptoms including seizures and cognitive deficits. Starting at early stages of tumor development glioma cells diffusely infiltrate brain tissue where they interact with non-neoplastic cells including neurons and can perturb normal brain function. While the clinical consequences of glioma induced cortical dysfunction are well established, the neuronal alterations that underlie cortical dysfunction in glioma are unknown. We hypothesize that glioma cells infiltrate surrounding brain tissue and induce alterations in neurons that may contribute to the neurological symptoms associated with gliomas. Due to intermingling of glioma cells and neurons it has been challenging to isolate and characterize neurons from glioma brain tissue while preserving complex neuronal morphology. To address this issue we developed a new mouse glioma model that allowed us to obtain a neuron specific gene expression profile, otherwise obscured by the predominantly large population of glioma cells within the tumor. In this thesis I use this model to test the hypothesis that infiltrating glioma cells induce phenotypic alterations in neurons that contribute to the neurological symptoms associated with glioma. The Camk2a-Ribotag mouse glioma model enabled us to isolate neuron specific transcripts from glioma brain tissue. The Ribotag mouse has a conditional HA-tagged ribosomal protein (Rpl22) that can be expressed upon Cre-recombination. Camk2a is specifically expressed in excitatory neurons, the Camk2a-Cre mouse induces Cre-recombination in the Ribotag mouse so that Camk2a+ neurons selectively express HA-tagged Rpl22. We used the Camk2a-Ribotag glioma model to isolate neuron specific ribosome bound transcripts to characterize neuronal alterations in glioma. In chapter 2 of this thesis I describe how we developed and characterized the Camk2a-Ribotag mouse glioma model. We first obtained mouse glioma cells that have p53 deletion and overexpress PDGFRa, then we injected these cells in the Camk2a-Ribotag mouse and use this as our glioma model to extract neuron specific ribosome bound transcripts. This method is referred to as translating ribosome affinity purification (TRAP) which is used to obtain cell type specific translational profiles. Using this approach we identified alterations in neuronal gene expression, specifically we show that there is an upregulation of actin binding genes associated with dendritic spine morphology and a downregulation of synaptic genes associated synaptic regulation. We demonstrate that drebrin, an actin binding protein in dendritic spines, is upregulated in tumor brain synaptosomes, we also show a downregulation of dendritic spine density in HA-tagged neurons which suggests that these neuronal alterations contribute to synaptic dysfunction in our glioma model. Dendritic spines are dynamic structures that regulate synaptic function in response to diverse stimuli. mTOR signaling can regulate brain specific functions such as synaptic plasticity. Alterations in mTOR signaling can result in cognitive deficits, epilepsy and brain abnormalities that are associated with neurological disease. We hypothesized that mTOR regulates the neuronal alterations we identified in our glioma model. In chapter 3 of this thesis I describe how we tested this hypothesis by acutely inhibiting mTOR signaling with the ATP competitive inhibitor AZD8055 in the Camk2a-Ribotag mouse glioma model. Using TRAP we show that acute mTOR inhibition reverses many neuron specific alterations that occurs in the glioma infiltrated cortex, actin binding genes that were upregulated in tumor brains were downregulated after mTOR inhibition and synaptic genes that were downregulated in tumor brains were upregulated after mTOR inhibition. These results suggest that key neuron specific alterations are regulated by mTOR signaling in our glioma model. In chapter 4 of this thesis I describe how we used ribosome profiling to identify translational alterations in our Camk2a-Ribotag mouse glioma model. Ribosome profiling in an RNA sequencing based method that is used to measure translation efficiency by calculating the number of ribosomes per transcript. Using this approach we identified an upregulation in the translation of DNA methylation and demethylation gene ontologies. These results suggest that alterations in specific DNA methylation and demethylation gene ontologies are regulated at the level of translation and warrant further analysis of cell type specific translational alterations using ribosome profiling. The work described in this thesis demonstrates 1) use of the Camk2a-Ribotag mouse glioma model for the identification of neuron specific alterations, 2) neuron specific alterations include the upregulation of dendritic spine genes, downregulation of synaptic genes and downregulation of dendritic spine density, 3) acute mTOR inhibition reverses many of these neuronal alterations, 4) ribosome profiling revealed the translational upregulation of epigenetic genes in our mouse glioma model. The findings described in this thesis provide the first characterization of neuron specific transcriptional and translational alterations in glioma infiltrated cortex that and provide new insights into the mechanisms that underlie the devastating neurological symptoms in glioma patients.

Photodynamic therapy (PDT) derives its tumour selectivity from preferential photosensitizer accumulation and short light penetration in tissue. However, additional strategies are needed to improve the therapeutic index of PDT in oncological applications where light is delivered interstitially to large volumes (e.g. prostate), or when adjacent normal tissue is extremely sensitive (e.g. brain). Much research to improve PDT's selectivity is directed towards developing targeted photosensitizers. Here, I present two alternative strategies to improve PDT's selectivity, without compromising its efficacy. For interstitial delivery, I investigated whether customizable cylindrical diffusers can be used to deliver light doses that conform better to target geometries, specifically the prostate. Additionally, I examined whether the neuroprotectant erythropoietin, used as an adjuvant to PDT for brain tumours, can reduce the sensitivity of normal tissue, thereby improving treatment selectivity. To determine if tailored diffusers constitute an improvement over conventional ones, I introduce a novel optimization algorithm for treatment planning. I also analyze the sensitivity of the resulting plans to changes in the optical properties and diffuser placement. These results are contextualized by a mathematical formalism to characterize the light dose distributions arising from tailored diffusers. In parallel, I investigate the neuroprotective effects of erythropoietin in PDT of primary cortical neurons in culture and normal rat brain in vivo. I show that the most important parameter determining prostate coverage is the number of diffusers employed. Moreover, while tailored diffusers do offer an improvement over conventional ones, the improvement is likely masked by perturbations introduced by the uncertainties of light delivery. Although these results largely discard the use of tailored diffusers in prostate PDT, significant insight has been gained into PDT treatment planning, and tailored diffusers may still be advantageous in more complicated geometries. Additionally, I show that erythropoietin does not improve survival of PDT-treated neurons PDT, nor reduces the volume of necrosis in vivo, for the ranges of conditions and doses studied. To our knowledge, this is the first time this strategy has been tested in brain PDT and deserves to be investigated further, by using later time-points, functional outcomes, and other neuroprotectants.