Tesi sul tema "Déficience de la paroi cellulaire"

Listeria monocytogenes (Lm) est un pathogène intracellulaire facultatif responsable de la listériose, une infection alimentaire particulièrement dangereuse pour les femmes enceintes et les personnes immunodéprimées. Connue pour son adaptabilité, Lm persiste dans divers environnements, rendant son contrôle difficile. Lors d'infections prolongées de cellules épithéliales, telles que les hépatocytes et les trophoblastes, Lm passe d'un état réplicatif à un état quiescent au sein de vacuoles de type lysosomal, appelées Listeria-containing vacuoles (LisCVs). Cette transition est associée à la perte de ActA, protéine permettant la nucléation de l'actine, et à l'arrêt de la polymérisation de l'actine à la surface bactérienne. Au sein des LisCVs, la majorité des bactéries restent intactes et entrent dans un état peu voire non réplicatif jusqu'à atteindre un état viable mais non cultivable (VBNC), une forme dormante permettant la survie dans des conditions défavorables. L'infection prolongée des hépatocytes par Lm perturbe l'immunité de l'hôte, notamment en diminuant la sécrétion des protéines de phase aiguë (APP), essentielles à la réponse immunitaire. Ce processus pourrait empêcher l'élimination complète de Listeria du foie et favoriser ainsi l'établissement d'infection persistante. Lm montre également une capacité d'adaptation remarquable dans des environnements en dehors de l'hôte, notamment dans les milieux aquatiques, où il peut entrer dans un état VBNC. Les pathogènes VBNC posent un risque sanitaire majeur, car ils échappent aux méthodes de détection basées sur la croissance tout en conservant la capacité à se réactiver vers des formes virulentes. Une étude récente montre que lorsqu'elle est exposée à des conditions pauvres en nutriments, Lm perd sa forme en bâtonnet pour devenir ronde en raison de la perte de sa paroi cellulaire. Ces formes sans paroi cellulaire (cell wall-deficient, CWD) peuvent s'adapter aux déséquilibres physico-chimiques en modifiant leur membrane et en produisant des protéines spécifiques. La première partie de la thèse explore les interactions hôte-pathogène lors d'infections par Lm, en se focalisant sur les cellules trophoblastiques. À l'aide de la protéomique comparative par spectrométrie de masse (LC-MS/MS), cette étude compare les profils de sécrétome des cellules infectées et non infectées durant les phases réplicative (24h p.i.) et persistante (96h p.i) de l'infection. L'analyse des voies métaboliques mises en jeu dans le modèle trophoblastique indique que Lm module les réponses immunitaires par des processus intermédiaires tels que l'angiogenèse et les voies de signalisation, dont HIF-1α et MAPK, essentiels à la transduction du signal. Comme dans le foie, ces modulations pourraient être cruciales pour créer et maintenir une niche dans les cellules trophoblastiques ; cependant, les mécanismes restent à identifier. La seconde partie de la thèse étudie la persistance environnementale de Lm via un modèle in vitro d'eau minérale et une analyse de protéomique comparative. Les données montrent une régulation à la baisse des protéines liées à la paroi cellulaire, en cohérence avec l'établissement de forme CWD. L'analyse fonctionnelle a révélé également des réponses aux stress, notamment une diminution de la transduction des signaux, de la virulence et de la production d'énergie, cohérentes avec l'état VBNC. Ces résultats éclairent les stratégies de survie environnementale de Lm et ses mécanismes de persistance. Ce travail explore la persistance de Lm dans les trophoblastes et l'environnement, montrant son adaptation moléculaire à survivre dans des environnements variés. Dans les cellules hôtes, Lm réprime l'immunité, tandis que, dans des conditions pauvres en nutriments, elle privilégie l'acquisition de nutriments et la résistance aux stress. L'ensemble de ces données soulignent sa résilience et pourrait conduire à des applications potentielles pour détecter et traiter les infections persistantes
Listeria monocytogenes (Lm) is a facultative intracellular pathogen responsible for listeriosis, a severe foodborne illness in pregnant women and immunocompromised individuals. Known for its adaptability, Lm persists across varied environments, making it difficult to control. During long-term infection in epithelial cells, such as hepatocytes and trophoblasts, Lm shifts from a replicative to a quiescent state within lysosome-like vacuoles, termed Listeria-containing vacuoles (LisCVs). This transition is associated with the loss of the actin-nucleating protein ActA and the arrest of actin polymerisation at the bacterial surface. Within LisCVs, the majority of bacteria remain intact and enter a slow/non-replicative or a viable but non-culturable (VBNC) state, a dormant form enabling persistence under adverse conditions. Prolonged infection of hepatocytes by Listeria disrupts host immunity, particularly reducing the secretion of acute-phase proteins (APPs), key to the immune response. This process might prevent the complete elimination of Listeria from the liver, thereby favoring the establishment of persistent infection. Lm also displays notable adaptability outside host environments, particularly in water systems, where it can enter a VBNC dormant state. VBNC pathogens pose heightened health risks as they are undetectable by growth-based methods and can reactivate into a virulent form. A recent study shows that when exposed to these nutrient-poor conditions, the bacteria lose their rod shape and become round due to their cell wall loss. These cell wall-deficient (CWD) forms can adapt to physicochemical imbalances by modifying their membrane and producing specific proteins. The first part of this thesis explores host-pathogen interactions during Lm infections, focusing on trophoblast cells. Using comparative proteomics via LC-MS/MS, this study analyses differences in secretome profiles between infected and uninfected cells across replicative (24h p.i.) and persistent (96h p.i.) infection phases. Pathway analysis in the trophoblast model indicates that Lm modulates immune responses through intermediary processes like angiogenesis and signalling pathways, including HIF-1α and MAPK, essential for signal transduction. Similar to the liver, these modulations may be crucial for creating and sustaining a niche in trophoblast cells; however, mechanisms remain to be identified. The second part of this thesis investigates Lm environmental persistence using an in vitro mineral water model and comparative proteomics. Proteomic data identified the downregulation of cell wall-related proteins, consistent with the establishment of CWD form. Functional analysis showed additional stress responses, including decreased signal transduction, virulence, and energy production, all consistent with the VBNC state. These findings provide insight into Lm environmental survival strategies, aiding in the understanding of its persistence mechanisms. This work examines Lm persistence in trophoblast cells and environmental conditions, demonstrating its molecular adaptation to survive in diverse environments. Within host cells, Lm emphasises immune repression, while in nutrient-poor conditions, it focuses on nutrient scavenging and stress resistance. These findings highlight its resilience and could lead to potential applications for detection and treatment of persistent infections
Το Listeria monocytogenes (Lm) είναι ένας προαιρετικά ενδοκυτταρικός παθογόνος μικροοργανισμός, υπεύθυνος για τη λιστερίωση, μια σοβαρή τροφιμογενή λοίμωξη που επηρεάζει κυρίως έγκυες γυναίκες και ανοσοκατασταλμένα άτομα. Γνωστό για την προσαρμοστικότητά του, το Lm επιμένει σε ποικίλα περιβάλλοντα, καθιστώντας τον έλεγχό του δύσκολο. Κατά τη διάρκεια χρόνιων λοιμώξεων σε επιθηλιακά κύτταρα, όπως ηπατοκύτταρα και τροφοβλάστες, το Lm μεταβαίνει από πολλαπλασιασμό σε λανθάνουσα κατάσταση σε Listeria-containing vacuoles (LisCVs). Αυτή η μετάβαση συνδέεται με την απώλεια της ActA και την αναστολή του πολυμερισμού της ακτίνης στην επιφάνειά του. Στα LisCVs, τα βακτήρια εισέρχονται σε μια αργή/μη πολλαπλασιαστική ή βιώσιμη αλλά μη καλλιεργήσιμη (VBNC) κατάσταση, ευνοώντας την επιμονή. Η παρατεταμένη λοίμωξη των ηπατοκυττάρων από τη Listeria διαταράσσει την ανοσία του ξενιστή, μειώνοντας την έκκριση πρωτεϊνών οξείας φάσης (APPs), κρίσιμων για την ανοσοαπόκριση. Αυτό μπορεί να εμποδίσει την πλήρη εξάλειψή της από το ήπαρ, προωθώντας χρόνια λοίμωξη. Το Lm εμφανίζει προσαρμοστικότητα και εκτός ξενιστών, ιδιαίτερα σε υδάτινα συστήματα, όπου εισέρχεται στη VBNC κατάσταση. Οι οργανισμοί VBNC συνιστούν κίνδυνο, καθώς δεν ανιχνεύονται με μεθόδους καλλιέργειας αλλά μπορούν να επανενεργοποιηθούν. Πρόσφατη μελέτη δείχνει ότι σε συνθήκες πτωχών θρεπτικών στοιχείων, τα βακτήρια χάνουν το ραβδοειδές σχήμα τους και γίνονται στρογγυλά λόγω απώλειας κυτταρικού τοιχώματος. Αυτές οι μορφές χωρίς κυτταρικό τοίχωμα (CWD) προσαρμόζονται σε φυσικοχημικές ανισορροπίες μέσω τροποποιήσεων στη μεμβράνη και παραγωγής ειδικών πρωτεϊνών. Το πρώτο μέρος αυτής της διατριβής εξετάζει τις αλληλεπιδράσεις ξενιστή-παθογόνου στις λοιμώξεις Lm, εστιάζοντας στα κύτταρα τροφοβλάστης. Με συγκριτική πρωτεομική (LC-MS/MS), αναλύονται οι διαφορές στο εκκρίτωμα μολυσμένων και μη μολυσμένων κυττάρων στις φάσεις πολλαπλασιασμού (24h) και επιμονής (96h). Η ανάλυση μονοπατιών δείχνει ότι το Lm τροποποιεί τις ανοσολογικές αποκρίσεις μέσω διαδικασιών όπως η αγγειογένεση και τα μονοπάτια σηματοδότησης HIF-1α και MAPK, κρίσιμα για τη μεταβίβαση σήματος. Όπως και στο ήπαρ, αυτές οι τροποποιήσεις μπορεί να συμβάλλουν στη διατήρηση μιας λοίμωξης στα κύτταρα τροφοβλάστης, αν και οι ακριβείς μηχανισμοί παραμένουν άγνωστοι. Το δεύτερο μέρος εξετάζει την περιβαλλοντική επιμονή του Lm χρησιμοποιώντας in vitro μοντέλο μεταλλικού νερού και συγκριτική πρωτεομική. Τα δεδομένα ανέδειξαν μείωση πρωτεϊνών κυτταρικού τοιχώματος, επιβεβαιώνοντας τη μορφή CWD. Επιπλέον, η λειτουργική ανάλυση έδειξε αποκρίσεις στο στρες, όπως μείωση μεταβίβασης σήματος, λοιμογόνου δράσης και παραγωγής ενέργειας, συμβατές με την κατάσταση VBNC. Αυτά τα ευρήματα προσφέρουν νέα δεδομένα για τις στρατηγικές περιβαλλοντικής επιβίωσης του Lm, συμβάλλοντας στην κατανόηση των μηχανισμών επιμονής του. Η εργασία αυτή εξετάζει την επιμονή του Lm σε κύτταρα τροφοβλάστης και περιβαλλοντικές συνθήκες, καταδεικνύοντας τη μοριακή του προσαρμογή. Στα κύτταρα ξενιστή, το Lm καταστέλλει το ανοσοποιητικό, ενώ σε συνθήκες πτωχών θρεπτικών στοιχείων εστιάζει στη συλλογή τους και την αντοχή στο στρες. Αυτά τα ευρήματα αναδεικνύουν την ανθεκτικότητά του και θα μπορούσαν να συμβάλουν στην ανίχνευση και θεραπεία επίμονων λοιμώξεων

Les cellules dans la nature se développent dans un large éventail de formes, suivant divers modèles de croissance. Malgré l'importance de ces processus fondamentaux, la façon dont les cellules régulent leur croissance et leur morphogenèse est encore mal comprise. Dans cette thèse, j'ai exploré ces aspects, avec une approche principalement biomécanique, en concentrant mes investigations sur des cellules à paroi à croissance de pointe et en exploitant en particulier la levure fissipare Schyzosaccharomyces pombe. J'ai d'abord développé de nouvelles méthodes pour mesurer les paramètres mécaniques clés de la paroi cellulaire in vivo et à grande échelle, ce qui a permis les premières observations de la dynamique des parois cellulaires. Ceci a révélé que la paroi cellulaire est plus souple et très variable au niveau des pôles de croissance, et presque stable et plus rigide dans les sites non cultivés. Au cours de l'allongement, il existe une interaction entre la mécanique des parois et la croissance cellulaire, dont le contrôle actif permet l'expansion cellulaire tout en préservant l'intégrité des cellules. De plus, j'ai observé qu'il existe une forte corrélation entre la mécanique des parois cellulaires et la morphologie cellulaire, et des perturbations des propriétés de la paroi affectent directement l'établissement et la maintenance de la forme. Ensemble, mes résultats montrent que la régulation de la paroi est fondamentale dans la détermination de la dynamique cellulaire dans les cellules à parois épaissies. Globalement, cela suggère que l'observation dynamique de la mécanique de surface cellulaire est essentielle pour une compréhension complète des processus multifactoriels et complexes comme la croissance et la morphogenèse
Cells in nature develop in a wide range of forms, following diverse growth patterns. Despite the importance of these fundamental processes, how cells regulate their growth and morphogenesis is still poorly understood. In this thesis, I explored these processes, focusing my investigations on tip growing walled cells and in particular, by exploiting the fission yeast Schyzosaccharomyces pombe, adopting a mainly biomechanical approach. To this aim, I first developed novel methods to measure key cell wall mechanical parameters in vivo and in large scale, which allowed the very first observations of cell wall dynamics. This revealed that the cell wall is softer and highly variable at growing poles, and almost stable and stiffer at non-growing sites. During elongation, there is an interplay between wall mechanics and cell growth, whose active control allows cell expansion while preserving cell integrity. In addition, I observed that there is a strong correlation between cell wall mechanics and cell morphology, and ectopic perturbations of wall properties directly affect shape establishment and maintenance. Together my results show that the regulation of wall mechanics is fundamental in the determination of cell dynamics in tip growing walled cells. Moreover, this suggests that dynamic observation of cell surface mechanics is crucial for a complete understanding of multifactorial and complex processes as growth and morphogenesis

Dans ce travail, nous avons tenté de caractériser d’un point de vue structural et biochimique les composants de la paroi de 2 espèces de diatomées ainsi que de localiser et de caractériser le silicium intracellulaire. Les 3 morphotypes de P. Tricornutum (oval, fusiforme et triradié) ont été caractérisées d’un point de vue structural et mécanique, les mécanismes de passage d’une forme à une autre ont été étudiés. L’analyse de la surface pariétale des morphotypes de P. Tricornutum révèle la présence d’environ 1 % de silicium sous la forme de silice (SiO2) et une forme faiblement condensée. La paroi des formes triradiée et fusiforme contient environ 30 % de protéines, 25 % de polysaccharides et 45 % de lipides, la forme ovale est enrichie en lipides (55 %) et en polysaccharides (30 %) avec une concentration en protéines de 13 %. L’impact de l’alcalinisation du milieu sur l’excrétion d’exo polymères, la formation d’une structure minérale et la biodisponibilité du silicium ont été étudiés chez P. Tricornutum. Les composantes minérales et organiques du frustule ont été analysées par résonance magnétique nucléaire. La présence d’acylglycérol a été détectée dans la paroi de T. Pseudonana, des groupements carboxyliques et phosphates semblent être en contact avec le silicium à l’intérieur de la paroi. Du silicium sous une forme relativement condensée, peut être sous la forme d’un « sol » a été trouvé à l’intérieur de la cellule, ce sol de silice est probablement utilisé par la cellule comme précurseur pour la synthèse du frustule
The aim of the present work is the structural and biochemical characterization of the walls of diatoms, and the localization of their intracellular silicon. The 3 morphotypes of P. Tricornutum (oval, fusiform and triradiate) were characterized structurally and mechanically, mechanisms of transition from one form to another were studied. The analysis of the wall surface of P. Tricornutum morphotypes reveals the presence of about 1% silicon in the form of silica (SiO2) and a weakly condensed species. Triradiate and fusiform wall contains about 30% proteins, 25% polysaccharides and 45% lipids, the oval form is enriched in lipids (55 %) and polysaccharides (30 %) with 13 % of proteins. Formation of mineral structure and silicon bioavailability has been studied in culture of P. Tricornutum, in relation with medium alkalinization and exopolymer excretion. The mineral and organic components of T. Pseudonana frustule were analyzed by nuclear magnetic resonance. The presence of acylglycérol was detected in the wall of T. Pseudonana, carboxylic and phosphates groups seem to be in contact with the silicon inside the wall. A relatively condensed silicon species, probably in the form of a "sol" was found inside the cell, this “silica sol” is probably used by the cell as a precursor for the synthesis of frustule

Les étapes clés de la mise en place des Arabinoxylanes (AX) et b(1-4,1-3)Glucanes (bGm), constituants majoritaires des parois de l’albumen de blé, et la distribution des différents motifs structuraux liés à ces polymères ont été étudiés. 7 stades de développement, ont été explorés (anthèse -> dessiccation) par l’immunohistochimie et les microspectrométries IR et RAMAN. Au stade précoce de formation des parois, seuls les (1-3)-ß-glucanes étaient présents, et de façon transitoire. Au stade cellularisation, les bGm et les arabinogalactanes-protéines apparaissent. Les AX sont détectés plus tardivement au début du stade de différenciation cellulaire. Ils sont plus fortement substitués qu’aux stades ultérieurs. Il y a une variation de degré de substitution des AX selon le type cellulaire. La féruloylation des AX intervient dès le début de la différenciation. La synthèse et la féruloylation des AX se font dans le Golgi. L'étape suivante est l'identification de gènes de biosynthèse
Arabinoxylan (AX) and (1-3)(1-4)-glucan are the major cell wall polysaccharides of wheat endosperm. The time course and pattern of deposition of these components in the endosperm cell walls of wheat during grain development was studied. 7 stages were retained from beginning of endosperm endosperm cellularization upto the maturation period. Immunochemical, Fourier transform-Infrared and Raman methods were used. Three stages of grain development were identified as key stages for cell wall construction. The developing walls contained (1->3)-β-glucans. (1-3)(1-4)-glucan and arabinogalactan-proteins are the main cell wall components of endosperm at the end of cellularization stage. AX appeared only at the cell differentiation stage. At this stage, AX appear more substituted than at the later stages. Feruloylation of AX increases during the grain filling stage. Moreover, a difference in the degree of AX substitution was found across the endosperm

La paroi végétale est composée de polymères complexes de nature protéique, phénolique et polysaccharidique. Ces derniers se répartissent en trois catégories, les celluloses, les hémicelluloses et les pectines. Les homogalacturonanes (HG), composant majeurs des pectines, peuvent être déméthylestérifiés par des enzymes pariétales, les pectine méthylestérases (PMEs, E. C. 3. 1. 1. 11), qui constituent, chez Arabidopsis thaliana une famille multigénique de 66 membres. Au cours de cette étude, nous avons analysé de manière quantitative et qualitative les modifications des composés polysaccharidiques pariétaux au cours du développement de la silique chez Arabidopsis. La maturation de la silique se caractérise notamment par une diminution du degré de méthylestérification des HG et une augmentation de l’activité PME, ce qui nous a conduit à quantifier par RT-qPCR l’expression des 66 gènes codant ces enzymes putatives lors de ce processus de développement. Ceci a permis de mettre en évidence cinq groupes d'expression, et d'isoler plusieurs gènes présentant un profil intéressant sur lesquels la localisation tissulaire de l’expression a été réalisée grâce à des constructions entre leur promoteur et le gène codant la β-glucuronidase. Parmi ceux–ci, le gène At5g47500 est exprimé dans le méristème apical caulinaire et coexprimé dans de nombreux tissus avec le gène At5g20740 codant un inhibiteur de PME putatif. Une approche du rôle de AT5G47500 dans le fonctionnement du méristème a été menée, permettant de montrer que cette protéine joue effectivement un rôle dans le contrôle du degré de méthylestérification des pectines de celui-ci. La modification de la structure pariétale pourrait participer à l'émergence des primordia
Plant cell wall is a complex network which consists of phenolic, proteic and polysaccharadic compounds. The latter comprises notably cellulose, hemicelluloses and pectins. Homogalacturonans, which are one of the main pectic compounds, can be demethylesterified by cell wall bases enzymes, pectin methylesterases (PMEs, EC 3. 1. 1. 11), a multigenic family of 66 members in Arabidopsis thaliana. In this study, we have quantitatively and qualitatively analysed the cell wall polysaccharides composition during silique development in Arabidopsis. The decrease in the degree of methylesterification of homogalacturonan and the increase of total PME activity during silique maturation has lead us to investigate the variation in the expression of the 66 PMEs genes, using RT-qPCR, during this developmental process. Our results showed that PME gene expression can be clustered into five groups, and allowed some gene of interest to be chosen for further analysis. For several candidates, the precise tissue localization was realised using promoter::GUS fusions. This showed that one PME gene, At5g47500, is expressed in the shoot apical meristem and is coexpressed in many tissues with the At5g20740 gene, which encodes a putative PME inhibitor. A functional genomic approach showed that the function of AT5G47500 might be related to the fine tuning of the degree of methylesterification in meristematic tissues, which could play a role in the changes in cell wall structure leading to primordia emergence

Sur 11 aliments étudiés, quel que soit le traitement utilise (traitement à l'alcalin, le chauffage artificiel et le chauffage naturel), induisent tous, une augmentation de la teneur en azote paroi totale non soluble dans la solution de détergent neutre (NDIN): et azote pariétale non soluble dans la solution de détergent acide (ADIN), dans la matière sèche. Cette augmentation occasionne une diminution ou maintient de la dégradabilité dans le rumen. La teneur en NDIN et en ADIN des résidus de fermentation est donc toujours plus forte pour les foins traites que le foin non traite. Cette augmentation sous l'effet du traitement permet une augmentation de la digestion dans l'intestin. Il se produit donc une compensation au niveau intestinal de la baisse de degradabilite de la fraction NDIN et ADIN dans le rumen. Par suite de l'augmentation de la digestibilité dans l'intestin de la fraction NDIN et ADIN, la digestibilité globale dans l'ensemble du tube digestive est proche et souvent même supérieure à celle mesurée dans le foin non traiteé. Par ailleurs, la mesure de la digestibilité globale a été étudiée sur 16 fourrages divers. La digestibilité apparente globale de l'azote total est beaucoup plus faible que la digestibilité réelle globale. Pour la fraction NDIN, la digestibilité apparente globale est beaucoup plus forte que la fraction ADIN

Ce travail porte sur la réponse de la levure à des composés chimiques, qui de manière similaire aux antifongiques, altèrent la structure pariétale et/ou la biosynthèse de l'ergostérol. Ces deux voies sont essentielles pour la survie des champignons, la paroi les protège de leur environnement, alors que l'ergostérol garantit un fonctionnement correct de la membrane plasmique. Pour comprendre ces mécanismes et leurs interactions, nous avons choisi un organisme modèle, la levure Saccharomyces cerevisiae, et étudié sa réponse à des agents perturbant la synthèse de la paroi (populacandine B, rouge Congo, caféine et Calcofluor White), ainsi qu'à des inhibiteurs de la biosynthèse de l'ergostérol (lovastatine et acide zaragozic). Nous avons découvert que la caféine inhibe Tor1p et provoque une baisse rapide et transitoire du niveau intracellulaire en AMPc. Nous avons ainsi montré que Rom2p, un élément de la voie du maintien de l'intégrité pariétale, agit sous l'effet de la caféine comme une protéine "pivot" en transmettant le signal à la kinase Mpk1, mais également à la voie de signalisation de l'AMPc. La caféine a induit un "renforcement" de la paroi mais, contrairement aux autres drogues testées, cet effet ne s'exerce pas à travers une interaction directe. En effet, ce remodelage ne se produit pas à travers la voie habituelle Rlm1p, mais nécessite d'autres facteurs de transcription comme Crz1p, Swi4p et Msn2/4p. Ces résultats nous ont permis d'identifier de nouvelles relations entre les voies de maintien de l'intégrité pariétale, TOR, et la cascade de signalisation de l'AMPc, qui exercent un contrôle synergique sur la croissance des champignons en réponse aux stress
This work is focused on the fungal response to the chemical compounds, which similarly to antifungal drugs, impair the cell wall or ergosterol biosynthesis. Both examined pathways are essential for survival of fungi. The cell wall protects them from the harmful environment whereas ergosterol ensures correct functioning of the plasma membrane. For investigation of those pathways, we chose the genetically tractable fungus, the yeast Saccharomyces cerevisiae, and studied its response to the cell wall damaging agents, i. E. Papulacandin B, Congo red, Calcofluor white and caffeine, and to the inhibitors of the ergosterol biosynthesis like lovastatin and zaragozic acid. A novel function of caffeine was discovered to inhibit Tor1p and to cause a rapid but transient decrease in the intracellular level of cAMP. We have identified Rom2p, a component of the cell wall integrity pathway, as a pivotal protein mediating caffeine-derived signaling to Mpk1 kinase as well as to the cAMP signaling pathway. Caffeine induced strengthening of the cell wall but, in contrast to other tested drugs, this effect was not exerted through a direct interaction with the cell wall structure. Moreover, the caffeine-induced remodeling of the cell wall did not occur through the usual Rlm1p-mediated way but it required some other transcription factors like Crz1p, Swi4p and Msn2/4p. Altogether, we report here a number of results that bear on the relationship between the cell wall integrity, the TOR pathway and the cAMP signaling cascade that together control the growth of the fungal cell in response to stressing conditions

La paroi du champignon filamenteux A. fumigalus conditionne la croissance et est responsable du maintien de l'intégrité cellulaire lors de l'infection. Les protéines de la paroi de ce champignon filamenteux n'avaient pas été étudiées jusqu'à présent alors qu'elles semblent jouer un rôle essentiel dans la structuration de la paroi de la levure modèle S. cereviciae. Une approche essentiellement biochimique a permis de caractériser les protéines associées à la paroi de A..fumigatus. La majorité des protéines pariétales chez A. fumigatus sont des protéines solubles. Une seule protéine est relarguée à partir de la paroi par un traitement f3- (1 .3) glucanase : c'est une phosphatase acide qui possède une ancre GPl et dont l'expression est réprimée en présence de phosphate inorganique. Par ailleurs, une étude des protéines GPl chez A. fumigatus par génomique comparative a montré que les protéines GPI décrites comme associées de façon covalente à la paroi chez la levure n'ont pas d'homologue chez A. fumigatus. Ainsi. l'organisation des protéines au sein de la paroi de A..fumigatus est différente de celle de la levure : les protéines pariétales ne semblent pas avoir un rôle essentiel dans l'élaboration de la paroi. Ensuite, une nouvelle famille de glycoprotéines portant un N-glycane lié à un galactofuranose en position terminale a été décrite. Cette famille comprend une phospholipase C, une phosphatase alcaline et une phytase. Enfin, une analyse morphologique de deux mutants chitine synthase et gluconosyltransférase a permis d'associer la réduction de la croissance à un hyper-branchement du mycélium et à une diminution de la taille de la cellule apicale sans que l'organisation globale des polysaccharides pariétaux et le taux de croissance spécifique soient affectés.

Nous avons étudié l'implication du réseau pectique dans la croissance sur deux modèles végétales, Linum usitatissimum et Arabidopsis thaliana. Cette étude a porté sur la localisation d'épitopes portés par des polysaccharides non-cellulosiques ainsi que celle de la cellulose dans les parois des cellules de l'épiderme, qui est décrit comme étant le tissu contrôlant l'élongation cellulaire. Cette analyse par microscopie électronique à transmission (MET) a été appliquée à, 1) des hypocotyles de plantules de lin, cultivées en absence ou en présence de calcium exogène (10 puissance -3 m) et à 2) des hypocotyles de plantules d'Arabidopsis de type sauvage ou mutant korrigan présentant un défaut d'élongation. L'apport de calcium exogène engendre des modifications de la composition pectique des parois épidermiques des hypocotyles de lin. La mutation kor, qui porte sur une endo-beta-1,4-glucanase, enzyme membranaire impliquée dans le réseau de cellulose-hémicellulose, induit également des perturbations dans le réseau pectique. Sur les deux modèles étudiés, nous avons pu mettre en évidence une acidification du réseau pectique des parois épidermiques pour les plantules cultivées en présence de calcium et pour les mutants korrigan. Chez le mutant kor, nous avons également montré : 1) une réduction des chaînes latérales des RG I, 2) une diminution de la quantité de cellulose et, 3) une modification de l'organisation des réseaux pariétaux rendant la paroi plus lâche après traitements soustractifs. Ces observations, corrélées aux phénotypes respectifs de ces plantules, permettent d'avancer l'hypothèse selon laquelle le réseau pectique serait davantage impliqué dans la réponse de la plante à un stress environnemental ou à des modifications génétiques, afin de maintenir les propriétés physiques des parois végétales pour préserver au maximum le développement de la plante, qu'à la régulation même de l'élongation.

Le bois en tant que matériau présente des propriétés effectives exceptionnelles mais son origine biologique entraine un manque de stabilité physico-mécanique et biochimique ainsi qu'une grande variabilité d'organisation de ses éléments constitutifs à plusieurs échelles (cerne annuel, tissus ligneux, cellule, paroi cellulaire, matière ligno-cellulosique, macromolécules) qui limitent son utilisation. Nous avons, dans le cadre de cette thèse, utilisé la microscopie à force atomique en tant qu'outil de caractérisation des propriétés mécaniques. Le but était de quantifier les propriétés viscoélestiques de couche de la paroi cellulaire de bois. Les travaux ont porté sur la mise au point de protocoles expérimentaux visant à l'amélioration de la qualité des échantillons de bois, à la calibration de la raideur et du rayon de pointe des microleviers utilisés en AFM et de sa réponse lors de l'utilisation d'un mode AFM particulier: le mode contact résonnant. Les résultats obtenus se situent dans la même gamme que les valeurs issues de la littérature, et laissent entrevoir des développements futurs pouvant apporter des réponses qu'il ne semble pas possible d'atteindre avec les autres méthodes disponibles à l'heure actuelle.

L'objectif de ce travail était de développer un modèle in vitro de la paroi primaire des plantes. Une approche ascendante a été choisie pour la conception rationnelle de constructions 2D et 3D faites d'une membrane lipidique, de nanocristaux de cellulose (CNC) et de xyloglucane (XG). Tout d'abord, l'interaction entre les blocs de base a été examinée à l'aide de la diffusion de la lumière, la calorimétrie de titrage isotherme, la microbalance à quartz et la microscopie électronique, révélant tout d'abord la nature électrostatique de l'interaction entre les CNC et une membrane lipidique ainsi qu'une interaction spécifique entre les CNC et XG dans un rapport stoechiométrique précis. Par la suite, les paramètres optimisés des études d'interaction ont été utilisés pour obtenir des structures 2D et 3D en déposant des couches alternées de CNC et XG sur des substrats plats (films multicouches) et des vésicules unilamellaires géantes (GUV). Une croissance linéaire des films a été révélée par les expériences de microscopie à force atomique (AFM), tandis que la réponse des vésicules décorées aux chocs osmotiques conduit à leur flambage en raison de la rigidification de la membrane lipidique. Enfin, les propriétés mécaniques des constructions ont été caractérisées en utilisant l’AFM par indentation, révélant un module d'Young de quelques centaines de kPa, similaire à celui observé pour de vraies parois cellulaires végétales
The goal of this work was to develop an in vitro model of the plant primary cell wall. A bottom up approach was chosen for the rational design of 2D and 3D constructs made of a lipid membrane, cellulose nano crystals (CNCs) and xyloglucan (XG). First, the interaction between the building blocks was probed using light scattering, isothermal titration calorimetry, quartz crystal microbalance and electron microscopy, revealing firstly the electrostatic nature of the interaction between CNCs and a lipidic membrane and secondly, specific interaction between CNCs and XG in a precise stoichiometric ratio. Then, the optimal parameters from the interaction studies were used to obtain 2D and 3D structures by depositing alternating layers of CNCs and XG on flat substrates (multilayered films) and giant unilamellar vesicles (GUVs). A linear growth of the films was revealed by atomic force microscopy (AFM) experiments while the response of decorated vesicles to osmotic shocks lead to their buckling due to the rigidification of the lipid membrane. Finally, the mechanical properties of the constructs were characterized using AFM indentation, revealing a Young's modulus of few hundred kPa, similarly to what is observed for real plant cell walls

La RMN en phase solide est une méthode non négligeable lors de l'étude d'échantillons biologiques. Nous avons ainsi pu étudier le peptidoglycane et les acides téichoïques, composants essentiels de la paroi cellulaire bactérienne. Nous nous sommes tout particulièrement intéressés à leur organisation, à leur flexibilité et à leur interaction avec les cations. Nous avons également étudié les interactions entre les acides téichoïques et une protéine responsable de la viru-lence des pneumocoques. Cet exemple illustre parfaitement le manque de sensi-bilité des expériences de RMN ainsi que les limites des techniques actuelles de recouplage. Nous avons alors mis en évidence un phénomène permettant d'accélérer l'acquisition des spectres. Nous avons aussi travaillé à l'amélioration des séquences de recouplage PAR et PAIN-CP. Finalement, nous avons compa-ré des méthodes d'édition spectrale appliquées au bois, très étudié dès les débuts de la RMN en phase solide
Solid-state NMR is a well-suited method for the study of biological samples. Thanks to this technique, we could study the peptidoglycan and the teichoic acids, essential components of the bacterial cell wall. We were especially inte-rested in their organization, their flexibility and their interactions with cations. We also studied the interactions between the teichoic acids and a protein involved in the pneumococcal virulence. This example illustrates perfectly the lack of sensitivity of the NMR experiments and the limits of the existing recoupling sequences. We highlighted a phenomenon allowing the faster acquisition of NMR spectra. We also worked on the improvement of the PAR and PAIN-CP recoupling sequences. Finally, we compared spectral editing methods applied to wood samples, very well studied since the beginning of solid-state NMR

La RMN en phase solide est une méthode non négligeable lors de l'étude d'échantillons biologiques. Nous avons ainsi pu étudier le peptidoglycane et les acides téichoïques, composants essentiels de la paroi cellulaire bactérienne. Nous nous sommes tout particulièrement intéressés à leur organisation, à leur flexibilité et à leur interaction avec les cations. Nous avons également étudié les interactions entre les acides téichoïques et une protéine responsable de la viru-lence des pneumocoques. Cet exemple illustre parfaitement le manque de sensi-bilité des expériences de RMN ainsi que les limites des techniques actuelles de recouplage. Nous avons alors mis en évidence un phénomène permettant d'accélérer l'acquisition des spectres. Nous avons aussi travaillé à l'amélioration des séquences de recouplage PAR et PAIN-CP. Finalement, nous avons compa-ré des méthodes d'édition spectrale appliquées au bois, très étudié dès les débuts de la RMN en phase solide.

Les pectine méthylesterases et les invertases sont des enzymes clefs du métabolisme des glucides chez les plantes dont l'activité est modulée par des inhibiteurs appartenant à la même famille (PF04043) Dans ce travail, deux protéines de tomate appartenant à cette famille ont été identifiées et caractérisées Par RT-PCR quantitative, il a été montré que SolyPMEl est principalement exprimé dans le fruit rouge. Après expression en système hétérologue, purification et caractérisation, il s'agit du «PME binding protein» sans aucune activité mhibitnce. La purification de la protéine naturelle, par immuno-affinité, montre la formation d'un complexe avec la PME de tomate confirmant nos résultats précédents. SolyCIF a été exprimé dans Pichia postons et caractérisée d'un point de vue biochimique. SolyCIF est un inhibiteur d'invertase localise dans la paroi cellulaire et qui interagit in vitro avec l'invertase vacuolaire de tomate (TIV-1)
Pectin methylesterase and invertase are key enzymes in plant carbohydrate metabolism. Inhibitors of both enzymes constitute a structural family (INH/PMEI); nevertheless the respective target enzymes are structurally unrelated. In this thesis two new members of this family (SolyCIF & SolyPMEl) have been identified and characterised in tomato. SolyPMEl was found to be mainly expressed in red fruit. All attempts to produce active recombinant SolyPMEl protein for biochemical characterization appear to be unsuccessful. The isolation of both natural SolyPMEl and PME1 by immuno-afBnity, indicate that SolyPMEIs is in vivo engaged in the formation of a complex with endogenous PMEs. SolyCIF was expressed in two heterologous systems and functionally characterized. SolyCIF is a cell-wall proteinaceous invertase inhibitor which interacts in vitro with a vacuolar enzyme, TIV1. TIV1 is a monomer composed of several fragments that have to be tightly associated for enzymatic activity to occur

La paroi cellulaire est un compartiment extracellulaire propre au règne végétal. Majoritairement composée de polysaccharides, elle a une influence majeure sur la qualité nutritionnelle et les propriétés technologiques du grain de céréale. Sa composition et la structure chimique de ses constituants ainsi que leur arrangement au sein de la paroi évoluent tout au long du développement du grain ou en réponse aux facteurs biotiques ou abiotiques. Ces processus biologiques sont contrôlés en grande partie par des protéines pariétales. Une analyse quantitative du protéome pariétal de l’albumen et des enveloppes externes du grain de blé à deux stades précoces du développement a été réalisée dans l’objectif d’identifier ces acteurs protéiques. Un total de 693 protéines pariétales a été identifié, parmi lesquelles de nombreuses protéines potentiellement impliquées dans les modifications des polymères pariétaux. Des variations d’abondance des protéines de la paroi ont été mises en évidence soulignant ainsi les différences de métabolisme pariétal en fonction des tissus et du stade de dévelopemment du grain. Parmi les enzymes de remodelage des polysaccharides, les xyloglucanes endotransglycosylases/hydrolases (XTHs) jouent un rôle important dans la dynamique pariétale. Différentes approches in vitro et in vivo ont été mises en oeuvre pour caractériser une XTH abondante dans le grain de la plante Brachypodium distachyon dans l’objectif de préciser le rôle énigmatique des XTHs dans les parois des céréales particulièrement pauvres en xyloglucanes
The cell wall is an extracellular compartment specific to the plant kingdom. Mainly composed of polysaccharides, it has a major impact on the nutritional quality and the technological properties of cereal grain. Its composition and the chemical structure of its constituents as well as their arrangement within the wall evolve throughout the development of the grain or in response to biotic or abiotic factors. These biological processes are largely controled by cell wall proteins. A quantitative analysis of the cell wall proteome of wheat grain endosperm and outer layers at two early stages of development was carried out in order to identify these protein actors. A total of 693 cell wall proteins has been identified, including many proteins potentially involved in the remodeling of the cell wall polymers. Variations in the cell wall protein abundance were revealed, thus highlighting the differences in cell wall metabolism depending on tissues and stages of grain development. Amongst the polysaccharide remodeling enzymes, xyloglucan endotransglycosylases/hydrolases (XTHs) play an important role in cell wall dynamics. Different in vitro and in vivo approaches have been carried out to characterize an abundant XTH in the grain of the model plant Brachypodium distachyon in order to decipher the enigmatic role of XTHs in the cell walls of cereal, which contain low amount of xyloglucans

Le rhamnogalacturonane II est un polysaccharide hautement complexe, présent au sein de la paroi primaire des végétaux sous forme dimérisée via une liaison ester de borate. Cette dimérisation joue un rôle capital dans la mise en place de la paroi primaire et, par voie de conséquence, dans le développement de la plante. De plus, malgré sa haute complexité, la structure de ce composé pectique est conservée chez toutes les espèces terrestres suggérant sa forte implication dans d’importantes fonctions physiologiques. Dans le cadre de nos travaux, l’étude de plantes altérées dans la biosynthèse de monosaccharides constitutifs du RGII (L-Gal et Kdo) a permis d’apporter de nouvelles informations quant aux fonctions de ce polysaccharide. De plus, une approche bioinformatique a été mise en place afin de sélectionner des glycosyltransférases putatives impliquées dans la biosynthèse du RGII
Rhamnogalacturonan II (RGII) is a very complex polysaccharide which is present in plant primary cell walls, predominantly as a dimer cross-linked by a borate-diol ester. This dimerisation has been demonstrated to play a fundamental role in the cell wall formation and consequently, in plant growth. Furthermore, in spite of its complexity, the structure of this pectic component is highly conserved in land plants, which presumes a crucial implication of the RGII in key physiological functions. The objectives of the PhD thesis were 1-the study of plants affected in the biosynthesis of constitutive monosaccharides (L-Gal, Kdo) which allowed to get new insight into the function of this polysaccharide, 2- initiate a bioinformatic approach in order to select putative glycosyltransferases involved in RGII biosynthesis

Les pucerons sont des insectes phloémophages qui insèrent leur pièce buccale (stylets) au sein des parois afin d'atteindre les tubes criblés et de se nourrir de sève élaborée. Durant la progression des stylets dans l'apoplasme, un sondage est effectué par de brèves piqûres dans la plupart des cellules rencontrées. Les réponses de la plante aux dommages engendrés par une infestation aphidienne apparaissent qualitativement et quantitativement différentes des réponses à d'autres stress biotiques. Le puceron accepte plus ou moins la plante selon le niveau de résistance mis en place et selon sa capacité à se nourrir sur une gamme de plante-hôtes plus ou moins large. L'étude de leur comportement trophique via la technique de l'électropénétrographie montre qu'un puceron polyphage (Myzus persicae) semble plus adapté à Arabidopsis thaliana (famille des Brassicaceae) qu'un oligophage spécialiste de cette famille (Brevicoryne brassicae), ce dernier étant capable de discriminer des variations entre écotypes naturels. Ces variations concernent notamment la teneur en métabolites secondaires pouvant être répulsifs voire toxiques, mais aussi la structure de la paroi végétale. Parmi les gènes associés à ces modifications structurales et aux réponses de défense de la plante à un stress aphidien, quelques pectines méthylestérases (PME, E. C. 3. 1. 1. 11) sont induites durant les interactions plante-puceron. Les PME appartiennent à une famille multigénique (66 isoformes chez Arabidopsis thaliana) et contrôlent le degré de méthylestérification (DM) du principal domaine pectique : l'homogalacturonane (HG), un homopolymère constitués d'un enchaînement linéaire d'acides galacturoniques liés en α-(1-4). Le contrôle du DM des HG détermine les propriétés rhéologiques de la paroi (élasticité) et régule l'accessibilité d'enzymes dégradant les HG (polygalacturonases PG, pectate lyases) pouvant changer la porosité pariétale et produire des oligogalacturonides, éliciteurs endogènes de défense. L'activité des PME est donc susceptible d'influencer à la fois les réponses de défense de la plante et le comportement trophique du puceron. En utilisant une approche multidisciplinaire, nous avons démontré qu'une infestation par le puceron du pêcher (M. Persicae) modifie différemment selon l'écotype sauvage d'A. Thaliana (WS ou Col) la structure et la composition en sucres de la paroi, l'activité d'enzymes modifiant les HG (PME, PG) mais aussi l'expression de certains gènes de défense. Le rôle de deux pectines méthylestérases (PME17 et PME3) et d'un inhibiteur de PME (PMEI4) dans l'interaction A. Thaliana / M. Persicae a été mis en évidence en utilisant cette diversité d'approches. Des lignées mutantes ou surexpresseur présentent des effets totalement opposés sur le comportement trophique du puceron (électropénétrographie pendant 8 h) mais n'affectent pas sa physiologie (paramètres démographiques pendant 3 semaines). Ces effets sont corrélés à d'importantes variations en terme de structure pariétale et d'expression de gènes de défense, démontrant un effet pléïotropique propre à chacune des PME, mais aussi du PMEI4. Ces travaux soulignent les rôles potentiels de la paroi végétale et des PMEs dans la résistance contre les pucerons et apportent un nouvel éclairage sur la compréhension des mécanismes de défense de la plante
Aphids are phloem-feeding insects that generally insert their mouthpart (stylets) through the plant cell wall layers to reach the sieve elements and uptake phloem sap. During stylets progression in the apoplasm, most cells are briefly punctured intracellularly for probing. Plant defense responses to an aphid infestation appear to be quantitatively and qualitatively different from responses to other biotic stresses. Plant acceptance by an aphid depends on the level of plant resistance established and on its ability to feed on a more or less restricted range of plants. The study of their feeding behavior, monitored using the electropenetrography technique, showed that a polyphagous aphid (Myzus persicae) might be more adapted to Arabidopsis thaliana (Brassicaceae family) than an oligophagous aphid specialist of this family (Brevicoryne brassicae), this latter being able to discriminate variations between natural ecotypes. These variations concern in particular the content of secondary metabolites that could be toxic or repellent, but also the structure of the plant cell wall. Among the genes associated with cell wall modifications, some encoding pectin methylesterases (PMEs, EC 3. 1. 1. 11) are induced during plant-aphid interactions. PMEs belong to a large multigenic family (66 isoforms in A. Thaliana) and control the degree of methylesterification (DM) of the main pectic domain: the homogalacturonan (HG), an unbranched polymer of α-(1-4) linked D-galacturonic acid residues. The control of the DM of HGs determines the rheological properties of the cell wall (elasticity) and controls the accessibility of HG-degrading enzymes (polygalacturonases PGs and pectate lyases) able to change cell wall porosity and produce oligogalacturonides, endogenous defense inducers. PME activity is therefore likely to influence both the plant defense responses and the aphid probing behavior. Using a multidisciplinary approach, we demonstrated that an aphid infestation (M. Persicae) differently modifies cell wall structure and sugars composition of A. Thaliana Col and WS ecotypes, activities of HG-modifying enzymes (PMEs and PGs), as well as the expression of some defense genes. The role of two pectin methylesterases (PME17 and PME3) and an inhibitor of PME (PMEI4) in A. Thaliana - Myzus persicae interactions has been demonstrated using this wide range of approaches. Mutant and overexpression lines inversely affect the aphid trophic behavior (electropenetrography during 8 h) but don't affect its physiology (demographic parameters during 21 days). These effects are correlated with significant changes in term of cell wall structure and defense gene expression, underlining a pleiotropic effect specific to each PME and also of PMEI4. This work highlights the potential roles of plant cell wall and PMEs in the plant resistance against aphids and sheds new light on understanding the mechanisms of plant defense

Etude de la composition osidique d'alginate des genres pelvetia, fucus, arcophyllum, sargassum et laminaria. Preparation et caracterisation des alginates-lyases a partir de divers mollusques marins et d'une bacterie marine. Etude comparee de la regeneration de la paroi du protoplaste et de la mise en place normale de la paroi du zygote de fucus distichus par marquage avec des anticorps monoclonaux

Organite essentiel chez la levure Saccharomyces cerevisiae, la paroi assure à la fois un maintien de la forme cellulaire et une protection vis-à-vis des agressions extérieures auxquelles la cellule est continuellement soumise. La synthèse et la régulation de cette structure dynamique, constituée d’un réseau de sucres et de protéines, repose essentiellement sur une voie de signalisation basée sur une cascade de MAP kinases : la voie PKC1. Au sein de cette voie, la protéine Knr4 semble jouer un rôle important en influant directement sur l’activité de la MAP kinase Slt2p et en coordonnant la synthèse pariétale avec le cycle cellulaire. Cette protéine, codée par le gène KNR4/SMI1 initialement isolé par complémentation d’un mutant résistant à la toxine killer K9, reste pourtant encore très intrigante et sa fonction précise dans l’assemblage et la régulation de la structure pariétale a été le but avoué de mon travail de thèse. Au cours de ces trois années, différentes pistes de travail ont été considérées. Tout d’abord, nous avons étudié en profondeur la structure de Knr4p, laquelle s’est révélée appartenir à une classe protéique toute particulière : les protéines à larges domaines déstructurés. Par des approches bioinformatiques, biochimiques et biophysiques, nous avons ainsi pu analyser de façon très précise la structuration de cette protéine et aboutir finalement à la cristallisation d’un domaine globulaire et structuré. En parallèle, une analyse fonctionnelle des différents domaines de la protéine a montré que la partie terminale de Knr4p pouvait être éliminée sans perturber sa fonction, résultat évalué par récupération des phénotypes sauvage d’un mutant nul pour KNR4. En revanche, l’extrémité Nterminale, pourtant non essentielle pour certains phénotypes de croissance ou de sensibilité à des drogues antifongiques, devient essentielle en absence d’une voie PKC1 fonctionnelle. D’importants travaux complémentaires biochimiques, génétiques et transcriptomique ont alors été entrepris pour tenter de comprendre le rôle de l’extrémité N-terminale de Knr4p dans le contrôle de la croissance cellulaire en absence d’une voie PKC1 fonctionnelle. Enfin, l’influence de Knr4p sur l’activité de phosphorylation de Slt2p a été approfondie par des approches biochimiques in vitro qui nous ont permis de classer cette protéine comme un régulateurfin de la MAP kinase au sein de la voie PKC1
The cell wall of the yeast Saccharomyces cerevisiae is an essential organelle and provides both a preservation of the shape and a protection against environnemental stress to which the cell is permanently subjected. Synthesis and regulation of this dynamic structure, consisting of a network of sugars and proteins, are mainly based on a signaling cascade of MAP kinases: the PKC1 pathway. The Knr4 protein appears to play an important role in this pathway. Indeed, it seems to have a direct effect on the activity of the MAP kinase Slt2p and to coordinate cell wall synthesis with cell cycle. Nevertheless, this protein, encoded by the KNR4/SMI1 gene, initially isolated by complementation of a mutant resistant to the toxin killer K9, is still very intriguing and its function in the assembly and the regulation of the cell wall structure has been the main goal of my thesis. During these three years, various lines of inquiry have been considered. First, we have studied the structure of Knr4p, which has been proved to belong to a specific class of proteins: the intrinsically disordered proteins. By bioinformatic, biochemical and biophysical approaches, we deeply analyzed the structure of this protein and finally succeeded in the crystallization of a globular and structured domain. In the same time, a functional analysis of different fragments of the protein showed that the Cterminal extremity of Knr4p could be eliminated without disrupting its function. This result was evaluated by recovering wild phenotypes of a mutant deleted for KNR4. In contrast, the N-terminal extremity, although not essential for different growth phenotypes or for sensitivity to antifungal drugs, becomes essential in the absence of a functional PKC1 pathway. Significant biochemical, genetic and transcriptomic experiments were undertaken to try to understand the role of the N-terminal part of Knr4p in the cell growth control in absence of a functional PKC1 pathway. Finally, influence of Knr4p on the phosphorylation activity of Slt2p was studied by in vitro biochemical approaches that have enabled us to classify this protein as a tight regulator of this MAP kinase within the PKC1 pathway

En définitive, ces recherches ont mis en évidence que ce qui est important quand on incorpore des fibres dans les systèmes alimentaires, ce n'est pas seulement, comme on le croit généralement la quantité, mais aussi le type de fibres. La modification du type de fibres obtenues à partir d'une source végétale déterminée peut résulter de modifications des liaisons et de la structure pectique au cours de la maturation des tissus et aussi de modifications de la matrice des fibres provoquées par certaines conditions de traitement.

Le cuir chevelu humain abrite de nombreux microorganismes tels que le levures et les bactéries qui forment des micro-environnements sur la surface de la peau. Actuellement nous savons que les levures malassezia sont associées à un certain nombre de maladies humaines différentes. La paroi cellulaire des champignons pathogènes représente le point initial d'interaction entre l'hôt et le pathogène. La composition de la paroi cellulaire et la structure sont fortement associées à l'adhésion et à la pénétration dans les tissus. Actuellement, la paroi cellulaire a été étudiée uniquement chez trois espèces de malassezia (sympodialis, furfur, pachidermatis). Une etude biochimique a démontré que la paroi de m. Sympodialis contient du mannane, mais il manque de ß-(1-3)-glucane. Certaines données indiquent que ß-(1-6)-glucane est un composant majeur de la paroi de M. Sympodialis. Dans le cas de M. Fufur et pachidermatis, les composants de la paroi cellulaire ont été étudiés avec des réactions antigéniques. Les cellules vivantes de Malassezia furfur et malassezia pachydermatis n'ont pas réagi avec un anticorps anti-a-1-2-mannoside. Dans ce projet, nous nous concentrons sur l'espèce malassezia restricta la levure majeurs trouvés sur la peau humaine. Nous souhaitons apporter une meilleure compréhension de la paroi avec une analyse biochimique complète (gc, rmn, spectroscopie de masse, microscopie electronique à transmission et balayage)
Human scalp harbors complex communities composed of yeast and bacteria that form specific niches and/or microenvironments on the skin surface. Now we know that malassezia yeasts are associated with a number of different human diseases. He cell wall of pathogenic fungi represents the initial point of interaction between the host and the pathogen. Cell wall composition and structure are strongly associated with the adherence to and penetration into tissues. The dynamic nature of the fungal cell wall allows the yeast to overcome host defences. Urrently the cell wall has been studied only in three species of malassezia (sympodialis, furfur, pachidermatis). A biochemical study demonstrated that m. Sympodialis cell wall contains a simple mannan, but it lacks ß-(1-3)-glucan. Some data indicate that -(1-6)-glucan is a major component of the m. Sympodialis cell wall. In the case m. Fufur and pachidermatis, the cell wall components have been investigated with antigenic reactions. Live cells of malassezia fureur and malassezia pachydermatis did not react with an anti-a-1-2- mannoside antibody. However, they have showed a strong hydrophobicity and reactivity with an anti-b-1- 3-glucan antibody. . N this project we focus on the specie malassezia restricta the major yeast found on the human skin. We would bring a better understanding on malassezia cell wall with a complete biochemical/optical analysis (gc, rmn, mass spectroscopy, scanning and transmission electronic microscopy)

Les glycoproteines riches en hydroxyproline (hrgps), encore appelees extensines, sont des molecules structurales presentes dans la paroi primaire des vegetaux superieurs, qui s'accumulent fortement en reponse a de nombreux facteurs environnementaux et participent a la defense des plantes contre les microorganismes. Elles sont caracterisees par la repetition du pentapeptide ser-(hyp)#4 glycosyle par le galactose (ser-gal) et des oligoarabinosides (hyp-ara#n). Leur richesse en hydroxyproline, acide amine rare dans les proteines, les rapproche du collagene. Pour cette raison, les hrgps ont un interet certain en biotechnologies, dans les domaines reposant traditionnellement sur l'utilisation du collagene. Les resultats exposes dans le memoire concernent des aspects appliques et fondamentaux de ces glycoproteines vegetales. C'est ainsi que nous avons developpe une methode de preparation de fractions enrichies en hrgps, transposable industriellement. En l'etat actuel, on peut envisager de passer de l'etape pilote au stade industriel. Les hrgps presentent un degre de glycosylation variant selon le vegetal, le type cellulaire considere et l'environnement. Les arabinosides a hydroxyproline hyp-(ara)#n sont des marqueurs specifiques des hrgps. Une methode rapide et tres sensible de preparation d'oligoarabinosides standards a ete mise au point : ces composes obtenus par hydrolyse alcaline sont separes, purifies et quantifies par hpaec-pad. Cette methode a permis d'utiliser ces composes comme marqueurs chimiotaxonomiques, de mettre en evidence et de caracteriser par rmn du proton et du carbone un nouvel arabinoside de degre de polymerisation non encore decrit jusqu'ici : hyp-(ara)#5. Parallelement a la mise au point de ces techniques, des bioessais ont ete realises afin de reveler des effets biologiques des hrgps et des hyp-ara sur la croissance de microorganismes : bacterie symbiotique et champignon endomycorhizien. Les hrgps solubles inhibent de facon reversible la croissance de ces microorganismes. Ces resultats suggerent que les hrgps, proteines de defense, interviennent par leur nature polycationique dans l'interaction. La maitrise d'une methodologie industrielle et notre capacite a caracteriser par des techniques fines les hrgps, sont autant d'apports permettant desormais l'etude de ces glycoproteines au plan fondamental et leur exploitation au plan applique.

Les arbres atteignent des hauteurs et des durées de vie considérables grâce aux propriétés remarquables de leur bois. En effet, le bois remplit trois fonctions principales : (i) la conduction de la sève brute de la racine au houppier, (ii) le soutien mécanique de la masse toujours en augmentation de l'arbre en croissance et (iii) le stockage de réserves temporaires, capitales pour la pérennité de l'arbre. Chez les angiospermes, les vaisseaux, les fibres et les rayons parenchymateux sont, respectivement, affiliés à ces fonctions. Chacune de ces cellules possède son propre schéma de développement. Par ailleurs, la composition et la structure des parois de ces cellules varient considérablement en fonction des stades de développement et des conditions environnementales. Cette complexité représente donc un frein à l’étude des mécanismes moléculaires de la formation du bois. Cette difficulté peut être contournée par le développement d’approches à l’échelle cellulaire.La thèse présentée ici vise à une caractérisation du développement des fibres, plus particulièrement de leurs parois secondaires, par le déploiement d’outils de caractérisation à l’échelle cellulaire et d’une analyse intégrative à cette échelle. Le développement d’une méthode de caractérisation des parois à l’échelle cellulaire, l’imagerie hyperspectrale en ATR-FTIR, a permis une analyse fine des différences entre types cellulaires au sein d’un arbre et entre types de bois pour un même type cellulaire. L’étude de données transcriptomiques obtenues par RNA-Seq de fibres et rayons micro disséqués a, elle, permis d’identifier des différences transcriptionnelles entre ces deux types cellulaires. La combinaison de ces deux résultats a permis d’identifier des acteurs semblant majeurs dans le développement des fibres de bois. Ce travail de thèse ouvre donc des perspectives de recherche permettant de mieux comprendre les mécanismes moléculaires associés à la formation des fibres de bois
Trees are able to grow high et survive many years thanks to their wood properties. Wood delivers three major functions in trees : (i) water conduction, (ii) mechanical support et (iii) nutrient storage. In Angiosperm trees, vessels, fibers et parenchyma rays are respectively assigned to these functions, each of them following their own development scheme. Cell wall composition et structure varies greatly depending on cell type, developmental stage et environmental conditions. This complexity therefore represents a hindrance to study the molecular mechanisms of wood formation. However, this can be circumvented by the development of cell-specific approaches.This work aims at characterizing fiber development, focusing on their secondary cell wall, developing cell-specific methods et integrative analysis at the cell level. Development of ATR-FTIR hyperspectral imaging enabled to finely characterize differences in cell wall composition between cell types in a tree et within cell types in different types of wood. Transcriptomics data obtained by RNA-Seq of microdissected fibers et rays gave rise to major differences in the transcriptome of these two cell types. Combining both kind of result led to the identification of key players in fibers development. Hence, this work opens up new research hypothesis, which could lead to a better understanding of the molecular mechanisms underlying wood fiber development, including from a dynamic perspective

La floculation des levures Kluyveromyces lactis haploïdes: floculante k. 1 5c, non floculante k. 1 5a, faiblement floculante k. 1 6d et très faiblement floculante k. 1 6a fait intervenir des lectines et des phosphopeptidomannannes de la paroi cellulaire. Les phosphopeptidomannannes ont été obtenus par traitement des cellules fraiches par autoclavage dans un tampon citrate pH 7. L’estimation des masses moléculaires des extraits phosphopeptidomannannes obtenus ainsi que leur composition chimique globale ne révèlent aucune corrélation directe avec le degré de floculation des levures étudiées. Cependant, des essais biochimiques utilisant des lectines isolées et des cellules fraiches défloculées indiquent une différence dans ce phénomène de reconnaissance. L’acétolyse des phosphopeptidomannannes cellulaires des quatre levures libéré cinq fractions correspondant a des mono, di, tri, penta et hexasaccharides. L’analyse structurale par 1h rmn de ces oligosaccharides, révèle la présence de mannose, de deux types de mannobioses, deux types de mannotrioses et deux types de mannotétraoses portant des glucosamines. Le phénomène de la floculation chez les levures k. Lactis haploïdes implique les phosphopeptidomannannes en tant que ligands de lectines. Les chaines latérales de ces polymères pariétaux doivent porter des structures alpha-(1,3) pour être reconnus par la lectine

L’objet de cette étude a été de vérifier l'incidence du gène ras1 sur les structures pariétales et membranaires de la levure Schizosaccharomyces pombe. L’analyse chimique des parois cellulaires a révélé des différences notamment dans les teneurs en protéines et en phosphore qui sont fortement augmentées chez les levures mutantes ras1- et ras1vaI17. Le fractionnement des glycoprotéines pariétales, isolées par traitement au SDS, montre que les deux mutants ras1 renferment plus de polymères charges représentes particulièrement par des phosphoprotéines. Ces polymères semblent fortement liés à la paroi, ils ne sont en effet libérés qu'après traitement par le SDS à chaud. La protéine correspondant à 31,5 kDa a une teneur significativement plus importante dans les parois des cellules mutantes ; elle possède une activité beta (1, 3) glucannase dont le rôle dans les modifications morphologiques des cellules ras1- ne doit pas être écarté. La mutation du gène ras1 induit aussi une activation du métabolisme des phospholipides membranaires. Les deux mutants ras1 présentent en effet une nette augmentation dans les teneurs des phosphatidylinositols (PI) et des phosphotidylserines (PS). Cette augmentation dans les taux des phospholipides anioniques est due probablement à l'association membranaire et l'activité biologique des protéines ras1. L’étude des stérols membranaires a mis en évidence du 24-méthylène dihydrolanosterol (eburicol). La présence de ce stérol en c31 plaide en faveur d'une voie de synthèse de l'ergostérol similaire à celle existant plutôt chez les champignons filamenteux que chez les levures

La paroi donne une enveloppe rigide à la cellule végétale. Elle renferme des polysaccharides (cellulose, hémicelluloses, pectines), des lignines dans certains types cellulaires, des protéines structurales et enzymatiques. La paroi est une structure dynamique: les parois sont modifiées au cours du développement et en réponse aux contraintes environnementales. Les protéines sont des acteurs de cette dynamique en participant à l'assemblage et au remodelage des polysaccharides, à la signalisation cellulaire. La paroi permet notamment aux cellules de résister à la pression de turgescence, force motrice de l'élongation cellulaire: les étapes de relaxation, d'intégration de nouveaux constituants et de consolidation de la paroi doivent être parfaitement coordonnées pour maintenir les structures pariétales. Un système de surveillance et des senseurs du statut de la paroi pourraient assurer cette coordination. Nous sommes intéressés par un récepteur lectine-kinase (LecRK-I.9) d'Arabidopsis thaliana dont le domaine extracellulaire est de type lectine de Légumineuses. Il est un acteur potentiel d'un système de surveillance du statut de la paroi. Les questions posées dans ce travail sont: (i) dans quels processus de développement LecRK-I.9 peut-il être impliqué ? (ii) quelles sont les régulations que ciblent LecRK-I.9 ? (iii) quelle est la nature des ligands de LecRK-I.9 ? L'expression de LecRK-I.9 est prépondérante dans les tissus racinaires et nous avons pu montrer que LecRK-I.9 est impliqué dans les processus d'initiation et d'émergence des racines latérales et adventives pour lesquels des remodelages pariétaux sont nécessaires. Il apparaît comme régulateur négatif de ces processus. En effet, chez les plantes lecrk-I.9, l'expression de gènes codant des peptides pariétaux CEP, régulateurs précoces de l'initiation des racines latérales, est dérégulée, de même pour de nombreuses enzymes travaillant de façon concertée à un relâchement des structures pariétales. Les plantes lecrk-I.9 présentent ainsi des parois modifiées dans leur composition en polysaccharides. Un dommage causé à la paroi a été obtenu par un traitement inhibiteur de la biosynthèse de cellulose. En particulier, des dépôts de lignine ectopique se mettent en place dans les apex racinaires sous le contrôle de l'acide jasmonique (JA) et des espèces réactives de l'oxygène (ROS). Nous avons pu montrer que LecRK-I.9 contrôle les teneurs en JA dans ce processus. De plus, via la régulation JA, LecRK-I.9 contrôle l'expression de gènes codant des protéines et des peptides pariétaux, mais également des protéines de détoxification des ROS. L'ensemble des résultats suggèrent que LecRK-I.9 est un régulateur de la dynamique pariétale avec pour cibles, les teneurs en JA, l'homéostasie des ROS, les enzymes de remodelage des polysaccharides. Le travail s'oriente maintenant vers les conséquences de modifications de la composition pariétale sur la nutrition minérale en fer. En effet, les plantes lecrk-I.9 montrent une forte accumulation de fer pariétal. Enfin, LecRK-I.9 est associé aux brins d'Hecht, en particulier dans les points d'ancrage pariétaux. L'interaction entre domaines lectine et composés pariétaux à l'aide de puces à oligosaccharides pourrait déterminer la participation de LecRK-I.9 à une continuité structurale entre paroi et plasmalemme
Cell walls are complex structures of cellulose, hemicelluloses, pectins and proteins secreted by the cell, so setting up a rigid and continuous structure within the tissue of plants. Cell walls are dynamic structures that are continuously modified in the course of development and in response to environmental cues: cell wall proteins play a primarily role by assembling and remodelling polysaccharides, and by participating to cell signalling. In particular, cell walls are designed to handle turgor pressure, the driving force of cell elongation: the loosening of polysaccharide networks, the addition of new components and stiffening should be tightly coordinated to maintain the cell wall structures. A sensory complex to monitor the cell wall status should provide this coordination in an effective manner. We are interested in an Arabidopsis thaliana lectin receptor kinase (LecRK-I.9) with a Legume lectin-type extracellular domain. It is hypothesized that LecRK-I.9 is part of a cell wall surveillance system. The questions asked in this work are: (i) in which developmental processes is LecRK-I.9 involved? (ii) what are the regulations targeted by LecRK-I.9? (iii) what are the ligands for LecRK-I.9? LecRK-I.9 expression was primarily found in root tissues and, LecRK-I.9 was shown to be involved in the processes of adventitious and lateral root initiation and emergence. Both processes require large cell wall remodelling. LecRK-I.9 was defined as a negative regulator of the processes. Indeed, the cell wall peptides CEP are early regulators of lateral root initiation: genes encoding CEP were up-regulated in lecrk-I.9 seedlings. In the same way, genes encoding cell wall remodelling enzymes working together for cell wall loosening are also up-regulated. Finally, lecrk-I.9 seedlings showed modified cell walls in their polysaccharide content. Cellulose biosynthesis inhibition was employed to impair the cell wall structures. In particular, jasmonic acid (JA)- and reactive oxygen species (ROS)- mediated signalling may regulate ectopic lignin deposits in root apices induced by cell wall damage. LecRK-I.9 was shown to control the JA levels during the process of ectopic lignin deposition. Moreover, through JA tuning, LecRK-I.9 regulates the expression of genes encoding cell wall proteins and peptides, but also proteins for detoxifying ROS. Our results suggest that LecRK-I.9 regulates cell wall dynamics in roots by targeting JA levels, ROS homeostasis and remodelling enzymes for polysaccharides. Future prospects include relationships between cell wall composition and mineral nutrition for iron. Indeed, lecrk-I.9 seedlings showed an enhanced accumulation of iron in cell walls. Finally, LecRK-I.9 was found to be associated to Hechtian strands particularly in the cell wall anchor points. Interactions between lectin domains and cell wall polysaccharides are currently searched using glycoarrays for cell wall polysaccharides: LecRK-I.9 could be the linker to establish a physical connection between cell wall and plasma membrane

Parmi les différentes activités enzymatiques qui participent à la modification des parois végétales se trouve un groupe de glycosylhydrolases particulier, les alpha-L-arabinofuranosidases (arabinofuranosidase). L'activité alpha-L-arabinofuranosidase est définie comme l'hydrolyse des alpha-L-arabinofuranoses terminaux nonréducteurs. Pourtant, malgré la simplicité de cette définition, le(s) substrat(s) in planta des arabinofuranosidases et, par conséquent, leur rôle dans la physiologie végétale, demeuraient à ce jour inconnus. Durant ce travail de thèse nous avons caractérisé deux gènes d'Arabidopsis, At3g10740 (ARAF1) et At5g26120 (ARAF2), annotés "alpha-L-arabinofuranosidase" dans les bases de données, et appartenant à la famille 51 de glycosylhydrolases. ARAF1 et ARAF2 sont exprimés dans des types cellulaires bien définis, en particulier dans les tissus vasculaires tels que le phloème, le cambium et le parenchyme du métaxylème. L'analyse des parois de mutants knockout et de transformants du gène ARAF1 montre que ce sont les arabinanes pectiques, et non les arabinanes présents dans les arabinogalactaneprotéines et les arabinoxylanes, qui sont un substrat probable de l'enzyme ARAF1. Finalement, l'observation des phénotypes des plantes mutantes et transformantes pour les gènes ARAF1 et ARAF2 nous amènent à penser que, au delà de la modification des parois, les arabinofuranosidases pourraient jouer un rôle dans la régulation du métabolisme du carbone, la synthèse des UDPsucres et, plus généralement, la réponse des plantes à leur environnement
Alpha-L-arabinofuranosidases (arabinofuranosidases) are a group of glycosylhydrolases that participate in the remodelling of plant cell walls. Alpha-L-arabinofuranosidase activity is defined as the hydrolysis of terminal, nonreducing alpha-L-arabinofuranoses. However, despite the simplicity of this definition, the in planta substrate(s) for arabinofuranosidases and, therefore, their role in plant physiology, have remained unknown to this day. During this PhD we undertook the charaterization of two family 51 Arabidopsis genes, annotated "alpha-L-abinofuranosidase", At3g10740 (ARAF1) and At5g26120 (ARAF2). ARAF1 and ARAF2 are expressed in particular cell types, including vascular tissues such as phloem, cambium and metaxylem parenchyma. Cell wall analysis from mutant and transformant plants showed that pectic arabinan, and not arabinogalactan proteins arabinan nor arabinoxylan, is an ARAF1 substrate. Finally, the phenotypes observed for ARAF1 and ARAF2 mutants and transformants suggest that arabinofuranosidases participate not only in cell wall remodelling, but also in carbon partition regulation, UDPsugar synthesis regulation and adaptation of plants to their environment

Afin de définir le rôle de la paroi et en particulier la chitine dans la résistance des levures à l'Amphotéricine E, plusieurs espèces et souches sont utilisées pour cette étude : Rhodotorula, Schizosaccharomyces, Candida et Kluyveromyces. Bien que ces levures ne soient pas des agents pathogènes (à l'exception de la souche Candida albicans), elles ont la caractéristique d'avoir des différences de résistance ainsi que des taux de chitine différents. Les sphéroplastes des souches étudiées ont montré une sensibilité élevée à l'AmE. En effet, les levures débarrassées de leur paroi sont 3 à 6 fois plus sensibles à l'AmE que les cellules intactes, et dans ces conditions les différences de sensibilité à l'AmE entre les souches sont moins prononcées. De plus, l'extraction et le dosage des stérols des levures ne montrent aucune relation directe entre la quantité de ces stérols et en particulier de l'ergostérol et la résistance de ces levures à l'AmE. Ceci montre que la membrane n'est pas la seule structure cellulaire impliquée dans le mécanisme d'action de l'AmE. Il existe donc un rôle de la paroi dans l'action de l'AmE sur les levures. Dans le but de perturber la structure pariétale et de cibler ainsi le composé intervenant dans la rés'istance des levures à l'antifongique, les levures ont été traitées par différentes enzymes. Or, après incubation des cellules avec les protéases, phosphatases et les glucanases ces dernières deviennent plus sensibles à cet antifongique. Par contre, le traitement des levures par la chitinase rend les levures plus résistantes à cet antifongique. L'analyse quantitative des constituants de la paroi montre qu'à l'exception de la chitine qui varie, les teneurs des autres constituants ne montrent aucune relation entre leurs variations quantitatives et la résistance (et sensibilité) des levures à l'AmE. Par contre, les parois des deux levures qui ont acquis une résistance à l'AmE sont toutes les deux plus riches en chitine que leurs cellules mères respectives, alors que l'augmentation de la résistance , intrinsèque des autres souches de levures s'accompagne d'une diminution du taux de chitine. Les activités chitine synthétases, CSI, CSII et CSIII montrent que les trois chitine synthétases sont présentes tant chez les mutants que chez les souches mères et que la souche Kb présente une activité enzymatique plus élevée que la souche Kbm. Ce qui rejette l 'hypothèse de l'augmentation des taux de chitine dans les parois des mutants en conséquence à une activation des chitine synthétases. Comme la chitinase peut aussi agir sur les taux de chitine pariétale, nous avons vérifié l'expression de cette enzyme chez les différentes souches. Cette enzyme est détectée à des taux très faibles chez les souches qui ont acquis une résistance à l'AmE par comparaison à l'activite des souches mères respectives. Ainsi l'augmentation du taux de chitine dans les parois cellulaires des mutants semble résulter d'une répression ou diminution d'activités de la chitinase et la chitine pariétale est un élément à retenir pour expliquer les mécanismes d'action de l 'AmE pour chaque type de levures.

La paroi primaire des cellules végétales est composée majoritairement de polysaccharides, notamment de microfibrilles de cellulose et d'hémicelluloses maintenues dans une matrice de pectines (Cosgrove, 2001). Parmi ces dernières, les homogalacturonanes (HG) qui sont les plus abondants peuvent être modifiés par des enzymes pariétales à l'origine de changements de structure de la paroi (Yadav et al. , 2009). Les gènes codant certaines de ces enzymes sont exprimés dans la graine d'Arabidopsis thaliana, suggérant un rôle de celles-ci dans le développement de la graine. L'étude de mutants d'insertion obtenus pour certains de ces gènes a mis en évidence un rôle de la pectine méthylestérase 58 (PME58) dans la structuration du mucilage. Le mucilage est une matrice riche en pectines produite par les cellules épidermiques du tégument de la graine et libérée lors de leur imbibition. Notre étude a montré que la PME58 est impliquée dans la déméthylestérification des HG présents dans le mucilage, dont la majorité provient probablement de la fragmentation des parois primaires des cellules épidermiques lors de l'extrusion du mucilage. L'étude des mutants pme58 par des approches analytiques et par immunodétection a montré que la PME58 est impliquée dans la régulation de la structuration et de la cohésion du mucilage, via la modulation des interactions entre les composants pectiques et cellulosiques

Le gène KDSA code pour l'acide 3-desoxy-D-manno-octulosonique 8-phosphate (Kdo-_P) synthase qui synthétise le précurseur phosphorylé du Kdo, un constituant indispensable et indissociable de la membrane externe des bactéries à Gram négatif. Chez les plantes, le rôle du Kdo reste méconnu, mais il entre dans la composition d'un polysaccharide pectique complexe : le rhamnogalacturonane II, indispensable à la structuration du réseau de pectines de la paroi primaire. L'étude de l'enzyme KDSA a été réalisée chez la tomate (Lycopersicon esculentum Mill. ) et chez Arabidopsis thaliana. Son expression est préférentiellement associée aux cellules en division et son rôle, potentiellement associé à la biosynthèse du RG-II, serait très important puisqu'aucune plante mutante, dépourvue d'activité Kdo-8-P synthase, n'a pu être isolé. Une étude préliminaire de la Kdo transférase, enzyme terminale de la voie de biosynthèse du Kdo a aussi été réalisée et les premiers résultats seront discutés
The KDSA gene codes for the 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid 8-phosphate (Kdo-8-P) synthase which synthesizes the phosphorylated precursor of Kdo, an essential and indissociable component of the outer membrane in Gram-negative bacteria. In plants, the role of Kdo is largely misunderstood ; however it is a constituent of a complex pectic polysaccharide : rhamnogalacturonan II, essential for the structuration of the pectin bnetwork in primary cell wall. The study of the KDSA enzyme has been performed in tomato (Lycopersicon esculentum Mill. ) and in Arabidopsis thaliana. The expression of KDSA was shown to be preferentially associated with dividing cells. Its function is thought to be of great importance since no null mutant plants, lacking the Kdo-8P synthase activity, could be isolated. A preliminary study of the Kdo transferase has been performed. This enzyme is the last one of the biosynthetic pathway of Kdo and the first results will be discussed

L'auxine est une hormone végétale impliquée dans le développement du gynécée. La réponse à l'auxine dépend majoritairement de deux familles protéiques : les ARF (Auxin Response Factors) et les Aux/IAA. Les ARF sont des facteurs de transcription qui régulent la transcription des gènes de réponse à l'auxine, tandis que les Aux/IAA inhibent l'activité transcriptionnelle des ARF par dimérisation. En présence d'auxine, les Aux/IAA sont dégradés et libèrent les ARF. Au cours de ma thèse, je me suis focalisée sur deux proches paralogues ETTIN/ARF3 et ARF4 impliqués dans le développement du gynécée chez Arabidopsis thaliana. Parmi les cibles directes d'ETT identifiées dans l'équipe, 2 catégories ont retenu notre attention : des gènes impliqués dans la voie de signalisation de l'auxine et des gènes codant des enzymes de remodelage de la paroi. Mon projet a consisté à essayer de comprendre l'implication de ces régulations transcriptionnelles dans le développement du gynécée. Dans une première partie, j'ai étudié la signalisation de l'auxine dans le développement du gynécée, puis l'implication d'ETT dans cette signalisation. Dans une deuxième partie, j'ai confirmé la répression par ETT, des cibles identifiées. Nous avons montré qu'ETT induit la déméthylation des pectines en inhibant les inhibiteurs de pectine méthylestérase. De plus, j'ai montré qu'ETT et ARF4 agiraient de façon redondante pour contrôler positivement la croissance du gynécée. Dans une troisième partie, j'ai abordé l'analyse des domaines fonctionnels du facteur de transcription CRABS CLAW, également impliqué dans le développement du gynécée. En conclusion, mes travaux de thèse apportent une nouvelle vision sur le rôle de la signalisation de l'auxine au cours du développement du gynécée et montrent l'importance du remodelage de la paroi dans la morphogénèse des organes.

Les changements des propriétés de texture du fruit au cours de la maturation et de la sénescence sont associés à la dégradation de la paroi. Toutefois, les évènements à l’origine de ces changements ne sont pas clairement identifiés et pourraient se réaliser dès le développement précoce du fruit. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés aux parois cellulaires du péricarpe externe depuis la mise en place des polysaccharides pariétaux lors du développement précoce jusqu’à leur dégradation au cours de la maturation du fruit. Une étude morphologique des cellules du péricarpe aux différents stades de développement du fruit a permis de préciser les différents phases de l’expansion cellulaire. L’analyse chimique des parois a montré un remaniement de leur composition tout au long du développement du fruit avec une synthèse importante de rhamnogalacturonanes de type I au début de la phase d’expansion cellulaire. L’analyse de la structure fine des xyloglucanes et des (galacto)glucomannanes a révélé un remodelage de ces polymères pendant la phase de maturation mais également durant la phase d’expansion cellulaire. L’immunocytochimie a apporté des éléments nouveaux sur la distribution des différents polysaccharides au sein de la paroi. Enfin, nous avons examiné l’influence des modalités de conservation sur la composition de la paroi de fruits issus de lignées présentant une texture contrastée au stade rouge. Nous avons montré que les conditions de conservation modulaient la dégradation des pectines et que les différences de composition des parois entre lignées s’atténuaient au cours de la période postrécolte
Fruit texture depends on histology and cell wall architecture, both under genetic and developmental controls. If ripening related cell wall modifications have been well documented with regard to softening, little is known about cell wall construction during early fruit development. Identification of key events and their kinetics with regard to tissue architecture and cell wall development can provide new insights on early phases of texture elaboration. Changes in the pericarp cellular structure during fruit development were first characterized. Cell expansion was shown to occur differently to the location within the pericarp. Analysis of cell wall composition and polysaccharide structure revealed that both are continuously modified during fruit development and not only during the ripening stage. During early stages, the relative high rhamnose content in cell walls indicates a high synthesis of rhamnogalacturonan I next to the one of homogalacturonans. Fine tuning of rhamnogalacturonan I side chains appears to occur from the cell expansion phase until prior the mature green stage. Cell wall polysaccharides remodelling also concerns xyloglucans and (galacto)glucomannans, the major hemicelluloses in tomato cell walls. In situ localization of cell wall polysaccharides in pericarp tissue brings new insights on cell wall construction and architecture. Then, the impact of post-harvest storage conditions on fruit texture from different genotypes was investigated in relation with cell wall changes. An effect of post-harvest conditions was found on pectins. Differences in cell wall composition between genotypes decreased on the course of storage

Il existe une grande variété de champignons pathogènes humains qui sont à l’origine de maladies bénignes à mortelles. La plupart du temps, ces infections sont associées à d’autres pathologies ou traitements médicaux comme l’asthmes, les leucémies, les transplantations d’organes, le SIDA ou les traitement immunosuppresseurs à base de corticostéroides. Malgré le nombre important de décès et le nombre grandissant d’occurrence des mycoses sévères à travers le monde, les infections fongiques sont encore négligées par les autorités sanitaires.Parmi ces pathogènes fongiques, le champignon filamenteux Aspergillus fumigatus est un des pathogènes principaux du système respiratoire. L’aspergillose, dont les taux de d’infection et de mortalité demeurent élevés, devient un enjeu de santé publique. Les spores d’A. fumigatus sont entourés d’une paroi, essentielle pour leur croissance et leur permettant de résister face au système immunitaire de l’hôte. Cette paroi est composée d’un réseau de polysaccharides recouvert d’un pigment appelé DHN-mélanine et d’une couche de protéines appelées hydrophobines. Ce projet a pour but d’établir l’architecture structurale de la paroi des spores d’A. fumigatus à l’échelle atomique en utilisant la RMN du solide (ssNMR) en rotation à l’angle magique (MAS).D’un autre côté, Cryptococcus neoformans est l’agent pathogène responsable de la cryptococcose ; une mycose affectant le système nerveux central. Cette maladie fongique est, encore de nos jours, une cause significative de mortalité à travers le monde puisqu’elle entraîne de graves symptômes tels que la méningo-encéphalite ; particulièrement fréquente chez les patients déjà infectés par le VIH. C. neoformans se présente sous la forme d’une cellule encapsulée de 5 à 7 μm de diamètre entourée d’une paroi et d’une capsule. Cette paroi, rigide, est liée à la membrane plasmique et composée de polymères d’α-glucan, de β-glucan, de chitine et de chitosan. De plus, la capsule de C. neoformans est majoritairement composée de carbohydrates tels que le glucuronoxylomannan (GXM) (jusqu’à 90 %) ou le glucuronoxylomannogalactan (GXMGal) mais aussi de mannoprotéines et de lipides. Le but de ce projet de thèse est d’identifier les différents composants de la paroi mais aussi de la capsule de C. neoformans par ssNMR et d’établir l’architecture de ces deux entités. Un des aspects de ce projet est aussi d’explorer les possibilités et les limitations des méthodes de détection proton en RMN couplée à un MAS élevé (100 kHz) comme outil d’analyse des parois fongiques.En résumé, puisque la RMN des solides est une méthode de spectroscopie non invasive, nous avons appliqué ce type d’analyses dans le cadre de l’étude de l’architecture moléculaire de systèmes complexes (parois fongiques, capsules, …) dans des conditions aussi proches que possible de l’état natif des cellules. Pendant ces trois années de thèse, nous avons mis en place une méthodologie robuste et rapide permettant d’étudier la composition complexe des structures externes présentes dans les cellules fongiques ainsi que leur architecture au sein des cellules entières. De plus, puisque dans le cadre des infections microbiennes la pathogénicité du microbe repose souvent sur les structures externes des cellules infectieuses, les résultats obtenus au court de cette thèse, apportant une meilleure compréhension de l’organisation cellulaire d’A. fumigatus et C. neoformans, pourraient ainsi être utilisés dans le cadre du développement et de la mise en place de nouvelles stratégies thérapeutiques afin de combattre plus efficacement ces infections fongiques
There is a broad range of fungal pathogen infecting humans and causing diseases that can be from mild to lethal. Severe fungal infections are due to opportunistic pathogens that infect immunosuppressed individuals and are most of the time associated with other diseases or medical conditions such as asthma, leukemia, organ transplants, AIDS or immunosuppressive corticosteroid therapies. Despite the number of deaths and the increase in severe mycosis, fungal infections remain neglected by public health authorities.Among fungal pathogens, the filamentous fungus Aspergillus fumigatus is one of the major pathogen of the respiratory system. Aspergillosis displaying both high incidence and mortality rates, is becoming a massive public health issue. The spores of Aspergillus fumigatus are surrounded by a cell wall, essential for their growth and allowing them to resist against host defense mechanisms. The cell wall is composed of a set of polysaccharides covered by the DHN-melanin pigment and a layer of proteins called hydrophobins. In this project, we aimed at investigated the structural architecture of Aspergillus fumigatus cell wall at atomic resolution using MAS ssNMR spectroscopy.In another hand, Cryptococcus neoformans is the etiological agent of cryptococcosis; which consists in mycosis affecting the central nervous system. This fungal disease remains a significant cause of mortality worldwide by leading to severe symptoms such as meningoencephalitis - especially for immunocompromised individuals suffering from AIDS. C. neoformans results in encapsulated particles with a size of 5-7μm with a two-layers external structure composed of a cell wall and a capsule. The cell wall, rigid, is bounded to the plasma membrane and composed of polymers of α-glucan, β-glucan, chitin and chitosan45. Then, the capsule of C. neoformans is mainly composed of carbohydrates such as glucuronoxylomannan (GXM) (up to 90%), glucuronoxylomannogalactan (GXMGal), mannoproteins and lipids. During this thesis project, we aimed at identifying the different components of C.neoformans cell wall and capsule by ssNMR and to investigate the architecture of these two layers. Part of this project was also the exploration of possibilities and limits of 1H detection methods at fast MAS regime (100 kHz) as the tool to analyze intact cell walls.To sum up, as the solid-state NMR is a non-destructive spectroscopy, we applied this method to the study of the molecular architecture of complex systems (cell wall, capsule…) in cellular conditions – as close as possible to the native state. During these three years, we set up a methodology allowing studying the complex composition of fungal external structures as well as their architecture in the cell context. Finally, because in microbial infections, the pathogenesis often relies on the external structures of the pathogen, all these results could give a better comprehension of the A. fumigatus and C. neoformans cell organization that may help to find new therapeutic strategies to fight, more efficiently, against fungal infections

Le bois est devenu le matériau de choix pour de nombreuses industries. La mobilité moléculaire du bois ainsi que celle de ses trois principaux polymères constitutifs, la cellulose, l'hémicellulose et la lignine, ont été étudiées. La stabilité thermique et la structure physique des matériaux ont été respectivement déterminées par Analyse Thermo Gravimétrique (ATG) et Analyse Calorimétrique Diatherme (ACD). Parallèlement, les cinétiques de relaxation macromoléculaire ont été mesurées par Spectroscopie Diélectrique Dynamique (SDD) et Courant Thermo Stimulé (CTS). La combinaison de ces deux dernières techniques a permis d'étudier la mobilité moléculaire locale et délocalisée sur une large gamme de fréquence. L'influence des liaisons hydrogène et du taux d'hydratation sur la mobilité moléculaire a été mise en évidence. L'analyse effectuée sur le bois génétiquement modifié apporte des informations sur l'évolution des interactions inter chaînes
The wood has become a popular material for several industries. The wood molecular mobility and the one of three principal constitutive polymers, cellulose, hemicellulose and lignin were studied. Thermal stability and physical structure of materials were respectively obtained by Thermo Gravimetric Analysis (TGA) and Differential Scanning Calorimetry (DSC). In parallel, macromolecular relaxation dynamics were measured by Dynamic Dielectric Spectroscopy (DDS) and Thermo Stimulated Currents (TSC). The combination of two last methods let us study the localised and delocalised molecular mobility on the extended frequency scale. The influence of the hydrogen bonds and the hydration rate on the molecular mobility was also pointed out. The analysis realised on genetically modified wood brought us the information on the inter chain interactions evolution

Ce travail de these s'inscrit dans le cadre d'une approche genetique de l'elongation cellulaire chez a. Thaliana. L'aspect auquel nous nous sommes particulierement interesses est le role joue par la paroi pectocellulosique au cours de ce processus. A cette fin, un crible visant a rechercher des mutants affectes dans leur elongation a l'obscurite a ete mene. Neuf loci independants ont ete caracterises. Les mutants correspondants, excepte le mutant bot1, ont un phenotype tres ressemblant : ils ont en commun un hypocotyle tres court et plus epais que celui du type sauvage ainsi que la presence de deformations au niveau de la surface epidermique. Celles-ci semblent provenir, chez les mutants korrigan (kor) et procuste1 (prc1) d'une expansion laterale anormale des cellules corticales et epidermiques. Le mutant kor a ete etudie et caracterise sur le plan genetique et moleculaire. Le gene clone code pour une enzyme tres homologue dans sa partie presumee catalytique aux endo-1,4--d-glucanases deja decrites chez les plantes. Cette proteine se caracterise par la presence d'une extension n-terminale qui permet la localisation membranaire au niveau du plasmalemme. En outre, la structure et l'organisation parietale sont perturbees chez kor. De profondes modifications de la trame cellulosique/hemicellulosique ainsi qu'un remaniement du metabolisme pectique montrent que cette enzyme est necessaire pour la mise en place de la paroi au cours de l'elongation. Enfin l'etude du comportement de kor dans differentes conditions physiologiques a ouvert des pistes pour l'etude des eventuelles relations entre les phytohormones, l'activite de kor et l'elongation cellulaire.

La paroi végétale joue un rôle important durant la morphogenèse cellulaire. Dans ce travail, nous avons étudié le mutant reb1-1 d'arabidopsis qui présente des altérations morphologiques au niveau des racines. La mutation affecte la biosynthèse du galactose et son incorporation dans les polysaccharides complexes de la paroi. En effet, la galactosylation des xyloglucanes est affectée. Par contre, les pectines ne sont pas affectées par la mutation. Ces résultats suggèrent que l'incorporation du galactose dans la paroi serait régulée à l'échelle du polymère. Dans un second temps, une potentielle interaction entre les AGPs et les microtubules corticaux a été étudiée. En utilisant des drogues qui immobilisent les AGPs, nous avons montré que des racines d'Arabidopsis présentaient une altération morphologique et une forte désorganisation des microtubules. Ces résultats suggèrent que les AGPs peuvent influencer les microtubules, et favoriser une interaction physique entre la paroi et le cytosquelette
Plant cell wall plays a key role during cell morphogenesis. Here, we have investigated the occurrence of galactose-containing polysaccharides, in the reb1-1 Arabidopsis mutant roots. The mutation affects galatose biosynthesis. Our data show that mutant roots are devoided by galactosylated xyloglucan side chains. Interestingly, pectin galactosylation is not affected. These findings suggest that galactose biosynthesis and its incorporation into complex polysaccharides is regulated at the polymer level. In the second part of this work, a potential connexion between cell wall arabinogalactan-proteins (AGPs) and microtubules was investigated. AGPs disrupting drugs were used to disturb AGPs dynamic at cell surface. A strong alteration of cell morphology and a rapid cortical microtubules organization were observed. These findings demonstrate that AGPs are able ton influence cortical microtubules, placing them as critical molecular linkers between the cytoskeleton and the plant cell wall

La paroi cellulaire des végétaux supérieurs est une structure complexe jouant de nombreux rôles au cours du développement ainsi qu'en réponse aux stress. Les protéines pariétales sont notamment importantes au cours de l'élongation cellulaire. Des hypocotyles étiolés d'Arabidopsis thaliana ont été choisi comme modèle d'élongation cellulaire parce qu'ils subissent une élongation polarisée et rapide en l'absence de division cellulaire. Deux stades de développement ont été comparés grâce à des analyses protéomique et transcriptomique : pendant leur élongation vs après la fin de leur croissance. Pour rendre l'analyse protéomique efficace, une nouvelle méthode de purification de parois et une stratégie de séparation des protéines pariétales ont été établies. Les protéines ont été identifiées par cartographie peptidique massique en utilisant la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF. Cette étude a permis d'identifier 137 protéines parmi lesquelles 51 n'avaient pas été identifiées auparavant. Plusieurs familles de protéines connues pour être impliquées dans l'elongation cellulaire ou son arrêt ont été trouvées par l'une ou l'autre approche (XTH, PG, expansines, peroxydases, laccases). De nouvelles protéines candidates pour jouer des rôles dans l'élongation cellulaire ont été identifiées, telles des protéases, des protéines liées au métabolisme des lipides ou des protéines de fonction inconnue. La comparaison des résultats de protéomique et de transcriptomique ne montre pas de cohérence systématique, suggérant l'existence de mécanismes de régulation post-transcriptionnels des gènes codant les protéines pariétales.

Le maïs fourrage est considéré comme la plante de stock incontournable pour l'alimentation des ruminants. Sa valeur alimentaire est essentiellement liée à la digestibilité des constituants de la paroi cellulaire. La teneur et la structure des lignines, ainsi que les relations entre la lignine et les autres constituants pariétaux sont les principales composantes influençant la digestibilité des parois des fourrages. A ce jour, seuls les gènes impliqués dans la voie de biosynthèse des lignines ont été identifiés et étudiés, mais leurs variations ne sont pas suffisantes pour expliquer les différences de digestibilité observées entre lignées. L'objectif de mon travail de thèse est d'identifier et d'étudier de nouveaux gènes candidats impliqués dans les variations de digestibilité des parois du maïs fourrage. La démarche utilisée repose sur une approche transcriptomique. Une puce à ADN, spécifique de la paroi du maïs, a été conçue à partir de séquences Zinnia, issues d'une banque SSH "paroi", et de recherche bioinformatique de gènes impliqués dans l'élaboration de la paroi. Une base de données "Maize Cell Wall Database" a été créée afin de regrouper les séquences et les analyses bio-informatiques effectuées. 683 Gene Specific Tags correspondant aux 3'UTR des gènes impliqués dans l'élaboration de la paroi ont été amplifiés et déposés sur notre "Maize Cell Wall Macroarray". Cette puce a été hybridée avec des ADNc radiomarqués provenant de différents tissus de maïs récoltés à différents stades de développement afin de mettre en évidence la dynamique d'expression des gènes pariétaux au cours du développement. La puce "paroi" a aussi été hybridée avec des ADNc provenant i) des mutants brown midrib, qui diffèrent par leur contenu en lignine et leur digestibilité, et ii) de lignées de maïs se distinguant par des digestibilités de parois différentes. Les résultats obtenus mettent en évidence l'intégration de la lignification dans un ensemble de régulations bien au delà des simples gènes du "lignin pathway". La puce "paroi" nous a permis de commencer à visualiser des co-régulations transcriptionnelles des gènes de composants pariétaux et de mettre en évidence l'empreinte transcriptionnelle d'une bonne digestibilité. Grâce aux résultats obtenus au cours de ce travail, avec la mise en évidence d'un ensemble original de gènes impliqués dans la biogenèse des parois, il sera possible de comprendre les bases des différences de digestibilité observées entre lignées
Forage maize serves as a basis of ruminant nutrition. Forage feeding value is essentially related to digestibility of cell wall components. Lignin content and structure, and relations between lignin and other cell wall components are the main characteristics influencing forage cell wall digestibility. To date, only few genes involved in the lignin biosynthesis pathway have been identified and characterised, but their variations in expression are not sufficient to explain differences in digestibility between lines. The aim of my PhD is to identify and to study new candidate genes implicated in variations of cell wall digestibility of forage maize. The strategy used is based on a transcriptomic approach. A maize cell wall specific cDNA macroarray was constructed with maize homologs to Zinnia sequences, derived from a secondary cell wall SSH library, and a bioinformatic search of genes involved in cell wall formation. A "Maize Cell Wall Database" was constructed in order to centralize sequences and results from in depth bioinformatic analyses. 683 Gene Specific Tags, derived from 3'UTR of each gene involved in cell wall formation, were amplified and spotted on our "Maize Cell Wall Macroarray". This chip was hybridized with radiolabelled cDNA coming from different tissues of maize collected at various stages of development in order to highlight the dynamics of expression of parietal genes during the development. The cell wall macroarray was also hybridized with radiolabelled cDNA coming from i) brown midrib mutants, which differ by their lignin content and digestibility, and ii) maize lines previously characterized by different cell wall digestibilities. Results obtained highlight integration of lignification in a whole pattern of regulation far beyond genes of the "lignin pathway". The cell wall macroarray enabled us to start visualizing transcriptional co-regulations in genes of cell wall components and highlighting a transcriptional print of a good digestibility. Thanks to the results obtained during my PhD, with the description of an original set of genes implied in cell wall biogenesis, it will be possible to uderstand the bases of digestibility differences observed between maize lines

Les pectines méthylestérases (PME, EC. 3. 1. 1. 11) sont des enzymes pariétales qui catalysent la déméthylestérification des pectines. Chez les plantes supérieures, les PME existent sous de nombreuses isoformes et sont impliquées dans divers processus de développement. Trois gènes (Lupme5, Lupme3 et Lupme1) codant des PME ont été isolés de l’hypocotyle de lin (Linum usitatissimum). Au cours de ce travail, nous avons purifié une isoforme très basique (B2 pI 9. 5), qui se trouve sous une forme mature (35 kDa) au sein de la paroi. Nous nous sommes intéressés aussi à l’expression du gène codant cette isoforme (LuPME5). Pour mieux comprendre ses rôles possibles dans l’hypocotyle, nous avons comparé l’expression de Lupme5 avec celle des deux autres gènes dans les différentes zones d’élongation et de maturation de l’hypocotyle de plantules âgées de 4, 6 et 10 jours à l’aide de la RCT-PCR semi-quantitative. Cette technique nous a permis de montrer que Lupme5 est le gène le plus exprimé, mais aussi qu’il a un profil d’expression qui pourrait être lié à la rigidification de la paroi après élongation. Une construction contenant une séquence partielle de ce gène (comprenant la partie N-terminale, spécifique de LuPME5), insérée en orientation antisens, sous le contrôle du promoteur CaMV 35S, a été transférée dans le lin. Parmi les cals transgéniques antisens obtenus, certains ont présenté une baisse de l’expression de l’ARNm de Lupme5 et de l’activité PME et de la quantité de protéine révélée par Western blot. Une légère augmentation dans le pourcentage de méthylestérification de la paroi a été observée chez ces cals transgéniques, indiquant une certaine efficacité de la construction antisens
Pectin methylesterases (PME, EC. 3. 1. 1. 11) are enzymes that demethoxylate pectins in the cell wall. Numerous PME isoforms exist in higher plants; these isoforms are known to play different roles in various developmental processes. Three genes (Lupme5, Lupme3 and Lupme1) encoding PME were isolated from flax (Linum usitatissimum) hypocotyls. We purified the mature LuPME5 isoform which was found to have a very basic isoelectric point (pI 9. 5) and a molecular mass of 35 kDa. In order to understand the possible roles of this isoform in the hypocotyls, we first performed a semi-quantitative RT-PCR in order to compare the expression levels of Lupme5 with Lupme3 and Lupme1. The expression of these genes was essayed in the different elongation and maturation zones of the hypocotyls of 4, 6 and 10 days old plants. The result showed that Lupme5 is the most expressed gene and that its expression profile could be correlated with the cell wall stiffening after elongation. A construct, containing a partial specific sequence of Lupme5 (in the antisense orientation) was introduced into flax genome. The antisense transformants displayed reduction in the levels of Lupme5 mRNA expression, crude PME activity and protein content. A slight increase in the degree of methylesterification of the cell wall was observed in the antisense constructs, indicating the functional efficiency of these constructs

Durant la reproduction sexuelle des plantes, la germination du grain de pollen et la croissance du tube pollinique dans le pistil sont des étapes essentielles pour permettre la fécondation et la production de graines. Le grain de pollen est composé de deux noyaux spermatiques et d'une cellule végétative délimitée, de l'intérieur vers l'extérieur, par la membrane plasmique, l'intine et l'exine. La dégradation de l'intine, composée de polysaccharides complexes dont les homogalacturonanes (HGs), est nécessaire pour une bonne germination du grain de pollen. Les HGs sont synthétisés sous leur forme fortement méthyl-estérifiés, dans l'appareil de Golgi, avant d'être sécrétés dans la paroi. La dé-méthyl-estérification des HGs est catalysée par des enzymes pariétales, les pectines-méthyl-estérases (PMEs). Lorsque les HGs sont dé-méthyl-estérifiés, ceux-ci peuvent se lier entre eux via une interaction avec le calcium, qui permet un renforcement pariétal du à ces structures en "boîtes à oeufs". Lorsque les HGs sont partiellement dé-méthyl-estérifiés, ils peuvent être la cible d'autres enzymes, telles que les polygalacturonases, ce qui entraîne également une modification des propriétés physiques de la paroi. Quatorze des 66 PMEs chez A. Thaliana sont exclusivement exprimées dans le grain de pollen et le tube pollinique. Nous avons analysé l'expression de ces 14 PMEs par qRT-PCR à trois stades de la germination du grain de pollen : dans le grain de pollen sec, dans les grains de pollen en cours d'imbibition et lors de la croissance des tubes polliniques. L'expression est à la fois dépendante du temps et du gène. Nous avons donc analysé par la suite des lignées mutantes pour les PMEs : PPME1, PME48 et PME23, à la fois in-vitro et in-vivo. Les lignées mutantes présentent des retards de germination par rapport aux grains de pollen sauvages. De plus, des phénotypes remarquables comme des doubles germinations ou un taux important d'éclatement des tubes polliniques ont été mis en évidence. L'objectif de ce projet a été de préciser le rôle des PMEs et des PMEIs au cours du trafic cellulaire dans la régulation des propriétés dynamiques et le remodelage de la paroi du grain de pollen lors de sa germination et des tubes polliniques lors de leur croissance
During sexual plant reproduction, pollen germination and pollen tube elongation in the pistil are essential for delivering the sperm cells to the ovule. Pollen grain is composed of two sperm cells and a vegetative cell limited, from the inside to the outside, by a plasma membrane, the intine and the exine. The degradation of the intine, composed of complex polysaccharides including homogalacturonans, is of main importance to insure a proper germination. Homogalacturonan (HG) is assumed to be synthetized under a methylesterified form in the Golgi apparatus before its secretion to the cell wall. De-methylesterification of HGs is catalyzed in the cell wall by Pectin methylesterases (PMEs). Upon block-wise action of PME, the blocks of de-methylesterified HGs can interact with Ca2+, promoting the formation of the so-called "eggs-box" structure and thus rigidifying the cell wall. Upon random action, the partially de-methylesterified HGs may become a target for pectin-degrading enzymes, such as polygalacturonases, affecting the texture and rigidity of the cell wall. Interestingly, 14 of the 66 Arabidopsis PMEs are specifically expressed in pollen grain and pollen tube. We have analyzed the expression of these 14 PMEs by RT-PCR in dry pollen grains, during imbibition and pollen tube growth. The expression is gene- and time-dependent. Based on this, we have studied knock-out mutants PMEs (ppme1, pme48 and pme23) under in-vitro and in-vivo conditions. These mutant lines present a strong delay in germination compared to the wild type and a remarkable phenotype with multiple pollen tube tips emerging from the pollen grain and an important bursting pollen tubes rate. The objective of this project was to clarify the role of PMEs and PMEIs during the regulation of dynamic properties during cell traffic and remodeling of the pollen grain cell wall during its germination and during the growing pollen tube cell wall

De part sa localisation à l'interface entre la cellule et son environnement, la paroi végétale joue un rôle clé lors des interactions avec des agents pathogènes. Au cours de ma thèse, l'importance de la paroi végétale lors de l'infection d'Arabidopsis par la bactérie Ralstonia solanacearum a été étudiée. Pour cela, une analyse immunocytologique couplée à une approche bioinformatique a permis d'identifier les modifications pariétales induites en réponse à l'infection et de les corréler à l'arsenal enzymatique existant chez la bactérie. En parallèle, le crible de mutants ''paroi'' d'Arabidopsis testés pour leur sensibilité à différents agents pathogènes a contribué à ouvrir de nouvelles pistes pour mieux comprendre le rôle de la paroi dans les réponses de défense puisque 28 mutants ont une sensibilité modifiée. L'essentiel de mes recherches a porté sur la caractérisation de wat1 (walls are thin 1), un mutant d'Arabidopsis présentant une résistance accrue à R. Solanacearum. Par des approches génétique, transcriptomique et métabolomique, nous avons pu définir que wat1 présente une immunité vasculaire et que les mécanismes de résistance impliqueraient une perturbation dans le " crosstalk " entre les métabolismes de l'auxine, des glucosinolates indoliques et de l'acide salicylique au niveau du système racinaire plutôt que des modifications pariétales stricto sensu
Due to its location at the interface between the cell and its environment, the plant cell wall plays a key role in interactions with pathogens. During this project, the importance of plant cell walls during infection of Arabidopsis by the bacterium Ralstonia solanacearum has been studied. First, an immunocytological analysis coupled with a bioinformatic approach allowed us to identify cell wall modifications in response to infection and to correlate them to the cell wall-degrading enzymatic arsenal present in the bacteria. In parallel, the screening of cell wall mutants of Arabidopsis for susceptibility to different pathogens led to the identification of twenty eight mutants with altered sensitivity and, as a result, will open new avenues for understanding the role of the wall in defense responses. Much of my PhD research has focused on the characterization of wat1 (walls are thin 1), an Arabidopsis mutant with increased resistance to R. Solanacearum. Through combined genetic, transcriptomic, and metabolomic approaches, we show that wat1 exhibits vascular immunity, most likely resulting from altered crosstalk between auxin, indole glucosinolate and salicylic acid metabolism in roots rather than in cell wall modifications per se

Le maïs, l'une des plantes les plus cultivées au monde, sert de base dans l'alimentation humaine et des ruminants et pour la production d'agrocarburant. Sa valeur agronomique est principalement liée à la digestibilité des constituants de la paroi cellulaire (sucres, lignines,. . . ). De nombreuses études ont été menées afin d'améliorer la digestibilité de cette paroi, notamment sur la voie de biosynthèse des lignines. Au cours de ma thèse, nous avons démontré, chez le maïs, que la mutation du gène ZmCCR1 (Cinnamoyl-CoA reductase), codant pour une enzyme clé de la voie de biosynthèse des lignines, conduisait à une diminution des unités H associée à une meilleure digestibilité. La deuxième partie de mes recherches a porté sur l'identification des paramètres influençant la digestibilité à l'échelle cellulaire. En effet, il existe chez le maïs une très grande diversité de types cellulaires à paroi lignifiée non seulement entre différents organes, mais également au sein de chaque organe (sclérenchyme, parenchyme, vaisseaux de xylème. . . ). Dans ce but, une étude combinant de multiples techniques biochimique, histologique et transcriptomique, a été réalisée sur deux lignées de digestibilité contrastée. Ainsi, nous avons mis en évidence l'importance de la proportion de tissus lignifiés, plus particulièrement du sclérenchyme périvasculaire. Au-delà, le développement de la microdissection laser (LCM) a permis de souligner la différence de composition des tissus lignifiés
Maize is one of the most widely grown crops in the world and is grown for grain for human consumption, feedstock for cattle and more recently biofuel. When used as fuel, the most important agronomic trait is digestibility which is dictated by cell wall composition and structure. Many studies have been undertaken in order to improve cell wall digestibility and have essentially focused on the lignin biosynthetic pathway. During my PhD research, we have shown that a mutation in ZmCCR1 (Cinnamoyl-CoA reductase 1), key enzyme in lignin biosynthesis, modified lignin structure which in turn resulted in an increase in digestibility. Beyond lignification per se, my studies focused on the identification of other potential parameters influencing digestibility at the cellular level. This is especially pertinent in maize since its stem biomass is made up of different several lignified tissues and cell types. By combining cell wall biochemistry on laser microdissected (LMD) lignified tissues, with histological studies, we have been able to show that in highly contrasting lines (Cm484 and F98902) the lignified cell types patterning and in particular, the amount and cell wall composition are critical factors in determining maize digestibility

L’auxine est une hormone fondamentale dans le développement et la physiologie de la plante. L’obtention des plantes conditionnelles pour ABP1 a permis la mise en évidence de son importance dans la signalisation de l’auxine. Ainsi ABP1 agirait d’une part sur l’endocytose de vésicules à clathrine au niveau de la membrane plasmique et d’autre part sur la stabilité des Aux/IAAs. Ce dernier résultat suggère qu’une voie de signalisation en aval d’ABP1 permet de modifier l’homéostasie de la voie de régulation transcriptionnelle de l’auxine, la voie SCFTIR/AFBs.Mon travail de thèse a consisté à caractériser les plantes inactivées pour ABP1 lors de la croissance à l’obscurité dans la plante modèle Arabidopsis thaliana. Mon étude montre qu’ABP1 contrôle l’expansion cellulaire en jouant sur la plasticité pariétale. J’ai ainsi pu mettre en évidence une modification de la proportion de formes fucosylées des chaînes latérales des xyloglucanes, le principal hémicellulose de la paroi primaire chez Arabidopsis. Cette modification de la fucosylation des xyloglucanes requiert des changements d’expressions géniques médiés ce qui conforte l’existence d’une voie de signalisation reliant ABP1 à la voie SCFTIR/AFBs.En parallèle, j’ai mené une approche génétique de recherche de suppresseurs du phénotype lié à l’inactivation d’ABP1 à l’obscurité. Parmi les dix lignées validées, j’ai d’ores et déjà identifié le gène DCL3 comme étant impliqué dans la suppression du phénotype ss12k et mis en évidence l’implication de la voie d’extinction de gènes par l’intermédiaire de petits ARNs non codant (voie RdDM) dans le contrôle de l’expansion cellulaire
Auxin is a key hormone concerning the control of plant physiology and the impact on plant development. Conditional plants for ABP1 allowed the post embryonic studies and have contributed to demonstrate the involvement of ABP1 in a broad range of cellular and developmental responses including the clathrin-dependent endocytosis and the regulation of Aux/IAAs homeostasis. These datas revealed that an ABP1-dependent pathway is acting on transcriptional regulation by modulating the SCFTIR/AFBs signaling pathway. I took advantage of the phenotype of dark grown seedlings to study cell expansion in ABP1 loss of function background. ABP1 knockdown induced modifications of fucosylated form of xyloglucan side chains that are the main hemicellulose in Arabidopsis primary cell wall. All data converge to show that this effect results from alterations of expression of cell wall related genes via the modulation of the SCFTIR/AFBs pathway. In parallel, I used a suppressor approach to discover new signaling components downstream of ABP1. Characterisation of one of the suppressor leads to the identification of a loss of function allele of DCL3. This data demonstrates the involvement of the RNA directed DNA methylation pathway downstream of ABP1