Tesi sul tema "Composition membranaire"

Durant notre travail, nous avons voulu préciser l'importance de la glycolyse pour les fonctions membranaires cardiaques en nous focalisant sur la pyruvate kinase (PK). Parallèlement, nous avons essayé de rendre compte du rôle crucial de la composition membranaire en acides gras polyinsaturés w-3 (AGPI w-3) sur le maintien de l'homéostasie cellulaire. Premièrement, sur un modèle de cœur isolé perfusé de rat, l'administration d'adénosine exogène diminue la fréquence cardiaque et inhibe la glycolyse via la PK. A l'inverse, la stimulation des échanges ioniques membranaires, via l'utilisation de monensine, stimule le travail cardiaque. Cet effet est associé à une augmentation du flux glycolytique via la PK. Ces résultats tendent à montrer l'existence d'un lien étroit entre la PK et la Na+-K+ATPase dans le cœur. Deuxièmement, une déficience en AGPI w-3 altère la fonction cardiaque physiologique. La fonction postischémique est également affectée, mais l'administration intraveineuse d'une émulsion lipidique enrichie en AGPI w-3limite l'effet délétère de la carence. L'ensemble de notre étude montre l'importance de considérer le phénomène de la compartimentation de l'énergie et de la composition lipidique membranaire au niveau de la cellule musculaire cardiaque
Ln the present work, we studied the importance of the glycolytic A TP for cardiac membrane functions, and specifically the role of the pyruvate kinase (PK). Furthermore, we tested the role of w-3 polyinsaturated fatty acids (PUFAs w-3) in membranes phospholipids for cellular homeostasis. Firstly, in isolated perfused normoxic rat hearts the inhibition of heart rate by exogenous adenosine was associated with a pyruvate kinase-mediated inhibition of glycolysis. Together, stimulation of sarcolemmal ionic fluxes with Na+ ionophore monensin increased cardiac work with a large stimulation of glycolysis secondary to the stimulation of the pyruvate kinase. These results suggest that the PK is linked to the Na+-K+ATPase in heart. Secondly, our results demonstrated that PUFAs w-3 deficiency altered cardiac work in physiological conditions and affected the recovery of cardiac mechanical activity after ischemia. Morover injection of lipid emulsion which contains PUFAs w-3 enhanced cardiac function after ischemia in these rats. Our study shows that it is important to consider the energy compartmentation and the composition in PUFAs w-3 in membranes phospholipids in cardiac muscle cell

La cavéoline-1 (21kDa) est le composant protéique principal des cavéoles, microdomaines spécifiques des membranes plasmiques, enrichis en cholestérol et sphingolipides. Ces structures jouent un rôle dans de nombreux processus cellulaires et sont le siège de nombreux réseaux d'interactions protéine-protéine et lipide-protéine. L'objectif général de ces travaux était de contribuer à la compréhension des bases moléculaires des réseaux d'interactions impliquant la cavéoline-1 avec ses partenaires lipides et protéines, afin de mieux comprendre la structure et le rôle multifonctionnel des cavéoles. Ne disposant d'aucune donnée structurale sur aucun des composants des cavéoles pour décrire ces réseaux, nous nous sommes d'abord intéressés à la structure du marqueur principale des cavéoles, i. E. La cavéoline-1 et plus particulièrement du domaine de liaison à l'interface membranaire N-MAD ou CSD (incluant le motif CRAC) et du domaine intra-membranaire. Un des objectifs de la thèse a été l'obtention d'une grande quantité de ces domaines afin de réaliser une étude structurale par RMN. Pour cela différentes approches de synthèse chimique et biochimique, ont été mises en œuvre. L'ensemble de ce travail a permis d'obtenir des premières données structurales et d'interaction avec des lipides sur des fragments de la cavéoline-1, CSD et CRAC en présence de différents environnements mimétiques menibranaires. L'étude structurale par RMN du fragment incluant le CSD et le domaine intra-membranaire obtenue par synthèse chimique a permis d'identifier des régions structurées en hélice a (82 à 102 et 115 à 120)
Caveolin-1 (21kDa) is the main component of specific microdomain of the plasma membrane, enriched in cholesterol and sphingolipids, called caveolae. These structures play a role in many cellular processes. A protein-protein and lipid-protein interactions networks occur within these structures. The main goal of this work bas been to contribute to elucidate the molecular basis of the interactions networks between caveolin-1, lipids and proteins, in order to understand the structure and multifunctional role of caveolae. In the absence of any available structural information at the atomic level on any components of caveolae to describe these networks, our first work has been to focus on the structure of the main caveolae component, i. E caveolin-1 and more particularly the membrane attachment domain N-MAD or CSD (including CRAC motif) and the intra -membrane domain. One of our goals was to obtain a large quantity of these domains to perform an NMR study. To this aim chemical synthesis and biochemical synthesis were used. Our work has provided the fîrst structural data and interaction with lipids of caveolin-1 fragment, CSD and CRAC in various membrane mimics. NMR structural study of the synthetic fragment including CSD and the hydrophobic domain highlights two a helical regions (82 to 102 and 115 to 120)

Le role de la composition lipidique dans la tolerance de pseudomonas aeruginosa atcc 15442 a l'activite bactericide de quatre desinfectants est etudie. La souche est cultivee dans un milieu avec des concentrations croissantes de deux ammoniums quaternaires, le bromure de didecyl dimethyl ammonium (bdda) et le chlorure de benzyldimethyl tetradecyl ammonium (c14) et en presence de deux autres agents, le phosphate tri-sodique (tsp) et le sel de sodium du dichloroisocyanurate (nadcc). En presence de bdda et de c14 seulement, la souche a pu croitre dans des concentrations superieures aux concentrations minimales inhibitrices. L'adaptation de la souche s'est accompagnee d'une augmentation de la tolerance a l'activite bactericide des memes composes et de modifications de la composition en acides gras. Pour les deux composes non-ammoniums quaternaires, aucune modification de la tolerance et de la composition en acides gras est observee. Les acides gras modifies en presence des ammoniums quaternaires sont specifiques au lipide a du lipopolysaccharide. Il semblerait que le lipopolysaccharide soit implique dans la penetration des ammoniums quaternaires dans les cellules. La voie de penetration empruntee par les deux non-ammoniums quaternaires serait donc differente. Les variations de la composition en acides gras du lipide a du lipopolysaccharide observees en presence des deux ammoniums quaternaires auraient pour but de diminuer l'adhesion des agents antimicrobiens aux cellules pour limiter leur penetration. Ainsi, nous avons pu montrer qu'il existe une relation entre la tolerance de pseudomonas aeruginosa atcc 15442 aux ammoniums quaternaires et sa composition lipidique, mais que cette relation n'explique pas l'ensemble du mecanisme de tolerance, tres complexe.

Du cerveau à l’os, la rigidité et la composition de la matrice extracellulaire varient énormément et jouent un rôle dans les réponses cellulaires. La rigidité influe également sur la tension de la membrane plasmique, elle-même régulée par le trafic membranaire. Comment la rigidité et la composition du substrat peuvent réguler l'exocytose, qui à son tour régule la tension de la membrane, reste largement inconnu. Ici, j'ai utilisé l’imagerie pHluorin d’évènements uniques d’exocytose de cellules cultivées sur des substrats de rigidité et de composition contrôlée pour explorer la régulation de VAMP2 et VAMP7. J'ai développé un logiciel informatique pour identifier automatiquement les évènements de fusion, permettant une analyse rapide de données. J'ai contribué à l'étude montrant que l’exocytose VAMP7 est régulée par la kinase src, qui phosphoryle VAMP7 dans son domaine Longin (LD) (Burgo et al. JBC 2013). De plus, j’ai trouvé que la rigidité du substrat stimule l’exocytose, en présence de la laminine, de VAMP7, mais pas VAMP7 sans LD ni VAMP2. VAMP7 et VAMP7 sans LD sont par ailleurs également sensibles aux variations de la tension membranaire induites par chocs osmotiques. Enfin, j'ai identifié que LRRK1 est un partenaire du LD, et contrôle le transport rétrograde de VAMP7.Ces approches m’ont permis de révéler un nouveau mécanisme par lequel la rigidité, agissant sur la signalisation des intégrines, contrôle le transport de VAMP7 via LRRK1 et Rab21 (Wang et al. soumis). Ce mécanisme pourrait avoir un large intérêt potentiel pour comprendre la dynamique de la membrane dans des conditions normales et pathologiques, en particulier le cancer
From brain to bones, stiffness and composition of the extracellular matrix vary greatly and play a role in cell responses. Substrate rigidity also impacts plasma membrane tension, which has a close relationship with membrane trafficking. How substrate rigidity and chemistry sensing may regulate exocytosis, which in turn regulates membrane tension, is still largely unknown. Here, I used pHluorin imaging of single vesicle exocytosis in cells cultured on substrates of controlled rigidity and composition to explore the regulation of VAMP2 and VAMP7-mediated exocytosis. I developed a computer software to automatically identify fusion events thus allowing quick analysis of batch data. I contributed to the study showing that VAMP7 exocytosis is regulated by src kinase which phosphorylates VAMP7 in its Longin domain (LD) (Burgo et al. JBC 2013). I further found that VAMP7 but not VAMP7 lacking LD- or VAMP2-mediated secretion was stimulated by substrate stiffness on laminin. VAMP7 and VAMP7 lacking LD were similarly sensitive to osmotic chock-induced membrane tension changes. Finally, i showed that LRRK1, a regulator of egf receptor transport, is a partner of the LD, and controls the retrograde transport of VAMP7. These approaches allowed me to reveal a new mechanism whereby substrate rigidity, by acting on integrin signalling, enhances VAMP7 exocytosis via LRRK1- and Rab21-dependent regulation of its peripheral readily-releasable pool (Wang et al. submitted). This mechanism may have broad potential relevance for plasma membrane dynamics in normal conditions and diseases, particularly cancer

Lors de ce travail, deux séries d'analyses ont été effectuées en parallèle pour contrôler l'influence de facteurs environnementaux sur Pseudomonas fluorescens. La première a consisté à vérifier que le profil en acides gras de phospholipides de la membrane bactérienne est intimement lié aux conditions de culture de la bactérie. La deuxième partie s'est attachée au métabolisme secondaire bactérien. Ces deux séries d'analyses ont montré des similitudes quant à l'influence des conditions de culture sur le profil en acides gras et la production de métabolites, En effet, dans les deux cas, une analyse statistique a montré que la phase de croissance et la température de culture sont les facteurs prédominants. Ceci suggère qu'il existe un lien entre le profil d'acides gras de la membrane et la production de métabolites secondaires. Ce lien semble s'exprimer au travers des protéines membranaires dont l'activité est affectée par les variations en acides gras de phospholipides
During this work, two series of analyses were carried out in parallel to control the influence of environmental factors on Pseudomonasfluorescens. The first one has consisted in controlling that phospholipid fatty acids profile of the bacterial membrane is closely related to the culture conditions of the bacterium. In the second part, the bacterial secondary metabolism was investigated. These two series of analyses have showed similarities concerning the influence of the culture conditions on the fatty acids composition and the metabolites production. Indeed, in both cases, a statistical analysis has showed that the growth phase and the culture temperature are the prevalent factors. This suggests there is a link between the fatty acids profile of the membrane and the secondary metabolites production. This link seems to be expressed through membrane proteins whose activity is affected by the variations of phospholipid fatty acids composition

Un organisme stressé produit des métabolites secondaires actifs qu'il ne produit pas dans des conditions de culture "optimales". Cela se produit sans modification du génome, à partir de variations phénotypiques. Afin de mesurer l'impact de modifications environnementales sur le métabolisme de la bactérie Frateuria aurantia, nous avons mis au point une "mesure de stress" basée sur l'analyse des modifications de sa composition lipidique membranaire. L'étude ayant porté initialement sur l'influence d'un nombre réduit de stress (température, phase de croissance, composition du milieu, pH) a été étendue par le biais d'un plan d'expériences factoriel à 13 facteurs environnementaux incluant le champ magnétique. L'influence d'interactions existantes entre les différents facteurs de stress s'est avérée être de la plus haute importance et doit être étudié plus intensément
A stressed organism produces active secondary metabolites that are not produced in "optimal" culture conditions. That happens from phenotypic variations, without genetic modification. In order to measure the impact of environmental modifications on the bacterial metabolism of Frateuria aurantia, we developed a "measure of stress", based on analyse of the modifications of its membrane lipid composition. The study, which initially dealing with the influence of a reduce number of stress (temperature, growth phase, medium composition and pH), has been extended by means of an experimental plan with 13 environmental factors including magnetic field. The influence of interactions between different stress factors revealed to be of great importance and must be studied more thoroughly

Les organismes vivants sont soumis à diverses pressions de sélection qui n'agissent pas seulement au niveau du phénotype global mais à chaque niveau de l'organisation de la cellule.
Nous avons analysé la composition globale en acides aminés de l'ensemble les protéines de chaque protéomes étudiés à l'aide, entres autres, de l'Analyse Factorielle des Correspondances et d'un outil de partitionnement, les nuées dynamiques.
Ont été étudiés
(i) les modèles microbiens les mieux connus E. coli, B. subtilis et M. jannaschii,
(ii) un échantillon représentatif du monde procaryote de 28 organismes aux caractéristiques les plus diverses,
(iii) la pathogénicité de P. luminescens,
(iv) la qualité psychrophile de la bactérie P. haloplanktis, dont la vie à basse température est caractérisée par des
protéines fortement biaisées en asparagine et
(v) une perspective d'application aux eucaryotes simples est évoquée au regard des travaux préliminaires sur l'usage
des codons de P. marneffei, un chamipgnon dimorphique et pathogène.

Le développement de systèmes d’assainissement spécifiques et décentralisés peut apporter des réponses à une double problématique : l’amélioration des conditions sanitaires dans les zones les plus pauvres du monde et le développement de sources renouvelables de nutriments essentiels pour l’agriculture. L’objectif de cette thèse est de développer des connaissances scientifiques sur une filière de traitement et valorisation de l’urine couplant une cristallisation à une séparation membranaire. Il a été démontré que la précipitation de phosphore sous forme de struvite permet de récupérer la quasi-totalité du phosphore et une partie de l’azote en 20 secondes environ suite à l’ajout de magnésium avec un ratio Mg :P=1,3 :1. L’influence des conditions d’agitation, de l’apport en magnésium, des conditions de stockage de l’urine et de la présence de matières organiques et de cristaux initiaux a été étudié en réacteur batch et continu.L’ultrafiltration de différents types d’urine (fraichement excrétée, stockée, stockée puis cristallisée) a été réalisée avec des membranes en PES, PAN et PVDF. Les mécanismes responsables de cette chute de flux ainsi que l’influence spécifique des fractions particulaires colloïdales et particulaires ont été étudiés. En se basant sur ces résultats différents procédés ont été proposés et discutés
The development of decentralized and specific sanitation system is an issue that concerns both the improvement of sanitary conditions in the poorest area of the world and the development of renewable sources of nutrients for agriculture. This study aims to provide some elements about a treatment line including crystallization and membrane separation for the treatment and valorization of urine. Crystallization allows to recover phosphorus and part of nitrogen contained in urine. Membrane separation is used in order to remove bacteria and viruses from urine. To check the potentialities of these processes some tests were performed at labscale with synthetic and real human urines.It was shown that the struvite crystallization by magnesium addition with a ratio Mg:P=1,3:1 allows recovering most of the phosphorus from urine with a very rapid kinetics (about 20s). Influence of mixing conditions, urine storage, organic matter and initial crystals in urine was studied in batch and continuous reactor. Ultrafiltrations of different pretreated urines (no pretreatment, stored urine, stored and crystallized urine) were performed with PES, PAN and PVDF membranes. Mechanisms responsible for an important flux decline during urine flitration were studied. Specific influence of particular, colloidal and soluble fraction on the flux decline was also evidenced. On these basis different possible treatment lines of urines are proposed and discussed

L'isolement d'une fraction hautement purifiee de membranes plasmiques et l'emploi de radioiodations enzymatiques ont permis de suivre la composition des proteines et de certains lipides polaires, ainsi que leur representation a la surface cellulaire

L’objectif de cette thèse était de mettre en évidence les caractéristiques structuro-fonctionnelles d’un type cellulaire précis, les hémocytes de bivalves. Les outils analytiques tels que la chromatographie liquide haute performance (CLHP) et la chromatographie en phase gazeuse (CPG) ont permis une investigation approfondie des composants lipidiques membranaires. La composition détaillée des classes et sous-classes de phospholipides ainsi que les spécificités de leur composition individuelles en acides gras ont été mises en évidence. De plus, l’utilisation de la cytométrie en flux a permis de caractériser un certain nombre de fonctions hémocytaires ainsi que la ploïdie des hémocytes. La composition lipidique des membranes d’hémocytes chez quatre espèces de bivalves l’huître creuse Crassostrea gigas, la palourde Japonaise, Ruditapes philippinarum, la coque Cerastoderma edule et la mye Mya arenaria a été finement caractérisée. Parmi les particularités principales, une forte teneur en plasmalogènes enrichis en acides gras « non methylene interrupted » (NMI) et en 20:ln-l1 a été mise en évidence pour la première fois dans des hémocytes. Ces acides gras présentent la particularité d’être biosynthétisés de novo par les bïvalves marins. Les membranes des hémocytes sont également très riches en céramide aminoéthylphosphonate CAEP) et en stérols. La seconde étape a consisté à étudier les modifications des compositions lipidiques membranaires et des fonctions cellulaires potentiellement induites par la néoplasie disséminée, afin de dégager des liens structuro-fonctionnels au niveau membranaire. Pour ce faire, les cellules circulantes provenant d’animaux sains et d’animaux atteints par la néoplasie disséminée ont été comparées chez la coque du Bassin d’Arcachon et la mye de l’Ile du prince Edouard (Canada). Dans le cas des coques, une proportion beaucoup plus faible d’espèces moléculaires plasmalogènes-acides gras NMI a été observée dans les membranes des cellules néoplasiques. Cette observation était associée à une activité phagocytaire plus faible et à une origine subcellulaire d’espèces réactives de l’oxygène (ERO) différente. Chez les myes, une plus faible proportion de l’espèce moléculaire phosphatidylsérine plasmalogène-20:1n-1l associée une plus faible activité phagocytaire a été détectée dans les cellules; circulantes des animaux affectés par la néoplasie disséminée. Les caractéristiques de la néoplasie disséminée chez la coque du Bassin d’Arcachon sont apparues très différentes de celles observées chez la mye de l’île du Prince Edouard, notamment au niveau de la ploïdie des cellules néoplasiques mais aussi de la prolifération cellulaire et de la prévalence des différents stades de développement de la maladie. Une progression différente de cette pathologie entre les deux espèces a été suggérée. Ceci pourrait expliquer les différences d’altérations des structures lipidiques membranaires des cellules néoplasiques entre ces deux espèces
The aim of the works presented in this PhD thesis was to evidence structure-functional characteristics of a precise - cell type, bivalve hemocytes. Analytical tools such as high performance liquid chromatography (HPLC) and gas chromatography (GC) allowed an in-depth investigation of membrane lipid components. Detailed composition of phospholipid classes and subclasses and their respective specific fatty acid composition were evidenced. Moreover, use of flow cytometry allowed characterizing some hemocyte cell functions and ploidy. Membrane lipid composition of hemocytes was finely characterized in four bivalve species; the Pacific oyster Crassostrea gigas, the Manila clam, Ruditapes philippinarum, the edible cockle Cerastoderma edule and the soft-shell clam Mya arenaria. Among the main lipid particularities, a high content of plasmalogen enriched in non-methylene interrupted (NMI) fatty acids and in 20:1n-11 was evidenced for the first time in hemocytes. These fatty acids present the particularity to be biosynthesized de novo in marine bivalves. Hemocyte membranes were also found to be very rich in ceramide aminoethylphosphonate (CAEP) and in sterols. The second step consisted in the study of the modifications of membrane lipid composition and cell functions potentially induced by disseminated neoplasia, in order to emerge structuro-functional links at the membrane level. For this purpose, circulating cells originating from healthy animals and from animals affected by disseminated neoplasia were compared in cockle from Arcachon Bay and in soft-shell clam from Prince-Edward-Island (Canada). In the case of cockles, a highly lower proportion of plasmalogen-NMI FA molecular species was observed in neoplastic cell membranes. This observation was associated to a lower phagocytic activity and a subcellular origin of reactive oxygen species (ROS) different. In soft-shell clams, n lower proportion of plasmalogen phosphatidylserine-20:1n-l1 molecular species was associated to a lower phagocytic activity in circulating cells of animals affected by disseminated neoplasia. Characteristics of disseminated neoplasia affecting cockles from Arcachon Bay appeared very different from the ones observed in soft-shell clam from Prince-Edward-Island, concerning particularly the ploidy of neoplastic cells but also their proliferation and the prevalence of the different development stages of the disease. A different progression of the pathology was suggested. This could explain the observed differences in membrane lipid structure alterations of neoplastic cells between the two species

Les résultats obtenus dans ce travail ont permis de démontrer que chez les deux bactéries lactiques modèles, L. lactis subsp. cremoris et O. oeni, la transcription du gène cfa, codant pour la Cfa synthase, est stimulée lorsque les cellules entrent en phase stationnaire de croissance ou lorque que les cellules sont cultivées en conditions de stress (milieu acide ou présence d'éthanol dans le milieu). Le rôle des CFA a pû être appréhendé par l'analyse physiologique comparative de la souche parentale L. lactis subsp. cremoris et du mutant Δcfa généré chez cette souche. Les forts pourcentages de survie obtenus chez les souches cultivées à pH 5,0, puis subissant un stress acide (pH 3,0), prouvent que la cyclopropanation des acides gras insaturés n'est pas indispensable à la survie de L. lactis subsp. cremoris en conditions de stress acide. En outre, les données d'anisotropie de fluorescence démontrent que la présence de CFAs membranaires ne permet pas de réguler le niveau de fluidité membranaire, en particulier avec les souches cultivées en présence d'éthanol, où une fluidification membranaire est observée dans tous les cas. L'hypothèse d'un équilibre entre les acides palmitoléique / cis-vaccénique / lactobacillique pour réguler la fluidité membranaire chez L. lactis subsp. cremoris est avancée. L'étude du rôle physiologique des CFA chez O. oeni nécessite l'expression du gène cfa de la bactérie en système hétérologue. Les résultats obtenus confirment la fonctionnalité du gène chez la bactérie hôte L. lactis subsp. cremoris, cependant la cyclisation du précurseur acide cis-vaccénique, reste partielle chez la souche mutante complémentée. Un travail de caractérisation biochimique in vitro de l'enzyme Cfa synthase de O. oeni a donc été entrepris afin d'expliquer la faible efficacité de l'enzyme de O. oeni chez la bactérie hôte. Les travaux réalisés ont permis la surproduction et la purification de l'enzyme. Une technique de mesure d'activité in vitro a été également développée. Une stratégie d'expression du gène cfa de O. oeni en système hétérologue dans la bactérie hôte E. coli BL21 Star a permis la surpoduction d'une protéine d'environ 45 kDa, en accord avec la masse moléculaire théorique de la Cfa synthase de O. oeni. A partir de l'extrait protéique, une purification a été réalisée par chromatographie d'affinité sur colonne d'agarose nickel. Les tests d'activité enzymatique in vitro ont pu été réalisés. La température optimale de l'enzyme est de 35,8°C. Son pH optimal est de 5,6. Même en se plaçant dans les conditions physico-chimiques optimales de l'enzyme, nous constatons que la cyclisation in vitro de l'acide cis-vaccénique issu des phospholipides membranaires du mutant L. lactis subsp. cremoris Δcfa reste partielle. Ceci induit une détermination expérimentale de valeurs de KM et Vmax largement supérieures aux données citées dans la littérature. La différence, entre les deux bactéries modèles, de nature et de répartition des phospholipides membranaires pourrait expliquer l'action partielle de la Cfa synthase de O. oeni.

L'objectif de cette thèse était de mettre en évidence les caractéristiques structuro-fonctionnelles d'un type cellulaire précis, les hémocytes de bivalves. Les outils analytiques tels que la chromatographie liquide haute performance (CLHP) et la chromatographie en phase gazeuse (CPG) ont permis une investigation approfondie des composants lipidiques membranaires. La composition détaillée des classes et sous-classes de phospholipides ainsi que les spécificités de leur composition individuelles en acides gras ont été mises en évidence. De plus, l'utilisation de la cytométrie en flux a permis de caractériser un certain nombre de fonctions hémocytaires ainsi que la ploïdie des hémocytes. La composition lipidique des membranes d'hémocytes chez quatre espèces de bivalves ; l'huître creuse Crassostrea gigas, la palourde Japonaise, Ruditapes philippinarum, la coque Cerastoderma edule et la mye Mya arenaria a été finement caractérisée. Parmi les particularités principales, une forte teneur en plasmalogènes enrichis en acides gras " non methylene interrupted " (NMI) et en 20:1n-11 a été mise en évidence pour la première fois dans des hémocytes. Ces acides gras présentent la particularité d'être biosynthétisés de novo par les bivalves marins. Les membranes des hémocytes sont également très riches en céramide aminoéthylphosphonate (CAEP) et en stérols. La seconde étape a consisté à étudier les modifications des compositions lipidiques membranaires et des fonctions cellulaires potentiellement induites par la néoplasie disséminée, afin de dégager des liens structuro-fonctionnels au niveau membranaire. Pour ce faire, les cellules circulantes provenant d'animaux sains et d'animaux atteints par la néoplasie disséminée ont été comparées chez la coque du Bassin d'Arcachon et la mye de l'Ile du prince Edouard (Canada). Dans le cas des coques, une proportion beaucoup plus faible d'espèces moléculaires plasmalogènes-acides gras NMI a été observée dans les membranes des cellules néoplasiques. Cette observation était associée à une activité phagocytaire plus faible et à une origine subcellulaire d'espèces réactives de l'oxygène (ERO) différente. Chez les myes, une plus faible proportion de l'espèce moléculaire phosphatidylsérine plasmalogène-20 :1n-11 associée une plus faible activité phagocytaire a été détectée dans les cellules circulantes des animaux affectés par la néoplasie disséminée. Les caractéristiques de la néoplasie disséminée chez la coque du Bassin d'Arcachon sont apparues très différentes de celles observées chez la mye de l'Ile du Prince Edouard, notamment au niveau de la ploïdie des cellules néoplasiques mais aussi de la prolifération cellulaire et de la prévalence des différents stades de développement de la maladie. Une progression différente de cette pathologie entre les deux espèces a été suggérée. Ceci pourrait expliquer les différences d'altérations des structures lipidiques membranaires des cellules néoplasiques entre ces deux espèces.

Les pathologies infectieuses d'origine alimentaire, en particulier les listérioses avec leur fort taux de létalité, demeurent un véritable problème de santé publique. Ubiquitaire et psychrotrophe, Listeria monocytogenes est fréquemment présente dans les environnements alimentaires (matières premières, chaîne de production), et peut contaminer de nombreuses denrées, telles que les produits prêt à consommer. Pour cette catégorie de produits, la réfrigération est la principale méthode permettant de maitriser la croissance du pathogène et de garantir la sécurité sanitaire du produit. Une étude préliminaire de l'équipe a montré que plusieurs souches de L. monocytogenes sont capables d'incorporer des acides gras exogènes dans leur membrane, ce qui provoque un changement dans leur capacité de croissance à basse température. En effet, les acides gras saturés (AGS) limitent la croissance, alors que les acides gras insaturés (AGI) la favorisent. La tendance actuelle visant à privilégier les AGI dans les aliments au détriment des AGS pour répondre à des recommandations nutritionnelles pourrait donc augmenter le risque de listériose des produits réfrigérés riches en lipides.Dans ce contexte, le but de ce travail était de mieux comprendre le comportement de L. monocytogenes à basse température dans des environnements riches en acides gras. Dans un premier temps, nous avons caractérisé, génotypiquement et phénotypiquement, la souche Lm208 qui présentait le taux de croissance le plus important à basse température en présence d'acide oléique dans l'étude préliminaire. Le génome a été séquencé, annoté, et enrichi. Nous avons ensuite complété l'étude phénotypique en évaluant la réponse de L. monocytogenes à différents acides gras en fonction de leur structure (longueur de chaîne, insaturations). Les AGI induisant, après incorporation, une température de fusion des phospholipides membranaires comprise entre 18 et 23°C (AGI à 18 carbones) permettent la plus importante augmentation de croissance de Lm208 à basse température.Dans un deuxième temps, nous avons mené des études transcriptomiques non ciblée et ciblée pour mettre en évidence l'expression de gènes en relation avec le phénotype étudié. L'analyse RNA seq globale sur quatre conditions (croissance avec ou sans supplémentation en acide oléique à 5°C et 37°C) a permis de sélectionner les gènes impliqués dans ce phénomène de surcroissance. Une analyse par RT qPCR a ensuite été conduite sur les gènes ciblés en élargissant le panel des conditions de culture testées. Parmi les gènes d'intérêt, fabK impliqué dans la voie de biosynthèse des acides gras, cheY et flaA impliqués dans la mobilité et l'assemblage des flagelles sont respectivement sur exprimés ou sous exprimés en présence d'AGI ou AGS. L'expression différentielle de fabK pourrait avoir un lien avec la régulation de la voie de biosynthèse des AGI versus AGS. La présence de flagelles très longs et nombreux en présence d'AGI à basse température a été confirmée par microscopie électronique à transmission. Ce phénotype remarquable pourrait avoir des conséquences sur la capacité de L. monocytogenes à former des biofilms et à persister dans les environnements de production.En conclusion, ce travail a confirmé l'effet promoteur de croissance de nombreux AGI sur L. monocytogenes à basse température, et a mis en évidence un phénotype associé correspondant à la synthèse de flagelles longs et nombreux, ce qui peut avoir d'importantes conséquences en termes de sécurité sanitaire des aliments riches en lipides et des environnements de production associés
Food-borne infectious diseases, especially listeriosis with its high case fatality rate, remain a real public health problem. Being ubiquitous and psychrotrophic, Listeria monocytogenes is frequently found in food environments (raw materials, production chain), and can contaminate numerous foodstuffs, such as ready to eat products (RTE). For RTE products, refrigeration is the main method for controlling pathogen growth and guaranteeing product food safety. A previous study performed in our laboratory showed that several strains of L. monocytogenes can incorporate exogenous fatty acids into their membranes, modifying their ability to grow at low temperature. Saturated fatty acids (SFA) limit growth, while unsaturated fatty acids (UFA) promote it. This ability could question new trends in reformulating food with unsaturated fatty acids to fit with nutritional claims that could increase the risk of listeriosis in lipid-rich refrigerated products.In this context, this work aimed at understanding the behavior of L. monocytogenes at low temperatures in fatty acid rich environments. First, we characterized, genotypically and phenotypically, Lm208, the strain that has shown the highest growth rate at low temperatures in the presence of oleic acid in the preliminary study. The genome was sequenced, annotated, and enriched. We then completed the phenotypic characterization by evaluating the behavior of L. monocytogenes in the presence of different FAs according to their structure (chain length, unsaturation). UFAs inducing, after incorporation, a membrane phospholipid melting temperature between 18 and 23°C (18 carbon UFA) enabled the greatest increase in Lm208 growth at low temperature.Secondly, we performed non targeted and targeted transcriptomic studies to study the gene expression related to the observed phenotype. Global RNA seq analysis over four conditions (growth with or without oleic acid supplementation at 5°C and 37°C) enabled us to select the genes involved in this overgrowth phenomenon. RT qPCR analysis was then carried out on the targeted genes, enlarging the range of culture conditions tested. Among the genes of interest, fabK, involved in the fatty acid biosynthesis pathway, and cheY and flaA, involved in flagellar mobility and assembly, were respectively over and under expressed in the presence of UFA or SFA. The differential expression of fabK could be linked to the regulation of the UFA versus SFA biosynthetic pathway. The presence of very long and numerous flagella in the presence of UFA at low temperatures was observed by transmission electron microscopy. This remarkable phenotype could be involved in the ability of L. monocytogenes to form biofilms and persist in production environments

L’objet de cette étude a été de vérifier l'incidence du gène ras1 sur les structures pariétales et membranaires de la levure Schizosaccharomyces pombe. L’analyse chimique des parois cellulaires a révélé des différences notamment dans les teneurs en protéines et en phosphore qui sont fortement augmentées chez les levures mutantes ras1- et ras1vaI17. Le fractionnement des glycoprotéines pariétales, isolées par traitement au SDS, montre que les deux mutants ras1 renferment plus de polymères charges représentes particulièrement par des phosphoprotéines. Ces polymères semblent fortement liés à la paroi, ils ne sont en effet libérés qu'après traitement par le SDS à chaud. La protéine correspondant à 31,5 kDa a une teneur significativement plus importante dans les parois des cellules mutantes ; elle possède une activité beta (1, 3) glucannase dont le rôle dans les modifications morphologiques des cellules ras1- ne doit pas être écarté. La mutation du gène ras1 induit aussi une activation du métabolisme des phospholipides membranaires. Les deux mutants ras1 présentent en effet une nette augmentation dans les teneurs des phosphatidylinositols (PI) et des phosphotidylserines (PS). Cette augmentation dans les taux des phospholipides anioniques est due probablement à l'association membranaire et l'activité biologique des protéines ras1. L’étude des stérols membranaires a mis en évidence du 24-méthylène dihydrolanosterol (eburicol). La présence de ce stérol en c31 plaide en faveur d'une voie de synthèse de l'ergostérol similaire à celle existant plutôt chez les champignons filamenteux que chez les levures

L’objectif de cette thèse a été d’élaborer une stratégie de détoxification la quantité d'un composé intracellulaire en permettant sa sortie hors de la cellule via l'utilisation d'un système d’efflux.L’hôte choisi pour cette étude est un nouvel organisme modèle, Deinococcus geothermalis. Nous avons utilisé les pompes d'efflux comme outils biologique pour permettre la sortie d'un composé devenu toxique en intracellulaire. Pour ce faire, nous avons dans un premier temps inséré par recombinaison homologue une sélection de gènes codant pour des pompes d’efflux hétérologues dans le chromosome de D. geothermalis. Puis la seconde étape a été de déterminé la susceptibilité des recombinants obtenus vis à vis de composés à forte valeur ajoutée. Un certain nombre de recombinants présentant une résistance plus élevée que la souche sauvage à plusieurs composés ont alors été sélectionnés. L'étape suivante a été de vérifier que le gain de résistance observé était effectivement dû à l’insertion dans l’enveloppe bactérienne d’une pompe d’efflux fonctionnelle. Pour ce faire, des tests d’efflux employant un marqueur fluorescent, le composé Hoechst 33342 ou avec un antibiotique fluorescent ont été réalisés. Nous avons réussi à obtenir la preuve de concept qu' un gène codant pour une pompe d'efflux hétérologue pouvait conduire à l'expression d'une protéine fonctionnelle chez D. geothermalis et cette protéine membranaire permettait la diminution la quantité intracellulaire d'un composé donné
The objective of this thesis was to develop a strategy for detoxifying the amount of an intracellular compound by allowing its exit from the cell through the use of an efflux system.The host chosen for this study is a new model organism, Deinococcus geothermalis. We used efflux pumps as biological tools to allow the release of a compound that became toxic intracellularly. To do this, we first inserted by homologous recombination a selection of genes encoding heterologous efflux pumps into the D. geothermalis chromosome. Then the second step was to determine the susceptibility of the recombinants obtained to high value-added compounds. A number of recombinants with higher resistance than the wild multi-compound strain were then selected. The next step was to verify that the observed resistance gain was indeed due to the insertion of a functional efflux pump into the bacterial shell. To do this, efflux tests using a fluorescent marker, Hoechst compound 33342 or with a fluorescent antibiotic were performed. We were able to obtain proof of concept that a gene encoding a heterologous efflux pump could lead to the expression of a functional protein in D. geothermalis and that this membrane protein allowed the intracellular amount of a given compound to be decreased

Les acides gras polyinsatures (agpi) des phospholipides membranaires jouent un role structural et fonctionnel. Les lipides alimentaires, en modifiant la composition en acides gras de la membrane cellulaire, peuvent influencer la fonction structuro-modulatrice de ces agpi. Si l'effet immunosuppresseur des agpi a longuement ete decrit, leur mecanisme d'action sur la reponse immunitaire reste encore mal connu. Nos resultats ont montre que la chaine du recepteur de l'il2 est plus exprimee sur des splenocytes de rats nourris avec un regime a base d'huile d'olive composee essentiellement d'acide oleique, par rapport a ceux provenant de rats nourris avec un regime a base d'huile de soja riche en agpi. La correlation entre la composition en acides gras de la membrane et les fonctions lymphocytaires a permis de souligner l'effet inverse de l'acide linoleique et de l'acide oleique. L'etude des microdomaines membranaires, connus pour etre riches en cholesterol et en sphingomyelines, nous a permis de mettre en evidence une composition lipidique particuliere a savoir un enrichissement en acide palmitique dans les phosphatidylcholines et en acide nervonique dans les sphingomyelines. Dans les microdomaines provenant de splenocytes de rats nourris avec un regime a base d'huile d'olive, l'enrichissement en cholesterol et en sphingomyelines a acide nervonique est de facon significative, plus important que dans ceux provenant de rats nourris avec un regime a base d'huile de soja. Le regime lipidique influence egalement les profils de tyrosine phosphorylation et la translocation de proteines telles que p56 l c k et zap-70 au niveau des microdomaines des lymphocytes stimules par l'anti cd3. Nos resultats suggerent que l'effet immunomodulateur des acides gras apportes par l'alimentation, pourrait s'expliquer par une modification de la structure lipidique des microdomaines membranaires, influencant ainsi la diffusion et le regroupement de proteines impliquees dans la signalisation.

O. oeni est une bactérie lactique responsable de la fermentation malolactique des vins. Un des mécanismes impliqués dans la survie de O. oeni dans ce milieu requière la synthèse de la protéine de stress de faible masse moléculaire (sHsp) Lo18. Cette sHsp exerce une activité de chaperon sur des substrats protéiques et lipidiques.Des variations de pH (5 à 9) ont permis de moduler l'oligomérisation de Lo18 in vitro et de démontrer que sa plasticité oligomérique est un élément clé pour ses activités. Des observations de la sHsp par microscopie électronique ont montré que Lo18 s'organise à pH 5 en un 16-mère composé de deux anneaux superposés ayant comme structure de base probable un dimère.La réponse adaptative de O. oeni a également été caractérisée suite à des stress fluidifiant sa membrane plasmique. Une étude transcriptomique a révélé une augmentation du taux de transcrits pour des gènes dont les produits interviennent dans la biosynthèse des acides gras membranaires saturés et insaturés lors d'un stress à l'alcool benzylique. Des approches physiologique, moléculaire et structurale ont permis de proposer un modèle décrivant l'action chronologique de Lo18 en lien avec ses deux activités de chaperon en réponse à un stress éthanol. Dès l'application du stress, Lo18 est fortement synthétisée et agit préférentiellement à la membrane sous une forme quaternaire simplifiée. O. oeni modifie alors sa composition en acides gras membranaires, affectant ainsi l'affinité de Lo18 pour la membrane ainsi que ses activités.Les résultats obtenus permettent non seulement, de mieux comprendre le fonctionnement et le rôle de Lo18 dans la réponse au stress de O. oeni mais aussi de mettre en exergue les mécanismes d'adaptation préservant l'intégrité de sa membrane cellulaire, élément essentiel dans la survie et la performance des ferments malolactiques dans le vin

Les microparticules (MP) sont des vésicules qui résultent du bourgeonnement des membranesdes cellules activées ou apoptotiques. Leur capacité à vectoriser des systèmes fonctionnelsexprimés par leurs cellules d’origine nous a conduit à explorer, la génération de plasmine àleur surface. Dans un premier travail, nous montrons que les MP dérivées de cellulesendothéliales (MPE) sont des surfaces catalytiques capables d’activer le plasminogène par lesystème de l’urokinase et de son récepteur (uPA/uPAR). Les MPE agissent comme desvecteurs de plasmine constituant une nouvelle voie dans la régulation des activitésprotéolytiques de l’endothélium. Dans un second travail, nous avons montré que l’uPA portéepar les cellules ou par les MPE est spécifiquement impliquée dans un mécanismereconnaissance du plasminogène lié à une autre surface biologique générant de la plasmine insitu avec une grande efficacité. Dans un troisième travail, nous montrons que cette activitéfibrinolytique est détectable sur les MP extraites de la circulation sanguine, où elle est plusspécifiquement portée par les sous populations endothéliales et leucocytaires. Cette activitéqui est dépendante de l’uPA mais aussi de l’activateur tissulaire du plasminogène, estmodulée dans des pathologies cardiovasculaires et auto-immunes. Dans une seconde partie, lapertinence de la mesure des MP comme biomarqueur en pratique clinique nous a amené ànous focaliser sur leurs méthodes d’analyse. En effet, à l’heure actuelle, l’évaluation dubénéfice apporté par les MP est limitée par un manque de standardisation des méthodologies.Dans ce travail, nous présentons une nouvelle stratégie de standardisation de la cytométrie enflux (CMF) et son évaluation dans le cadre d’une étude multicentrique utilisant des microbillesfluorescentes calibrées en taille. Enfin, nous discutons dans une revue les limitesactuelles de la CMF et les stratégies ou améliorations technologiques permettant de lesdépasser
Microparticles (MP) are small vesicles resulting from the blebbing of cell membranes in response to activation or apoptosis. Because they express functional molecules from their parent cells, plasmin generation at their surface has been explored. First we have shown that endothelial derived MP (EMP) promote plasminogen activation at their surface in an urokinase and its receptor (uPA/uPAR) dependant manner. Thus, plasmin generation by EMP constitutes a new pathway for the regulation of the endothelium proteolytic activities. Second, we have shown that cellular or MP uPA is specifically involved in the recognition and effective activation of plasminogen bound to another biological surface. Third, we have demonstrated that circulating endothelial and leukocytes MP bear this plasminogenolytic activity which it not only uPA but also tissue-type plasminogen activator dependant and modulate in pathological settings such as cardiovascular and auto-immune diseases. Supported by this work, a patent on a method to measure MP plasmin activity has been filed. In a second part, we focused on analytical methods available to measure MP. Indeed, there is an increasing interest to measure MP as biomarker in clinical practice. However, the evaluation of their input for patients is impeding by methodological concerns and a lack of standardization so far. In this work, we present a new strategy based a size-calibrated fluorescent beads for the standardization of flow cytometry (FCM). This approach was evaluated in a multicentre study. Finally, we reviewed the present limitation of the FCM for MP measurement and the strategies or technological improvements to overcome them