Letteratura scientifica selezionata sul tema "Chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC)"

Dans ce travail, nous avons effectué l'étude de la relation structure/fonction de la chymotrypsine bovine pancréatique glycosylée chimiquement par la glucosamine par l'utilisation de ces interactions avec des ions métalliques immobilisés. La méthode de glycosylation avec la protection de site actif par N-acétyl-L-tyrosinamide a permis de récupérer 75% de protéine et la quantité de sucre couplée covalement a varié de 3 à 6 résidus par mole. Cette modification chimique a diminué considérablement l'activité enzymatique de chymotrypsine. La perte de l'activité peut être expliquée par les changements conformationnelles dans le site de liaison au substrat. Les changements importants dans l'accessibilité de deux résidus histidine His 57 du site actif et His 40 du site de liaison au substrat ont été étudiés par les interactions de protéine avec le Cu (Il) immobilisé en utilisant deux méthodes : la chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) et l'électrophorèse capillaire d'affinité avec ions métalliques immobilisés (IMACE). La glycosylation semble produire deux populations différentes de protéines. Pour la partie majeure de chymotrypsine, l'absence de l'affinité pour IDA-Cu (Il) a été observée en conditions d'IMAC et IMACE. En même temps, la glycosylation chimique a augmenté l'affinité pour Cu (Il) immobilisé pour une autre partie de chymotrypsine. Dans les deux cas, l'affinité pour le chélate métallique a été estimée par les constantes de dissociation (KD) entre la protéine et le ligand IDA-Cu (Il). Le troisième axe de nos recherches concerne l'analyse de la thermostabilité de M-chymotrypsine après la glycosylation. Dans les conditions habituelles (tampon Tris), aucune augmentation de thermostabilité n'a pas été observée pour l'enzyme glycosylée. Cependant, lorsque le tampon borate est utilisé, nous avons observé un impact bénéfique de la glycosylation sur la thermostabilité de l'enzyme. Cette augmentation de la thermostabilité peut être expliquée par la formation des nouvelles liaisons ester entre les groupements diols des sucres et des ions borate qui joue un rôle de "couche protectrice" autour du site actif de IU -chymotrypsine. Dans ce cadre, l'IMAC a été utilisée pour mesurer l'influence de ces ions sur un changement éventuel de la conformation de protéine. Aucune différence n'a pas été observée entre l'enzyme glycosylée et l'enzyme glycosylée préalablement incubée en présence d'ions borate. Les ions borate influencèrent la thermostabilité de l'enzyme glycosylée uniquement par la stabilisation de sa structure tertiaire.

Les peptides chélateurs de métaux (PCMs), issus d'hydrolysats de protéines, présentent diverses applications dans les domaines de la nutrition, de la pharmacie, des cosmétiques, etc. Cependant, l'approche empirique généralement utilisée pour découvrir des peptides bioactifs à partir d'hydrolysats est longue et coûteuse en raison de nombreuses étapes de fractionnement, de séparation et d'évaluation des activités biologiques. Cette thèse a donc pour but de développer une nouvelle approche pour la prédiction de la séparation des PCMs en utilisant la modélisation et la simulation chromatographiques basées sur l'analogie entre la chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC) et la résonance plasmonique de surface (SPR). Pour la première fois, l'analogie SPR-IMAC a été étudiée expérimentalement sur 22 peptides et 70% d'entre eux ont validé cette analogie, puisque les peptides bien retenus en IMAC étaient également dotés d'une bonne affinité pour Ni2+ en SPR. Dans un deuxième temps, des peptides ayant une forte affinité pour Ni2+ (c'est-à-dire une faible constante de dissociation KD en SPR et un temps de rétention élevé en IMAC) ont été utilisés pour étudier la simulation des profils de concentration de peptides à la sortie de la colonne en IMAC. La connaissance des isothermes d'adsorption étant nécessaire pour effectuer la simulation, il a fallu développer une méthodologie pour prédire les paramètres de l'isotherme de Langmuir en IMAC à partir des données SPR. La simulation a été évaluée en comparant les temps de rétention expérimentaux et simulés qui devraient être proches pour une prédiction fiable. Par conséquent, plusieurs approches ont été étudiées pour déterminer les paramètres de sorption de Langmuir. L‘approche la plus intéressante a introduit un facteur correctif sur la capacité d'adsorption maximale qmax seulement. En effet, l'affinité des peptides pour le Ni2+ immobilisé étant supposée constante quelle que soit technologie utilisée (SPR vs. IMAC), la constante d'affinité KA n'a pas été modifiée. Parallèlement, les applications industrielles des PCMs et des hydrolysats peptidiques ont été étudiées. Tout d'abord, des hydrolysats de protéines de pois ont été produits par protéolyse enzymatique soit avec l'Alcalase® suivi de la Flavourzyme® (Alc+Flav≤1kDa), soit par la Protamex® suivi de la Flavourzyme® (Prot+Flav≤1kDa). La technologie SwitchSENSE® a mis en évidence la présence de peptides chélateurs de Ni2+ et les tests antioxydants ont montré que l'hydrolysat Prot+Flav≤1kDa avait une activité antiradicalaire et un pouvoir réducteur plus élevés, liés à son degré d'hydrolyse plus élevé et à la quantité de peptides de petite taille. Les hydrolysats de protéines de pois et les PCMs ont ensuite été étudiés pour leur capacité à inhiber l'oxydation des lipides dans les émulsions. Ils ont ralenti l'oxydation des lipides par chélation des métaux pro-oxydants (tels que Fe2+) en réduisant les produits d'oxydation primaires et secondaires, responsables de la détérioration des produits contenant des lipides. Ainsi, les hydrolysats de pois et les PCMs pourraient être utilisés comme antioxydants dans les produits alimentaires et cosmétiques, comme alternatives aux produits chimiques tels que l'EDTA, le BHT et le TBHQ
Metal-Chelating Peptides (MCPs), from protein hydrolysates, present various applications in nutrition, pharmacy, cosmetic etc. Yet, the empirical approach generally used to discover bioactive peptides from hydrolysates is time consuming and expensive due to many steps of fractionation, separation and biological activities evaluation. Thus, this PhD aimed to develop a novel approach for MCPs separation prediction using chromatography modelling and simulation based on the analogy between Immobilized Metal ion Affinity Chromatography (IMAC) and Surface Plasmon Resonance (SPR). For the first time, the SPR-IMAC analogy was experimentally investigated on 22 peptides and 70% of them validated this analogy, since peptides well retained in IMAC were also endowed with a good affinity for Ni2+ in SPR. In the second time, peptides with high affinity for Ni2+ (i.e low dissociation constant KD in SPR and a high retention time in IMAC) were used to study the modelling and simulation of peptide concentration profiles at the column outlet in IMAC. Since knowledge of adsorption isotherms was required to perform simulation, it was necessary to develop a methodology for predicting Langmuir isotherm parameters in IMAC from SPR data. The validity of simulation was evaluated by comparing experimental and simulated retention times that should be close for reliable prediction. Therefore, several approaches were evaluated to determine Langmuir sorption parameters, the most interesting one introduces a correction factor on the maximum adsorption capacity qmax alone, assuming that the affinity of peptides for immobilized Ni2+ did not change depending on the technology used (SPR vs. IMAC), thus affinity constant KA was not modified. Meanwhile, industrial application of MCPs and hydrolysates were studied. First, pea protein hydrolysates were produced by either Alcalase® followed by Flavourzyme® (Alc+Flav≤1kDa) or Protamex® followed by Flavourzyme® (Prot+Flav≤1kDa). SwitchSENSE® technology evidences the presence of Ni2+ chelating peptides and antioxidants tests showed that Prot+Flav≤1kDa has higher radical scavenging and reducing power, related to its higher degree of hydrolysis and small-size peptides quantity. Secondly, pea hydrolysates and MCPs were investigated for their ability to inhibit the lipid oxidation in emulsions. They slowed down lipid oxidation through chelation of prooxidant (metals such as Fe2+) reducing primary and secondary oxidation products responsible of deterioration of lipid containing products. Thus, pea hydrolysates and MCPs could be used as antioxidants in food and cosmetic products, as alternative to chemicals such as EDTA, BHT and TBHQ

Nous nous sommes intéressés à un système végétal, la pomme de terre (PdT), pour tenter d'obtenir à partir de l'amidon des dérivés à valeur ajoutée tel que le fructose. Les constructions génétiques de deux enzymes : l'&-amylase (& -Amyl) et la glucose-isomérase (Gl) thermostables d'origine microbienne, ont été donc introduites dans la génome de la plante. Notre travail consiste en la purification et la caractérisation de la protéine chimérique «& -Amyl/Gl à partir de tubercules de PdT transgéniques. Nous avons tout d'abord mis en évidence par Chromatographie d'Affinité pour les Ions Métalliques Immobilisés (IMAC), trois groupes d'enzymes amylolytiques de PdT témoins récoltés en champs, Une hétérogénéité moléculaire et l'existence de formes multiples d'enzymes amylolytiques d'origine végétale contrairement à celles d'origines microbienne et mam-mifère ont été ensuite mises en évidence. De plus, des changements métaboliques ont été constatés au cours du vieillissement et de la germination des tubercules. Le travail sur les PdT transgéniques nous a permis de montrer l'existence d'une protéine de 100 kDa pouvant correspondre à la protéine chimère mais dépourvue d'activité amylolytique, En revanche, les protéines de 44 et 20 kDa possédant l'activité amylolytique se sont révélées être actives à 37 et 60°C. Nous n'avons pas constaté d'augmentation de taux du fructose dans le cas des PdT transgéniques ce qui peut signifier la fragilité et/ou l'instabilité de la protéine chimérique au fil des différentes générations. De plus, les différences morphologiques de PdT transgénique traduisent des changements métaboliques probablement dus au transgénèse. Le deuxième volet de la thèse en co-tutelle consiste en la purification et la caractérisation de B-galactosidases d'Aspergillus oryzae. Grâce à l'IMAC sur Cu(ll) chélaté suivie par un tamissage moléculaire, nous avons purifié les S-galactosidases provenant de la couche parentale et de la souche mutée. La B-galactosidase recombi¬nante s'est révélée plus active et plus thermostable que l'enzyme de la souche parentale.

La production de protéines dans les plantes transgéniques nécessite la mise au point de techniques de purification simples et efficaces, et la caractérisation fine des changements structuraux, en particulier des modifications post-translationnelles. L'étude de ces modifications a été réalisée en utilisant comme modèle la sporamine, protéine présente naturellement dans la patate douce. Les méthodes de purification et d'analyse ont été développées sur la sporamine de patate douce, puis adaptées à différentes constructions de sporamine recombinante exprimées dans le tabac. La chromatographie d'affinité avec les ions métalliques immobilisés (IMAC) a été utilisée comme outil de purification. Une analyse fine des modifications a été réalisée par spectrométrie de masse en mode électrospray (ESI-MS). La rétention de la sporamine de patate douce est observée sur gel Sépharose-6B-IDA-Cu(ll). L'analyse par SDS-PAGE et western blot montre que la sporamine est éluée à 6mM d'imidazole, totalement purifiée. L'analyse par ESI-MS permet de détecter plusieurs entités, mettant ainsi en évidence des modifications très fines au niveau du site de clivage du propeptide. Pour les différentes constructions exprimées dans le tabac, plusieurs fractions (éluées majoritairement à 5 et/ou 10 mM d'imidazole), contenant la sporamine, ont été obtenues. La masse de la ou des différentes entités présentes dans ces fractions peut être déterminée avec précision par ESI-MS. La maturation des différentes constructions de sporamine recombinante peut alors être étudiée. Cette approche nouvelle offre l'avantage d'être à la fois plus sensible (détection d'espèces minoritaires) et plus précise (analyse de la masse, à l'échelle de l'acide aminé) que les méthodes classiques utilisées jusqu'alors.

Depuis les années 1990, les oligomères du chitosane (COS) suscitent un intérêt croissant pour certaines applications biomédicales et alimentaires. Il est possible d'obtenir différents ratios d'oligomères à des degrés de polymérisation (DP) variant de 2 à 8 unités, selon le procédé d'hydrolyse du chitosane employé (chimique ou enzymatique). Il est difficile d'étudier leurs effets tant physiques que biochimiques de façon individuelle car ces oligomères sont difficiles à séparer et jusqu'à maintenant, leur commercialisation est limitée. Tout comme le chitosane, les oligomères possèdent des propriétés de complexation avec des ions métalliques de transition. Plusieurs facteurs interviennent lors de la formation de complexes avec le chitosane, notamment le pH, le degré de polymérisation (DP) ainsi que l'ion métallique. Le travail élaboré dans ce mémoire s'est basé sur l'hypothèse d'une séparation possible d'un mélange de COS (dimère, trimère, tétramère) en faisant intervenir l'affinité avec des ions métalliques en fonction du DP. Nous proposons ainsi une méthode chromatographique basée sur l'affinité entre les ions métalliques cuivre (II) et les groupements amine des oligomères de chitosane. La chromatographie d'affinité sur des ions métalliques immobilisés (IMAC) est déjà appliquée à la purification de biomacromolécules (protéines, ADN). L'adaptation de ce type chromatographique à notre problématique montre un réel intérêt car le développement du système est économique et simple d'utilisation. Des matériaux polyhydroxyliques (Agarose et silice) ont été fonctionnalisés par des groupements de type IMAC. Différentes fonctions chélatantes ont été greffés sur la Sepharose CL-6B (agarose réticulé): l'acide iminodiacétique (IDA), l'acide aspartique carboxyméthylé (CM-Asp) et le tris(carboxymethyl)diamine (TED). Ces matrices ont été caractérisées par FTIR et leurs capacités de rétention de Cu2+ par spectrophotométrie d'adsorption atomique (AAS). Un mélange commercial de COS (dimère, trimère, tétramère) fourni par ISM Biopolymer inc, a été utilisé pour l'étude sur les capacités de rétention. Les différents supports IMAC à base d'agarose (ACL6B) ont montré des quantités de rétention en COS respectivement de 6 mg/cm³, 4 mg/cm³ et 2 mg/cm³ sur les matrices modifiées (ACL6B-IDA, ACL6B-CM-Asp, ACL6B-TED). Les matériaux chromatographiques IMAC ont été employés en mode FPLC (à pression moyenne). Les fractions obtenues ont été analysées par une technique colorimétrique à base d'acide bicinconinique (BCA) et par chromatographie en couche mince avec la détection des oligomères à la ninhydrine. Les résultats sont corrélés avec l'analyse de la population retrouvée des différentes fractions par spectrométrie de masse quadripôle simple. Les oligomères de chitosane ont été partiellement séparés et/ou enrichis (selon la méthode employée) à 95 % pour le dimère, 70 % pour le trimère et 90 % pour le tétramère, avec nos matériaux chélatants obtenus au laboratoire, à base d'agarose réticulée. Ces résultats sont nettement supérieurs à ceux obtenus avec des matériaux chromatographiques commerciaux (Profinity, Chelex-100). Cette nouvelle méthode originale, à base de chromatographie d'affinité IMAC, offre des possibilités de diversification d'applications des COS et pourrait permettre de diminuer les coûts de revient lors de leur préparation à l'échelle industrielle. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Chitosane, Chitooligosaccharide (COS), Chromatographie d'affinité sur ions métalliques immobilisés (IMAC).