Tesi sul tema "Cellulose – Microbiology"

The occurrence of multiple cellulase components of Trichoderma harzianum E58 and the implications of their existence on the hydrolysis of cellulose were examined. A single commercial enzyme preparation, Novo-Celluclast, showed different extents of hydrolysis of several cellulosic substrates over time. The filter paper activities of six batches of T. harzianum E58 showed poor correlation with the ability of these enzymes to hydrolyze other cellulosic substrates over extended periods of time. Hydrolysis of a single substrate by a single enzyme preparation resulted in similar slopes in reducing sugar production with enzyme concentration, between one-hour and twenty-four-hour hydrolyses. The multiplicity of the cellulase components of T. harzianum E58 was examined, and the number of endoglucanase components and their specificities towards $\beta$-1,4-linkages were studied. Several types of endoglucanases were produced by the fungus. The role of the exoglucanase was examined using sub-saturation concentrations of T. harzianum E58 cellulase. No significant increase in hydrolysis was observed when purified exoglucanase was added to the cellulase mixture. The high proportion of non-specific endoglucanases and the need for an efficient endoglucanase-to-exoglucanase ratio are discussed in terms of a modified model for cellulose hydrolysis. (Abstract shortened by UMI.)

Thesis (M.Sc. (Microbiology)) --University of Limpopo, 2013
The production of cellulase is a key factor in the hydrolysis of cellulosic materials and it is essential to make the process economically viable. Cellulases are the most studied multi- enzyme complex and comprise of endo-glucanases (EG), cellobiohydrolases (CBH) and β- glucosidases (BGL). The complete cellulase system; comprising CBH, EG and BGL components thus acts synergistically to convert crystalline cellulose to glucose. Cellulases are currently the third largest industrial enzyme worldwide. This is due to their wide applications in cotton processing, paper recycling, juice extraction, as detergent enzymes and additives in animal feed. In this study, production of cellulase by five fungal isolates (BTU 251-BTU 255) isolated from mushrooms, was investigated and optimised. Internal transcribed spacer regions (ITS1 and ITS4) were applied to identify the five fungal microorganisms. Isolates were identified as follows: BTU 251 as Aspegillus niger,BTU 253 as Penicillium polonicum, and BTU 255 as Penicillium polonicum. Cellulase was produced in shake flask cultures using Mandel’s mineral solution medium and Avicel as a carbon source. Cellulase activity was tested using 3, 5-Dinitrosalicylic acid assay and zymography, A. niger BTU 251 showed five activity bands ranging from 25- 61 kDa had an average nkat of 7000. Cultures from BTU 252 were the least active with an average nkat/ml of 200 and one activity band of 25 kDa. P. polonicum BTU 253 showed three activity bands ranging between 45 and 60 kDa and had an average nkat/ml of 2200. BTU 254 showed five activity bands ranging from 22- 116 kDa and had average nkat of 350. P. polonicum BTU 255 produced the highest cellulase activity of 8000 nkat/ml and with three activity bands estimated at 45-60 kDa on zymography. The optimal temperature for activity of the cellulases was between 55-70°C and enzymes were most active within a pH range of 4-6. Optimal pH for production of cellulases by P. polonicum BTU 255, P. polonicum BTU 253 and A. niger BTU 251 was 4 while optimal temperature for production of the cellulases was between 50-55°C. Total cellulase activity was determined using Whatman No.1 filter paper as a substrate and β- glucosidase production was determined in polyacrylamide gels using esculin as a substrate. In the hydrolysis of crystalline cellulose (Avicel), a combination of A. niger BTU 251 and P. polonicum BTU 255 (1:1), (1:9), (1:3), and (1:2) produced maximum glucose as follows: 1:1 (0.83g/L), 1:9 (10.4g/L), 1:3 (0.77g/L) and 1:2 (0.73g/L). Cellulases from P. polonicum BTU 255 were partially purified using affinity precipitation and analysed using MALDI- TOF/TOF. Peptide sequences of P. polonicum obtained from MALDI-TOF/TOF analysis were aligned by multiple sequence alignment with C. pingtungium. Conserved regions were identified using BLAST anaylsis as sequences of cellobiohydrolases. More research is required in producing a variety of cellulases that are capable of hydrolysing crystalline cellulose, the current study contributes to possible provision of locally developed combinations of cellulases that can be used in the production of bioethanol.

The action of many antimicrobial agents is dependent on their ability to interact with biological membranes. A group of polypeptide antibiotics was found to have surface activite properties. One of them, gramicidinS, produced a minimum in the surface tension curve, which was attributed to instabilities in the intra-molecular hydrogen bonds. Biosurfactants were found to have a great effect on the two phase hydrolysis of cellulose by cellulase. Seven times as much sugar was produced by the hydrolysis of Sigmacell 100 when the biosurfactant sophorolipid was present. The surfactant affects the adsorption of cellulase onto cellulose, and prevents the cellulase from binding irreversibly to the cellulose and becoming inactive.

Dissertation (PhD)--Stellenbosch University, 2007.
PCT patent registered: https://www.google.com/patents/WO2009034414A1?cl=en&dq=pct/ib2007/004098&hl=en&sa=X&ei=b7AxUsSZK4jB0gWi14HgCQ&ved=0CEkQ6AEwAg USA: https://www.google.com/patents/US20110129888?dq=pct/ib2007/004098&ei=b7AxUsSZK4jB0gWi14HgCQ&cl=en
USA patent registered: https://www.google.com/patents/US20110129888?dq=pct/ib2007/004098&ei=b7AxUsSZK4jB0gWi14HgCQ&cl=en
ENGLISH ABSTRACT: The conversion of cellulosic biomass into fuels and chemicals has the potential to positively impact the South African economy, but is reliant on the development of low-cost conversion technology. Perhaps the most important progress to be made is the development of “consolidated bioprocessing” (CBP). CBP refers to the conversion of pretreated biomass into desired product(s) in a single process step with either a single organism or consortium of organisms and without the addition of cellulase enzymes. Among the microbial hosts considered for CBP development, Saccharomyces cerevisiae has received significant interest from the biotechnology community as the yeast preferred for ethanol production. The major advantages of S. cerevisiae include high ethanol productivity and tolerance, as well as a well-developed gene expression system. Since S. cerevisiae is non-cellulolytic, the functional expression of at least three groups of enzymes, namely endoglucanases (EC 3.2.1.4); exoglucanases (EC 3.2.1.91) and β-glucosidases (EC 3.2.1.21) is a prerequisite for cellulose conversion via CBP. The endo- and exoglucanases act synergistically to efficiently degrade cellulose to soluble cellodextrins and cellobiose, whereas the β-glucosidases catalyze the conversion of the soluble cellulose hydrolysis products to glucose. This study focuses on the efficient utilization of cellobiose by recombinant S. cerevisiae strains that can either hydrolyse cellobiose extracellularly or transport and utilize cellobiose intracellularly. Since it is generally accepted that S. cerevisiae do not produce a dedicated cellobiose permease/transporter, the obvious strategy was to produce a secretable β-glucosidase that will catalyze the hydrolysis of cellobiose to glucose extracellularly. β-Glucosidase genes of various fungal origins were isolated and heterologously expressed in S. cerevisiae. The mature peptide sequence of the respective β-glucosidases were fused to the secretion signal of the Trichoderma reesei xyn2 gene and expressed constitutively from a multi-copy yeast expression vector under transcriptional control of the S. cerevisiae PGK1 promoter and terminator. The resulting recombinant enzymes were characterized with respect to pH and temperature optimum, as well as kinetic properties. The maximum specific growth rates (μmax) of the recombinant strains were compared during batch cultivation in high-performance bioreactors. S. cerevisiae secreting the recombinant Saccharomycopsis fibuligera BGL1 enzyme was identified as the best strain and grew at 0.23 h-1 on cellobiose (compared to 0.29 h-1 on glucose). More significantly, was the ability of this strain to anaerobically ferment cellobiose at 0.18 h-1 (compared to 0.25 h-1 on glucose). However, extracellular cellobiose hydrolysis has two major disadvantages, namely glucose’s inhibitory effect on the activity of cellulase enzymes as well as the increased risk of contamination associated with external glucose release. In an alternative approach, the secretion signal from the S. fibuligera β-glucosidase (BGL1) was removed and expressed constitutively from the above-mentioned multi-copy yeast expression vector. Consequently, the BGL1 enzyme was functionally produced within the intracellular space of the recombinant S. cerevisiae strain. A strategy employing continuous selection pressure was used to adapt the native S. cerevisiae disaccharide transport system(s) for cellobiose uptake and subsequent intracellular utilization. RNA Bio-Dot results revealed the induction of the native α-glucoside (AGT1) and maltose (MAL) transporters in the adapted strain, capable of transporting and utilizing cellobiose intracellularly. Aerobic batch cultivation of the strain resulted in a μmax of 0.17 h-1 and 0.30 h-1 when grown in cellobiose- and cellobiose/maltose-medium, respectively. The addition of maltose significantly improved the uptake of cellobiose, suggesting that cellobiose transport (via the combined action of the maltose permease and α-glucosidase transporter) is the rate-limiting step when the adapted strain is grown on cellobiose as sole carbon source. In agreement with the increased μmax value, the substrate consumption rate also improved significantly from 0.25 g.g DW-1.h-1 when grown on cellobiose to 0.37 g.g DW-1.h-1 upon addition of maltose to the medium. The adapted strain also displayed several interesting phenotypical characteristics, for example, flocculation, pseudohyphal growth and biofilm-formation. These features resemble some of the properties associated with the highly efficient cellulase enzyme systems of cellulosome-producing anaerobes. Recombinant S. cerevisiae strains that can either hydrolyse cellobiose extracellularly or transport and utilize cellobiose intracellularly. Both recombinant strains are of particular interest when the final goal of industrial-scale ethanol production from cellulosic waste is considered. However, the latter strain’s ability to efficiently remove cellobiose from the extracellular space together with its flocculating, pseudohyphae- and biofilm-forming properties can be an additional advantage when the recombinant S. cerevisiae strain is considered as a potential host for future CBP technology.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Die omskakeling van sellulose-bevattende biomassa na brandstof en chemikalieë beskik oor die potensiaal om die Suid-Afrikaanse ekonomie positief te beïnvloed, indien bekostigbare tegnologie ontwikkel word. Die merkwaardigste vordering tot dusvêr kon in die ontwikkeling van “gekonsolideerde bioprosessering” (CBP) wees. CBP verwys na die eenstap-omskakeling van voorafbehandelde biomassa na gewenste produkte met behulp van ‘n enkele organisme of ‘n konsortium van organismes sonder die byvoeging van sellulase ensieme. Onder die mikrobiese gashere wat oorweeg word vir CBP-ontwikkeling, het Saccharomyces cerevisiae as die voorkeur gis vir etanolproduksie troot belangstelling by die biotegnologie-gemeenskap ontlok. Die voordele van S. cerevisiae sluit in hoë etanol-produktiwiteit en toleransie, tesame met ‘n goed ontwikkelde geen-uitdrukkingsisteem. Aangesien S. cerevisiae nie sellulose kan benut nie, is die funksionele uitdrukking van ten minste drie groepe ensieme, naamlik endoglukanases (EC 3.2.1.4); eksoglukanases (EC 3.2.1.91) en β-glukosidases (EC 3.2.1.21), ‘n voorvereiste vir die omskakeling van sellulose via CBP. Die sinergistiese werking van endo- en eksoglukanases word benodig vir die effektiewe afbraak van sellulose tot oplosbare sello-oligosakkariede en sellobiose, waarna β-glukosidases die finale omskakeling van die oplosbare sellulose-afbraak produkte na glukose kataliseer. Hierdie studie fokus op die effektiewe benutting van sellobiose m.b.v. rekombinante S. cerevisiae-rasse met die vermoeë om sellobiose ekstrasellulêr af te breek of dit op te neem en intrasellulêr te benut. Aangesien dit algemeen aanvaar word dat S. cerevisiae nie ‘n toegewyde sellobiosepermease/ transporter produseer nie, was die mees voor-die-hand-liggende strategie die produksie van ‘n β-glukosidase wat uitgeskei word om sodoende die ekstrasellulêre hidroliese van sellobiose na glukose te kataliseer. β-Glukosidase gene is vanaf verskeie fungi geïsoleer en daaropvolgend in S. cerevisiae uitgedruk. Die geprosesseerde peptiedvolgorde van die onderskeie β-glukosidases is met die sekresiesein van die Trichoderma reesei xyn2-geen verenig en konstitutief vanaf ‘n multikopie-gisuitdrukkingsvektor onder transkripsionele beheer van die S. cerevisiae PGK1 promotor en termineerder uitgedruk. Die gevolglike rekombinante ensieme is op grond van hul pH en temperatuur optima, asook kinetiese eienskappe, gekarakteriseer. Die maksimum spesifieke groeitempos (μmax) van die rekombinante rasse is gedurende aankweking in hoë-verrigting bioreaktors vergelyk. Die S. cerevisiae ras wat die rekombinante Saccharomycopsis fibuligera BGL1 ensiem uitskei, was as the beste ras geïdentifiseer en kon teen 0.23 h-1 op sellobiose (vergeleke met 0.29 h-1 op glukose) groei. Meer noemenswaardig is the ras se vermoë om sellobiose anaërobies teen 0.18 h-1 (vergeleke met 0.25 h-1 op glukose) te fermenteer. Ekstrasellulêre sellobiose-hidroliese het twee groot nadele, naamlik glukose se onderdrukkende effek op die aktiwiteit van sellulase ensieme, asook die verhoogde risiko van kontaminasie wat gepaard gaan met die glukose wat ekstern vrygestel word. ’n Alternatiewe benadering waarin die sekresiesein van die S. fibuligera β-glucosidase (BGL1) verwyder en konstitutief uitgedruk is vanaf die bogenoemde multi-kopie gisuitrukkingsvektor, is gevolg. Die funksionele BGL1 ensiem is gevolglik binne-in die intrasellulêre ruimte van die rekombinante S. cerevisiae ras geproduseer. Kontinûe selektiewe druk is gebruik om die oorspronklike S. cerevisiae disakkaried-transportsisteme vir sellobiose-opname and daaropvolgende intrasellulêre benutting aan te pas. RNA Bio-Dot resultate het gewys dat die oorspronklike α-glukosied (AGT1) en maltose (MAL) transporters in die aangepaste ras, wat in staat is om sellobiose op te neem en intrasellulêr te benut, geïnduseer is. Aërobiese kweking van die geselekteerde ras het gedui dat die ras teen 0.17 h-1 en 0.30 h-1 groei in onderskeidelik sellobiose en sellobiose/maltose-medium. Die byvoeging van maltose het die opname van sellobiose betekenisvol verbeter, waarna aangeneem is dat sellobiose transport (via die gekombineerde werking van die maltose permease en α-glukosidase transporter) die beperkende stap gedurende groei van die geselekteerde ras op sellobiose as enigste koolstofbron is. In ooreenstemming hiermee, het die substraatbenuttingstempo ook betekenisvol toegeneem van 0.25 g.g DW-1.h-1, gedurende groei op sellobiose, tot 0.37 g.g DW-1.h-1 wanneer maltose by die medium gevoeg word. Die geselekteerde ras het ook verskeie interessante fenotipiese kenmerke getoon, byvoorbeeld flokkulasie, pseudohife- en biofilm-vorming. Hierdie eienskappe kom ooreen met sommige van die kenmerke wat met die hoogs effektiewe sellulase ensiem-sisteme van sellulosomeproduserende anaerobe geassosieer word. Hierdie studie beskryf die suksesvolle konstruksie van ‘n rekombinante S. cerevisiae ras met die vermoë om sellobiose ekstrasellulêr af te breek of om dit op te neem en intrasellulêr te benut. Beide rekombinante rasse is van wesenlike belang indien die einddoel van industriële-skaal etanolproduksie vanaf selluloseafval oorweeg word. Die laasgenoemde ras se vermoë om sellobiose effektief uit die ekstrasellulêre ruimte te verwyder tesame met die flokkulasie, pseudohife- en biofilm-vormings eienskappe kan ‘n addisionele voordeel inhou, indien die rekombinante S. cerevisiae ras as ‘n potensiële gasheer vir toekomstige CBP-tegnologie oorweeg word.

The major fraction of microbial communities cannot be cultivated by artificial means in the laboratory. In order to access the full diversity of microbial life in the open environment it is necessary to employ culture independent methods. Molecular biology and now metagenomics have enabled the phylogenetic and functional investigation of microbial communities without isolation and cultivation of organisms and has led to a new appreciation of the breadth of diversity of microbes on Earth and to the discovery and characterisation of new enzymes. Here, molecular biological techniques have been applied to the study of microbial communities specifically in anaerobic environments and with an emphasis on those involved in the primary degradation of plant cellulosic biomass. Quantitative PCR was used to assess the presence of cellulolytic bacteria both in landfill leachate and specifically in association with cotton cellulose “baits” maintained in leachate microcosms. Lineages of clostridia previously associated with cellulose degrading strains were detected in all five of the landfill leachate samples, and Fibrobacter spp. were detected at low abundance (2.3% of total bacteria) in one sample. Clostridia Group III and Fibrobacter spp. were enriched on the surface of a bait (17% and 29% of total bacteria, respectively) that was rapidly degraded by the colonising community and were present in low abundance (< 1%) and absent, respectively, on another colonised by a community which did not exhibit any degradation of the cellulose. The observed correlation between high levels of cellulose degradation and presence Fibrobacter spp. demonstrates a cellulolytic role outside of the gut environment for these organisms the first time. A metatranscriptome was prepared from a set of cotton cellulose baits maintained in a lake sediment for 2-8 weeks, and Illumina sequencing was used to generated ca. 7 million paired-end reads. Just under one million putative protein coding sequences were identified and of these, MEGAN analysis determined that 40% had no blast hit to the NCBI NR database suggesting that a large number of unknown sequences were present. Analysis of this metatranscriptome and a metagenome produced from the same site revealed that bacteria accounted for 75% of the protein coding sequences and 97% of the metagenome. Genes with matches to cellulolytic lineages of clostridia were found to be present and Fibrobacter sequences were also detected in both of these datasets further demonstrating their presence in the wider environment as probable cellulose degraders ORF prediction and HMM searching were used to search for expressed cellulases in the metatranscriptome and identified 503 sequences with high similarity to glycoside hydrolase protein families, representing carbohydrate active enzymes with possible cellulolytic activity. Of these 112 were also found to have representatives in the metagenome with 100% sequence similarity. All of these sequences had a low level of identity to entries in the NCBI NR database indicating the discovery of previously unknown genes. A fosmid library was produced from the same DNA used to generate the metatranscriptome and it is possible that full-length copies of the expressed genes identified in silico will have been captured. This fosmid library can be interrogated accordingly using probe and PCR primer sequences designed using the curated metatranscriptome dataset. In this way, potentially novel cellulases can be discovered for biochemical characterisation, genetic manipulation and biotechnological exploitation.

Cellulosic materials are expected to form a significant proportion of the waste proposed for disposal in underground repositories being designed for the storage of radioactive waste. Under the alkaline conditions of these facilities, cellulose degrades by a so called „peeling‟ reaction resulting in the production of a complex mixture of products (CDPs), the major components being α- and β isosaccharinic acid (α and β-ISA). A significant amount of research has been performed on ISA as part of the safety assessment for the development of these underground repositories due to the ability of ISA to complex with, and increase the solubility of radioactive isotopes. Until now, the vast majority of this research has involved the readily-available α-ISA, only a limited number of studies have involved β-ISA because no simple procedure is available for its isolation. Therefore, in this project, a method for the synthesis and isolation of β-ISA was developed. Cellulose degradation experiments which were performed to maximise solution concentrations of β-ISA are described in chapter 3. Microcrystalline cellulose was degraded under anaerobic conditions at either RT, 50 °C or 90 °C and comparisons were made between the use of NaOH and Ca(OH)2 as the base catalyst. As expected, the major products of all degradation reactions were α- and β-ISA, in addition, small amounts of free metasaccharinic acid (MSA) was detected in the Ca(OH)2 reactions. The largest solution concentrations of β-ISA were produced when cellulose was degraded at 90 °C using NaOH; after 24 hrs of reaction, solution concentrations of 12.7 g L-1 were achieved, whereas, in the equivalent Ca(OH)2 reaction, after 4 days a maximum concentration of only 5.1 g L-1was produced. For this reason, cellulose was degraded at 90 °C using NaOH to produce degradation solutions to be used in procedures to isolate β ISA. An additional finding was that significant amounts of ISA were being removed from degradation solutions due to absorption on to unreacted cellulose fibres; in the NaOH reaction, absorption was occurring rapidly and the percentage of ISA in both the solution and solid phases were very similar. In the Ca(OH)2 reaction, the absorption was a slow process and the percentage of ISA on the solid phase (61 %) was lower than the percentage of ISA in the solution phase (84 %) suggesting that solid Ca(OH)2 was affecting both the rate at which absorption was occurring and the composition of the absorbed species; this was possibly due to solid Ca(OH)2 physically obstructing the access of ISA to the cellulose fibres and also catalysing the oxidation of some of the ISA into smaller fragmentation products. Methods which were developed to isolate β-ISA are described in chapter 4. Isolation of β-ISA was initially achieved by eluting crude cellulose degradation solutions directly through a column of anion exchange resin. Using an automated system, a large throughput of material was possible resulting in the accumulation of relatively large amounts of β-ISA; after repeating the column 17 times, 1 g of pure β-ISA was isolated. However, using this method, the crude solutions severely fouled the anion exchange resin, concluding that anion exchange was more suited to small scale isolations of β-ISA. A final isolation procedure was developed which involved the elution of mixtures of benzoylated CDPs through normal phase silica columns. It was determined that prior to elution, coloured impurities could be efficiently removed by passing the derivatised mixture through a wide bed of silica. Slow elution of the resulting clean syrup through a large silica column allowed up to 7 g of tribenzoylated β-ISAL to be isolated and following de-benzoylation procedures, 2.6 g of β-ISA was isolated from a single column. The large protecting groups also allowed single crystals of both α- and β-tribenzoate to be produced and the resulting X-ray structures confirmed the absolute configuration of tribenzoylated β-ISAL as being 2R, 4S. Additional NMR analysis of collected fractions allowed several other polyhydroxylated compounds to be identified, also present as their perbenzoylated esters, these being: 3,4-dihydroxybutanoic acid, 2,5-dihydroxypentanoic acid, 2,3-dideoxypentanoic acid and 2,4,5-trihydroxypentanoic acid. The isolation of large amounts of β-ISA allowed several solution phase physical properties of β ISA to be measured and these are reported in chapter 5, including the aqueous pKa (3.61) which was determined using NMR methods. The rate constants for the inter-conversion between ISAH and ISAL were also studied for both α- and β-ISA. In acidic environments, ISAH undergoes an acid catalysed lactonisation to generate isosaccharino-1,4-lactone (ISAL), conversely in basic environments, ISAL undergoes a base catalysed ring-opening to produce ISAH. Using pH-stat autotitration, the second-order rate constants for the lactone hydrolysis reaction were determined, to which values of 25.3 M-1 s-1 for β-ISAL and 97.0 M-1 s-1 for α-ISAL were observed. The acid catalysed lactonisation of ISAH was studied using 1H NMR spectroscopy; the second-order rate constant for the lactonisation of β-ISAH (3.10 x 10-3 M-1 s-1) was larger than the second order rate constant for the lactonisation of α-ISAH (7.04 x 10-4 M-1 s-1).

Thesis (MSc)--University of Stellenbosch, 2007.
ENGLISH ABSTRACT: Cellulose, a glucose polymer, is considered the most abundant fermentable polymer on earth. Agricultural waste is rich in cellulose and exploiting these renewable sources as a substrate for ethanol production can assist in producing enough bioethanol as a cost-effective replacement for currently used decreasing fossil fuels. Saccharomyces cerevisiae is an excellent fermentative organism of hexoses; however the inability of the yeast to utilize cellulose as a carbon source is a major obstruction to overcome for its use in the production of bio-ethanol. Cellobiose, the major-end product of cellulose hydrolysis, is hydrolyzed by -glucosidase or cellobiose phosphorylase, the latter having a possible metabolic advantage over -glucosidase. Recently, it has been showed that S. cerevisiae is able to transport cellobiose. The construction of a cellulolytic yeast that can transport cellobiose has the advantage that end-product inhibition of the extracellular cellulases by glucose and cellobiose is relieved. Furthermore, the extracellular glucose concentration remains low and the possibility of contamination is decreased. In this study the cellobiose phosphorylase gene, cepA, of Clostridium stercorarium was cloned and expressed under transcriptional control of the constitutive PGK1 promoter and terminator of S. cerevisiae on a multicopy episomal plasmid. The enzyme was expressed intracellulary and thus required the transport of cellobiose into the cell. The fur1 gene was disrupted for growth of the recombinant strain on complex media without the loss of the plasmid. The recombinant strain, S. cerevisiae[yCEPA], was able to sustain aerobic growth on cellobiose as sole carbon source at 30°C with Vmax = 0.07 h-1 and yielded 0.05 g biomass per gram cellobiose consumed. The recombinant enzyme had activity optima of 60°C and pH 6-7. Using Michaelis-Menten kinetics, the Km values for the colorimetric substrate p-nitrophenyl-b-D-glucopyranoside (pNPG) and cellobiose was estimated to be 1.69 and 92.85 mM respectively. Enzyme activity assays revealed that the recombinant protein was localized in the membrane fraction and no activity was present in the intracellular fraction. Due to an unfavourable codon bias in S. cerevisiae, CepA activity was very low. Permeabilized S. cerevisiae[yCEPA] cells had much higher CepA activity than whole cells indicating that the transport of cellobiose was inadequate even after one year of selection. Low activity and insufficient cellobiose transport led to an inadequate glucose supply for the yeast resulting in low biomass formation. Cellobiose utilization increased when combined with other sugars (glucose, galactose, raffinose, maltose), as compared to using cellobiose alone. This is possibly due to more ATP being available for the cell for cellobiose transport. However, no cellobiose was utilized when grown with fructose indicating catabolite repression by this sugar. To our knowledge this is the first report of a heterologously expressed cellobiose phosphorylase in yeast that conferred growth on cellobiose. Furthermore, this report also reaffirms previous data that cellobiose can be utilized intracellularly in S. cerevisiae.
AFRIKAANSE OPSOMMING: Sellulose, ‘n homopolimeer van glukose eenhede, word beskou as die volopste suiker polimeer op aarde. Landbou afval produkte het ‘n hoë sellulose inhoud en benutting van diè substraat vir bio-etanol produksie kan dien as ‘n koste-effektiewe aanvulling en/of vervanging van dalende fossielbrandstof wat tans gebruik word. Die gis, Saccharomyces cerevisiae, is ‘n uitmuntende organisme vir die fermentasie van heksose suikers, maar die onvermoë van die gis om sellulose as koolstofbron te benut is ‘n groot struikelblok in sy gebruik vir die produksie van bio-etanol. Sellobiose, die hoof eindproduk van ensiematiese hidrolise van sellulose, word afgebreek deur -glukosidase of sellobiose fosforilase. Laasgenoemde het ‘n moontlike metaboliese voordeel bo die gebruik van -glukosidase vir sellobiose hidrolise. Daar was onlangs gevind dat S. cerevisiae in staat is om sellobiose op te neem. Die konstruksie van ‘n sellulolitiese gis wat sellobiose intrasellulêr kan benut, het die voordeel dat eindproduk inhibisie van die ekstrasellulêre sellulases deur sellobiose en glukose verlig word. Verder, wanneer die omsetting van glukose vanaf sellobiose intrasellulêr plaasvind, word die ekstrasellulêre glukose konsentrasie laag gehou en die moontlikheid van kontaminasie beperk. In hierdie studie was die sellobiose fosforilase geen, cepA, van Clostridium stercorarium gekloneer en uitgedruk onder transkripsionele beheer van die konstitutiewe PGK1 promoter en termineerder van S. cerevisiae op ‘n multikopie episomale plasmied. Die ensiem is as ‘n intrasellulêre proteïen uitgedruk en het dus die opneem van die sellobiose molekuul benodig. Die disrupsie van die fur1 geen het toegelaat dat die rekombinante ras op komplekse media kon groei sonder die verlies van die plasmied. Die rekombinante ras, S. cerevisiae[yCEPA], het aërobiese groei by 30°C op sellobiose as enigste koolstofbron onderhou met mmax = 0.07 h-1 en ‘n opbrengs van 0.05 gram selle droë gewig per gram sellobiose. Die rekombinante ensiem het optima van 60°C en pH 6-7 gehad. Die K m waardes vir die kolorimetriese substraat pNPG en sellobiose was 1.69 en 92.85 mM onderskeidelik. Ondersoek van die ensiem aktiwiteit het getoon dat die rekombinante proteïen gelokaliseer was in die membraan fraksie en geen aktiwiteit was teenwoordig in die intrasellulêre fraksie nie. CepA aktiwiteit was laag as gevolg van ‘n lae kodon voorkeur in S. cerevisiae. Verder het geperforeerde S. cerevisiae[yCEPA] selle aansienlik beter CepA aktiwiteit getoon as intakte selle. Hierdie aanduiding van onvoldoende transport van sellobiose na binne in die sel tesame met die lae aktiwiteit van die CepA ensiem het gelei tot onvoldoende glukose voorraad vir die sel en min biomassa vorming. Sellobiose verbruik het toegeneem wanneer dit tesame met ander suikers (glukose, galaktose, raffinose, maltose) gemeng was, heelwaarskynlik deur die vorming van ekstra ATP’s vir die sel wat ‘n toename in sellobiose transport teweeg gebring het. Fruktose het egter kataboliet onderdrukking veroorsaak en sellobiose was nie benut nie. Sover ons kennis strek, is hierdie die eerste verslag van ‘n heteroloë sellobiose fosforilase wat in S. cerevisiae uitgedruk is en groei op sellobiose toegelaat het. Verder, bewys die studie weereens dat S. cerevisiae wel sellobiose kan opneem.

Some species of Oomycetes are well studied pathogens that cause considerable economical losses in the agriculture and aquaculture industries. Currently, there are no chemicals available that are environmentally friendly and at the same time efficient Oomycete inhibitors. The cell wall of Oomycetes consists of b-(1à3) and b-(1à6)-glucans, cellulose and in some species minute amounts of chitin. The biosynthesis of cellulose and chitin in Oomycetes is poorly understood. However, cell wall synthesis represents a potential target for new Oomycete inhibitors. In this work, cellulose and chitin synthase genes and gene products were analyzed in the plant pathogen Phytophthora infestans and in the fish pathogen Saprolegnia monoica.   A new Oomycete CesA gene family was identified, containing four subclasses of genes designated as CesA1 to 4. The gene products of CesA1, 2 and 4 contain pleckstrin homology (PH) domains located at the N-terminus, which is unique to the Oomycete CesAs. Our results show that the SmCesA2 PH domain binds to phosphoinositides, F-actin and microtubules in vitro and can co-localize with F-actin in vivo. Functional characterization of the CesA genes by gene silencing in P. infestans led to decreased cellulose content in the cell wall. The cellulose synthase inhibitors DCB and Congo Red inhibited the growth of the mycelium of S. monoica and had an up-regulating effect on SmCesA gene expression. Zoospores from P. infestans treated with DCB were unable to infect potato leaves. In addition, two full-length chitin synthase genes (Chs) were analyzed from S. monoica.  Expression of SmChs2 in yeast yielded an active recombinant protein. The biochemical characterization of the in vitro product of SmChs2 confirmed that the protein is responsible for chitin formation. The chitin synthase inhibitor nikkomycin Z inhibited the SmChs2 both in vivo and in vitro.   Altogether these results show that at least some of the CesA1-4 genes are involved in cellulose biosynthesis and that synthesis of cellulose is crucial for infection of potato by P. infestans. The PH domain is involved in the interaction of CesA with the cytoskeleton. In addition, we firmly demonstrate that the SmChs2 gene encodes a catalytically active chitin synthase.
QC 20110531

Clostridium cellulolyticum est une bactérie anaérobie stricte et cellulolytique qui produit des complexes multienzymatiques (cellulosomes) très performants pour la dégradation des polysaccharides de la paroi végétale. C. cellulolyticum adhère à la cellulose et ce phénomène intervient dès les premiers stades de croissance. Pour de nombreuses bactéries cellulolytiques, les cellulosomes semblent impliqués dans le processus d'adhérence et alors que les mécanismes moléculaires mis en jeu pour l'adhérence à la cellulose sont connus ou proposés, celui ou ceux de C. cellulolyticum sont inconnus.Mon projet de thèse a consisté à étudier l'adhérence et la colonisation des fibres de cellulose par C. cellulolyticum et d'identifier le ou les facteurs moléculaires impliqués dans l'adhérence. J'ai ainsi mis en œuvre deux stratégies distinctes. D'une part, une approche par mutagénèse aléatoire qui a permis d'isoler deux clones à l'adhérence diminuée et d'autre part, une approche par mutagénèse ciblée visant à inactiver des gènes candidats, susceptibles d'intervenir dans l'adhérence.J'ai aussi étudié la colonisation des fibres de cellulose par C. cellulolyticum et observé que les cellules adhèrent avec une haute spécificité et affinité à la cellulose. La colonisation des fibres se ferait en mono-couche cellulaire et par successions d'événements d'adhésion-relarguage-réadhésion. Un mutant d'inactivation de CipC, la protéine d'échafaudage des cellulosomes, a mis en évidence l'implication de cette protéine dans l'adhérence, mais aussi que l'adhérence à la cellulose pourrait être multifactorielle. Enfin, j'ai étudié le rôle de HycP, une protéine à CBM3 dont la fonction est inconnue
Clostridium cellulolyticum is a strict anaerobe, cellulolytic bacteria. It produces multienzymatic complexes, called cellulosomes, which are able to efficiently degrade the plant cell wall polysaccharides. Cellulolytic bacteria, including C. cellulolyticum do binds to cellulose since early growth stage. For most of the studied cellulolytic bacteria, adherence to cellulose seems to be mediated by their cellulosomes. However, molecular factors involved in C. cellulolyticum adherence to cellulose remain unknown.My Ph.D. aimed to implement different but complementary strategies to study adhesion and colonization of cellulose fibers by C. cellulolyticum and to identify the molecular mechanism(s) by which the bacteria bind to cellulose. In order to identify some proteins encoding genes involved in adhesion, I firstly developed random mutagenesis and isolated two adhesion deficient mutants. I also used a targeted mutagenesis tool to inactivate some candidate genes.My studies highlight C. cellulolyticum adheres with both high specificity and affinity to cellulose. Colonization of cellulose fibers by C. cellulolyticum forms a mono-layer of segregated cells on cellulose surface and may occur through cycles of adhesion-release-re-adhesion to substrate. Inactivation of the CipC encoding gene led to a short decrease of the mutant strain's adherence level. This result suggests some other proteins may be involved in C. cellulolyticum adhesion to cellulose. Finally, I studied HycP, a produced and secreted CBM3 encoding protein of unknown function. HycP is a unique protein among databases and may have a phagic origin

Fibrobacter succinogenes est l'une des especes bacteriennes cellulolytiques du rumen la plus efficace pour degrader la cellulose cristalline des parois vegetales ingerees par le ruminant. Elle possede un systeme hydrolytique complexe dont l'organisation est encore mal connue. Le gene endb de la souche s85 code pour une endoglucanase, egb, que nous avons purifiee et dont les constantes cinetiques ont ete determinees. Malgre de fortes similitudes entre ses caracteristiques physico-chimiques et celles de l'endoglucanase eg1 purifiee a partir du milieu de culture de f. Succinogenes, ces deux enzymes semblent distinctes. Le gene endc de la souche bl2 de f. Succinogenes, clone chez e. Coli, code pour une activite carboxymethylcellulase. La proteine produite, egc, est une endoglucanase de 65 kda. Sa temperature optimale d'activite est de 37c et son ph optimum de 7,0. L'enzyme ne se lie pas a la cellulose et est activee par les cations divalents (mg#2#+, ca#2#+). La sequence nucleotidique du gene endc a ete determinee. La sequence proteique de egc, deduite de la sequence nucleotidique du gene, montre que egc est homologue aux cellulases de la famille 9-1 des glycosyl-hydrolases. L'enzyme possede une structure modulaire composee de 3 domaines dont un domaine terminal basique (btd) dont la deletion inactive l'enzyme. La localisation des endoglucanases egb et egc chez f. Succinogenes a ete etudiee a l'aide de serums specifiques. Les proteines semblent presentes dans les extraits bacteriens de f. Succinogenes cultive sur differents substrats. Cependant, la masse molaire des endoglucanases reconnues chez e. Coli. Plusieurs hypotheses sont proposees, dont la modification post-traductionnelle des enzymes chez f. Succinogenes. La quantification des arnm codant pour ces enzymes indique une surexpression des genes endb et endc en presence de cellulose, ainsi que pour les huit autres genes de glycosyl-hydrolases de f. Succinogenes. L'expression de ces differents genes pourrait etre induite par des produits de degradation de la cellulose, ou soumise a une repression de type catabolique par les sucres solubles. Enfin, la presence de ces differents genes a ete detectee chez neuf souches de f. Succinogenes et une souche de f. Intestinalis. Les activites cellulase et xylanase de ces differentes souches sont, par ailleurs, globalement semblables, ce qui suggere des similitudes de la structure de leurs systemes hydrolytiques, et permet de valider l'utilisation de la souche s85, repiquee en laboratoire depuis plus de 40 ans, pour l'etude du complexe hydrolytique des bacteries du genre fibrobacter.

The mesophilic Ruminococcus flavefaciens FD-1 (NCDO 2215) is a Gram-positive obligate anaerobic bacterium. The aim of this thesis was to clone, sequence and analyze a cellodextrinase gene (celA) and a carboxymethylcellulase gene (celE), and study their regulation and induction at the transcriptional level. The sequence of the celA gene from FD-1 was determined and the amino acid sequence of the CelA enzyme (336 amino acid residues) deduced. It showed 40% identity with endoglucanase C of Clostridium thermocellum and 27.4% identity with endoglucanase 3 of Fibrobacter succinogenes. These three enzymes are grouped into subfamily "A3". The ATG start codon of celA is preceded by a GAGG sequence, predicted to be a ribosome binding site. The derived amino acid sequence corresponded to a protein of Mᵣ 38686. SDS-PAGE analysis of in vitro and in vivo translational products showed that CelA has a molecular mass of ca 39 kDa and was secreted into the Escherichia coli periplasmic space. Although CelA has activity on carboxymethylcellulose, further study on the enzyme showed that it degraded cellopentaose and other cellodextrins to predominantly cellobiose. Thus CelA is a cellodextrinase. It also has high activity against p-nitrophenyl-β-D-cellobioside. A gene, expressing a protein with both carboxymethyl cellulase and xylanase activity, was cloned from R. flavefaciens FD-1 using an E. coli/Bacillus subtilis shuttle vector, pEBl. The 3.6 kb DNA insert on the plasmid pWFl, which carried the gene, celE, contained an open reading frame of 963 bp encoding 320 amino acid residues with a caculated Mᵣ of 35937. Homology analysis showed 11.6% identity and 55.3% similarity with the N-terminal catalytic region of the cellulase gene of alkalophilic Bacillus sp. strain 1139. In order to obtain expression in E. coli, the gene had to be transcribed from the lambda Pᵣ promoter. To determine whether cellulase genes of R. flavefaciens FD-1 were regulated at the level of transcription, celA and celE were used as probes against RNA isolated from R. flavefaciens FD-1 grown on cellobiose, cellulose or cellotriose. Transcription of both genes was induced when cellulose was added to cells growing in cellobiose. This induction continued after cellulose depletion and after cell division had ceased. Transcription of both genes was also induced by cellotriose although not to the same extent as by cellulose. This suggests that cellotriose and possibly ether dextrins may act as key inducers to trlgger celA and eels gene expression in R. flavefaciens FD-1.

Oltre alla progressiva perdita dei linfociti T CD4, i pazienti HIV-infetti presentano diverse citopenie periferiche. In particolare l’anemia si riscontra nel 10% dei pazienti asintomatici e nel 92% di quelli con AIDS e la terapia cART non è in grado di risolvere tale problematica. I meccanismi patogenetici alla base di questa citopenia si ritiene che possano riguardare la deregolazione citochinica, il danno alle HPCs, alle cellule in differenziamento e alle cellule stromali. Le cellule progenitrici ematopoietiche CD34+, dopo essere state separate da sangue cordonale e differenziate verso la linea eritroide, sono state trattate con HIV-1 attivo, inattivato al calore e gp120. In prima istanza è stata messa in luce la mancata suscettibilità all’infezione e l’aumento dell’ apoptosi dovuto al legame gp120-CD4/CXCR4 e mediato dal TGF-β1 nelle cellule progenitrici indifferenziate. L’aspetto innovativo di questo studio però si evidenzia esaminando l’effetto di gp120 durante il differenziamento verso la filiera eritrocitaria. Sono stati utilizzati due protocolli sperimentali: nel primo le cellule sono inizialmente trattate per 24 ore con gp120 (o con HIV-1 inattivato al calore) e poi indotte in differenziamento, nel secondo vengono prima differenziate e poi trattate con gp120. Il “priming” negativo determina una apoptosi gp120-indotta molto marcata già dopo 48 ore dal trattamento ed una riduzione del differenziamento. Se tali cellule vengono invece prima differenziate per 24 ore e poi trattate con gp120, nei primi 5 giorni dal trattamento, è presente un aumento di proliferazione e differenziamento, a cui segue un brusco arresto che culmina con una apoptosi molto marcata (anch’essa dipendente dal legame gp120-CD4 e CXCR4 e TGF-β1 dipendente) e con una drastica riduzione del differenziamento. L’insieme dei risultati ha permesso di definire in modo consistente la complessità della genesi dell’anemia in questi pazienti e di poter suggerire nuovi target terapeutici in questi soggetti, già sottoposti a cART.
Beside the CD4 T cells progressive loss, HIV-infected subjects exhibit some peripheral cytopenias. In particular, anemia is found in 10% of asymptomatic and in 92% of AIDS patients and cART therapy is not able to solve this problem. The pathogenic mechanisms underlying this cytopenia are related to cytokine dysregulation, damage of HPCs, impairment of stromal cells and inhibition of the differentiation of HPCs. The CD34+ hematopoietic progenitor cells were separated from cord blood, differentiated towards the erythroid lineage and treated with active HIV-1, heat-inactivated virus and gp120. First of all we demonstrate that HPCs are not susceptible to infection and the gp120-CD4/CXCR4 binding cause a TGF-β1 mediated apoptosis. The innovative aspect of this study, however, is evident examining the effect of gp120 during differentiation towards the erythrocyte. Two experimental protocols are used: in the first cells are initially treated for 24 hours with gp120 ( HIV-1 or with heat-inactivated ) and then induced into differentiation, in the second cells are firstly differentiated and then treated with gp120. The negative "priming" induces a gp120-mediated apoptosis 48 hours after treatment and a differentiation reduction. If these cells are instead primarily differentiated for 24 hours and then treated with gp120, in the first 5 days after treatment, there is an increase of proliferation and differentiation, which is followed by a very marked apoptosis (also TGF-β1 mediated and due to gp120-CD4/CXCR4 binding) and a drastic reduction of differentiation. These results allowed us to define the complexity of the genesis of anemia in these patients and suggest new therapeutic targets for these subjects already receiving cART .

Les lymphocytes T sont les cibles privilégiées de la réplication du VIH-1. Ce virus détourne la machinerie cellulaire pour s'assurer l'infection efficace de son hôte. J'ai étudié les processus de réplication du VIH-1 et de sa transmission entre cellules T. J'ai observé simultanément différents modes de transmission virale directe entre cellules T comme la synapse virologique, le filopode ou la polysynapse, structure nouvellement caractérisée qui associe une cellule infectée à plusieurs cibles en même temps. J'ai quantifié précisément ces différentes modes de contact et leur importance. Mes observations aboutissent à proposer la synapse virale et la polysynapse comme principales voies de transmission du VIH. L'interface entre virus et cellules cibles est au cœur de mon travail de recherche. J'ai caractérisé les modifications du cytosquelette d'actine induites par le virus au niveau des cellules T. La protéine Nef se révèle ici comme un des inducteurs majeurs de ces réarrangements. Sous son impulsion, de profonds changements s'enclenchent : réduction de motilité cellulaire, diminution des replis membranaires de type « ruffles » et augmentation des filopodes. J'ai également étudie le rôle des Rhô GTPases Racl, 2 et Cdc42 ainsi que la GTPase dynamin 2 lors de la transmission virale directe de cellule à cellule et via des virions libres. Ces protéines responsables du remodelage du cytosquelette peuvent être considérées comme des cibles privilégiées du virus pour détourner des fonctions cellulaires majeures. Mes études révèlent et caractérisent quelques traits des interactions complexes entre le VIH et les cellules cibles
T lymphocytes are the main target cells for active HIV-1 replication. The virus subverts the cellular machineries to ensure the most efficient infection of the host. I studied the process of HIV-1 replication and intercellular spread in T cells. I visualized the simultaneous existence of different mechanisms of viral transmission between T lymphocytes, such as virological synapses (VS), filopodia, and by newly characterized polysynapses, structures formed between one infected cell and multiple adjacent recipients. I quantified further these diverse modes of contact and studied their relative importance in mediating new target infection. I observed that viral transfer mainly occurs across VS and through polysynapses. I investigated the interplay between the virus and its host cell upon infection. I showed that the virus modulates the physiology of T cells. This is, at least partially, due to the interactions of HIV with the cell cytoskeleton. The viral protein Nef appears as an important modulator of actin cytoskeleton remodeling. It mediates profound changes within the cells, reducing their motility and ability to undergo membrane ruffling, inducing at the same time the formation of filopodia. I also identified Rhô GTPases Racl, 2 and Cdc42 as well as GTPase dynamin2 as possible partners of HIV in mediating free viral infection and cell-cell spread. These regulators of actin cytoskeleton remodeling are likely targets for the virus to get the control over important cellular functions involving actin plasticity. The research presented here allowed to better characterize the means of HIV cell-to-cell spread and the modulation of the cellular biology by the viral infection

Plusieurs environnements de travail sont hautement contaminés par des bioaérosols qui sont souvent associés à l’induction de diverses pathologies respiratoires. Il est donc important de mieux définir l’impact des composantes des bioaérosols sur l’immunité mucosale pulmonaire. La cellule dendritique est à l’interface de l’individu et de son environnement et aurait un rôle dans l’initiation de réponses immunopathologiques induites par les bioaérosols. Le but de ce projet était donc de comparer comment divers agents, combinaisons d’agents, ou des échantillons issus d’environnements hautement contaminés par des bioaérosols modulaient l’activation des cellules dendritiques in vitro. Nos résultats montrent que le degré d’activation des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse in vitro discriminent un agent fortement immunogène, les endotoxines, d’agents faiblement immunogènes tels les β-D glucanes et les archées Methanosphaera stadtmanae et Methanobrevibacter smithii. Nous montrons également qu’une stimulation combinée de ces agents active de façon additive les cellules dendritiques, confirmant ainsi l’importance d’étudier l’impact des bioaérosols comme un ensemble, et non pas seulement certaines composantes individuellement. De plus, la cinétique d’activation des cellules dendritiques est modulée par la nature de la stimulation, ce qui confirme l’hypothèse d’interaction entre les composantes des bioaérosols sur la réponse immune. Enfin, l’activation des cellules dendritiques permet de stratifier par classe divers environnements de travail, ce qui est corroboré par un modèle d’inflammation pulmonaire in vivo. Ce projet élargit donc notre connaissance des mécanismes sous-jacents à l’induction de réactions immunes pathologiques par les bioaérosols complexes
Several occupational settings are highly contaminated with bioaerosols, which are often associated with the induction of various respiratory pathologies. It is therefore important to define the impact of the components of bioaerosols on mucosal immunity. Dendritic cells are at the interface of the individual and his environment and play a role in the initiation of immunopathological responses induced by bioaerosols. The purpose of this project was to compare how various agents, agent combinations, or samples from environments highly contaminated with bioaerosols modulated dendritic cell activation in vitro. Our results show that the degree of activation of dendritic cells derived from the bone marrow differentiates between a highly immunogenic agent, endotoxins, from weakly immunogenic agents such as β-D glucans and archaea Methanosphaera stadtmanae and Methanobrevibacter smithii. We also show that combined stimulation of these agents additively activates dendritic cells, thus confirming the importance of studying the impact of bioaerosols as a whole, and not just individual components. In addition, the kinetics of activation of dendritic cells is modulated by the nature of the stimulation, which confirms the hypothesis of interaction between the components of bioaerosols on the immune response. Finally, the activation of dendritic cells stratifies various working environments by class, which is corroborated by an in vivo lung inflammation model. This project therefore broadens our understanding of the mechanisms underlying the induction of immunopathological reactions by complex bioaerosols.

Dans le but d'évaluer la possibilité de mise en place une ingénierie écologique des processus microbiens de la digestion anaérobie dans les bioprocédés, différents leviers environnementaux ont été appliqués à des digesteurs de cellulose. Le premier levier étudié, de nature physico-chimique, était la température. Le deuxième faisait appel à une adaptation préalable d'une biomasse complexe par incubation avec des molécules simples avant mise en présence de cellulose. Le dernier consistait en la co-inoculation de diverses biomasses exogènes avec une boue anaérobie. Les conséquences des perturbations apportées par ces leviers sur les dynamiques métaboliques et écologiques de bioréacteurs anaérobies dégradant de la cellulose ont été évaluées. Différents indicateurs physico-chimiques ont été utilisés pour caractériser la dégradation de la cellulose (production de molécules intermédiaires, production de gaz, etc.). Les outils de la biologie moléculaire ont permis de caractériser les dynamiques microbiennes à l'échelle des communautés (par fingerprinting ARISA) ou des individus (par pyroséquençage de l'ADNr 16S). L'utilisation d'isotopes stables (cellulose marquée 13C), a permis de réaliser un traçage précis des flux de matières (intermédiaires de dégradation de la cellulose enrichis en 13C) et des microorganismes impliqués dans la chaîne de dégradation de la cellulose (groupes microbiens fonctionnels identifiés par la technique de " stable isotope probing "). Les expériences de changements de température ont montrél'influence importante de ce paramètre sur les communautés microbiennes, en particulier les archées. Elles ont mis en évidence le caractère asymétrique de l'effet de la température sur les communautés microbiennes et les conséquences irréversibles du passage par les conditions thermophiles. Ces propriétés ouvrent des perspectives intéressantes pour exploiter les chocs de température afin de modifier les propriétés de la biomasse. L'expérience de fonctionnalisation de la biomasse à l'aide de quatre molécules simples (acide propionique, acide butyrique, glucose et cellobiose) montre qu'un modelage des populations microbiennes par préadaptation est possible. Une fois en contact avec la cellulose, les biomasses fonctionnalisées génèrent des schémas de dégradation et des structures de communautés qui se répartissent de manière inattendue en deux catégories seulement. Ce résultat suggère qu'il est possible d'orienter les états d'équilibre d'une communauté microbienne complexe par préadaptation fonctionnelle. Enfin, des expériences de co-inoculation ont mis en avant la difficulté d'exploiter directement les propriétés enzymatiques de flores cellulolytiques performantes mais également les possibilités de modifier les équilibres de diversité au sein de la biomasse du bioprocédé. Ces expériences suggèrent qu'un paramètre tel que la diversité de la communauté d'un bioprocédé pourrait être manipulé par bioaugmentation. Ce travail démontre que nous disposons d'ores et déjà d'un certain nombre d'outils pour élaborer une ingénierie écologique des bioprocédés à travers une nouvelle démarche de gestion qui se place à l'échelle de l'écosystème microbien et des services associés.

Le cadre de cette étude est le coût énergétique lié à la production des Microfibrilles de Cellulose (MFC) qui est aujourd’hui un facteur limitant à son développement à l’échelle industrielle. Le but de cette étude est de caractériser les interactions cellulose/hémicellulose au sein de ces systèmes.Des MFC provenant de différentes pâtes à papier chimiques ont été caractérisées par RMN du solide afin d’obtenir des informations à l’échelle moléculaire. Suite à l’optimisation d’un protocole expérimental, les hémicelluloses contenues dans les MFC issues de pâte kraft de bouleau ont ensuite été extraites avec un rendement de 60% et sont composés uniquement d’un homopolymère de xylan de DP 75.La turbidimétrie a été utilisée pour qualifier la qualité des suspensions, dont il a été montré qu’elle dépend fortement du procédé de mise en pâte et du séchage. Des corrélations positives ont été établies entre l’état de dispersion et les propriétés mécaniques de feuilles de papier additionnées de microfibrilles. L’analyse RMN de modèles biomimétiques reconstitués a confirmé le changement de conformation du xylan lorsqu’il est adsorbé sur la cellulose et les mesures de surface spécifique ont montré que seule la couche de xylan en contact avec la cellulose était concernée par ce changement.Les interactions cellulose/xylane ont été étudiées par RMN du solide et par dynamique moléculaire atomistique (MD). Les simulations MD ont montré que le xylan s’adsorbe parallèlement aux chaines de cellulose. Des mesures d'interaction sur ce système ont conduit à une mesure d'énergie de 9kJ/résidu de xylose.Des tests de mesure d’adhésion ont également été réalisés à partir d’un modèle trois couches constitué de xylan entre deux films de cellulose et une forte adhésion a pu être observée.L’utilisation de xylanase comme prétraitement est proposé pour améliorer la production des MFC
The study was motivated by the necessity to reduce the high energy costs of Micro-Fibrillated Cellulose (MFC) production, which is a limiting factor for its industrial development and aimed at understanding the cellulose/hemicelluloses interaction within this system. MFC resulting from different chemical pulps were characterized by solid-state NMR spectroscopy to get information on the hemicelluloses content and molecular conformation. By optimizing an extraction protocol, more than 60% of the residual hemicelluloses were extracted from birch kraft MFC and characterized as a high purity homopolymer of β-1,4 linked xylan of DP 75.Turbidimetry was used to qualify the quality of the suspensions, which strongly depended on the pulping and drying history. Positive correlations between the state of dispersion, specific surface and mechanical properties of MFC-reinforced handsheets were evidenced.Cellulose/xylan interactions were investigated using solid-state NMR and atomistic molecular dynamics (MD) simulation. NMR spectra confirmed that xylan in contact with cellulose altered its conformation, from the three-fold helix to a presumable cellulose-like two-fold one. In combination with specific surface area measurements, the conformational change was shown to happen only for the first layer of xylan adsorbed in direct interaction with the cellulose surface. MD simulations showed that adsorbed xylan tends to align parallel to the cellulose chain direction fully extended. Interaction energy between xylan chain and cellulose surface estimated with MD was 9kJ/xylose. Then a three-layers system made of xylan between two cellulose films were built to perform adhesion tests that showed strong adhesion between xylan and cellulose surfaces. Xylanase was proposed as a pulp pretreatment for MFC production

Dans le cadre de l'utilisation potentielle d'azospirillum lipoferum, microorganisme diazotrophe, comme activateur de la croissance de plantes de grande culture, un procede associant production et conservation des cellules par deshydratation apres inclusion dans un gel d'alginate, a ete mis au point a l'echelle du laboratoire. L'influence des facteurs d'environnement sur la croissance du microorganisme a ete caracterisee et quantifiee en culture discontinue. La levee de limitations nutritionnelles a conduit a la definition d'un milieu permettant une bonne multiplication des cellules (concentration finale, 2 10#1#10 cel. /ml. Taux de croissance cellulaire moyen, 0,35 h##1) tout en controlant l'accumulation de substance de reserve. Des conditions d'environnement gazeux (po#2 en particulier) favorisant la croissance ont egalement ete proposees. Differentes conditions operatoires de sechage ont ete mises en uvre dans le but de quantifier leurs influences sur le maintien de la viabilite des cellules. La perte de viabilite a pu etre interpretee par rapport a la teneur en eau et a la reactivite de l'eau dans le gel. L'influence de la vitesse de sechage et de l'etat physiologique des cellules sur la cinetique de perte de viabilite a ete caracterisee. Un ensemble de variables operatoires a pu etre defini permettant de maintenir, sur une duree de 220 jours, une bonne viabilite cellulaire (50% du nombre initial de cellules)

Master of Agribusiness
Department of Agricultural Economics
Michael Woolverton
To meet the demand of the 2007 Energy Bill will require a new approach to ethanol production in the United States. The question persists: how can the ethanol industry in the United States produce 21 billion gallons of ethanol from cellulosic sources? This challenge will require changes in the facilities currently manufacturing ethanol, the collection and storage methods to which the Midwestern farmer is accustomed, and a drastic change in farm production practices. Several different methods of cellulosic ethanol production are being examined. One such method is to change the focus from starch based ethanol to ethanol produced by harvest, collection, and manufacture from corn cobs. Research has included surveys, development of economic models, and focus group meetings to determine the feasibility of corn cobs as a viable raw material source for cellulosic ethanol. Findings indicate that: corn cob collection is feasible for the Midwestern farmer. According to the economic models presented in this thesis, Midwestern farmers can benefit economically from the collection of corn cobs. Further, the collection of corn cobs allows for current ethanol plants to be upgraded with new technology without major change in the manufacturing processes. The focus of this research was to determine which method of corn cob collection was preferable for Midwestern corn producers.

L'hydrogene est un intermediaire important de la degradation microbienne anaerobie de la matiere organique. Dans les ecosystemes digestifs, l'hydrogene produit par des microorganismes hydrolytiques et fermentaires peut etre potentiellement reutilise par trois groupes microbiens majeurs: les archa methanogenes, les bacteries sulfato-reductrices et les bacteries acetogenes. Nous avons compare le niveau de population de ces hydrogenotrophes dans divers ecosystemes digestifs, caracterise quelques souches et etudie les interactions entre ces microorganismes et ceux producteurs d'h#2. Les methanogenes representent la population hydrogenotrophe dominante dans la plupart des ecosystemes digestifs etudies. Les sulfato-reductrices sont toujours presentes quel que soit l'ecosysteme avec un niveau de population similaire. La flore acetogene, bien que premiere a s'etablir dans le rumen, est presente en plus grand nombre chez les non-ruminants. Les acetogenes, mixotrophes, sont capables d'utiliser un plus grand nombre de substrat que les methanogenes mais l'affinite de ces dernieres pour l'hydrogene est plus elevee. Des cocultures in vitro ont montre que les acetogenes sont capables, comme les methanogenes d'influencer le metabolisme des producteurs d'h#2. Les sulfato-reductrices detournent egalement le metabolisme des producteurs d'h#2 bien que le sulfure produit soit toxique pour certains microbes. A l'aide d'agneaux gnotobiotiques, nous avons montre que les methanogenes peuvent, in vivo, augmenter l'activite metabolique des souches productrices d'h#2 et nous avons mis au point un modele exempt d'acetogenes pour etudier leur role in vivo

Le pouvoir pathogène de Shigella flexneri est dû à la capacité qu'ont ces bactéries de pénétrer et de se multiplier dans les cellules épithéliales de la muqueuse colique humaine. Des études génétiques ont montré que plusieurs loci chromosomiques et un plasmide de 220 kilobases (kb) étaient nécessaires à la pathogénicité. Bien que les gènes chromosomiques soient indispensables à l'expression d’un phénotype complet d'invasion, il a été montré que le plasmide de virulence portait à lui seul toute l'information nécessaire à l'étape d'entrée dans les cellules HeLa. Dans le but d'identifier les gènes responsables de cette étape d'entrée de Shigella dans les cellules, nous avons cloné des fragments du plasmide de virulence d'une souche de S. Flexneri sérotype 5. Plusieurs plasmides recombinants contenant une séquence commune de 37 kb sont apparus capables de promouvoir l'entrée des bactéries dans les cellules. Afin de localiser les gènes de virulence sur cette séquence, l'un des plasmides recombinants a été mutagénisé à l'aide du transposon Tn. 5. Huit insertions, entraînant une inhibition ou une altération du processus d'entrée, ont défini cinq loci répartis sur une région de 20 kb. Des études préliminaires sur l'expression des protéines par les clones recombinants avaient montré que parmi les polypeptides exprimés, quatre étaient reconnus par les sérums de singes convalescents de shigellose. Ces quatre polypeptides constituent les antigènes protéiques majeurs qui provoquent une réponse humorale durant l'infection des hommes et des singes par toutes les espèces de Shigella. Parmi les huit mutants d’insertion ayant une capacité d'entrée altérée, trois présentaient des modifications de l'expression de ces polypeptides. C'est sur la région de 7 kb codant pour ces antigènes, a (78 kilodaltons, kD), b (62 kD), c (43 kD), et d (38 kD), et pour un polypeptide de 21 kD, non exprimé par un des mutants d'insertion, que nous nous sommes concentrés. Les gènes codant pour les quatre polypeptides ont été localisés. L'analyse des résultats a conduit à la proposition d'un modèle d'opéron avec une alternative au niveau de la protéine de 21 kD qui, soit ferait partie de l'opéron, soit en serait un activateur. LpaB et ipaC, les gènes correspondant aux deux antigènes majeurs b et c, ont été clonés et leur séquence nucléotidique déterminée. Le bas pourcentage en G+C et l'utilisation différente des codons par rapport à E. Coli suggèrent une origine non entérobactérienne des gènes de virulence. L'ensemble de ce travail a établi les bases génétiques et moléculaires qui permettront l'étude plus approfondie du processus d'entrée de Shigella dans les cellules eucaryotes.

Le microbiote exerce sur la santé humaine des effets bénéfiques essentiels qui peuvent être renforcés par l'administration de probiotiques. Ces micro-organismes vivants qui, selon la définition, administrés en quantité adéquates, confèrent un bénéfice à la santé de l'hôte, sont souvent issus de la flore humaine et appartiennent pour la plupart aux bactéries lactiques, en particulier au genre Lactobacillus. Ainsi la souche probiotique L. Rhamnosus Lcr35 lyophilisée avec son milieu de culture constitue le principe actif de produits pharmaceutiques indiqués dans le traitement des diarrhées et la prévention des vaginites, commercialisés de longue date dans de nombreux pays. L'objectif de notre travail a consisté à caractériser d'un point de vue moléculaire cette bactérie ainsi que ses interactions avec les cellules de l'hôte. L'utilisation de plusieurs techniques de typage moléculaire (séquençage, ribotypage, électrophorèse en gradient de température) a permis d'établir que la souche Lcr35 appartient effectivement à l'espèce L. Rhamnosus, avec une proximité plus grande vis-à-vis du probiotique L. Rhamnosus GG qu'avec la seule souche type de l'espèce. Les profils d'électrophorèse en champ pulsé et d'amplification génique (PCR) basée sur des séquences répétées (rep-PCR) de 2 isolats de Lcr35 issus de lots produits à 40 ans d'intervalle se sont avérés identique montrant l'excellente conservation de la souche au cours du temps. Au contraire, des profils nettement distincts ont été obtenus pour 7 autres souches du groupe des L. Casei par ailleurs phénotypiquement proches. Par une technique d'hybridation soustractive contre le génome de L. Rhamnosus GG, 5 séquences spécifiques de Lcr35, dont 2 phagiques, ont été mises en évidence. L'ensemble des résultats obtenus a conduit à développer des méthodes de PCR et de rep-PCR rapides et discriminantes permettant l'identification de la souche probiotique Lcr35 en routine. Afin de qualifier les mécanismes d'action de ce probiotique, nous avons dans un 1er temps cherché à déterminer quels étaient les gènes bactériens spécifiquement mis en jeu in vivo dans un modèle murin, en utilisant la resolvase-based in vivo expression technology (R-IVET). Bien que cette technique n'ait pas pu être menée à son terme avec succès, les différentes étapes réalisées sont présentées et interprétées dans ce mémoire. Par ailleurs, nous avons montré que L. Rhamnosus Lcr35 est capable d'adhérer rapidement et efficacement à des cellules humaines cervicales et vaginales immortalisées in vitro. Ce probiotique exerce également un effet microbicide vis-à-vis de Prevotella bivia et Gardnerella vaginalis, des pathogènes fréquemment associés aux vaginites bactériennes, ainsi qu'à l'encontre du principal agent des candidoses, Candida albicans. Ces résultats soulignent l'intérêt thérapeutique de la bactérie Lcr35 utilisée comme principe actif dans le traitement et la prophylaxie des affections vaginales microbiennes communes. Enfin, une analyse de la réponse de cellules épithéliales (intestinales et vaginales) et dendritiques humaines in vitro au contact de la souche Lcr35 a révélé des modifications transcriptionnelles significatives, notamment pour les cellules dendritiques. Les principales modifications d'expression concernent des gènes impliqués dans la réponse immunitaire, la présentation des antigènes, la transduction des signaux et - surtout chez les cellules épithéliales - les processus d'adhésion cellulaire. De plus, les modifications des réponses transcriptionnelles observées étaient étroitement corrélées à l'inoculum bactérien mis au contact des cellules, démontrant ainsi une relation effet-dose
Microbiota exert essential beneficial effects on human health which can be reinforced by administering probiotics. These live microorganisms which, according to their definition, confer a health benefit on the host when administered in adequate amounts, are often isolated from human flora and most belong to the lactic acid bacteria, in particular to the genus Lactobacillus. Thus, the probiotic strain L. Rhamnosus Lcr35 lyophilized with its culture medium constitutes the active substance of pharmaceutical products that have long been used in the treatment of diarrhoea and prevention of bacterial vaginosis in numerous countries woldwide. The aim of our work consisted in molecular characterization of this bacterium and its interactions with the host cells. Using several molecular typing methods (sequencing, ribotyping, temperature gradient gel electrophoresis), we established that strain Lcr35 belongs to the L. Rhamnosus species with a greater similarity to the probiotic L rhamnosus GG than to the species type strain. Patterns obtained from two isolates of Lcr35 sampled 40 years apart bu pulsed-field gel elctrophoresis and repetitive DNA element-based (rep-)PCR could not be distinguished, showing the excellent preservation of the strain over time. In contrast, seven strains belonging to the L. Casei group displayed clearly distinct patterns, despite being phenotypically close. Subtractive hybridization using the L. Rhamnosus GG genome as a driver revealed five Lcr35-specific sequences, of which two were phage-related. On the basis of these findings, rapid and discriminative PCR and rep-PCR methods for routine identification of the probiotic dtrain Lcr35 were developed. In order to qualify the mechanisms of action of this probiotic strain, we first tried to determine which genes were specifically involved in vivo in a murine model, using resolvase-based in vivo expression technology (R-IVET). Although this technique could not be carried through all its stages, those successfully completed are presented and commented on. We also showed that L rhamnosus Lcr35 was able to adhere rapidly and efficiently to immortalized human cervical and vaginal cells in vitro. The strain exhibited microbicidal activity against Prevotella bivia and Gardnerella vaginalis, pathogens frequently involved in bacterial vaginosis, and against the common fungal pathogen Candida albicans, the main causative agent of candidiasis. It is of interest, therefore, as a therapeutic agent for the treatment and prevention of common vaginal infection disorders. Finally, analysis of the response of human epithelial (intestinal and vaginal) and dentritic cells in vitro to contact with strain Lcr35 showed significant transcriptional modifications, especially ofr the dendritic cells. The main modifications in expression affect genes involved in immune response, antigen processing and presentation, signal transduction and - particularly in epithelial cells - cell adhesion processes. The modifications in transcriptional responses observed in the human cells were closely correlated to the bacterial inoculum in contact, thus demonstrating a dose-effect relationship

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Financiadora de Estudos e Projetos
The cave environments are oligotrophic and have specific characteristics that determine the native microbiota. Few studies have investigated the composition and function of soil microbiota of subterranean environments. This study aimed to expand the knowledge on the cave microbiota, discuss the functional role of the microbiota in these environments, isolate and select fungal strains with biotechnological potential for the degradation of cellulose. Soil epigean environment and two poins inside the cave Catão, São Desiderio BA, were sampled. The amount of total organic carbon, carbon and nitrogen in the microbial biomass and the microbial density was evaluated in the soil. All strains were evaluated for the activities of endoglucanase, β-glucosidase and total cellulase by submerged fermentation. Of these three strains of Aspergillus strains, one strain standard, and a Penicillium the process of solid state fermentation using wheat bran as substrate were selected. We observed a significant difference between epigeal and subterranean environment in relation to physical, chemical and biological soil parameters evaluated. We obtained 20 isolates belonging of the genus Aspergillus (SDC1.1, SDC 1.2, SDC 1.4, SDC 1.6, SDC 2.4, SDC 2.6, SDC 2.8, SDC 2.10, SDC 2.11, SDC 2.12), Penicillium (SDC 1.3, SDC 1.7, SDC 2.2, SDC 2.7, SDC2.9, SDC 2.13), Trichoderma (SDC 2.3), Scopulariopses (SDC 2.1) e Purpureocillium (SDC 2.5). Of all isolates showed 90% cellulolytic activity. During the submerged fermentation endoglucanase activity showed maximum values of 6.39 IU/mL in a strain of Aspergillus sp6 and maximum total cellulase activity was 1.7 IU/ml for Aspergillus sp8 strain. The strain Aspergillus sp6 showed maximum β- glucosidase activity of 13.67 IU/mL. Compared to solid-state fermentation, the Aspergillus sp6 and Aspergillus sp8 strains stood out compared to mutant strain Aspergillus niger 3T5B8, with values of endoglucanase and total cellulase activity higher whole with a lower protein content in their enzymatic extracts. From these resulados, we conclude that the cave environment presents singularities compared to epigean environment which probably allows you to select naturally microorganisms that use alternative sources for energy and nutrients.
Os ambientes cavernícolas são oligotróficos e possuem características específicas que determinam a microbiota local. Poucos estudos têm investigado a composição e funcionalidade da microbiota edáfica de ambientes subterrâneos. Este trabalho teve como objetivo ampliar o conhecimento sobre a microbiota cavernícola, discutir o papel funcional da microbiota nesses ambientes, isolar e selecionar linhagens fúngicas com potencial biotecnológico para a degradação de celulose. Foram coletadas amostras de solo do meio epígeo e de dois pontos no interior da caverna do Catão, São Desidério-BA. Nas amostras foram avaliadas as quantidades de carbono orgânico total, a densidade microbiana, carbono e nitrogênio da biomassa microbiana, bem como isoladas linhagens de fungos filamentosos. Todas as linhagens foram avaliadas quanto as atividades de endoglucanase, celulase total e β-glucosidases por meio de fermentação submersa. Dessas linhagens foram selecioandas três linhagens de Aspergillus, sendo uma linhagem padrão, e uma linhagem de Penicillium para o processo de fermentação em estado sólido, utilizando farelo de trigo como substrato. Observamos uma diferença significativa entre o meio epígeo e subterrâneo em relação aos parâmetros físicos, químicos e biológicos do solo avaliados. Obtivemos 20 isolados pertencentes aos gêneros Aspergillus (SDC1.1, SDC 1.2, SDC 1.4, SDC 1.6, SDC 2.4, SDC 2.6, SDC 2.8, SDC 2.10, SDC 2.11, SDC 2.12), Penicillium (SDC 1.3, SDC 1.7, SDC 2.2, SDC 2.7, SDC2.9, SDC 2.13), Trichoderma (SDC 2.3), Scopulariopses (SDC 2.1) e Purpureocillium (SDC 2.5). De todos os isolados 90% apresentaram atividade celulolítica. Durante a fermentação submersa a atividade endoglucanase apresentou valores máximos de 6,39 IU/mL em uma linhagem de Aspergillus sp6 e a atividade máxima de celulase total foi de 1,7 IU/mL para uma linhagem Aspergillus sp8. A linhagem Aspergillus sp6 apresentou atividade β-glucosidase máxima de 13,67 IU/mL. Em relação a fermentação em estado sólido, as linhagens Aspergillus sp6 e Aspergillus sp8 se destacaram em relação a linhagem padrão Aspergillus niger 3T5B8, com valores de atividade endoglucanase e celulase total superiores e com um menor conteúdo proteico em seus extratos enzimáticos. A partir desses resultados, concluímos que o ambiente cavernícola apresenta singularidades em relação ao meio epígeo e que provavelmente permite selecionar naturalmente microrganismos que utilizam fontes alternativas para obtenção de energia e nutrientes.

La gale commune est une des principales maladies affectant la pomme de terre. Cette maladie est causée par Streptomyces scabiei (S. scabies ), une bactérie du sol qui produit de la thaxtomine A (TA), une toxine essentielle à l'apparition des symptômes de la gale commune. En effet, la TA empêche la synthèse ou l'intégration de la cellulose dans la paroi cellulaire des cellules végétales et entraîne la mort des cellules du périderme de la pomme de terre. Comme cette maladie ne peut être contrôlée par aucun pesticide présentement homologué, il est important de développer des stratégies de lutte alternatives. Notre laboratoire étudie le mode d'action et les effets de la TA sur les cellules végétales. Nous avons réussi à augmenter la résistance à la TA de suspensions cellulaires de peuplier en augmentant progressivement la concentration de la toxine qui était ajoutée à leur milieu. Ces cellules ont conservé leur plus forte tolérance à la TA, même après avoir été cultivées en l'absence de la toxine durant plusieurs années. C'est pourquoi nous avons voulu étudier la possibilité d'utiliser cette technique pour produire des plants de pomme de terre plus résistants à la TA et éventuellement à la gale commune. Nous avons donc produit des cals à partir de segments de tiges de différents cultivars de pomme de terre, déposés sur un milieu contenant des concentrations de plus en plus élevées de TA. Une fois les cals développés, nous avons régénéré des embryons somatiques pour obtenir des plantules potentiellement plus résistantes à la phytotoxine. Pour tester cette nouvelle résistance, nous avons produit des microtubercules à partir des plantules, afin de les mettre en présence de fortes concentrations de TA et d'observer l'intensité de la nécrose résultante. Les résultats démontre que quelques lignées habituées du cultivar Russet Burbank ont semblé être plus résistantes que le cultivar parent à la TA et probablement même à la gale commune, ce qui est très encourageant. Nos expériences démontrent qu'il est possible d'habituer des cellules indifférenciées de pomme de terre à la TA, pour ensuite régénérer des lignées de pomme de terre ayant une plus grande résistance à la TA que le cultivar parent. Il serait intéressant de poursuivre l'étude afin de tester les caractéristiques agronomiques des lignées obtenues, pour s'assurer qu'elles restent intéressantes pour l'industrie et de faire une étude protéomique pour mieux comprendre les processus impliqués dans la mise en place de la résistance à la TA.

La polyarthrite rhumatoïde est une maladie auto-immune qui touche environ 1% de la population mondiale. Elle entraîne une inflammation synoviale et une destruction de l’architecture articulaire. L’articulation rhumatoïde est un milieu très inflammatoire qui est infiltré par des cellules telles que les neutrophiles, les macrophages, les monocytes, les lymphocytes B et T ; par des protéines telles que des cytokines, des chimiokines, des molécules d’adhésion, par des complexes immuns, et par des auto-anticorps comme les facteurs rhumatoïdes qui sont un marqueur spécifique de la maladie et qui permettent d’établir un pronostic sur son évolution. De plus, dans l’articulation rhumatoïde, il y aura formation d’un pannus rhumatoïde avec érosion progressive du cartilage et de l’os. Les ostéoclastes sont les cellules principalement impliquées dans cette érosion osseuse. Afin d’effectuer des études in vitro, les ostéoclastes sont généralement obtenus à partir de monocytes isolés de sang humain, ce qui rend leur étude complexe car les variations sont très grandes d’un donneur de sang à l’autre. Nous avons utilisé la lignée cellulaire d’origine myéloïde HL60 pour obtenir des ostéoclastes et avons caractérisé ces cellules HL60 « osteoclast-like » dans tous les aspects de leur fonction et de leur activation. Nous avons aussi montré que les facteurs rhumatoïdes pouvaient agir directement sur les ostéoclastes pendant leur différenciation et pendant la résorption osseuse. Cette étude nous a permis d’amorcer la compréhension du rôle possible des facteurs rhumatoïdes sur la résorption osseuse dans la polyarthrite rhumatoïde.

Etude des hydrolases de trois especes de phycomycetes anaerobies du rumen de mouton, neocallimastix frontalis, sphaeromonas communis et piromonas communis: caracterisation physicochimique, regulation de la synthese et de la secretion. Purification de la beta -glucosidase, de la beta -fucosidase et de la beta -xylosidase de n. Frontalis

Neisseria meningitidis est une bactérie diderme qui colonise le nasopharynx humain de façon commensale. Occasionnellement, elle franchit la barrière nasopharyngée et accède à la circulation sanguine où elle peut provoquer un choc septique et/ou une méningite Le pouvoir pathogène de N. meningitidis est lié à sa capacité à interagir avec les cellules endothéliales humaines. Après avoir adhéré aux cellules grâce à des organelles filamenteux, les pili de type IV, les bactéries induisent une déformation de la membrane plasmique de la cellule hôte sous la forme de protrusions riches en actine ressemblant à des filopodes. Ces protrusions permettent aux bactéries de résister aux forces de cisaillements générées par le flux sanguin et de proliférer à la surface des cellules. Contrairement à de nombreuses autres bactéries pathogènes, cette déformation de la membrane plasmique ne nécessite pas de polymérisation d’actine. Cependant, les mécanismes cellulaires et moléculaires de cette déformation sont inconnus. Dans cette étude, nous montrons que lorsque des bactéries individuelles adhèrent à la cellule hôte, la membrane plasmique se déforme en adhérant le long des fibres de pili de type IV de façon similaire au mouillage d’un liquide sur un solide. Les pili de type IV agissent donc comme un échafaudage extracellulaire qui guide les protrusions de membrane plasmique indépendamment du cytosquelette d’actine. Nous montrons également que la capacité de la membrane plasmique à se déformer le long de structures adhésives nanométriques est une propriété intrinsèque des cellules endothéliales. Ces travaux décrivent le mécanisme d’une étape importante de la pathophysiologie de N. meningitidis et mettent en évidence des propriétés nouvelles de la membrane plasmique des cellules humaines qui pourraient être impliquées dans d’autres processus fondamentaux de biologie cellulaire
Neisseria meningitidis is a diderm bacterium that is naturally found in the human nasopharynx as a commensal. Occasionally, it can cross the mucosa and reach the underlying blood vessels where it enters the circulation. Once in the bloodstream, it can cause severe septic shock and/or meningitis. The ability of N. meningitidis to cause disease is tightly linked to its ability to interact with human endothelial cells. In particular, upon bacterial adhesion via filamentous organelles called type IV pili, bacteria remodel the host cell plasma membrane in the form of actin-rich, filopodia-like protrusions. These protrusions allow bacteria to resist blood flow-generated shear stress and proliferate on top of the host cells. Unlike many other bacterial pathogens, plasma membrane remodeling induced by N. meningitidis does not require actin polymerization. Yet, the cellular and molecular mechanisms of this process are unknown. Here, we show that upon adhesion of individual bacteria, the host cell plasma membrane deforms by adhering along type IV pili fibers in a wetting-like fashion. Therefore, type IV pili act as an extracellular scaffold that guide plasma membrane protrusions in an F-actin-independent manner. We further show that the ability of the plasma membrane to deform along nanoscale adhesive structures is an intrinsic property of endothelial cells. Therefore, this study uncovers the mechanism of a key step of N. meningitidis pathophysiology and reveals novel properties of human cell plasma membrane that could be at play in other fundamental cellular processes

L'invasion des cellules par les Apicomplexa est associée à la sécrétion de protéines de micronèmes. Nous avons étudié la fonction de deux protéines, MIC1 et MIC3, possédant des propriétés d'adhésion pour la surface des cellules in vitro. Le domaine d'adhésion de MIC3 est apparenté au domaine de fixation du N-actétylglucosamine. Il est fonctionnel sous forme dimérique et seulement après clivage d'une proséquence. Deux acides aminés aromatiques indispensables à la fonction de reconnaissance de la cellule hôte ont été identifiés. Après délétion par génétique inverse des gènes MIC1 et MIC3 indépendamment ou simultanément et nous avons montré le rôle additif de ces protéines dans la virulence. Seulement le Mic1KO présente un défaut d'invasion. Le rôle de MIC3 dans la virulence dépend de ses propriétés adhésives pour la surface des cellules hôtes. Des essais de vaccination utilisant le double mutant conduisent à une protection totale des souris vis à vis d'une seconde infection par voie orale
Cell invasion by apicomplexan is associated ith secretion of microneme proteins. We have investigated the role of two soluble MIC1 and MIC3 proteins, which have affinity for cell surface. We have developped an original MIC3 binding essay by transfection of mammalian cells. The receptor binding site of MIC3 is located in the N-terminal chitin binding-like domain, which remains poorly accessible until the adjacent propetide has been cleaved, and shown that binding requires dimerization. Two aromatic amino acids in this domain have been identified to be crucial for binding to cells. Mic1KO, mic1-3KO or mic1-3KO parasites have been genetically engineered. While individual disruption of MIC1 or MIC3 genes slightly reduced virulence, doubly depleted parasites were markedly impaired in virulence and confered protection against oral cyst challenge. Deletion of the MIC1 gene alone affected fibroblast invasion. MIC3 binding function is crucial for expression of virulence

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Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq
An actinomycete strain, isolated from cane sugar bagasse (CSB), identified as Streptomyces sp was selected for its ability to produce cellulases. The production of cellulases was analyzed by submerged fermentation by cultivation on minimal medium (MM) containing CSB, wheat bran (WB) or carboxymethylcellulose (CMC) as carbon source, and yeast extract (YE) as nitrogen source. The results show that WB was the best inducer of CMCases (2.0 U.mL-1). Aiming to analyze the production of cellulases and xylanases kinetics, the isolate was inoculated in minimal medium containing 0.5% (w/v) WB and maintained for 12 days at 45°C under constant agitation of 180 rpm. The highest yield of Avicelase was observed after 264 h of cultivation (5.646 Uml-1), after 144 h for CMCase (3.872 Uml-1), after 144 h for FPase (0.0947 Uml-1) and after 288 h for Xylanase (92.40 Uml- 1). Culture supernatants with maximum activity of Avicelase, CMCase, Fpase and Xylanase were analyzed for optima pH and temperature of the respective enzymes. The highest enzyme activities were detected at pH 7.0 at 35°C for Avicelase, pH 4.5/75°C for CMCase, pH 5.5/45°Cfor FPase and pH 5.5/70°C for Xylanase. The enzymes retained more than 70% of the initial activity after 2 h incubation at 50°C. The profile proteins analyzed by zymogram demonstrated a set of secreted cellulases (37, 21 and 17 kDa) and xylanases (39, 21, 18 and 17 kDa) when grown on FT for 144 h. The saccharification assay with CSB as substrate showed that the enzyme complex was able to release 19% of glucose and 62.9% of xylose.
Uma linhagem de Actinomiceto, isolada do bagaço de cana-de-açúcar (BCA), identificada como Streptomyces sp foi selecionada pela sua capacidade de produzir celulases. A produção de celulases foi analisada por fermentação submersa (FS) pelo cultivo do isolado em meio mínimo (MM) contendo BCA, farelo de trigo (FT) ou carboximetilcelulose (CMC) como fonte de carbono, e extrato de levedura (EL) como fonte de nitrogênio. Os resultados demostraram que o FT foi o melhor indutor da produção de CMCases (2,0 U.mL-1). Com o objetivo de analisar a cinética de produção de celulases e xilanases pelo isolado, este foi inoculado em meio mínimo contendo 0,5% (w/v) FT e mantido por 12 dias a 45°C sob agitação constante de 180 rpm. A maior produção de Avicelase foi observada após 264 h de cultivo (5,646 UmL-1), de CMCase após 144 h (3,872 UmL-1), de FPase após 144 h (0,0947 UmL-1) e de Xilanase após 288 h (92,40 UmL-1). Os sobrenantes de cultura com atividade máxima de Avicelase, CMCase, FPase e Xilanase foram analisados quanto ao pH e temperatura ótimos das respectivas enzimas. Os resultados obtidos demonstraram que a maior atividade de Avicelase foi detectada em pH 7,0 a 35°C; CMCase apresentou melhor atividade em pH 4,5 a 75°C; FPase apresentou melhor atividade em pH 5,5 a 45°C e Xilanase apresentou melhor atividade em pH 5,5 a 70°C. Quanto à termoestabilidade, as enzimas presentes mantiveram mais de 70% da atividade inicial após 2 h de incubação a 50°C. O perfil de proteínas analisado por zimograma demonstrou que o isolado secretou um conjunto de celulases (37, 21 e 17 KDa) e xilanases (39, 21, 18 e 17 KDa) quando cultivado em FT por 144 h. No ensaio de sacarificação de BCA o complexo enzimático foi capaz de liberar 19% de glicose e 62,9% de xilose.

Les listeria sont des bacilles gram + dont la seule espèce pathogène pour l'homme est l. Monocytogènes. Le site d'entrée de la bactérie dans l'organisme serait l'intestin cependant la cellule permettant le passage de la barrière intestinale n'est pas connue. Il existe in vitro des cellules sensibles (pénétration forte de la bactérie et multiplication intracellulaire) et des cellules résistantes (pénétration faible sans multiplication intracellulaire) a l'infection. Nous avons donc essaye de comprendre le mécanisme d'entrée de la bactérie en se basant sur cette différence d'entrée dans les cellules. L'infection in vitro par le test pm mesurant la pénétration et la multiplication des bactéries dans les cellules sensibles caco-2 et le test pf mesurant le nombre de plage de lyse dans les tapis cellulaires a permis de montrer une relation entre l'infection des cellules sensibles et la virulence des souches. Par comparaison avec les résultats de virulence appréciée avec le modèle in vivo utilisant des souris immunodéprimées, la sensibilité des 2 tests est de 1. La spécificité du test pm est de 0,84 et celle du test pf de 0,89. La validation d'un test de virulence base sur le test pf est en cours. L'étude des facteurs favorisant l'infection in vitro a montré un rôle de la transformation cellulaire. En étudiant les facteurs modifiés par ce processus, il s'est avéré que la prolifération cellulaire favorise la pénétration de la bactérie. Il existe 2 voies d'entrée différentes de l. Monocytogènes dans les cellules. L'entrée dans les cellules prolifératives est dépendante des microfilaments alors que dans les cellules non prolifératives, elle implique une endocytose médiée par les microtubules et les récepteurs lies aux puits recouverts. L'infection des 2 types de cellules nécessite l'expression par la bactérie du locus inlab. La pénétration de l. Monocytogènes nécessite les tyrosines kinases cellulaires qui sont activées des 5 minutes d'infection. Lors de sa pénétration dans les cellules prolifératives et non prolifératives, l. Monocytogènes active une ou plusieurs kinases de la famille de pp60#c#-#s#r#c. Cette activation est indépendante du locus inlab. La connaissance de l'utilisation par l. Monocytogènes de la machinerie cellulaire devrait permettre d'elaborer une methode pour empêcher la bactérie de passer la barrière intestinale.

Klebsiella pneumoniae (Kp) est une des principales espèces responsables d’infections nosocomiales et aussi l’agent d’un syndrome émergent, l’abcès primitif du foie. Une résistance croisée à la céfoxitine (FOX) et à d’autres antibiotiques dont les fluoroquinolones (FQ), liée à l’augmentation de l’efflux de ces molécules, a été récemment décrite chez Kp. A partir de 3 isolats cliniques de phénotype « efflux » et de leurs révertants sensibles à tous les antibiotiques, des mutants aux porines altérées ont été sélectionnés in vitro. Dans le modèle Caenorhabditis elegans, nous avons montré pour la 1e fois que les souches surexprimant un système d’efflux étaient plus virulentes que les révertants tandis que celles ayant une altération des porines l’étaient moins. A partir des révertants, des mutants de phénotype « efflux » ont été sélectionnés in vitro en présence de FOX (n=5) ou de FQ (n=12) à des concentrations égales à 0,25 puis 4 fois la concentration minimale inhibitrice (CMI). Il a été montré par RT-PCR que 16 des 17 mutants et 2 des 3 isolats cliniques surexprimaient le gène acrB. Une mutation ponctuelle dans le gène soxR a été détectée chez un mutant et une modification du gène ramR chez 9 autres mutants (8 mutations ponctuelles et une délétion complète). Le rôle de RamR et SoxR dans la résistance par efflux a été démontré par complémentation avec les gènes sauvages. Les mécanismes en cause chez les 7 mutants restants et les 3 isolats cliniques sont en cours d’étude. Enfin, la mesure des CMI d’un large panel d’antibiotiques a permis de définir ceux dont l’activité est amoindrie par la surexpression d’un système d’efflux ou l’altération des porines.