Tesi sul tema "Bactéries oxydant les nitrites"

L'utilisation de pesticides est essentielle pour augmenter les rendements agricoles, mais ces produits chimiques peuvent manquer leurs cibles, s'accumuler dans le sol et nuire aux micro-organismes qui sont importants pour la santé de l'écosystème. Les évaluations traditionnelles des risques liés aux pesticides n'ont pas entièrement pris en compte la toxicité des pesticides pour les micro-organismes. Pour remédier à cette situation, un système à plusieurs niveaux a été proposé pour évaluer les effets des pesticides sur un groupe microbien clé, les micro-organismes oxydant l'ammoniac (AOM). Le système comprend des tests de toxicité in vitro (niveau I) aux microcosmes de sol puis aux études en pots (niveau II), et enfin aux évaluations à l'échelle du terrain (niveau III). Les principaux objectifs de cette thèse étaient de i) développer et valider un essai biologique in vitro utilisant l'AOM et des bactéries oxydantes des nitrites (NOB) fonctionnellement apparentées comme essai standard de niveau I, lié aux tests monospécifiques couramment utilisés en écotoxicologie aquatique, ii) comparer la toxicité des pesticides sur l'AOM avec un kit d'évaluation de la toxicité disponible dans le commerce, et iii) caractériser la physiologie de la souche de NOB Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1, l'une des souches les plus sensibles aux pesticides identifiés dans cette thèse. La toxicité de pesticides représentatifs (insecticides, fongicides et herbicides) a été évaluée sur plusieurs AOM, y compris des bactéries oxydant l'ammoniac (AOB), des archées oxydant l'ammoniac (AOA) et des NOB. Les seuils de toxicité (EC50) ont été déterminés pour chaque combinaison souche-pesticide, Nitrosotalea sinensis Nd2 (AOA), Nitrosospira briensis (AOB) et Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1 (NOB) ont été identifiées comme les souches les plus sensibles et les bioindicateurs appropriés pour l'essai biologique proposé sur une seule espèce. Les fongicides et les insecticides étaient généralement plus toxiques pour AOM que pour NOB, tandis que les herbicides présentaient une toxicité variable pour tous les groupes de nitrifiants. Sur la base de ces résultats, la toxicité d'autres pesticides de différentes catégories sur les trois souches les plus sensibles a été évaluée. En utilisant l'essai in vitro proposé pour une seule espèce, les valeurs EC50 ont confirmé que ces souches étaient des bioindicateurs efficaces pour les essais de toxicité de niveau I. Les fongicides étaient les plus toxiques pour les AOM que pour les NOB. Les fongicides ont été les plus toxiques pour N. sinensis, provoquant une inhibition significative à des niveaux de concentration agronomiques. Les sensibilités différentes de ces souches à diverses classes de pesticides soulignent la nécessité d'une approche globale qui saisisse un large spectre de réponses microbiennes. L'évaluation de la toxicité des pesticides à l'aide du kit MARA (Microbial Assay for Risk Assessment), qui utilise 11 souches microbiennes hétérotrophes pour détecter la toxicité des pesticides, a montré une sensibilité relativement faible, les pesticides n'affectant ces souches qu'à des concentrations élevées, contrairement à l'AOM qui a montré une sensibilité beaucoup plus élevée aux pesticides. La physiologie de Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1, l'un des bioindicateurs identifiés, a montré une tolérance à l'acide avec une croissance optimale à un pH de 6,0 et une croissance détectable jusqu'à un pH de 3,5. En co-culture, cette souche a favorisé la croissance d'AOA acidophiles, telles que Nitrosotalea devaniterrae Nd1 et N. sinensis, en éliminant les nitrites inhibiteurs. Ce mécanisme de mutualisme trophique souligne l'importance des concentrations de substrat dans les interactions microbiennes dans les sols acides
The use of pesticides is essential for boosting agricultural yields, but much of these chemicals miss their targets, accumulating in soil and harming ecosystems and microorganisms. Despite the importance of soil microbes in ecosystem health, traditional pesticide risk assessments have not fully addressed the toxicity of pesticides on them. To address this, recent studies proposed a tiered system to assess pesticide effects on the key microbial group of ammonia-oxidizing microorganisms (AOM). The system progresses from in vitro toxicity tests (Tier I) to soil microcosms or pot studies (Tier II), and finally to field-scale evaluations (Tier III). The main objectives of this thesis were to i) develop and validate an in vitro bioassay using AOM and functionally related NOB as a standard Tier I assay, related to the single-species tests commonly used in aquatic ecotoxicology, ii) compare the toxicity of pesticides on AOM with an existing toxicity assessment assay, the Microbial Assay for Risk Assessment (MARA) kit from NCIMB (Scotland), and iii) characterize the physiology of Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1, one of the most sensitive strains identified in this thesis. The toxicity of representative pesticides—covering insecticides, fungicides, and herbicides— was assessed on several ammonia-oxidizing microorganisms (AOM), including ammonia-oxidizing bacteria (AOB), ammonia-oxidizing archaea (AOA), and nitrite-oxidizing bacteria (NOB). Toxicity endpoints (EC50) were determined for each strain-pesticide combination, with Nitrosotalea sinensis Nd2 (AOA), Nitrosospira briensis (AOB), and Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1 (NOB) identified as the most sensitive strains and suitable bioindicators for the proposed single species bioassay. Fungicides and insecticides were generally more toxic to AOM than NOB, while herbicides showed variable toxicity across all nitrifier groups. This testing approach proved valuable for Tier I ecotoxicity assessments of pesticides on soil microbial communities. Building on these findings, toxicity of additional pesticides from different categories on the three most sensitive strains was assessed. Using the proposed single-species in vitro assay, EC50 values confirmed these strains as effective bioindicators for Tier I testing framework. N. sinensis was the most sensitive strain, followed by N. briensis and Ca. N. laanbroekii NHB1, indicating these strains are promising bioindicators for pesticide toxicity in soil. Fungicides were most toxic to N. sinensis, causing significant inhibition at agronomical concentration levels. The differential sensitivities of these strains to various pesticide classes highlight the need for a comprehensive approach that captures a broad spectrum of microbial responses. The evaluation of pesticides toxicity using the MARA kit, which uses 11 heterotrophic microbial strains to detect toxicity, demonstrated relatively low sensitivity, with pesticides affecting these strains only at high concentrations, in contrast to AOM which showed much higher sensitivity to pesticides. The physiology of Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1, one of the identified bioindicator was also characterised. The strain demonstrated an acidotolerant physiology with optimal growth at pH 6.0 and detectable growth down to pH 3.5. In co-culture, Ca. N. laanbroekii NHB1 enhanced the growth of acidophilic ammonia-oxidizing archaea (AOA), such as Nitrosotalea devaniterrae Nd1 and N. sinensis, by removing inhibitory nitrite. This cross-feeding mechanism underscores the importance of substrate concentrations in microbial interactions in acidic soils

La première partie de ce travail est réalisé dans le but de préparer des produits pouvant jouer un rôle très important de l’imagerie cellulaire des lipopolysaccharides sur la surface des cellules bactériennes, tout en utilisant des méthodes fiables telle que la ‘’chimie click’’. Dans un premier temps, nous avons synthétisé une première génération d’outils fluorescents à base de rhodamine B et fluorescéine modifiée par une fonction oxyde de nitrile. Dans un deuxième temps nous avons cherché les meilleures conditions d’applications de la chimie click 3+2 sans cuivre, entre la fonction oxyde de nitrile et le motif saccharidique complémentaire portant une fonction vinylique. Finalement, nous avons appliquée, avec succès, la méthode click avec cuivre sur plusieurs types de bactéries portant sur leur membrane cellulaire des lipopolysaccharides ayant un motif ‘’Kdo’’ fonctionnalisé par un groupement azoture déjà synthétiser au sein de notre équipe, et une sonde fluorescente porteuse d’une fonction alcyne. Une nouvelle génération d’outils de marquage saccharidique est en cours de finalisation dans le but d’optimiser les conditions finales, tel que le dérivé de ‘’Kdo’’ fonctionnalisé cette fois-ci par des dérivées cycliques, bicycliques et aromatiques porteurs d’une fonction alcyne ou alcène, pour réaliser les derniers essais de marquage in vitro. Le stress oxydant est lié au vieillissement des cellules et à de nombreuses maladies: cardiovasculaire, cancer, diabète, Alzheimer… Il est dû à un déséquilibre entre le système oxydant / antioxydant au niveau des cellules, et se caractérise par la présence principalement de substance radicalaires réactives oxygénées. Dans le but d'identifier le taux de substances réactives oxygénées dans les cellules, le travail dans la deuxième partie de la thèse reposait sur la synthèse multi étape d'une molécule fluorescente dérivée de la coumarine. Le composé ciblé est le peroxyde d'oxygène, connu sous le nom d'eau oxygénée. Possédant un ester vinyl-boronique, notre molécule sera oxydée et réarrangée en aldéhyde conduisant à la condensation intramoléculaire avec le groupement aminé adjacent pour former un cycle indolique, libérant ainsi de la fluorescence. La recherche des conditions optimales de la dernière étape de la voie synthétique sont toujours en cours d’optimisation. Dans le futur, on cherchera les conditions optimales de la dernière étape de la synthèse de la sonde spécifique au peroxyde d’oxygène. Cette molécule est d'une importance remarquable comme sonde du stress oxydant. En réussissant cette étape, on pourra avoir en main une bibliothèque de ‘’KDO’’ fonctionnalisé afin d’avoir des résultats satisfaisants in vivo
The first part of this work is done in order to prepare products that play a very important role in cellular imaging lipopolisaccharides on the surface of bacterial cells, while using reliable methods such as '' click chemistry ''. Initially, we synthesized the first generation of tools based fluorescent rhodamine B and fluorescein -modified nitrile oxide function. In a second step we sought the best possible applications of click chemistry 3+2 copper free, between the nitrile oxide function and the additional saccharide unit with a vinyl function. Finally, we applied successfully, the click method with copper on several types of bacteria on their cell membrane lipopolysaccharides having a pattern Kdo functionalized azide group already synthesized within our team, and a probe carrying a fluorescent alkyne. A new generation of tools saccharide marking is being finalized in order to optimize the final terms, such as derivative functionalized Kdo this time by cyclic, bicyclic and aromatic derivatives holders of an alkene or alkyne function to perform final testing of in vitro labeling. Oxidative stress is linked to cell aging and many diseases: cardiovascular disease, cancer, diabetes, Alzheimer's ... It is due to an imbalance between oxidant system/antioxidant in cells, and is characterized mainly by the presence of radical substance reactive oxygen. In order to identify the rate of reactive oxygen substances in cells, work in the second part of the thesis based on multi- step synthesis of a fluorescent molecule derived from coumarin. The target compound is oxygen peroxide, known as the name of hydrogen peroxide. Having a vinyl boronic ester, this molecule will be oxidized and rearranged aldehyde leading to intramolecular condensation with the adjacent amino group to form an indolique ring , thereby releasing fluorescence. The search for optimal conditions for the last step of the synthetic pathway is still being optimized. In the future, the optimal conditions for the last step of the synthesis of specific probe oxygen peroxide are sought. This molecule is remarkable importance as a probe of oxidative stress. By passing this step, we will have on hand a library of KDO functionalized to have satisfactory results in vivo

Campylobacter jejuni est une bactérie à Gram négative microaérophile pathogène responsable d'un grand nombre d'entérites d'origine alimentaire. Cette bactérie est capable de survivre dans différents environnements et de s'adapter à des conditions non optimales pour sa croissance. Parmi ces conditions, le stress oxydant constitue un stress majeur pour tous les organismes vivants provoquant un déséquilibre du potentiel redox et l��inactivation de nombreuses protéines. Parmi les différentes enzymes permettant un retour à l’équilibre. Seul le système thiorédoxine-thiorédoxine réductase (TrxAB) a été annoté chez C. Jejuni. Au cours de ce travail nous avons analysé l’importance de ce système dans l’adaptation au stress oxydant chez C. Jejuni. Pour cela nous avons développé un milieu de culture synthétique dont tous les composants et leurs concentrations sont connus (milieu MCLMAN), il nous a permis d’étudier la réponse au stress oxydant de cette bactérie. L’identification des protéines spécifiquement réduites par TrxAB a montré que ce couple participe au fonctionnement de toutes les grandes voies métaboliques, certaines de ces enzymes sont uniques et considérées vitales dans d’autres organismes. Le système TrxAB semble vital, les gènes correspondants n’ont pas pu être inactivés
Campylobacter jejuni, a microaerophilic pathogen Gram-negative bacterium, is the causative agent of a large number of food-borne enteritis. This bacterium is able to survive in different environments and adapt to non-optimal growth conditions. Among these conditions, oxidative stress is a major stress for all living organisms that disturbs the cellular redox potential and inactivates numerous enzymes. Various systems can allow reversion but genome annotation of C. Jejuni suggests that it possesses the thioredoxin-thioredoxin reductase (TrxAB) system only. Therefore, importance of this system was analysed during C. Jejuni oxidative stress adaptation. Thus, we developed a synthetic medium having defined compound composition (MCLMAN medium) allowing the study of this bacterium oxidative stress response. Identification of proteins specifically reduced by TrxAB revealed its contribution to all main metabolic pathways; including reduction of unique enzymes considered as essential for other organisms. Furthermore, TrxAB encoding genes could not be inactivated in C. Jejuni thus TrxAB system appears of vital importance in this bacterium

Les Bactéries Lactiques (BL), largement utilisées dans l'industrie pour la fabrication des produits laitiers fermentés, sont exposées au stress oxydant ce qui conduit à des pertes de rendement et diminue leur survie. De même, chez l'Homme, la formation d'espèces oxygénées réactives (ROS) par les phagocytes peut conduire dans le cas d'une inflammation anormale à un stress oxydant et à une perte de l'homéostasie intestinale. Le premier objectif de ce travail était l'obtention de souches de BL aux capacités antioxydantes améliorées et l'étude de leur physiologie lors d'un stress oxydant. Deux stratégies ont été développées. I) Des mutants spontanés de Lactococcus lactis résistant au stress oxydant (SpOx) et utilisables en industrie ont été obtenus. Les modifications moléculaires provoquées par la mutagenèse ont été identifiées par analyse protéomique. Ii) Une catalase a été introduite par ingénierie génétique chez des souches de BL ce qui a permis d'éliminer H2O2, augmentant la survie lors d'un stress oxydant. Le deuxième objectif était d'évaluer les effets d'une BL antioxydante dans la prévention et le traitement de pathologies intestinales liées à la formation de ROS. Les effets de l'administration de Lb. Casei produisant ou non MnKat ont été caractérisés dans un modèle murin d'inflammation intestinale. Indépendamment de la production de MnKat, Lb. Casei limite les signes inflammatoires coliques. Ces résultats confirment l'intérêt de l'utilisation de Lb. Casei pour traiter des pathologies inflammatoires intestinales. L'identification des mécanismes responsables de ces effets anti-inflammatoires pourrait permettre une meilleure compréhension des effets des probiotiques
Lactic acid bacteria (LAB), widely used for the production of fermented dairy products, are often exposed to oxidative stress leading to the decreases of production rates and of LAB survival. In human, the production of ROS by immune cells can led to oxidative stress and to a loss of intestinal homeostasis in the case of abnormal inflammation. The first aim of this work was to obtain LAB strains with improved antioxidative capacities and to study their behaviour during oxidative stress. We developed two strategies: i) Spontaneous Oxidative stress resistant mutants (SpOx) of Lactococcus lactis were obtained using natural selection. The molecular modifications induced by the mutagenesis were identified using a comparative proteomic analysis. Ii) A catalase was introduced in LAB strains which are to eliminate H2O2 and have an improved survival when exposed to oxidative stress. The second aim of this work was to evaluate preventive or therapeutic effects of an antioxidative LAB strain in the case of intestinal disorders related to oxidative stress. The effects of Lb. Casei, producing or not MnKat, administration were characterized using an intestinal colitis model in mice. Independently to the presence of MnKat, Lb. Casei administration reduces inflammatory scores of colonic mucosa. Identification of the mechanisms leading to anti-inflammatory properties of Lb. Casei BL23 could help to better understand the probiotics effects. These results confirm the high interest of Lb. Casei utilisation for the treatment of intestinal inflammatory diseases

Des bacteries sulfo-oxydantes (161) ont ete obtenues a partir d'echantillons de fluide, d'invertebres et de fragments de cheminee, preleves sur deux nouveaux sites hydrothermaux (2000 m), dans des bassins arriere-arc; le bassin de lau et le bassin nord fidjien. Plusieurs types de bacteries chimioheterotrophes ont ete isoles. Elles entrainent une transformation du thiosulfate, soit en sulfate (acidifiantes), soit en polythionates (alcalinisantes). La plupart des bacteries acidifiantes passent par un stade transitoire alcalin. Ce sont des bacilles gram negatif. 37% ont un metabolisme fermentatif et 88% reduisent les nitrates en nitrites ou denitrifient. La taxonomie numerique et l'analyse du g+c% permettent de les identifier aux genres pseudomonas, acinetobacter et vibrio. Trois isolats ont ete apparentes aux thiobacilles autotrophes stricts. Ils sont identiques. Ils se developpent sur differents composes soufres reduits: thiosulfate, tetrathionate, sulfure et soufre elementaire sans passer par un stade intermediaire polythionate. Ce sont des micro-organismes a ubiquinone q-8, halophiles moderes, presentant une croissance optimale a ph 7,5 et a 35c. Au vu de la composition en guanine et cytosine (67,1 mol%) et du profil des acides gras, ces organismes sont des representants d'une nouvelle espece. Les sequences de l'arnr 16s confirment cette hypothese en les placant, avec thiobacillus neapolitanus, dans un nouvel embranchement de la subdivision gamma des proteobacteries. Le nom thiobacillus hydrothermalis est propose pour cette nouvelle espece

Par leurs activités métaboliques de consommation d'hydrogène et de production de sulfures, les bactéries sulfato-réductrices sont les principales responsables des phénomènes de corrosion métallique en l'absence d'oxygène. Une étude physiologique et enzymatique de quelques Desulfovibrio a contribué à la compréhension du rôle de ces bactéries dans les phénomènes de biocorrosion anaérobie. Desulfovibrio (D. ) vulgaris en milieu organique, après avoir oxydé le lactate, consomme l'hydrogène formé par la réaction électrochimique de dissolution du fer. Les Desulfovibrio peuvent être responsables soit d'une corrosion par contact direct avec le métal en utilisant la couche d'H2 formé à sa surface, (les bactéries sont alors adsorbées à la surface grâce à un réseau cristallin de sulfure de fer), soit d'une corrosion à distance en consommant l'hydrogène dissous ou gazeux. Comme leurs hydrogénases peuvent être stables dans le temps indépendamment de la structure cellulaire (D. Vulparis) et actives aux températures élevées (à 70°C - 75°C) (D. Baculatus), ces bactéries peuvent agir dans des conditions incompatibles avec la viabilité des cellules mais compatibles avec l'expression enzymatique. Une étude en fonction de la température a montré qu'à l'intérieur même du groupe mésophile des Desulfovibrio, le comportement vis-à-vis de ce paramètre est spécifique de chaque bactérie, ce qui rend compte de la présence permanente des représentants de cette population dans les sites où les variations de température sont importantes. Un changement de quelques degrés Celsius peut provoquer des modifications dans les rendements de croissance des bactéries et par conséquent des variations dans l'intensité de la corrosion. En plus du sulfate D. Multispirans peut réduire avec des vitesses spécifiques de croissance différentes, le nitrate, le nitrite et le fumarate. Certains sulfato-réducteurs pourront donc s'adapter aux variations de concentrations en accepteurs d'électrons et également métaboliser des substances oxydées utilisées comme biocides. Le choix d'un accepteur d'électrons plutôt que d'un autre ne dépend pas uniquement de la spécificité de l'équipement enzymatique de la bactérie, mais de sa sensibilité à l'action inhibitrice de certaines de ces molécules oxydées.

Le contrôle de la qualité microbiologique de l'eau potable repose sur le dénombrement de bactéries coliformes et de bactéries hétérotrophes aérobies et anaérobies, faisant intervenir des méthodes traditionnelles de culture sur milieux nutritifs gélosés. Seule une petite fraction (environ 1%) de ces bactéries est cultivable du fait de conditions de culture inappropriées (température, pH, disponibilité en eau et nutriments) à la croissance de populations bactériennes diversifiées. Ceci conduit à une sous-estimation du nombre réel de bactéries viables. Ces méthodes de mesures par culture sont donc loin d'être satisfaisantes pour la numération des micro-organismes subissant un stress oxydant (lors de la désinfection des eaux par exemple). En outre, elles ont le désavantage de nécessiter des temps d'incubation longs de 24h à 15 jours. Au contraire, l'utilisation de techniques de comptage par microscopie combinées avec un marquage par des fluorochromes permet une énumération rapide des bactéries. Cependant, elles n'autorisent qu'un dénombrement total des cellules bactériennes (i. E. Sans distinguo entre cellules vivantes et mortes). Une étude pionnière dans les années 90 montrait chez des bactéries exposées au chlore (HC1O), une perte de fluorescence du DAPI (fluorochrome marqueur d’acides nucléiques), suggérant ainsi une possibilité de repérer des bactéries blessées par les oxydants. Nous avons prolongé ces observations initiales en travaillant avec d'autres fluorochromes marqueurs d'acides nucléiques (SYBR-II, TOTO-1, PI) combinés à l'utilisation de la cytométrie en flux (plus quantitative et indépendante de l'observateur comparativement à la technique de microscopie en épifluorescence). Nous avons ainsi confirmé que l'oxydant chlore (HC1O/CIO-) altère la perméabilité membranaire des cellules bactériennes mais provoque aussi, comme l'ozone, des dommages des polymères intracellulaires (ADN et ARN). Des essais in vitro sur des solutions d'acides nucléiques montrent que la perte de fluorescence est concentration dépendante, suggérant plusieurs mécanismes d'altération de l'ARN ou de l'ADN par le chlore. Les trois fluorochromes testés sont sensibles à ces altérations, ce qui indirectement nous a amené à mettre en cause l'utilisation de PI traditionnellement employé comme marqueur de perméabilité membranaire. Par contre, les modifications chimiques causées par d'autres désinfectants (dioxyde de chlore, C1O2 ou monochloramine, NH2C1) ne changent pas l'efficacité du marquage des acides nucléiques par les fluorochromes. A l'aide d’une bactérie génétiquement modifiée, présentant une fusion des gènes umuC et umuD avec le gène lacZ, nous avons pu observer que l'expression du système SOS de réparation de l'ADN était compromise pour des concentrations de chlore proches de celles conduisant à une perte de cultivabilité des bactéries. Cette observation permet alors de définir une concentration de chlore efficace (conduisant à une vrai désinfection) pour laquelle les dommages causés à l'ADN sont non réparables (lésions irréversibles). En travaillant avec des eaux prélevées sur usine de potabilisation, nous avons pu observer la présence quasi-systématique de deux populations dites LNA (low nucleic acid content- ayant un faible contenu en acides nucléiques) et HNA (high nucleic acid content- ayant un fort contenu en acides nucléiques) et surtout montrer la grande sensibilité de cette dernière à l’action du chlore. Les résultats obtenus au cours de cette étude montrent que la perte du signal de fluorescence de fluorochromes marquant des bactéries chlorées ou ozonées peut servir de méthode de contrôle rapide (moins d'une heure) de désinfection de l'eau en usine de traitement d'eau potable.

Le contrôle de la qualité microbiologique de l'eau potable repose sur le dénombrement de bactéries coliformes et de bactéries hétérotrophes aérobies et anaérobies, faisant intervenir des méthodes traditionnelles de culture sur milieux nutritifs gélosés. Seule une petite fraction (environ 1%) de ces bactéries est cultivable du fait de conditions de culture inappropriées (température, pH, disponibilité en eau et nutriments) à la croissance de populations bactériennes diversifiées. Ceci conduit à une sous-estimation du nombre réel de bactéries viables. Ces méthodes de mesures par culture sont donc loin d'être satisfaisantes pour la numération des micro-organismes subissant un stress oxydant (lors de la désinfection des eaux par exemple). En outre, elles ont le désavantage de nécessiter des temps d'incubation longs de 24h à 15 jours. Au contraire, l'utilisation de techniques de comptage par microscopie combinées avec un marquage par des fluorochromes permet une énumération rapide des bactéries. Cependant, elles n'autorisent qu'un dénombrement total des cellules bactériennes (i. E. Sans distinguo entre cellules vivantes et mortes). Une étude pionnière dans les années 90 montrait chez des bactéries exposées au chlore (HC1O), une perte de fluorescence du DAPI (fluorochrome marqueur d’acides nucléiques), suggérant ainsi une possibilité de repérer des bactéries blessées par les oxydants. Nous avons prolongé ces observations initiales en travaillant avec d'autres fluorochromes marqueurs d'acides nucléiques (SYBR-II, TOTO-1, PI) combinés à l'utilisation de la cytométrie en flux (plus quantitative et indépendante de l'observateur comparativement à la technique de microscopie en épifluorescence). Nous avons ainsi confirmé que l'oxydant chlore (HC1O/CIO-) altère la perméabilité membranaire des cellules bactériennes mais provoque aussi, comme l'ozone, des dommages des polymères intracellulaires (ADN et ARN). Des essais in vitro sur des solutions d'acides nucléiques montrent que la perte de fluorescence est concentration dépendante, suggérant plusieurs mécanismes d'altération de l'ARN ou de l'ADN par le chlore. Les trois fluorochromes testés sont sensibles à ces altérations, ce qui indirectement nous a amené à mettre en cause l'utilisation de PI traditionnellement employé comme marqueur de perméabilité membranaire. Par contre, les modifications chimiques causées par d'autres désinfectants (dioxyde de chlore, C1O2 ou monochloramine, NH2C1) ne changent pas l'efficacité du marquage des acides nucléiques par les fluorochromes. A l'aide d’une bactérie génétiquement modifiée, présentant une fusion des gènes umuC et umuD avec le gène lacZ, nous avons pu observer que l'expression du système SOS de réparation de l'ADN était compromise pour des concentrations de chlore proches de celles conduisant à une perte de cultivabilité des bactéries. Cette observation permet alors de définir une concentration de chlore efficace (conduisant à une vrai désinfection) pour laquelle les dommages causés à l'ADN sont non réparables (lésions irréversibles). En travaillant avec des eaux prélevées sur usine de potabilisation, nous avons pu observer la présence quasi-systématique de deux populations dites LNA (low nucleic acid content- ayant un faible contenu en acides nucléiques) et HNA (high nucleic acid content- ayant un fort contenu en acides nucléiques) et surtout montrer la grande sensibilité de cette dernière à l’action du chlore. Les résultats obtenus au cours de cette étude montrent que la perte du signal de fluorescence de fluorochromes marquant des bactéries chlorées ou ozonées peut servir de méthode de contrôle rapide (moins d'une heure) de désinfection de l'eau en usine de traitement d'eau potable.

La Pyruvate: Ferrédoxine oxydoréductase (PFOR) est une enzyme clef des métabolismes anaérobies qui catalyse l'oxydation réversible du pyruvate en acétyl-coenzymeA et CO2. Généralement, cette enzyme présente une grande sensibilité à l'oxygène induite par la présence de centres [4Fe-4S]2+/1+ dans la protéine. La caractérisation extensive de la PFOR de Desulfovibrio africanus (Da) a révélé une stabilité inédite de cette protéine en présence d'air. Mon travail a permis de spécifier le mécanisme de protection de la PFOR de Da à l'aide d'une étude de mutagenèse dirigée associée à des expériences in vivo. Le mécanisme est dépendant d'un « switch rédox » de deux cystéines qui permettrait de positionner une méthionine dans l'environnement immédiat d'un centre [4Fe-4S] afin de le protéger des dommages oxydatifs. Les analyses in vivo ont démontré que, dans les cellules, la PFOR de plusieurs Desulfovibrio, est efficacement protégée contre un stress oxydant. De plus, la forme stable mais inactive de l'enzyme qui est formée au cours de l'oxydation peut être réactivée par un retour en conditions réductrices. Cette réactivation correspond au clivage du pont di sulfure présent dans l'enzyme oxydée. Afin de caractériser les partenaires moléculaires catalysant, in vivo, ce clivage, nous nous sommes intéressés aux systèmes thiol-rédox des Desulfovibrio. Dans ce contexte, nous avons initié l'étude des thiorédoxines et des thiorédoxine réductases de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH). En parallèle, nous avons étudié le rôle physiologique de la PFOR chez DvH, en mettant en œuvre une stratégie de délétion du gène porR. A l'heure actuelle, nous n'avons pas obtenu le mutantporK. Cependant nous avons démontré que ce gène appartenait à. Un opéron codant pour plusieurs protéines reliées fonctionnellement. Ainsi, la PFOR ferait parti d'un super-complexe impliqué dans l'oxydation du substrat énergétique et la production d'ATP
The Pyruvate-Ferredoxin Oxidoreductase (PFOR) is a key enzyme of anaerobic metabolisms that catalyses the reversible oxidation of pyruvate in acetyl-coenzymeA and CO2. Usually, this enzyme is highly sensitive to oxygen, because of the presence of iron- sul fur clusters. However, extensive studies of Desulfovibrio africanus (Da) PFOR pointed out a surprising stability of this protein when exposed to air. My PhD work wanted to get a better understanding of the protective mechanism of Da PFOR, using a directed-mutagenesis. Approach coupled to in vivo assays. We characterized a redox switch mechanism involving two cysteines that would direct the positioning of a methionine near one of the iron-sulfur clusters, thus protecting it from oxidative damages. In vivo analysis showed that PFORs from several Desulfovibrio species, are efficiently protected against oxidative stress. This redox-switch leads to a stable but inactive form of the enzyme under oxidative conditions that can be reactivated, in vivo, when conditions are shifted back to reducing ones. This reactivation requires the reduction of the disulfide bond of the oxidized enzyme. In order to identify the molecular partners that catalyse this reduction in vivo, we have started to study the thioredoxins and thioredoxin reductases of Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH). We also studied the PFOR physiological role in DvH, using a gene deletion approach , although until now, we haven't been able to obtain the porK mutant. But we have shown that this gene belongs to an operon coding for several proteins functionally linked. Therefore, the PFOR might be part of a supra-complex involved in the oxidation orthe energetic substrate and ATP production

A l'aube du XXIème siècle, les nanosciences et nanotechnologies promettent des progrès remarquables dans de nombreux domaines, mais soulèvent aussi de nombreuses inquiétudes en particulier au sujet de leurs effets sur la santé humaine et l'environnement. Cette étude a pour objectif d'apporter des éléments de réponse à la compréhension de la nature et de l'origine des effets biologiques de nanoparticules manufacturées : les oxydes de titane et les nanotubes de carbone. Pour cela les effets sur la viabilité cellulaire, la localisation cellulaire et la capacité à provoquer un stress oxydant, d'un panel de ces nanoparticules caractérisées de façon poussée ont été regardés in vitro sur deux modèles cellulaires : les cellules alvéolaires humaines A549 permettant de se placer dans un contexte d'exposition de l'homme par voie respiratoire et les bactéries Escherichia coli MG1655 et Cupriavidus metallidurans CH34 permettant de se placer dans un contexte de contamination environnementale. Il apparaît que les nanoparticules étudiées ne sont pas inertes pour ces différents modèles et que la nature et l'intensité des effets observés dépendent non seulement du modèle mais surtout des conditions d'exposition et des caractéristiques physicochimiques des nanoparticules qui pour certaines ont pu être identifiées comme prépondérantes.

La bactérie hyperthermophile Thermotoga maritima a été cultivée dans un fermenteur dans lequel la concentration en O2 a été rigoureusement contrôlée. A 80°C et pH 7, il a été démontré que T. maritima pouvait survivre à des expositons de durées variables à l’O2 et qu’elle était capable de le consommer. La vitesse spécifique de consommation de l’O2 a été estimée à 73.6 µmoles O2.min-1.g protéines-1 lors d’une courte exposition à l’O2 (30 min). De longues expositions à l’O2 (20 h) nous ont permis de démontrer que la présence d’O2 ralentissait la croissance de T. maritima et conduisait à un shift du métabolisme vers la production de lactate aux dépens de l’acétate et à un arrêt de production d’H2. Dans ces conditions, il a été constaté que 73% du glucose était consommé selon un métabolisme partiellement oxydatif faisant intervenir simultanément les deux voies Embden-Meyerhof et Entner-Doudoroff de la glycolyse. En l’occurrence, l’oxydation incomplète du glucose est corrélée à la réduction de l’O2 en eau. Les études transcriptomiques ont montré que cette réduction de l’O2 résultait d’une cascade de réactions intermédiaires faisant intervenir des enzymes de type peroxydases [activation de l’expression des enzymes Ahp (alkyl hydroperoxyde réductase), Bcp1 et Bcp2 (thiol peroxydase thioredoxin-dépendante)] qui acheminent les électrons libérés via les radicaux libres. D’autres enzymes comme la rubréryhtrine et la neelarédoxine interviendraient pour détoxiquer les espèces réactives d’O2. Les électrons libérés seraient au final utilisés pour réduire l’O2 en H2O par l’enzyme FprA, dont l’expression varie en fonction du potentiel redox du milieu de culture. Ce schéma est proposé comme un des éléments essentiels du dispositif enzymatique permettant la consommation de l’O2 et la protection des cellules contre les effets des espèces réactives de l’oxygène chez T. maritima
Batch cultures of the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima were performed in a bioreactor where O2 concentrations in the gas phase were strictly controlled. At 80°C and pH 7, we demonstrated that T. maritima survived despite being exposed to oxygen at different times and that it consumed it. O2 uptake rate was estimated at 73.6 µmoles O2 min-1g proteins-1 during a short exposure to O2 (30 minutes). A long time exposure of T. maritima cultures to oxygen (20h) led to a drastic reduction in growth, together with a shift in glucose metabolism towards lactate instead of acetate production and a stop in H2 production. Under these conditions, it has been observed that 73% of glucose was partially oxidised by using both Embden-Meyerhof and Entner-Doudoroff glycolytic payhways. Uncomplete oxidation of glucose is correlated to a reduction of O2 to H2O. Transcription analyses revealed that this reductive process of O2 involved enzymes like peroxidases [activation of alkyl hydroperoxide reductase (ahp), bcp1 and thioredoxin-dependent thiol peroxidase (bcp 2)]. Moreover, genes encoding reactive oxygen species (ROS)-scavenging systems (neelaredoxin and rubrerythrin), were found to be upregulated during oxygen exposure. The oxygen reductase FprA, which expression was shown to depend on the redox level of the culture medium, is proposed as a primary consumer of O2. All these enzymes are essential for T. maritima to consume O2 consumption and to fight against the toxic effects of ROS in cells

Les ARN non-codant (ARNnc) assurent différentes fonctions vitales permettant aux bactéries de s'adapter rapidement aux conditions changeantes de leur environnement L'analyse de données transcriptomiques de la souche Pseudomonas brassicacearum NFM421 en réponse à différents stress en utilisant des puces à ADN qui contiennent aussi bien les régions codantes que les régions non codantes a révélé la modulation de deux ARNnc potentiels en réponse à des métaux lourds (Cd et U), dénommés IrsZ et IrsY. De plus, le génome de P. brassicacearum a été entièrement séquencé et une centaine d'ARNnc potentiels a été identifié par l'utilisation d'outils bioinformatiques de prédiction d'ARNnc. Ce travail vise à caractériser les deux ARNnc potentiels, IrsZ et IrsY, et à déterminer leur fonction chez P. brassicacearum. L'analyse bioinformatique de leur séquence ne révèle pas d'homologue dans la base de données des ARNnc. Nous avons validé expérimentalement par différentes approches techniques l'expression des deux ARNnc candidats dans différentes conditions de cultures et sous différents stress. Ceci a conduit notamment à révéler la modulation par le fer de l'expression des deux ARNnc IrsZ et IrsY. Leur expression est fortement activée par de fortes concentrations en fer. Cependant, en réponse à un stress oxydant causé par le peroxyde d'hydrogène, l'expression des deux ARNnc est réprimée. Cette répression est exacerbée chez les bactéries surexprimant oxyR. Nos travaux semblent indiquer que IrsZ et IrsY agissent comme des senseurs du statut intracellulaire du fer
Regulatory non-coding RNAs (ncRNA), act as regulators of translation and message stability. They modulate a wide range of physiological responses to environmental stimuli. Due to their biological interest, different bioinformatics tools and experimental approaches have been developed for detecting new ncRNA. Transcriptome analysis of the plan root-associated bacterium Pseudomonas brassicacearum NFM421 strain in response to various stresses, using microarrays containing coding as well as non-coding DNA fragments, revealed the modulation of two potentials ncRNA in response to heavy metals (Cd and U), named IrsZ and IrsY. Furthermore, P. brassicacearum genome was completely sequenced and hundreds of potentials ncRNA have been predicted by using computational tools. This work aims at characterizing the two potentials ncRNA, IrsZ and IrsY, and to determine their function in P. brassicacearum. No homologous was found in the ncRNA database. We validated the expression of the two potential ncRNA by different experimental approaches in different culture conditions and under different stresses. This led to reveal that both IrsZ and IrsY are modulated by iron. Their expression is strongly activated by high concentrations of iron. However, the expression of both Irs ncRNA is suppressed under oxidative stress generated by hydrogen peroxide. This repression is exacerbated in P. brassicacearum overexpressing oxyR. Our work suggests that IrsZ and IrsY act as sensors of intracellular iron status

Les parodontites sont des maladies chroniques inflammatoires causées par un biofilm bactérien. Elles sont la première cause de perte des dents dans les pays industrialisés et représentent donc un coût important pour la société. Le biofilm buccal est composé de plus de 500 espèces différentes, parmi lesquelles Porphyromonas gingivalis est reconnue comme une cause majeure du développement des symptômes. Cette bactérie à Gram négatif est considérée comme anaérobie bien qu’elle tolère des concentrations faibles en oxygène, ce qui favorise la colonisation de la cavité orale. Notre objectif était de mettre en évidence les processus biologiques conférant à P. gingivalis sa résistance à l’oxygène et au stress oxydant, mais également ceux impliqués dans la transition métabolique en concentrations variables d’oxygène. Des analyses in silico des génomes de souches de P. gingivalis ont révélé la présence d’un système respiratoire dépendant de l’oxygène, impliquant une cytochrome bd oxydase CydAB. Nous avons construit un mutant de P. gingivalis ATCC 33277 par délétion des gènes cydAB. Nos travaux ont montré que ce mutant était plus sensible que la souche parentale aux espèces réactives de l’oxygène (ROS) dont le peroxyde d’hydrogène et le générateur d’anion superoxyde paraquat. De plus, nous avons démontré que CydAB était impliquée dans le phénotype aérotolérant de P. gingivalis, et que cette enzyme consommait effectivement l’oxygène grâce à une étude par oxygraphie à haute résolution. Les mécanismes de régulations en réponse aux ROS et à l’oxygène sont encore mal connus, notamment en ce qui concerne la régulation positive de l’expression des gènes cydAB en présence d’oxygène. Deux gènes codant des régulateurs de type FNR ont été identifiés dans le génome de P. gingivalis, l’un d’entre eux codant un régulateur de la réponse au stress nitrosant, HcpR. Le second gène PGN_1569 a fait l’objet de notre étude. Par mutation et par analyses transcriptomiques, nous avons démontré que ce régulateur s’autorégulait négativement et activait l’expression de 4 groupes de gènes en anaérobie, n’incluant pas les gènes cydAB. L’expression de ces gènes est par ailleurs contrôlée par d’autres régulateurs redox, OxyR et/ou SigH et/ ou RprY. Cette étude met donc en évidence une connexion entre FNR et les autres régulateurs de la réponse au stress oxydant chez P. gingivalis. Des études complémentaires permettront de caractériser la fonction encore hypothétique des protéines codées par le régulon FNR. Il est intéressant de noter que l’absence de FNR confère à P. gingivalis une plus grande capacité à former un biofilm en anaérobie
Periodontal diseases are chronic inflammatory infections caused by bacteria in oral biofilm they are the first cause of loss of tooth in industrial countries with an important cost for the society. The biofilm comprises more than 500 bacterial species. Amongst them, Porphyromonas gingivalis, a Gram-negative bacterium, is well known as a major causative agent of periodontitis. Although considered as mainly anaerobe, P. gingivalis tolerates low oxygen concentration, therefore enhancing its ability to colonize the oral cavity. Our aim was to decipher the biological processes underpinning the resistance of P. gingivalis to oxygen and reactive oxygen species (ROS) and to characterise the transition from anaerobiosis to hypoxia. In silico studies of P. gingivalis genomes have revealed the presence of a putative oxygen-dependent respiratory system involving a cytochrome bd oxidase CydAB. We constructed a mutant deleted for cydAB genes in the P. gingivalis ATCC 33277 strain. Our study showed that cydAB mutation increased the sensibility of the mutant to reactive oxygen species such as the anion-superoxide generator paraquat and hydrogen peroxide. Moreover we demonstrated that CydAB is involved in the aerotolerance of P. gingivalis, and in oxygen consumption, as demonstrated by high resolution respirometry assay. Many regulations in response to ROS and oxygen are still unexplained in P. gingivalis, including the activation of cydAB expression by oxygen exposure. Two genes encoding FNR-like regulators were identified in the genome of P. gingivalis. One of them encodes the HcpR regulator which controls part of the nitrosative stress response. The second gene PGN_1569 was the focus of our study. By mutation and transcriptome analysis, we demonstrated that this FNR-like regulator repressed its own transcription and activated the expression of 4 gene clusters in anaerobiosis, but not including cydAB genes. The expression of these 4 gene clusters is also controlled by other redox regulators, OxyR and/or SigH and/or RprY. Therefore, this study pointed out the interplay between FNR and known oxidative stress response regulators of P. gingivalis. Further work will study the functions of the hypothetical proteins encoded by the FNR regulon. Interestingly, the fnr mutant displayed higher ability than the wild-type strain to form biofilm in anaerobiosis

Ce travail a pour objectif de tester des solutions viables et durables pour la phytoremédiation de sols contaminés en éléments traces. Il inclut à la fois des données sur l'évaluation initiale et résiduelle des risques (biomonitoring) et sur des solutions de phytomanagement à long terme utilisant des plantes et microorganismes associés, en particulier la phytoextraction aidée couplant l’épuisement du pool labile de contaminants du sol, la production de matière première végétale et la restauration de services écosystémiques. La phytotoxicité du Cu, le rôle améliorant des amendements organiques et minéraux et la tolérance des plantes ont été examinés utilisant des essais biologiques ainsi qu’une technique de dilution du sol. L'utilité d’une lignée de mutant de tournesol (Helianthus annuus) et d’une lignée parental de tabac (Nicotiana tabacum) pour le biomonitoring de sols contaminés en Cu a été investiguée. Les paramètres biochimiques qui sont en relation avec le statut antioxidant des plantes et leurs réponses moléculaires à l’excès de Cu ont en général montré une plus grande sensibilité que les traits morphologiques. Le tabac est plus tolérant au Cu que le tournesol. Des bactéries endophytes issues de différentes sources, notamment des graines d’une population métallicole d’une graminée (Agrostis capillaris) peuvent stimuler la croissance du tournesol et du tabac aux expositions en Cu modérément en excès. Pour ces plantes annuelles, accumulatrices secondaires du Cu et à phénotype d’exclusion, l'augmentation de la capacité de phytoextraction de Cu par les parties aériennes s’effectue principalement par l’accroissement de la biomasse aérienne, plutôt que par celui de sa concentration en Cu. Par conséquent, une attention a été prêtée aux pratiques agricoles dans les essais en parcelles sur site. Plusieurs options d’amélioration ont été examinées in situ: l'application d’amendements du sol, l'utilisation de lignées de mutants et de variants somaclonaux, la rotation de cultures et des cultivars, la bioaugmentation, la fertilisation, l’irrigation, etc. Deux lignées de mutants et des cultivars commerciaux de tournesol ainsi qu’une lignée parentale de tabac ont montré un fort potentiel pour la phytoextraction du Cu, accompagné d’une production significative de graines et/ou autre biomasse valorisable. Les solutions de restauration écologique basées sur la phytoextraction, utilisant des plantes annuelles accumulatrices secondaires de Cu permettraient (1) la décontamination progressive des sols contaminés en Cu au cours des rotations culturales, (2) un retour financier lié à la valorisation de la biomasse végétale, et (3) la restauration de services écosystémiques
This work aimed at assessing sustainable phytoremediation options for trace element-contaminated soils. It includes both the assessment of initial and residual risks (biomonitoring) and long-term sustainable decontamination options using plants and associated microbes, especially aided phytoextraction with the secondary purposes of producing plant-based feedstock and restoring ecosystem services. Copper phytotoxicity, the improving role of soil conditioners, and plant tolerance were tested using a bioassay as well as a fading technique. The usefulness of a mutant line of sunflower (Helianthus annuus) and a motherline of tobacco (Nicotiana tabacum) for the biomonitoring of Cu-contaminated soils was investigated. Biochemical parameters in relation to antioxidant status of plants and molecular responses to Cu excess generally showed a greater sensitivity than morphologic ones. Tobacco has a higher Cu tolerance than sunflower. Endophytic bacteria from various sources, notably from the seeds of metallicolous populations of grasses (Agrostis capillaris) can promote the growth of sunflower and tobacco exposed to Cu excess. For annual Cu-secondary accumulator plants with an excluder phenotype, increase in shoot Cu removal occurred primarily through increase in shoot biomass, rather than in shoot Cu concentration. Therefore, attention in field trials was paid to agricultural practices. Various improving options were tested in situ: application of soil amendments, the use of mutant lines and somaclonal variation, cultivars and crop rotation, bioaugmentation, fertilization, irrigation, etc. Two mutant lines and some commercial cultivars of sunflower as well as the motherline of tobacco showed a high potential for Cu phytoextraction as well as for plant-based feedstock. Ecological restoration options for Cu-contaminated soils based on phytoextraction using annual Cu-secondary accumulator plants with a high shoot biomass would (1) result in the progressive decontamination of Cu-contaminated soils during crop rotations, (2) provide a financial return through biomass valorization, and (3) promote ecosystem services