Letteratura scientifica selezionata sul tema "Bactéries oxydant les nitrites"

L'étude a permis de suivre l'évolution des caractéristiques physico-chimiques et microbiologiques des eaux dans un réseau de distribution expérimental de taille industrielle, afin de comparer d'une part l'effet du chlore et de la monochloramine sur la biomasse présente dans le système à l'équilibre et d'autre part d'établir des relations quantitatives entre prolifération bactérienne, oxydant et matière organique biodégradable. Dès les premières heures de transit dans le réseau, une consommation des oxydants est constatée, avec toutefois une plus grande stabilité de la monochloramine (vitesse de consommation de 0,05 mgCl2 l-1h-1 et 0,02 mgCl2 l-1h-1 respectivement pour le chlore et la monochloramine). Même en présence d'un désinfectant résiduel, il est possible de noter une accumulation de bactéries-à ta surface des tuyaux de distribution (105 à 106 cellules. cm-2, dont environ 1 % est cultivable sur gélose) qui augmente avec la diminution de concentration du désinfectant résiduel. Les relations logarithmiques entre densité cellulaire (phase eau ou biofilm) et oxydant résiduel montrent d'une part que pour inactiver totalement les bactéries en suspension dans l'eau il convient de maintenir une chloration en continu avec un résiduel constant supérieur ou égal à 0,5 mgCl2 l-1 et, d'autre part que les chloramines sont au moins 2,5 fois moins efficaces que le chlore, même vis-à-vis des bactéries fixées. La présence de matière organique biodégradable dans les eaux explique la prolifération des bactéries dans le système de distribution. Ainsi une concentration additionnelle de 100 µg.l-1 de carbone organique dissous biodégradable (CODB) dans l'eau entrant dans le réseau de distribution occasionne en 24 heures et à 20°C une augmentation du nombre de bactéries fixées (+7,5.105 cellules.cm-2) ou en suspension (+ 4.104 cellules.ml-1) dans le réseau de distribution, à l'équilibre, déjà largement colonisé par des micro-organismes. Ainsi le contrôle de la fraction biodégradable de la matière organique apparaît toujours comme un objectif primordial.

Cet article porte sur l'étude de la réaction de nitratation (oxydation de nitrites en nitrates) par voie biologique aérobie avec des bactéries autotrophes nitratantes. Les phénomènes d'inhibition de l'ammoniac sur l'activité nitratante de populations microbiennes issues de boues activées (populations mixtes ou enrichies en bactéries nitratantes) ont été caractérisés. A l'aide d'une méthodologie faisant appel à la respirométrie, les caractéristiques de la population enrichie ont été définies : - les conditions optimales de mise en oeuvre sont un pH de 7,8 et une température de 29·C - les paramètres cinétiques définissant les performances sont QSmax=61 mgN-NO2-/gMVS×h et KS=3,04 mgN-NO2-/l - cette population présente une bonne tolérance vis-à-vis de NH3, une inhibition de 60% de la respiration des bactéries nitratantes ayant été obtenue pour 11,4 mgN-NH3/l. Les mêmes effets inhibiteurs ont été observés lors de la mise en culture discontinue de populations mixtes dans les conditions optimales de pH et température. Dans ces conditions de mise en oeuvre, différentes cultures dont les concentrations en biomasse totale ont varié de 0,1 à 2 gMVS/l, en présence de 3 mgN-NH3/l, ont présenté la même vitesse spécifique de nitratation. Ces phénomènes d'inhibition de la nitratation par NH3 paraissent complexes et fortement dépendant de facteurs environnementaux qui agissent sur la dynamique de croissance de ces bactéries.

L'utilisation de pesticides est essentielle pour augmenter les rendements agricoles, mais ces produits chimiques peuvent manquer leurs cibles, s'accumuler dans le sol et nuire aux micro-organismes qui sont importants pour la santé de l'écosystème. Les évaluations traditionnelles des risques liés aux pesticides n'ont pas entièrement pris en compte la toxicité des pesticides pour les micro-organismes. Pour remédier à cette situation, un système à plusieurs niveaux a été proposé pour évaluer les effets des pesticides sur un groupe microbien clé, les micro-organismes oxydant l'ammoniac (AOM). Le système comprend des tests de toxicité in vitro (niveau I) aux microcosmes de sol puis aux études en pots (niveau II), et enfin aux évaluations à l'échelle du terrain (niveau III). Les principaux objectifs de cette thèse étaient de i) développer et valider un essai biologique in vitro utilisant l'AOM et des bactéries oxydantes des nitrites (NOB) fonctionnellement apparentées comme essai standard de niveau I, lié aux tests monospécifiques couramment utilisés en écotoxicologie aquatique, ii) comparer la toxicité des pesticides sur l'AOM avec un kit d'évaluation de la toxicité disponible dans le commerce, et iii) caractériser la physiologie de la souche de NOB Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1, l'une des souches les plus sensibles aux pesticides identifiés dans cette thèse. La toxicité de pesticides représentatifs (insecticides, fongicides et herbicides) a été évaluée sur plusieurs AOM, y compris des bactéries oxydant l'ammoniac (AOB), des archées oxydant l'ammoniac (AOA) et des NOB. Les seuils de toxicité (EC50) ont été déterminés pour chaque combinaison souche-pesticide, Nitrosotalea sinensis Nd2 (AOA), Nitrosospira briensis (AOB) et Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1 (NOB) ont été identifiées comme les souches les plus sensibles et les bioindicateurs appropriés pour l'essai biologique proposé sur une seule espèce. Les fongicides et les insecticides étaient généralement plus toxiques pour AOM que pour NOB, tandis que les herbicides présentaient une toxicité variable pour tous les groupes de nitrifiants. Sur la base de ces résultats, la toxicité d'autres pesticides de différentes catégories sur les trois souches les plus sensibles a été évaluée. En utilisant l'essai in vitro proposé pour une seule espèce, les valeurs EC50 ont confirmé que ces souches étaient des bioindicateurs efficaces pour les essais de toxicité de niveau I. Les fongicides étaient les plus toxiques pour les AOM que pour les NOB. Les fongicides ont été les plus toxiques pour N. sinensis, provoquant une inhibition significative à des niveaux de concentration agronomiques. Les sensibilités différentes de ces souches à diverses classes de pesticides soulignent la nécessité d'une approche globale qui saisisse un large spectre de réponses microbiennes. L'évaluation de la toxicité des pesticides à l'aide du kit MARA (Microbial Assay for Risk Assessment), qui utilise 11 souches microbiennes hétérotrophes pour détecter la toxicité des pesticides, a montré une sensibilité relativement faible, les pesticides n'affectant ces souches qu'à des concentrations élevées, contrairement à l'AOM qui a montré une sensibilité beaucoup plus élevée aux pesticides. La physiologie de Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1, l'un des bioindicateurs identifiés, a montré une tolérance à l'acide avec une croissance optimale à un pH de 6,0 et une croissance détectable jusqu'à un pH de 3,5. En co-culture, cette souche a favorisé la croissance d'AOA acidophiles, telles que Nitrosotalea devaniterrae Nd1 et N. sinensis, en éliminant les nitrites inhibiteurs. Ce mécanisme de mutualisme trophique souligne l'importance des concentrations de substrat dans les interactions microbiennes dans les sols acides
The use of pesticides is essential for boosting agricultural yields, but much of these chemicals miss their targets, accumulating in soil and harming ecosystems and microorganisms. Despite the importance of soil microbes in ecosystem health, traditional pesticide risk assessments have not fully addressed the toxicity of pesticides on them. To address this, recent studies proposed a tiered system to assess pesticide effects on the key microbial group of ammonia-oxidizing microorganisms (AOM). The system progresses from in vitro toxicity tests (Tier I) to soil microcosms or pot studies (Tier II), and finally to field-scale evaluations (Tier III). The main objectives of this thesis were to i) develop and validate an in vitro bioassay using AOM and functionally related NOB as a standard Tier I assay, related to the single-species tests commonly used in aquatic ecotoxicology, ii) compare the toxicity of pesticides on AOM with an existing toxicity assessment assay, the Microbial Assay for Risk Assessment (MARA) kit from NCIMB (Scotland), and iii) characterize the physiology of Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1, one of the most sensitive strains identified in this thesis. The toxicity of representative pesticides—covering insecticides, fungicides, and herbicides— was assessed on several ammonia-oxidizing microorganisms (AOM), including ammonia-oxidizing bacteria (AOB), ammonia-oxidizing archaea (AOA), and nitrite-oxidizing bacteria (NOB). Toxicity endpoints (EC50) were determined for each strain-pesticide combination, with Nitrosotalea sinensis Nd2 (AOA), Nitrosospira briensis (AOB), and Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1 (NOB) identified as the most sensitive strains and suitable bioindicators for the proposed single species bioassay. Fungicides and insecticides were generally more toxic to AOM than NOB, while herbicides showed variable toxicity across all nitrifier groups. This testing approach proved valuable for Tier I ecotoxicity assessments of pesticides on soil microbial communities. Building on these findings, toxicity of additional pesticides from different categories on the three most sensitive strains was assessed. Using the proposed single-species in vitro assay, EC50 values confirmed these strains as effective bioindicators for Tier I testing framework. N. sinensis was the most sensitive strain, followed by N. briensis and Ca. N. laanbroekii NHB1, indicating these strains are promising bioindicators for pesticide toxicity in soil. Fungicides were most toxic to N. sinensis, causing significant inhibition at agronomical concentration levels. The differential sensitivities of these strains to various pesticide classes highlight the need for a comprehensive approach that captures a broad spectrum of microbial responses. The evaluation of pesticides toxicity using the MARA kit, which uses 11 heterotrophic microbial strains to detect toxicity, demonstrated relatively low sensitivity, with pesticides affecting these strains only at high concentrations, in contrast to AOM which showed much higher sensitivity to pesticides. The physiology of Ca. Nitrobacter laanbroekii NHB1, one of the identified bioindicator was also characterised. The strain demonstrated an acidotolerant physiology with optimal growth at pH 6.0 and detectable growth down to pH 3.5. In co-culture, Ca. N. laanbroekii NHB1 enhanced the growth of acidophilic ammonia-oxidizing archaea (AOA), such as Nitrosotalea devaniterrae Nd1 and N. sinensis, by removing inhibitory nitrite. This cross-feeding mechanism underscores the importance of substrate concentrations in microbial interactions in acidic soils

La première partie de ce travail est réalisé dans le but de préparer des produits pouvant jouer un rôle très important de l’imagerie cellulaire des lipopolysaccharides sur la surface des cellules bactériennes, tout en utilisant des méthodes fiables telle que la ‘’chimie click’’. Dans un premier temps, nous avons synthétisé une première génération d’outils fluorescents à base de rhodamine B et fluorescéine modifiée par une fonction oxyde de nitrile. Dans un deuxième temps nous avons cherché les meilleures conditions d’applications de la chimie click 3+2 sans cuivre, entre la fonction oxyde de nitrile et le motif saccharidique complémentaire portant une fonction vinylique. Finalement, nous avons appliquée, avec succès, la méthode click avec cuivre sur plusieurs types de bactéries portant sur leur membrane cellulaire des lipopolysaccharides ayant un motif ‘’Kdo’’ fonctionnalisé par un groupement azoture déjà synthétiser au sein de notre équipe, et une sonde fluorescente porteuse d’une fonction alcyne. Une nouvelle génération d’outils de marquage saccharidique est en cours de finalisation dans le but d’optimiser les conditions finales, tel que le dérivé de ‘’Kdo’’ fonctionnalisé cette fois-ci par des dérivées cycliques, bicycliques et aromatiques porteurs d’une fonction alcyne ou alcène, pour réaliser les derniers essais de marquage in vitro. Le stress oxydant est lié au vieillissement des cellules et à de nombreuses maladies: cardiovasculaire, cancer, diabète, Alzheimer… Il est dû à un déséquilibre entre le système oxydant / antioxydant au niveau des cellules, et se caractérise par la présence principalement de substance radicalaires réactives oxygénées. Dans le but d'identifier le taux de substances réactives oxygénées dans les cellules, le travail dans la deuxième partie de la thèse reposait sur la synthèse multi étape d'une molécule fluorescente dérivée de la coumarine. Le composé ciblé est le peroxyde d'oxygène, connu sous le nom d'eau oxygénée. Possédant un ester vinyl-boronique, notre molécule sera oxydée et réarrangée en aldéhyde conduisant à la condensation intramoléculaire avec le groupement aminé adjacent pour former un cycle indolique, libérant ainsi de la fluorescence. La recherche des conditions optimales de la dernière étape de la voie synthétique sont toujours en cours d’optimisation. Dans le futur, on cherchera les conditions optimales de la dernière étape de la synthèse de la sonde spécifique au peroxyde d’oxygène. Cette molécule est d'une importance remarquable comme sonde du stress oxydant. En réussissant cette étape, on pourra avoir en main une bibliothèque de ‘’KDO’’ fonctionnalisé afin d’avoir des résultats satisfaisants in vivo
The first part of this work is done in order to prepare products that play a very important role in cellular imaging lipopolisaccharides on the surface of bacterial cells, while using reliable methods such as '' click chemistry ''. Initially, we synthesized the first generation of tools based fluorescent rhodamine B and fluorescein -modified nitrile oxide function. In a second step we sought the best possible applications of click chemistry 3+2 copper free, between the nitrile oxide function and the additional saccharide unit with a vinyl function. Finally, we applied successfully, the click method with copper on several types of bacteria on their cell membrane lipopolysaccharides having a pattern Kdo functionalized azide group already synthesized within our team, and a probe carrying a fluorescent alkyne. A new generation of tools saccharide marking is being finalized in order to optimize the final terms, such as derivative functionalized Kdo this time by cyclic, bicyclic and aromatic derivatives holders of an alkene or alkyne function to perform final testing of in vitro labeling. Oxidative stress is linked to cell aging and many diseases: cardiovascular disease, cancer, diabetes, Alzheimer's ... It is due to an imbalance between oxidant system/antioxidant in cells, and is characterized mainly by the presence of radical substance reactive oxygen. In order to identify the rate of reactive oxygen substances in cells, work in the second part of the thesis based on multi- step synthesis of a fluorescent molecule derived from coumarin. The target compound is oxygen peroxide, known as the name of hydrogen peroxide. Having a vinyl boronic ester, this molecule will be oxidized and rearranged aldehyde leading to intramolecular condensation with the adjacent amino group to form an indolique ring , thereby releasing fluorescence. The search for optimal conditions for the last step of the synthetic pathway is still being optimized. In the future, the optimal conditions for the last step of the synthesis of specific probe oxygen peroxide are sought. This molecule is remarkable importance as a probe of oxidative stress. By passing this step, we will have on hand a library of KDO functionalized to have satisfactory results in vivo

Campylobacter jejuni est une bactérie à Gram négative microaérophile pathogène responsable d'un grand nombre d'entérites d'origine alimentaire. Cette bactérie est capable de survivre dans différents environnements et de s'adapter à des conditions non optimales pour sa croissance. Parmi ces conditions, le stress oxydant constitue un stress majeur pour tous les organismes vivants provoquant un déséquilibre du potentiel redox et l��inactivation de nombreuses protéines. Parmi les différentes enzymes permettant un retour à l’équilibre. Seul le système thiorédoxine-thiorédoxine réductase (TrxAB) a été annoté chez C. Jejuni. Au cours de ce travail nous avons analysé l’importance de ce système dans l’adaptation au stress oxydant chez C. Jejuni. Pour cela nous avons développé un milieu de culture synthétique dont tous les composants et leurs concentrations sont connus (milieu MCLMAN), il nous a permis d’étudier la réponse au stress oxydant de cette bactérie. L’identification des protéines spécifiquement réduites par TrxAB a montré que ce couple participe au fonctionnement de toutes les grandes voies métaboliques, certaines de ces enzymes sont uniques et considérées vitales dans d’autres organismes. Le système TrxAB semble vital, les gènes correspondants n’ont pas pu être inactivés
Campylobacter jejuni, a microaerophilic pathogen Gram-negative bacterium, is the causative agent of a large number of food-borne enteritis. This bacterium is able to survive in different environments and adapt to non-optimal growth conditions. Among these conditions, oxidative stress is a major stress for all living organisms that disturbs the cellular redox potential and inactivates numerous enzymes. Various systems can allow reversion but genome annotation of C. Jejuni suggests that it possesses the thioredoxin-thioredoxin reductase (TrxAB) system only. Therefore, importance of this system was analysed during C. Jejuni oxidative stress adaptation. Thus, we developed a synthetic medium having defined compound composition (MCLMAN medium) allowing the study of this bacterium oxidative stress response. Identification of proteins specifically reduced by TrxAB revealed its contribution to all main metabolic pathways; including reduction of unique enzymes considered as essential for other organisms. Furthermore, TrxAB encoding genes could not be inactivated in C. Jejuni thus TrxAB system appears of vital importance in this bacterium

Les Bactéries Lactiques (BL), largement utilisées dans l'industrie pour la fabrication des produits laitiers fermentés, sont exposées au stress oxydant ce qui conduit à des pertes de rendement et diminue leur survie. De même, chez l'Homme, la formation d'espèces oxygénées réactives (ROS) par les phagocytes peut conduire dans le cas d'une inflammation anormale à un stress oxydant et à une perte de l'homéostasie intestinale. Le premier objectif de ce travail était l'obtention de souches de BL aux capacités antioxydantes améliorées et l'étude de leur physiologie lors d'un stress oxydant. Deux stratégies ont été développées. I) Des mutants spontanés de Lactococcus lactis résistant au stress oxydant (SpOx) et utilisables en industrie ont été obtenus. Les modifications moléculaires provoquées par la mutagenèse ont été identifiées par analyse protéomique. Ii) Une catalase a été introduite par ingénierie génétique chez des souches de BL ce qui a permis d'éliminer H2O2, augmentant la survie lors d'un stress oxydant. Le deuxième objectif était d'évaluer les effets d'une BL antioxydante dans la prévention et le traitement de pathologies intestinales liées à la formation de ROS. Les effets de l'administration de Lb. Casei produisant ou non MnKat ont été caractérisés dans un modèle murin d'inflammation intestinale. Indépendamment de la production de MnKat, Lb. Casei limite les signes inflammatoires coliques. Ces résultats confirment l'intérêt de l'utilisation de Lb. Casei pour traiter des pathologies inflammatoires intestinales. L'identification des mécanismes responsables de ces effets anti-inflammatoires pourrait permettre une meilleure compréhension des effets des probiotiques
Lactic acid bacteria (LAB), widely used for the production of fermented dairy products, are often exposed to oxidative stress leading to the decreases of production rates and of LAB survival. In human, the production of ROS by immune cells can led to oxidative stress and to a loss of intestinal homeostasis in the case of abnormal inflammation. The first aim of this work was to obtain LAB strains with improved antioxidative capacities and to study their behaviour during oxidative stress. We developed two strategies: i) Spontaneous Oxidative stress resistant mutants (SpOx) of Lactococcus lactis were obtained using natural selection. The molecular modifications induced by the mutagenesis were identified using a comparative proteomic analysis. Ii) A catalase was introduced in LAB strains which are to eliminate H2O2 and have an improved survival when exposed to oxidative stress. The second aim of this work was to evaluate preventive or therapeutic effects of an antioxidative LAB strain in the case of intestinal disorders related to oxidative stress. The effects of Lb. Casei, producing or not MnKat, administration were characterized using an intestinal colitis model in mice. Independently to the presence of MnKat, Lb. Casei administration reduces inflammatory scores of colonic mucosa. Identification of the mechanisms leading to anti-inflammatory properties of Lb. Casei BL23 could help to better understand the probiotics effects. These results confirm the high interest of Lb. Casei utilisation for the treatment of intestinal inflammatory diseases

Des bacteries sulfo-oxydantes (161) ont ete obtenues a partir d'echantillons de fluide, d'invertebres et de fragments de cheminee, preleves sur deux nouveaux sites hydrothermaux (2000 m), dans des bassins arriere-arc; le bassin de lau et le bassin nord fidjien. Plusieurs types de bacteries chimioheterotrophes ont ete isoles. Elles entrainent une transformation du thiosulfate, soit en sulfate (acidifiantes), soit en polythionates (alcalinisantes). La plupart des bacteries acidifiantes passent par un stade transitoire alcalin. Ce sont des bacilles gram negatif. 37% ont un metabolisme fermentatif et 88% reduisent les nitrates en nitrites ou denitrifient. La taxonomie numerique et l'analyse du g+c% permettent de les identifier aux genres pseudomonas, acinetobacter et vibrio. Trois isolats ont ete apparentes aux thiobacilles autotrophes stricts. Ils sont identiques. Ils se developpent sur differents composes soufres reduits: thiosulfate, tetrathionate, sulfure et soufre elementaire sans passer par un stade intermediaire polythionate. Ce sont des micro-organismes a ubiquinone q-8, halophiles moderes, presentant une croissance optimale a ph 7,5 et a 35c. Au vu de la composition en guanine et cytosine (67,1 mol%) et du profil des acides gras, ces organismes sont des representants d'une nouvelle espece. Les sequences de l'arnr 16s confirment cette hypothese en les placant, avec thiobacillus neapolitanus, dans un nouvel embranchement de la subdivision gamma des proteobacteries. Le nom thiobacillus hydrothermalis est propose pour cette nouvelle espece

Par leurs activités métaboliques de consommation d'hydrogène et de production de sulfures, les bactéries sulfato-réductrices sont les principales responsables des phénomènes de corrosion métallique en l'absence d'oxygène. Une étude physiologique et enzymatique de quelques Desulfovibrio a contribué à la compréhension du rôle de ces bactéries dans les phénomènes de biocorrosion anaérobie. Desulfovibrio (D. ) vulgaris en milieu organique, après avoir oxydé le lactate, consomme l'hydrogène formé par la réaction électrochimique de dissolution du fer. Les Desulfovibrio peuvent être responsables soit d'une corrosion par contact direct avec le métal en utilisant la couche d'H2 formé à sa surface, (les bactéries sont alors adsorbées à la surface grâce à un réseau cristallin de sulfure de fer), soit d'une corrosion à distance en consommant l'hydrogène dissous ou gazeux. Comme leurs hydrogénases peuvent être stables dans le temps indépendamment de la structure cellulaire (D. Vulparis) et actives aux températures élevées (à 70°C - 75°C) (D. Baculatus), ces bactéries peuvent agir dans des conditions incompatibles avec la viabilité des cellules mais compatibles avec l'expression enzymatique. Une étude en fonction de la température a montré qu'à l'intérieur même du groupe mésophile des Desulfovibrio, le comportement vis-à-vis de ce paramètre est spécifique de chaque bactérie, ce qui rend compte de la présence permanente des représentants de cette population dans les sites où les variations de température sont importantes. Un changement de quelques degrés Celsius peut provoquer des modifications dans les rendements de croissance des bactéries et par conséquent des variations dans l'intensité de la corrosion. En plus du sulfate D. Multispirans peut réduire avec des vitesses spécifiques de croissance différentes, le nitrate, le nitrite et le fumarate. Certains sulfato-réducteurs pourront donc s'adapter aux variations de concentrations en accepteurs d'électrons et également métaboliser des substances oxydées utilisées comme biocides. Le choix d'un accepteur d'électrons plutôt que d'un autre ne dépend pas uniquement de la spécificité de l'équipement enzymatique de la bactérie, mais de sa sensibilité à l'action inhibitrice de certaines de ces molécules oxydées.

Le contrôle de la qualité microbiologique de l'eau potable repose sur le dénombrement de bactéries coliformes et de bactéries hétérotrophes aérobies et anaérobies, faisant intervenir des méthodes traditionnelles de culture sur milieux nutritifs gélosés. Seule une petite fraction (environ 1%) de ces bactéries est cultivable du fait de conditions de culture inappropriées (température, pH, disponibilité en eau et nutriments) à la croissance de populations bactériennes diversifiées. Ceci conduit à une sous-estimation du nombre réel de bactéries viables. Ces méthodes de mesures par culture sont donc loin d'être satisfaisantes pour la numération des micro-organismes subissant un stress oxydant (lors de la désinfection des eaux par exemple). En outre, elles ont le désavantage de nécessiter des temps d'incubation longs de 24h à 15 jours. Au contraire, l'utilisation de techniques de comptage par microscopie combinées avec un marquage par des fluorochromes permet une énumération rapide des bactéries. Cependant, elles n'autorisent qu'un dénombrement total des cellules bactériennes (i. E. Sans distinguo entre cellules vivantes et mortes). Une étude pionnière dans les années 90 montrait chez des bactéries exposées au chlore (HC1O), une perte de fluorescence du DAPI (fluorochrome marqueur d’acides nucléiques), suggérant ainsi une possibilité de repérer des bactéries blessées par les oxydants. Nous avons prolongé ces observations initiales en travaillant avec d'autres fluorochromes marqueurs d'acides nucléiques (SYBR-II, TOTO-1, PI) combinés à l'utilisation de la cytométrie en flux (plus quantitative et indépendante de l'observateur comparativement à la technique de microscopie en épifluorescence). Nous avons ainsi confirmé que l'oxydant chlore (HC1O/CIO-) altère la perméabilité membranaire des cellules bactériennes mais provoque aussi, comme l'ozone, des dommages des polymères intracellulaires (ADN et ARN). Des essais in vitro sur des solutions d'acides nucléiques montrent que la perte de fluorescence est concentration dépendante, suggérant plusieurs mécanismes d'altération de l'ARN ou de l'ADN par le chlore. Les trois fluorochromes testés sont sensibles à ces altérations, ce qui indirectement nous a amené à mettre en cause l'utilisation de PI traditionnellement employé comme marqueur de perméabilité membranaire. Par contre, les modifications chimiques causées par d'autres désinfectants (dioxyde de chlore, C1O2 ou monochloramine, NH2C1) ne changent pas l'efficacité du marquage des acides nucléiques par les fluorochromes. A l'aide d’une bactérie génétiquement modifiée, présentant une fusion des gènes umuC et umuD avec le gène lacZ, nous avons pu observer que l'expression du système SOS de réparation de l'ADN était compromise pour des concentrations de chlore proches de celles conduisant à une perte de cultivabilité des bactéries. Cette observation permet alors de définir une concentration de chlore efficace (conduisant à une vrai désinfection) pour laquelle les dommages causés à l'ADN sont non réparables (lésions irréversibles). En travaillant avec des eaux prélevées sur usine de potabilisation, nous avons pu observer la présence quasi-systématique de deux populations dites LNA (low nucleic acid content- ayant un faible contenu en acides nucléiques) et HNA (high nucleic acid content- ayant un fort contenu en acides nucléiques) et surtout montrer la grande sensibilité de cette dernière à l’action du chlore. Les résultats obtenus au cours de cette étude montrent que la perte du signal de fluorescence de fluorochromes marquant des bactéries chlorées ou ozonées peut servir de méthode de contrôle rapide (moins d'une heure) de désinfection de l'eau en usine de traitement d'eau potable.

Le contrôle de la qualité microbiologique de l'eau potable repose sur le dénombrement de bactéries coliformes et de bactéries hétérotrophes aérobies et anaérobies, faisant intervenir des méthodes traditionnelles de culture sur milieux nutritifs gélosés. Seule une petite fraction (environ 1%) de ces bactéries est cultivable du fait de conditions de culture inappropriées (température, pH, disponibilité en eau et nutriments) à la croissance de populations bactériennes diversifiées. Ceci conduit à une sous-estimation du nombre réel de bactéries viables. Ces méthodes de mesures par culture sont donc loin d'être satisfaisantes pour la numération des micro-organismes subissant un stress oxydant (lors de la désinfection des eaux par exemple). En outre, elles ont le désavantage de nécessiter des temps d'incubation longs de 24h à 15 jours. Au contraire, l'utilisation de techniques de comptage par microscopie combinées avec un marquage par des fluorochromes permet une énumération rapide des bactéries. Cependant, elles n'autorisent qu'un dénombrement total des cellules bactériennes (i. E. Sans distinguo entre cellules vivantes et mortes). Une étude pionnière dans les années 90 montrait chez des bactéries exposées au chlore (HC1O), une perte de fluorescence du DAPI (fluorochrome marqueur d’acides nucléiques), suggérant ainsi une possibilité de repérer des bactéries blessées par les oxydants. Nous avons prolongé ces observations initiales en travaillant avec d'autres fluorochromes marqueurs d'acides nucléiques (SYBR-II, TOTO-1, PI) combinés à l'utilisation de la cytométrie en flux (plus quantitative et indépendante de l'observateur comparativement à la technique de microscopie en épifluorescence). Nous avons ainsi confirmé que l'oxydant chlore (HC1O/CIO-) altère la perméabilité membranaire des cellules bactériennes mais provoque aussi, comme l'ozone, des dommages des polymères intracellulaires (ADN et ARN). Des essais in vitro sur des solutions d'acides nucléiques montrent que la perte de fluorescence est concentration dépendante, suggérant plusieurs mécanismes d'altération de l'ARN ou de l'ADN par le chlore. Les trois fluorochromes testés sont sensibles à ces altérations, ce qui indirectement nous a amené à mettre en cause l'utilisation de PI traditionnellement employé comme marqueur de perméabilité membranaire. Par contre, les modifications chimiques causées par d'autres désinfectants (dioxyde de chlore, C1O2 ou monochloramine, NH2C1) ne changent pas l'efficacité du marquage des acides nucléiques par les fluorochromes. A l'aide d’une bactérie génétiquement modifiée, présentant une fusion des gènes umuC et umuD avec le gène lacZ, nous avons pu observer que l'expression du système SOS de réparation de l'ADN était compromise pour des concentrations de chlore proches de celles conduisant à une perte de cultivabilité des bactéries. Cette observation permet alors de définir une concentration de chlore efficace (conduisant à une vrai désinfection) pour laquelle les dommages causés à l'ADN sont non réparables (lésions irréversibles). En travaillant avec des eaux prélevées sur usine de potabilisation, nous avons pu observer la présence quasi-systématique de deux populations dites LNA (low nucleic acid content- ayant un faible contenu en acides nucléiques) et HNA (high nucleic acid content- ayant un fort contenu en acides nucléiques) et surtout montrer la grande sensibilité de cette dernière à l’action du chlore. Les résultats obtenus au cours de cette étude montrent que la perte du signal de fluorescence de fluorochromes marquant des bactéries chlorées ou ozonées peut servir de méthode de contrôle rapide (moins d'une heure) de désinfection de l'eau en usine de traitement d'eau potable.

La Pyruvate: Ferrédoxine oxydoréductase (PFOR) est une enzyme clef des métabolismes anaérobies qui catalyse l'oxydation réversible du pyruvate en acétyl-coenzymeA et CO2. Généralement, cette enzyme présente une grande sensibilité à l'oxygène induite par la présence de centres [4Fe-4S]2+/1+ dans la protéine. La caractérisation extensive de la PFOR de Desulfovibrio africanus (Da) a révélé une stabilité inédite de cette protéine en présence d'air. Mon travail a permis de spécifier le mécanisme de protection de la PFOR de Da à l'aide d'une étude de mutagenèse dirigée associée à des expériences in vivo. Le mécanisme est dépendant d'un « switch rédox » de deux cystéines qui permettrait de positionner une méthionine dans l'environnement immédiat d'un centre [4Fe-4S] afin de le protéger des dommages oxydatifs. Les analyses in vivo ont démontré que, dans les cellules, la PFOR de plusieurs Desulfovibrio, est efficacement protégée contre un stress oxydant. De plus, la forme stable mais inactive de l'enzyme qui est formée au cours de l'oxydation peut être réactivée par un retour en conditions réductrices. Cette réactivation correspond au clivage du pont di sulfure présent dans l'enzyme oxydée. Afin de caractériser les partenaires moléculaires catalysant, in vivo, ce clivage, nous nous sommes intéressés aux systèmes thiol-rédox des Desulfovibrio. Dans ce contexte, nous avons initié l'étude des thiorédoxines et des thiorédoxine réductases de Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH). En parallèle, nous avons étudié le rôle physiologique de la PFOR chez DvH, en mettant en œuvre une stratégie de délétion du gène porR. A l'heure actuelle, nous n'avons pas obtenu le mutantporK. Cependant nous avons démontré que ce gène appartenait à. Un opéron codant pour plusieurs protéines reliées fonctionnellement. Ainsi, la PFOR ferait parti d'un super-complexe impliqué dans l'oxydation du substrat énergétique et la production d'ATP
The Pyruvate-Ferredoxin Oxidoreductase (PFOR) is a key enzyme of anaerobic metabolisms that catalyses the reversible oxidation of pyruvate in acetyl-coenzymeA and CO2. Usually, this enzyme is highly sensitive to oxygen, because of the presence of iron- sul fur clusters. However, extensive studies of Desulfovibrio africanus (Da) PFOR pointed out a surprising stability of this protein when exposed to air. My PhD work wanted to get a better understanding of the protective mechanism of Da PFOR, using a directed-mutagenesis. Approach coupled to in vivo assays. We characterized a redox switch mechanism involving two cysteines that would direct the positioning of a methionine near one of the iron-sulfur clusters, thus protecting it from oxidative damages. In vivo analysis showed that PFORs from several Desulfovibrio species, are efficiently protected against oxidative stress. This redox-switch leads to a stable but inactive form of the enzyme under oxidative conditions that can be reactivated, in vivo, when conditions are shifted back to reducing ones. This reactivation requires the reduction of the disulfide bond of the oxidized enzyme. In order to identify the molecular partners that catalyse this reduction in vivo, we have started to study the thioredoxins and thioredoxin reductases of Desulfovibrio vulgaris Hildenborough (DvH). We also studied the PFOR physiological role in DvH, using a gene deletion approach , although until now, we haven't been able to obtain the porK mutant. But we have shown that this gene belongs to an operon coding for several proteins functionally linked. Therefore, the PFOR might be part of a supra-complex involved in the oxidation orthe energetic substrate and ATP production