Tesi sul tema "Bactérie pathogène humaine"

Clostridioides difficile est une cause majeure de diarrhée nosocomiale. La physiopathologie de C. difficile est régie par des réseaux de régulation complexes, incluant des mécanismes basés sur l'ARN tels que les riboswitches. Les riboswitches, situés dans la région 5' non traduite des ARNm, se lient à des ligands spécifiques, induisant des changements de conformation qui modulent l'expression du gène en aval. Chez C. difficile, 16 riboswitches répondent à la molécule de signalisation c-di-GMP. Le c-di-GMP est un régulateur contrôlant la transition d'un mode de vie planctonique libre à un mode de vie sessile associé à la régulation des facteurs de virulence. Plusieurs riboswitches à c-di-GMP régulent des gènes impliqués dans la formation des flagelles, l'assemblage des pili de type IV, le développement du biofilm, l'adhésion et la production de facteurs de virulence tels que les toxines chez C. difficile. De plus, le c-di-GMP inhibe la sporulation chez C. difficile, mais le mécanisme sous-jacent n'est pas connu.Nous avons caractérisé ici des riboswitches à c-di-GMP qui n'ont pas encore été étudiés. Nos analyses bioinformatiques ont révélé que 5 d'entre eux sont situés directement en amont de gènes codant des petites protéines (PPs) de 58 acides aminés (AA). De manière intéressante, un alignement de ces 5 protéines a montré qu'elles sont presque identiques en séquence. De plus, une recherche d'homologie a permis de découvrir 2 protéines supplémentaires de 60 AA, très similaires aux cinq premières, bien que leurs gènes ne soient pas précédés d'un riboswitch. Cette nouvelle famille de protéines est conservée dans toutes les souches de C. difficile, mais n'a pas d'homologues en dehors de l'espèce. Nous avons construit une version étiquetée d'une PP et l'avons détectée par immunoblotting de fractions cellulaires, confirmant sa nature protéique et révélant qu'elle est associée à la membrane.Des données de séquençage de l'ARN (RNA-seq) ont démontré que le c-di-GMP régule négativement l'expression des 5 gènes de PP en aval des riboswitches ainsi que des 2 gènes supplémentaires. Nous avons également observé que le c-di-AMP, un autre dinucléotide cyclique impliqué dans l'osmorégulation, réprime l'expression des 7 gènes. Des expériences de fusions transcriptionnelles entre la région promotrice d'une PP et un gène rapporteur ont confirmé que le c-di-GMP nécessite le riboswitch pour moduler l'expression des gènes en aval. En revanche, le c-di-AMP régule leur expression indépendamment du riboswitch en modulant l'activité du promoteur. Ainsi, le c-di-GMP et le c-di-AMP influencent l'expression des PP par des mécanismes distincts.Pour étudier le rôle des PP chez C. difficile, nous avons surexprimé l'une d'elles et comparé son transcriptome à celui de la souche sauvage. Cela a révélé l'induction de l'expression de plus de 100 gènes impliqués dans la sporulation dans la souche surexprimant la PP. Conformément à ces données, la surexpression de cette PP a conduit à un phénotype d'hypersporulation. En outre, la délétion des 7 gènes de PP (mutant Δ7) a entraîné une réduction de la sporulation, avec des phénotypes intermédiaires pour les souches où seuls certains gènes des PP ont été délétés. Le défaut de sporulation de Δ7 est similaire à celui d'une souche produisant des niveaux élevés de c-di-GMP, suggérant que l'impact du c-di-GMP sur la sporulation pourrait être médié par la régulation des PP. Pour tester cette hypothèse, nous avons créé un mutant Δ7 produisant de fortes concentrations de c-di-GMP. Le défaut de sporulation de cette souche était équivalent à celui du mutant Δ7 non affecté dans sa production de c-di-GMP, indiquant que les effets des délétions des PP et de la surproduction de c-di-GMP ne sont pas cumulatifs.Dans l'ensemble, nos résultats démontrent que cette nouvelle famille de petites protéines est régulée à la fois par le c-di-GMP et le c-di-AMP et joue un rôle clé dans le contrôle de la sporulation chez C. difficile
Clostridioides difficile is the leading cause of nosocomial diarrhea in adults in industrialized countries. The pathophysiology of C. difficile is governed by complex regulatory networks, including RNA-based mechanisms like riboswitches. Riboswitches, located in the 5' untranslated region of mRNAs, bind specific ligands, inducing conformational changes that either promote or inhibit the expression of the downstream gene. In C. difficile, 16 riboswitches respond to the signaling molecule cyclic di-GMP (c-di-GMP). C-di-GMP acts as a second messenger and is recognized as a central regulator controlling the transition from a free planktonic to a sessile lifestyle associated with biofilm formation and virulence factor regulation. Several of the c-di-GMP-responding riboswitches have been well-studied in C. difficile and shown to regulate genes involved in flagella formation, type IV pili assembly, biofilm development, adhesion, and the production of virulence factors such as toxins. Moreover, c-di-GMP inhibits sporulation in C. difficile, but the underlying mechanism remains unclear.In this PhD work, we sought to characterize c-di-GMP-responding riboswitches that have not yet been studied. Our bioinformatics analyses revealed that 5 of them are located directly upstream of predicted genes encoding small proteins (SPs) of 58 amino acids. Interestingly, an alignment of these 5 proteins showed that they are almost identical in sequence. Moreover, a homology search uncovered two additional proteins of 60 amino acids, highly similar to the first five, though their genes are not preceded by a c-di-GMP riboswitch. This novel family of proteins is conserved across C. difficile strains but lacks homologs outside the species. We built a tagged version of one SP and detected it by immunoblotting of cell fractions, confirming its protein nature and revealing that it is primarily localized to the cell membrane.RNA sequencing (RNA-seq) data demonstrated that c-di-GMP negatively regulates not only the expression of the 5 SP genes downstream of the riboswitches but also the 2 additional genes. Unexpectedly, we also observed that c-di-AMP, another cyclic dinucleotide primarily involved in osmoregulation, repressed the expression of all seven genes. We performed reporter assays in different strain backgrounds to explore how these small proteins are regulated by both c-di-GMP and c-di-AMP. These experiments indicated that c-di-GMP required the riboswitch for modulation of downstream gene expression. In contrast, c-di-AMP regulated their expression independently of the riboswitch by modulating the promoter activity. Thus, c-di-GMP and c-di-AMP influence SP expression through distinct mechanisms.To investigate the role of these small proteins in C. difficile physiology, we overexpressed one SP and compared its transcriptome to that of the wild-type strain using RNA-seq. This revealed the upregulation of more than 100 genes involved in sporulation in the overexpressing strain. Consistent with these data, overexpression of this SP led to a hypersporulation phenotype. Furthermore, deletion of all 7 SP genes (Δ7 mutant) resulted in a significant reduction in sporulation, with intermediate phenotypes in strains where only some of the SP genes were deleted. Interestingly, the sporulation defect in the Δ7 mutant was mirrored in a strain producing elevated levels of c-di-GMP, suggesting that the impact of c-di-GMP on sporulation could be mediated by SP regulation. To test this hypothesis, we created a Δ7 mutant producing high concentrations of c-di-GMP. The sporulation defect in this strain was equivalent to that of the Δ7 mutant unaffected in its c-di-GMP production, indicating that the effects of SP gene deletions and c-di-GMP overproduction were not cumulative.Overall, our findings demonstrate that this novel family of small proteins is regulated by both c-di-GMP and c-di-AMP and plays a key role in controlling sporulation in C. difficile

Les cellules dendritriques (DCs) jouent un rôle critique dans l'orchestration des réponses immunes adaptatives. Sous une forme immature, elles stationnent dans les muqueuses, où elles surveillent le microenvironnement via des récepteurs, les PRRs. L'activation de la DC par de multiples PAMPs module son profil de différenciation, déterminant dans un 2ème temps la polarisation de la réponse vers les différentes voies effectrices Th1, Th2, Th17 ou vers la génération de T régulateurs. Dans ce travail, nous avons étudié la réponse de cellules dendritiques humaines, dérivées des monocytes, à l'exposition à une bactérie pathogène, Klebsiella pneumoniae LM21, et à une bactérie probiotique, Lactobacillus rhamnosus Lcr35. Pour K. Pneumoniae, nous disposions de mutants isogéniques déficients en capsule ou en antigène O du LPS. Nous avons mis en évidence en microscopie confocale que la capsule freinait considérablement la phagocytose des bactéries par les DCs. Parallèlement, en cytométrie en flux, les mutants capsule induisaient une maturation des DCs plus importante que la souche sauvage et une augmentation des cytokines Th1. Nous avons investigué les effets du L. Rhamnosus Lcr35 sur la maturation des DCs en utilisant une large gamme de concentrations. Le probiotique à fortes doses induisait un changement à grande échelle de l'expression génique sur les puces à ADN avec une signature moléculaire inflammatoire. En cytométrie, le probiotique induisait une maturation dose-dépendante des DCs, jusqu'à un état semi-mature. Les dosages ELISA ont démontré que le probiotique induisait une augmentation dose-dépendante des cytokines pro-Th1/Th17 (TNFα, IL-12 et IL-23)
Dendritic cells (DCs) play a critical role in orchestrating adaptive immune responses. Immature DCs reside in peripheral tissues, such as the mucosa, where they sense the microenvironment via pattern recognition receptors, which recognize pathogen products called pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The activation of DCs by multiple PAMPs modulates their profiles of differentiation, which will determine at a later time the polarization of the response to different effector pathways Th1, Th2, Th17 or to the generation of regulatory T cells. In this work, we studied the response of human dendritics cells, derived from monocytes, to exposure to a pathogenic bacterium, Klebsiella pneumoniae LM21 and a probiotic bacterium, Lactobacillus rhamnosus Lcr35. For K. Pneumoniae, we had isogenic mutants deficient in capsule or O-antigen of LPS. We demonstrated by confocal microscopy that the capsule severely constrained the phagocytosis of bacteria by DCs. In parallel, flow cytometry showed that the capsule mutants led to a greater maturation of DCs compared to the wild strain and increased Th1 cytokine production. LPS mutants induced a less marked increase of these cytokines. We investigated the effects of L. Rhamnosus Lcr35 on the maturation of DCs using a wide range of concentrations. The probiotic, at high doses, induced large-scale changes in gene expression on DNA microarrays with a molecular signature of inflammatory type. In cytometry, the probiotic induced a dose-dependent maturation of DCs, until a semi-mature state. Cytokine measurement revealed the induction by the probiotic of a dose-dependent increase in the pro-Th1/Th17 cytokines (TNFα, IL-12 and IL-23)

Staphylococcus aureus est un pathogène humain important responsable d’un large spectre d’infections communautaires et nosocomiales faisant de lui un problème majeur de santé publique dans le monde. Le passage de commensalisme à la pathogénie est régi par la régulation fine de l’expression des gènes. En plus des facteurs de transcription, les ARNs régulateurs jouent également un rôle clé dans cette régulation. Cette thèse s’intéresse plus particulièrement à l’étude de l’un d’entre eux, le srn_3610_sprC, dont l’implication dans la virulence et dans l’internalisation des bactéries par les macrophages humains a été démontrée. Dans le but de mieux comprendre ces effets, nous avons mis en place la technique MAPS et identifié trois ARNm : czrB, deoD et agrB. La caractérisation de l’interaction entre SprC et czrB a révélé une régulation négative de SprC sur l’opéron czrAB par modification de la stabilité de l’ARN. Ce mécanisme de régulation conduit à une diminution de la résistance de S. aureus au zinc. Le zinc fait partie des stratégies antibactériennes mises en œuvre par les cellules humaines. En plus de la description de la régulation par Srn_3610_SprC, nous avons développé un protocole pour l’’extraction des ARNs bactériens après internalisation par les macrophages. Cette nouvelle méthode a permis d’étudier l’implication de l’opéron czrAB dans l’internalisation et la survie intracellulaire de S. aureus. Nous avons ainsi pu montrer qu’il était fortement surexprimé dans un contexte intracellulaire. Ainsi, la régulation négative de SprC sur l’expression de czrB pourrait expliquer la diminution de la survie de S. aureus au sein des macrophages
Staphylococcus aureus is an important human pathogen responsible for a wide spectrum of both hospital- and community-acquired infections, making it a major public health issue worldwide. The transition from commensalism to pathogenicity is governed by a fine regulation of genes expression. Beside transcription factors, regulatory RNAs play a key role in this regulation. This thesis focuses on the study of one of them, Srn_3610_SprC, which is known to be involved in virulence and bacterial internalization by human macrophages. For a better understanding if its role and function, we implemented the MAPS technology and identified three mRNA: czrB, deoD and agrB. The characterization of the interaction between SprC and czrB revealed a negative regulation of SprC on the czrAB operon through modification of the RNA stability. This mechanism of regulation leads to a decrease in the resistance of S. aureus to zinc. Zinc belongs to the antibacterial strategies implemented by human cells. In addition to the depiction of regulation by Srn_3610_SprC, we developed a protocol for the extraction of bacterial RNAs after internalization by macrophages. This novel method allowed the study of the role of czrAB operon in the internalization and intracellular survival of S. aureus. We showed that it was highly over-expressed in an intracellular context. Therfore, the negative regulation of SprC onto czrB expression could explain the decrease in the survival of S. aureus within macrophages

Depuis quelques années, des Toxi-Infections Alimentaires Collectives causées par la contamination de produits frais, comme les laitues, par des bactéries pathogènes entériques (Salmonella, Escherichia coli productrice de shigatoxines -ou STEC-) apparaissent de plus en plus nombreuses. La présence de ces bactéries dans cet environnement inhabituel est un risque sanitaire émergent majeur, d'autant plus que les bactéries entériques, pathogènes ou non, présentent fréquemment des résistances aux antibiotiques. Afin d’étudier la persistance des bactéries antibiorésistantes ou pathogènes sur des laitues, la caractérisation de plasmides de résistance portés par des souches de E. coli issues d’environnements aquatiques contaminés a été réalisé pour, par la suite, étudier leur implication potentielle dans l’adhésion des souches-hôtes sur différentes variétés de laitues. L’étude de la survie et de l’adhésion de souches de E. coli environnementales et de laboratoire, transformées avec les plasmides d’intérêt, sur de jeunes plants de laitues a permis de mettre en évidence trois points : 1) plus le temps de contact entre bactéries et feuilles augmente et moins la survie bactérienne est importante ; 2) il existe une différence de survie et d’adhésion selon les variétés de laitues étudiées ; 3) il existe une différence de survie et d’adhésion entre les souches de laboratoire et les souches environnementales, ces dernières étant en meilleur état métabolique et montrant une adhésion plus importante durant les 11-12 jours d’expérimentation. Après ces constatations de persistance des E. coli antibiorésistantes en conditions contrôlées, des études en champs sur 4 exploitations maraîchères normandes, possédant des itinéraires techniques différents, ont été réalisées. La recherche de pathogènes entériques, Salmonella et STEC, a été effectuée sur les laitues et une recherche de E. coli, témoin de contamination fécale, a été réalisée sur les laitues ainsi que dans l’eau d’irrigation d’un des sites. Les résultats révèlent une qualité microbiologique satisfaisante des parcelles étudiées (selon l’arrêté européen N°2073/2005) bien que des E. coli aient été régulièrement retrouvées au niveau des laitues, dont certaines antibiorésistantes. L’analyse de l’eau d’irrigation a montré la présence continue de E. coli, dont des souches présentant des profils d’antibiorésistance communs à ceux retrouvés sur les laitues, montrant que l’eau d’irrigation est l’une des sources critiques de contamination des végétaux en champs
In recent years, foodborne diseases caused by fresh products contaminated, such as lettuce, with enteric pathogenic bacteria (Salmonella, Shigatoxin-producing Escherichia coli-or STEC-) increasingly. The presence of these bacteria in this unusual environment is a major emerging health risk, especially since enteric bacteria, whether pathogenic or not, are frequently resistant to antibiotics. To study the persistence of antibiotic-resistant or pathogenic bacteria on lettuce, the characterization of resistance plasmids carried by E. coli strains from contaminated aquatic environments was carried out in order to study their potential involvement in adhesion of host strains on different varieties of lettuce. The study of the survival and adhesion of environmental and laboratory E. coli strains, transformed with the plasmids of interest, on young lettuce plants allowed to highlight three points: 1) more time contact between bacteria and leaves increases and less bacterial survival is important; 2) there is a difference in survival and adhesion depending on the varieties of lettuce studied; 3) there is a difference in survival and adhesion between laboratory strains and environmental strains, the latter being in better metabolic state and showing greater adhesion during the 11-12 days of experimentation. After the persistence of antibiotic-resistant E. coli strains under controlled conditions, field studies on 4 Normandy vegetable farms, with different technical itineraries, were carried out. The search for enteric pathogens, Salmonella and STEC, was carried out on lettuce and a search for E. coli, a control of fecal contamination, was realized on the lettuce as well as in the irrigation water of one of the sites. The results reveal a satisfactory microbiological quality of the agricultural plots studied (according to the European decree N ° 2073/2005) although E. coli strains were regularly found at the lettuce level, including some antibiotic resistant. Analysis of the irrigation water showed the continued presence of E. coli strains, including strains with common antimicrobial resistance profiles to those found on lettuce, showing that irrigation water is one of the critical sources of plant contamination in the field

Détection et quantification de bactéries à faible taux par SPRi Résumé: Le protocole standard pour le diagnostic des bactéries dans le domaine médical et agro-alimentaire reste la culture microbienne, qui prend plusieurs jours pour identifier l'agent pathogène. Cependant, ces temps de latence ne sont pas compatibles avec l'urgence d'analyser rapidement la présence de bactéries pathogènes. Il ya un besoin croissant de vouloir développer de nouveaux outils pour identifier les bactéries pathogènes en un temps plus court. Afin atteindre cet objectif, la technologie de l'imagerie par Résonance des Plasmons de Surface (SPRi) a été utilisée avec succès pour la détection spécifique durant leur croissance des populations bactériennes en utilisant des protéines et/ou des anticorps comme molécule de bio reconnaissance des surfaces bactériennes. Ainsi, la détection spécifique de un à plusieurs milliers de pathogènes/ml peut être réalisé en quelques heures seulement. Dans le présent travail, plusieurs souches bactériennes ont été utilisées comme modèle : Streptococcus pneumoniae R6, Escherichia coli K12 ; ainsi que des agents pathogènes réels (Salmonella enteritidis) apportant la preuve que cette méthode peut être élargie à d'autres souches. Les résultats peuvent être quantitatifs par l'établissement d'une courbe d'étalonnage, permettant ainsi de remonter à la concentration initiale d'un échantillon contaminé. La stratégie développée au cours de ce travail se base sur le couplage simultané de la culture bactérienne et de la détection/identification spécifique, en utilisant l'imagerie SPR. Mots clés en français : Imagerie par résonance plasmonique de surface (SPRi), Streptococcus pneumoniae, E.coli K12, Salmonella enteritidis, croissance bactérienne, interactions, détection, capture, diagnostic, agro-alimentaire, pathogènes.

Les bactéries pathogènes opportunistes (BPO) sont responsables d'une grande part de la pathologie infectieuse bactérienne. Les BPO d'origine environnementale doivent subir des changements profonds de mode de vie pour s'adapter et coloniser l'homme. Comprendre les conditions de cette adaptation permettra de préciser la notion d'opportunisme infectieux et le rôle des BPO environnementales dans l'émergence des pathogènes.Les genres Ochrobactrum et Agrobacterium regroupent des bactéries présentant une grande variété de modes de vie et établissant différentes relations avec la cellule eucaryote. Ces bactéries connues pour vivre dans l'environnement sont par ailleurs des pathogènes opportunistes de l'homme principalement responsables d'infections chez les individus immunodéprimés. Dans le cadre de ce travail nous avons entrepris une étude populationnelle par une approche de génétique multilocus sur des collections de souches cliniques et environnementales de différentes origines géographiques. Les structures de population obtenues ont été confrontées à divers caractères phénotypiques reliés à la virulence et/ou l'adaptation chez l'homme, la température de croissance, la formation de biofilm et la virulence vis-à-vis des modèles Caenorhabditis elegans et macrophages humains.Ochrobactrum anthropi et Ochrobactrum intermedium sont les deux principales espèces d'intérêt médical du genre Ochrobactrum. La population d'O. anthropi est de type épidémique qui s'organise en deux complexes clonaux (CCs). Si le CC1 regroupe à la fois des souches de diverses origines, le CC4 ne contient que des souches cliniques. Cette sous-population apparait associée à l'homme même si les caractères phénotypiques étudiés ne révèlent pas de différences entre ces deux sous populations. De la même façon, ces deux CCs ne se distinguent pas par leur comportement en modèle macrophage ou par leur diversité génomique. O. intermedium, tout comme O. anthropi, présente une forte diversité génétique toutefois, aucun regroupement des souches en fonction de leur origine n'est mis en évidence pour cette espèce. La diversité des souches cliniques apparait aussi importante que celle de l'ensemble de la population. Plusieurs arguments suggèrent une niche étroite pour cette espèce, notamment une faible diversité génomique. Par ailleurs, le faible nombre de souches environnementales associé à une meilleure croissance planctonique à 37°C qu'à 25°C et 30°C suggèrent que l'homme pourrait constituer cette niche. L'étude de la virulence d'O. intermedium en modèle macrophage ou C. elegans met en évidence différents comportements, pour autant ceux-ci ne semblent pas liés à la structure de population. Certaines souches sont capables de se multiplier dans le modèle macrophage.L'étude du genre Agrobacterium par une approche multilocus sur une collection représentative des différents modes de vie de ces bactéries met en évidence, tout comme pour O. anthropi, une sous population clinique qui regroupe près de 80% des souches de cette origine. D'autres arguments tels que la croissance à 42°C confirment que le génovar A7 peut correspondre à une sous-population associée à l'homme. Les données obtenues seront confrontées aux connaissances sur d'autres bactéries pathogènes opportunistes d'origine environnementale comme Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia et les bactéries du complexe Burkholderia cepacia qui présentent également des sous populations associées à l'homme et/ou à certaines pathologies humaines. L'existence de ces sous populations suggère une spécialisation qui sera discutée dans le contexte de la spéciation des bactéries pathogènes afin de revisiter le concept d'opportunisme infectieux
The opportunistic bacterial pathogens (OBP) cause the main part of bacterial infectious diseases. Environmental-borne OBP should encounter dramatic changes in lifestyle in order to colonize human beings. The conditions of this adaptation should precise concepts about OBP and emerging pathogens.The genera Ochrobactrum and Agrobacterium groups bacteria with versatile lifestyles that establish diverse relationships with the eukaryotic cells. These environmental-borne OBP caused diverse infectious diseases in immune-compromised patients. In this study, we undertook an approach of multilocus genetic on large population of environmental and clinical strains of Ochrobactrum and Agrobacterium. The population structures were compared to phenotypic traits related to adaptation and virulence in man, such as growth temperature, biofilm formation and virulence tested in Caenorhabditis elegans and human macrophages models.Ochrobactrum anthropi and Ochrobactrum intermedium are the two main Ochrobactrum species to be involved in human diseases. O. anthropi displays an epidemic population structure organized in two large clonal complexes (CCs). CC4 groups only human associated strains whereas CC1 contain environmental and clinical strains. Population genetics suggested that CC4 is a human-associated clone although phenotypic, genomic and virulence traits do not differ between CC1 and CC4 strains.As O. anthropi, O. intermedium displays a high genetic diversity without correlation between the genetic structure and the origin of strains. The level of genetic diversity among clinical strains appears as high as observed in the whole population. Several data such as a low level of genomic diversity suggested that O. intermedium is associated to a narrow ecological niche. The low number of environmental strains described for this species as well as an optimal growth at 37°C suggested that human beings could be the main niche for O. intermedium. Virulence in macrophage and C. elegans models showed diverse behaviour whereas some strains are able to survive and multiply in macrophages model.Multilocus genetics in a population of Agrobacterium spp. that displays diverse lifestyles, revealed a human associated population as observed for O. anthropi. The clinical genovar A7 groups 80% of the clinical strains included in the study, this strains growing at 42°C. Data obtained in this study will be confronted to the knowledge about other environmental-borne OBP such as Pseudomonas aeruginosa, Stenotrophomonas maltophilia and bacteria belonging to the species complex Burkholderia cepacia. All these bacteria displayed sub-populations associated to man or to a particular human disease. These sub-populations suggest a specialization process that will be described in the context of the speciation of bacterial pathogen in order to revisite the concept of « opportunisme infectieux »

Le microbiote intestinal humain est un important réservoir de gènes de résistance aux antibiotiques qui demeure toutefois méconnu. Dans cette étude, nous avons exploré les gènes de résistance du microbiote intestinal de participants sains avant et après une exposition à l’antibiotique cefprozil. Trois approches ont été utilisées pour caractériser ces gènes et examiner leur altération par les antimicrobiens : la métagénomique, la culturomique et la sélectomique recombinante. Le séquençage métagénomique et la culturomique ont permis d’identifier plusieurs gènes de résistance aux β-lactamines et à d’autres antibiotiques. Cependant, la culturomique a permis d’identifier ces gènes chez un plus grand nombre de participants. La culturomique a mis en évidence la présence de gènes de résistance à la vancomycine de type vanD dans les microbiotes de 46% des participants comparativement à 8% avec le séquençage métagénomique. La culturomique a aussi montré que l’exposition in vitro et in vivo à une β-lactamine stimule l’émergence des gènes vanD. La sélectomique recombinante, qui repose sur la construction de banques d’expression à partir de l’ADN des bactéries, a été utilisée pour caractériser de manière fonctionnelle les gènes de résistance aux β-lactamines chez les bactéries cultivables de l’intestin. Elle a permis d’identifier et caractériser cinq β-lactamases différentes dont deux montrant une activité à spectre étendu. La majorité des gènes de β-lactamases étaient associés à d’autres gènes de résistance et/ou des éléments mobiles. Ces travaux ont montré que la culture favorise l’identification de gènes non détectés par le séquençage métagénomique et que la sélectomique recombinante est un outil puissant pour caractériser les fonctions des gènes. Cette étude a aussi révélé que la prise d’une β-lactamine communément utilisée peut influencer l’abondance des bactéries qui contiennent des gènes de résistance à un antibiotique d’une autre classe, comme la vancomycine, un antibiotique de dernier recours dans l’arsenal des antimicrobiens.
The human intestinal microbiota is an important and poorly known antibiotic resistance genes reservoir. In this study, we explored resistance genes from the microbiota of healthy volunteers before and after exposure to the β-lactam cefprozil antibiotic. Three approaches were used to characterise resistance genes in the human microbiota and examine alteration by antimicrobials: metagenomics, culturomics and recombinant selectomics. Metagenomic and culturomic sequencing of intestinal microbiota enabled identification of several genes for resistance to β-lactams and other antibiotics. However, culturomics allowed identification of these genes in more participants than metagenomics. Culturomics highlighted the presence of the clinically important vancomycin resistance vanD-like genes in the microbiota of about 46% of participants compared to 8% with metagenomics. Culturomics also showed that in vitro and in vivo β-lactams exposition stimulates the emergence of vanD genes. Recombinant selectomics, which is based on the construction of expression libraries made with bacterial DNA, was also used to functionally characterise β-lactam resistance genes from the cultivable intestinal bacteria. It allowed identification and characterisation of five different β-lactamases including two with an extended-spectrum activity. The majority of β-lactamases genes was associated with other resistance genes and/or mobile elements. This study demonstrated that culture favors the identification of genes undetected by direct metagenomic sequencing and selectomics was a powerful tool to characterise gene functions. It also demonstrated that intake of a commonly used antibiotic of the β-lactam family can influence the abundance of bacteria containing resistance genes to an antibiotic from another class, such as vancomycin, which is a last resort antibiotic.

Les pathogènes d'origine hydrique peuvent menacer les approvisionnements en eau potable, les eaux utilisées à des fins récréatives, pour l'agriculture et l'aquaculture et contaminer les réseaux d’eau. L. Pneumophila et E. Coli 0157:H7 ont émergé profitant d’un nouvel écosystème hydrique créé par l’Homme, de modifications de nos modes d’alimentations. Ces pathogènes ayant d’importantes répercutions sur la santé, il est nécessaire de les détecter rapidement et à faible dose. L’objectif a été de développer, d’évaluer, d’appliquer un macroarray permettant de détecter et quantifier les Legionella, E. Coli O157:H7 dans des matrices liquides de plus ou moins grande complexité et dans une gamme de concentrations ayant une réalité environnementale. Cette méthode rapide pourrait permettre la mise en place d’un système d’auto-surveillance dans les réseaux d’eau. Elle pourrait être adaptée à un système d’alerte et répondre aux besoins en terme de contrôle du risque infectieux
Waterborne pathogens could threat drinking water supply, water used for swimming, for agriculture, aquaculture and contaminate water network. L. Pneumophila and E. Coli 0157:H7 have emerged taking advantage of creating new hydric ecosystem by humans, due to modifications of food habits. These pathogens must be detected rapidly and at low doses because they have important health effects. The objective of this work was to develop, to evaluate, and to apply a macroarray allowing detection and quantification of Legionella, E. Coli O157:H7 in more or less complex water templates and in a realistic environmental concentration range. This rapid method should allow the use of monitoring systems in network water. It should also be adapted to alert systems and should reply to requirements of infectious risk control

La tuberculose est un problème de santé publique mondiale. Cette maladie infectieuse cause environ 2 millions de morts chaque année. L'étude de l'épidémiologie de la tuberculose est essentielle pour sa surveillance et le contrôle de sa propagation. Le génotypage des souches du complexe Mycobacterium tuberculosis (MTC), l'agent responsable de la tuberculose, permet une caractérisation moléculaire rapide de ce dernier. Dans la première partie de mes travaux de thèse, avec les méthodes de génotypage actuelles, nous avons évalué la diversité génétique de MTC dans deux régions géographiquement différentes. Le système Luminex xMAP® basé sur des microbilles est un outil flexible pour de nombreuses applications médicales et scientifiques. La deuxième partie de mes travaux a consisté à développer des méthodes de multiplexage à haut débit automatisées, sur la base du système Luminex xMAP®, qui permettent de réaliser des analyses moléculaire des souches de M tuberculosis à différents niveaux de précision. La région CRISPR (clustered regularly interspaced palindromic repeats) est une structure génétique très répandue chez les Archaea et les Eubactéries. Cette structure peut refléter la diversité génétique et l'évolution moléculaire des microorganismes. Dans la troisième partie de ma thèse, nous avons transféré une méthode d'étude ciblant deux loci CRISPR et précédemment développée chez M tuberculosis à un autre pathogène : Salmonella enterica, et l'avons mise en place sur le système Luminex xMAP®
Tuberculosis is a worldwide problem of public health, causing approximately 2 million deaths each year. The epidemiology of tuberculosis is essential for monitoring and controlling its propagation. The genotyping of strains of the Mycobacterium tuberculosis complex (MTC), its agent, allows a fast molecular detection of recent transmission events, and the description of the diversity of this pathogen. Ln the first part of my work of thesis, with the current methods of genotyping, we evaluated the genetic diversity of MTC in two geographically different areas. The system Luminex xMAP® based on microbeads is a flexible tool for many medical applications and research activities. The second part of my work consisted in developing automated multiplexing high throughput methods, on the basis of system Luminex xMAP®, which makes it possible to carry out fast molecular analyses of the strains of M tuberculosis at various levels of precision. CRISPR region (clustered regularly interspaced palindromic repeats) is a very widespread genetic structure among Archaea and Eubacteria. This structure can reflect the genetic diversity and the molecular evolution of micro-organisms. Ln the third part of my thesis, we transferred the method developed in M. Tuberculosis on two loci CRISPR of another pathogen, Salmonella enterica, and implemented it on the Luminex xMAP® system

Certaines pratiques agricoles telles que l’épandage de produits résiduaires organiques (PRO) ou l’irrigation des sols peuvent être à l’origine de l’introduction de bactéries pathogènes de l’Homme dans les sols. Le sol joue alors un rôle central dans la dissémination de ces bactéries pathogènes dans les différents compartiments de l’environnement et peut contaminer les matières premières végétales, les animaux d’élevage mais également les ressources en eau. Le risque sanitaire associé à la dissémination de ces bactéries pathogènes doit être évalué afin de limiter le développement de maladies infectieuses. Dans ce contexte, l’incidence et le potentiel de survie de bactéries pathogènes a été étudié dans un large ensemble de sols provenant du territoire français (Réseau de Mesure de la Qualité des Sols : RMQS). Ce travail a pour objectif général d’identifier les facteurs biotiques et abiotiques des sols qui déterminent l’incidence et la survie de d’un pathogène strict, Listeria monocytogenes, et d’un pathogène opportuniste, Enterococcus faecalis, dans ces matrices environnementales Pour ceci, 2 approches ont été adoptées : la première approche a visé à mettre au point des systèmes de détection de PCR quantitative spécifiques pour ces deux espèces bactériennes afin de détecter et quantifier ces 2 bactéries dans un ensemble de 1200 ADN de sols présentant des paramètres pédoclimatiques contrastés. L. monocytogenes n’est pas détectée dans les ADN de sols avec la méthode moléculaire développée, dont le seuil de détection est d’environ 104 bactéries par gramme de sol. La détection moléculaire d’E. faecalis a été biaisée par un problème de contamination des ADN extraits. Après extraction de nouveaux ADN sur 150 échantillons de sol, E. faecalis a été détecté en faible quantité dans 5 des 150 sols testés (4% des sols) à des concentrations d’environ 102 bactéries par gramme de sol. Dans une deuxième approche, la survie de L. monocytogenes et d’E. faecalis a été suivie dans un ensemble de 100 sols caractérisés par des paramètres pédoclimatiques variables. Des microcosmes de sols ont été inoculés et la survie bactérienne a été évaluée par des méthodes culturales classiques. L. monocytogenes survit à long terme dans un plus grand nombre de sols qu’E. faecalis. Les sols favorables à la survie à long terme sont majoritairement (44%) les mêmes pour les 2 bactéries. Les sols sableux présentant un pH acide sont défavorables à la survie des 2 bactéries. Cependant des différences sont observées quant aux paramètres physico-chimiques des sols qui déterminent la survie de ces 2 bactéries. Ainsi, la survie de L. monocytogenes est corrélée positivement au taux de saturation en cations basiques, à la capacité d’échange cationique et à la concentration en calcium pour le court terme et à la teneur en argile pour le long terme. En revanche, pour E. faecalis, une corrélation négative avec la teneur en calcium total est trouvée pour la survie à court terme alors que la survie à long terme est négativement corrélée à la concentration en phosphore assimilable. Un effet inhibiteur de la microflore des sols a été mis en évidence sur la survie de L. monocytogenes et E. faecalis : il est statistiquement significatif pour les sols présentant un pH supérieur à 7 pour les 2 pathogènes. Les résultats obtenus vont permettre de modéliser la survie de ces pathogènes dans les sols en fonction de paramètres pédo-climatiques et donc à terme de mieux gérer les épandages de PRO en fonction des types de sols pour limiter la persistance de pathogènes dans les sols
Soil contamination by bacterial pathogens can occur through manure, sewage sludge spreading or irrigation using waste water treatment plants effluents. Agricultural soils may act as reservoirs for these pathogens, play a significant role in their dissemination, leading to the potential contamination of food and water resources. Health risk associated with the occurrence of pathogens in environmental matrices has to be thoroughly evaluated. In this context, the objectives of this work were: i) to determine the prevalence of two pathogenic bacterial species (Listeria monocytogenes and Enterococcus faecalis) in a large collection of French soils originated from a systematic soil survey of the territory, called RMQS (16x16 km grid), ii) to determine major biotic and abiotic parameters driving the survival of bacterial pathogens in soils. Two approaches were used to reach these objectives: i) the prevalence of the two pathogens was monitored in 1200 soils using specific molecular detection tools (real time PCR using TaqMan probe detection system) and ii) the survival of the 2 pathogens, inoculated in soil microcosms, was determined over a 84 days incubation period under laboratory conditions, on a subset of 100 soils from the RMQS survey, using classical microbiological methods. L. monocytogenes was not detected in the set of 1200 soils (with a detection limit estimated to be 104 bacteria per gram of soil) using the molecular detection method, while E. faecalis was detected in approximately 4% of the soils tested (on a smaller set of 150 RMQS soils). The two bacterial pathogens were able to survive in the majority of soil, although L. monocytogenes survived in a greater number of soils. Soils where both pathogens survived represented 44% of soils. The survival of both pathogens is strongly impaired in sandy acidic soils. However, textural and chemical parameters driving survival of the two pathogens differed: L. monocytogenes survival is increased in soils with higher BCSR (basic cation saturation ration) and CEC (cation exchange capacity). L. monocytogenes long-term survival is favored by higher soil clay content. E. faecalis survival is impaired in soils with high total Ca content (calcareous soils). Soil microflora inhibits survival of both pathogens especially in soil with alcaline pH’s. The results of our study will allow implementing survival models for these two pathogens. Such data is invaluable for a better and safer managment of soil manuring using various organic residues

L'objectif principal de ce travail etait d'explorer les bactéries pathogènes que recèle le tube digestif des gorilles. Pour ce faire, un total de 48 échantillons de selles, provenant du Cameroun, appartenant à 21 gorilles ont été analysés. D'abord la culturomique et le pyroséquençage ont été utilisés pour évaluer exhaustivement la diversité bactérienne. En appliquant la culturomique, 86 conditions de culture dont des milieux fabriqués à base de plantes tropicales, sur un échantillon de selles de gorille, 12 800 colonies microbiennes ont été isolées et testées, et 147 espèces bactériennes identifiées. De nombreux pathogènes opportunistes ont été observés, dont 8 qui sont fréquemment associés à des maladies chez l'homme: Mycobacterium bolletii, Proteus mirabilis, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Escherichia coli, Staphylococcus aureus et Clostridium botulinum. En utilisant la PCR en temps réel pour cribler des pathogènes bactériens dans les 48 échantillons de selles de gorilles, des bactéries fastidieuses telles que Bartonella spp. Borrelia spp., Coxiella burnetii, Tropheryma whipplei ont été observées. Nous avons estimé la prévalence de ces agents pathogènes qui varie entre 4,76% et 85,7%. Ce travail a permis de savoir que l'homme et le gorille ont en commun plusieurs espèces bactériennes dont des pathogènes émergents. Par conséquent, les gorilles sauvages peuvent servir de réservoir et de source pour l'émergence et/ou la réémergence des bactéries pathogènes pour l'homme
The main objective of this work is to explore the gorilla's potential role as a reservoir for pathogenic bacteria. We used both microbial culturomics and pyrosequencing to analyze the gorilla gut bacteria. By applying culturomics to one index gorilla, we tested 12,800 colonies and identified 147 different bacterial species, including 5 new species. Many opportunistic human pathogens were observed, including 8 frequently associated with human disease: Mycobacterium bolletii, Proteus mirabilis, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Serratia marcescens, Escherichia coli, Staphylococcus aureus and Clostridium botulinum. Using specific real-time PCR on 48 gorilla fecal samples, we also observed the fastidious pathogens Bartonella spp. Borrelia spp., Coxiella burnetii, Tropheryma whipplei. Using microsatellite analysis of the gorilla samples, we estimated that the prevalence of these pathogens was between 4.76% and 85.7%. Therefore, the gorilla shares many bacterial pathogens with humans, which suggests that wild gorillas might be a reservoir for the emergence and/or reemergence of these pathogens, especially in areas where human and gorilla habitats overlap and because of the increasing presence of humans in the African equatorial forests

Streptococcus pyogenes, également appelé Streptocoque du Goupe A (SGA), est un pathogène à l'origine d'une grande diversité d'infections, allant d'infections superficielles comme l'angine aux infections invasives, comme la fasciite nécrosante et les endométrites. Au 19ème siècle, une femme sur dix mourait après l'accouchement de fièvre puerpérale, notamment d'endométrite. En France, les infections gynéco-obstétricales correspondent encore de nos jours à 27 % des infections invasives à SGA chez les femmes. Les souches de SGA présentent une forte diversité génétique et de répertoire de facteurs de virulence. Le génotype emm28 est le troisième génotype le plus prévalent en France et il est associé aux endométrites. Nous avons analysé par deux axes complémentaires les facteurs et mécanismes impliqués dans les endométrites à SGA. Par des approches de biochimie et de biologie cellulaire, nous avons caractérisé l'interaction entre les cellules de l'hôte et R28, une protéine de surface spécifique du génotype emm28. Le domaine N-terminal de R28 (R28Nt) et ses deux sous-domaines favorisent la fixation des bactéries à des cellules endométriales, cervicales et déciduales. Ils fixent de manière directe les intégrines α3β1, α6β1 et α6β4. Par ailleurs, R28Nt promeut aussi l'adhésion à des cellules épithéliales de la peau et des poumons. Ces résultats suggèrent que la fixation des intégrines par R28Nt concourt, non seulement, aux endométrites dues au génotype emm28, mais aussi, et de manière plus générale, à la prévalence de ce génotype. Afin de mieux caractériser les étapes précoces essentielles au développement des endométrites à SGA, nous avons développé un modèle original d'infection : nous infectons ex vivo la décidue humaine, qui correspond à la membrane utérine durant la grossesse. Nous avons analysé les effets de l'infection de la décidue par des techniques de microscopie et d'analyse d'image de pointes. SGA adhère au tissu et se multiplie au contact de celui-ci grâce à des éléments sécrétés par le tissu. Sur ce tissu, SGA forme des biofilms composés d'ultrastructures ressemblant, pour certains, à des fils reliant deux coques d'une même chaine et, pour d'autres, à des filaments reliant plusieurs chaînettes ; certains s'organisent en réseau. GAS envahit en profondeur le tissu, ce qui dépend de l'expression de la cystéine protéase SpeB. SGA induit la mort de la moitié des cellules en moins de 4 h à travers la sécrétion de différents facteurs, dont la Streptolysine O (SLO). Enfin, GAS est capable de restreindre la réponse immunitaire du tissu à l'échelle transcriptomique et protéique, le contrôle protéique dépendant de l'expression de SLO et de SpeB
Streptococcus pyogenes, also known as Group A Streptococcus (GAS), is a Gram-positive pathogen responsible for a wide range of diseases. GAS induces superficial infections such as pharyngitis, with 700 million cases/year worldwide, life threatening invasive infections such as necrotizing fasciitis, with 160 000 deaths, and post-infectious sequelae such as rheumatic fever. Altogether, GAS is responsible for 517 000 deaths in the world annually. GAS strains are genetically diverse and their genotyping involves the sequencing of the emm gene 5' end; emm encodes the M protein, a major virulence factor. More than 250 emm-types have been identified and they harbor specific virulence factor repertoires. During the pathogenesis of GAS infections, GAS adheres to the tissue, multiplies, affects the tissue integrity and invades it, resists and controls the immune response. During my PhD, we focused on deciphering the molecular mechanisms involved in GAS early critical steps of human tissue infection, with gyneco-obstetrical sphere infections, including endometritis, as a model. The first to third most prevalent emm-types eliciting invasive infections in Europe, emm28, is associated with these infections. In a first part of my project, we sought receptors for the emm28 specific R28 surface protein and which domains are involved in promoting adhesion to cells. In the second part, we set up an innovative ex vivo model of human decidual infection and we characterized the contribution of virulence factors to the colonization and invasion of this tissue. By cell adhesion experiments, we show that the R28 N-terminal domain (R28Nt) is responsible for an increase of GAS adhesion to human primary decidual cells. We have subdivided R28Nt into two subdomains; each is involved in binding to decidual, cervical and epithelial endometrial cells. We identified several putative R28Nt receptors and focused on R28Nt interaction with integrins. R28Nt and both subdomains directly interact with the integrins alpha3beta1, alpha6beta1 and alpha6beta4. Since R28Nt also increases the binding to the surface of pulmonary and skin epithelium cells, tissues encountered in GAS induced infections, we suggest that the R28Nt-integrin interactions contribute not only to emm28 endometritis, but also to the overall prevalence of the emm28 strains. In the second part of my project, to better characterize the mechanisms involved in GAS infections, we developed an ex vivo model of tissue infection, using human decidua, a tissue encountered during endometritis. We infected the maternal side of feto-maternal membrane, i. e. decidua, from healthy caesarians with an emm28 endometritis clinical isolate and its derived mutants. Using state of the art imaging set-up, image processing and analysis, we followed and quantified in real time different early infection steps. The bacteria multiply until they colonize the entire tissue surface in up to eight hours and this multiplication is triggered by the tissue. The bacteria form a multilayer biofilm of up to 14 µm thick. GAS readily and actively invades the decidua in a time-dependent manner, which depends on the presence of the cysteine protease SpeB. GAS induces dramatic cell cytotoxicity, with up to 50% of cells killed in the first four hours of infection; Streptolysin O (Slo) is involved in this cytotoxicity, confirming the critical importance of this factor in the early steps of infection. Cytokine overexpression and secretion in the tissue after infection indicate that GAS induces a limited immune response and the inflammatory response does not critically depend on the presence of Slo or SpeB. In conclusion, this study demonstrates the importance of several virulence factors, R28, SpeB and Slo, in the GAS emm28 early steps of infection, such as colonization, biofilm formation, cytotoxicity and tissue invasion, indicating their involvement not only in endometritis, but in other emm28 infections

Les Streptocoques Béta-hémolytiques du groupe A (GAS) sont responsables de manifestations cliniques variées et de séquelles non suppuratives comme notamment le rhumatisme articulaire aigu (RAA). Les affections sévères à GAS tuent plus de 500.000 personnes chaque année. Le pouvoir pathogène du GAS est encore mal compris. Il semble être notamment lié à la présence de nombreux gènes codant pour des facteurs de virulence dans le génome du GAS, dont celui codant la protéine emm. La protéine transmembranaire M joue un rôle essentiel dans la virulence du GAS. Le typage moléculaire des GAS se base sur la séquence de la partie hypervariable de ce gène (emm-typing). L’épidémiologie du GAS semble varier au cours du temps et en fonction de la localisation géographique et/ou du contexte socio-économique. Cependant, les différences dans les critères d’inclusion des différentes études épidémiologiques disponibles dans la littérature rendent les comparaisons difficiles.

Pour mieux évaluer ces variations, nous avons mené une analyse prospective de l’épidémiologie clinique et moléculaire d’isolats de GAS provenant d’enfants présentant une infection à GAS, simultanément en deux localisations géographiques différentes (Bruxelles et Brasília, Brésil).

Un des points importants de notre étude a été la mise en évidence de la diversité génétique de la protéine M des isolats belges et brésiliens. Alors que de nombreux emm-types différents sont retrouvés à Brasília (48 emm-types sur 128 isolats), ceux retrouvés à Bruxelles sont relativement peu nombreux (20 emm-types sur 200 isolats) et sont ceux communément retrouvés dans les pays industrialisés. Afin de mieux comprendre les bases moléculaires de cette différence, une analyse phylogénétique basée sur la quasi-totalité de la séquence de la protéine M exposée à la surface de la bactérie a été réalisée. Cette analyse a permis de montrer que les emm-types belges sont génétiquement éloignés les uns des autres alors que les emm-types brésiliens sont génétiquement plus proches. De manière intéressante, cette analyse a montré que les souches belges présentent une grande diversité au niveau de la région de la protéine M dite ‘constante’. En conséquence, la diversité génétique globale des protéines M belges et brésiliennes est similaire, mais elle se situe dans des régions différentes de la protéine M, ce qui pourrait indiquer l’existence de pressions de sélection différentes entre les deux pays. D’un point de vue vaccinal, ces résultats indiquent qu’un vaccin dirigé contre certaines des parties constantes de M présenterait une bonne couverture théorique dans les deux pays. Par contre, le vaccin 26-valent, en cours d’évaluation clinique, aurait une couverture théorique de 76% à Bruxelles et de 32% à Brasília.

Notre analyse phylogénétique a également permis de montrer que la non-sensibilité à la ciprofloxacine (observée dans 22,5 % et 9% des souches belges et brésiliennes respectivement) survient dans des souches génétiquement éloignées, contrairement à ce qui est proposé actuellement dans la littérature. De plus, nous avons mis en évidence un polymorphisme au sein des gènes codant les topoisomérases cibles de la ciprofloxacine. L’identification de mutations responsables du phénotype de non-sensibilité nécessite par conséquent une confirmation expérimentale.

Les manifestations cliniques sont assez différentes entre Bruxelles et Brasília. Les infections cutanées sont beaucoup plus fréquentes à Brasília. De manière intéressante au Brésil, des souches de GAS présentant un tropisme cutané sont isolées du pharynx. Ces souches ‘cutanées’ pourraient avoir acquis des déterminants génétiques leur permettant de se développer dans des tissus pharyngés. De plus, ces résultats pourraient remettre en question le postulat que seules les souches de tropisme pharyngé sont impliquées dans le développement du RAA. D’autres études épidémiologiques dans des pays où le RAA est endémique devront être réalisées afin de préciser nos résultats et de mieux comprendre les mécanismes moléculaires menant au développement du RAA.

Cependant, étant donné la prévalence du RAA et l’accès limité au diagnostic microbiologique des pharyngites dans le réseau public de soins au Brésil, nous avons développé un score clinique permettant de limiter les traitements antibiotiques chez les enfants probablement atteints de pharyngites virales. L’utilisation de ce score permettrait de réduire le nombre de prescriptions antibiotiques dans les pharyngites de l’enfant de 41 à 55% à Brasília.

Le choc toxi-infectieux est une pathologie relativement rare et le RAA n’est quasi plus décrit dans les pays développés. Cependant, deux nourrissons ont présenté un choc toxi-infectieux suivi d’un RAA (HUDERF, Bruxelles). A notre connaissance, cette association clinique n’a jamais été décrite. L’analyse de ces deux cas du point de vue de la virulence bactérienne a révélé la présence de nombreux gènes de facteurs de virulence, portés par des phages et différents dans les deux souches. Nos résultats illustrent la complexité de la relation hôte-pathogène.

La capacité des bactéries à s’adapter à leurs hôtes et à causer des pathologies dépend de nombreux facteurs, qui varient d’un isolat à l’autre, et dont l’importance varie d’un hôte à l’autre. Notre travail a permis d’exemplifier la diversité génétique des GAS, aussi bien au niveau du gène emm qu’au niveau des facteurs de virulence, et de l’implication de ceux-ci dans le développement de pathologies streptococciques rares.

Doctorat en Sciences médicales
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L'ARN interférence (ARNi) est un mécanisme ancestral de régulation génique dirigé par des petits ARN non codants, incluant les microARN (miARN). Les miARN sont présents chez un grand nombre d'organismes eucaryotes et ont été caractérisés dans divers processus biologiques. Au cours de la dernière décennie, les miARN des plantes et des mammifères sont apparus comme des régulateurs majeurs des interactions hôtes-bactéries pathogènes. En effet, ils contrôlent de multiples étapes des infections bactériennes. De manière intéressante, le phytopathogène Pseudomonas syringae sécrète des protéines effectrices de type III qui suppriment différentes étapes de la voie des miARN chez les plantes pour promouvoir la maladie. Cependant, nous ignorons encore si les bactéries pathogènes des mammifères auraient pu développer des stratégies analogues. Nous montrons ici que la protéine effectrice de type IV LegK1 produite par Legionella pneumophila supprime les activités des miARN en cellules humaines. Ceci nécessite à la fois son activité sérine/thréonine kinase ainsi qu’une plateforme de liaison aux Argonautes (Ago). Nous avons découvert que LegK1 n’interagissait pas seulement avec les protéines Ago1, Ago2 et Ago4 humaines, mais aussi avec d’autres composants du « miRNA-Induced Silencing Complex (miRISC) ». De plus, LegK1 favorise la croissance de L. pneumophila à la fois chez son hôte naturel, l’amibe et en macrophages humains. Enfin, nous démontrons que Ago4 humain est une cible génétique majeure de LegK1. Ces résultats démontrent qu'une bactérie pathogène de l'homme peut supprimer directement l'ARNi et promouvoir ainsi la pathogénie bactérienne
RNA interference (RNAi) is an ancestral gene silencing mechanism orchestrated by short non-coding small RNAs, including microRNAs (miRNAs). miRNAs are present in a wide range of eukaryotic organisms and have been characterized in diverse biological processes. During the past decade, plant and mammalian miRNAs have emerged as major regulators of host-bacteria interactions by controlling multiple steps of bacterial infections. As a counter-defense mechanism, type III-secreted effectors from a phytopathogenic Pseudomonas syringae strain were found to suppress different steps of the plant miRNA pathway to enable disease. However, it remains unknown whether mammalian pathogenic bacteria could have evolved similar strategies. Here, we report that the Legionella pneumophila type IV-secreted effector LegK1 efficiently suppresses miRNA activities in human cells. This phenomenon requires both its known eukaryotic-like serine/threonine kinase activity and a newly identified Argonaute (Ago)-binding platform. We found that LegK1 not only interacts with human Ago1, Ago2 and Ago4 but also with other components of the miRNA-induced silencing complex (miRISC). Furthermore, LegK1 was found to promote L. pneumophila growth in both its natural host amoeba and in human macrophages, highlighting its biological relevance in bacterial pathogenesis. Finally, we demonstrated that human Ago4 is a major genetic target of LegK1, whose targeting is required to promote growth of L. pneumophila in human macrophages. Altogether, these findings provide the first evidence that a human pathogenic bacterium can directly suppress RNAi to promote pathogenicity

L'objectif de cette thèse est d'appliquer la méthode d'identification bactérienne par spectrométrie de masse MALDI-TOF pour une utilisation en routine dans un laboratoire de microbiologie clinique. Dans un 1er temps et de manière prospective, nous avons évalué la performance et le coût-efficacité de l'identification bactérienne de routine par MALDI-TOF par rapport aux techniques conventionnelles d'identification phénotypique. Durant la période des 16 semaines d'étude, nous avons comparé la performance de la technique par MALDI-TOF aux techniques conventionnelles d'identification phénotypique comprenant la coloration de Gram, la galerie API ANA et le Vitek 2. En cas de résultats discordants entre ces deux techniques, l'identification était réalisée par biologie moléculaire. Nous avons montré que le MALDI-TOF est un moyen efficace et rentable pour l'identification des bactéries de routine. Le MALDI-TOF peut être utilisée en 1ère intention dans l'identification bactérienne avant l'ensemble de techniques phénotypiques. Dans un 2ème temps, nous avons évalué rétrospectivement la performance et le coût-efficacité de l'utilisation exclusive de MALDI-TOF en diagnostic bactériologique de routine en comparaison avec les techniques conventionnelles. En analysant les données des 11 dernières années, nous avons montré que le MALDI-TOF est efficace et tout à fait adaptée pour l'identification d'espèce bactérienne en routine. Nous avons également prouvé que MALDI-TOF est un outil puissant pour identifier les espèces bactériennes rarement impliquées dans les infections humaines. Cette technique pourrait être une alternative aux méthodes moléculaires dans le laboratoire clinique
The objective of this thesis is to apply the method of bacterial identification by MALDI-TOF MS in daily practice in a routine clinical microbiological laboratory. Firstly, we prospectively evaluated the performance and the cost-effective of bacterial identification by MALDI-TOF in comparison with conventional phenotypic identification methods. During a 16-week study, we compared the performance of MALDI-TOF with conventional techniques of identification including Gram staining, API ANA identification strip and automated identification using the Vitek 2. The unmatched identifications between MALDI-TOF and conventional methods were resolved by molecular identification. In this study, we showed that MALDI-TOF was an effective tool and less expensive for the rapid identification of bacterial species in clinical microbiology laboratory. MALDI-TOF can be used in first intention for identification before Gram staining or other phenotypic identification techniques based on physicochemical properties of bacteria. Secondly, we retrospectively evaluated the performance and the cost-effectiveness of the exclusive use of MALDI-TOF in bacteriological diagnosis in comparison with conventional phenotypic identification. 11-year retrospective analysis of data showed that MALDI-TOF was efficient and completely adapted for the routine identification of bacterial species. We also showed that MALDI-TOF had capacity to identify bacterial species that were rarely involved in human diseases. This technique could be an alternative to molecular methods in the clinical laboratory

Les gastroentérites aiguës affectent chaque année entre un quart et la moitié des personnes dans le Monde. Elles sont causes de morbidité, de mortalité et de coûts de santé importants. Leur transmission directe ou indirecte via l’eau, les aliments, l’air ou les surfaces inertes dépend de leur étiologie (virale, bactérienne ou parasitaire) et du contexte local. Bogotá et sa région présentent plusieurs spécificités : des eaux usées rejetées en rivière souvent sans ou après seulement un traitement primaire, la mise en décharge des papiers toilettes, couches et protections souillés par les excréments, et une consommation de fruits et légumes faible et limitée à des produits bon marché irrigués par des eaux pouvant être contaminées fécalement. Notre thèse visait à évaluer les flux de certains pathogènes entériques de l’Homme dans l’environnement à proximité de Bogotá et à essayer de relier ces flux à la santé de la population.La thèse a associé trois contributions. Premièrement, une méthode de culture du norovirus humain a été mise au point en utilisant des villosités intestinales isolées de souris comme modèle cellulaire présentant toute la diversité des cellules épithéliales intestinales. Plusieurs concentrations en trypsine ont été testées pour activer les norovirus ; la méthode a été appliquée à des échantillons fécaux et environnementaux. Deuxièmement, les contaminations en E. coli et en pathogènes entériques de l’Homme ont été suivies dans des eaux (lixiviat de décharge, eau de ruissellement, rivière, eau d’irrigation, eau potable), des légumes-feuilles mangés crus (blettes) et l'air (au-dessus d’une décharge, en zone rurale, en zone urbaine) dans la région de Bogotá. Troisièmement, l’impact des contextes socioéconomiques et des pratiques individuelles (alimentation, hygiène et santé) sur les cas de gastroentérites aiguës a été testé à partir d’enquêtes réalisées dans un district de Bogotá et analysées par divers outils (analyse en composante principale, modélisation …).Nous avons montré que les villosités intestinales isolées de souris permettent l'infection et la réplication du norovirus humain. Le virus doit être activé avec de la trypsine et a un cycle réplicatif moyen de 10 h. Les villosités sont efficaces pour obtenir un matériel biologique abondant et sont idéales pour étudier l'activité biologique du norovirus ou générer des anticorps. Elles ont permis de voir des norovirus non détectés par méthode moléculaire dans certains excréments ou échantillons environnementaux ; les échantillons positifs par méthode moléculaire ou en immunodot-blot contenaient quasiment tous des norovirus infectieux. Au niveau régional, les rejets d'eaux usées dans les rivières Bogotá et Balsillas et dans le marais Tres Esquinas contaminent le réseau d'irrigation de La Ramada au nord-ouest de Bogotá en E. coli et potentiellement en pathogènes entériques de l’Homme. Les blettes récoltées dans cette zone étaient fortement contaminées, en contraste d’autres zones de culture. Leur contamination évoluait de leur production à leur achat dans les commerces de proximité, les lavages pouvant être contaminants ou décontaminants, les manipulations sur l’étal des marchands étant contaminantes. L’air était souvent contaminé par E. coli et par Shigella spp., sans pouvoir attribuer à la décharge Doña Juana un rôle particulier. La présence de Shigella spp. était observée parallèlement dans plus de la moitié des selles des personnes diarrhéiques. Les enquêtes réalisées ont montré que la fréquence annuelle des gastroentérites aiguës diminuait avec l’accroissement de l’âge des personnes ; elle semblait plus faible dans les foyers avec personnes âgées, peut-être en lien avec des pratiques plus strictes en matière d’hygiène, alimentaire notamment
Acute gastroenteritis affect between a quarter and a half of people in the World each year. They are responsible for significant morbidity, mortality and healthcare costs. Their direct or indirect transmissions via water, food, air or inert surfaces depend on their aetiology (viral, bacterial or parasitic) and the local context. Bogotá and its region have several specificities: wastewater are often discharged into rivers without or after primary treatment only, the deposit in landfill of toilet papers and diapers soiled by excrement, and the low consumption of fruits and vegetables largely restricted to a handful of relatively cheap products that may be irrigated by surface freshwaters heavily contaminated with faeces. Our PhD aimed to assess the fluxes of some human enteric pathogens in the region of Bogotá and to try to relate these fluxes to the population health. The PhD combined three contributions. First, a method for culturing the human norovirus has been developed using isolated mouse intestinal villi as a cell model exhibiting the full diversity of intestinal epithelial cells. Several concentrations of trypsin were tested to activate noroviruses; the method was applied to faecal and environmental samples. Second, contamination with E. coli and some human enteric pathogens was monitored in water (landfill leachate, runoff water, river, irrigation water, drinking water), leafy vegetables eaten raw (chards) and air (above a landfill, in rural areas, in urban areas) in the Bogotá region. Third, the impact of socioeconomic contexts and individual practices (food, hygiene and health) on cases of acute gastroenteritis was assessed from surveys carried out in one district of Bogotá and analysed by various tools (principal component analysis, modelling …). We have shown that mouse isolated intestinal villi allow the infection and replication of human norovirus. The virus has to be activated with trypsin and has an average replicative cycle of 10 h. Villi are efficient in obtaining abundant biological material and are ideal for studying the biological activity of norovirus or for generating antibodies. They made it possible to see infectious noroviruses not detected by molecular method in several faeces and environmental samples; almost all samples positive by molecular method or immunodot-blot contain infectious noroviruses. At the regional level, the discharges of wastewater in the Bogotá and Balsillas rivers and in Tres Esquinas march contaminate the irrigation network of La Ramada area in the northwest of Bogotá with E. coli and potentially human enteric pathogens. Chards harvested in this area were heavily contaminated, in contrast to other growing areas. Their contamination evolved from their production to their purchase in nearby stores, washings increasing or decreasing their contamination, and handling on the merchant's stalls increasing contamination. The air was often contaminated with E. coli and Shigella spp.; it was not possible to detect a particular contribution of the Doña Juana landfill in pathogen aerosolization. The presence of Shigella spp. was observed in parallel in more than half of the stools of people with diarrhoea. Surveys have shown that the annual frequency of acute gastroenteritis decreases with increasing age; it seemed less common in households with elderly people, possibly due to stricter food hygiene practices. A transmission model of acute gastroenteritis distinguishing contamination from outside the households and contaminations between people in the same households did not show significant differences between neighbourhoods. Used to simulate numerical experiments, it suggests working on much higher numbers of surveys
La gastroenteritis aguda afecta entre una cuarta parte y la mitad de las personas en el mundo cada año. Son responsables de importantes costos de morbilidad, mortalidad y asistencia sanitaria. Sus transmisiones directas o indirectas a través del agua, alimentos, aire o superficies inertes dependen de su etiología (viral, bacteriana o parasitaria) y del contexto local. Bogotá y su región aledaña tienen varias especificidades: las aguas residuales a menudo se vierten a los ríos sin o solo después de un tratamiento primario, el depósito de papel higiénico y pañales sucios con excrementos son dispuestos generalmente en un relleno sanitario, y el bajo consumo de frutas y verduras restringido en gran medida a un puñado de productos relativamente baratos pueden ser irrigados por aguas dulces superficiales muy contaminadas con excrementos. Nuestra tesis doctoral tuvo como objetivo evaluar los flujos de algunos patógenos entéricos humanos en la región de Bogotá y tratar de relacionar estos flujos con la salud de la población. El doctorado combinó tres contribuciones. En primer lugar, se desarrolló un método para cultivar el norovirus humano utilizando vellosidades intestinales aisladas de ratón como modelo celular que exhibe la diversidad completa de células epiteliales intestinales. Se probaron varias concentraciones de tripsina para activar norovirus; el método se aplicó a muestras fecales y ambientales. En segundo lugar, se evidenció la contaminación de E. coli y patógenos entéricos humanos en el agua (lixiviados de vertedero, agua de escorrentía, río, agua de riego, agua potable), vegetales de hoja que se comen crudos (acelgas) y aire (sobre un vertedero sanitario, así como en áreas rurales y urbanas) en la región de Bogotá. En tercer lugar, se evaluó el impacto de los contextos socioeconómicos y las prácticas individuales (alimentación, higiene y salud) frente a los casos de gastroenteritis aguda a partir de encuestas realizadas en una localidad de Bogotá y analizadas mediante diversas herramientas (análisis de componentes principales, modelización…). Con este doctorado, hemos demostrado que las vellosidades intestinales aisladas de ratón permiten la infección y la replicación del norovirus humano. El virus debe activarse con tripsina y tiene un ciclo replicativo promedio de 10 h. Las vellosidades son eficaces para obtener abundante material biológico y son ideales para estudiar la actividad biológica de los norovirus o para generar anticuerpos. Ellas permitieron ver norovirus infecciosos no detectados por método molecular en varias heces y muestras ambientales; casi todas las muestras positivas por método molecular o inmunodot-blot contienían norovirus infecciosos. A nivel regional, los vertidos de aguas residuales en los ríos Bogotá y Balsillas y en el humedal Tres Esquinas contaminan la red de riego La Ramada en el noroeste de Bogotá con E. coli y potencialmete con patógenos entéricos humanos. Las acelgas recolectadas en esta área resultaron muy contaminadas, a diferencia de otras áreas de cultivo. Su contaminación evolucionó desde la producción hasta su compra en las tiendas cercanas, los lavados aumentaron o disminuyeron su contaminación y la manipulación en los puestos de comercio aumentaron la contaminación. El aire a menudo estaba contaminado con E. coli y Shigella spp., sin poder atribuir al relleno sanitario Doña Juana un rol particular. A su vez la presencia de Shigella spp. se observó en paralelo en más de la mitad de las deposiciones de personas con diarrea. Las encuestas demostraron que la frecuencia anual de gastroenteritis aguda disminuye respecto al aumento en edad; parecía menos común en hogares con personas mayores, posiblemente debido a prácticas de higiene alimentaria más estrictas. Un modelo de transmisión de gastroenteritis aguda que distinguió la contaminación fuera de los hogares y las contaminaciones entre personas dentro de los mismos hogares no mostró diferencias significativas entre vecindarios

L'objectif de mon travail fut de valider et d'optimiser la spectrométrie de masse de type MALDI-TOF pour l'identification et la classification d'un ensemble de bactéries pathogènes ou opportunistes chez l'homme, en enrichissant une base de données et en testant la robustesse de la méthode, afin d'obtenir une méthode rapide fixe et fiable d'acquisition de résultats. Les différents résultats obtenus ont permis la validation de la technique comme outil d'identification bactérienne fiable en routine. Elle permet désormais de caractériser les mélanges de deux bactéries voir même la différentiation d'espèces très proches comme les Shigella spp et E. coli. Nous avons montré que la technique sera encore améliorée par un outil supplémentaire de comparaison des souches pour une veille épidémiologique "en temps réel", sans investissement supplémentaire, en permettant plusieurs types d'économie. Elle apporte un gain réel dans la prise en charge du patient et le choix éclairé des antibiotiques testés pour l'antibiogramme. La technique peut aussi constituer un outil alternatif de sérotypage.