Tesi: "ARN Dependent ARN Polymerase"

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Devert, Anthony. "Etude des ARN Polymérases ARN-dépendantes impliquées dans le RNA silencing". Thesis, Aix-Marseille 2, 2011. http://www.theses.fr/2011AIX22086.

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Abstract (sommario):

Ce travail de thèse porte sur l’étude des ARN polymérases ARN dépendant impliquées dans le RNA silencing chez Arabidopsis thaliana. Durant ma thèse, la recherche d'interacteurs des RDR, parmi des protéines impliquées dans le RNA silencing, a permis la détection d'interaction entre RDR6 et SDE3, RDR6 et SGS3, mais aussi entre SDE3 et SGS3 en Co-IP et BiFC. Une co-localisation de ces protéines a été observée lorsqu'elles sont produites transitoirement dans des cellules épidermales de N. benthamiana.Un crible d’une banque d’ADNc d’A. thaliana par double hybride de levure, a permis d’isoler des interacteurs potentiels de RDR6. Deux interacteurs potentiels, AtUAP56-1 et U2B’’, sont impliqués dans l’épissage des précurseurs des ARNm. Un effet sur le RNA silencing dans des mutants de l’épissage en 3’ des ARNm était connu et nous avons confirmé l’interaction entre RDR6 et AtUAP56-1 par BiFC. L’étude de lignées mutantes pour AtUAP56-1 a donc été initiée.Une étude biochimique de RDR6 et de RDR2 a été réalisée. Des formes recombinantes de RDR2 et RDR6 ont été produites de façon transitoire dans des feuilles de N. benthamiana, et une étude comparative de RDR2 et RDR6 a été réalisée. Les deux RDR sont actives sur des matrices ARN et ADN, et montrent in vitro une activité amorce-indépendante. De plus, nous avons détecté pour la première fois une activité amorce-dépendante de RDR6 et RDR2. Ces résultats apportent de nouvelles données biochimiques qui sont en accord avec les études menées in vivo et enrichissent les modèles actuels du RNA silencing
The aim of this work was to study RNA-dependent RNA polymerases involved in RNA silencing in Arabidopsis thaliana. During my thesis, the search for RDR interactors among proteins involved in RNA silencing allowed the detection of interactions between RDR6 and SDE3, RDR6 and SGS3, and also between SDE3 and SGS3 using Co-IP and BiFC. In addition, the co-localisation of these proteins was observed when produced transiently in epidermal cells of N. Benthamiana.A screen of an A. thaliana cDNA library by yeast two hybrid allowed us to identify some putative new RDR6 interactors. Two putative RDR6 interactors, AtUAP56 and U2B’’, are known to be involved in pre-miRNA splicing. Furthermore, a link between pre-mRNA 3’ splicing and RNA silencing was previously reported. We also confirmed the interaction between AtUAP56-1 and RDR6 by BiFC. An investigation of A. thaliana of AtUAP56-1 mutants has been initiated.Recombinant RDRs were produced transiently in N. Benthamiana, and a biochemical comparative study of RDR2 and RDR6 performed. We found that RDR2, like RDR6, has a de novo polymerase activity on DNA and RNA templates, and for both RDRs we also showed, for the first time, a primer-dependant synthesis of dsRNA from RNA template. These findings provide important new insights into our understanding of the molecular mechanisms of RNA silencing amplification in Arabidopsis

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Durieux-Trouilleton, Quentin. "Analyse structurale et fonctionnelle de la réplication et de la transcription des Bunyavirus". Electronic Thesis or Diss., Université Grenoble Alpes, 2024. http://www.theses.fr/2024GRALV028.

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Abstract (sommario):

L’ordre des Bunyavirales constitue un ordre vaste et diversifié de plus de 500 virus à ARN à simple brin négatif segmenté, contenant plusieurs virus émergents et/ou hautement pathogènes pour l'homme. Au sein de cet ordre, la famille des Hantaviridae contient le virus Hantaan (HTNV) qui entraîne des fièvres hémorragiques avec syndrome rénal, ainsi que le virus de Sin Nombre (SNV) qui cause des syndromes pulmonaires graves. Ces maladies sont reliées à des taux de mortalité importants, respectivement 15 % et 50 %. Une seconde famille, celle des Peribunyaviridae, contient des virus entraînant des cas d’encéphalites chez les enfants. C’est notamment le cas du virus de La Crosse (LACV). Aucun vaccin ni médicament n'est actuellement approuvé par les autorités de santé pour les contrer.L’objectif de cette thèse est d’étudier ces virus et plus précisément leur ARN polymérase dépendante de l’ARN, qui est une large protéine multi-fonctionnelle de 250kDa. Cette protéine, aussi appelée L, joue un rôle clé dans la réplication et la transcription du génome viral. Les expériences réalisées se sont principalement focalisées sur la polymérase du virus Hantaan (HTNV-L). Des expériences complémentaires ont également été réalisées sur SNV-L et LACV-L.J’ai utilisé la cryo-microscopie électronique (cryo-ME) comme méthode principale pour déterminer la structure d’HTNV-L. Les premières structures partielles d’HTNV-L ont révélé que la structure apo de HTNV-L adopte une conformation inactive avec une configuration α-hélicoïdale inédite du motif catalytique E. L'analyse structurale de la protéine en présence de l'extrémité 5' de l'ARN viral (vRNA) a montré que la liaison de ce dernier entraîne une cascade de modifications impliquant notamment la réorganisation complète du motif catalytique E en une configuration en β-feuillet canonique, ce qui conduit à des changements conformationnels drastiques dans le site actif. La liaison de l'extrémité 5' de l'ARN viral à HTNV-L est également nécessaire pour le recrutement de l'extrémité 3' de l'ARN viral vers le site actif de la polymérase pour l'initiation de la réplication. Les tests d'activité couplés aux structures cryo-ME d’HTNV-L et LACV-L révèlent les mécanismes impliqués dans les différentes étapes de la réplication du génome, notamment son initiation qui utilise un mécanisme d’amorçage et réalignement. Les structures bloquées à l'élongation de la réplication révèlent ensuite la formation d'un double brin d’ARN matrice/produit dans la cavité du site actif, couplée à des changements conformationnels d’HTNV-L.Dans un second temps, le traitement des images par cryo-ME d’HTNV-L apo a également dévoilé les structures haute résolution d’HTNV-L en trois oligomères différents : des monomères, des dimères symétriques et des hexamères symétriques composés de trimères de dimères. La formation de multimères implique des mouvements drastiques des protomères, montrant la capacité de changement conformationnel d’HTNV-L. Ces oligomères ont été l’opportunité d’observer et de résoudre la structure de chacun des domaines d’HTNV-L, y compris les plus flexibles, révélant enfin la structure complète de cette enzyme essentielle.Ensemble, ces éléments révèlent (i) la capacité de multimérisation d’HTNV-L dans sa forme apo inactive, qui correspond probablement à un système de stockage stabilisant et protecteur pour la protéine, (ii) l'activation de la polymérase déclenchée par la liaison de l'ARN viral et (iii) les mécanismes moléculaires complexes sous-jacents à la réplication du génome. Globalement, ces résultats améliorent considérablement la compréhension des mécanismes impliqués dans la réplication du génome des Bunyavirus et fournissent une base solide pour le développement futur d'antiviraux contre ce groupe de pathogènes émergents
Bunyavirales is a large and diverse order of more than 500 segmented negative-stranded single-stranded RNA viruses, including several emerging and/or highly pathogenic human viruses. Within this order the family Hantaviridae includes the Hantaan virus (HTNV) that causes haemorrhagic fever with renal syndrome, and the Sin Nombre virus (SNV), which can lead to severe pulmonary syndromes. These illnesses are linked to significant mortality rate of 15% and 50% respectively. A second family, Peribunyaviridae, includes viruses that cause encephalitis in children, notably La Crosse virus (LACV). There is currently no vaccine or drug approved by health authorities to combat these viruses.The aim of this thesis is to study these viruses and, in particular, their RNA-dependent RNA polymerase, that is a large multi-functional protein of 250kDa. This protein, also called L protein, plays a key role in the replication and transcription of the viral genome. The experiments that I carried out focused mainly on Hantaan virus polymerase (HTNV-L). Complementary experiments were also performed on SNV-L and LACV-L.I used cryo-electron microscopy (cryo-EM) as the main method to determine the structure of HTNV-L. The first partial structures of HTNV-L revealed that its apo structure adopts an inactive conformation with a novel α-helical configuration of the catalytic motif E. Structural analysis of HTNV-L in the presence of the 5'-end of the viral RNA (vRNA) showed that the binding of the latter triggers a cascade of modifications, that notably involves the complete reorganisation of the catalytic motif E into a canonical β-sheet configuration, leading to drastic conformational changes in the active site. Binding of the viral RNA 5'-end to HTNV-L is also required for the recruitment of the viral RNA 3'-end to the polymerase active site for replication initiation. Activity assays coupled with cryo-EM structures of HTNV-L and LACV-L reveal the mechanisms involved in the different steps of genome replication, in particular its initiation, which uses a prime-and-realign mechanism. Structures stalled during replication elongation then reveal the formation of a template/product duplex in the active site cavity, coupled with conformational changes in HTNV-L.Secondly, cryo-EM imaging of apo HTNV-L also revealed the high-resolution structures of HTNV-L in three different oligomers: monomers, symmetric dimers and symmetric hexamers composed of trimers of dimers. Multimer formation involves large movements of the protomers, demonstrating the ability of HTNV-L to undergo conformational changes. These oligomers provided the opportunity to observe and determine the structure of each domain of HTNV-L, including the most flexible ones, finally revealing the complete structure of this essential viral enzyme.Taken together, these elements reveal (i) the ability of HTNV-L to multimerise in its inactive apo form, which probably corresponds to a stabilising and protective storage system for the protein, (ii) the activation of the polymerase triggered by viral RNA binding, and (iii) the intricate molecular mechanisms underlying genome replication. Collectively, these results significantly improve the understanding of the mechanisms involved in Bunyavirus genome replication and provide a solid basis for the future development of antivirals against this group of emerging pathogens

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HERICOURT, FRANCOIS. "Etude moleculaire de l'arn polymerase arn-dependante du virus de la mosaique jaune du navet (tymv)". Paris 6, 1999. http://www.theses.fr/1999PA066244.

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Abstract (sommario):

Ce travail de these concerne l'etude de l'arn polymerase arn-dependante (rdrp) d'un virus a arn simple brin de polarite positive, le tymv. L'analyse de cette proteine essentielle a la replication de ce virus a ete entreprise selon 3 axes de recherche : 1) l'etude de ses proprietes biochimiques grace a sa surexpression dans un systeme d'expression eucaryote utilisant un baculovirus recombinant, 2) l'etude de ses interactions avec les autres proteines virales non structurales par la technique du double-hybride et 3) la recherche d'interactions avec des proteines cellulaires soit a) deja soupconnees de participer au complexe de replication, tel que le facteur d'elongation eef1, soit b) encore inconnues, par le criblage d'une banque d'adn, egalement grace au systeme du double-hybride. Les resultats obtenus montrent que la rdrp du tymv est phosphorylee in vivo dans les cellules d'insecte et que certaines especes minoritaires de cette proteine correspondent a des formes ubiquitinees, suggerant ainsi que cette proteine puisse etre degradee par la voie ubiquitine-dependante du proteasome. Par ailleurs, l'etude des interactions entre la rdrp et les autres proteines virales nous ont permis de definir essentiellement 2 interactions entre ces differentes proteines et de delimiter la region minimale necessaire a l'interaction de la rdrp sur elle-meme au niveau de sa partie n-terminale. Enfin, la recherche d'interaction entre la rdrp du tymv et differentes sous-unites du facteur d'elongation eef1 nous a conduit a cloner une nouvelle sous-unite de ce facteur chez arabidopsis thaliana et a purifier le complexe de replication de ce virus chez cette plante modele. En parallele, nous avons isole lors d'un crible double-hybride avec une banque d'adn genomique de levure, 36 candidats capables d'interagir specifiquement avec la rdrp du tymv. De telles proteines constituent des pistes de recherche prometteuses dont l'etude permettra une meilleure comprehension des mecanismes moleculaires de l'interaction entre virus et cellule hote.

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Subissi, Lorenzo. "Biochemical insights into SARS-CoV replication". Thesis, Aix-Marseille, 2014. http://www.theses.fr/2014AIXM5002.

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Abstract (sommario):

Mon travail de thèse s'est focalisé sur la machinerie enzymatique impliquée dans la réplication du génome ARN du Syndrome Respiratoire Aigu Sévère-Coronavirus (SRAS-CoV). J'ai montré in vitro que l'activité ARN polymérase ARN-dépendante (RdRp) portée par nsp12 nécessite le complexe nsp7/nsp8, qui agit comme facteur de processivité. Grâce à ce complexe polymérase hautement actif, j'ai pu en suite étudier le mécanisme de "proofreading" (correction d'épreuve) associé aux coronavirus, pour lequel seulement des preuves indirectes avaient été assemblées. En effet, les coronavirus codent pour une activité exonucléase 3'-5' (nsp14-ExoN) qui lorsqu'elle est absente, entraine 14-fois plus d'erreurs de réplication en contexte cellulaire. In vitro, nous avons pu montrer que nsp14-ExoN est capable d'exciser l'ARN double brin ainsi qu'un nucléotide mésapparié en 3' de l'ARN en cours d'élongation. J'ai pu apporter pour la première fois une preuve directe de l'existence d'un système de réparation des erreurs au cours de la synthèse, mené par le complexe nsp7/nsp8/nsp12/nsp14. En effet, le complexe nsp7/nsp8/nsp12 ralentit jusqu'à 30-fois quand il rajoute une base mésappariée. Par sequençage, nous avons pu montrer la réparation de cette base mésappariée en presence de nsp14. Enfin, grâce à ce système in vitro nous avons une base pour comprendre l'inefficacité de la ribavirine sur des patients atteints du SRAS. En effet, la ribavirine, incorporée par le complexe polymérase, serait également excisée par nsp14, annihilant tout potentiel effet mutagenique. En conclusion, ce système va permettre de guider le développement d'antiviraux de type nucleoside analogues contre les coronavirus
This work focused on the enzymatic machinery involved in Severe Acute Respiratory Syndrome-Coronavirus (SARS-CoV) RNA replication and transcription. Firstly, I established a robust in vitro polymerase assay with the canonical SARS-CoV RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) nsp12. I showed that nsp12, in order to engage processive RNA synthesis, needs two viral proteins, i.e. nsp7 and nsp8. This nsp7/nsp8 complex not only activates nsp12-RdRp, but also acts as a processivity factor. Thus, using this processive polymerase complex, I could investigate SARS-CoV proofreading for which only indirect evidences were reported. Indeed, coronaviruses encode for a 3'-5' exonuclease (nsp14-ExoN), putatively involved in a mechanism that proofreads coronavirus RNA during viral replication. We first showed in vitro that nsp14-ExoN, which is stimulated by nsp10, is able to excise specifically dsRNA as well as all primer/templates bearing a 3' mismatch on the primer. Moreover, we could confirm by sequencing that a RNA 3' mismatch was indeed corrected in vitro by the nsp7/nsp8/nsp12/nsp14 complex. We provide for the first time direct evidence that nsp14-ExoN, in coordination with the polymerase complex, is able to proofread RNA. Interestingly, using this in vitro system we found an element that could possibly explain the inefficacy of ribavirin therapeutic treatment on SARS-patients: ribavirin, which is incorporated by the SARS-CoV polymerase complex, would also be excised by nsp14. In conclusion, this system will drive future development of antivirals, particularly of the nucleoside analogue type, against coronaviruses

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Duplàa, Cécile. "Analyse quantitative des produits de polymerase chain reaction utilisant l'incorporation de dUTP biotinylé". Bordeaux 2, 1993. http://www.theses.fr/1993BOR2P045.

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Ferrigno, Olivier. "Les elements transposables sine b2 fournissent un promoteur arn polymerase ii mobile". Nice, 1999. http://www.theses.fr/1999NICE5357.

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Abstract (sommario):

Les sine (short interspaced elements) sont des composants tres abondants des genomes de mammiferes qui se propagent par retrotransposition. Parmi les sine, la famille des elements b2 constitue approximativement 0,7% de l'adn genomique total de rongeur. Les b2, comme la plupart des sine ont evolue a partir d'un arn de transfert, mais possedent aussi une region unique, d'origine inconnue, de 70 pb a leur extremite 3. Nous avons localise un de ces membres dans un intron du gene lama3 qui code pour les isoformes de la chaine 3 de la laminine-5 murine. Nous avons identifie un nouveau transcrit 3 dont le site d'initiation est situe dans cette sequence b2 au niveau de la region unique et est derive du brin antisens au transcrit ressemblant aux arnt synthetises par la pol iii. Nos etudes ont montre tout d'abord que la nouvelle transcription in vivo par la pol ii du gene lama3 est conduite par un petit fragment de 70 pb appartenant exclusivement a la sequence b2 et est dirigee par un element initiateur et une boite tata en amont. Cette sequence initiatrice est reconnue par le facteur de transcription usf et l'expression ectopique de ce facteur peut stimuler fortement la transcription par la pol ii de l'element b2 in vivo. Ces resultats mettent en evidence pour la premiere fois la presence d'un promoteur pol ii dans un element sine. Nous avons ensuite elargi nos etudes en montrant que la grande majorite des elements b2 possedent un promoteur pol ii, et que ce promoteur possede des similitudes de sequences avec plusieurs promoteurs de genes codant pour des proteines. Ces donnees indiquent que les elements sine b2 ont le potentiel de distribuer un promoteur pol ii fonctionnel et regulable a travers le genome. Ceci a pu, au cours de l'evolution, resulter en la creation de nouveaux arnm qui fournissent le materiel de base pour la selection naturelle.

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Swale, Christopher. "RNA binding and assembly of human influenza A virus polymerases". Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015GREAV053/document.

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Abstract (sommario):

Le virus de la grippe A est un virus à ARN négatif appartenant à la famille des Orthomyxoviriadea dont la réplication se produit dans le noyau des cellules infectées. L'organisation du génome est segmentée en huit segments d'ARNv de polarité négative, codant pour un minimum de 16 protéines virales différentes. Ces ARN viraux (ARNv) sont en complexe avec de nombreuses copies de nucléoprotéines et liés par leurs extrémités 5' et 3' au complexe hétérotrimérique de l'ARN-polymérase ARN-dépendante composé des sous unités PA, PB1 et PB2. Cet assemblage macromoléculaire (ARNv / polymérase / NP) nommée Ribonucléoprotéine (RNP) constitue une entité génomique indépendante. Dans le contexte de la RNP, l'ARN-polymérase assure à la fois la transcription et la réplication du génome ARNv. En assurant ces deux fonctions, l'ARN-polymérase joue un rôle majeur dans la réplication virale et constitue une cible antivirale privilégiée. Les travaux de recherche présentés dans cette thèse se concentrent sur les éléments structuraux participants à l'assemblage de l'ARN polymérase et son interaction avec les avec les ARNv. Pour atteindre ces objectifs, notre laboratoire, en collaboration avec d'autres groupes, a mis en place un système d'expression en polyprotéines permettant d'exprimer la polymérase. Plus encore, cette méthode a aussi permis de reconstituer des complexes entre l'ARN-polymérase et des partenaires cellulaires, notamment RanBP5 qui appartient à la famille des importines-β
Influenza A virus is a negative-strand RNA virus belonging to the Orthomyxoviriadea family whose replication occurs in the nucleus of infected cells. The genome organisation of influenza virus is segmented in eight vRNA segments of negative polarity coding for at least 16 different viral proteins. Each vRNA is bound to multiple copies of nucleoprotein (NP) and to the heterotrimeric RNA-dependent RNA-polymerase complex (PA, PB1 and PB2) through its 5' and 3' extremities. This macromolecular assembly (vRNA/polymerase/NP) forms the ribonucleoprotein (RNP) particle, which acts as a separate genomic entity within the virion. The RNP complex is at the core of viral replication and in the context of RNPs, the polymerase performs both transcription and replication of the vRNA genome. As such, the polymerase constitutes a major antiviral drug target. The research work presented within this thesis focuses on the underlying determinants of the RNA polymerase assembly process and its interaction with its vRNA genome. To fulfill these goals, our lab, in collaboration with other groups, has set up a novel polyprotein expression system to express the polymerase but also to reconstitute polymerase and cellular partner complexes, notably RanBP5, which belongs to the importin-β family

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Azevedo, Jacinthe. "Caractérisation d'une nouvelle famille de protéines susceptibles d'interagir avec une ARN polymerase plastidiale". Université Joseph Fourier (Grenoble), 2005. https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011722.

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Abstract (sommario):

Les ARN polymérases de type phagique, codées dans le noyau (NEP; Nuclear Encoded RNA Polymerase), assurent une partie de la transcrIption du génome plastidial des végétaux supérieurs. Ces travaux mettent en évidence l'existence d'une nouvelle famille de protéines d'A. Thaliana susceptibles d"interagir avec les NEP des plantes dicotylédones: les protéines NIP (NEP Interacting Protein). Les protéines NIP sont retrouvées uniquement dans le végétaux supérieurs et leur synthèse est dépendante de la lumière. Elles présentent un domaine d'interaction protéine-protéine RING fmger en C terminal. Nous avons montré pour la première fois par inununodétection que ces protéines sont intégrées aux membranes thylacoïdiennes et qu'elles retiennent probablement les NEP plastidiales à la surface de la membrane. Cette interaction avec les membranes pourrait apporter une nouvelle vision du fonctionnement des NEP dans le chloroplastes des plantes dicotylédones
The phage-like RNA polymerases, encoded in the nucleus (NEP; Nuclear Encoded RNA Polymerase) ensure partial!y plastidial genome transcription in higher plants. This work underlined the existence of a new protein family potentially able to interact with NEP in dicotyledon plants: NIP proteins (NEP Interacting Protein). NIP proteins are only present in higher plants and their synthesis is light dependant. Their C-terminal region presents a RINC finger protein-protein interacting domain. Using immundetection, we show the first time that NIP proteins are integrated into thylakoid membranes, keeping probably NEP close to the membrane on the stroma side. This association to membranes offers new insights into NEP activity in chloroplasts of dicotyledon plants

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Gu, Bo. "Co-transcriptional processing of pre-mRNA : Effects of RNA polymerase II carboxyl-terminal domain modification". Paris 6, 2012. http://www.theses.fr/2012PA066202.

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Abstract (sommario):

La transcription par l’ARN polymerase II (RNAPII) est un processus complexe qui inclue initiation, échappement du promoteur, elongation et terminaison. Chaque étape est régulée par un grand nombre d’éléments en cis et de facteurs en trans. La maturation des transcrits est aussi une succession d’étapes incluant la formation d’une coiffe en 5’, épissage puis clivage suivi de polyadénylation en 3’. Il est couramment admis que la transcription par la RNAPII et la maturation des transcrits est largement couplée et que les différents processus s’influencent mutuellement. En recherchant des ARNs non-codants pouvant réguler l’activité de la RNAPII chez les mammifères, nous avons trouvé que le snARN U1 était constitutivement associé à la RNAPII qu’elle soit en train de transcrire ou non. En outre, une analyse par microscopie de fluorescence a montré que cette interaction était indépendante de l’épissage qui est l’une des principales fonctions de U1 snRNA. Je me suis particulièrement intéressé aux modifications du domaine CTD de la RNAPII qui est une caractéristique de cette polymerase eukaryote. J’ai trouvé que la phosphorylation de la serine 2 était importante pour assurer l’épissage co-transcriptionnel et une terminaison en 3’ correcte. Je montre aussi que la stimulation de la terminaison par l’épissage est médiée par le facteur U2AF65. Enfin, j’analyse l’importance de la phosphorylation de la serine 2 du CTD sur l’épissage alternatif et le recrutement des facteurs TAF15, PSF et P54
Transcription of RNA polymerase II (RNAPII) is a highly complex procedure, including initiation, promoter escape, elongation and termination. Each step of transcription is regulated by a variety of cis-elements and trans-factors. Maturation of RNAPII transcripts is also a complicated course consisting of transcript capping, splicing and 3’ end processing. It is widely accepted that RNAPII transcription and its RNA processing are interactional and different processes of RNAPII transcript maturation influence each other. In the attempt of finding the non-coding RNAs that can regulate the activity of RNAPII in mammals, we found that U1 snRNA is associated with RNAPII no matter if RNAPII is transcribing or not. Moreover, using fluorescence microscopy, we showed that the interaction between U1 snRNA and RNAPII is independent on splicing, which is the main function of U1 snRNA. During the investigation of the effect of RNAPII on transcript maturation, I focused on post-translational phosphorylation of the carboxyl-terminal domain of RNAPII, which is the unique domain of RNAPII in all RNAPI, II and III. I found that the phosphorylation of CTD serine 2 residues is required for constitutive splicing as well as 3’ end processing. I also provided the evidence to show the effect of splicing on 3’ end processing via the splicing factor U2AF65. Furthermore, I showed the effect of CTD serine 2 residue phosphorylation on alternative splicing and the recruitment of TAF15, PSF and P54 to the transcription sites. Finally, I summarized the unknown points in my study and proposed the perspective

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Gajda, Anna Ewa. "Regulation of a gene transcription by RNA polymerase III in Saccharomyces cerevisiae : the role of evolutionarily conserved domains of the Maf1 protein, RNA polymerase III repressor". Paris 11, 2010. http://www.theses.fr/2010PA112224.

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Abstract (sommario):

Dans l'environnement, la levure doit faire face à des conditions variées qui nécessitent une adaptation rapide du métabolisme cellulaire. Une des premières réponses est l'inhibition de la transcription par l'ARN polymérase III (Pol III). La protéine Maf1, le seul régulateur de la machinerie de la Pol III chez Saccharomyces cerevisiae (Sc), est conservée au cours de l'évolution. Les protéines Maf1 des Eucaryotes contiennent deux domaines A et BC phylogénétiquement conservés. Ce travail de thèse a cherché à identifier le rôle de ces domaines dans la fonction de la protéine ScMaf1. J'ai construit une banque de mutants de Maf1, identifié les changements dans leurs séquences ainsi que leurs phénotypes. En utilisant la technique du double-hybride, j'ai montré que les domaines A et BC interagissent physiquement et que l'extrémité N-terminale de 34 acides aminés du domaine A est le fragment minimal nécessaire à cette interaction. Grâce à un crible génétique, j'ai mis en évidence que les mutations du domaine BC (D250E et V260D-N344I) permettent de restaurer l'activité de Maf1 mutée dans le domaine A (K35E). Cette restauration est observable pour le phénotype, la répression efficace de la transcription par la Pol III, le niveau de phosphorylation et la localisation cellulaire de Mafl. La technique du double-hybride m'a permis aussi de montrer que la mutation K35E inactive partiellement l'interaction entre les domaines de Maf1 qui est restaurée par les mutations suppresseurs D250E et V260D-N344I. Les résultats permettent de conclure que : « la répression de la transcription par la Pol III requiert l'interaction physique des domaines de Maf1»
Yeast cell encounters numerous environ mental situations that require a rapid and efficient adaptation of cellular melabolism to changing Iife conditions. One of the first responses is the inhibition of RNA polymerase III (Pol llI) transcription. The Maf1 protein, the unique negative regulator of the Pol III apparatus in Saccharomyces cerevisiae (Sc), is conserved through evolution. The family of eukaryotic Maf1 share highly conserved amino acid sequence with two easily recognizable regions called A and BC domains. The work performed during this PhD thesis concerns the role of these evolutionary conserved domains in the activity of ScMaf1. I have constructed a Iibrary of Maf1, identified and localized the mutations of corresponding Maf1 proteins and studied the phenotype. Using yeast two-hybrid system, I have found the A and BC domains interact physically and defined the minimal 34 aa fragment of the A domain involved in this interaction. Using genetic screen for internal suppressor mutations, I have identified that mutations localized in BC domain (D250E, V260D-N344I) recovered the activity of Maf1 mutated in A domain (K35E), as deduced from no defected growth, efficient Pol III repression, phosphorylation and cellular localization of identified suppressors. The identified K35E mutation disrupted physical interaction between Maf1 domains unless the presence of additional D250E or V260D-N344I suppressor mutations occurred. The Take Home message from the results obtained during my PhD thesis is that: "Full repression of Pol III requires the physical interaction between Maf1 domains"

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Thomen, Philippe. "Transcription par une ARN Polymerase : mesures de forces à l'échelle de la molécule unique". Phd thesis, Université Pierre et Marie Curie - Paris VI, 2002. http://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00011391.

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Abstract (sommario):

Nous avons réalisé une expérience à l'échelle de la molécule unique pour étudier l'influence d'une force mécanique sur la transcription par l'ARN polymérase du phage T7. Cette enzyme, prototype de moteur moléculaire, est très processive et partage des homologies avec les membres de la famille Pol I incluant la transcriptase inverse du VIH 1. Une extrémité de l'ADN à transcrire est tenue par une polymérase fixée sur une surface, l'autre extrémité est attachée à une bille microscopique capturée à l'aide d'un piège optique interférométrique qui permet de mesurer la force développée durant la transcription. Des mesures de vitesse de transcription ont été réalisées dans la gamme 5-20 pN, à différentes concentrations en nucléotides (NTP). On observe que la diminution de la concentration en NTP, qui rend l'étape de liaison du nucléotide dans le site actif limitante, fait apparaître une dépendance marquée de la vitesse à la force, alors que les hautes concentrations en NTP rendent la polymérase insensible à la force. On en déduit que le mouvement d'avancée de l'enzyme le long de l'ADN est couplé à la fixation du nucléotide dans le site actif. Ainsi l'énergie d'hydrolyse n'est pas directement convertie en énergie mécanique. Les homologies entre polymérases suggèrent que ce mécanisme est également partagé, ce qui permet de proposer que pour les polymérases en général, l'étape de fixation du nucléotide dans le site actif est couplé au mouvement sur l'ADN.

Nous avons également mené un autre type d'expérience en mesurant la force lors de l'ouverture mécanique de la double hélice d'ADN, qui a permis de déterminer la friction exercée sur l'ADN en rotation.

La configuration d'ouverture de l'ADN a été également utilisée pour étudier l'interaction d'une protéine, EcoR V avec l'ADN. L'analyse des résultats a mis en évidence une grande variabilité dans l'énergie de dissociation, liée à des différences d'affinités entre les sites de reconnaissance spécifiques de l'enzyme.

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SCHYNS, GHISLAIN. "Reconnaissance specifique de promoteurs chez la cyanobacterie calothrix pcc 7601 : arn polymerase et effecteurs". Paris 7, 1995. http://www.theses.fr/1995PA077254.

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Abstract (sommario):

Procaryotes photosynthetiques, les cyanobacteries sont des bacteries qui ont develope un grand nombre de mecanismes d'adaptation aux modifications des conditions de l'environnement comme, par exemple, la fixation de l'azote atmospherique, la differenciation cellulaire en hormogonies ou en heterocystes ou l'adaptation chromatique complementaire. Apres avoir developpe une methode de purification de l'arn polymerase de calothrix pcc 7601, nous avons mis au point un systeme de transcription in vitro grace auquel nous avons etudie la specificite de reconnaissance par l'enzyme des onze promoteurs de genes de calothrix pcc 7601 cartographies a ce jour. Ce travail a egalement permis de montrer que la proteine rcaa, effecteur decrit anterieurement comme se fixant au niveau de la region promotrice de l'operon qui specifie la phycoerythrine, cpeba, entraine une modification specifique du profil de transcription pour quatre des promoteurs examines. Ces quatre promoteurs appartiennent a des genes codant pour des constituants du phycobilisome. La proteine rcaa, tout comme rcad, proteine affine de la region promotrice de l'operon specifiant la phycocyanine 2, cpc2, modifie in vitro la transcription de l'operon cpc1 qui code pour la phycocyanine 1. Les resultats obtenus nous ont permis de proposer un modele pour la regulation transcriptionnelle de l'expression de trois operons codant pour des phycobiliproteines. Enfin, ce travail a fourni l'occasion de comparer la transcription chez escherichia coli et chez calothrix pcc 7601

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Mercoyrol, de Beaulieu Laure de. "ARN polymerase II de germe de blé : étude des propriétés catalytiques fondamentales de l'enzyme". Aix-Marseille 2, 1992. http://www.theses.fr/1992AIX22020.

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Abstract (sommario):

La purification de l'arn polymerase ii de germe de ble a permis l'etude de ses proprietes catalytiques fondamentales, en absence de tout facteur additionnel. La formation de la premiere liaison phosphodiester de la chaine d'arn est suffisante pour conferer la stabilite au complexe de transcription. L'enzyme s'engage ensuite dans la phase d'elongation de la chaine d'arn. Le travail presente illustre le role primordial joue par la dynamique de la transition entre ces deux etapes. L'existence d'une transition lente entre deux etats du complexe ternaire de transcription rend compte du fait que l'arn polymerase ii presente un comportement cinetique de type hysteretique. Ces deux etats sont caracterises par des proprietes catalytiques differentes, notamment par des probabilites differentes de relacher les produits de transcription. L'arn polymerase ii catalyse ainsi la synthese d'arn selon deux modes differents: l'un abortif caracteristique des phases d'initiation et de terminaison, l'autre processif caracteristique de la phase d'elongation. L'enzyme possede donc intrinsequement les proprietes requises pour l'initiation, l'elongation et la terminaison des chaines d'arn. Ces deux formes de l'enzyme sont interconvertibles. Ainsi la sequence et la conformation de la matrice d'adn transcrite, la presence d'un facteur de transcription homologue, la force ionique du milieu reactionnel ou la nature du cofacteur metallique controlent la selection du mode synthetique de l'enzyme. Dans le cas des matrices d'adn de conformation z, cette selection s'accompagne d'une diminution de la fidelite de la transcription

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Dietrich, Jacques. "ARN polymerase 2 de germe de blé : conditions de la synthèse abortive et productive d'ARN". Aix-Marseille 2, 1987. http://www.theses.fr/1987AIX22009.

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Cerutti, Elena. "Nucleotide Excision Repair at the crossroad with transcription". Thesis, Lyon, 2019. http://www.theses.fr/2019LYSE1057.

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Abstract (sommario):

L’intégrité de l’ADN est continuellement remise en question par divers agents endogènes et exogènes (p. ex., la lumière ultraviolette, la fumée de cigarette, la pollution de l’environnement, les dommages oxydatifs, etc.) qui causent des lésions de l’ADN qui interfèrent avec les fonctions cellulaires correctes. Le mécanisme de réparation par excision de nucléotides (NER) supprime les adduits d’ADN déformantes l’hélice tels que les lésions induites par les UV et il existe dans deux sous voies distinctes selon l’endroit où les lésions de l’ADN sont situées dans le génome. L’une de ces sous voies est directement liée à la transcription de l’ADN (TCR) par l’ARN Polymérase 2 (ARNP2). Dans la première partie de ce travail, nous avons démontré qu’un mécanisme NER entièrement compétent est également nécessaire pour la réparation de l’ADN ribosomique (ADNr), transcrite par ARN Polymérase 1 (ARNP1) et représentant 60 % de la transcription cellulaire totale. De plus, nous avons identifié et clarifié le mécanisme de deux protéines responsables du repositionnement nucléolaire dépendant des UV de l’ARNP1 et de l’ADNr observé pendant la réparation. Dans la deuxième partie de ce travail, nous avons étudié la fonctionne moléculaire de la protéine XAB2 lors de la réparation NER et nous avons démontré son implication dans le processus TCR. De plus, nous avons également montré la présence de XAB2 dans un complexe d’épissage du pré-ARNm. Enfin, nous avons décrit l’impact de XAB2 sur la mobilité de l’ARNP2 lors des premières étapes de la réparation TCR, suggérant ainsi un rôle de XAB2 dans le processus de reconnaissance des lésions
The integrity of DNA is continuously challenged by a variety of endogenous and exogenous agents (e.g. ultraviolet light, cigarette smoke, environmental pollution, oxidative damage, etc.) that cause DNA lesions which interfere with proper cellular functions. Nucleotide Excision Repair (NER) mechanism removes helix-distorting DNA adducts such as UV-induced lesions and it exists in two distinct sub-pathways depending where DNA lesions are located within the genome. One of these sub pathways is directly linked to the DNA transcription by RNA Polymerase 2 (TCR). In the first part of this work, we demonstrated that a fully proficient NER mechanism is also necessary for repair of ribosomal DNA, transcribed by RNA polymerase 1 and accounting for the 60 % of the total cellular transcription. Furthermore, we identified and clarified the mechanism of two proteins responsible for the UV-dependent nucleolar repositioning of RNAP1 and rDNA observed during repair. In the second part of this work, we studied the molecular function of the XAB2 protein during NER repair and we demonstrated its involvement in the TCR process. In addition, we also shown the presence of XAB2 in a pre-mRNA splicing complex. Finally, we described the impact of XAB2 on RNAP2 mobility during the first steps of TCR repair, thus suggesting a role of XAB2 in the lesion recognition process

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Mollet, Christophe. "Utilisation du gene rpob pour la phylogenie et l'identification des bacteries". Aix-Marseille 2, 1997. http://www.theses.fr/1997AIX20666.

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Bligny, Muriel. "Caractérisation d'une ARN polymérase d'origine nuléaire (NEP) dans les plastes d'épinard". Université Joseph Fourier (Grenoble), 1999. http://www.theses.fr/1999GRE10055.

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Abstract (sommario):

Nous avons aborde la caracterisation du systeme transcriptionnel plastidial nep grace a une approche in vitro utilisant le promoteur de l'operon plastidial rrn, pc, et des extraits plastidiaux contenant la nep. Dans un premier temps, nous avons verifie que le promoteur pc, utilise dans les chloroplastes d'epinard, est un promoteur nep. Nous avons ensuite separe et caracterise trois activites transcriptionnelles a partir d'extraits chloroplastiques d'epinard partiellement purifies, et en grande partie grace a la mise au point d'un systeme de transcription in vitro. La premiere correspond a la pep. La seconde, appelee nep-2, reconnait le promoteur pc in vitro et la troisieme, ou nep-1, pourrait etre une arnp de 110 kda de type phagique codee par un gene rpot. En ce qui concerne la nep-2, nous avons observe qu'elle n'est pas inhibee par la tagetitoxine tandis qu'elle l'est partiellement par la rifampicine a une concentration elevee d'une part, et d'autre part, qu'elle semble reconnaitre le promoteur t7. Nous en avons deduit que la nep-2 est probablement une arnp de type phagique. Le fait que la nep-1 pourrait elle aussi etre une arnp de type phagique resulte des observations suivantes : elle est reconnue par un anticorps dirige contre une proteine deduite d'un gene rpot, son poids moleculaire apparent est de 110-120 kda et le test alpa montre qu'elle a les proprietes d'une arnp. Ainsi, non pas une, mais deux arnps de type phagique pourraient partager la transcription du genome plastidial avec la pep ! enfin, nous avons demontre que cdf2 est un facteur d'initiation de la transcription conferant a la nep-2 la capacite de reconnaitre specifiquement le promoteur pc.

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Bretting, Wiebke. "Study of RPC32α, subunit of the RNA polymerase III, in a tumor model". Thesis, Bordeaux, 2017. http://www.theses.fr/2017BORD0822/document.

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Abstract (sommario):

Les ARN polymérases sont des acteurs indispensables de la transcription. Chez les eucaryotes il existe trois ARN polymérases (I, II et III). La ARN polymérase III (Pol III) possède 17 sous-unités, dont une qui existe sous deux formes: RPC32α et RPC32β. Seulement une des deux formes peut être intégrée dans la Pol III, créant ainsi deux polymérases différentes Pol IIIα et Pol IIIβ. Alors que RPC32β est présent dans les cellules somatiques, RPC32α est exprimé surtout dans des cellules souches et des cellules tumorales. Aujourd’hui rien n’est connu sur leurs rôles respectifs. Le cancer du sein est un problème majeur de santé publique car c’est le cancer féminin le plus fréquent. Plusieurs types de cancer du sein sont identifiés selon la présence ou absence de certains récepteurs hormonaux. Des cancers qui testent négative pour le récepteur d’oestrogène et de progestérone et qui ne surexpriment pas le récepteur pour les facteurs de croissance épidermiques humains 2 (HER2) sont appelés triple-négative. Ils ont un pronostique peu favorable, due à l’agressivité de ce type de cancer et un manque de thérapie cibles. Pour étudier le rôle de RPC32α il fallait identifier un model tumorale. En collaboration avec Jean-Paul Feugeas (INSERM UMR 1098) une étude transcriptomique a été fait sur 2627 échantillons cliniques de tissus de sein. L’étude montre que RPC32α est surexprimé dans les cancers triple-négative, alors que son homologue RPC32β est surexprimé dans les tissues normaux. Une analyse sur six lignées de cancer du sein et une ligné non-tumorale ont pu confirmer les résultats de l’analyse transcriptomique. Le modèle de cancer du sein a donc été validé. Une caractérisation des différentes lignées de cancer du sein a démontré que d’autres sousunités de la Pol III n’étaient pas surexprimées dans les cancers triple-négative. La surexpression de RPC32α n’était donc pas une conséquence d’une hyperactivité de la Pol III. Une analyse des transcrits synthétisé par la Pol III a montré que en générale les transcrits de la Pol III étaient plus fortement exprimé dans les cancers triple-négative que dans d’autres cancers. Afin d’étudier l’implication de RPC32α dans les phénomènes de tumorisation, plusieurs lignées cellulaires dépourvues de RPC32alpha ont été créé utilisant la technique CRISPRCAS9. L’absence de RPC32α n’a pas induit une augmentation de transcription ni de l’ARN de 4 RPC32α, ni de celle de RPC32β. Il n’existe donc pas de boucle de rétroaction pour RPC32α et les deux homologues ne sont pas co-régulés. Plusieurs, mais pas tous les transcrits synthétisé par la Pol III ont une expression fortement baissé dans les lignées mutants. Le fait que pas tous les transcrits ne soit affectés par la perte de RPC32α, indique qu’il existe une spécificité de transcription pour Pol IIIα et Pol IIIβ. Les cellules des linges mutants ne présentaient pas de phénotype différent des cellules mères et la croissance était la même dans toutes les lignées. Par contre les tests de croissance en agar-mou ont révélé que les lignées mutants formaient 85% de moins de colonies, indiquant que RPC32α est nécessaire pour la croissance tumorigénique in vitro. Pour tester l’effet de la perte de RPC32α sur la croissance tumorigénique in vivo, des cellules mutants et des cellules mères ont été injecté dans des souris. Les souris greffées avec des cellules mutantes montrent un départ de tumorisation retardé. Au bout de six semaines elles avaient de tumeurs deux fois plus petit que les souris avec des cellules mères. Après ablation de la tumeur primaire, les souris ont été surveillées pour l’apparition de métastases. Quatre semaines plus tard les souris greffées avec des cellules mutantes avaient 100 fois moins de métastases que les souris contrôles. Ces résultats montrent que RPC32α est nécessaire pour la tumorisation in vitro et in vivo. La protéine semble surtout jouer un rôle dans la formation des métastases, qui sont un des problèmes majeurs dans le traitement des cancers
The RNA polymerases are key players of transcription. Eukaryotes have three RNA polymerases (I, II and III). The RNA polymerase III (Pol III) has 17 subunits, one of which exists in two alternative forms: RPC32α and RPC32β. Only one of the two forms can be integrated into the enzymes, thus generating either Pol IIIα or Pol IIIβ. While RPC32β is found in all somatic cells, RPC32α is expressed in stem cells and tumor cells. To date nothing is known of their respective roles. Breast cancer is one of the major public health problems, as it is the most common cancer in women. Several types of breast cancers are distinguished, according to the presence or absence of hormonal receptors. Cancers that test negative for estrogen receptors, progesterone receptors and that do not overexpress the human epidermal growth factor receptor 2, are called triple-negative breast cancers. They tend to have a poor prognosis, due to the aggressive nature of the cancer and the lack of targeted therapies. To study the role of RPC32α, a tumor model needed to be identified. In collaboration with Jean-Paul Feugeas (INSERM UMR 1098) a transcriptomic study was performed on 2627 clinical breast tissue samples. The study showed that RPC32α was overexpressed in triplenegative breast cancer, whereas RPC32β was overexpressed in normal tissue. A study on six breast cancer cell lines and one non-tumorigenic line confirmed the results of the transcriptomic study. The breast cancer model was thus validated. A characterization of different breast cancer cell lines showed that other Pol III subunits were not overexpressed in triple-negative breast cancer. The overexpression of RPC32α was therefore not a mere consequence of a Pol III hyperactivity. An analysis of the transcripts synthesized by Pol III showed that overall the Pol III transcript levels were elevated in triplenegative breast cancer compared to other breast cancer subtypes. In order to study the role of RPC32α in tumorigenesis, several RPC32α knock-out cell lines were created using CRISPR-Cas9. The loss of RPC32α did not induce an increase in transcription of the RNAs of RPC32α or RPC32β. This shows that no feed-back loop exists for RPC32α and that the two homologues are not co-regulated. Various Pol III transcripts showed decreased expression levels in the knock-out cell lines. Yet not all transcripts were reduced in the absence of RPC32α. This indicates that some sort of transcription specificity must exist for Pol IIIα and Pol IIIβ. The knock-out cell lines did not show any alterations in their phenotype or growth rates. However, in soft agar assays the knock-out cell lines produced 85% less colonies than the mother cell line. This proves that RPC32α is necessary for tumorigenic growth in vitro. To find out if RPC32α was also necessary for tumorigenic growth in vivo, knock-out and wild type cells were injected into mice. The mice grafted with knock-out cells showed a slowed onset of tumor growth. After six weeks, the mice injected with knock-out cells had tumors half the size of the mice injected with wild type cells. The primary tumor was ablated and mice were tracked for metastasis. Four weeks later, mice injected with RPC32α knock-out cells had 100 times less metastasis than the control group. These results show that RPC32α is necessary for tumorigenic growth in vitro and in vivo. The protein seems also to be implicated in the formation of metastasis, which are one of the greatest problems in cancer treatment today

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Arnaud-Barbe, Nadège. "Définition d'un système d'expression et de purification d'ARN polymérases recombinantes du bactériophage T7 : étude de la transcription de matrices ADN et ARN par ces polymérases". Lyon 1, 1998. http://www.theses.fr/1998LYO1T071.

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CHYPRE, CAMILLE. "Poly (adp-ribose) polymerase cytoplasmique associee a des particules ribonucleo-proteiques libres contenant des arn messagers reprimes". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1989. http://www.theses.fr/1989STR13081.

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Abstract (sommario):

La presence d'une activite enzymatique polyadp-ribose polymerase, associee a des particules ribonucleoproteiques libres contenant des arn messagers reprimes a ete mise en evidence. Cette forme enzymatique a ete ensuite purifiee a homogeneite et caracterisee

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Bednarska, Aleksandra. "Artificial systems for in vitro gene expression". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015SACLN016/document.

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Abstract (sommario):

L’ARN polymérase dépendante d’ADN (RNAP) est une enzyme responsable de la polymérisation de ribonucleotides dans une séquence d'ARN complémentaire de l'ADN de matrice. La famille de RNAP a plusieurs membres, comme de protéines sous-unité unique (par exemple du bactériophage T7) ou multiple sous-unité (bactériennes et eucaryotes). Transcription de l'ARN - un événement crucial dans l'expression des gènes - varie en fonction de l'origine de RNAP. Bien que le processus de transcription est relativement bien caractérisée, de nombreux éléments restent mal compris, surtout par rapport à la dynamique de la reconnaissance de promoteur, d'évasion et de l'allongement dans une contexte de cellule où la densité moléculaire, les concentrations et les effets plus proches environs sont importants. L'objectif de cette thèse était la développement d’une méthode qui permettrait suivre la réaction RNAP in vitro en temps réel dans des conditions très contrôlées. Un axe majeur a été mis pour développer un biocapteur basé surface qui permettrait à la caractérisation des principales étapes de la réaction de transcription. Par conséquent, les interactions entre des molécules d'ADN immobilisés sur une surface du capteur et RNAP libre délivré par un système microfluidique de la surface ont été examinées. Changements de l'indice de réfraction, corrélés avec les changements de masse sur la surface ont été suivis en utilisant l'imagerie par résonance de plasmon de surface (SPRi). SPRi est une technique sensible dédiée à l'analyse des interactions entre deux ligands en temps réel. Les bases du mécanisme sont la détection de légères différences dans la réflexion de la lumière polarisée à un angle fixe qui est associé avec une variation de masse à l'interface. Les données obtenues à partir SPRi sont utilisées pour déterminer la cinétique des interactions. Géométrie d’ADN puces permet de suivre plusieurs échantillons simultanément, qui raccourcit considérablement le temps que de manipulation et améliore la qualité et la reproductibilité des résultats obtenus. Autres biocapteurs optofluidique: résonateur de microring et microscopie de fluorescence par réflexion totale interne (TIRF) ont été développés en parallèle. Nous avons biofunctionalisé et caractérisé des surfaces de capteur (de verre couvert de polymère pour un résonateur de microring et la microscopie TIRF et 50 nm couche mince d’or sur des prismes de SPRi) afin d'immobiliser ADN d'une manière contrôlée, par création d’une monocouche auto-assemblée (SAM). Fonctionnalisation de polymères SU-8 concernées deux méthodes: covalent immobilisation de (bio) molécules et la conjugaison non covalente sur la base de couplage hydrophobe. Pour la fonctionnalisation de surface d’or, quatre stratégies différentes d'immobilisation des molécules ont été comparés: formation de la liaison de thiol - or, la formation des liaisons amide, interactions extrAvidin - biotine et le couplage hydrophobe. Les études de la conjugaison de l'ADN à la surface d'or fonctionnalisé ont été effectuées en ce qui concerne la spécificité et la densité d'ADN immobilisées de longueurs différentes: 50, 500 et 1000 pb. Enfin, les surfaces biofunctionalized ont été utilisées pour suivre en temps réel des réactions de transcription de deux RNAP: bactériophage T7 RNAP monomère et l'holoenzyme d'Escherichia coli RNAP. Les analyses cinétiques de la formation d’un complexe nucléoprotéine et la transcription d'ARN ont été fait par report de la densité et la longueur de l'ADN immobilisé, la position de la séquence du promoteur spécifique. Transcription de l'ARN dans l'appareil SPRi a été confirmée par la collection, la détection et l'analyse des produits ARN.L'objectif final comprends une synthèse de l'ARN contrôlée qui serait une étape intermédiaire d'enquêter en temps réel la production de protéines in vitro
DNA-dependent RNA polymerase (RNAP) is an enzyme responsible for the polymerization of ribonucleotides into an RNA sequence complementary to the template DNA. RNAP family has several members being single subunit (e.g. T7 bacteriophage) or multi subunit (bacterial and eukaryote) proteins. RNA transcription – a crucial event in gene expression – differs depending on the RNAP origin. Although the transcription process is relatively well characterized, many elements remain poorly understood, especially with respect to the dynamics of promoter recognition, escape and elongation in a cell like context where molecular density, concentrations and nearest neighbour effects are prevalent.The goal of this thesis was to develop a robust method that would allow real time monitoring of RNAP reaction in vitro in thoroughly controlled conditions. A major axis was to develop a surface-based biosensor that would allow the characterization of the main steps of the transcription reaction. Consequently, interactions between DNA molecules immobilized on a sensor surface and free RNAP delivered through a microfluidic flow system to the surface were examined. Changes in refractive index, correlated with changes in mass at a surface were followed using surface plasmon resonance imaging (SPRi). SPRi is a sensitive technique dedicated to analysis of interactions between two ligands in real time. The mechanism bases on the detection of slight differences in the reflectivity of polarized light at a fixed angle that are associated with a mass variation at the interface. Data obtained from SPRi are used to determine the kinetics of the interactions. Microarray geometry of SPRi allows monitoring several samples simultaneously that significantly shortens manipulation time and improves a quality and reproducibility of obtained results. Other label-free optofluidic biosensors: microring resonator and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy were developed in parallel.We firstly biofunctionalized and characterized sensor surfaces (polymer coated glass for microring resonator and TIRF microscopy and 50-nm thin layer gold coatings on glass prisms for SPRi) in order to immobilize DNA strands in a controlled manner, using a self-assembled monolayer (SAM). Functionalization of photoresist polymer SU-8 concerned two methods: covalent (bio)molecule grafting and non-covalent conjugation based on hydrophobic coupling. Regarding gold surface functionalization, four different strategies of antifouling (bio)molecule immobilization were compared: thiol – gold bond formation, amide bond formation, extrAvidin – biotin interactions and hydrophobic coupling. Studies of DNA conjugation to the functionalized gold surface were performed with respect to specificity and density of immobilized DNA molecules of different lengths: 50, 500 and 1000 bp.Finally, biofunctionalized surfaces were used for real time monitoring of transcription reactions using two RNAPs: monomeric bacteriophage T7 RNAP and the holoenzyme of Escherichia coli RNAP. Kinetic analyses of nucleoprotein complex formation and RNA transcription were performed as a function of immobilized DNA density, the length of the immobilized DNA, the position of the specific promoter sequence with respect to the point of immobilization and the direction of subsequent transcription. RNA transcription in the SPRi apparatus was confirmed by collection, detection and analysis of relevant products.The future development of biosensors dedicated to in vitro gene expression will include the adaptation of the methods presented above to other optofluidic systems and further development of the technique. The final goal comprises a controlled RNA synthesis that would be an intermediate step to investigate real time in vitro protein production

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Nowacki, Mariusz. "Developmental genome rearrangements in Paramecium tetraurelia : novel proteins and short RNAs involved in trans-nuclear, homology-dependent crosstalk". Paris 6, 2005. http://www.theses.fr/2005PA066233.

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Sun, Zhong-Ping. "Etude d'un modèle d'expression des lipoxygénases de lignées cellulaires utilisées pour la détection des virus". Limoges, 1994. http://www.theses.fr/1994LIMO304D.

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Fidalgo, Baptista Tiago. "Functional study of the coactivator SAGA : role in RNA Polymerase II transcription". Thesis, Strasbourg, 2017. http://www.theses.fr/2017STRAJ067/document.

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Abstract (sommario):

Des études antérieures suggèrent que les complexes SAGA et TFIID sont des facteurs jouant un rôle complémentaire dans la transcription par l’ARN polymérase II. Chez S. cerevisiae, environ 10% des gènes semblent dépendants de SAGA alors que TFIID aurait un rôle dominant sur 90% du génome. De nouvelles approches m’ont permis de montrer que SAGA est recruté sur les régions régulatrices d’une majorité de gènes, indépendamment de leur classification. Des analyses d’ARN nouvellement-synthétisés ont également démontré que l’inactivation des complexes SAGA ou TFIID, par mutation ou déplétion inductible de leurs sous-unités, altèrent la transcription de pratiquement tous les gènes par l’ARN polymérase II. L’acétyltransférase Gcn5 et la sous-unité Spt3 agissent de façon synergique au sein du complexe SAGA pour stimuler le recrutement de TBP et la transcription par l’ARN polymérase II. Ces données indiquent que les complexes SAGA et TFIID agissent comme des cofacteurs généraux, étant nécessaires pour la synthèse de quasiment tous les ARNm et ayant des effets équivalents sur les gènes précédemment décrits comme dominés par SAGA ou par TFIID
Prior studies suggested that SAGA and TFIID are alternative factors that promote RNA polymerase II (RNA Pol II) transcription with about 10% of genes in S. cerevisiae dependent on SAGA. The remainder 90% of the genome would be regulated by TFIID. We reassessed the role of SAGA by mapping its genome-wide location and role in global transcription in budding yeast. We observed that SAGA maps to regulatory elements of most genes, irrespective of previous designations of SAGA- or TFIID-dominated genes. Additionally, disruption of either SAGA or TFIID through mutation or rapid subunit depletion reduces transcription from nearly all genes, measured by newly-synthesized RNA or RNA Pol II chromatin immunoprecipitation. We also found that the acetyltransferase Gcn5 synergizes with Spt3 to promote global transcription and that Spt3 functions to stimulate TBP recruitment at all tested genes. Our data demonstrate that both SAGA and TFIID act as general cofactors required for essentially all RNA Pol II transcription and is not consistent with the previous classification of SAGA- and TFIID-dominated genes

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Harismendy, Olivier. "Etude de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae : approches par puces à ADN". Paris 7, 2004. http://www.theses.fr/2004PA077094.

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Kandan-Kulangara, Febitha. "Poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) and RNA interference (RNAI) during cell death". Doctoral thesis, Université Laval, 2013. http://hdl.handle.net/20.500.11794/25972.

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Abstract (sommario):

L’activation de la poly(ADP-ribose) polymérase-1 (PARP-1) en réponse aux dommages à l’ADN est impliquée dans diverses réponses cellulaires, de la réparation de l’ADN à la mort cellulaire. Dans l'annexe I, nous avons décrit différentes techniques indispensables pour détecter le métabolisme de PARP-1 en réponse aux dommages à l’ADN in vitro et in vivo. Les travaux de cette thèse se concentrent sur le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire. PARP-1 est clivée et inactivée par des caspases pendant l’apoptose ; j’ai donc utilisé une PARP-1 non-clivable pour étudier le rôle de l’activation et de la fragmentation de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB. Nous avons observé que, contrairement aux fibroblastes de peau humaine exprimant la PARP-1, les fibroblastes avec un "knockdown" de PARP-1 sont résistants à l’apoptose induite par les UVB, phénotype pouvant être totalement inversé par ré-expression de PARP-1 sauvage mais pas de PARP-1 non-clivable par les caspases, suggérant un rôle significatif du clivage de PARP-1 en réponse à la mort cellulaire induite par les UVB (chapitre 2). Dans ce contexte, nous avons récemment passé en revue comment les substrats non clivables par des caspases peuvent être utilisés comme outil important pour démystifier le rôle de ce clivage pour la mort comme pour la vie, avec l’exemple spécifique de PARP-1 non-clivable par les caspases (chapitre 3). Curieusement, en utilisant l’ARNi comme outil d’étude du rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire, nous avons observé que l’ARNi stable (shRNA) de nombreux gènes, incluant PARP-1, échoue lors de l’apoptose, en raison de l’inactivation catalytique par clivage par une caspase de l’endoribonucléase Dicer-1, indispensable pour la régulation de l’ARNi et des miARN (chapitre 4). Cependant, nous avons découvert que l’ARNi transitoire persiste plusieurs jours même après induction de l’apoptose, soulignant des différences entre les ARNi stable et transitoire dans la dynamique de "knockdown" génétique et dans la dépendance de la fonction de Dicer-1 (chapitre 5). En résumé, mon travail a permis la découverte des avantages et des limites de l’ARNi durant l’apoptose et le rôle de PARP-1 dans la mort cellulaire induite par les UVB.

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Quintin, Justine. "Organisation de la chromatine et signalisation par les oestrogènes". Thesis, Rennes 1, 2013. http://www.theses.fr/2013REN1S074/document.

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Abstract (sommario):

En réponse à son environnement composé de signaux endogènes et exogènes, une cellule doit pouvoir adapter son transcriptome, et cela à travers une modulation fine de l'expression de ses gènes. Les mécanismes permettant une telle adaptation reposent sur de multiples paramètres, entre autre l'organisation du génome, que ce soit au niveau de sa séquence primaire ou de son organisation au sein de la chromatine qui est un support pour l'intégration de nombreuses informations (structurelles et épigénétiques). De plus, l'organisation tridimensionnelle du noyau cellulaire apporte des contraintes physiques et fonctionnelles qui contribuent également à ces régulations. Afin de comprendre comment toutes ces informations peuvent être intégrées lorsqu'un signal régule la transcription d'un ensemble de gènes colinéaires («cluster» de gènes), nos études se sont focalisées sur la description et dissection des mécanismes impliqués dans la régulation coordonnées de gènes œstrogéno-dépendant par le récepteur aux œstrogènes (ER) et ses facteurs pionniers (FOXA1, FOXA2 et GATAs) dans des cellules cancéreuses d'origine mammaire. Dans ce cadre, nous nous sommes plus particulièrement intéressés au cluster TFF, situé sur le bras long du chromosome 21, incluant le gène modèle TFF1, en utilisant des techniques d'analyse à grande échelle (ChIP-chip, ChIP-seq, 4C et analyses transcriptomiques)
A given cell has to be able to adapt its fate and homeostasis in response to endogenous and exogenous signals. This adaptation occurs through finely tuned regulations of genes' expressions leading to the variation of their transcriptomes. Multiple parameters have to be integrated in order to provide such mechanisms of regulation. First, the primary sequence of the genome and its organization into chromatin are major regulatory components that harbor genetic, structural and epigenetic information. Second, the three-dimensional organization of the genome into the nucleus brings both physical and functional constraints that also contribute towards these regulatory processes. Here, we engaged a work aiming to understand and dissect how these several levels of information are integrated during the transcriptional regulation of colinear genes (cluster of genes) by the same signal. We took as a model the coordinated regulation of the estrogen-sensitive TFF cluster driven by the estrogen receptor (ER) and its pioneering factors (FOXA1, FOXA2 and GATAs) in mammary cancer cells. This cluster is located within the long arm of the chromosome 21, and contains the gene model termed TFF1. We used large-scale methods (ChIP-chip, ChIP-seq, 4C and microarray transcriptomic analyses) to decipher these dynamic mechanisms

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Tavenet, Arounie. "Caractérisation de la régulation de la transcription par l'ARN polymérase III chez Saccharomyces cerevisiae". Thesis, Paris 11, 2011. http://www.theses.fr/2011PA112227/document.

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Abstract (sommario):

L’ARN polymérase III synthétise de nombreux petits ARN non traduits, dont les ARNt et l’ARNr 5S, essentiels à la croissance de toute cellule. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la régulation de la transcription par l’ARN polymérase III chez la levure Saccharomyces cerevisiae. Nous avons détecté Sub1 sur les gènes de classe III in vivo. Nous avons également observé que Sub1 est capable de stimuler la transcription par l’ARN III reconstituée in vitro avec les facteurs TFIIIB et TFIIIC recombinants et avec l’ARN Pol III purifiée. Sub1 stimule deux étapes de la transcription : l’initiation et la réinitiation facilitée. Des expériences supplémentaires nous montrent que la protéine interagit directement avec TFIIIB et TFIIIC. Enfin, nous avons pu constater que la délétion de Sub1 dans la levure conduit à une diminution de la transcription par l’ARN Pol III en phase exponentielle de croissance. Par la suite, nous avons cherché à déterminer quel lien pouvait exister entre l’activateur Sub1 et le répresseur Maf1 de la transcription par l’ARN Pol III. Enfin, nous avons également souhaité identifier d’autres éléments pouvant interagir avec la protéine Sub1 au cours de sa fonction de régulateur
RNA polymerase III synthetizes many small untranslated RNA, including tRNA and 5S rRNA which are essential to cell growth. In this work, we took an interest in RNA polymerase III transcription regulation in the baker’s yeast, Saccharomyces cerevisiae. We have detected Sub1 on all class III genes in vivo. We also observed that Sub1 is able to stimulate RNA polymerase III transcription which has been reconstituted in vitro with TFIIIB et TFIIIC recombinants factors and purified RNA polymerase III. Sub1 stimulates two steps of RNA polymerase III transcription : initiation and facilitated reinitiation. Supplementary experiments established that Sub1 directly interacts with TFIIIB and TFIIIC transcription factors. Finally, we showed that Sub1 deletion in yeast leads to a decrease in RNA polymerase III transcription during exponential phase. Then, we tried to determine which link could exist between Sub1, the activator, and Maf1, the repressor of RNA polymerase III transcription. Furthermore, we attempted to identify other elements which could interact with Sub1 during transcription regulation

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Richard, Patricia. "Dynamique intranucléaire et biogenèse des ARNs H/ACA". Toulouse 3, 2006. http://www.theses.fr/2006TOU30081.

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Abstract (sommario):

Les ARNs H/ACA sont de petits ARNs nucléaires qui remplissent des fonctions variées dans la cellule. Ils servent d'ARNs guides pour les conversions d'uridines en pseudouridines des ARNs ribosomiques et des snARNs du spliceosome. Nous avons mis en évidence la présence d'un signal particulier au niveau des ARNs H/ACA guidant les modifications des snARNs et permettant leur accumulation dans les Cajal bodies. Ce signal est également présent au niveau de l'ARN de la télomérase qui s'accumule également dans les Cajal bodies. Grâce à des expériences de microscopie à fluorescence, nous avons apporté des éléments importants permettant d'émettre l'hypothèse que l'ARN de la télomérase est délivré au niveau d'une sous-population de télomères en phase S du cycle cellulaire. Finalement, nos travaux sur l'expression et la maturation des ARNs H/ACA introniques montrent que l'épissage et l'assemblage de la particule H/ACA chez l'Homme sont deux évènements indépendants
H/ACA RNAs are small nuclear RNAs that have many different functions in the cell. They are guide RNAs for the conversion of the uridine into pseudouridine of ribosomal RNAs and spliceosomal snRNAs. We showed that box H/ACA RNAs directing modifications of spliceosomal snRNAs carry a special signal that direct these box H/ACA RNAs into Cajal bodies. This signal is also present in the telomerase RNA that accumulates in Cajal bodies. With fluorescent microscopy, we were able to propose that Cajal bodies may deliver telomerase RNA at a subset of telomeres in S phase cells. Finally, our work on the expression and processing of box H/ACA RNAs revealed that splicing and assembly of box H/ACA RNP particles are two independent molecular events in human cells

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Marques, Candeias Marco. "RNA-Dependent regulation of p53". Paris 7, 2007. http://www.theses.fr/2007PA077077.

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Abstract (sommario):

La protéine suppresseur de tumeur p53 est impliquée dans la régulation de la croissance et de la survie des cellules en réponse à une multitude de facteurs de stress cellulaires. Son activation a pour conséquence des modifications de l'expression d'un grand nombre de gènes. Son régulateur principal est la protéine Mdm2, une E3 ubiquitine-ligase qui lie p53 et conduit à sa dégradation par la voie protéasomale. Cependant, la façon dont p53 peut reconnaître spécifiquement différents stimuli de stress et y répondre en induisant des voies alternatives de régulation menant soit à un arrêt du cycle cellulaire, soit à l'apoptose ou encore au vieillissement prématuré, n'est pas encore clairement établi. Le groupe de Fahraeus a décrit l'existence d'une protéine p53 tronquée de la partie N-terminale (p53/47) et issue d'une traduction alternative au niveau d'un second site d'initiation de la traduction dans TARN messager (ARNm) de p53. Cette protéine n'interagit pas directement avec Mdm2 et induit des changements de stabilité et de trans-activation des formes tétramèriques de p53. Les résultats présentés dans cette thèse montrent que l'ARNm de p53 participe à la régulation de l'activité de p53 par le biais de trois mécanismes différents de contrôle de l'expression de p53 (FLp53), de p53/47 et de Mdm2. Des modifications de la synthèse de FLp53 ou de p53/47 sont induites par différents facteurs de stress cellulaires agissant sur des régions distinctes de l'ARNm de p53, ainsi que par des mécanismes de traduction coiffe-dépendants et -indépendants. En outre, la région de l'ARNm de p53 codant pour le domaine de liaison avec Mdm2 interagit directement avec le domaine RING de Mdm2, ce qui conduit à la diminution de l'activité ubiquitine-ligase de Mdm2, à l'augmentation de la traduction de p53 et à son activation, le tout ayant pour conséquence une augmentation des niveaux protéiques de p53 et de Mdm2. Des ARNm de p53 comportant des mutations silencieuses localisées dans cette région ont été identifié. Il est démontré également que l'expression de p53/47 diversifie l'activité de p53 d'une façon stress-dépendante. L'ensemble des résultats présentés indique que, par la régulation des mécanismes alternatifs de la traduction et par sa liaison à Mdm2, l'ARNm de p53 induit différents niveaux d'expression et d'activité des isoformes de p53, ce qui aide à déterminer le devenir biologique des cellules en réponse à différents types de stress cellulaires
P53 controls the growth and survival of cells by acting in response to a multitude of cellular stresses. Activation of p53 results in changes in the expression of a large number of gene products. Its focal regulator is the E3 ubiquitin-ligase Mdm2, which binds and targets p53 for proteasomal degradation. However, it is not yet fully understood how p53 can distinguish the different stress stimuli and induce alternative pathways leading to either cell-cycle arrest, apoptosis or premature ageing. Fahraeus' group and others have described an N-terminally truncated p53 protein (p53/47) originating from a second translation initiation site in the p53 messenger RNA (mRNA) which does not directly interact with Mdm2 and imposes altered stability and transactivation properties to p53 tetramers. Results presented in this thesis show that the p53 mRNA helps in the regulation of the p53 activity by using three different mechanisms to control the expression of the full-length p53 protein (FLp53), p53/47 and Mdm2. Changes in synthesis of FLp53 or p53/47 are regulated by distinct cell stress-induced pathways acting through separate regions of the p53 mRNA and through both cap-dependent and -independent mechanisms. Furthermore, the p53 mRNA region coding for the Mdm2-binding domain interacts with the RING domain of Mdm2 and this results in the impairment of Mdm2's E3 ligase action and supports p53 mRNA translation and activation resulting in high levels of both p53 and Mdm2. P53 mRNAs with silent mutations in this region were found in cancers and are shown to have less aptitude to bind Mdm2 and express a smaller amount of active p53 protein. It is also reported that expression of p53/47 diversifies p53 activity in a stress-dependent fashion. Altogether, the presented data indicate that by regulating alternative mechanisms of translation and by binding to Mdm2, the p53 mRNA gives rise to different levels of the p53 isoforms which help to orchestrate the cell biological outcome of p53 activation in response to different types of cell stress

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Van, Den Beek Marius. "Piwi-dependent transcriptional silencing and Dicer-2-dependent post-transcriptional silencing limit transposon expression in adult heads of Drosophila Melanogaster". Thesis, Paris 6, 2015. http://www.theses.fr/2015PA066153/document.

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Abstract (sommario):

Les éléments transposables (ET) sont des constituants majeurs des génomes eucaryotes. Leur mobilisation joue un rôle important dans l'évolution et l'adaptation des organismes. Cependant, la transposition des ET peut conduire à des dommages irréversibles du génome et elle doit donc être étroitement contrôlé. Chez Drosophila melanogaster, la transposition des ET est contrôlée par les siRNA (small interfering RNAs) et les piRNA (Piwi-interacting RNAs) qui agissent en réprimant des cibles ARN de séquences complémentaires. Les siRNA et piRNA ont des modes distincts de biogenèse, de reconnaissance de cibles et d'activité repressive. Les piRNAs sont seulement présents en abondance dans les gonades, et transmis maternellement aux embryons. Par une approche de séquençage à haut débit, j'ai pu montrer que bien qu'ils induisent une répression transcriptionnelle des ET à ce stade du développement, ils sont pratiquement absents des têtes de drosophiles adultes. Cet état est cependant hérité et il est suffisant pour limiter l'expression des ET dans l'adulte, même en l'absence de siRNA. A l'inverse, si la répression transcriptionnelle précoce n'est pas établie, les siRNA agissent comme un système de sauvegarde en limitant l'expression des ET. En cas de perte conjointe des piRNA et siRNA, l'expression des ET augmente significativement et la durée de vie des mouches adultes se trouve réduite. Les analyses de sequences à grande échelle m'ont par ailleurs conduit à développer des outils logiciels intégrés dans Galaxy et à m'impliquer significativement dans la communauté qui développe ce système au niveau international
Transposable elements are major components of eukaryotic genomes and have been proposed as important drivers of gene network evolution, as they can move or “transpose” in their host genome, creating gene duplications, gene inactivations or altogether altering gene function. Nevertheless, uncontrolled high-rate transposition leads to DNA damage and genomic instabilities, and therefore needs to be kept at a low level. In the fruitfly Drosophila melanogaster, transposition is counteracted by multiple mechanisms, amongst which the generation of small interfering RNAs (siRNAs) and Piwi-interacting RNAs (piRNAs). siRNAs and piRNAs belong to the category of small RNAs, and these are involved in negative regulation of complementary target RNAs abundance, but siRNAs and piRNAs have distinct mechanisms of biogenesis, target recognition and mechanisms of target regulation. Notably, piRNAs are only abundant in gonads and are transmitted to the embryo. By sequencing small RNAs and normal transcripts in adult heads, I conclude that, while piRNAs are likely absent in adult heads, they induce a repressive state on TEs. If this repressive state is lost, the siRNA pathway can compensate and limit Transposable element levels. If siRNAs are lost, the repressive state induced by piRNAs suffices to limit Transposable element levels. If both piRNAs and siRNAs are lost, the expression level of Transposable elements increases, and flies have a shorter life span. The requirement to analyse large-scale sequencing data led to the development of multiple tools for the reproducible research platform Galaxy

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Daniel, Laurianne. "Human Ribosomal DNA and RNA Polymerase I Fate during UV-induced DNA Repair". Thesis, Lyon, 2017. http://www.theses.fr/2017LYSE1093/document.

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Abstract (sommario):

La réparation par excision de nucléotides (NER) garantit l'intégrité du génome lors de l'exposition aux rayons UV. Après irradiation aux UV, un des premiers problèmes rencontrés par la cellule est l'arrêt général de la transcription dû au blocage de l'ARN polymérase II (ARNP2) au niveau des lésions UV. Pour régler ce problème, le NER possède une voie de réparation spécifiquement couplée à la transcription (TCR). Les connaissances concernant le NER ont été obtenu via des études sur la transcription par l'ARNP2. Cependant, dans les cellules à fort métabolisme, plus de 60% de la transcription correspond à la transcription, dans le nucléole, de l'ADN ribosomique (ADNr) par l'ARN polymérase I (ARNP1). De nombreuses protéines sont absence du nucléole, c'est pourquoi certains processus nucléaires ne peuvent avoir lieu dans cette structure. Afin d ‘être répliqué et réparé, l'ADNr se déplace à la périphérie du nucléole. Malgré l'importance de la transcription par l'ARNP1, la réparation de l'ADNr a été peu étudiée chez l'homme. De plus, à notre connaissance, aucune étude ne s'est penchée sur le mécanisme moléculaire du déplacement de l'ADNr à la périphérie du nucléole. Notre étude démontre l'implication de la TCR dans la réparation de l'ADNr après lésions UV induites. De plus, nos recherches ont démontré que l'ARNP1 reste accrochée à l'ADNr et sont tous les deux délocalisés à la périphérie du nucléole après irradiation aux UV. Enfin, nous avons identifié l'actin et la moysine I nucléaires comme facteurs protéiques nécessaire à cette délocalisation
Nucleotide excision repair (NER) guarantees genome integrity and proper cellular functions against UV-induced DNA damage. After UV irradiation, one of the first burden cells have to cope with is a general transcriptional block caused by the stalling of RNA polymerase II (RNAP2) onto distorting UV lesions. To insure UV lesions repair specifically on transcribed genes, NER is coupled with transcription in an extremely organized pathway known as Transcription-Coupled Repair (TCR). Most of the knowledge about TCR has been gathered from RNAP2 transcription. However, in highly metabolic cells, more than 60% of total cellular transcription results from ribosomal DNA (rDNA) transcription, by the RNA polymerase I (RNAP1), which takes place in the nucleolus. Many nuclear proteins are excluded from the nucleolus and because of this some nucleolar processes cannot occur inside this structure. In order to be replicated and repaired rDNAs need to be displaced at the nucleolar periphery. Despite the importance of RNAP1 transcription, repair of the mammalian transcribed rDNA has been scarcely studied. Moreover, to the best of our knowledge no molecular mechanism has been proposed for rDNA displacement. Our study clearly demonstrated that the full TCR machinery is needed to repair UV-damaged rDNA and restart RNAP1 transcription. Our results show that UV lesions block RNAP1 transcription and that RNAP1 is firmly stalled onto rDNAs without being degraded. Our study also describes the displacement of the RNAP1/rDNA complex to the nucleolar periphery after UV irradiation and identifies both nuclear ß-actin and nuclear myosin I as factors required for this displacement

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Thomassin, Hélène. "Poly-adp-ribosylation cytoplasmique : etude dans les particules ribonucleoproteiques libres contenant des arn messagers reprimes". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1987. http://www.theses.fr/1987STR13022.

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Darrière, Tommy. "Etude de l'ARN polymérase I et du rôle de ses sous-unités spécifiques chez la levure Saccharomyces cerevisiae". Thesis, Toulouse 3, 2017. http://www.theses.fr/2017TOU30293/document.

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Abstract (sommario):

Dans les cellules eucaryotes, il existe 3 ARN Polymérases nucléaires (Pol I, II et III), chacune ayant une fonction de synthèse d'ARN qui lui est propre. L'ARN polymérase I (Pol I) est responsable de la synthèse du précurseur des grands ARN ribosomiques (ARNr), ce qui correspond à une activité de transcription massive dans la cellule. Des données structurales sur cette enzyme de 14 sous-unités sont disponibles. Ceci permet une meilleure compréhension de son mode de fonctionnement, et a confirmé que l'ARN Pol I possède 3 sous-unités spécifiques, aussi appelées "Built-in Transcription Factors", responsables d'activités régulatrices. Deux d'entres elles, Rpa49 / Rpa34, forment un hétérodimère structuralement proche des facteurs de transcription TFIIF et TFIIE de la Pol II, impliqués tant dans l'initiation que dans l'élongation de la transcription. La dernière, Rpa12, est connue pour avoir un rôle dans la stabilité de l'ARN Pol I et l'activité de clivage du transcrit de la polymérase en cours de pause (via son extrémité C-terminale), comme son homologue TFIIS, facteur de transcription de l'ARN Pol II. Nous avons effectué des études génétiques sur des mutants de l'ARN Pol I dépourvus de la sous-unité Rpa49 (rpa49Δ). Cette délétion est viable mais entraîne des problèmes d'initiation et élongation. Nous étudions dans ce travail le clonage et la caractérisation de "suppresseurs" extragéniques correspondant à des mutations ponctuelles de trois sous-unité de la Pol I qui rétablissent une synthèse d'ARNr en l'absence de la sous-unité Rpa49. Toutes ces mutations suppressives identifiées ont été localisées premièrement dans les deux grandes sous-unités Rpa190 et Rpa135, structuralement très proches de Rpa12, mais également au sein même de Rpa12, indiquant une possible interaction entre les sous-unités Rpa49 et Rpa12 ou la région autour. Notamment, un élément spécifique de l'ARN Pol I dans Rpa190, le "DNA Mimicking Loop", est structuralement très proche de la région où l'on trouve ces mutations suppresseur. Les caractérisations génétiques, structurales, mais aussi biochimiques et fonctionnelles de ces suppresseurs nous permettent de proposer des hypothèses sur les rôles de Rpa49 et de Rpa12, mais aussi de cette petite région de Rpa190, en l'initiation de la transcription, ce qui n'a jamais été mis en évidence auparavant
In eukaryotes cells, there are 3 nuclear RNA Polymerases (Pol I, II and III), each having a particular RNA synthesis function. The RNA Polymerase I (Pol I) produces a single transcript: the precursor of the large ribosomal RNA (rRNA), which correspond to a massive transcription activity in the cell. Structural data of this 14-subunits enzyme is now available. This allows a better understanding of its operating mode, and confirmed that the Pol I has 3 specific subunits, also called "Built-in transcription factors", capable of regulatory activities. Two of them, Rpa49/Rpa34, are forming a heterodimer structurally related to the Pol II transcription factors TFIIF and TFIIE, implicated in both initiation and elongation of the transcription. The last one, Rpa12, is known to have a role in Pol I stability and the cleavage activity of the paused Pol I (via its C-terminus part), like its homologous TFIIS in the Pol II. We performed extensive genetic studies of Pol I mutants lacking one of these subunits: Rpa49 (rpa49Δ). This depletion is viable, but results in initiation and elongation problems. Here, we report the cloning and characterization of extragenic suppressors mapping point mutations in three subunits of Pol I restoring efficient Pol I activities in absence of Rpa49. All suppressor mutations identified were structurally mapped firstly in the two largest subunits Rpa190 and Rpa135 very closed to Rpa12, and then in Rpa12 itself, indicating a possible interplay between the Rpa49 and Rpa12 subunits, and the area around. Notably, a RNA pol I specific element in Rpa190, called "DNA Mimicking Loop", is structurally very closed to the region in which we find all of our suppressor mutations. The genetic, structural but also biochemical and functional characterizations of these suppressors allow us to propose roles of these Rpa49 and Rpa12 subunits, but also of the small area of Rpa190, which has never been highlighted before

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Gilbert, Nathalie. "Etude tridimensionnelle en microscopie confocale des proteines agnors, de l'arn polymerase i, du ki67 et de l'adn durant l'interphase et la mitose de cellules cancereuses humaines". Reims, 1993. http://www.theses.fr/1993REIMM205.

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Bressanelli, Stéphane. "Etude structurale de la polymérase du virus de l'hépatite C : détermination par radiocristallographie de sa structure tridimensionnelle et identification de sites d'interactions catalytiques et régulateurs avec des nucléotides". Paris 11, 2002. http://www.theses.fr/2002PA112012.

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Abstract (sommario):

Le virus de l'hépatite C (VHC) constitue un problème majeur de santé publique. De fait, plus de 170 millions de personnes dans le monde sont chroniquement infectées par ce virus enveloppé à ARN positif classé dans la famille des Flaviviridae. Il résulte de la capacité du VHC à persister dans l'organisme, principalement dans le foie, le développement à long terme de maladies hépatiques graves. Par conséquent, l'ampleur de la prévalence du VHC va conduire dans les années qui viennent à une mortalité et une morbidité considérables. Des médicaments véritablement efficaces contre l'infection par le VHC restent à développer et c'est vers ce but que tendent l'ensemble des études sur ce virus, sur lequel beaucoup reste à découvrir. La présente thèse s'inscrit dans ce cadre : elle concerne l'étude structurale d'une enzyme codée par le virus et indispensable à la réplication de son génome, la polymérase du VHC. .
Hepatitis C virus (HCV) is major public health problem. More than 170 million people worldwide are chronically infected by this enveloped RNA virus classified as a separate genus in the Flaviviridae family. Continued replication of HCV after first infection is the rule and leads to grave liver disease over time. Thus, given the prevalence of HCV today, we can expect considerable HCV-related mortality and morbidity in the years to come. There are no effective drugs against HCV available today and the development of such drugs is ultimate goal of all studies on this as yet poorly understood virus. The present work focuses on a key enzyme in HCV replication : The virally-encoded polymerase. The structural results obtained may be seen as the first steps in the rational design of specific anti-HCV compounds that may exhibit both efficient inhibition of HCV genome replication and low toxicity to the patient. The main results of this work are the determination of crystal structure of the HCV polymerase. .

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Reguillon, Isabelle. "Les mécanismes de la transcription chez les eucaryotes". Bordeaux 2, 1994. http://www.theses.fr/1994BOR2P049.

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Pham, Van Hau. "Novel inhibitors of the tRNA-dependent amidotransferase of "Helicobacter pylori" : Peptides generated by phage display and dipeptide-like compounds". Doctoral thesis, Université Laval, 2016. http://hdl.handle.net/20.500.11794/27079.

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Abstract (sommario):

Cette thèse présente la découverte de nouveaux inhibiteurs de l’amidotranférase ARNt-dépendante (AdT), et résume les connaissances récentes sur la biosynthèse du Gln-ARNtGln et de l’Asn-ARNtAsn par la voie indirecte chez la bactérie Helicobacter pylori. Dans le cytoplasme des eucaryotes, vingt acides aminés sont liés à leur ARNt correspondant par vingt aminoacyl-ARNt synthétases (aaRSs). Ces enzymes sont très spécifiques, et leur fonction est importante pour le décodage correct du code génétique. Cependant, la plupart des bactéries, dont H. pylori, sont dépourvues d’asparaginyl-ARNt synthétase et/ou de glutaminyl-ARNt synthétase. Pour former le Gln-ARNtGln, H. pylori utilise une GluRS noncanonique nommée GluRS2 qui glutamyle spécifiquement l’ARNtGln ; ensuite, une AdT trimérique, la GatCAB corrige le Glu-ARNtGln mésapparié en le transamidant pour former le Gln-ARNtGln, qui lira correctement les codons glutamine pendant la biosynthèse des protéines sur les ribosomes. La formation de l’Asn-ARNtAsn est similaire à celle du Gln-ARNtGln, et utilise la même GatCAB et une AspRS non-discriminatrice. Depuis des années 2000, la GatCAB est considérée comme une cible prometteuse pour le développement de nouveaux antibiotiques, puisqu’elle est absente du cytoplasme de l’être humain, et qu’elle est encodée dans le génome de plusieurs bactéries pathogènes. Dans le chapitre 3, nous présentons la découverte par la technique du « phage display » de peptides cycliques riches en tryptophane et en proline, et qui inhibent l’activité de la GatCAB de H. pylori. Les peptides P10 (CMPVWKPDC) et P9 (CSAHNWPNC) inhibent cette enzyme de façon compétitive par rapport au substrat Glu-ARNtGln. Leur constante d’inhibition (Ki) est 126 μM pour P10, et 392 μM pour P9. Des modèles moléculaires ont montré qu’ils lient le site actif de la réaction de transmidation catalysée par la GatCAB, grâce à la formation d’une interaction π-π entre le résidu Trp de ces peptides et le résidu Tyr81 de la sous-unité GatB, comme fait le A76 3’-terminal de l’ARNt. Dans une autre étude concernant des petits composés contenant un groupe sulfone, et qui mimiquent l’intermédiaire de la réaction de transamidation, nous avons identifié des composés qui inhibent la GatCAB de H. pylori de façon compétitive par rapport au substrat Glu-ARNtGln. Cinq fois plus petits que les peptides cycliques mentionnés plus haut, ces composés inhibent l’activité de la GatCAB avec des Ki de 139 μM pour le composé 7, et de 214 μM pour le composé 4. Ces inhibiteurs de GatCAB pourraient être utiles pour des études mécanistiques, et pourraient être des molécules de base pour le développement de nouvelles classes d’antibiotiques contre des infections causées par H. pylori.
This thesis describes the discovery of inhibitors of a tRNA-dependent amidotransferase (AdT) and summarizes the present state of our knowledge about the two-step biosynthesis of Gln-tRNAGln and Asn-tRNAAsn in Helicobacter pylori. In eukaryotic cytoplasm, twenty amino acids (aa) are generally attached to their cognate tRNAs by twenty corresponding aminoacyl-tRNA synthetases (aaRSs). These enzymes have a high specificity, and their function is important to the proper decoding of mRNA. However, in a number of bacteria including H. pylori, GlnRS and/or AsnRS are absent. To synthesize Gln-tRNAGln, H. pylori first uses a noncanonical GluRS2 which is specific for tRNAGln to form Glu-tRNAGln; then the trimeric AdT (GatCAB) transforms Glu-tRNAGln into Gln-tRNAGln which is proper for protein biosynthesis. In a similar manner, the biosynthesis of Asn-tRNAAsn also takes place in H. pylori by using the same GatCAB and a canonical nondiscriminating AspRS. The widespread use of these indirect pathways among prominent human pathogens, and their absence in the mammalian cytoplasm, identify AdT as a promising target for the development of new and highly specific antimicrobial agents. By using phage display, we discovered several cyclic peptides rich in tryptophan and proline that inhibit H. pylori GatCAB. Peptides P10 (CMPVWKPDC) and P9 (CSAHNWPNC) are competitive inhibitors of GatCAB with respect to its substrate Glu-tRNAGln. The inhibition constants (Ki) of P10 and P9 are 126 and 392 μM, respectively. Their docking models revealed that they bind to the transamidation active site of GatB via π-π stacking interactions with Tyr81, as does the 3’-terminal A76 of tRNA. We also discovered two small dipeptide-like sulfone-containing inhibitors of H. pylori GatCAB by mimicking the intermediate of its transamidation reaction. Although they are much smaller than the cyclic peptides mentioned above, they are competitive inhibitors of GatCAB with respect to GlutRNAGln, with Ki values of 139 μM for compound 7 and 214 μM for compound 4. These inhibitors could be useful not only to study the reaction mechanisms of GatCAB, but also could be lead compounds for the development of a new class of antibiotics to treat infections caused by H. pylori.

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Palancade, Benoît. "Propriétés de l'ARN polymérase II et de sa phosphatase FCP1 dans l'embryon précoce de Xénope". Paris 6, 2002. http://www.theses.fr/2002PA066284.

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El, Ayoubi Leyla. "Etude fonctionnelle des sous-unités hRPC62 et hRPC39 de l’ARN Polymérase III humaine". Thesis, Bordeaux, 2014. http://www.theses.fr/2014BORD0007.

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Abstract (sommario):

Dans les cellules eucaryotes, la transcription de l’ADN nucléaire est effectuée grâce à trois ARN Polymérases ADN dépendantes (Pol). La Pol I transcrit les ARN ribosomaux, la Pol II produit essentiellement des ARN messagers et des micro ARN alors que la Pol III transcrit des petits ARN non traduits impliqués dans une variété de processus cellulaires essentiels tels que la traduction, l’épissage ou la régulation de la transcription. L’ARN Polymérase III humaine est un complexe enzymatique constitué de 17 sous-unités dont la plupart sont apparentées à des sous-unités de la Pol I et/ou la Pol II. Une de ces sous-unités, hRPC32 est présente sous forme de deux paralogues α et β codés par deux gènes différents où hRPC32β est exprimée de façon ubiquitaire alors que hRPC32α est exprimée spécifiquement dans les cellules transformées ou non différenciées. Au sein de la Pol III, hRPC32α/β, hRPC62 et hRPC39 forment un sous-complexe ternaire stable dissociable de l’enzyme. Ces trois sous-unités sont spécifiques à la Pol III et sont impliquées dans l’étape d’initiation de la transcription. L’objectif de ce travail de thèse est d’éclaircir les mécanismes de fonctionnement du sous-complexe hRPC62-hRPC39-hRPC32α/β. Le travail réalisé a permis, dans un premier temps, de cartographier les domaines d’interaction entre la sous-unité hRPC62 et les deux paralogues α et β de la sous-unité hRPC32. Ensuite, nous avons mené une analyse biochimique des activités enzymatiques des protéines recombinantes de hRPC62 et hRPC39. Cette analyse a montré que hRPC62 possède des homologies fonctionnelles avec TFIIEα, un facteur de transcription de l’ARN Polymérase II récemment décrit comme étant un homologue structural de la sous-unité hRPC62. Ces données supportent le modèle suggérant que certaines sous-unités des ARN Polymérases peuvent être considérées comme des facteurs de transcription recrutés de façon permanente à l’enzyme
In eukaryotes, nuclear transcription is carried out by DNA dependent RNA polymerases (Pol) I, II and III. Pol I transcribes ribosomal RNA’s, Pol II produces essentially messenger and micro RNA’s whereas Pol III transcribes small untranslated RNA’s involved in a variety of cellular processes such as translation, splicing or the regulation of transcription. Human Pol III is a multi-subunit enzyme composed of 17 subunits. The majority of these subunits are homologous or closely related to Pol II and/or Pol I subunits. However, five subunits are specific to Pol III with no counterparts in Pol I or Pol II. One of the Pol III specific subunits, hRPC32 has two paralogues, α and β, expressed from two different genes. hRPC32β is expressed ubiquitously while hRPC32α expression is specific to transformed or non-differentiated cells. Within the Pol III enzyme, hRPC32α or β associate with two other Pol III specific subunits, hRPC62 and hRPC39, to form stable ternary sub-complexes thought to be implicated in transcription initiation. The purpose of this work was to clarify the functional mechanism of hRPC32α/β-hRPC62-hRPC39 sub-complexes. In this study, we first mapped the protein-protein interaction of hRPC62 with hRPC32α and hRPC32β. Second, we performed a biochemical study of hRPC62 and hRPC39 enzymatic activities. This analysis showed that hRPC62 has functional homologies with TFIIEα, a Pol II transcription factor recently described as a structural homolog of hRPC62. These results support the model that certain RNA polymerase subunits can be considered as transcription factors that have been stably recruited to the enzyme

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Vosnakis, Nikolaos. "Investigating the role of human HAT (histone acetyltransferase) containing complexes, ATAC and SAGA, in living cells". Thesis, Strasbourg, 2014. http://www.theses.fr/2014STRAJ119/document.

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Abstract (sommario):

Les complexes acétyltransférases (HAT), SAGA et ATAC, sont des régulateurs de la transcription des gènes. Cependant, peu d’études ont été menées sur la dynamique de ces complexes au niveau cellulaire et sur les mécanismes régulant leur assemblage. Au cours de mes travaux de thèse, j’ai utilisé des approches d’imagerie sur cellules vivantes, afin de déterminer la mobilité de ces complexes en comparaison avec celle d’autres régulateurs transcriptionnels. Les résultats ont montré que les sous-unités de SAGA et ATAC interagissent de manière transiente avec la chromatine. En complément, nous avons montré que les sous-unités spécifiques de SAGA et ATAC (ADA2b et ADA2a) ont des propriétés dynamique intracellulaire différentes et que GCN5, affecte la distribution d’ADA2a. Des analyses protéomique menées sur le comportement de ces protéines au niveau endogène, ont permis de montrer que les voies d’assemblage de ces deux complexes étaient différentes au niveau cytoplasmique et nucléaire
Human SAGA and ATAC, are histone acetyltransferase (HAT) containing complexes that share a set of subunits and facilitate RNA polymerase II (Pol II) transcription. Little is known for the dynamics of the complexes in living cells and the regulation of their assembly. In this work, we used live-cell imaging to characterise the mobility of the two complexes and compare it with other actors of Pol II transcription. All tested ATAC and SAGA subunits exhibit very transient interactions with chromatin, a property that explains certain aspects of the function of the complexes. Moreover, we showed that overexpressed ATAC- and SAGA-specific HAT-module subunits (ADA2a and ADA2b respectively) have different intracellular dynamics and that the abundance of the shared subunit GCN5, affects the distribution of ADA2a. Quantitative proteomic analysis expanded our findings on endogenous proteins and provided evidence that the cytoplasmic and nuclear assembly pathways of SAGA and ATAC are different

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Hemmery, Hélène. "Étude de la synthèse totale de la ripostatine A". Thesis, Paris 11, 2014. http://www.theses.fr/2014PA112336/document.

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Abstract (sommario):

Cette thèse est consacrée à l’étude de la synthèse totale de la ripostatine A, un antibiotique inhibiteur de l’ARN polymérase des bactéries, isolé en 1995 à partir de la myxobactérie Sorangium cellulosum. La ripostatine A est caractérisée par une lactone à 14 chaînons et un lactol à 6 chaînons ; elle comporte trois doubles liaisons et trois centres stéréogènes. Les deux voies de synthèse envisagées de la ripostatine A comportaient comme étapes clés une cycloaddition 1,3-dipolaire d’oxyde de nitrile et une macrolactonisation. Des accès stéréocontrôlés à deux précurseurs importants comportant un motif 1,4-diène ont été développés, notamment à l’aide d’une carboalumination d’alcyne. Des β-hydroxycétones, précurseurs avancés dans la synthèse, ont été obtenues à partir de ces 1,4 diènes. Un couplage de Stille, entre un alcénylstannane qui a été synthétisé et un halogénure dérivé d’une des β-hydroxycétones préparées, reste à réaliser afin d’assembler le squelette de la ripostatine A
This thesis is dedicated to the study of the total synthesis of ripostatin A, an antibiotic which inhibits eubacterial RNA polymerase, isolated in 1995 from the myxobacteria Sorangium cellulosum. Ripostatin A is characterized by a 14 membered lactone and a 6 membered lactol, it contains three double bonds and three stereogenic centers. The two synthetic routes envisaged for ripostatin A included as key steps a nitrile oxide 1,3 dipolar cycloaddition and a macrolactonisation. Stereocontroled accesses to two important precursors containing a 1,4-diene moiety were developed, using in particular an alkyne carboalumination. Advanced precursors, β-hydroxyketones, were obtained from these 1,4 dienes. A Stille coupling between a synthesized stannane and an halide derived from one of the β-hydroxyketones, remains to be realized in order to assemble the skeleton of ripostatin A

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Sifer, Christophe. "Mise au point d'un système de RT-PCR pour la mise en évidence d'un ARN messager tardif du sixième herpesvirus humain". Paris 5, 1998. http://www.theses.fr/1998PA05P189.

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Gerlach, Piotr. "La structure et la fonction de la polymérase d'orthobunyavirus La Crosse". Thesis, Université Grenoble Alpes (ComUE), 2015. http://www.theses.fr/2015GREAV013/document.

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Abstract (sommario):

Les virus ne sont rien de plus que des particules composées de lipides et/ou de protéines qui encapsulent de l'information génétique composée d'ARN ou d'ADN. Au cours du cycle viral, les virus entrent dans la cellule hôte où ils dupliquent leur génome, puis forment de nouvelles particules virales qui ressortiront de la cellule pour se diffuser. Alors que pour produire leurs protéines virales les virus détournent la machinerie cellulaire, ils utilisent pour la plupart leur propre polymérase spécifique pour répliquer leur génome.Les Bunyaviridae sont une grande famille des virus à ARN simple brin segmenté de polarité négative. Les Arenaviridae et les Orthomyxoviridae sont les deux autres familles de ce type. Certains bunyavirus provoquent des maladies humaines graves, comme des fièvres hémorragiques, des encéphalites et des méningites. D'autres infectent des plantes et animaux, posant une menace économique sérieuse en agronomie.Les ARN polymérases ARN-dépendante de virus à ARN négatif segmenté sont des machineries multi-fonctionnelles, capables de répliquer le génome viral et de le transcrire en ARNs messagers. La réplication est effectuée de novo, en utilisant un intermédiaire d'ARN complémentaire de polarité positive, alors que la transcription est initiée par vol de coiffe d'ARN cellulaire. Chaque segment du génome viral est recouvert par des nucléoprotéines et fixé à la polymérase par ses extrémités 3' et 5' conservées. Le complexe ARN viral/nucléoprotéines/polymérase forme une ribonucléoprotéine, qui est l'unité fonctionnelle de la réplication/transcription.L'objectif de mon projet de thèse était la caractérisation structurale et fonctionnelle de la polymérase du virus La Crosse, également nommée protéine L. Ce projet était basé sur l'hypothèse que toutes les polymérases de virus à ARN négatif segmenté pourraient partager une organisation et un mode d'action similaire. Lors de la première année de ma thèse, j'ai tenté de caractériser le domaine C-terminal, que nous supposions être responsable de la fixation de coiffe. Au cours de la deuxième année, j'ai étendu mes recherches sur l'étude de l'interaction entre les extrémités de l'ARN viral et la protéine L (protéine entière et construction tronquée en C-terminal). Confronté à des difficultés pour établir des tests de réplication et de transcription in vitro, j'ai poursuivi mes recherches en troisième année avec l'étude d'interactions et de co-cristallisation entre polymérase et ARN viral. Cela a finalement conduit au résultat principal de ma thèse - la détermination de la structure par cristallographie aux rayons X de la polymérase de virus de La Crosse en complexe avec les extrémités 3' et 5' de l‘ARN viral. La structure obtenue constitue une percée dans le domaine de bunyavirus. Elle révèle – à la différence de ce qui avait été initialement proposé – que les extrémités 3' et 5' de l'ARN se lient dans deux sites séparés et conservés. La liaison de l'extrémité 5' de l'ARN viral stabilise de façon allostérique l'un des motifs catalytiques du site actif de la polymérase. La structure révèle l'existence de deux tunnels séparés pour l'ARN produit et l'ARN matrice de sortir, ce qui suggère que le brin d'ARN naissant est séparé de la matrice et quitte la polymérase comme ARN simple brin. La proximité des tunnels d'entrée et de sortie de la matrice explique comment la polymérase peut se déplacer le long de l'ARN génomique avec une perturbation minimale de la ribonucléoprotéine.En parallèle de la structure de la polymérase du virus La Crosse, les structures des polymérases hétérotrimériques de la grippe A et B en complexe avec l'ARN viral ont également été déterminées au sein du groupe du Dr. Stephen Cusack. La comparaison de l'organisation des polymérases des deux familles et de la nature de leur liaison avec l'ARN viral montre que, malgré une homologie de séquence minimale, des similitudes structurelles sont frappantes. Cela suggère fortement la présence d'un ancêtre commun
Viruses are not more than particles composed of lipids and/or proteins with genetic information – the viral RNA or DNA genome – embedded inside. In order to be efficient, once they enter the host cell they need to multiply this genetic information, package it into new viral particles and spread out from the cell. While in order to produce viral proteins viruses highjack cellular machinery, for replicating their genome most viruses use their own, specialized polymerases.Bunyaviridae is the largest viral family of segmented negative-strand RNA viruses, comprising also Arenaviridae and Orthomyxoviridae families. Some bunyaviruses are causative agents of severe human diseases including heamorrhagic fevers, encephalitis and meningitis. Others infect a variety of plants and animals posing a significant economic threat to the crop cultivation and cattle breeding.RNA-dependent RNA polymerases of segmented negative-strand RNA viruses are multifunctional machines, able to perform both de novo genome replication via positive-strand cRNA intermediate, and viral mRNA transcription using cap-snatched host-derived mRNA primer. Viral RNA genome of bunyaviruses, arenaviruses, and orthomyxoviruses is divided into three, two, and eight segments respectively. Each segment, coated by nucleoproteins and attached through its conserved 3′ and 5′ ends to the polymerase, constitutes an individual ribonucleoprotein particle – an autonomous RNA synthesis unit.The scope of the PhD project described in this thesis was the structural and functional characterization of the La Crosse orthobunyavirus polymerase, also named the L protein. It was based on the hypothesis that all polymerases of segmented negative-strand RNA viruses share a similar domain organization and mode of action. During the 1st year attempts were made to confirm and characterize a putative C-terminal cap-binding domain. During the 2nd year project was extended to study 3′ and 5′ vRNA ends interactions with the full length and C-terminus truncated L protein. Facing difficulties to establish replication and transcription assays in vitro, vRNA binding studies and co-crystallizastion were continued during the 3rd year. This finally led to the main achievement of the thesis – the x-ray structure of La Crosse orthobunyavirus polymerase in complex with vRNA. Obtained structure is a breakthrough in the bunyavirus field. It reveals – unlike it was initially believed – conserved, sequence specific and separate binding sites for 3′ and 5′ vRNA ends located within the polymerase. The 5′ vRNA end binding allosterically structures one of the conserved catalytic motifs within the polymerase active site. The structure sheds also some new light on bunyaviral replication and transcription mechanisms. There exist two distinct product and template exit channels, suggesting that the nascent RNA strand is separated from the template and leaves the polymerase as the single-strand RNA. Close proximity of the template entry and exit channels explains how the polymerase can translocate along the genomic template with minimal disruption of the RNP.In parallel to the La Crosse polymerase structure, structures of Influenza A and B heterotrimeric polymerases in complex with vRNA were also obtained in Stephen Cusack group. This gave a great opportunity to compare the domain organization and the nature of vRNA binding by viral polymerases belonging to Bunyaviriadae and Orthomyxoviridae families, and proved that despite minimal sequence homology the structural similarities are striking. This strongly suggests an evolutionary common ancestor, which can possibly be shared with non-segmented negative-strand RNA viruses as well

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Winsor, Barbara. "Caracterisation de mutants de saccharomyces cerevisiae affectes dans la biosynthese des arn messagers rpobl, isel, rnal4, rnal5". Université Louis Pasteur (Strasbourg) (1971-2008), 1987. http://www.theses.fr/1987STR13216.

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Saad, Nizar. "Identification and analysis of a T-Box regulatory element controlling the expression of the enzymes involved in the tRNA-dependent synthesis of asparagine in Clostridium acetobutylicum". Strasbourg, 2011. https://publication-theses.unistra.fr/restreint/theses_doctorat/2011/SAAD_Nizar_2011.pdf.

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Abstract (sommario):

Ce projet a permis de comprendre au niveau structural et mécanistique le fonctionnement du système d’antiterminaison chez Clostridium acetobutylicum et de conclure que ce mécanisme de régulation de l’expression des gènes est totalement dépendant du contexte physiologique de chaque espèce bactérienne. La redondance des gènes de la synthèse de l’Asn-ARNtAsn chez C. Acetobutylicum a permis de révéler un mécanisme complexe de régulation de ces gènes en réponse au stress environnemental et aux changements physiologiques subis par C. Acetobutylicum. Ce mécanisme est basé sur la régulation au niveau transcriptionnel de l’expression des gènes codant pour la voie indirecte de synthèse de l’Asn-tRNAAsn. Durant notre recherche on a montré que cette régulation est effectuée par un riboswitch de type T-Box spécifique d’un ARN de transfert, l’ARNtAsn. L’utilisation d’une combinaison d’études in vitro et in vivo, a permis de montré une ambigüité dans l’usage du codon au niveau de la « spécifier loop » de cette T-Box. Cette ambigüité permet la reconnaissance des deux espèces d’ARNt; l’ARNtAsn(GUU) et l’ARNtGlu(UUC). Enfin, la découverte de la synchronisation de 2 riboswitch de type T-Box est une découverte majeure qui permettra une avancée dans la compréhension du rôle de la T-Box dans son contexte cellulaire. Ces découvertes ouvrent la voie à une meilleure compréhension de la régulation des gènes chez les bactéries Gram positives pathogènes qui dans leur grande majorité utilisent ce riboswitch
The T-box control system is a very common mechanism that Gram+ bacteria use to regulate the transcription of a variety of genes, like those involved in tRNA aminoacylation, in response to amino acid starvation. This regulation system is based on the stabilization of an antiterminator structure by the interaction with a cognate uncharged tRNA. Analysis of Gram+ Clostridium acetobutylicum (Cac) genome revealed an aberrant redundancy for the genes putatively involved in asparagine (Asn) and AsntRNAAsn synthesis. Through our investigations using various approaches, we showed that Cac only uses the indirect pathway to form Asn and Asn-tRNAAsn. We demonstrated that an entire transamidation pathway is organized as an operon under the control of a tRNAAsn-dependent T-Box riboswitch. One of our important findings gave some explanation to the function of this gene redundancy, which might be interconnected to control tRNA-dependent Asn synthesis, which might in turn be involved in controlling Cac metabolic switch from acid to solvent production. Moreover, we gave new exciting explanations on how the T-Box recognizes its cognate tRNA. Our work brought some evidences that a T-Box can use more than one codon to control gene expression and that; therefore, they have more than one tRNA ligand. Finally, we demonstrated that one antitermination event can be reprogrammed through a synchronization mediated by a protein effector, and guided by another T-Box. Thanks to this process, a T-Box would be able to adequately respond to the level of two metabolically related amino acids. This finding paves the way for a better understanding of the antitermination mechanism in Gram+ bacteria

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Levivier, Emilie. "Exploration des similitudes de séquences protéiques à haut niveau de divergence évolutive : perspectives de l'approche Hydrophobic Cluster Analysis (HCA)". Paris 7, 2003. http://www.theses.fr/2003PA077069.

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Izard, Jerome. "Contrôle de la croissance et régulation génique chez Escherichia coli". Thesis, Grenoble, 2012. http://www.theses.fr/2012GRENV061/document.

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Abstract (sommario):

La faculté d’adaptation aux conditions environnementales des bactéries provient de lacomplexité de leur réseau de régulation génique, impliquant de nombreux régulateursspécifiques et la machinerie d’expression génique. Nous avons montré que le gène crl, codantun régulateur global d’Escherichia coli, est exprimé de façon transitoire lors de laphase exponentielle. Notre étude a permis d’identifier deux régulateurs responsables dece profil parmi une centaine testés. Ainsi, le complexe CRP-AMPc, réprime de façon indirectel’expression de crl, tandis que la nucléoprotéine Fis se fixe sur le promoteur de crlet active sa transcription directement. Le profil d’expression de crl étant similaire à celuide nombreux régulateurs globaux, nous nous sommes intéressés au rôle de la machinerieglobale d’expression des gènes et à son impact sur la croissance. Dans ce but, nous avonsconstruit un système nous permettant de contrôler la croissance d’E. coli en modulantl’expression des sous-unités _ et _’ de l’ARN polymérase et donc le niveau de transcriptiondans la cellule. Lorsque l’ARN polymérase est en faible concentration, le taux decroissance devient quasiment nul et les cellules filamentent. Ce contrôle de la croissanceest dose dépendant et a été mis en évidence autant à l’échelle de la population qu’à cellede la cellule unique. Nous avons enfin étudié par RNA-seq l’impact du niveau d’ARNpolymérase sur la transcription de l’ensemble du génome de cette souche. Cette étudemontre que toutes les classes fonctionnelles de gènes sont affectées par notre système, àl’exception des gènes qui codent les protéines ribosomales
Bacteria can adapt to many different environmental conditions. This capacity of adaptationis conferred to the organism by a complex regulatory network, composed of specificregulators and the global gene expression machinery. We have studied the expression dynamicsof Crl, a global regulator of Escherichia coli, and observed a peak of transcriptionduring the exponential phase of growth. In order to identify potential regulators of crlexpression, we have measured the expression profile of crl in about one hundred differentmutant strains. This screen has revealed that CRP-cAMP represses indirectly the transcriptionof crl and the nucleoprotein Fis activates transcription of the crl promoter bybinding to the crl promoter region. We noted that the expression of most global regulatorsof E. coli have an expression profile similar to the one of Crl. We have thereforestudied the relationship between global gene expression machinery and cellular growth.We constructed a bacterium where the transcription of the two large subunits of RNApolymerase, _ et _’, is under external control. A small concentration of RNA polymeraseleads to a small growth rate of this engineered bacterium and the cells start to filament,whereas a high concentration of RNA polymerase produces phenotypically wild-type cells.We have characterized the control of growth rate by our system at the population level andin single cells. An analysis of the global transcription pattern of this strain by RNA-seqshows that the transcription of genes in all functional classes, with the possible exceptionof genes coding for ribosomal proteins, are almost equally affected by the modificationsof the intracellular concentration of RNA polymerase

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Sourimant, Julien. "Caractérisation structurale et fonctionnelle de la polymérase du virus respiratoire syncytial". Thesis, Versailles-St Quentin en Yvelines, 2015. http://www.theses.fr/2015VERS019V.

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Abstract (sommario):

Le virus respiratoire syncytial (VRS) est le principal agent responsable desbronchopneumonies du jeune veau et des bronchiolites du nourrisson. Il n’existe pas devaccin ni d’antiviraux spécifiques pour l’homme. La réplication du génome et la transcriptiondes gènes viraux sont assurées par un ensemble de protéines virales constituant le complexeARN polymérase ARN-dépendant : la nucléoprotéine N, la phosphoprotéine P, le facteur detranscription M2-1 et la grosse sous-unité L. L’objectif principal de ma thèse était d’obtenirde nouvelles données structurales et fonctionnelles sur le complexe ARN-polymérase ARNdépendante(RdRp) du VRS, en particulier sur le couple P-L. Pour ceci j’ai tout d’aborddéveloppé un protocole de production et purification de la protéine L sous formerecombinante en cellules d’insecte. Ceci m’a permis ensuite de cartographier le sited’interaction de P avec L. J’ai ainsi mis en évidence que la protéine L interagit avec la partieC-terminale de la protéine P, au-niveau des résidus 216 à 239. Les données obtenuessuggèrent que ce domaine peut former un nouvel élément de reconnaissance moléculaire(« MoRE ») se structurant en hélice alpha lors de l’interaction avec la protéine L. De plus, lacartographie de ce domaine d’interaction m’a permis d’identifier entre les résidus 164 et 205de P une nouvelle région impliquée dans le recrutement de la protéine L aux corpsd’inclusions viraux. Ces nouvelles données ouvrent la voie à de nouvelles études structuralesde l’ARN-polymérase du VRS et nous permettent d’envisager de nouvelles stratégiesantivirales ciblant ce complexe
Respiratory syncytial virus (RSV) is the leading cause of calves bronchopneumonia andinfants bronchiolitis. Neither vaccine nor antiviral treatments are currently available for use inhumans. Viral genome is replicated and transcribed by a set of viral proteins constituting theviral RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) complex: the nucleoprotein (N), thephosphoprotein (P), the transcription factor (M2-1) and the large subunit (L). This workaimed to unveil new structural and functional data regarding the viral RdRp, especially the PLcouple. With this aim in view, I have first conceived a protocol to produce and purifyrecombinant L and P proteins expressed in insect cells. This tool enabled the fine mappingand characterization of the L binding domain of the RSV phosphoprotein. This highlightedthe interaction between the L protein and the C-terminal region of the P protein, especiallyresidues 216 to 239. Further data suggests that this area constitutes an alpha helix formingmolecular recognition element (« MoRE ») during P-L interaction. Furthermore, this studyunveiled a new region of the P protein encompassing residues 164 to 205, involved in therecruitment of L protein to viral inclusion bodies. These new results open the way toupcoming structural studies of RSV RdRp and allow us to define a new target for thedevelopment of antiviral drugs against RSV

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Eychenne, Thomas. "Étude intégrative du rôle de deux sous unités essentielles du Médiateur de la transcription dans la mise en place des complexes de pré-initiation". Thesis, Université Paris-Saclay (ComUE), 2016. http://www.theses.fr/2016SACLS266/document.

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Abstract (sommario):

La transcription est la première étape de l’expression des gènes. Chez les eucaryotes, la transcription par l’ARN polymérase II (Pol II) est un processus hautement régulé. Elle commence par la fixation d’activateurs spécifiques sur des régions régulatrices. Cela permet le recrutement de co-activateurs suivi des facteurs généraux de la transcription (GTFs) et de l’ARN polymérase II pour former le complexe de préinitiation (PIC). Le Médiateur est un complexe co-activateur essentiel à ce processus. Chez la levure Saccharomyces cerevisiae, il est composé de 25 sous-unités dont 10 sont essentielles à la viabilité. Son rôle principal est d’intégrer les signaux de régulation pour les transmettre aux composants du PIC. On connait aujourd’hui un certain nombre de fonctions du Médiateur. Néanmoins, sa complexité et la présence de sous-unités essentielles compliquent la compréhension détaillée de son mécanisme de fonctionnement in vivo. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé aux sous-unités essentielles Med10 et Med7, toutes deux appartenant au module du milieu du Médiateur, peu étudié jusqu’à présent. Nous avons construit une collection de mutants thermosensibles de ces deux sous-unités chez la levure S. cerevisiae. Nous avons caractérisés ces mutants par différentes approches de biologie moléculaire, biochimie et génomique fonctionnelle. L’étude de la sous-unité Med10 nous a permis de mettre en évidence in vivo un lien fonctionnel entre le Médiateur et TFIIB, un GTF essentiel au recrutement de la Pol II. Nous avons ainsi identifié les sous-unités Med14 et Med10 qui sont en contact avec TFIIB. Nos analyses de ChIP-seq montrent que le module du milieu et Med10, en particulier, est requis pour la formation correcte du PIC sur l’ensemble du génome. Ces données nous ont également permis de montrer que le Médiateur influence la formation du PIC en relation avec l’architecture des promoteurs en termes de présence de boîtes TATA, d’occupation des nucléosomes et leur dynamique. Ce travail nous a permis une meilleure compréhension du rôle du Médiateur dans l’activation de la transcription et donné des informations mécanistiques sur la façon dont l’interaction entre le Médiateur et TFIIB (et les autres GTFs) ainsi que l’architecture des promoteurs mènent à une régulation gène-spécifique
Transcription is the first step of gene expression. In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) transcription is a highly regulated process. Transcription begins with the binding of a specific transcription factor on a DNA regulatory sequence. This enable the recruitment of co-activators, followed by general transcription factors (GTFs) and RNA polymerase II (Pol II) to form preinitiation complex (PIC). Mediator is a co-activator complex which is essential in this process. In yeast Saccharomyces cerevisiae, Mediator is composed of 25 subunits, among which 10 are essential for cell viability, organized into four distinct modules. The main role of this complex is to transmit regulatory signal to PIC components. Although Mediator has been the subject of a large numbers of studies, its complexity prevents the detailed understanding of how it acts in vivo. During my PhD, I focused my work on the study of the two essential subunits Med7 and Med10. Both of these subunits belong to the middle module, poorly studied so far. We obtained a collection of temperature-sensitive mutants of Med7 and Med10 in yeast S. cerevisiae. We used different molecular biology and functional genomics to characterize these mutants. The work on Med10 subunit enabled us to highlight in vivo a functional link between Mediator and TFIIB, one of the GTFs. Notably, we have shown a new contact between Med14 subunit and TFIIB. Our ChIP-seq analysis shows that Mediator middle module, and in particular Med10 subunits, is crucial for PIC assembly genome-wide. These data also permit us to show that Mediator influence PIC formation in relation to promoter architecture. Taken together, these results indicates that Mediator in crucial to orchestrate the incorporation of the different proteins into the PIC. This work permit us to improve our understanding of how functional interplay between Mediator, TFIIB, other GTFs, and the promoter architecture leads to gene-specific transcription

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Tesi sul tema "ARN Dependent ARN Polymerase"

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