Letteratura scientifica selezionata sul tema "Acides ribonucléiques"

Il est essentiel de tenir compte des défis auxquels nous avons déjà été confrontés et auxquels nous avons répondu dans le cadre de la mise au point d’un vaccin contre le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2 (SRAS-CoV-2). Compte tenu de la gravité de la crise sanitaire que le SRAS-CoV-2 a causée à l’échelle mondiale, et compte tenu du fait que nous en savons très peu sur le virus, nous devrions nous concentrer sur des approches qui peuvent améliorer les résultats en matière de développement dans un laps de temps relativement court. Ce commentaire traite de l’utilisation des vaccins à base d’acide nucléique (acide désoxyribonucléique et acide ribonucléique) contre les infections virales et les contextes de pandémie. Les avantages potentiels des vaccins à base d’acide nucléique par rapport aux vaccins conventionnels sont présentés, puis nous discuterons des vaccins à base d’acide nucléique en développement contre les infections virales ainsi que des défis relatifs à ces vaccins au début des essais cliniques.

The distribution of nucleic acids, particularly of ribonucleic acid, was studied in the organs and cells of the turbellarian Dugesia tigrina, using the fluorochrome acridine orange as a histochemical marker. The cells showing the strongest ribosomal fluorescence are neoblasts and nerve cells with the exception of their axons. Secretory cells such as intestinal epithelial cells and vitelline cells also exhibit an orange–red fluorescence, though not as strong. Muscle fibers, both somatic and pharyngeal, show very little RNA fluorescence. Other organs are intermediate in intensity of fluorescence. This new method may serve as a useful tool for the histochemical study of peptide and protein synthesis in the lower metazoans. Examples of applications are embryonic development and growth, states of nutritional deprivation, and regeneration.

Les ARNt se caractérisent par la présence d'une grande variété de nucléosides modifiés. Selon leur positionnement et leur structure chimique, les nucléosides modifiés confèrent, en partie du moins, son identité a l'ARNt qui les contient. La caractérisation chimique de certains nucléosides hypermodifiés a été entreprise pour tenter d'élucider les relations entre la structure de ces nucléosides et leur fonction biologique. La stratégie analytique mise au point et utilisée dans cet objectif réside essentiellement en un ensemble de méthodes combinées chromatographiques et spectrométriques permettant, à partir d'ARNt, l'isolement, la purification et l'identification de mono nucléosides de structures inconnues. A l'aide de ces méthodes et après avoir établi une bibliothèque des paramètres chromatographiques et spectraux de plus de 50 nucléosides de référence, nous avons déterminé la structure chimique de nouveaux nucléosides modifiés. L'étude conduite sur les ARNT méthionine initiateurs (ARNt#Met #i) de plusieurs espèces de levures et de végétaux, nous a ainsi permis de découvrir et d'identifier deux purines hypermodifiées localisées en position 64 et de structures chimiques inédites: adénosine et guanosine phosphoribosylées. Nous avons pu montrer qu'une telle modification purique peut etre considérée comme un marqueur de ces ARNt#M#e#ti. Son role biologique serait d'empêcher l'ARNt#M#e#ti d'être entrainé vers les étapes de l'élongation protéique. Nous avons également mis en évidence et établi la structure d'un autre nucléoside hypermodifié, la 2-o-methyl-5-carbomoylmethyluridine (ncm#5um), localisé en position 34 (wobble) d'un nouvel isoaccepteur l'ARNt#l#e#u (ncm#5umaa) isolé de la levure saccharomyces cerevisiae. Nous avons alors montre qu'une telle structure chimique entraine une reconnaissance unique et spécifique du seul codon leucine UUA

L'etude des arn par rmn est limitee par leur distribution inhomogene de protons et la faible resolution des spectres de correlations 1 3c- 1h, rendant particulierement difficile l'attribution et leur caracterisation structurale. Il est demontre que l'utilisation de la correlation croisee csa-dipolaire apporte un important gain en resolution et en sensibilite pour ces experiences. Ces avantages ont ete appliques aux principales experiences permettant l'attribution et la mesure des parametres structuraux et dynamiques dans les arn de tailles importantes. L'etude quantitative des phenomenes de relaxation induits par cette correlation croisee permet, d'une part, de determiner simplement la conformation des sucres, et d'autre part, apporte la premiere caracterisation experimentale des csa dans les bases nucleiques des arn en solution. Dans les biomolecules paramagnetiques la mesure de ces vitesses de relaxation croisee permet d'obtenir de nouvelles contraintes structurales a longue portee, particulierement interessantes pour la determination de la structure des arn. Une approche est proposee pour generaliser cette methode aux biomolecules ne possedant pas de site naturel de fixation aux ions paramagnetiques. Dans une seconde partie, il est propose un protocole de calcul de structure optimise pour la determination de la topologie des ponts disulfures a partir des contraintes rmn. Une etude des possibilites et limitations de cette methode, indique qu'elle est generale et peut etre appliquee des les premiers stades des etudes rmn des proteines riches en ponts disulfures. Les applications a deux toxines riches en ponts disulfures resistantes aux endoproteases, apportent de nouvelles informations structurales et biochimiques pour ces familles de proteines.

La spectrométrie de masse (MS) s'est imposée depuis quelques années comme une méthode essentielle pour la caractérisation des biomolécules. Le développement de nouveaux analyseurs à ultra-haute résolution et grande précision de mesure de masse, tels que la résonance cyclotronique des ions à transformées de Fourier (FTICR), ont amélioré la sélectivité de la méthode. Afin de faciliter la caractérisation d'échantillons complexes dans de nombreux domaines, la MS peut être couplée à des méthodes séparatives telles que l'électrophorèse capillaire (CE). La CE est la méthode électrophorétique la plus performante en termes de résolution, d'efficacité et de capacité de pics tout en étant très rapide. Le couplage CE-MS a été développé pour un grand nombre d'analytes et permet d'obtenir une sensibilité optimale de la MS grâce au recours d'une interface sheathless permettant l'utilisation de nano-débit. Cependant, pour pouvoir combiner les performances de séparation de la CE, la haute sélectivité et sensibilité de l'interface sheathless avec l'ultra-haute résolution du FTICR-MS, il est nécessaire de relever les défis techniques liées aux propriétés intrinsèques de la CE et du FTICR telles que la rapidité de la séparation, la haute efficacité des pics et le temps d'acquisition de la MS. Les travaux présentés dans ce manuscrit présentent donc la mise en place du couplage CE FTICR-MS, nouveau au laboratoire, et son application dans l'étude de biomolécules, et notamment la caractérisation des modifications post-transcriptionnelles des acides ribonucléiques (ARN). Une étude du couplage a tout d'abord été réalisée à l'aide de standards, puis un premier transfert de méthode a été effectué sur des échantillons biologiques déjà décrits dans la littérature. Divers développements de méthodes sont ensuite présentés tels que l'optimisation de la préparation d'échantillon, et le développement de nouveaux outils bio-informatiques permettant d'aller plus loin dans la caractérisation de ces modifications et dans la complexité des échantillons. Enfin, le couplage CE-FTICR-MS ainsi que des derniers développements de méthode ont été mis en application sur des échantillons plus complexes et dont les modifications post-transcriptionnelles ne sont pas décrites dans la littérature. L'utilisation du couplage CE-FTICR-MS pour la caractérisation des ARN a notamment permis d'identifier une modification post-transcriptionnelle inconnue dans un de ces échantillons complexes et peu étudiés dans la littérature
Mass spectrometry (MS) has emerged in recent years as benchmark method for the characterization of biomolecules. The development of new analyzers with ultra-high resolution and high mass accuracy, such as Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FTICR), has improved the selectivity of the method. To ease the characterization of complex samples, MS can be coupled with separative methods such as capillary electrophoresis (CE). CE is the most powerful electrophoretic method in terms of resolution, efficiency and peak capacity, and is very fast. The CE-MS coupling has been developed for a large number of analytes and allows to obtain an optimal sensitivity of MS thanks to the use of a sheathless interface allowing the use of nanoflow rates. However, in order to combine the separation performances of CE, the high selectivity and sensitivity of the sheathless interface with the ultra-high resolution and the high mass accuracy of FTICR-MS, it is necessary to address the technical challenges related to the intrinsic properties of CE and FTICR such as the speed of separation, high peak efficiency and MS acquisition time. The work presented in this manuscript presents the implementation of the CE-FTICR-MS hyphenation and its application for the study of biomolecules, and in particular the characterization of post-transcriptional modifications of ribonucleic acids (RNA). A study of the CE-FTICR-MS hyphenation was first performed using standards, then a first method transfer was performed on biological samples already described in the literature. Various method developments are then presented such as the optimization of the sample preparation, and the development of new bioinformatics tools allowing to go further in the characterization of these modifications and in the complexity of the samples. Finally, the CE-FTICR-MS hyphenation as well as the latest method developments were applied on more complex samples, and whose post-transcriptional modifications are not described in the literature. The use of the CE-FTICR-MS hyphenation for the characterization of RNA enabled the identification of an unknown post-transcriptional modification in one of these complex samples that has not been previously studied in the literature

Les aminoglycosides, des dérivés aminés de saccharides, interfèrent avec le mécanisme de synthèse des protéines chez les bactéries en se fixant au site de décodage de l'ARN de transfert aminoacylé (site A) situé en 3' de l'ARN ribosomique 16S. Au cours de ce travail de thèse, les structures de trois complexes entre des fragments d'ARN incorporant le site A et les aminoglycosides paromomycine, tobramycine et généticine, ont été résolues par cristallographie aux rayons X à 2,40-2,54 Å. L'analyse des structures montre que la reconnaissance et la fixation spécifiques des aminoglycosides au site A font intervenir de nombreuses liaisons hydrogène directes et pontées par des molécules d'eau. Dans ces structures, la partie néamine commune aux aminoglycosides (cycles I et II) s'intercale dans l'hélice de manière similaire : le cycle I (non plan) forme une pseudo paire de bases avec l'adénine 1408 ; la néamine oblige les adénines 1492 et 1493 à pointer hors de l'hélice. La comparaison des structures 3D de ces trois complexes offre des explications moléculaires aux différents résultats de biochimie et de microbiologie, ainsi qu'à certains phénomènes de résistances et de toxicités. Les conformations du site A et des aminoglycosides au sein de ces complexes sont similaires à celles du site A et de la paromomycine au sein de la sous-unité ribosomique 30S. Ainsi, la stratégie développée permet une description des interactions et des modes de fonctionnement des aminoglycosides proche du contexte naturel mais plus précise, essentielle à notre connaissance du système ARN/aminoglycoside. De ces résultats découlent des lignes directrices laissant envisager sous un jour nouveau la conception d'antibiotiques moins sujets aux résistances et moins toxiques.

La modification posttranscriptionnelle des acides ribonucléiques (ARNs) est une étape de maturation conservée dans tous les domaines du vivant. Mes travaux de thèse ont porté sur la caractérisation fonctionnelle et structurale de flavoenzymes impliquées dans la modification des ARN de transfert (ARNt) : les dihydrouridines synthases (Dus) dictant la formation de dihydrouridine via la flavine mononucléotide (FMN) et TrmFO responsable de la méthylation en C5 de l'uridine 54 via la flavine adénosine dinucléotide (FAD) ainsi que le methylènetétrahydrofolate. Afin d'élucider le mécanisme de TrmFO, nous avons élaboré une apoenzyme grâce à une simple mutation qui est efficacement reconstituée in vitro. Nous avons chimiquement synthétisé l'intermédiaire catalytique qui consiste en un FAD-iminium comportant un methylène sur le N5 de l'isoalloxazine. Cette espèce synthétique a été caractérisée par spectrométrie de masse et absorption UV-visible. La reconstitution de TrmFO avec cette molécule restore l'activité in vitro sur un ARNt transcrit prouvant le rôle du FAD comme agent méthylant via une méthylation réductrice. Dus2 réduit spécifiquement U20 et est constituée d'un Dus domaine néanmoins, chez les mammifères un double-stranded RNA-binding domaine (dsRBD) est présent. Afin de comprendre la fonction de cette organisation modulaire, nous avons montré que seule l'enzyme sauvage est active contrairement aux domaines isolés. Nous avons résolu les structures cristallographiques des deux domaines suggérant une redistribution des charges positives en surface. Ce dsRBD dicte la reconnaissance de l'ARNt en se fixant à la tige acceptrice/Tpsi. Ceci est régulé par une extension N-terminal, mis en évidence par des mutations, des titrations RMN ainsi qu’une structure cristallographique en complexe avec un ARN de 22 nucléotides. Ce travail illustre l’acquisition d’un dsRBD au cours de l’évolution dont la fonction est étendu à la reconnaissance des ARNts
Posttranscriptional modification of ribonucleic acids (RNAs) is a crucial maturation step conserved in all domains of life. During my thesis, I have brought structural and functional insights on flavoenzymes involved in transfer RNA (tRNA) modifications: dihydrouridine synthase (Dus) responsible for dihydrouridine formation using flavin mononucleotide (FMN) and TrmFO responsible for C5 methylation of uridine position 54 relying on flavin adenosine dinucleotide (FAD) and methylenetetrahydrofolate. To elucidate the chemical mechanism of TrmFO we designed an apoprotein via a single mutation that could be reconstituted in vitro with FAD. Furthermore, we chemically synthesized the postulated intermediate active species consisting of a flavin iminium harboring a methylene moiety on the isoalloxazine N5 that was further characterized by mass spectrometry and UV-visible spectroscopy. Reconstitution of TrmFO with this molecule restored in vitro activity on a tRNA transcript proving that TrmFO uses FAD as a methylating agent via a reductive methylation.Dus2 reduces U20 and is comprised of a canonical Dus domain however, mammals have an additional double-stranded RNA-binding domain (dsRBD). To bring functional insight for this modular organization, we showed that only full length human Dus2 was active while its isolated domains were not. tRNA recognition is driven by the dsRBD via binding the acceptor and TΨ stem of tRNA with higher affinity then dsRNA as evidenced by NMR. We further solved the X-ray structures for both domains showing redistribution of surface positive charges justifying the involvement of this dsRBD for tRNA recognition in mammalian Dus2. This was attributed to a peculiar N-terminal extension proven by mutational analysis and an X-ray structure of dsRBD in complex with 22-nucleotide dsRNA. Altogether our work illustrates how during evolution, Dus2 enzymes acquired an engineered dsRBD for efficient tRNA binding via a ruler mechanism