Littérature scientifique sur le sujet « Virus leucemogeni »

Le virus leucemogene bovin (blv) est un retrovirus oncogene. Il ressemble de par sa structure et sa fonction au virus de la leucemie a cellules t chez l'homme (htlv). Le blv induit une expansion chronique de la population b appelee lymphocytose persistante qui est suivie de l'apparition d'un lymphosarcome b rarement chez la vache mais frequemment chez le mouton, notre modele d'experimentation. Comme certains animaux sont resistants a la lymphocytose induite par le blv, nous nous sommes interesses aux parametres viraux et cellulaires susceptibles d'intervenir dans le maintien de l'etat asymptomatique et dans le developpement de la lymphocytose. Aucune relation entre le niveau d'expression des differents arn de la region px (tax-rex, r3 et g4) et l'etat clinique n'est observable. Par contre la reponse de l'hote semble importante puisqu'une diminution de l'expression des arnm codant pour les cytokines il1 et tnf est observee avec le developpement de la lymphocytose. Par ailleurs, nous avons montre que seule la sous population b cd11b + participe au developpement de la lymphocytose et que cette expansion est correlee a l'augmentation de survie des cellules b cd11b + ex vivo, alors que les lymphocytes b cd11b + et b cd11b sont identiquement infectees par le blv. Chez l'homme et la souris les lymphocytes b cd5 et/ou cd11b sont majoritairement impliques dans les leucemies b. Chez la souris, cette population definit un lignage b particulier appele b1. Nous avons mis en evidence des homologies phenotypiques entre la population b1 de la souris et la population b cd11b +. Par contre, fonctionnellement il existe quelque differences. Il existe donc deux populations b chez le mouton, les b cd11b et b cd11b +, et seules ces dernieres sont sensibles a la transformation cellulaire induite par le blv. Nos travaux suggerent qu'il est important desormais d'etudier l'expression virale et les mecanismes de transformation cellulaire dans le contexte particulier des lymphocytes b cd11b +.

A) cette etude a permis de definir au niveau moleculaire les antigenes reconnus par les lymphocytes t cytotoxiques (ctl) specifiques du gross mulv. Les cellules cibles furent construites par une double transfection des cellules l de souris (h-2#k) par des genes h-2 puis par des genes viraux clones. Nos resultats montrent que les produits des genes gyag et env sont reconnus par des ctl specifiques du mulv de gross et que l'intensite de la reaction immunitaire contre chacun des antigenes viraux varie selon le genotype de la souris repondeuse. De plus, l'antigenicite de la proteine de surface cellulaire codee par les genes de l'enveloppe ou de gag varie suivant les antigenes h-2 avec lesquels la proteine virale est associee. D'autre part, les cellules transfectees exprimant un seul gene viral sont immunogenes in vivo et engendrent la resistance contre la greffe subsequente de la tumeur viro-induite. De plus, la specificite et l'intensite de la lyse dues au fait des ctl sont dirigees par des genes en dehors du h-2. B) les lymphocytes t cytotoxiques (ctl) du virus d'immunofeficience humaine (vih), en tuant les cellules infectees par le virus apparaissent etre tres importants en permettant d'expliquer la resistance contre le vih des patients infectes. Des ctl circulants, specifiques des produits du gene de l'enveloppe (env), ont ete quantifies. Il existe une frequence tres forte de ctl specifiques du vih dans le sang peripherique des patients infectes. Apres une courte periode de culture en presence de l'antigene de l'enveloppe, le nombre de ctl specifiques du vih augmente, suggerant la forte immunogenicite de l'enveloppe du vih. Ces cellules lytiques sont des ctl classiques, expriment les marqueurs cd3, cd8 et d44 et sont restreintes par les antigenes du complexe majeur d'histocompatibilite hla de classe i. Les patients infectes possedent aussi des ctl specifiques circulants diriges contre les produits

Le virus htlv-i retrovirus isole chez l'homme en 1980 est endemique au japon, dans la region caraibe, en amerique du sud et en afrique intertropicale. Dans ces regions 1 a 30% de la population generale a des anticorps seriques anti-htlv-i. Ce virus est l'agent etiologique de la leucemie t de l'adulte (atl) et d'une neuromyelopathie chronique denommee paraparesie spastique tropicale/myelopathie associee a l'htlv-i (tsp/ham). Ce travail realise entre 1983 et 1991 comporte quatre etapes successives. 1) dans un travail initial d'epidemiologie clinique et de terrain, j'ai participe a la decouverte de l'association entre htlv-i et tsp/ham, lien qui a ete confirme par la suite dans de nombreuses zones d'endemie virale. Nous avons par ailleurs decrit la presence de ce type de pathologie en afrique noire et en france metropolitaine. Enfin le lien de causalite entre ce virus et les tsp/ham a ete demontre par l'etude d'un cas post-transfusionnel. 2) nous avons ensuite isole et caracterise sur le plan immunologique, biochimique et moleculaire le virus htlv-i present chez les patients ayant une tsp/ham et montre qu'il etait similaire a celui que l'on peut isoler chez des patients ayant un atl. 3) par la suite, nous avons demontre l'existence d'une charge virale importante au niveau des cellules mononucleees du sang peripherique de ces patients et demontre que paradoxalement il existait a ce niveau une tres faible expression virale. 4) enfin dans un travail d'epidemiologie moleculaire, nous avons sequence une portion du gene d'enveloppe de l'htlv-i chez des sujets ayant soit une tsp/ham, soit un atl soit etant seropositifs. Les resultats sont les suivants: ? la variabilite in vivo de l'htlv-i au cours du temps chez un meme individu ou chez differents hotes successifs est tres faible voire nulle sur une periode de quelques annees, ? les rares changements nucleotidiques observes sont similaires dans les souches virales de meme origine geographique, ? aucune mutation specifique d'une pathologie hematologique ou neurologique n'a pu etre mise en evidence, ? il existe des variants moleculaires de l'htlv-i en afrique (zaire) et surtout en melanesie. ? les virus htlv-i de melanesie, dont nous avons sequence dans sa totalite l'un d'entre eux, sont les htlv-i les plus distants connus par rapport aux souches prototypes. ? la faible variabilite genetique in vivo de l'htlv-i peut etre utilisee comme un outil moleculaire pour suivre la transmission de ce virus chez differents hotes successifs mais aussi pour mieux comprendre les anciens mouvements de populations comportant des sujets infectes par ce virus

Le retrovirus leucemogene murin f-mulv, competent pour la replication, entraine des leucemies myeloblastiques apres un temps de latence de plusieurs mois. L'infection de culture de cellules medullaires par ce virus entraine la transformation des cellules de la lignee myeloblastique apres une latence equivalente. En utilisant une sonde specifique du f-mulv, l'analyse du spectre d'integration des provirus dans les lignees obtenues in vitro a montre qu'il y a proliferation d'un clone cellulaire tres tot pendant le processus de leucemogenese. Une banque d'adn genomique a ete construite a partir d'une lignee ayant 5 provirus integres; les f-mulvs s'integrent preferentiellement dans 3 regions appelees fim-1, fim-2 et fim-3, fim-2 est la partie 5' de l'oncogene c-fms qui code pour le recepteur au csf1. L'integration d'un f-mulv dans la gene fim-2/cfms entraine sa surexpression sans apparente modification de structure. Role possible d'un recepteur a facteur de croissance physiologique dans un processus leucemogene

Le virus leucemogene myeloproliferatif murin ou mplv est un retrovirus leucemogene murin qui provoque in vivo un syndrome myeloproliferatif aigu. In vitro, il entraine l'immortalisation de precurseurs des differentes lignees hematopoietiques qui proliferent et se differencient en l'absence de facteurs de croissance. Le mplv derive du virus f-mulv dont il differe par sa region enveloppe fortement remaniee. Un provirus mplv biologiquement actif a ete clone moleculairement. L'analyse de la sequence de son gene enveloppe a montre qu'il a subi deux deletions et qu'il contient une sequence non virale nommee v-mpl. Cette sequence, conservee chez les mammiferes, a ete localisee sur le chromosome 4 de la souris et en 1p34 chez l'homme. Mpl ne correspond a aucun gene connu mais appartient a la superfamille des recepteurs de facteurs de croissance hematopoietiques depourvus d'activite kinase. Le gene c-mpl est exprime dans les organes hematopoietiques. Des adnc de ce gene ont ete clones chez l'homme et chez la souris. Chez l'homme, deux familles d'adnc ont ete isoles. Ils coderaient pour des proteines differant par leur region cytoplasmique. Chez la souris, des clones codant pour une proteine transmembranaire ou pour une proteine soluble ont ete isoles. Ces differents adnc sont probablement generes par epissages alternatifs et certaines de ces formes pourraient moduler la fonction normale du recepteur ou intervenir de facon differente dans la transmission du signal par ce recepteur. Le v-mpl est une version fortement tronquee mais non mutee du c-mpl murin. Il s'agit du premier exemple de transduction retrovirale d'un gene de la superfamille des recepteurs de facteurs de croissance hematopoietiques

La leucemie erythroblastique de friend est une leucemienurine aigue provoquee par un complexe retroviral (sffv-mulv). Cette maladie evolue en 2 etapes successives: une etape precoce au cours de laquelle les organes hematopoietiques des animaux infectes sont envahis par des cellules proerythroblastiques a duree de vie breve qui differencient en globules rouges en absence d'erythropoietine ou meurent "in situ"; une etape tardive au cours de laquelle apparaissent des cellules cancereuses qui croissent indefiniment "in vivo" et "in vitro". La transformation maligne resulte d'un processus clonal ou oligoclonal. Des sites d'integration du sffv ont permis d'identifier un locus genonique denomme spi-1 pour sffv provirus spi-1 est different des oncogenes connus et des sites d'insertin provirale decrits. Ceci suggere que le rearrangement de ce locus genomique est un evenement initial dans le processus de la tumorigenese au cours de la leucemie de friend

L’attività di ricerca svolta in questa tesi ha riguardato due diversi progetti. Il primo concerne il problema della coinfezione da parte del retrovirus HTLV-2 di soggetti tossicodipendenti italiani che sono infettati da HIV-1, allo scopo di comprendere l’interazione tra i due retrovirus a livello cellulare e stabilire quale possa essere l’effetto sulla progressione dell’AIDS. Il secondo è centrato sullo studio e della funzione delle proteine Tax di HTLV-1 (Tax-1) e HTLV-2 (Tax-2) e sulla caratterizzazione, mediante mutagenesi, dei domini proteici specifici che modulano la funzione stessa. Il primo progetto ha comportato la messa a punto di analisi di PCR quantitativa e la determinazione del carico provirale di HTLV-2 in diversi soggetti infettati e la caratterizzazione molecolare degli isolati di HTLV-2. Dalle analisi compiute sulla popolazione coinfettata e monoinfettata da HIV-1 è risultato che il numero di pazienti “long-term non progressors” verso l’ AIDS è significativamente più alto nel gruppo dei coinfetti HIV-1/HTLV-2 rispetto a quello dei monoinfetti HIV-1. Questi dati indicano chiaramente che HTLV-2 ha un effetto protettivo contro la progressione dell’AIDS. Nel gruppo dei soggetti coinfettati da HIV-1/HTLV-2 sono stati seguiti 5 pazienti sottoposti a terapia antiretrovirale per HIV-1 ed è stato riscontrato un significativo aumento del carico provirale di HTLV-2 e un concomitante decremento in viremia HIV-1 in seguito al trattamento. Questi dati suggeriscono che la terapia antivirale contro l’HIV-1 è inefficace a contenere l’infezione da HTLV-2. La prima parte del secondo progetto ha riguardato l’analisi della localizzazione di Tax-2. A tal fine, il gene tax-2 è stato clonato in un vettore di espressione per cellule di mammifero, aggiungendo in frame all’estremità Cterm la “Green Fluorescent protein” (GFP). L’espressione transiente in cellule HeLa e 293T e la rilevazione tramite microscopia a fluorescenza hanno evidenziato una distribuzione citoplasmatica della proteina in forma punteggiata. Lo stesso procedimento è stato eseguito su mutanti della stessa proteina troncata progressivamente all’estremità C-term e fusa con GFP: 331-GFP, 156- GFP, 115-GFP, 60-GFP. Le immagini al microscopio a fluorescenza hanno confermato una localizzazione di Tax-2 a livello citoplasmatico, ad eccezione del clone 60-GFP, il quale risulta esclusivamente nucleare. L’ulteriore riduzione della proteina ai primi 33 aa mostra una distribuzione della fluorescenza diffusa a tutta la cellula, simile a quella ottenut a dall’espressione della sola proteina GFP. Questi dati confermano la presenza di un “nuclear localization determinant” (NLD) nei primi 60 aa della proteina. Al fine di caratterizzare più precisamente questa parte di Tax-2, sono stati analizzati numerosi mutanti per piccole delezioni aminoacidiche sul clone 60-GFP. Tutti i cloni analizzati, ad eccezione di quello che presenta la delezione 17-20, hanno mostrato una localizzazione nucleare, indicando che mutazioni puntiformi non sono in grado di perturbare la funzionalità del NLD. È stato possibile infine circoscrivere ulteriormente il NLD agli aa 1-41 in quanto, togliendo i primi 21 aa, si riscontra la perdita di funzionalità del NLD stesso. La seconda parte del progetto, riguardante la funzione della proteina Tax, è stata centrata sull’analisi comparativa della localizzazione cellulare di Tax-1 e Tax-2. Per fare questo sono stati clonati i geni tax-1 e tax-2 aggiungendo in frame all’estremità C-term delle proteine dei tag di diverso tipo: la GFP, la Yellow Fluorescent Protein (YFP) (~27 KDa), la proteina Halo (~30 KDa) ed una sequenza aminoacidica di 32 aa contenente l’epitopo V5 (~3 KDa). I cloni di Tax-1, -GFP, -YFP, -Halo e -V5 hanno mostrato una localizzazione prevalentemente nucleare, mentre i cloni di Tax-2, -GFP, -YFP e -Halo sono risultati prevalentemente citoplasmatici. Quando Tax-2 è stata clonata ed espressa con un tag di minor dimensioni quale V5, si è ottenuta una localizzazione prevalentemente nucleare. Questi risultati hanno permesso di dimostrare che l’utilizzo di tag di diverse dimensioni può modulare diversamente la localizzazione delle due proteine, in particolar modo Tax-2. Per identificare le regioni delle due proteine coinvolte nella regolazione della localizzazione cellulare, sono stati fatti esprimere mutanti sia di Tax-1 che di Tax-2 progressivamente troncati all’estremità C-term e fusi con il tag V5. Mettendo a confronto le immagini al microscopio confocale di questi mutanti è stata osservata una distribuzione cellulare molto simile per Tax-1 e Tax-2, anche nelle rispettive forme troncate: prevalentemente nucleari per Tax-1 e Tax-2 “full-length”e per la forma 1-340 e nucleo-citoplasmatiche per gli altri mutanti troncati di dimensioni inferiori. Data la mancanza di un anticorpo specifico contro Tax-2, è necessario di utilizzare sistemi tag per l’espressione ed il riconoscimento di Tax-2 all’interno della cellula per studiarne la localizzazione. Questo ha messo in evidenza che quest’ultima è particolarmente suscettibile alle modificazioni apportate dall’aggiunta di tag in posizione N-term e C-term. Per ovviare a questo problema, si è deciso di preparare costrutti di espressione per Tax-1 e Tax-2 inserendo il tag Flag-H6 all’interno della molecola proteica, tra gli aminoacidi 337 e 338 delle due proteine. Mettendo a confronto la localizzazione di Tax-1 nativa senza tag e quella di Tax-1 utilizzando il tag Flag-H6 in posizione 337, si è visto che questo ultimo non interferisce sui meccanismi che regolano la localizzazione di Tax-1. È stato inoltre possibile stabilire anche per Tax-2 che il tag Flag-H6 posto in posizione 337 permette una corretta lo calizzazione della proteina a livello nucleare. Utilizzando questo sistema di espressione è stato possibile mettere in evidenza alcune caratteristiche funzionali di Tax-2 che non erano ancora state dimostrate. Si è visto infatti che Tax-2 si localizza in modo specifico in strutture nucleari simili ai nuclear bodies (NB) tipici di Tax-1 e che la sua espressione è in grado di determinare un accumulo specifico del fattore RelA di NFKB a livello nucleare nelle stesse strutture. In conclusione questo studio ha permesso di chiarire l’interazione tra HTLV-2 and HIV in soggetti coinfettati ed ha prodotto nuove importanti informazioni sul problema della distribuzione cellulare di Tax-1 e Tax2. Il complesso meccanismo responsabile dell’attività pleiotropica delle due proteine potrà essere chiarito in futuro mediante un'analisi appropriata delle loro modificazioni post-traduzionali
The research activity carried out in this thesis covered two different projects. The first one concerns the problem of the infection by the retrovirus HTLV-2 of Italian intravenous drug users who are also infected by HIV-1, to understand the interaction between the two retroviruses at the cellular level and define the effect of coinfection on AIDS progression. The second is centered on the study and function of Tax proteins of HTLV-1 (Tax-1) and HTLV-2 (Tax-2) and the characterization by mutagenesis of specific protein domains that modulate their function. The first project entailed the development of quantitative PCR analysis and the determination of the proviral load of HTLV-2 in infected subjects and the molecular characterization of HTLV-2 isolates. From the analyses carried out on these subjects it was found that the number of long term non-progressors for AIDS is significantly higher among HIV-1/HTLV-2 coinfected patients than HIV-1 monoinfected cases. These data clearly indicate that HTLV-2 is exerting a protective effect against AIDS progression. Five coinfected subjects undergoing antiretroviral therapy showed a significant increase in HTLV-2 proviral load concomitant to a decrease in HIV-1 viremia, suggesting that the treatment against HIV-1 is ineffective against HTLV-2 infection. The first part of the second project involved the analysis of Tax-2 localization. To this end, tax-2 gene was cloned into an expression vector adding in frame the Green Fluorescent Protein (GFP) to C-term end. The transient expression in HeLa and 293T cells and the detection by fluorescent microscopy revealed that Tax-2 was preferentially distributed in the cytoplasm and formed single dots. To possibly understand the role of C-terminal domain in protein localization, the same expression procedure was performed for Tax-2 mutants progressively truncated at the C-term and merged with GFP: 331-GFP, GFP 156-, 115-GFP, 60-GFP. Fluorescence microscopy confirmed that Tax-2 was localized in the cytoplasm, with the exception of mutant 60-GFP, which was exclusively nuclear. Further reduction to 33 aa fragment showed a widespread cellular fluorescence, similarly that obtained for full length Tax-2-GFP. These data confirmed the presence of a "nuclear localization determinant" (NLD) in the first 60 aa of Tax-2. To more precisely characterize this N-terminal part of the protein, several mutants for single or small amino acid deletions of clone 60- GFP were analyzed. All clones, with the exception of a mutant with 17-20 deletion, presented a nuclear localization, indicating that point mutations are not changing NLD function. Instead, by removing the first 21 aa, NLD function was lost, suggesting that the first 41 aa are necessary for NLD function. The second part of the project on Tax function was centered on the study of comparative cellular localization of Tax-1 and Tax-2. Tax-1 and tax-2 were cloned by adding in frame at C-term different types of protein tags: GFP, Yellow Fluorescent Protein (YFP) (~ 27 KDa ), Halo protein (~ 30 KDa) and a sequence of 32 amino acid containing the epitope V5 (~ 3 KDa). The expression of Tax-1, -GFP, -YFP, -Halo and -V5 showed a predominantly nuclear localization, whereas that of Tax-2 linked to GFP, YFP or Halo was predominantly cytoplasmic. When Tax-2 was cloned and expressed using the small tag V5, a predominantly nuclear localization was obtained. These results demonstrated that using tags of different sizes can induce different localizations of the two proteins. To identify the regions of the two proteins involved in regulating cellular localization, Tax-1 and Tax-2 mutants progressively truncated at the C-term and merged with the tag V5 were constructed and expressed. A very similar cellular distribution for Tax-1 and Tax-2 was obtained, as visualized by confocal microscopy: predominantly nuclear for both Tax-1 and Tax-2 full length and 1- 340 forms and cytoplasmic for truncated mutants below the first 300 aa. Since no adequate antibody is available to recognise native Tax-2 expression inside the cell, adding a tag to the terminal parts of the protein becomes necessary, though these conformational changes could result in abnormal localization effect. It was thus decided to prepare constructs for Tax -1 and Tax-2 expression by inserting internally to the protein structure the tag Flag- H6 between amino acids 337 and 338. By comparing the localization of native Tax-1 without tags and Tax-1 with the 337 Flag-H6, it was found that this does not interfere with the mechanisms regulating Tax-1 localization and function. It was also found that 337 Flag-H6 presented a nuclear localization and was adequately functional. Using this expression system allowed to show that also Tax-2 is located in specific nuclear complexes that are similar, but not identical, to the nuclear bodies (NB) formed by Tax-1 and that their expression is responsible for a specific accumulation of RelA NFKB factor at nuclear level. In conclusion, this study has allowed further understanding of the crossinteraction between HTLV-2 and HIV in coinfected subjects, and has given new important clues on the problem of cellular distribution and function of Tax-1 and Tax-2. The complex mechanisms that are responsible for the pleiotropic activities of the two proteins will be further clarified in the future by investigating their post-translational modifications.