Thèses sur le sujet « Validazione metodo »

Il presente lavoro di tesi si pone nell'ambito dell'analisi dati attraverso un metodo (QDanet_PRO), elaborato dal Prof. Remondini in collaborazine coi Dott. Levi e Malagoli, basato sull'analisi discriminate a coppie e sulla Teoria dei Network, che ha come obiettivo la classificazione di dati contenuti in dataset dove il numero di campioni è molto ridotto rispetto al numero di variabili. Attraverso questo studio si vogliono identificare delle signature, ovvero un'insieme ridotto di variabili che siano in grado di classificare correttamente i campioni in base al comportamento delle variabili stesse. L'elaborazione dei diversi dataset avviene attraverso diverse fasi; si comincia con una un'analisi discriminante a coppie per identificare le performance di ogni coppia di variabili per poi passare alla ricerca delle coppie più performanti attraverso un processo che combina la Teoria dei Network con la Cross Validation. Una volta ottenuta la signature si conclude l'elaborazione con una validazione per avere un'analisi quantitativa del successo o meno del metodo.

Questo elaborato tratta la convalida di un metodo per l’analisi delle sostanze correlate presenti in un preparato farmaceutico. Il prodotto analizzato è il propranololo HCL 160 mg dose. Le prove sono state effettuate nel laboratorio di controllo qualità della Valpharma International (Pennabilli (RN) Italia). Il metodo studiato era già stato convalidato dalla farmacopea europea, di conseguenza ci si aspettava che risultasse idoneo all’uso per cui è stato creato. Tuttavia le variabili che entrano in gioco durante l’esecuzione di una procedura sono numerose e non tutte prevedibili. Nasce da qui l’esigenza di riconvalidare il metodo anche all’interno dei laboratori aziendali.

Sono stati sviluppati metodi per determinare differenti sostanze organiche presenti in matrici acquose di diversi tipi, utilizzando la cromatografia come tecnica. Dopo lo sviluppo, questi metodi sono stati studiati per una possibile validazione, verificando le prestazioni.

Il presente lavoro di tesi è finalizzato alla messa a punto e validazione di un metodo analitico per la determinazione degli etil esteri degli acidi grassi (EEAG) in oli di oliva vergini, proponendo un approccio alternativo a quello ufficiale, definito dal Reg. UE 61/2011. La sperimentazione riguarda l’ottimizzazione di una metodica preparativa mediante HPLC-UV, raccogliendo manualmente la frazione contente gli EEAG (frazione di interesse) in uscita dalla colonna. Risulta così possibile sostituire la tradizionale cromatografia liquida su colonna in vetro, impaccata manualmente, proposta dal metodo ufficiale, riducendo i volumi di solventi necessari ed i tempi di analisi previsti dal metodo ufficiale per la determinazione di tali analiti. In una prima fase, quindi, sono state determinate le condizioni analitiche ottimali, al fine di ottenere la migliore separazione degli analiti di interesse, in quanto sono composti minoritari degli oli di oliva vergini ed è quindi necessario raccoglierne una quantità che possa permettere la successiva separazione, identificazione e quantificazione mediante GC-FID. Per poter valutare l’efficacia del protocollo analitico alternativo, questo è stato sottoposto ad una validazione in-house. A tale fine sono stati valutati alcuni parametri necessari per la validazione di un metodo analitico, quali ripetibilità, riproducibilità, linearità, limite di rivelazione (LOD) e limite di quantificazione (LOQ), robustezza, accuratezza e precisione.

Le micotossine sono contaminanti significativi negli alimenti e nei mangimi e sono causa di gravi effetti tossici sulla salute umana e animale. Diversi studi hanno dimostrato l’esistenza di una moltitudine di metaboliti fungini che contaminano alimenti e mangimi. Recentemente, le autorità sanitarie internazionali hanno espresso preoccupazione per la presenza di micotossine "emergenti" negli alimenti. Tra le specie fungine responsabili della produzione di tali metaboliti, la specie Alternaria ha la capacità di produrre più di 70 tossine, come Alternariol (AOH), Alternariol monomethyl ether (AME), Tenuazonic Acid (TeA) e Tentoxin (TEN), presenti nei cereali, in prodotti a base di pomodoro, nell’olio d'oliva, nella frutta e nella verdura fresca. Queste micotossine sono state recentemente oggetto di pareri scientifici dell'Autorità Europea per la Sicurezza Alimentare (EFSA), che ha espresso preoccupazione per la scarsa disponibilità di dati sull'incidenza negli alimenti destinati al consumo umano e animale. Esiste, infatti, un alto grado di incertezza legato alla rappresentatività degli alimenti attualmente testati. Inoltre, la mancanza di informazioni sul metodo analitico utilizzato contribuisce ulteriormente a creare incertezza sui livelli di tossine da Alternaria. Sono necessari ulteriori studi per aggiornare la valutazione del rischio da parte dell'EFSA e, pertanto, l'obiettivo specifico di questo progetto era incentrato sullo sviluppo di metodi LC-MS/MS e LC/HRMS accurati per l'analisi delle tossine da Alternaria. Il progetto è stato sviluppato in collaborazione con l'Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia. Il metodo LC-MS/MS è stato utilizzato per l'analisi target delle micotossine emergenti nelle matrici alimentari. In particolare sono state svolte le seguenti attività: • ottimizzazione dei parametri del metodo per lo screening simultaneo di Alternariol (AOH), Alternariol monometiletere (AME), Acido tenuazonico (TeA), Ocratossine e Zearalenone (ZEA), Fumonisina B1, B2, B3, tossina T-2, HT-2 tossina e deossinivalenolo (DON) (vomitossina); • sviluppo di un protocollo di preparazione del campione, da applicare a cereali e frutta secca; il protocollo di preparazione del campione si è basato su una doppia estrazione (estrazione liquida) e purificazione mediante estrazione in fase solida (SPE). • validazione del metodo secondo le linee guida comunitarie (Decisione della Commissione 2002/657/CE); il metodo è stato ottimizzatoo valutando i seguenti parametri: specificità, precisione, linearità strumentale, recupero, limite di decisione (CCα), capacità di rilevamento (CCβ), effetto matrice e robustezza. La cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (UHPLC-Q-HRMS) è stata utilizzata per la determinazione, sensibile e specifica, delle tossine da Alternaria. Le prestazioni ottenute sono state confrontate con quelle ottenute mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni. Tutti e due i metodi hanno mostrato una buona linearità e ripetibilità. Si dice che lo spettrometro di massa Q-Exactive sia più adatto per il rilevamento in tracce rispetto ai metodi MS/MS basati sul triplo quadrupolo, perché, nonostante abbia prestazioni comparabili, ha una migliore selettività. Il progetto di ricerca avrebbe dovuto fornire un'ampia indagine sul contenuto emergente di micotossine in vari prodotti alimentari, contribuendo a una stima dell'esposizione al rischio di micotossine. Le difficoltà legate alla pandemia in corso hanno reso difficile la ricerca, inizialmente prevista in questo progetto. Nonostante tutto, lo scopo di questo lavoro è stato colmare il vuoto di dati e fornire informazioni rilevanti per migliorare la sicurezza dei prodotti locali.
Mycotoxins are significant contaminants in food and feeds. These molecules have demonstrated serious effects in both human and animal health. Different studies showed the presence of a multitude of fungal metabolites that contaminate food and feed. Recently, the international health authorities have expressed concerns about the presence of "emerging" mycotoxins in foodstuffs. The term “emerging mycotoxins” is commonly referred to those compounds that are currently under the spotlight of the scientific community and the policy-makers, due to their toxicological profile. Among the fungal species responsible for the metabolite production, Alternaria species have the ability to produce more than 70 toxins, such as Alternariol (AOH), Alternariol monomethyl ether (AME), Tenuazonic Acid (TeA) e Tentoxin (TEN), found in cereals, tomato products, olive oil, fresh fruits and vegetables. These mycotoxins have been recently covered by scientific opinions from the European Food Safety Authority (EFSA), who has expressed concern about the low availability of incidence data in food for human and animal consumption. There is, indeed, a high degree of uncertainty related to the representativeness of the food currently tested because it contains too many inaccuracies. Furthermore, the lack of information on the analytical method used further contributes to the uncertainty of the reported Alternaria toxin levels. More comprehensive studies are required to update the risk evaluation by the EFSA and, therefore, the specific aim of this project was focussed on the development of accurate LC-MS/MS and LC/HRMS methods for the analysis of emerging Alternaria toxins. The protocol was employed in collaboration with the Istituto Zooprofilattico Sperimentale della Sicilia. LC-MS/MS method was used for the target analysis of emerging mycotoxins in food matrices. In particular, the following activities were carried out: • optimisation of the method parameters for simultaneous screening of Alternariol (AOH), Alternariol monomethyl ether (AME), Tenuazonic Acid (TeA), Ochratoxins and Zearalenone (ZEA), Fumonisin B1, B2, B3, T-2 toxin, HT-2 toxin and deoxynivalenol (DON) (vomitoxin); • development of a sample preparation protocol, apply to cereals and dry fruits; the sample preparation protocol was based on a double extraction (Liquid extraction) and purification through solid-phase extraction (SPE). • validation of the method according to EU guidelines (Commission Decision 2002/657/EC); the method was performed by evaluating the following parameters: specificity, precision, instrumental linearity, recovery, decision limit (CCα), detection capability (CCβ), matrix effect and ruggedness. The ultrahigh-performance chromatography coupled to quadrupole-orbitrap high-resolution mass spectrometry (UHPLC-Q-HRMS) was applied to the sensitive and specific determination of the emerging Alternaria toxins. Performances were compared to those obtained by high-performance liquid chromatography detection. All two methods showed good linearity and repeatability. The Q-Exactive mass spectrometer is said to be better suitable for trace detection than state-of-the-art MS/MS methods based on the triple quadrupole, because, despite having performance comparable, it has better selectivity. The research project should have provided a broad investigation of the emerging mycotoxin content in various food products, contributing to an estimate of mycotoxin risk exposure. The difficulties linked to the pandemic in progress made difficult research, initially planned within this project. Despite everything, the purpose of this work was to fill the data gap and provide relevant information to improve the safety of local products.

Sin dal 1990 l'apparizione sul mercato di nuove sostanze psicoattive (NPS) è un fenomeno mondiale sempre crescente. Ogni anno vengono introdotte nuove sostanze nel mercato della droga come alternative legali alle sostanze controllate dalla legge. L’identificazione di queste nuove sostanze in matrici biologiche rappresenta una continua sfida per i laboratori di analisi. È estremamente importante sviluppare metodologie analitiche in grado di identificare sostanze sconosciute consentendone il monitoraggio e fornendo informazioni scientifiche riguardo la farmacocinetica, possibili range di tossicità ed effetti farmacologici. Oggi, le tecniche cromatografiche ifenate (tecniche basate sull’accoppiamento di più strumentazioni) sono dei mezzi molto utilizzati nella tossicologia clinica e forense. Il seguente progetto di ricerca ha lo scopo di sviluppare e validare nuovi metodi analitici basati su tecniche cromatografiche accoppiate alla spettrometria di massa e spettrometria di massa tandem per la determinazione delle NPS e delle classiche droghe d’abuso in matrici biologiche. In particolare, considerando la poliassunzione di droghe, è stato sviluppato un metodo di screening utilizzando la cromatografia liquida ad alta prestazione abbinata alla spettrometria di massa tandem (HPLC-MS-MS) per la determinazione di 77 NPS (appartenenti a diverse classi di sostanze), 24 droghe classiche e 18 metaboliti nel sangue, in urina e saliva. Attualmente, i cannabinoidi sintetici sono il più grande gruppo di NPS monitorato dall’Agenzia Europea per le Droghe (EMCDDA ). Due nuovi metodi analitici sono stati sviluppati per la determinazione dei cannabinoidi sintetici JWH-122, JWH-210 e UR-144 in saliva: un metodo in gascromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS) e un metodo complementare che utilizza la cromatografia liquida ad alta prestazione abbinata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (UHPLC-HRMS) per la quantificazione sia dei parent drugs che dei loro metaboliti. Infine, in risposta alla crescente diffusione di nuovi catinoni sintetici, viene presentato un metodo mirato per la loro identificazione e quantificazione mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni e spettrometria di massa ad alta risoluzione (UHPLC-HRMS). Tutti i metodi qui descritti sono stati validati con successo e applicati a campioni reali (sangue, urina, saliva, capelli) fornendo risultati affidabili e dimostrando di essere metodologie sensibili utilizzabili in laboratori clinici e forensi.
The emergence of new psychoactive substances (NPS) has been a growing global phenomenon since 1990. Every year new substances appear into the drug market as legal alternatives to illicit drugs. In this regard, the identification in biological matrices of emerging synthetic compounds represents a continuous challenge for analytical toxicologists. It is extremely important to develop suitable drugs analysis methodologies which can provide information on pharmacokinetics, pharmacodynamics effects and possible toxic concentration ranges, and on the diffusion of these unknown substances. Hyphenated chromatographic techniques have become powerful tools largely used in clinical and forensic toxicology. This research project aimed to develop and validate new analytical methodologies based on hyphenated chromatographic techniques for the determination of NPS and classical drugs of abuse in biological matrices. Considering the polydrug consumption, a comprehensive high-performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry (HPLC–MS-MS) screening method was developed for the determination of 77 NPS (belonging to different chemical classes), 24 classic drugs and 18 related metabolites in blood, urine, and oral fluid. Currently, synthetic cannabinoids are the largest group of NPS monitored by the European Monitoring Centre for Drugs and Drug Addiction and to investigate the oral fluid pharmacokinetics of JWH-122, JWH-210 and UR-144 two new methodologies were developed. A gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) method for the determination of parent compounds and a complementary ultra-high performance liquid chromatography high resolution mass spectrometry (UHPLC-HRMS) confirmatory method for the quantification also of their metabolites. Finally, to keep in pace with the increasing spread of new synthetic cathinones an ultra-high performance liquid chromatography high resolution mass spectrometry (UHPLC-HRMS) method is presented for their simultaneous targeted screening and quantification in hair samples of consumers. All methods described here have been successfully validated and applied to authentic samples (blood, urine, oral fluid, hair) providing reliable results and proving to be sensitive methodologies suitable for use in clinical and forensic laboratories.

A chronic systemic inflammation is reported to be involved in atherosclerosis, coronary heart disease, diabetes and the metabolic syndrome. Evidences suggest that elevated levels of circulating pro-inflammatory markers (interleukin 6, C-reactive protein and tumor necrosis factor alpha) are risk factors for many chronic diseases (Battezzati A, 2005). Food choices play an important role because of macro and micronutrients may interact with human body producing specific metabolic and inflammatory responses relevant to the prevention of chronic-degenerative diseases (Dauchet L, 2009, Pelucchi C, 2009). Particularly, fruit and vegetable provide measurable amounts of bioactive compounds, such as Salicylic acid (SA) that is an ubiquitous hormone in plants. Circulating SA in human is related to fruit and vegetable consumption [Spadafranca et al 2006]. However, only few studies report the effect of acute meal administration on the blood concentrations of salicylic acid. The aim of this study therefore was to investigate the short-term effect of a single meal of fruit on blood concentrations of salicylic acid and the effects of fruit intake on metabolic and inflammatory parameters are unknown. Based on these considerations, a simple, highly selective, and sensitive method using stable isotope dilution and gas chromatography–mass spectrometry has been developed to quantify Salicylic acid and Ferulic acid at concentrations naturally occurring in human serum. This method involves: • deproteinization with ACN; • enzymatic hydrolysis with beta-glucuronidase. • Liquid-liquid extraction with ethylacetate and diethyl ether • derivatization with BSFTA+TMS1% • GC-MS- electron impact-selective ion monitoring analysis. We therefore administrated to 26 healthy subjects a peach shake (PSM), of known SA content and centesimal composition, and an isoglucidic solution (MSM). The evening before the tests Group1 (n=16) abstained from FV consumption; Group2 (n=10) kept a free diet. During the tests circulating SA, glucose, insulin, FFA, IL-6 and CRP were measured. Basal SA was lower (p<0,001) in Group1 (0.09±0.02 μmol/l) than in Group2 (0,30±0,03 μmol/l). After PSM, SA peaked at 90 min in Group1 (0,18±0,01 μmol/l, p<0.01) and Group2 (0,38±0,02 μmol/l, p<0.05) and remained above baseline (p<0.05) up to 3 hours. Glycemia increased more slowly with PSM than MSM (+9,69±0,70 vs +28,21±3,15 mg/dl at 15 min, p<0.01) with a lower average glucose excursion (p<0.05). Insulin peaked at 45 min with PSM and MSM (41,49±5,94 vs 38,40±5,56 µIU/ml) and decrease less rapidly with PSM. FFA were percentually more suppressed (p<0,01) after PSM. IL-6 increased less (p<0.05) with PSM than MSM. CRP was similar between the meals. In conclusion, peach consumption increases circulating SA for more than three hours. Compared to a watery carbohydrates mix, fruit results in a slower plasma glucose increment, and a lower glucose excursion a smaller increment of inflammatory cytokines. Our results confirm that SA is normally present in the blood of people that does not take salicylates drugs. Fruit and vegetables are the main dietary sources of SA and subjects on a free diet, showed concentrations of SA three times higher than individuals who abstained from fruit and vegetables consumption. However, we noticed that SA is still present in blood in individuals who abstained from eating fruits and vegetables in the previous twelve hours. This phenomenon could be due to the long half-life of SA (Hare LG, 2003) either to endogenous metabolic pathways as recently suggested by Paterson (Paterson JR, 2008). Moreover it is interesting to notice that the concentrations of SA achieved in our study are similar to those found by Xu et al (Xu, 1999) to be effective in inhibiting COX-2 gene transcription in HUVE cells. Even though ASA is clinically used at doses that are two orders of magnitude greater than the doses naturally delivered in our study, we demonstrated that after a fruit meal, basal circulating SA may be reach concentrations comparable with those found by Blacklock et al, 2001 in vegetarians and may overlap those of subjects chronically taking aspirin 75 mg/die.

Diagnostic test validation is challenge for the clinical pathologist when a new instrument or a new analyzer is introduced in the lab. The aim of this work is to assess the analytical and/or clinical performances of novel biomarker to evaluate a possible application as a useful marker in veterinary medicine. Four different objectives are investigate: 1. Haematological parameters: two new gates are draw, in particular a “high fluorescent region” to identify canine blood samples with cell of probable neoplastic origin that need further investigation and a gate to identify “high fluorescent platelet fraction” in macrothrombocytopenic Norfolk terrier. Both gates are useful to perform a correct diagnosis with a better outcome for the patients. 2. Inflammatory markers: the measurement of dROMs (derivative of reactive oxygen metabolites) in serum of dogs with leishmaniasis showe a strong involvement of these compounds in the symptomatic or the asymptomatic Leishmania infections, and could be use to identify dogs with sub-clinical forms. Another studies involve the validation of a new test for IFN-γ measurement after incubation of feline leukocytes with immunogenic peptides. This study is from one side a draw up of a new test with consequently assessment of analytical performances, and from another side a pathogenic study about FIP infection in cats. The paraoxonase 1 activity in dogs is the last inflammatory maker investigated, and results show a probable biological behaviour as a negative acute phase protein. 3. Hypertension markers: homocysteine and entothelin-1 (ET-1). Hypertension usually is secondary to diseases that indirectly could affect the systemic pressure, mainly renal and heart diseases. Homocysteine appears increased in dogs with both heart and kidney disease, but the clinical usefulness and the sensibility is not enough for positive impact on patient management. ET-1 appeared with higher sensibility and specificity in dogs with chronic kidney diseases and with hypertension, and its related with the severity of disease and could be a useful marker for the monitoring the follow up. 4. Development of new methods to investigate sialic acid characteristics and to assess if the different molecules bind to sialic acid molecules could interact with the development of the pathology. Results show an increased metastatic potential when sialic acid has α2,6 conformation in dogs with mammary tumour, and in cats the total sialic acid serum concentration is related to the immune response of cats during Coronavirus infections. 5. At last, evaluation of analytical performances of urine protein-to-creatinine ratio: it’s a commonly used test, but this study revealed a high imprecision that could affect test results.

The research project focused on the development and validation of an analytical method for the combined determination of the concentration in ambient air of 3 of the most used diisocyanates in the workplace: 1,6-hexamethylene diisocyanate (1,6-HDI) , 4,4'-diphenylmethane diisocyanate (4,4'-MDI) and 2,6-toluen diisocyanate (2,6-TDI). The analytical method was developed based on procedures indicated by the Occupational Safety and Health Administration (OSHA, ID OSHA 42 and ID OSHA 47) using high performance liquid chromatography coupled with a fluorimetric detector. The method has been validated and has been shown to have adequate sensitivity and precision for the analysis of real samples, in the context of environmental monitoring for the determination of the airborne concentrations of these substances. The method was then applied in determining the environmental concentration levels of 1.6-HDI, 4,4'-MDI and 2,6-TDI, as part of two monitoring campaigns, in two different work contexts. A further aim of the research project was the development and validation of analytical methods for the determination of urinary concentrations of 1,6-HDI, 4,4'-MDI and the two TDI isomers, 2, 4- and 2,6-TDI, or the corresponding diamines. For this purpose, gas chromatography coupled to the mass spectrometer detector was used as a separation and analytical identification technique. The method was identified starting from a comparison of the scientific literature on the subject and the indications provided by one of the most important sector agencies, the American Conference of Governmental Industrial Hygienists (ACGIH). The optimal analytical conditions were identified by conducting a series of tests, first in organic solvent and then in the urinary matrix of subjects not professionally exposed to diisocyanates or solvents. The urinary test matrix was treated by high temperature acid hydrolysis, as indicated by the majority of the work reported in the literature and in accordance with the indications in the ACGIH Documentation for the analysis of urinary samples of workers exposed to TDI and HDI. The 3 methods developed have been validated and have returned a sensitivity and precision appropriate to the determination of the concentration levels of the diamines of diisocyanates covered by the present research project. To date, it has been possible to apply these methods for the evaluation of the recorded internal dose for samples of patients exposed to bronchial provocation tests specific for the diagnosis of occupational asthma.
Il progetto di ricerca si è incentrato sulla messa a punto e sulla validazione di una metodica analitica per la determinazione combinata della concentrazione in aria ambiente di 3 dei diisocianati maggiormente utilizzati in ambito lavorativo: 1,6-esametilen diisocianato (1,6-HDI), 4,4’-difenilmetano diisocianato (4,4’-MDI) e 2,6-toluen diisocianato (2,6-TDI). Il metodo analitico è stato sviluppato a partire da procedure indicate dall’Occupational Safety and Health Administration (OSHA; ID OSHA 42 e ID OSHA 47) utilizzando la cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata a un rivelatore fluorimetrico. Il metodo è stato validato e ha dimostrato di avere sensibilità e precisione adeguate per l’analisi di campioni reali, nell’ambito di monitoraggi ambientali per la determinazione delle concentrazioni aerodisperse di tali sostanze. Il metodo è stato quindi applicato nella determinazione dei livelli di concentrazione ambientale di 1,6-HDI, 4,4’-MDI e 2,6-TDI, nell’ambito di due campagne di monitoraggio, in due diversi contesti lavorativi. Ulteriore scopo del progetto di ricerca è stata la messa a punto e la validazione di metodiche analitiche per la determinazione delle concentrazioni urinarie dei metaboliti dell’1,6-HDI, del 4,4’-MDI e dei due isomeri del TDI, 2,4- e 2,6-TDI, ovvero le corrispondenti diammine. A tal fine è stata utilizzata come tecnica di separazione ed identificazione analitica la gascromatografia accoppiata al rivelatore spettrometro di massa. La metodica è stata individuata a partire da una comparazione della letteratura scientifica sull’argomento e dalle indicazioni fornite da una delle agenzie di settore di maggiore rilievo, l’American Conference of Governmental Industrial Hygienists (ACGIH). Le condizioni analitiche ottimali sono state individuate conducendo una serie di prove, prima in solvente organico quindi in matrice urinaria di soggetti non esposti professionalmente a diisocianati o a solventi. La matrice urinaria delle prove è stata trattata mediante idrolisi acida ad alta temperatura, come indicato dalla maggioranza dei lavori riportati in letteratura ed in accordo con quanto indicato nella Documentation ACGIH per l’analisi dei campioni urinari dei lavoratori esposti a TDI e a HDI. I 3 metodi messi a punto sono stati validati ed hanno restituito una sensibilità ed una precisione adeguate alla determinazione dei livelli di concentrazione delle diammine dei diisocianati oggetto del presente progetto di ricerca. Ad oggi è stato possibile applicare tali metodiche per la valutazione della dose interna registrata per campioni di pazienti esposti a test di provocazione bronchiale specifici per la diagnosi di asma professionale.

We observed 82 healthy subjects, from both sexes, aged between 19 and 77 years. All subjects performed two different tests: for being scientifically acknowledged, the first one was used as a reference and it was a stress test (CPX). During the entire test, heart rate and gas exchange were recorded continuously; the second, the actual object of this study, was a submaximal test (TOP). Only heart rate was recorded continuously. The main purpose was to determinate an index of physical fitness as result of TOP. CPX test allowed us to individuate anaerobic threshold. We used an incremental protocol of 10/20 Watt/min, different by age. For our TOP test we used an RHC400 UPRIGHT BIKE, by Air Machine. Each subject was monitored for heart frequency. After 2 minutes of resting period there was a first step: 3 minutes of pedalling at a constant rate of 60 RPM, (40 watts for elder subjects and 60 watts for the younger ones). Then, the subject was allowed to rest for a recovery phase of 5 minutes. Third and last step consisted of 3 minutes of pedalling again at 60 RPM but now set to 60 watts for elder subjects and 80 watts for the young subjects. Finally another five minutes of recovery. A good correlation was found between TOP and CPX results especially between punctua l heart rate reserve (HRR’) and anaerobic threshold parameters such as Watt, VO2, VCO2 . HRR’ was obtained by subtracting maximal heart rate during TOP from maximal theoretic heart rate (206,9-(0,67*age)). Data were analyzed through cluster analysis in order to obtain 3 homogeneous groups. The first group contains the least fit subjects (inactive, women, elderly). The other groups contain the “average fit” and the fittest subjects (active, men, younger). Concordance between test resulted in 83,23%. Afterwards, a linear combinations of the most relevant variables gave us a formula to classify people in the correct group. The most relevant result is that this submaximal test is able to discriminate subjects with different physical condition and to provide information (index) about physical fitness through HRR’. Compared to a traditional incremental stress test, the very low load of TOP, short duration and extended resting period, make this new method suitable to very different people. To better define the TOP index, it is necessary to enlarge our subject sample especially by diversifying the age range.

We observed 82 healthy subjects, from both sexes, aged between 19 and 77 years. All subjects performed two different tests: for being scientifically acknowledged, the first one was used as a reference and it was a stress test (CPX). During the entire test, heart rate and gas exchange were recorded continuously; the second, the actual object of this study, was a submaximal test (TOP). Only heart rate was recorded continuously. The main purpose was to determinate an index of physical fitness as result of TOP. CPX test allowed us to individuate anaerobic threshold. We used an incremental protocol of 10/20 Watt/min, different by age. For our TOP test we used an RHC400 UPRIGHT BIKE, by Air Machine. Each subject was monitored for heart frequency. After 2 minutes of resting period there was a first step: 3 minutes of pedalling at a constant rate of 60 RPM, (40 watts for elder subjects and 60 watts for the younger ones). Then, the subject was allowed to rest for a recovery phase of 5 minutes. Third and last step consisted of 3 minutes of pedalling again at 60 RPM but now set to 60 watts for elder subjects and 80 watts for the young subjects. Finally another five minutes of recovery. A good correlation was found between TOP and CPX results especially between punctua l heart rate reserve (HRR’) and anaerobic threshold parameters such as Watt, VO2, VCO2 . HRR’ was obtained by subtracting maximal heart rate during TOP from maximal theoretic heart rate (206,9-(0,67*age)). Data were analyzed through cluster analysis in order to obtain 3 homogeneous groups. The first group contains the least fit subjects (inactive, women, elderly). The other groups contain the “average fit” and the fittest subjects (active, men, younger). Concordance between test resulted in 83,23%. Afterwards, a linear combinations of the most relevant variables gave us a formula to classify people in the correct group. The most relevant result is that this submaximal test is able to discriminate subjects with different physical condition and to provide information (index) about physical fitness through HRR’. Compared to a traditional incremental stress test, the very low load of TOP, short duration and extended resting period, make this new method suitable to very different people. To better define the TOP index, it is necessary to enlarge our subject sample especially by diversifying the age range.

La tesi presentata riguarda lo sviluppo e la validazione di metodi analitici basati su cromatografia accoppiata a spettrometria di massa utilizzati per l'analisi di molecole target in matrici complesse. Gli analiti studiati hanno differenti applicazioni che vanno dalla chimica clinica alla nutraceutica. Visti gli standard richiesti per questi studi in termini di selettività, sensibilità ed accuratezza, il lavoro si è concentrato nella fase di sviluppo e validazione di metodi di analisi personalizzati, applicabili agli specifici sistemi investigati.
The present thesis deals with the development and validation of analytical methods based on chromatography coupled with mass spectrometry, which are aimed to the analysis of target molecules in complex matrices. The target compounds have different applications, ranging from the clinical chemistry to the nutraceutical field. Since the requested proper standards of selectivity, sensitivity and accuracy used to depend strongly on the selected application, several efforts have been dedicated to the phase of development and validation of highly customized analytical methods, suitable for the specific system under investigation.

La tesi, sviluppata in collaborazione con l'azienda "Magneti Marelli", ha avuto come l'obiettivo la caratterizzazione di un modello matematico per descrivere il comportamento di una batteria. Per fare ciò sono stati utilizzati vari metodi di analisi numerica per migliorare un algoritmo di caratterizzazione del modello, di cui la parte teorica è illustrata nei primi capitoli. Nei capitoli successivi sono stati riportati i risultati delle analisi ai problemi matematici incontrati, in particolare problemi di Cauchy e di minimizzazione non lineare. In conclusione sono riportati i risultati ottenuti dallo sviluppo di un algoritmo di stima, sviluppato in ambiente Simulink, ottenuto grazie ai risultati della caratterizzazione precedente.

The fish sector is a very important in the alimentary production scenario, both for the economic and nutritional aspect. Lately it has been noticed a growth in the consumption due to the offer of new fish species on the market and to the innovation in the production and distribution. This improvement led to an increase of the fraud for species substitution problem and to the necessity of new analytical tools to improve the product traceability and authentication. The Barcoding method, proposed in this PhD work as the gold standard reference method, was used for the creation of a biological and sequence local database, now filled with 40 species with over 400 sequences, resulting in a useful tool for the labs working on the fish species identification. The database applicability and the Barcoding method reproducibility have then been tested through a ring-trial. The agreement among the labs pointed out the high usability of the method underlining some issues on the interpretation or on the expression of the final result. While working on the project a surveillance activity on the national market pointed out a greater fraud percentage in some commercial groups (cephalopods, grouper and gadiformes), than other common products as the flat fish. It was not possible to analyze the frauds referred to the Thunnus genus since they were part of groups genetically alike. The study was thus oriented to the high resolution melt analysis (HRMA). In silico analysis and the previous in vitro studies showed how this technology permits to obtain the characterization of the three commercially more important species on the national market (T. thynnus, T, alalunga e T. albacares). Another case study led to develop rapid alternative diagnostic methods to the Barcoding in order to recognize the Octopus vulgaris specie. In particular, the Real-Time PCR method allowed to distinguish rapidly the Octopus vulgaris from the other cephalopods species, with a particular attention on the species that are morphologically alike or that are the most involved in the specie substitution fraud. The method was even tested on a set of 77 samples coming from some supermarkets located in 4 provinces in the triveneto territory. This study pointed out a high fraud percentage referring to the Octopus vulgaris (51.2%). The Barcoding also brought up the presence of a strong percentage of mislabeling. Some other factors linked to the fraud are the capture area and the specie declared on the label. The approach suggested gives a valid methodological system to face the fraud issue, through an accurate market analysis and a surveillance activity aimed to the products that are subject to substitution. Moreover, a rigid validation approach is necessary for the biomolecular methods, in order to have the possibility to suggest strong and reliable tools for the species identification to the supervisory authority.
Il panorama ittico rappresenta un settore molto importante nel contesto produttivo alimentare, sia per l'€™aspetto economico sia per quello nutrizionale. Negli ultimi anni si osserva infatti un incremento dei consumi dovuto alla crescente offerta di nuove specie ittiche che si presentano sul mercato e alla continua innovazione nei settori della produzione e della distribuzione. Il metodo del Barcoding, proposto in questo lavoro di Dottorato come gold standard di riferimento, è stato utilizzato per la costruzione di un database locale biologico e di sequenze, creando così uno strumento robusto e utile per qualunque laboratorio operante nell'€™ambito dell'€™identificazione di specie ittiche. E'ˆ stata inoltre testata la robustezza del database e la riproducibilità  del metodo Barcoding mediante l'€™organizzazione di un ring trial. Durante tutto il periodo di dottorato è stata svolta un'€™attività  di sorveglianza sui mercati di tutto il territorio nazionale che ha permesso di mettere in luce una percentuale di frodi maggiore in alcuni gruppi di specie (molluschi cefalopodi, cernie e gadiformi), mentre una percentuale minore è stata riscontrata nei pesci piatti, i quali hanno però rappresentato la percentuale maggiore dei campioni raccolti. Durante questa attività  non è stato possibile valutare le frodi riguardanti i campioni appartenenti al genere Thunnus, in quanto facenti parte di gruppi geneticamente molto simili. E'ˆ stato quindi condotto uno studio approfondito volto all'€™analisi delle curve di melting ad alta risoluzione. L'™analisi in silico condotta e gli studi preliminari in vitro hanno mostrato come questa tecnologia permetta di ottenere la caratterizzazione delle tre specie commercialmente più rilevanti presenti sul mercato nazionale (T. thynnus, T. alalunga e T. albacares). Un altro caso di studio trattato in questo lavoro è legato allo sviluppo di metodi diagnostici rapidi alternativi al Barcoding per il riconoscimento della specie Octopus vulgaris. E'ˆ stata quindi sviluppata una metodica di PCR Real-Time che permettesse di distinguere rapidamente Octopus vulgaris dalle altre specie di cefalopodi, con particolare attenzione alle specie morfologicamente più simili con cui è più probabile la frode per sostituzione. Conseguentemente alla messa a punto del metodo, sono stati analizzati 77 esemplari provenienti da supermercati di 4 province del triveneto. Questa indagine ha messo in luce un€'alta percentuale di frode per quanto riguarda Octopus vulgaris (51.2%). Il Barcoding inoltre ha permesso di rilevare la presenza di una forte percentuale di mislabelling ossia di errore di etichettatura dei prodotti. L'€™approccio proposto in questo lavoro fornisce un valido sistema metodologico per affrontare il problema delle frodi, mediante un'accurata analisi dei mercati e un'€™attività di sorveglianza mirata ai prodotti maggiormente soggetti a sostituzione.

Il presente lavoro di tesi descrive il processo di potenziamento del banco prova Alma Test-Bed per la validazione dei sistemi di controllo d’assetto di nanosatelliti 3U tramite piattaforma rotante su cuscinetto ad aria. L’obiettivo è integrare un simulatore di Sole e migliorare la simulazione della microgravità della piattaforma rotante. La prima parte del lavoro svolto consiste nella progettazione funzionale e dettagliata della struttura atta a rendere il satellite insensibile all’accelerazione gravitazionale locale, permettendogli di assumere un range di configurazioni d’assetto ottimale per poterne testare il comportamento in orbita. Dato che le condizioni di microgravità possono essere riprodotte solamente tramite un controllo estremamente accurato del baricentro della piattaforma di supporto del satellite, la progettazione è stata affrontata da molteplici punti di vista, sia tramite modelli analitici, che con analisi agli elementi finiti. I risultati delle simulazioni fatte sul sistema progettato permettono infine di stimare delle coppie di disturbo che rientrano nei limiti delle specifiche di progetto. Le deformazioni in gioco, la componentistica utilizzata e i disturbi generati risultano in linea con lo stato dell’arte della tecnologia e con i risultati pubblicati in letteratura. La seconda parte del lavoro è incentrata sull’integrazione di un simulatore di Sole custom-made. Vengono analizzate le caratteristiche peculiari dei simulatori di Sole per classificare quello in uso e descritte le leggi di ottica sfruttate per collimare il fascio di luce generato. Attraverso un’estesa campagna sperimentale, è stato possibile valutare la bontà dei risultati ipotizzati e tarare ed ottimizzare il sottosistema fino ad ottenere un ottimo livello di collimazione (inferiore al grado) in un’ampia area illuminata. I risultati sperimentali indicano un risultato molto migliore delle specifiche di progetto, garantendo un ampio margine sulle stesse.

Grazie all'avvento del BIM è possibile avere una rappresentazione digitale, completa di tutte le sue parti ed informazioni sempre aggiornate. Supervisionare un progetto in fase realizzativa non è mai semplice, perché sono molteplici i fattori da monitorare per assicurarsi che tutto venga fatto secondo i progetti, in sicurezza e soprattutto rispettando i tempi. Grazie all'evoluzione tecnica e tecnologica, nuovi strumenti sono venuti in soccorso al progettista. La realtà virtuale ben si presta a riprodurre modelli tridimensionali di un progetto, per esempio quelli realizzati tramite il processo BIM. Sfruttare in tempo reale informazioni sui particolari costruttivi, sugli impianti, poterne verificare percorsi e punti critici consente di programmare già in sede progettuale le attività di manutenzione e di controllo limitando i margini d’errore. Con la visualizzazione del modello 3D renderizzato direttamente in un visore, consente al progettista nuove modalità progettuali e allo stesso tempo può coinvolgere l’utenza a esprimersi ancor prima che i lavori incomincino. Grazie all'affiancamento di uno dei casi studio di Open Project, la studentessa ha sviluppato una ricerca per dimostrare l’utilità di questo approccio in fase di design review soprattutto con l’unione di gruppi diversi di lavoro sullo stesso progetto, perciò è stato scelto uno studentato di Firenze di cui si stanno occupando i tecnici di Open Project e si sono uniti i modelli Revit architettonici, strutturali e impiantistici della stessa commessa. Il test a cui sono stati sottoposti i campioni consentiva agli utenti di partecipare allo stesso processo di co-design, permettendo la creazione di una prospettiva comune di lavoro grazie alla visualizzazione immersiva. Dopo l’analisi dei dati è stato possibile dedurre delle conclusioni utili alla valutazione di un impiego quotidiano della realtà virtuale nel panorama del settore delle costruzioni.

La presente tesi si focalizza sullo sviluppo di soluzioni innovative IoT attraverso Smart Object, finalizzati a rendere l'ambiente circostante intelligente. Il progetto di ricerca ha l’obbiettivo di proporre una soluzione completa in grado di rendere più efficienti i sistemi innovativi in ambito industriale e domestico. I dati raccolti attraverso l’impiego di sensori, in grado di misurare le grandezze di interesse, hanno generato dei feedback che migliorano da una parte i processi produttivi e dall’altra il monitoraggio dello stato di salute di un soggetto, automatizzando azione correttive. Nello specifico ci si è concentrati su due ambiti: la valutazione dell'affidabilità dei diodi ad emissione di luce (LED) per lo sviluppo di sistemi Smart Lighting ad alte prestazioni e lo sviluppo di sistemi innovativi per l’Ambient Assisted Living e Smart Living, con focus sul tema dell’invecchiamento e sulla misurazione dell’Età Biologica (BA) tramite sensori inerziali. Per quanto riguarda il primo ambito l’attività di ricerca ha riguardato la definizione di protocolli sperimentali finalizzati alla valutazione dell'affidabilità e del tempo di vita dei LED impiegati nella realizzazione di sistemi Smart Lighting ad alte prestazioni. Attività sempre più importante negli attuali sistemi illuminotecnici finalizzati, non solo a fornire illuminazione, ma anche a far parte di sistemi di Smart Environment attraverso cui somministrare nuovi servizi. In particolare, le ricerche sono state concentrate sull’affidabilità del giunto di saldatura che, in seguito alla comparsa di fessure (cracks) e bolle (voids), è il fattore principale che influenza il tempo di vita di un sistema di illuminazione. Per quanto riguarda il secondo ambito applicativo si è sviluppato un sistema di sensori indossabili, che è in grado di monitorare l'attività motoria, rilevando eventuali problemi nell'analisi del cammino e nella stabilità posturale. Dai risultati ottenuti nelle prove effettuate sul campo, il sistema assicura prestazioni analoghe rispetto al gold standard del settore. Visto gli ottimi risultati ottenuti dai dispositivi, questi possono essere utilizzati per il monitoraggio continuo dell'anziano al di fuori dell'ambiente ospedaliero in modo da realizzare sistemi Smart Health, sistemi di telecontrollo e telemonitoraggio.
This thesis focuses on the development of innovative IoT solutions through Smart Objects, with the aim of making surrounding environment intelligent.The research project aims to propose a complete solution capable of making innovative systems in the industrial and domestic sectors more efficient. The data collected through the use of sensors, capable of measuring the quantities of interest, generated feedback that improves the production processes on the one hand and the monitoring of the health of a subject on the other, automating corrective action. Specifically, we focused on two areas: the assessment of the reliability of light emitting diodes (LEDs) for the development of high performance Smart Lighting systems and the development of innovative systems for Ambient Assisted Living and Smart Living, with a focus on the topic of aging and on the measurement of Biological Age (BA) through inertial sensors. With regard to the first area, the research activity concerned the definition of experimental protocols aimed at assessing the reliability and lifetime of the LEDs used in the construction of high-performance Smart Lighting systems. An increasingly important activity in current lighting systems aimed not only at providing lighting, but also at being part of Smart Environment systems through which to administer new services. In particular, research has been focused on the reliability of the solder joint which, following the appearance of cracks and bubbles (voids), is the main factor affecting the lifetime of a lighting system. As regards the second application area, a wearable sensor system has been developed, which is able to monitor motor activity, detecting any problems in gait analysis and postural stability. From the results obtained in the tests carried out in the field, the system ensures similar performance compared to the gold standard of the sector. Given the excellent results obtained by the devices, these can be used for the continuous monitoring of the elderly outside the hospital environment in order to create Smart Health systems, remote control systems and remote monitoring.

L’accreditamento è un’attestazione tramite la quale, un soggetto indipendente di parte terza, riconosce la competenza ed il modus operandi di un ente ovvero un’organizzazione, in accordo con specifici requisiti di qualità stabiliti da norme internazionali o nazionali. Il quadro normativo di riferimento è costituito dalle norme della serie di norme UNI CEI EN ISO IEC17000, che specificano termini, definizioni e requisiti relativi alla valutazione della conformità, compreso l'accreditamento degli organismi di certificazione e l'utilizzo di detta certificazione per agevolare il commercio. In Italia ACCREDIA è l’ente unico nazionale di accreditamento, autorizzata dal Ministero dello Sviluppo Economico ed operante in conformità ai requisiti stabiliti dalla norma UNI EN ISO 17011 (norma che disciplina gli Enti di accreditamento). Ha il compito di valutare la competenza tecnica e l’idoneità professionale delle organizzazioni (Laboratori di prova, di Taratura ed Organismi di certificazione) che operano nel settore della qualità, accertandone la conformità alle pertinenti Norme Internazionali, per assicurare il valore e la credibilità delle certificazioni rilasciate. Nello specifico, l’accreditamento dei laboratori di prova, reso cogente dal framework legislativo nazionale ed europeo, si configura come un punto fondamentale per la validità dei risultati delle procedure di validazione e monitoraggio di qualsivoglia processo produttivo in aziende che operano in qualità. Nel presente elaborato, sono illustrate le modalità attraverso cui i laboratori di prova possono dimostrare l’affidabilità dei risultati, sia chimici che microbiologici ottenuti, in relazione a caratteristiche intrinseche del dato analitico (ad esempio sensibilità, specificità, riproducibilità, robustezza etc.) e come l’intero processo risponda ai requisiti della norma di accreditamento UNI EN ISO 17025.

In veterinary medicine, the characterisation of the P450 isoenzymes is still incomplete and moreover, the substrates used were selected on the basis of the available knowledge from experiments in human or laboratory species without any kinetic or inhibition study (Fink-Gremmels, 2008). Defining the contribution of a P450 isoform in the metabolism of a specific drug is of great interest not only for veterinary pharmacology and toxicology but also for human health, for the potential presence of toxic residues in food animal products. During the PhD course, projects dealing with the evaluation of cytochrome P450 activities in veterinary species have been developed. The aim was to increase knowledge about drug metabolizing enzymes in veterinary species and about the modulation of their activity. The modulation may be due to factors as breed but also exposure to environmental contaminants or somministration of illicit drugs used to enhance growth and consequently increase profit (Johnson, 2007). Data collected from these in vitro studies can be actually used to evaluate the effects of drug-drug interactions and for the plan of experimental projects aiming to identify in vivo markers of exposure or treatment. I) Determination of CYP1A and CYP2C activities in bovine liver. In this study, accuracy, precision, LOD and LOQ of High Performance Liquid Chromatography (HPLC) methods previously developed in the lab for the evaluation of ethoxyresorufin-O-deethylase (EROD) e tolbutamide methyl-hydroxylase (TMOH) activities, have been determined. The aim was to calculate the enzyme kinetic parameters: respectively 0.23 ± 0.051 and 1010 ± 155.7 μM for Km and 0.488 ± 0.035 and 0.089 ± 0.006 nmol/min/mg protein for Vmax. The methods were proved to be so sensitive to determine also very low levels of enzyme activity as those of veal calves fed with milk replacers and low iron content diet. Finally, to verify the presence of intra-specific differences in enzyme activity, EROD and TMOH were determined with liver microsomes from Charolais (CH), Blonde D’Aquitaine (BD) and Piedmontese (PM). The results of EROD evidenced higher activity in CH vs PM (p<0.05). So, for the first time, the presence of breed differences in this enzyme activity was established, confirming also what reported by other authors for CYP3A-dependent activities (Dacasto et al., 2005). These differences may influence bioavailability and clinical efficacy of xenobiotics (Sallovitz et al., 2002) and may be of particular interest in veterinary species for the potential presence of toxic residues in food animal products. II) Testosterone hydroxylation in bovine liver: enzyme kinetic and inhibition study. This study evaluated, by HPLC analysis, the kinetic of testosterone (TST) hydroxylase activities in vitro, with liver microsomes from cattle. Kinetic parameters for 6b–, 16b– and 2b –TST hydroxylase activities (OHT) were 93.4±13.8, 36.4±6.1 and 110.8±15.2 ±M respectively for Km and 0.558±0.03, 0.280±0.013 and 0.338±0.017 nmol/min/mg protein for Vmax.. Moreover, chemical inhibition studies with a CYP3A inhibitor (ketoconazole) and CYP2B inhibitors (orphenadrine and 9-ethynylphenanthrene) were performed to establish the involvement of CYP3A and potentially of CYP2B in these enzyme reactions. To further confirm the results obtained, an anti-peptide antibody against bovine CYP3A4 was also used. The antibody specificity with bovine liver microsomes was evaluated and then immunoinhibition studies were conducted, evidencing > 90% inhibition for 16b– and 2b –OHT activities and > 80% for 6b–OHT. These results seemed to suggest the predominant involvement of CYP3A in the production of the three main TST-hydroxylated metabolites in bovine liver while CYP2B seemed to be not involved. III) Effects of illicit treatments on CYP3A in bovine liver and in primary cultures of bovine hepatocytes. These experiments intended to prove the applicability of the HPLC method and TST substrate for evaluating CYP3A activity, aiming to actually verify illicit treatments effect and collect more data respect to previous studies in veal calf and beef cattle. In the first experiment, 6b-, 16b- and 2b-OHT were determined in bovine treated with dexamethasone (D) and dexamethasone+estradiol (DE). The results obtained evidenced a significant induction for 6b- and 16b-OHT in D and DE vs control (K, p<0.05) and for 2b–OHT in D and DE vs K (p<0.05 and p<0.01, respectively), confirming what reported for human (McCune et al., 2000). These results were confirmed by Immunoblotting which evidenced increasing in CYP3A protein expression in D and D+E vs K (p<0.01 and p<0.05, respectively). In the second experiment, 6b-, 16b- and 2b-OHT were determined in bovine hepatocytes after 24 h incubation with boldenone (B), androsta-1,4-diene-3,17-dione (A) and B + A. The results showed an inhibitory trend in hepatocytes incubated with growth promoters vs controls (K). In particular, 6b and 16b OHT were inhibited in A and B vs K while 2b-OHT in A vs K (p<0.05). At the protein level instead, no significant difference was found in CYP3A expression (Immunoblotting). The inhibitory effect observed may be due to the high doses used; inhibitory/toxic effects of high doses of inducing agents were evidenced for instance by Kostrubsky et al. (1999) who used human hepatocytes to study induction of cytochrome P450, stressing the importance of large dose-response studies as well as the need to assess toxicity in these investigations. The results obtained in these experiments confirmed the modulation of expression and regulation of cytochrome P450 enzymes by estrogens, corticosteroids and anabolic steroids. There is the need however, to explain deeply for bovine the mechanism through that these compounds act at pre- and post-transcriptional level. IV) Determination of CYP1A activity in the liver of Zosterisessor ophiocephalus as biomarker of pollution in the Venice Lagoon. Recently, it was proved that biomarkers (BM) are very useful to evidence early biological changes in environmental pollution. One of the most common BM used in fishes is the induction of the P450 system and in particolar ethoxyresorufin O-deethylase activity (EROD) is a marker of fish exposure to potentially toxic compounds, i.e. poli-chlorinated biphenils and polycyclic aromatic hydrocarbons (Burgeot et al., 1994). The aim of this study was to evaluate by HPLC EROD activity in Zosterisessor ophiocephalus, a benthic fish that may represent an useful bioindicator of environmental stress in the Venice Lagoon. Fishes were collected in spring and autumn in three different areas of the Venice Lagoon: Porto Marghera (PM), Valle di Brenta (VB) and Porto Canale (PC); the samples were then classified in females, males and sneakers (small males, < 1 years-old). Factorial analysis of EROD activity results evidenced that site, fish category and season were significant (p<0,001), and the interactions category*site and category *season as well (p<0,001). Considering site effect in particular, in PM EROD activity values were significantly higher than in VB and in PC (p<0,01 and p<0,001, respectively) and in VB higher than in PC (p<0,01). These results were in agreement with the available data relative to persistent organic pollutants (POPs) concentration (expressed as enrichment factor, EF) in the sediments of the Venice Lagoon, that showed major contamination in the area close to Porto Marghera (EF>12), intermediate in the area of Valle di Brenta (EF=5-12) and low around Porto Canale (EF=1-5; Guerzoni et al., 2004). However, site effect depended on the fish category and in particular differences were found between males and females, due more probably to the analyzed samples than to real differences in induction. From these results, EROD activity may be considered an useful biomarker even if, considering the multifactorial response of individuals, it is important to use several significant biomarkers to accurately evaluate the effects of environmental pollution in the aquatic ecosystem. V) Luminescence high-throughput methods for determining CYP3A and CYP2C activities in horse liver. In the last part of the thesis, results of kinetic and inhibition studies to evaluate CYP2C and CYP3A activities in horse liver through Glo assays were reported. The aim was to evaluate the performances of this technique for drug metabolism or drug-drug interaction studies. Enzyme kinetic parameters for CYP3A and CYP2C activities were respectively 14.5 ± 7.3 and 175.9 ± 16.2 μM for Km and 0.022 ± 0.0004 and 0.025 ± 0.0009 nmol/min/mg protein for Vmax. Ketoconazole (CYP3A inhibitor) evidenced IC50 values of 0.035 μM, confirming good specificity of the luciferin (L)-derivative substrate used for CYP3A (L-IPA). Sulfaphenazole (CYP2C inhibitor) evidenced IC50 values of 47.2 μM, suggesting the need to conduct further studies to verify substrate specificity (L-H), for instance using other selective inhibitors for the CYP2C subfamily as ibuprofen or diclofenac. Luminescence methods allowed to analyse many samples in short time, to monitor more than one isoform simultaneously in the same plate and showed good sensitivity confirmed by LOD values: 0.2 and 0.11 nM for L-H and L-IPA, respectively. So, these results may represent a good starting point to apply this technique in drug metabolism and drug-drug interaction studies in veterinary species
Nel corso dei tre anni di dottorato sono stati sviluppati progetti relativi alla valutazione dell’attività epatica di isoforme di citocromo P450 in specie di interesse veterinario. In medicina veterinaria, la caratterizzazione del sistema P450 è ancora incompleta; inoltre, i substrati utilizzati sono stati selezionati sulla base delle conoscenze disponibili a partire da esperimenti condotti nell’uomo o nelle specie di laboratorio senza studi di cinetica enzimatica o di inibizione (Fink-Gremmels, 2008). Definire il contributo di un’isoforma di citocromo P450 nel metabolismo di un farmaco specifico è importante non solo per la farmacologia e la tossicologia veterinarie ma anche per la salute dell’uomo, per la possibile presenza di residui nei prodotti di origine animale. L’obiettivo della presente tesi di dottorato è stato dunque quello di aumentare le conoscenze sugli enzimi che metabolizzano i farmaci in specie di interesse veterinario e sulla modulazione della loro attività. Tale modulazione può essere dovuta a fattori come la razza ma anche all’esposizione ad inquinanti ambientali oppure alla somministrazione di sostanze illecite utilizzate allo scopo di determinare incremento ponderale, riduzione degli indici di conversione alimentare e quindi aumento complessivo del reddito (Johnson, 2007). Le informazioni ottenute con tali studi in vitro dunque possono essere utili per valutare l’effetto di interazioni tra farmaci e per il disegno sperimentale di progetti volti all’identificazione di marker in vivo di esposizione o trattamento. I) Valutazione dell’attività di CYP1A e CYP2C nel fegato di bovino. Nel presente lavoro, sono stati verificati accuratezza, precisione, LOD e LOQ di metodi in High Performance Liquid Chromatography (HPLC) precedentemente messi a punto nel laboratorio per la valutazione dell’attività di etossiresorufina-O-deetilasi (EROD) e tolbutamide metil-idrossilasi (TMOH) in microsomi epatici di bovino allo scopo di determinare i parametri di cinetica enzimatica: rispettivamente 0,23 ± 0,051 e 1010 ± 155,7 μM per la Km e 0,488 ± 0,035 e 0,089 ± 0,006 nmol/min/mg proteina per laVmax. La sensibilità dei metodi messi a punto ha permesso di valutare anche livelli di attività enzimatica molto bassi come quelli dei vitelli a carne bianca che vengono alimentati con una dieta a base di sostitutivi del latte e basso contenuto di ferro. Infine, per verificare l’esistenza di differenze intra-specifiche nell’attività enzimatica, le attività di EROD e TMOH sono state determinate utilizzando microsomi epatici di bovini di razza Charolais (CH), Blonde D’Aquitaine (BD) e Piemontese (PM). I risultati ottenuti per l’attività di EROD hanno evidenziato una maggiore attività nei bovini di razza CH vs PM (p<0,05). E’ stata dunque dimostrata, per la prima volta, l’esistenza di differenze intra-specifiche dovute alla razza relative a questa attività enzimatica, confermando quanto evidenziato da altri autori in relazione ad attività CYP3A-dipendenti (Dacasto et al., 2003). Tali differenze potrebbero influenzare la biodisponibilità e l’efficacia clinica di xenobiotici (Sallovitz et al., 2002) e potrebbero essere di particolare interesse nelle specie di interesse veterinario per l’ipotetica presenza di residui potenzialmente tossici negli alimenti di origine animale. Per quanto riguarda invece l’attività di TMOH non sono state evidenziate differenze statisticamente significative. II) Valutazione dell’attività di idrossilazione del testosterone nel fegato di bovino: studio di cinetica enzimatica e di inibizione. In questo studio è stata valutata, tramite analisi in HPLC, la cinetica delle reazioni di idrossilazione del testosterone (TST) in vitro, con microsomi epatici di bovino. I parametri di cinetica enzimatica per le attività di 6b–, 16b– e 2b –TST idrossilasi (OHT) sono risultati 93,4±13,8, 36,4±6,1 e 110,8±15,2 ±M rispettivamente, per la Km e 0,558±0,03, 0,280±0,013 e 0,338±0,017 nmol/min/mg proteina per la Vmax.. Inoltre sono stati effettuati degli studi di inibizione chimica con inibitori di CYP3A (chetoconazolo) e di CYP2B (orfenadrina e 9-etinilfenantrene) per definire il coinvolgimento di CYP3A e potenzialmente di CYP2B in queste reazioni enzimatiche. I risultati ottenuti sono stati ulteriormente confermati con l’impiego di un anticorpo anti-peptide contro CYP3A4 di bovino. Dopo aver valutato la sua specificità con microsomi epatici di bovino, sono stati effettuati degli studi di immunoinibizione, che hanno evidenziato un’inibizione > 90% per le attività di 16b– e 2b –OHT e > 80% per 6b–OHT. Nel complesso, questi risultati sembrerebbero suggerire il coinvolgimento predominante di CYP3A nella produzione dei tre principali metaboliti del TST nel fegato di bovino mentre CYP2B non sembrerebbe essere coinvolto. III) Effetti di trattamenti illeciti su CYP3A nel fegato del bovino da carne e in colture primarie di epatociti di bovino. L’obiettivo principale di entrambe le prove sperimentali descritte è stato quello di dimostrare l’applicabilità del metodo HPLC e del substrato TST per la valutazione dell’attività enzimatica CYP3A-dipendente, allo scopo di verificare l’effetto del trattamento e di acquisire ulteriori evidenze sperimentali rispetto ai risultati di studi precedentemente coinvolti dal nostro gruppo di ricerca sul vitello a carne bianca e sul vitellone. In un primo esperimento, sono state determinate le attività di 6b-, 16b- e 2b-OHT in microsomi epatici di bovini trattati con desametazone (D) e desametazone + estradiolo (DE). I risultati ottenuti hanno evidenziato un’induzione statisticamente significativa nelle attività di 6b- e 16b-OHT in D e DE vs controlli (K, p<0,05) e nell’attività di 2b–OHT in D e DE vs K (p<0,05 e p<0,01, rispettivamente), confermando quanto riportato in letteratura per l’uomo (McCune et al., 2000). Tali risultati sono stati convalidati ulteriormente dall’analisi in Immunoblotting che ha evidenziato un aumento dell’espressione di CYP3A in D e D+E vs K (p<0,01 e p<0,05, rispettivamente). In un secondo esperimento, sono state determinate le attività di 6b-, 16b- e 2b-OHT in epatociti di bovino dopo 24 h di incubazione con boldenone (B), androsta-1,4-diene-3,17-dione (A) e B + A. I risultati ottenuti hanno evidenziato un trend inibitorio negli epatociti incubati con promotori di crescita rispetto a K. In particolare, le attività di 6b e 16b OHT sono state inibite in A e B vs K mentre l’attività di 2b-OHT in A vs K (p<0,05). A livello di proteina invece, non è stata riscontrata alcuna differenza statisticamente significativa nell’espressione di CYP3A (Immunoblotting). L’effetto inibitorio osservato potrebbe essere dovuto alle dosi utilizzate; un caso di effetto inibitorio/tossico di alte dosi di sostanze inducenti è riportato da Kostrubsky et al. (1999) che hanno utilizzato epatociti di uomo per studiare l’induzione del sistema citocromo P450 evidenziando la necessità di effettuare degli studi dose-risposta in un ampio range di concentrazioni delle sostanze utilizzate e di valutarne la tossicità. Nel complesso, i risultati ottenuti in questi due esperimenti hanno confermato la modulazione da parte di estrogeni, corticosteroidi ed anabolizzanti dell’espressione e la regolazione degli enzimi citocromo P450-dipendenti. Chiaramente, rimane comunque la necessità di spiegare più approfonditamente per quanto riguarda il bovino i meccanismi tramite i quali queste sostanze agiscono sia a livello pre-trascrizionale che post-trascrizionale. IV) Valutazione dell’attività di CYP1A nel fegato di Zosterisessor ophiocephalus come biomarcatore di inquinamento nella laguna di Venezia. Recentemente, è stato dimostrato che i biomarcatori (BM) sono molto utili per rilevare dei cambiamenti biologici precoci nell’inquinamento ambientale. Uno dei BM più comunemente usati nei pesci è l’induzione dell’attività di etossiresorufina-O-deetilasi (EROD) che è un indicatore dell’esposizione dell’organismo a composti potenzialmente tossici, come ad esempio i policloro-bifenili e gli idrocarburi aromatici policiclici (Burgeot et al., 1994). Di conseguenza, lo scopo del presente lavoro è stato quello di valutare l’attività di EROD tramite HPLC in Zosterisessor ophiocephalus, una specie bentonica che date le sue caratteristiche, può rappresentare un utile indicatore biologico dei livelli di stress ambientale presente nella Laguna di Venezia. I pesci sono stati raccolti in primavera ed in autunno in tre aree della Laguna di Venezia: Porto Marghera (PM), Valle di Brenta (VB) e Porto Canale (PC); i campioni sono stati poi suddivisi in femmine, maschi e sneakers (maschi giovani). L’analisi fattoriale ha evidenziato la significatività dei fattori sito, categoria e stagione (p<0,001) ma anche delle interazioni categoria*sito e categoria*stagione (p<0,01). Per quanto riguarda l’effetto del sito in particolare, PM possedeva valori di attività di EROD significativamente più elevati rispetto a VB e PC (p<0,01 e p<0,001, rispettivamente) e VB rispetto a PC (p<0,001). Tali risultati sembrerebbero essere in accordo con i dati disponibili relativi alla concentrazione di inquinanti organici persistenti (POP) espressa come fattore di arricchimento (EF) nei sedimenti della Laguna di Venezia, i quali indicano una contaminazione maggiore nell’area circostante a Marghera (EF>12), intermedia nei pressi di Valle di Brenta (EF=5-12) e ridotta nel territorio contiguo al sito di Porto Canale (EF=1-5; Guerzoni et al., 2004). L’effetto del sito dipendeva comunque dalla categoria di animali considerata ed in particolare sono state evidenziate delle differenze tra maschi e femmine, dovute probabilmente comunque al campione analizzato più che a differenze reali in termini di induzione. Dai risultati ottenuti, l’attività di EROD è da considerarsi un buon biomarcatore anche se, considerando la natura multifattoriale della risposta dell’individuo, è necessario l’utilizzo congiunto di più biomarcatori significativi per effettuare una valutazione accurata degli effetti dell’inquinamento nell’ecosistema acquatico. V) Messa a punto di metodi high-throughput in luminescenza per la valutazione dell’attività di CYP3A e di CYP2C nel fegato di cavallo. Nell’ultimo capitolo della tesi, sono riportati i risultati relativi agli studi di cinetica enzimatica e di inibizione chimica volti alla valutazione delle attività di CYP2C e CYP3A nel fegato di cavallo mediante l’utilizzo di saggi Glo. Lo scopo è stato quello di valutare le performance di questa tecnologia allo scopo di applicarla in studi di metabolismo e di interazioni tra farmaci. I parametri di cinetica enzimatica per le attività di CYP3A e di CYP2C sono risultati rispettivamente 14,5 ± 7,3 e 175,9 ± 16,24 μM per la Km e 0,022 ± 0,004 e 0,025 ± 0,0009 nmol/min/mg proteina per la Vmax. Chetoconazolo (inibitore di CYP3A) ha evidenziato un valore di IC50 pari a 0,035 μM, confermando quindi una buona specificità del substrato luciferina (L)-derivato utilizzato per CYP3A (L-IPA). Sulfafenazolo (inibitore di CYP2C) ha evidenziato un valore di IC50 pari a 47,2 μM, suggerendo dunque la necessità di effettuare ulteriori studi volti a verificare la specificità di substrato (L-H), ad esempio utilizzando altri inibitori selettivi per tale sottofamiglia come l’ibuprofene o il diclofenac. I metodi in luminescenza messi a punto permettono di analizzare un numero elevato di campioni in tempi brevi, di monitorare più di un’isoforma contemporaneamente nella stessa piastra e sono caratterizzati da una buona sensibilità, confermata dai valori di LOD ottenuti: 0,2 e 0,11 nM per L-H e L-IPA, rispettivamente. I risultati ottenuti dunque possono costituire un ottimo punto di partenza per poter applicare la tecnologia di tali saggi in studi relativi alle specie di interesse veterinario con vantaggi di costi e tempi di realizzazione delle analisi

Il progetto Smart Swap Building nasce in collaborazione con la Piattaforma Costruzioni della Rete Alta Tecnologia dell’Emilia-Romagna come progetto strategico in risposta alla crisi che sta duramente colpendo il settore delle costruzioni e che richiede l’innesco di nuove logiche di rigenerazione utili all’intera filiera, volte alla riqualificazione e alla riduzione del consumo di suolo. La recente contrazione del mercato immobiliare ha generato una significativa quantità di patrimonio invenduto. Il tasso di assorbimento delle nuove costruzioni pari all’80% nel 2007 è sceso fino al 35% nel 2012. Al termine del 2014, il numero complessivo delle abitazioni invendute si attestava oltre 540mila unità in Italia, per il 26% di nuova costruzione. Gli investimenti nel settore della ristrutturazione ormai raggiungono e superano quelli per le nuove costruzioni. Parallelamente lo stock immobiliare residenziale è composto per il 70% da edifici antecedenti al 1970 e necessita di un adeguamento a nuovi livelli di efficienza energetica, sicurezza sismica, inclusività e comfort abitativo. Il termine swap, mutuato dalla finanza, indica lo scambio di flussi tra due controparti: con il concetto di Smart Swap Building si vuole perciò intendere l’utilizzo del patrimonio edilizio invenduto come alloggio temporaneo per gli abitanti di aree nelle quali si intraprendano programmi di riqualificazione dell’esistente. Il principale obiettivo di questa ricerca è di valutare la fattibilità di adozione di strumenti informativo-rappresentativi avanzati nel workflow Smart Swap Building. Tali strumenti infatti permettono non solo di condurre in modo trasparente le fasi progettuali al fine di realizzare elaborati tradizionali corretti, ma si estende all’intero processo edilizio, mettendo in relazione elementi compositivi, tecnologici e strutturali con le fasi di costruzione e cantiere (BIM 4D), stima dei costi (BIM 5D), certificazione (BIM 6D) e gestione del ciclo di vita (BIM 7D + CAFM). Il progetto Smart Swap Building, integrando la forte esigenza di riqualificazione dell’esistente, nella logica di raggiungimento degli obiettivi europei di riduzione del consumo di suolo nonché di risparmio energetico, di risorse e di adeguamento del comfort abitativo, e un patrimonio immobiliare di nuova costruzione non utilizzato, necessita di opportuni strumenti informativi a supporto dei complessi processi decisionali, in grado di integrare differenti competenze, a diverse scale e in diversi momenti del ciclo di vita degli edifici. Lo strumento rappresentativo è ormai parte integrante del processo progettuale e, poiché le innovazioni produttive sono sempre collegate ai processi edilizi, dalla progettazione, al cantiere, fino alla gestione, diviene anch’esso elemento da valutare per definire la qualità progettuale ed effettuare ragionamenti sulla sostenibilità dell’opera ben più consapevoli ed approfonditi. In conclusione, il principale prodotto della ricerca si configura nella redazione di linee guida per l’impiego di strumenti informativo-rappresentativi per la gestione del workflow Smart Swap Building così come della loro validazione su casi applicativi e divulgazione online.
The main challenge of Smart Swap Building project, carried out in collaboration with Aster by Construction Platform of Emilia-Romagna High Technology Network, is to identify possible solutions to the crisis that is severely affecting the construction industry, through new approaches to urban regeneration based on housing refurbishment and soil consumption reduction. The recent downturn in the housing market has generated a significant amount of unsold assets. The absorption rate of 80% in 2007 fell to 35% in 2012. At the end of 2014, the total number of unsold houses was over 540 thousand units in Italy, 26% of them were new constructions. Investments in refurbishment now exceed those for new buildings. Actually the 70% of residential housing stock was built before 1970 and it needs to be adapted to new levels of energy efficiency, seismic safety, inclusiveness and comfort. Investments in refurbishment now exceed those for new buildings. The swap term, borrowed from finance field, indicates the flow exchange between two counterparts: Smart Swap Building wants to use the unsold housing stock as temporary accommodation for the inhabitants of areas in which a renewal program take place. The overall objective of this doctoral research is to evaluate the feasibility of BIM tools adoption in the Smart Swap Building workflow. These electronic tools not only allow a transparent design phase but covers the whole building process, relating technological and structural elements with construction scheduling (4D), cost estimation (5D), certification (6D) and management of the life cycle (7D + CAFM). Trying to meet European challenges of soil consumption and emission reduction, energy efficiency and living comfort, and involving the growing unsold housing stock, the Smart Swap Building project, aimed at the refurbishment of existing housing stock, has the strong need to define a set of advanced information tools to support the complex decision-making process, integrating different skills in different stages of the building life cycle. The representative tool is an integrated part of the design process and because product innovations are strictly connected to the building processes, from design to construction, to management, it becomes itself an element of project quality, allowing more sustainable and aware choices. In conclusion, the main output of the research will be guidelines aimed at digital informative tools adoption in the Smart Swap Building workflow management, and their validation through test-beds and online dissemination.