Thèses sur le sujet « Tumore polmone »

L’introduzione della tomografia computerizzata nelle applicazioni oncologiche è stata rivoluzionaria per la diagnostica delle immagini di molti organi e apparati, superando i limiti della radiologia convenzionale. Questa tecnica rappresenta, infatti, un efficace strumento nella diagnosi e caratterizzazione di numerosi tumori, in quanto questo tipo di applicazione perfusionale amalgama informazioni di natura morfologica, tipiche della TC tradizionale, con studi funzionali sui tessuti in esame. Tuttavia, diversi problemi, tra cui la mancanza di un protocollo standard sia durante la fase di acquisizione dei dati, sia durante la fase di elaborazione dei dati, costituiscono un ostacolo per la trasposizione in clinica della TCp. In questo lavoro di Tesi si è trattato principalmente della modalità di analisi dei dati: ad oggi, infatti, non è ancora stato formulato un protocollo che stabilisca in modo univoco una tecnica di analisi delle mappe perfusionali risultanti dall’elaborazione delle immagini TCp. In particolare, si è tentato di affiancare ai classici metodi di analisi di immagini noti in letteratura un ulteriore tecnica che si basa sull’analisi voxel-by-voxel della regione d’interesse su più slice e non solo su quella di riferimento. Questo studio è stato fortemente motivato dall’elevato grado di eterogeneità che caratterizza molti tessuti neoplastici. A tal proposito, l’elaborato mira ad analizzare in modo qualitativo le mappe perfusionali di slice adiacenti a quella di riferimento e a verificare se queste possano restituire informazioni aggiuntive che risultino indispensabili ai fini della formulazione di una corretta diagnosi e scelta del piano terapeutico da applicare al paziente.

Abstract Il tumore del polmone è stato recentemente associato all’infezione da papillomavirus umano (HPV). Il genoma di questo virus può integrarsi nel genoma dell’ospite in particolari locus definiti fragili e localizzati in vicinanza a geni oncosoppressori. Un possibile sito di integrazione del genoma virale di HPV è rappresentato dal locus FRA3B localizzato nel gene oncosoppressore FHIT. Questo locus genico presenta spesso alterazioni dei microsatelliti (MA), in particolare perdita di eterozigosità (LOH) in numerose tipologie di cancro compreso il tumore del polmone. In questo lavoro ci siamo proposti di studiare l’alterazione del microsatellite D3S1300 localizzato vicino al sito FRA3B in pazienti con NSCLC risultati HPV positivi. A tale scopo sono stati arruolati un totale di 26 pazienti con diagnosi di NSCLC e di questi 11 sono risultati HPV+ e 15 HPV-. Le alterazioni del microsatellite D3S1300 sono state analizzate in DNA estratto da campioni di sangue, brushing bronchiale ed Esalato Condensato (EBC) raccolti al momento dell’arruolamento. La presenza dei virus HPV nelle vie aeree è stata determinata mediante la tecnica di pirosequenziamento e genotipizzazione in tutti i pazienti NSCLC arruolati. I nostri risultati mostrano che il numero di alterazioni D3S1300 trovate sono in numero maggiore in pazienti NSCLC HPV+ rispetto a quelli risultati negativi per la presenza del virus nelle vie aeree. Non è stata trovata correlazione tra sesso, istotipo, stadiazione del tumore e la presenza di alterazioni del microsatellite D3S1300 nel DNA estratto da EBC e brushing bronchiale. I nostri dati suggeriscono che le alterazioni dei microsatelliti nel locus 3p sono presenti in pazienti NSLC HPV+ di origine caucasica e che quest’ultime possono essere coinvolte nella carcinogenesi del polmone nella popolazione infetta dal virus HPV. Ulteriori studi sono necessari per approfondire se l’analisi di queste alterazioni in campioni di EBC possa rappresentare uno strumento di screening non invasivo per questa popolazione ad elevato rischio per lo sviluppo del cancro del polmone. Abstact Lung cancer has recently been associated with human papilloma virus (HPV) infection. The most important event associated with HPV infection in cancer foresees HPV DNA integration into the host genome. Sites of integration such as the fragile site FRA3B adjacent to the FHIT frequently undergo microsatellite alterations (MAs). In this study we aim to verify the role of MAs at 3p in non-small cell lung cancer (NSCLC) with HPV positivity and eventual correlation with sex, histotype, TNM stage and cigarette smoking. We enrolled 26 NSCLC patients to analyze the presence of HPV in their airways (11 HPV+ and 15 HPV-). All subjects had allelotyping analysis of DNA from exhaled breath condensate (EBC), blood and bronchial brushing of microsatellite D3S1300 located in the chromosomal region 3p. For the first time we described the presence of MAs at 3p in EBC of NSCLC patients with HPV positivity. MAs in EBC corresponded to those in paired brushing. The number of patients with 3p MAs was higher in the group of NSCLC with HPV positivity than with HPV negativity. No relationship between the presence and type of MAs in EBC-brushing/DNA and sex, histotype or tumor stage was found. Our results suggested that MAs at 3p are present in caucasic NSLC HPV+ patients and might be involved in lung carcinogenesis. In consideration of the possible clinical usefulness of the analysis of MAS at 3p in the EBC of HPV+ patients in the non-invasive screening for lung cancer, these results merit further studies.

Negli ultimi anni sono emerse evidenze che supportano un ruolo di HPV nella patogenesi del cancro al polmone ed è stata riscontrata la presenza e l’espressione, attraverso distinte linee di ricerca, degli oncogeni di HPV nei tumori polmonari supportando l’ipotesi che forme oncogeniche del virus possano agire come cofattori nel processo carcinogenico. Per chiarire il ruolo di HPV nello sviluppo del tumore del polmone abbiamo utilizzato la linea cellulare polmonare A549 come modello cellulare e, dopo infezione con costrutti esprimenti gli oncogeni E6, E7 ed E6/E7 di HPV16, con un approccio di tipo proteomico, abbiamo studiato i cambiamenti nel profilo di espressione proteica delle diverse linee cellulari infettate, rispetto alla controparte normale, associate alla presenza degli oncogeni. Dall’analisi dei replicati dei gels bidimensionali tra le cellule non infettate e infettate stabilmente con HPV16E6/E7, si sono trovate 17 proteine differenzialmente espresse di almeno 2 volte, la cui intensità media normalizzata fosse statisticamente significativa (p<0.05). L’identificazione delle proteine è stata effettuata con esperimenti di spettrometria di massa MALDI-TOF-MS e nLC-ESI-Q-TOF-MS/MS. Le possibili relazioni e associazioni funzionali tra le proteine espresse differenzialmente nelle linee infettate con gli oncogeni di HPV16 sono state valutate tramite il programma bioinformatico Ingenuity Pathway Analysis. Il risultato, derivante da tutte e tre le diverse condizioni di infezione, suggerisce un coinvolgimento funzionale di processi di inibizione dell’apoptosi e le proteine Annexin IV, Gp96, Hsp27 e Tumor protein-translationally controlled 1 identificate come regolatori principali della sopravvivenza cellulare e inibizione della morte cellulare programmata.
In recent years data have accumulated implicating the involvement of oncogenic HPVs in bronchial carcinogenesis and the presence and expression of oncogenic HPV transcripts in non-small cell lung cancers have been reported throughout distinct studies. Taken together these data seem to support the hypothesis that oncogenic HPVs could act as co-factor in lung carcinogenesis. To further understand the role of HPV in the development of lung cancer we employed the lung cell line A549 stably infected with HPV16E6, HPV16E7 and HPV16E6/E7 constructs to investigate by a proteomic approach the protein profile changes associated with the expression of these oncogenes. Replicated 2-DE gels from uninfected and stably HPV16E6/E7 infected A549 cells were compared for changes in protein profile. We identified 17 different polypeptides whose average normalized spot intensity was statistically significant (p<0.05) and differed by 2- fold. The protein identification was achieved by peptide mass fingerprinting by MALDI-TOF-MS and nLC-ESI-Q-TOF-MS/MS peptide ladder sequencing Relationships between differentially expressed proteins and the HPV-induced infection mechanism have been clustered by knowledge-base database functional association network analysis. The results, deriving from the networks obtained from all three different infection conditions, suggested the functional involvement of a cell death inhibition pathway with central nodes including Annexin IV, Gp96, Hsp27 and Tumor protein-translationally controlled 1 as major key proteins for cell viability and inhibition of apoptosis pathway.

Il tumore al polmone è la principale causa di morte per tumore al mondo sia negli uomini che nelle donne. Il tumore polmonare non a piccole cellule (NSCLC) è il più frequente ed è relativamente insensibile a chemioterapia e radioterapia. Nonostante lo sviluppo di terapie molecolari personalizzate contro specifiche “mutazioni driver” e la combinazione di chemioterapia e terapie a bersaglio molecolare, la mortalità per tumore al polmone rimane molto alta a causa dello sviluppo di resistenza alle diverse terapie. Pertanto, rimane particolarmente urgente ricercare nuove terapie per NSCLC. Recentemente nel nostro laboratorio abbiamo scoperto p65BTK, una nuova isoforma della tirosina chinasi di bruton (BTK), la quale è risultata essere un nuovo oncogene a valle del pathway di RAS. Abbiamo dimostrato che la sua inibizione diminuisce la crescita e la sopravvivenza delle cellule di cancro del colon e ri-sensibilizza cellule tumorali resistenti ai trattamenti. Gli obiettivi di questo progetto sono: studiare il ruolo di p65BTK nel NSCLC e verificare se p65BTK può essere un nuovo target teranostico nel NSCLC. Studiando una coorte di 382 pazienti abbiamo dimostrato che p65BTK è espresso nel 50% dei tumori di pazienti con NSCLC e la sua espressione correla con l'istotipo, l’abitudine al fumo e lo stato mutazionale di EGFR. In particolare, abbiamo trovato una maggiore espressione di p65BTK in pazienti con adenocarcinoma, non fumatori e con EGFR non mutato. Generalmente questi pazienti non sono eleggibili per la terapia con inibitori di EGFR a causa della mancanza di EGFR mutato. Tramite western blot, abbiamo confermato l’over-espressione di p65BTK sia in linee cellulari umane di NSCLC mutate per RAS o per uno dei geni del pathway di RAS, che in cellule primarie derivate da tumori di topi Kras/Trp53 null, suggerendo una correlazione tra l’aumentata espressione di p65BTK e la iper-attivazione del pathway di RAS nel NSCLC. In seguito, abbiamo dimostrato che l'inibizione di p65BTK tramite diversi inibitori di BTK (Ibrutinib, AVL-292, RN486) riduce efficacemente la proliferazione e la clonogenicità di linee di NSCLC con differenti background genetici. Per determinare se p65BTK può essere considerato un nuovo bersaglio terapeutico nel NSCLC, abbiamo trattato linee resistenti di NSCLC con chemioterapia (Cisplatino, Gemcitabina, Pemetrexed) o inibitori di EGFR (Gefitinib, Erlotinib) in singolo, o in combinazione con concentrazioni non tossiche degli inibitori di BTK, valutandone l’effetto sulla vitalità cellulare. Gli inibitori di BTK usati in combinazione con gli inibitori di EGFR o con la chemioterapia sono risultati più efficaci nel ri-sensibilizzare le linee di NSCLC scarsamente responsive ai trattamenti standard e le diverse combinazioni hanno mostrato diversi gradi di sinergia. In conclusione, abbiamo dimostrato che p65BTK è over-espressa nei tumori di pazienti con NSCLC e in linee cellulari umane e murine di NSCLC. Pertanto, i nostri dati indicano p65BTK come un emergente target nel NSCLC e suggeriscono che la combinazione di inibitori di BTK e chemioterapia o terapia a bersaglio molecolare potrebbe rappresentare un nuovo approccio per superare la resistenza alle terapie nel NSCLC. I prossimi passi saranno volti a validare gli effetti dell'inibizione di p65BTK in modelli ex vivo (sferoidi derivati da cellule di NSCLC) e in vivo in modelli murini di NSCLC.
Lung cancer is the leading cause of cancer-related death worldwide both in men and women. In particular, Non-Small Cell Lung Cancer (NSCLC) is the most common subtype and is relatively insensitive to chemotherapy and radiation therapy. Despite the development of personalized molecular targeted therapies against specific driver mutations and the combination of chemotherapy with targeted therapy, lung cancer mortality remains very high because of intrinsic and acquired resistance. Thus, new strategies to overcome these limitations are needed. Recently, we discovered a new isoform of the Bruton Tyrosine Kinase (BTK), referred as p65BTK. We characterized p65BTK as a novel oncogene and a pivotal downstream effector of RAS. Moreover, we showed that its inhibition affected growth and survival of colon cancer cells and reverted resistance to chemotherapy. The aims of this project were: study the role of p65BTK in NSCLC cell biology and verify whether p65BTK may be a novel theranostic target in NSCLC. Studying a cohort of 382 patients, we observed that p65BTK was expressed in 50% of NSCLC patients’ tumors and its expression correlated with histotype, smoke habit and EGFR mutational status. In particular, we found p65BTK significantly more expressed in adenocarcinoma than in squamous carcinoma histotype and in non-smoker as compared to smoker patients. Moreover, its expression was significantly higher in non-smoker patients bearing wild type EGFR. Notably, these patients are not eligible for treatments with EGFR inhibitors due to a lack of EGFR mutation. By western blot analysis we confirmed p65BTK overexpression both in vitro, in NSCLC human cell lines with mutations in RAS or in one of the components of the RAS/MAPK pathway, and ex vivo, in tumor-derived primary cells from Kras/Trp53 null mice, suggesting that p65BTK overexpression correlate with a hyper-activated RAS/MAPK pathway also in NSCLC. Then, we showed that p65BTK inhibition by different BTK inhibitors (Ibrutinib, AVL-292, RN486) strongly impaired proliferation and clonogenicity of NSCLC cell lines with different genetic backgrounds. To determine if p65BTK could be a new theranostic target in NSCLC, representative resistant cell lines were treated with chemotherapy (Cisplatin, Gemcitabine, Pemetrexed) or EGFR-targeted therapy (Gefitinib, Erlotinib) alone or in combination with non-toxic concentrations of BTK inhibitors and then their viability was assessed. We found that BTK inhibitors were effective in re-sensitizing NSCLC cells scarcely responsive to the current treatments when used in combination with EGFR-targeted therapy or chemotherapy. However, the different BTK inhibitors’ combinations showed a better or worse synergy depending on which EGFR inhibitor or chemotherapeutic drug they were combined with. Thus, we demonstrate that p65BTK is overexpressed in NSCLC patients’ tumors and in human and murine NSCLC cells. Moreover, our data indicate p65BTK as an emerging actionable target in NSCLC and suggest that the combination of BTK inhibitors with chemotherapy or targeted therapy may represent a novel therapeutic approach to overcome drug resistance in NSCLC. As future perspectives, we will validate the effects of p65BTK inhibition in ex-vivo (spheroids derived from NSCLC cells) models and in in vivo mouse model of NSCLC.

Le ultime ricerche in campo oncologico sulle cure antitumorali sono indirizzate verso una categoria definita target therapy. In particolare tra le più promettenti, le terapie antiangiogenetiche, il cui scopo primario è quello di limitare l’apporto di sangue al tumore. In questo contesto la Tomografia Computerizzata (TC) perfusionale rappresenta un’importante tecnica di imaging radiologico in grado, teoricamente, di fornire misure quantitative, che permettano una valutazione, anche precoce, della risposta alle terapie antiangiogenetiche. I principali problemi aperti in questo campo riguardano la standardizzazione dei protocolli di acquisizione e di elaborazione delle sequenze perfusionali, che determinano la scarsa riproducibilità dei risultati intra- ed inter-paziente, non consentendone l’uso nella pratica clinica. In letteratura sono presenti diversi studi riguardanti la perfusione dei tumori polmonari, ma vi sono pochi studi sull’affidabilità dei parametri perfusionali calcolati. Questa Tesi si propone di analizzare, quantificare e confrontare gli errori e l’affidabilità dei parametri perfusionali calcolati attraverso la TC perfusionale. In particolare, vengono generate delle mappe di errore ed effettuati dei confronti di diverse regioni del polmone sano. I risultati ottenuti dall’analisi dei casi reali sono discussi al fine di poter definire dei livelli di affidabilità dei parametri perfusionali e di quantificare gli errori che si commettono nella valutazione dei parametri stessi. Questo studio preliminare consentirà, quindi, un’analisi di riproducibilità, permettendo, inoltre, una normalizzazione dei valori perfusionali calcolati nella lesione, al fine di effettuare analisi intra- ed inter-paziente.

Nella ricerca medica, nonostante la crescente evidenza che il sesso potrebbe essere un modificatore dell’effetto dei trattamenti, differenze basate sul sesso nella presentazione, progressione, eventi avversi e nel trattamento delle malattie sono raramente analizzate. Solo nel 2018, Conforti e colleghi hanno evidenziato per la prima volta che considerando pazienti affetti da diversi tipi di tumori in stadio avanzato e trattati con gli inibitori dei checkpoint immunitari, in monoterapia o come terapia combinata, gli uomini ottenevano un beneficio maggiore in sopravvivenza rispetto alle donne. L'obiettivo generale di questa tesi di dottorato è quello di estendere le conoscenze precedenti (limitate) delle differenze basate sul sesso nell'efficacia dell'immunoterapia e di esplorare i meccanismi a livello molecolare che regolano la risposta immunitaria antitumorale negli uomini e nelle donne. In primo luogo abbiamo studiato se, e confermato che, le donne con carcinoma polmonare avanzato traggono maggiore beneficio rispetto agli uomini dalla combinazione della chemioterapia con un anti-PD-1/PD-L1. Abbiamo anche trovato un'interazione tra il sesso e l'efficacia in termini di sopravvivenza di due strategie terapeutiche (anti-PD-1/PD-L1 da soli o in combinazione con la chemioterapia rispetto alla chemioterapia standard) con direzione opposta dell'effetto negli uomini e nelle donne: gli uomini traggono maggior beneficio con un trattamento anti-PD-1 da solo, mentre le donne hanno una migliore sopravvivenza con un anti-PD-1/PD-L1 più chemioterapia. Successivamente abbiamo studiato il dimorfismo di genere della risposta all'immunoterapia contro il tumore del polmone, ipotizzando che l'eterogeneità della risposta a diverse strategie immunoterapeutiche fosse dovuta a differenze nei meccanismi molecolari che guidano la risposta immunitaria antitumorale negli uomini e nelle donne. Abbiamo osservato un minor riconoscimento del tumore e una minore infiltrazione del sistema immunitario negli uomini rispetto alle donne. In particolare, negli uomini, abbiamo riscontrato una minore abbondanza di cellule immunitarie nel microambiente tumorale, un più alto T-cell exclusion score, una minore diversità di repertorio dei recettori delle cellule T e una minore quantità di ubiquitous TCR. Un'infiltrazione immunitaria così povera dei tumori negli uomini potrebbe dipendere da una presentazione dei neoantigeni tumorali meno efficiente al sistema immunitario, a causa dei livelli di espressione più bassi delle molecole di antigene leucocitario umano (HLA) di classe I e II, maggiore frequenza di I perdita di eterozigosi per HLA di tipo I e/o alterazioni in altre componenti del meccanismo di presentazione dell'antigene. Abbiamo anche dimostrato che, tra le vie molecolari e i processi biologici più arricchiti nel microambiente tumorale femminile, ve ne erano molti direttamente correlati alla risposta immunitaria antitumorale. Al contrario, nessuno dei gene sets trovati significativamente arricchiti nei tumori maschili era direttamente correlato alla risposta immunitaria antitumorale. Inoltre, abbiamo fornito un chiaro esempio delle potenziali implicazioni cliniche dei nostri risultati, mostrando differenze significative nell'associazione tra carico mutazionale del tumore e il beneficio di sopravvivenza osservato in uomini e donne trattati con anticorpi anti-PD-1/PD-L1. Abbiamo implementato diversi metodi statistici: le meta-analisi per combinare i risultati di diversi studi; il modello di Cox per analizzare i dati di sopravvivenza; le spline cubiche ristrette come mezzo per indagare gli scostamenti dalla linearità e per modellare la relazione tra covariate continue e gli outcome di sopravvivenza di interesse. Inoltre, abbiamo implementato la metodologia Gene Set Enrichment Analysis nel software statistico SAS con un’estensione alle meta-analisi.
In the last decade lots of research efforts were put in the field of immunotherapy, a relatively new class of treatments that boost the body’s natural defenses to fight against cancer. In medical research, despite growing evidence that sex (i.e., differences between men and women at biological level) might be a disease treatment modifier, sex-based differences in the presentation, progression, adverse events as well as in the prophylactic or therapeutic treatment of diseases were rarely analyzed and reported. Only in 2018, Conforti and colleagues found, for the first time, that considering patients affected by several types of advanced cancers, and treated with immune checkpoint inhibitors as monotherapy or as a combination therapy, males derive larger effect on OS then females do. The overall aim of this doctoral thesis was to extend previous (limited) knowledge on sex-based differences in cancer immunotherapy efficacy and to further explore mechanisms at molecular level that regulate anticancer immune response in men and women. First, we investigated whether, and confirmed that, women with advanced lung cancer derive larger benefit than men from the combination of chemotherapy to an anti-PD-1/PD-L1. We found also an interaction between patients’ sex and the efficacy in OS of two therapeutic strategies (anti-PD-1/PD-L1 alone or in combination with chemotherapy compared to standard chemotherapy) with opposite direction of the effect in men and women: men derive larger benefit than women with an anti-PD-1 treatment alone, while women have better survival with anti-PD-1/PD-L1 plus chemotherapy. Then we deeply studied the sex-based dimorphism of the response to lung cancer immunotherapy, conjecturing that the heterogeneity of response to different immunotherapeutic strategies might be due to differences in the molecular mechanisms that drive anticancer immune response in men and women. We observed a less efficient tumor recognition and infiltration by immune system in men compared to women. In particular, in men, we found a lower abundance of a number of immune cell types in the tumor microenvironment (TME), a significantly higher T-cell exclusion score, a smaller T-cell receptors repertoire diversity and a lower amount of ubiquitous expanded T-cell receptors. We found that such poorer immune infiltration of tumors in men may depend on a less efficient tumor neoantigens presentation to the immune-system, due to lower expression levels of human leukocyte antigen (HLA) class I and II molecules, higher frequency of HLA type I loss of heterozygosity and/or alterations in other component of the antigen presentation machinery. We also showed that, among the molecular pathways and biological processes most significantly enriched in the TME of women, there were many directly related to the anticancer immune response. Contrary, none of the gene sets found significantly enriched in tumors arising in men were directly related to anticancer immune responses. Moreover, we provided a clear example of the potential clinical implications of our findings, showing significant differences in the association between tumor mutational burden and survival benefit observed in men and women treated with anti-PD-1/PD-L1 antibodies. We implemented several statistical methods to answer the different questions depending on the aim of each study. We used meta-analyses to combine results from several studies and to produce estimates of the overall sex-effect of interest. We used cox proportional hazard regression model to analyze survival data and, as a mean to investigate departures from linearity, restricted cubic splines were applied to model the relationship between continuous covariates and the survival outcome of interest. Several bioinformatic tools were used to process the data. Moreover, we implemented the Gene Set Enrichment Analysis methodology in the statistical software SAS with an extension to meta-analysis.

Lung cancer remains the leading cause of cancer-mortality worldwide, mainly due to late diagnosis. Thus, the identification of biomarkers for an early detection would bring great benefit not only for patients but also for high risk subjects. This project was aimed to discover plasma biomarkers potentially useful to enhance our capabilities to identify those individuals at higher risk of lung cancer in heavy smokers population, enrolled in the Multicentric Italian Lung Detection (MILD) program. To this end, we performed multiparametric analysis of proteins and metabolites linked to systemic (Serum Amyloid A, SAA; Paraoxinase 1, PON1; and 50 plasmatic cytokines) and local (proteins and metabolites in exhaled breath condensate, EBC) inflammation and oxidative stress. We also studied the relationships between these parameters and the pulmonary function measured as FEV1 (forced esxpiratory volume in 1 s). Very recently we have demonstrated that increased plasma levels of the acute phase protein SAA and decreased FEV1 levels are associated with an increased risk of lung cancer incidence in heavy smokers. On this basis, for an efficacious detection of the high risk subgroup among the heavy smoking population, we explored the relationship between SAA plasma levels and FEV1. Importantly, we found a significant inverse correlation between these parameters, suggesting that increased levels of SAA are associated to decreased pulmonary function. We then evaluated a group of cytokines by Bio-Plex Suspension Array System, allowing the simultaneous detection of 50 cytokines. According to assessed SAA levels, we evaluated 142 plasma samples by Bio-Plex. By univariate analysis of obtained results we found that SAA levels correlated directly with cytokine levels of IL-12(p40), GRO-α, HGF, MCP-3, M-CSF, SCGF, SDF-1α, IL-6 and IP-10 and that FEV1 values correlated inversely with GRO-α, HGF, MCP-3, β-NGF, SCGF and MIG concentrations. MIG showed the best association with FEV1. Multivariate analysis highlighted an association between SCGF, CTACK, MIF, MIG, IL-16 and Eotaxin. Additionally, we assessed PON1 levels by Western blot and ELISA in the 142 samples. Our data showed an inverse correlation between PON1 and the major acute phase protein CRP (C reactive protein) as well as between PON1 and SAA together with a direct correlation between PON1 and FEV1. This supported our hypothesis that the decrease of the anti-oxidant function corresponds to a systemic increase of acute phase inflammatory proteins and a decrease of pulmonary function. Regarding the locally produced proteins and metabolites we evaluated inflammatory and oxidative stress parameters in 18 EBC samples derived from heavy smokers and 18 obtained from lung cancer patients. By mass spectrometry analysis and immunoenzymatic assays (ELISA, EIA, BIO-PLEX) we generated protein profiles and assessed the levels of Surfactant Protein C, Leucotrien B4, 8-Isoprostane and a group of 14 cytokines. Noteworthy, we could detect an interesting increased level of 8-Isoprostane in EBC samples of lung cancer patients with respect to those derived from heavy smokers. Taken together our multiparametric analyses highlighted the existance of interesting relationships between specific plasma or EBC components and the impairment of lung function. This supports the interesting possibility we have identified potential biomarkers useful for the evaluation of lung cancer risk. However, their effective clinical applicability will be investigated in future studies using a higher number of subjects.

Il carcinoma polmonare è una delle prime cause di morte non solo in Italia, ma anche in tutto il resto del mondo. In particolare, nel nostro paese l’ AIRTUM (Associazione Italiana Registri Tumori) ha stimato 42.500 nuove diagnosi di tumore del polmone nel 2019, che rappresentano il 15% di tutte le diagnosi di tumore negli uomini e il 12% nelle donne. Il 95% delle neoplasie polmonari può essere classificato come SCLC (Small-Cell-Lung-Cancer), detto anche microcitoma, o NSCLC (Non-Small-Cell-Lung-Cancer) in base all’aspetto delle cellule tumorali analizzate al microscopio. Quest’ultima tipologia è la più frequente e nel 30-55% delle diagnosi dà origine a focolai metastatici a livello osseo, associati a complicanze scheletriche, nocicezione e peggioramento della qualità di vita dei pazienti. I trattamenti terapeutici attualmente implementati per il controllo delle sedi neoplastiche includono la somministrazione di inibitori del riassorbimento osseo, radioterapia e chirurgia ortopedica; tuttavia, per limitare gli effetti collaterali associati a queste terapie e incrementare l’efficienza delle cure, sono in corso numerosi studi per lo sviluppo di strategie terapeutiche basate sull’utilizzo di nanoparticelle per applicazioni di drug delivery e ablazione fototermica.

BACKGROUND Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) and lung cancer are two catastrophic diseases, representing leading causes of morbidity and mortality worldwide. Although the treatment has greatly improved both diseases continue to show increasing frequency and above all an unpredictable progression. Several studies have firmly established a strict connection between COPD and lung cancer highlighting also the importance of the inflammatory response as a risk factor for both diseases. The inflammatory paradigm is undoubtedly one of the most fascinating theories to connect COPD and lung cancer and it has acquired new impetus by the recent discoveries in the COPD pathogenesis. Emerging evidence in this context has emphasized the role of adaptive immune responses, possibly with an autoimmune component due to the recognition of pulmonary selfantigens modified by cigarette smoking and to the failure of mechanisms regulating immunological tolerance. In this context, COPD-associated cancers might have specific pathogenetic and morphological features, differently from tumours arising in non-COPD patients, due to the synergic effect of cigarette smoke and chronic inflammation. AIM OF THE RESEARCH This research project focuses on the study of lung cancer in patients with COPD compared to smokers without COPD and never smoker patients in order to identify eventual distinct clinical, morphological and molecular phenotypes. MATERIALS AND METHODS From 2010 to 2012, we prospectively enrolled patients with peripheral non small lung cancer submitted to anatomical lung resection (lobectomy, bilobectomy or pneumonectomy) associated with systematic lymphadenectomy. Patients with central airway cancer, secondary lung tumours or previously submitted to inductive treatment were excluded from the study. According to respiratory functional tests and smoking history patients were then divided in 3 groups: COPD patients, smokers without COPD and never-smoker subjects with normal lung function (FEV1/FVC ratio >70%). Each patient underwent a full clinical and instrumental assessment. Morphological studies included detailed analysis of growth pattern (according to the latest revision of adenocarcinoma classification), cell proliferation (Ki67/MIB1 expression), parameters of intra-and peri-tumoral remodelling (inflammation, fibrosis and necrosis) and tumoural detection of interleukin-17 (IL-17) cytokine. Genetic analysis of EGFR and KRAS mutations was also performed in all cases. RESULTS In the study period, 66 patients who met the inclusion/exclusion criteria were initially enrolled:16 COPD, 32 smokers without COPD and 18 never smokers. As the selection criteria affected the predominant histologic profile with a clear predominance of the adenocarcinoma histotype (63% in COPD patients, 71% in smokers and 56% in neversmokers), we performed our investigations only in patients with this histology to obtain results not affected by different histotypes. Therefore the study group was composed of 43 patients (10 COPD, 23 smokers and 10 never-smokers), whose main demographic and functional parameters were comparable except for male/female ratio, reversed in never-smokers, and for lung function, reduced in COPD patients, as expected. Given the specific aim the comparison of different clinical, morphological and molecular data was mainly performed within the category of smoking patients (COPD patients and smokers without COPD), while never smokers represented control group. From a clinical point of view the most important differences concern the number of peripheral blood basophils and standard uptake value of positron emission tomography–computed tomography (SUV of PET-CT). COPD patients showed a significant higher number of basophils and lower SUV of PET-CT than smokers without COPD. Concerning the histological evaluation adenocarcinoma of COPD patients showed a more frequent lepid pattern, less evident solid aspect and lower MIB1/Ki67 index than adenocarcinoma of smokers without COPD. A significant more extensive necrosis was found in adenocarcinoma of COPD and smokers without COPD compared to never-smokers. Finally although not statistically significant a stronger IL17 tissue expression was observed in COPD cases compared to smokers without COPD. As regards molecular data the most interesting finding was a trend of less frequency of KRAS mutation in adenocarcinoma of COPD patients. CONCLUSIONS Adenocarcinoma in COPD patients presents clinical, molecular and morphological features of lower aggressiveness (higher number of basophils, low SUV of PET-CT, increased lepidic component, reduced solid pattern, lower cell proliferation and less frequent K-RAS mutation) compared to that of smokers without COPD. Alternative mechanisms of carcinogenesis may be involved in the development/progression of lung cancer in COPD patients. Given the importance of inflammation in the pathogenesis of the disease other mechanisms, such as IL-17 pathway, mainly driving inflammatory mediated carcinogenesis might be crucial. Additional knowledge of these mechanisms would be of considerable help in the fight against lung cancer especially concerning therapeutic perspectives, providing a rational basis for the development of targeted and more effective treatments.
INTRODUZIONE La BPCO e il tumore polmonare sono due malattie catastrofiche e rappresentano alcune tra le principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Sebbene il trattamento di queste patologie è notevolmente migliorato negli ultimi anni, esse continuano a presentare una crescente incidenza e soprattutto un andamento clinico non prevedibile a priori. Lo stesso termine "tumore polmonare non a piccole cellule (NSCLC)" comprende un gruppo di malattie neoplastiche con caratteristiche cliniche e molecolari estremamente eterogenee. Diversi studi hanno ormai fermamente stabilito la stretta connessione tra la BPCO e il cancro del polmone evidenziando anche l'importanza della risposta infiammatoria agli stimoli nocivi, in particolare il fumo di sigaretta, come fattore di rischio fondamentale per entrambe le malattie. La teoria infiammatoria è senza dubbio uno dei paradigmi più affascinanti per collegare la BPCO e il tumore polmonare e ha acquisito un nuovo impulso dalle più recenti scoperte nella patogenesi della BPCO. Infatti, sono emerse in questo campo evidenze importanti che hanno sottolineato il ruolo fondamentale di risposte immunitarie adattative, anche con una componente autoimmune dovuta sia al riconoscimento di auto-antigeni polmonari modificati dal fumo di sigaretta sia al fallimento dei meccanismi che regolano la tolleranza immunologica. In questo contesto, le neoplasie a insorgenza in pazienti con BPCO, per effetto sinergico del fumo e di una specifica infiammazione cronica, potrebbero possedere specifiche caratteristiche patogenetiche e morfologiche, differenti da tumori di altre popolazioni non affette da BPCO. SCOPO DELLA RICERCA Questo progetto di ricerca si concentra sullo studio del cancro del polmone nei pazienti con BPCO comparandolo a due gruppi di controllo, composti da fumatori sani e pazienti non fumatori, al fine di individuare distinti fenotipi neoplastici dal punto di vista bioumorale, morfologico e molecolare. MATERIALI E METODI Dal 2010 al 2012, sono stati arruolati nello studio pazienti con NSCLC in sede periferica sottoposti a resezione polmonare anatomica (lobectomia, bilobectomia o pneumonectomia) associata a linfadenectomia sistematica. I pazienti con neoplasia a carico delle vie aeree centrali, con tumore polmonare secondario o precedentemente sottoposti a trattamento chemioradioterapico sono stati esclusi dal progetto. Ogni paziente è stato sottoposto ad una completa valutazione clinica e strumentale, che ha compreso i test di funzionalità polmonare polmonari (i criteri GOLD sono stati utilizzati per identificare i pazienti con BPCO), radiografia del torace/TAC torace/18FDG PET-TC analisi del sangue. I pazienti sono stati poi divisi in 3 gruppi in base alle prove funzionali respiratorie e alla storia di fumo: pazienti con BPCO, soggetti fumatori e pazienti non fumatori con funzione polmonare normale (rapporto FEV1/FVC> 70%). Lo studio istologico della neoplasia è stato caratterizzato da: stadiazione pTNM, analisi morfometrica del pattern di crescita (secondo l'ultima revisione della classificazione del cancro del polmone), proliferazione cellulare (mediante valutazione dell’espressione di Ki67/MIB1), i parametri di rimodellamento intra-e peri-tumorale (infiammazione, fibrosi, necrosi) e la caratterizzazione del pattern citochinico di IL-17 a livello peri-e intra-tumorale. Infine è stata eseguita l'analisi genetica delle mutazioni dei geni EGFR e KRAS. RISULTATI Nel periodo di studio sono stati inizialmente arruolati 66 pazienti che rispettavano i criteri di inclusione/esclusione, di cui 16 BPCO, 32 fumatori senza BPCO e 18 non fumatori. Poiché i criteri di selezione hanno profondamente condizionato il profilo istologico predominante, con una netta prevalenza dell’istotipo adenocarcinoma (63% nella BPCO, 71% nei fumatori e 56% nei non fumatori), abbiamo deciso di condurre la valutazione neoplastica funzionale, morfologica, molecolare solo nell’ istologia prevalente. Pertanto, il gruppo di studio è risultato composto da 43 pazienti (10 BPCO, 23 fumatori, 10 non fumatori), che presentavano comparabili dati demografici e funzionali ad eccezione del rapporto maschio/ femmina, invertito nei non fumatori, per la funzione polmonare, ridotta nei pazienti con BPCO. Dato l'obiettivo specifico, il confronto dei differenti dati clinici, morfologici e molecolari è stato svolto prevalentemente all'interno della categoria dei soggetti fumatori (pazienti affetti da BPCO e fumatori senza BPCO), mentre i pazienti con storia negativa di fumo hanno rappresentato il gruppo di controllo.Da un punto di vista clinico, le più rimarcabili differenze sono emerse a livello del numero di basofili nel sangue periferico e del valore di standard uptake value (SUV) all’indagine PET-TC. Infatti i pazienti con BPCO hanno mostrato un numero significativamente superiore di basofili e un SUV inferiore rispetto ai soggetti fumatori senza BPCO. Per quanto riguarda la valutazione istologica, gli adenocarcinomi nei pazienti con BPCO hanno presentato un aumento del pattern lepidico, con riduzione della componente solida e una più bassa espressione del Ki67/MIB1 rispetto ai tumori dello stesso istotipo insorti in soggetti fumatori senza BPCO. Si è evidenziata una maggiore rappresentazione della componente necrotica negli adenocarcinomi dei pazienti fumatori, con o senza BPCO, rispetto al gruppo dei non fumatori. Infine un forte ma non significativo aumento di IL-17 è stato osservata nei casi con BPCO rispetto ai fumatori. L’analisi molecolare ha permesso di osservare, come dato più rilevante, un trend di ridotta frequenza di mutazione di KRAS negli adenocarcinomi dei pazienti con BPCO rispetto alle neoplasie del gruppo dei fumatori. CONCLUSIONI Gli adenocarcinomi correlati alla BPCO sono emersi presentare caratteristiche cliniche, morfologiche e molecolari di minore aggressività (aumento del numero di basofili, ridotto SUVmax alla PET-TC, aumento della componente lepidica, ridotti pattern solido e proliferazione cellulare e meno frequente mutazione di K-RAS) rispetto alle neoplasie insorte in pazienti fumatori senza BPCO. Vie alternative di carcinogenesi potrebbero essere coinvolte nello sviluppo/progressione del tumore polmonare dei pazienti con BPCO. Data l'importanza dell'infiammazione nella patogenesi di questa malattia polmonare, altri meccanismi, quale il pathway di IL-17, potrebbero essere cruciali per lo sviluppo cancerogenetico principalmente mediato dall’infiammazione. La conoscenza di questi meccanismi potrebbe essere di notevole aiuto nella lotta contro il tumore polmonare soprattutto per quanto riguarda nuove prospettive terapeutiche, fornendo le basi per sviluppare trattamenti mirati e con maggiore efficacia.

Background: MPLC represents a diagnostic challenge. Topic of the discussion is how to distinguish these patients as a metastatic or a multifocal disease. While in case of the different histology there are less doubt on the opposite in case of same histology is mandatory to investigate on other clinical features to rule out this question. Matherials and Methods: A retrospective review identified all patients treated surgically for a presumed diagnosis of SPLC. Pre-operative staging was obtained with Total CT scan and fluoro-deoxy positron emission tomography and mediastinoscopy. Patients with nodes interest or extra-thoracic location were excluded from this study. Epidermal growth factor receptor (EGFR) expression with complete immunohistochemical analisis was evaluated. Survival was estimated using Kaplan-Meyer method, and clinical features were estimated using a long-rank test or Cox proportional hazards model for categorical and continuous variable, respectively. Results: According to American College Chest Physician, 18 patients underwent to surgical resection for a diagnosis of MPLC. Of these, 8 patients had 3 or more nodules while 10 patients had less than 3 nodules. Pathologic examination demonstrated that 13/18(70%) of patients with multiple histological types was Adenocarcinoma, 2/18(10%) Squamous carcinoma, 2/18(10%) large cell carcinoma and 1/18(5%) Adenosquamosu carcinoma. Expression of EGFR has been evaluated in all nodules: in 7 patients of 18 (38%) the percentage of expression of each nodule resulted different. Conclusions: MPLC represent a multifocal disease where interactions of clinical informations with biological studies reinforce the diagnosis. EGFR could contribute to differentiate the nodules. However, further researches are necessary to validate this hypothesis.

Background: MPLC represents a diagnostic challenge. Topic of the discussion is how to distinguish these patients as a metastatic or a multifocal disease. While in case of the different histology there are less doubt on the opposite in case of same histology is mandatory to investigate on other clinical features to rule out this question. Matherials and Methods: A retrospective review identified all patients treated surgically for a presumed diagnosis of SPLC. Pre-operative staging was obtained with Total CT scan and fluoro-deoxy positron emission tomography and mediastinoscopy. Patients with nodes interest or extra-thoracic location were excluded from this study. Epidermal growth factor receptor (EGFR) expression with complete immunohistochemical analisis was evaluated. Survival was estimated using Kaplan-Meyer method, and clinical features were estimated using a long-rank test or Cox proportional hazards model for categorical and continuous variable, respectively. Results: According to American College Chest Physician, 18 patients underwent to surgical resection for a diagnosis of MPLC. Of these, 8 patients had 3 or more nodules while 10 patients had less than 3 nodules. Pathologic examination demonstrated that 13/18(70%) of patients with multiple histological types was Adenocarcinoma, 2/18(10%) Squamous carcinoma, 2/18(10%) large cell carcinoma and 1/18(5%) Adenosquamosu carcinoma. Expression of EGFR has been evaluated in all nodules: in 7 patients of 18 (38%) the percentage of expression of each nodule resulted different. Conclusions: MPLC represent a multifocal disease where interactions of clinical informations with biological studies reinforce the diagnosis. EGFR could contribute to differentiate the nodules. However, further researches are necessary to validate this hypothesis.

Il carcinoma polmonare rappresenta un problema socio-sanitario di grande rilievo, essendo la prima causa di morte per neoplasia. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (non small cell lung cancer - NSCLC) rappresenta la variante istologica più frequente (80% dei casi di tumore polmonare). Al momento della diagnosi circa il 60-70% dei pazienti presenta una malattia in stadio avanzato o metastatico non essendo suscettibile di trattamento chirurgico. Per questi pazienti il trattamento chemioterapico determina un prolungamento della sopravvivenza e un miglioramento della qualità  della vita rispetto alla sola terapia di supporto, identificandosi come standard terapeutico. L'individuazione del migliore trattamento chemioterapico per questo subset di pazienti rappresenta pertanto una delle principali sfide della ricerca oncologica. I regimi polichemioterapici si possono dividere schematicamente in tre generazioni in relazione all'introduzione nel corso degli anni di nuovi agenti chemioterapici. Con l'avvento dei regimi di terza generazione, il trattamento del NSCLC avanzato sembra aver raggiunto un plateau, mancando infatti chiare dimostrazioni di superiorità  di un regime di ultima generazione rispetto ad un altro. Tra questi l'associazione cisplatino e gemcitabina rappresenta uno dei regimi standard più utilizzati in considerazione del suo favorevole rapporto costo-beneficio. Al fine di migliorare i risultati del trattamento chemioterapico in termini di attività  ed efficacia, una possibilità  consiste nell'individuazione di parametri predittivi che ci consentano di identificare il miglior trattamento per il singolo paziente. Tra i vari parametri predittivi valutabili, un crescente interesse è stato rivolto a quelli di carattere genetico, anche grazie all'avvento di nuove tecniche di biologia molecolare e al sequenziamento del genoma umano che ha dato nuovo impulso a studi di farmacogenetica e farmacogenomica. Sulla base di queste considerazioni, in questa tesi è stato effettuato uno studio mirato a valutare l'espressione di determinanti molecolari coinvolti nel meccanismo di azione di gemcitabina e cisplatino in pazienti affetti dai due tipi istologici principali di NSCLC, adenocarcinomi e carcinomi squamocellulari. Lo studio dei livelli di espressione genica è stata effettuata in tessuti di 69 pazienti affetti da NSCLC arruolati presso l'Istituto Europeo di Oncologia di Milano. In particolare, mediante Real Time PCR è stata valutata l'espressione genica di ERCC1, hENT1, dCK, 5'-NT, CDA, RRM1 e RRM2 in 85 campioni isolati con microdissezione da biopsie provenienti dai tessuti polmonari normali o tumorali o dalle metastasi linfonodali. Le analisi di questi tessuti hanno mostrato differenze significative per i pattern di espressione genica di diversi determinanti molecolari potenzialmente utile nel predire l'efficacia di gemcitabina/cisplatino e per personalizzare i trattamenti in pazienti affetti da cancro. In conclusione, l'evoluzione delle tecniche di biologia molecolare promossa dagli studi di farmacogenetica racchiude in sè notevoli potenzialità  per quanto concerne l'ideazione di nuovi protocolli terapeutici. Identificando le caratteristiche genotipiche e i livelli di espressione geniche di determinanti molecolari implicati nella risposta ai farmaci potremmo infatti predisporre delle mappe di chemiosensibilità-chemioresistenza per ciascun paziente, nell'ottica di approntare di volta in volta le più appropriate terapie antitumorali in base alle caratteristiche genetiche del paziente e della sua patologia neoplastica.

Il carcinoma polmonare rappresenta un problema socio-sanitario di grande rilievo, essendo la prima causa di morte per neoplasia. Il carcinoma polmonare non a piccole cellule (non small cell lung cancer - NSCLC) rappresenta la variante istologica più frequente (80% dei casi di tumore polmonare). Al momento della diagnosi circa il 60-70% dei pazienti presenta una malattia in stadio avanzato o metastatico non essendo suscettibile di trattamento chirurgico. Per questi pazienti il trattamento chemioterapico determina un prolungamento della sopravvivenza e un miglioramento della qualità  della vita rispetto alla sola terapia di supporto, identificandosi come standard terapeutico. L'individuazione del migliore trattamento chemioterapico per questo subset di pazienti rappresenta pertanto una delle principali sfide della ricerca oncologica. I regimi polichemioterapici si possono dividere schematicamente in tre generazioni in relazione all'introduzione nel corso degli anni di nuovi agenti chemioterapici. Con l'avvento dei regimi di terza generazione, il trattamento del NSCLC avanzato sembra aver raggiunto un plateau, mancando infatti chiare dimostrazioni di superiorità  di un regime di ultima generazione rispetto ad un altro. Tra questi l'associazione cisplatino e gemcitabina rappresenta uno dei regimi standard più utilizzati in considerazione del suo favorevole rapporto costo-beneficio. Al fine di migliorare i risultati del trattamento chemioterapico in termini di attività  ed efficacia, una possibilità  consiste nell'individuazione di parametri predittivi che ci consentano di identificare il miglior trattamento per il singolo paziente. Tra i vari parametri predittivi valutabili, un crescente interesse è stato rivolto a quelli di carattere genetico, anche grazie all'avvento di nuove tecniche di biologia molecolare e al sequenziamento del genoma umano che ha dato nuovo impulso a studi di farmacogenetica e farmacogenomica. Sulla base di queste considerazioni, in questa tesi è stato effettuato uno studio mirato a valutare l'espressione di determinanti molecolari coinvolti nel meccanismo di azione di gemcitabina e cisplatino in pazienti affetti dai due tipi istologici principali di NSCLC, adenocarcinomi e carcinomi squamocellulari. Lo studio dei livelli di espressione genica è stata effettuata in tessuti di 69 pazienti affetti da NSCLC arruolati presso l'Istituto Europeo di Oncologia di Milano. In particolare, mediante Real Time PCR è stata valutata l'espressione genica di ERCC1, hENT1, dCK, 5'-NT, CDA, RRM1 e RRM2 in 85 campioni isolati con microdissezione da biopsie provenienti dai tessuti polmonari normali o tumorali o dalle metastasi linfonodali. Le analisi di questi tessuti hanno mostrato differenze significative per i pattern di espressione genica di diversi determinanti molecolari potenzialmente utile nel predire l'efficacia di gemcitabina/cisplatino e per personalizzare i trattamenti in pazienti affetti da cancro. In conclusione, l'evoluzione delle tecniche di biologia molecolare promossa dagli studi di farmacogenetica racchiude in sè notevoli potenzialità  per quanto concerne l'ideazione di nuovi protocolli terapeutici. Identificando le caratteristiche genotipiche e i livelli di espressione geniche di determinanti molecolari implicati nella risposta ai farmaci potremmo infatti predisporre delle mappe di chemiosensibilità-chemioresistenza per ciascun paziente, nell'ottica di approntare di volta in volta le più appropriate terapie antitumorali in base alle caratteristiche genetiche del paziente e della sua patologia neoplastica.

La Tomografia Computerizzata perfusionale (TCp) è una tecnica che permette di effettuare studi funzionali di natura emodinamica dei tessuti ispezionati, misurandone la perfusione attraverso l’analisi temporale della diffusione del mezzo di contrasto. Ricerche recenti indicano come alcuni parametri (ad esempio, il blood flow) della perfusione ematica dell’organo interessato rappresentino un valido strumento per la valutazione dell’efficacia delle terapie anti-angiogenetiche. Valutazione che, potendo avvenire già in fase precoce, senza attendere i più tardivi cambiamenti dimensionali, consente un eventuale adeguamento, altrettanto precoce, della terapia in caso di risultati parziali o di insuccesso. Tuttavia diversi problemi, tra cui la difficoltà ad ottenere misure riproducibili, dovuta alla estrema variabilità delle cause di errore, costituiscono un ostacolo alla standardizzazione e, conseguentemente, alla trasposizione in clinica della TCp. Il lavoro di tesi ha avuto come obiettivo quello di identificare le principali sorgenti di errore in tutto il processo di preparazione dell’esame, generazione e archiviazione dei dati TCp al fine di fornire a IRST-IRCCS un protocollo perfusionale che consente di tenere sotto controllo, innanzitutto, tutti i parametri relativi alla somministrazione del mezzo di contrasto e alla fase di acquisizione delle immagini. Successivamente, è stato creato un catalogo di esami perfusionali, facilmente consultabile sia dal personale medico sia da quello ingegneristico. Infine, è stato fornito il supporto, sia ai medici sia agli ingegneri, per la messa a punto di un metodo di validazione visiva dei risultati ottenuti. Contestualmente, uno dei principali risultati del lavoro di Tesi è stato quello di creare, all’interno di IRST-IRCCS, una figura che funga da “collettore” fra i radiologi e gli ingegneri dell’Università di Bologna. Proprio in questo modo è stato possibile standardizzare le procedure di esecuzione degli esami perfusionali e implementare, attraverso l’interfacciamento tra il personale medico ed i ricercatori dell’Università, i protocolli per la gestione ed il trattamento dei dati acquisiti.

L'associazione tra esposizione all'amianto e neoplasie polmonari è ben consolidata. Tuttavia, precisi dati istopatologici sono scarsamente considerati quando si studia il legame tra cancro e amianto in un approccio compensatorio. L'espressione dei miRNA è precocemente alterata dall'esposizione ad agenti cancerogeni professionali /ambientali, quindi utile per identificare un nuovo profilo correlato all'amianto in grado di distinguere una neoplasia indotta da asbesto rispetto a quella con diversa eziologia. Abbiamo condotto uno studio multifasico per identificare i miRNA associati alle neoplasie indotte dall'amianto. Sono stati inclusi quattro gruppi: pazienti con carcinoma polmonare non a piccole cellule asbesto-correlato e non (NSCLC-Asb e NSCLC), mesotelioma maligno (MM) e soggetti di controllo (CTRL). Successivamente, i miRNA selezionati sono stati valutati in una popolazione esposta all'amianto ed è stato realizzato un modello "in vitro" per identificare il meccanismo di regolazione dei miRNA indotto da asbesto. Quattro miRNA sierici costituiti dal miR-126, miR-205, miR-222 e miR-520g sono risultati coinvolti nelle neoplasie asbesto-correlate. In particolare, l'aumento dell'espressione del miR-126 e del miR-222 è stato trovato in soggetti attualmente esposti all’asbesto ed entrambi i miRNA sono coinvolti nelle principali pathway collegate allo sviluppo tumorale. Un'aumentata espressione dell’EGFR è stata trovata nelle cellule pre-cancerose indotte da asbesto, causando l'attivazione di effettori a valle (AKT e MAPK p38). L'attivazione asbesto-mediata della via EGFR-AKT ha portato alla sovra-espressione del miR-222 e alla sotto-espressione del miR-520g, che sono stati invertiti inibendo l'EGFR, suggerendo il suo coinvolgimento nella regolazione dei miRNA indotta da asbesto. Questo studio evidenzia miRNA che sono potenzialmente coinvolti in neoplasie legate all'amianto e i meccanismi di espressione in cui possono essere coinvolti nella patogenesi indotta da asbesto.
The association between asbestos exposure and lung malignancies is well established. Nevertheless, precise histopathological data are poorly considered when investigating the asbestos-cancer link in compensatory approach. MiRNA expression is early altered by exposure to occupational/environmental carcinogens, thus, useful to identify a novel asbestos-related profile able to distinguish asbestos-induced cancer from cancer with different etiology. We performed consequential study phases to identify miRNAs associated with the asbestos-induced malignancies. Four groups have been included: patients with asbestos-related and non-asbestos-related non-small cell lung cancer (NSCLC-Asb and NSCLC), malignant mesothelioma (MM), and disease-free subjects (CTRL). Next, the selected miRNAs were evaluated in an asbestos-exposed population and an ‘in vitro’ model was performed to identify the mechanism of asbestos-induced miRNA regulation. Four serum miRNAs consisting of miR-126, miR-205, miR-222 and miR-520g were found to be involved in asbestos-related malignant diseases. Notably, increased expression of miR-126 and miR-222 were found in currently exposed subjects, and both miRNAs were involved in major pathways linked to cancer development. Increased expression of EGFR was found in the asbestos-induced pre-cancerous cells, causing activation of the down-stream effector AKT and p38 MAPK signalling. Asbestos-mediated activation of EGFR-AKT pathway resulted in miR-222 upregulation and miR-520g downregulation, which were reversed by inhibiting EGFR, suggesting its involvement in asbestos-induced miRNA regulation. This study uncovers miRNAs that are potentially involved in asbestos-related malignancies and their expression outline mechanisms whereby miRNAs may be involved in asbestos-induced pathogenesis.

RAZIONALE Nonostante gli entusiasmanti risultati dell’impiego dell’immunoterapia nel trattamento delle neoplasie solide, solo il 30-40% dei pazienti presentato un beneficio a lungo termine mentre il restante 60-70% presenta progressione dopo i primi mesi di trattamento. La ricerca di biomarcatori in grado di selezionare i pazienti responsivi dai pazienti non responsivi rappresenta oggi la vera sfida dell’immuno-oncologia. In questo scenario si inserisce questo lavoro che ha l’obiettivo di investigare il ruolo prognostico/predittivo di alcuni biomarcatori. In particolare valuteremo il ruolo del pathway di IDO, il possibile ruolo del microbioma e il ruolo del fattore reumatoide. MATERIALI E METODI Sono stati arruolati pazienti affetti NSCLC in stadio IV seguiti presso Azienda Ospedaliera Sant’Andrea di Roma, Facoltà di Medicina e Psicologia Sapienza Università di Roma, da giugno 2016 a luglio 2017 Il trattamento con Nivolumab è stato somministrato a una dose standard di 3 mg / kg ogni 2 settimane fino a progressione di malattia o sviluppo di tossicità inaccettabile ANALISI CHINURENINE Abbiamo valutato i livelli sierici di trp, kyn e acido chinolinico con una cromatografia liquida modificata-metodo spettrometria di massa tandem (LC-MS / MS), ANALISI MICROBIOMA : Ogni campione di feci è stato raccolto e processato. Il DNA genomico è stato isolato dall'intero set di campioni, utilizzando il kit QIAamp DNA Stool Mini (Qiagen, Germania). La regione V1-V3 del locus RNA ribosomiale 16S (rRNA) è stata amplificata per la successiva fase di pirosequenziamento su un sequenziatore genoma 454-Junior (Roche 454 Life Sciences, Branford, USA). ANALISI DEL FATTORE REUMATOIDE In una coorte di pazienti, abbiamo determinato i livelli sierici di pre-trattamento di FR (kit ELISA in fase solida, valori superiori a 16 U / ml sono stati considerati positivi). RISULTATI ANALISI DELLE CHIMURENINE : La PFS era significativamente più lunga nei pazienti che presentavano valori inferiori di kyn / trp rispetto a pazienti con valori più elevati di kyn / trp (PFS mediana non raggiunta a 3 mesi; HR: 0,2; IC 95%: 0,06-0,62; p = 0,001). ANALISI MICROBIOMA : La meta-tassonomia del microbiota è stata descritta per i pazienti con NSCLC rispetto ai CTRL e ad ogni periodo di trattamento con Nivolumab. Nei pazienti affetti da NSCLC Rikenellaceae, Prevotella, Streptococco, Lactobacillus (p <0,05), Bacteroides plebeius, Oscillospira, Enterobacteriaceae (p <0,05) sono risultati aumentati rispetto ai CTRL. I non responder avevano Ruminococcus bromii, Dialister, Sutterella più abbondante dei pazienti responder alla terapia (p <0,05). Un po 'aumentato nei responder è apparso Akkermansia muciniphila, Bifidobacterium longum e Faecalibacterium prausnitzii (p <0,05). Propionibacterium acnes, Veillonella, Staphylococcus aureus, Peptostreptococcus apparivano significativamente sovraespressi, mentre il Clostridium perfringens era significativamente ridotto al C1 rispetto al punto temporale C3 del trattamento ANALISI DEL FATTORE REUMATOIDE : La progressione precoce della malattia è risultata significativamente più frequente nei pazienti con RF positiva (5/7, 71,4%) rispetto a quelli negativi (8/28, 28,6%, p <0,0001) CONCLUSIONE Il nostro studio suggerisce che i pazienti con elevato rapporto kyn/trp , un elevato livello plasmatico di FR sono caratterizzati da una prognosi estremamente infausta e da una resistenza primaria agli anti PD-1. Il nostro studio suggerisce inoltre che diversi profili di microbioma siano associati a rischio diverso di sviluppare cancro del polmone, ma anche come siano associati a differente risposta all’immunoterapia. I nostri dati si inseriscono nello scenario della medicina di precisione ed in particolare della immuno-oncologia di precisione in cui la ricerca del biomarcatore di risposta o resistenza è cruciale nel selezionare il paziente e ottimizzare le risorse ed i trattamenti disponibili.

Background. A leading cause of cancer deaths worldwide in both men and women is lung cancer. PET scanning is a sensitive modality for the detection of NSCLC. The major limitation of surgery in lung cancer is resection of all margins. Patients with microscopic involvement of the resection margin with tumor (R1) following seemingly complete resection have a significantly poorer prognosis than those with negative microscopic margins (R0). The optimal resection of the margins seems therefore to be a debated and fundamentally important question, which is associated with the precise operative location of the tumor. This accuracy that must be achieved is reflected in the length of the intervention, which must be as short as possible even if a very accurate procedure must be guaranteed. Different medical devices can help reduce operating times by ensuring the accuracy of tumor detection and removal of all margins. Intratumoral accumulation of the PET agent [18F]FDG can be used as a guide to identifying lesion margins of NSCLC pulmonary nodules by means of probes for radio-guided surgery, capable of detecting the high energy γ rays. The purpose of this thesis is to realize and validate a new concept, innovative probe, characterized by an active collimation system for fast radio-guided surgery, to date never conceived, using PET tracers, for the precise identification and on-going removal of the lung tumor. The goal of subsequent clinical application of this thesis is to be able to reduce operating times and to ensure negative margins in lung tumor removal, thanks to a new experimental technology of revolutionary conception. Materials and methods. A prototype of a probe for radio-guided surgery was developed. The instrument is classified in an application field between a portable gamma camera and a gamma-probes, combining a high efficiency two-dimensional view of the region of interest and a high spatial resolution. The GonioProbe comprises two integrated systems: the first one, the "Navigator", has the function to reach the gamma-rays emitting tissues, the second one, the "Lock-on-Target" system, can quickly identify the exact position of the tumor. Pre-clinical tests of the GonioProbe prototype have been performed using phantoms that reproduce the surgical theater and the position of radioactive sources (chest and lung tumor). Subsequently, tests and measurements were performed on BALB/c mice with the GonioProbe prototype. Three nude BALB/c mice (4-6 weeks old healthy female mice) were used for the experiment. The human lung cancer cell lines in the form of the solid tumor were implanted subcutaneously over the upper side of the right thigh of immune-compromised BALB/c mice. When the tumor diameters reached 6~7 mm, 250 μCi of 18F-FDG was injected intraperitoneally to the animals. The mice were scanned with the microPET (microPET Focus 120, Siemens CTI). During tests, various characteristics had been evaluated: precision in localization in terms of spatial resolution, range of radioactivity useful for the correct functioning of the instrument, instrument response time, effectiveness, time to identify the tumor lesion, accuracy in localization. Results. Mice were scanned to verify that the radiotracer is bound to the tumor tissue. The implementation of algorithms for goniometric tomography for reconstruction and visualization of images in real-time was done. The counts detected by the Gonioprobe are extremely high, this ability to effectively detect the counts is the characteristic that determines the possibility of having the directionality of the navigation system, with a short time to identify the tumor lesion. Even in most extreme conditions, the Gonioprobe, given its high sensitivity, is able to record the minimum variations in counting and to hook itself to the target after having directed the operator in the correct direction of radiation. From the statistical analysis of data collected it was determined that the expected statistical error of the Gonioprobe is less than 1 mm and therefore the Gonioprobe with respect to a commercial probe has proved to be more reliable. Conclusions. In this thesis, we have shown that thanks to the high efficiency of the GonioProbe, the amount of radioactivity to be injected in patients would be much lower than normal. Furthermore, the reduction in the time required for surgery would make it possible to further lower the dose to the operators. The problem of negative margins is fundamental, this issue could be easily solved thanks to the GonioProbe. In fact, due to the radical possibility of discriminating the lesion from the background, it will be possible to verify that there are no tissue residues in the operating bed. In conclusion, this technological advancement would allow a more effective and faster thoracic surgery in order to help the surgeon to definitively eradicate lung cancer.