Littérature scientifique sur le sujet « Transport intracellulaire des protéines »

La reprogrammation métabolique est l’un des marqueurs de la carcinogenèse. Au cœur de cette reprogrammation se trouvent les mitochondries qui produisent l’énergie sous forme de molécules d’ATP. La régulation spatio-temporelle de la production d’ATP, indispensable pour fournir l’énergie au bon endroit et au bon moment, est assurée par le transport intracellulaire des mitochondries. Les complexes Miro/TRAK présents à la surface des mitochondries se lient aux protéines motrices de la cellule (dynéine, kinésine, myosine) pour transporter les mitochondries le long du cytosquelette. Ces acteurs du transport mitochondrial sont souvent dérégulés dans le cancer. Nous présentons dans cette revue les mécanismes par lesquels le transport mitochondrial contribue à la migration, à la division cellulaire et à la réponse au stress des cellules cancéreuses. Décrypter ces mécanismes pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques en oncologie.

Les molécules de classe II du complexe majeur d’histocompatibilité(CMH) jouent un rôle clé dans l’induction de l’immunité. Chez le bovin, les molécules de classe II du CMH, codées par les loci DR et DQ, sont constituées par deux chaînes protéiques, α et β, qui sont associées à une chaîne invariante (I) durant leur transport intracellulaire. Des cellules endothéliales bovines (BBEC) de microvaisseaux cérébraux peuvent être cultivées in vitro et n’expriment pas de manière constitutive des molécules de classe II du MHC. Néanmoins, après traitement avec de l’interféron γ bovin (INFγ), les BBEC synthétisent des protéines de classe II du CMH. Une infection in vitro des BBEC par C. ruminantium a été effectuée sur des cellules traitées ou non par l’INFγ. L’expression des molécules de classe II a été suivie, au niveau des ARN, par analyse de “northern blot”. Quarante huit heures après l’infection, des transcrits correspondant à la chaîne I ont été détectés sur toutes les cellules infectées. Deux ARNmDQα de 1,3 et 1,5 kb sont présents sur les cellules infectées et traitées à l’INFγ, alors qu’un simple transcrit DQα de 1,5 kb a été observé sur les cellules seulement infectées. D’autre part, les cellules traitées mais non infectée sont montré un simple ARNmDQα de 1,3 kb. La nature et la fonctionnalité de l’espèce moléculaire de 1,5 kb demeurent inconnues, mais elle pourrait représenter un ARNmDQα polyadénylé en un deuxième site en aval du premier site de polyadénylation. En contraste de l’expression précoce des chaînes I et DQα, les ARNmDRα n’ont été détectés que sept jours après l’infection. Il est important de noter qu’une lyse totale des BBEC infectées n’a été obtenue qu’au treizième jour de l’infection, alors que les cellules infectées et traitées par l’INFγ ont montré un effet cytopathogène plus précoce et plus marqué. Les résultats présentés ici montrent que les molécules de classe II du CMH peuvent être induites sur les BBEC après infection par C. ruminantium, ce qui nous mène à l’hypothèse que les cellules endothéliales de cerveau peuvent exercer une fonction immune spécifique, comme la présentation d’antigènes. Des expériences supplémentaires doivent être accomplies de manière à évaluer si oui ou non ces cellules infectées peuvent spécifiquement stimuler des cellules T.

Les myopathies myofibrillaires sont un groupe de pathologies cliniquement et génétiquement hétérogènes mais partageant des caractéristiques histologiques communes. On retrouve au niveau du muscle des modifications de la structure des myofibrilles associées à une accumulation intracellulaire de protéines. Les manifestations cliniques sont variables d’un individu à l’autre mais marquées par une faiblesse musculaire généralement lentement progressive. À l’heure actuelle, neuf gènes codant des protéines faisant partie de la strie Z ont été identifiés à ce jour comme responsables de myopathie fibrillaire.

Les récepteurs couplés aux protéines G ou RCPG sont les récepteurs membranaires les plus abondants de notre génome avec environ 800 membres. Ils jouent un rôle essentiel dans la plupart des phénomènes physiologiques et physiopathologiques. De plus, ils constituent 30 % des cibles de médicaments actuellement commercialisés et restent un réservoir important pour de nouvelles thérapies innovantes. Leurs principaux effecteurs sont les protéines G hétérotrimériques. Celles-ci sont composées de 3 sous-unités, α, β et γ qui, lors du couplage avec un RCPG, se dissocient en Gα et Gβγ pour activer de nombreuses voies de signalisation. Cet article décrit certaines des avancées récentes dans la compréhension du fonctionnement et du rôle des protéines G hétérotrimériques. Après une courte introduction sur les RCPG, l’historique de la découverte des protéines G est décrit succinctement. Ensuite, les mécanismes fondamentaux de l’activation, la signalisation et la régulation des protéines G sont passés en revue. Les nouveaux paradigmes qui concernent la signalisation intracellulaire, la reconnaissance spécifique des protéines G par les RCPG ainsi que la signalisation biaisée sont également abordés.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de récepteurs membranaires. Classiquement, il était admis que la signalisation des RCPG, résultant de leur couplage aux protéines G, provenait exclusivement du pool de récepteurs présents à la surface cellulaire et, qu’une fois internalisés, les RCPG devenaient « silencieux ». À l’heure actuelle, il existe des preuves expérimentales montrant que des RCPG internalisés continuent à produire un signal via les protéines G. Dans notre travail, nous avons démontré, qu’une fois internalisé et présent dans la membrane des endosomes précoces, le récepteur du peptide insulinotrope dépendant du glucose (RGIP) continue de stimuler la production d’AMPc et d’activer la protéine kinase-A (PKA). En plus de preuves indirectes montrant que les cinétiques de production d’AMPc et d’activation de la PKA sont dépendantes de l’internalisation du RGIP et de son trafic intracellulaire, nous avons identifié la forme active de Gαs dans les endosomes précoces contenant le RGIP et détecté un signal au moyen d’une sonde par RET d’AMPc démontrant une production d’AMPc à la surface des endosomes contenant le GIP.

Alors que, pour la plupart, les médicaments actuels sont de petites molécules inhibant l’action d’une protéine en bloquant un site d’interaction, la dégradation ciblée des protéines, découverte il y a une vingtaine d’années via les petites molécules PROTAC, connaît aujourd’hui un très grand développement, aussi bien au niveau universitaire qu’industriel. Cette dégradation ciblée permet de contrôler la concentration intracellulaire d’une protéine spécifique comme peuvent le faire les techniques basées sur les acides nucléiques (oligonucléotides antisens, ARNsi, CRISPR-Cas9). Les molécules PROTAC sont des chimères hétéro-bifonctionnelles capables de lier simultanément une protéine spécifique devant être dégradée et une E3 ubiquitine ligase. Les PROTAC sont donc capables de provoquer l’ubiquitinylation de la protéine ciblée et sa dégradation par le protéasome 26S. De nature peptidique, puis non peptidique, les PROTAC sont maintenant administrables par voie orale. Ce détournement du système ubiquitine protéasome permet aux molécules PROTAC d’élargir considérablement le champ des applications thérapeutiques puisque l’élimination de protéines dépourvues de poches ou de crevasses bien définies, dites difficiles à cibler, devient possible. Cette technologie versatile a conduit à la dégradation d’une grande variété de protéines comme des facteurs de transcription, des sérine/thréonine/tyrosine kinases, des protéines de structure, des protéines cytosoliques, des lecteurs épigénétiques. Certaines ligases telles que VHL, MDM2, cereblon et IAP sont couramment utilisées pour être recrutées par les PROTAC. Actuellement, le nombre de ligases pouvant être utilisées ainsi que la nature des protéines dégradées sont en constante augmentation. Deux PROTAC sont en étude clinique pour les cancers du sein (ARV471) et de la prostate (ARV110). La dégradation spécifique d’une protéine par le protéasome peut aussi être induite par d’autres types de molécules synthétiques : colles moléculaires, marqueurs hydrophobes, HaloPROTAC, homo-PROTAC. D’autres constituants cellulaires sont aussi éligibles à une dégradation induite : ARN-PROTAC pour les protéines se liant à l’ARN et RIBOTAC pour la dégradation de l’ARN lui-même comme celui du SARS-CoV-2. Des dégradations induites en dehors du protéasome sont aussi connues : LYTAC, pour des chimères détournant la dégradation de protéines extracellulaires vers les lysosomes, et MADTAC, pour des chimères détournant la dégradation par macroautophagie. Plusieurs techniques, en particulier des plates-formes de criblage, la modélisation mathématique et la conception computationnelle sont utilisées pour le développement de nouveaux PROTAC efficaces.

La thyropéroxydase (TPO) est l'enzyme clé impliquée dans la synthèse des hormones thyroïdiennes. Bien que la TPO catalyse l'iodation de la thyroglobuline et le couplage de certains résidus iodotyrosines au niveau de la membrane apicale des cellules thyroïdiennes, la majorité des protéines sont retenues au niveau du réticulum endoplasmique et seules 15% des molécules accèdent à la surface cellulaire. Afin de mieux comprendre la maturation et le transport intracellulaire de la TPO humaine (hTPO), nous avons transfecté l'ADNc de la hTPO dans des cellules CHO. Dans les cellules CHO seules 15% à 20% des molécules de hTPO sont capables d'acquérir une structure tridimensionnelle reconnue par le mAb15 (anticorps qui reconnaît une structure conformationnelle) alors que la majorité des molécules (80 à 85%) est retenue dans le RE puis dégradée (demi-vie: 2-4h) par le protéasome cytosolique. Parmi les molécules reconnues par la mAb15, seules 20% sont capables d'atteindre la surface cellulaire alors que les 80% restantes sont dégradées (demi-vie :7-11h) par des protéases à sérine et à cystéine localisées au niveau de la membrane du RE. Nous avons donc montré que dans les cellules CHO, seules 2% des molécules de hTPO sont capables de gagner la surface cellulaire et que d'après son état de repliement (formes incorrectement repliées ou partiellement repliées reconnues par le mAb15), la hTPO est dégradé par deux systèmes différents au niveau du RE. Nous avons d'autre part montré que l'incorporation de l'hème au niveau de la hTPO était importante pour la sortie de la protéine du RE. Nous avons aussi mis en évidence un nouveau rôle pour l'H2O2 synthétisée à la surface des cellules thyroïdiennes et impliquée dans l'hormonosynthèse thyroïdienne. En présence d'H2O2, l'hème se lie de manière covalente à la hTPO et ceci par un phénomène de modification autocatalytique de l'hème. Nous avons d'autre part montré que la N-glycosylation est nécessaire à la prise de structure tridimensionnelle reconnue par le mAb15. Au niveau du RE, la hTPO interagit avec la calnexine et la calréticuline. Ces deux protéines chaperons, impliquées dans le contrôle de qualité du RE, ont une importance cruciale pour les premières étapes de repliement de la hTPO mais ne sont pas suffisantes pour la maturation complète de la protéine. Nous avons, par ailleurs, étudié le transport intracellulaire de la hTP02, une isoforme obtenue après épissage alternatif de l'ARNm de la hTPO et avons montré que cette isoforme est enzymatiquement inactive, n'accède jamais à la surface cellulaire et est très rapidement dégradée.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont impliqués dans le contrôle de la majorité des processus physiologiques. Dans le modèle classique, la signalisation par les RCPGs se résumait à l'activation de protéines G hétérotrimériques capables de moduler l'activité d'effecteurs, qui, à leur tour, contrôlent la concentration intracellulaire de seconds messagers tels que l'AMPc ou le calcium. Cette vision classique de la signalisation s'est par contre complexifiée au fil des années et l'on sait maintenant que les RCPGs interagissent avec une multitude d'autres protéines afin de transmettre de façon spécifique les signaux extracellulaires. Ainsi, pour bien comprendre comment est régulé un RCPG, il devient primordial de connaître les protéines interagissant avec celui-ci. Nous avons donc entrepris d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction pour les récepteurs DP (récepteur de la prostaglandine D[indice inférieur 2]), TP[bêta] (récepteur du thromboxane A[indice inférieur 2]) et [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique, puis, de déterminer le rôle de ces complexes protéiques dans la fonction des récepteurs. Lors d'un criblage par double-hybride visant à identifier de nouveaux partenaires d'interaction pour DP, nous avons identifié la protéine ankyrin repeat domain-containing protein 13C (ANKRD13C), une protéine n'ayant pas encore été caractérisée jusqu'à maintenant. Des études de localisation ont montré qu'ANKRD13C est associée à la membrane du réticulum endoplasmique (RE), où elle interagit avec DP. Cette interaction facilite d'abord la biogenèse du récepteur en ralentissant la dégradation des récepteurs nouvellement synthétisés. Elle régule aussi le transport de DP vers la membrane plasmique en induisant la rétention dans le RE des formes immatures du récepteur. Elle facilite finalement la dégradation par le protéasome des formes de récepteurs retenues dans le RE. Ces expériences suggèrent donc un rôle de chaperonne pour ANKRD13C dans la biogenèse du récepteur DP. La protéine adaptatrice RACK1 (Receptor for Activated C-Kinase 1) a ensuite été identifiée comme nouveau partenaire d'interaction pour l'isoforme [bêta] du récepteur du thromboxane A[indice inférieur 2] (TP[bêta]).Les résultats présentés dans cette étude montrent que les deux protéines interagissent directement et qu'elles forment un complexe au niveau du RE. L'interaction entre TP[bêta] et RACK1 s'est d'ailleurs avérée essentielle pour que le récepteur puisse être exporté du RE vers la membrane plasmique. Ces travaux ont donc révélé un rôle majeur de RACK1 dans la fonction de TP[bêta], plus précisément au niveau de son transport vers la surface cellulaire. Finalement, une nouvelle interaction entre le récepteur [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique ([bêta][indice inférieur2]-AR) et la petite protéine G Rab11 a été caractérisée.Les expériences réalisées démontrent que les deux protéines s'associent en cellules via une interaction directe. Une construction du [bêta][indice inférieur 2]-AR où les sites d'interaction avec Rab11 sont mutés a été générée. La mise en évidence d'un défaut de recyclage de ce mutant suite à une stimulation avec un agoniste spécifique a permis d'établir que l'interaction directe avec Rab11 est essentielle pour que le [bêta][indice inférieur 2]-AR puisse recycler de façon adéquate.Les résultats présentés dans cette thèse illustrent le rôle joué par trois nouveaux complexes protéiques dans la synthèse, l'export et le recyclage de RCPGs. L'identification et la caractérisation de ces nouvelles interactions permettra de mieux comprendre comment sont régulés les récepteurs DP, TP[bêta] et [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique, et permettra éventuellement d'améliorer les connaissances quant à la régulation de l'ensemble des récepteurs couplés aux protéines G.

L'intégrase (IN) du VIH-1 est une enzyme clé catalysant l'insertion de l'ADN proviral par une réaction d'intégration. Dans cette étude, nous avons montré que cette enzyme exprimée en tant que seule protéine rétrovirale dans la levure S. Cerevisiae est suffisante pour réaliser une intégration complète de l'ADN contenant deux extrémités LTR virales dans le génome nucléaire. Grâce à ce modèle, nous avons montré que RAD51 impliquée dans le processus de recombinaison homologue (HR) inhibe l'activité d'intégration catalysée par l'IN autant in vitro que dans la levure. De plus, les bases moléculaires du transport intracellulaire du complexe de transcription inverse (RTC) sont peu connues. Dans la levure, nous avons montré que l"IN s'accumule au niveau du centre organisateur des microtubules (MTOC) avant d'être importée dans le noyau. Une analyse cinétique des mouvements de l'IN montrent que l'IN et Stu2p, une protéine associée aux microtubules, migrent ensemble vers la périphérie du noyau suivie de son import nucléaire. La dépolymérisation des microtubules par du nocodazole ou l'expression de l'IN dans une souche déficiente de Dyn2p (chaîne légère de la dynéine, homologue de LC8 humain) empêche l'accumulation de l'IN à proximité de l'enveloppe nucléaire, inhibe son import nucléaire et son activité d'intégration. Nous avons par la suite confirmé que le mécanisme de transport de l'IN retrouvé dans les cellules humaines T, cellules cibles du VIH-1 est similaire à celui observé dans la levure. Ce résultat suggère que l'IN pourrait jouer un rôle important dans le transport du RTC viral. Pour vérifier cette hypothèse dans un contexte viral, nous avons infecté des cellules HeLa exprimant le récepteur CD4 avec des pseudo-virus VIH fluorescents soit avec l'IN sauvage soit avec l'IN mutée. En comparant le transport du RTC vers la périphérie du noyau, nous avons pu conclure que l'IN est impliqué dans ce processus de transport
HIV-1 integrase (IN) is the key enzyme catalyzing the proviral DNA integration step. In this study, we have shown that HIV-1 IN expressed as the sole retroviral protein in budding yeast S. Cerevisiae was sufficient to catalyze the complete integration of a DNA containing two viral LTRs into the nuclear genome. IUsing this model, we demonstrated the RAD51 dependent pathway of homologous recombination (HR) down regulates the integration activities catalyzed by IN both in vitro and in yeast. Moreover, the molecular bases of the HIV-1 retrotranscription complex (RTC) intracellular trafficking are still poorly understood. We report in yeast that IN accumulates at the Microtubule Organization Center (MTOC) before being imported into the nucleus A kinetic of IN movement in cells revealed that IN and Stu2p, a microtubule associated protein, co-migrated towards the nuclear periphery followed its nuclear import. Microtubules depolymerisation by nocodazole or IN expression in a Dyn2p deficient strain (dynein light chain 2, homologue to human LC8) prevented accumulation of IN near the nuclear envelope, inhibited its transport into the nucleus thereby blocking integration activity. Then, we confirmed that the transport mechanism of IN in human T cells, an HIV-1 permissive cell line, and yeast are very similar. Further these findings suggest that IN may play a role in the intracellular translocation of the RTC. To verify the obtained results in the viral context, we infected CD4-expressing HeLa cells with fluorescently labelled HIV pseudo-viruses. We used HIV pseudo-viruses either with wt IN or with mutated IN. Comparing the transport of the RTC toward the nuclear periphery we showed that IN mediated this translocation

Plus d’une soixantaine de protéines différentes sont insérées dans la membrane du lysosome et participent aux différentes fonctions de cet organite. Mais les voies de transport intracellulaire qui mènent les protéines membranaires lysosomales (LMP) jusqu’à cet organite ne sont pas bien comprises. De façon intéressante, certaines LMP présentent des localisations intracellulaires anormales dans certains cancers. C’est notamment le cas de la glycoprotéine LAMP1 qui s’avère surexposée à la surface cellulaire dans plusieurs cancers, où elle y joue plusieurs rôles dans l’agressivité tumorale. Grâce au système RUSH (pour Retention Using Selective Hooks), permettant la synchronisation du transport le long de la voie de sécrétion, nous avons montré que LAMP1, après néosynthèse, passe par la membrane plasmique avant d’accéder aux endosomes. La comparaison des voies empruntées par différentes LMP a aussi permis de révéler que LAMP1 et LIMP2 sont triées au niveau de l’appareil de Golgi, LIMP2 étant concentrée dans des structures vésiculaires caractéristiques et dépourvues de clathrine. Nous avons aussi montré que, de façon surprenante, ce tri au niveau de l’appareil de Golgi est indépendant des signaux de recrutement d’adaptateurs à la clathrine portés dans les queues C-terminales de ces deux LMP. Afin d’étudier quels mécanismes pourraient être impliqués dans la surexposition de LAMP1 à la surface cellulaire de certains cancers, nous avons aussi réalisé un criblage d’inactivation de gènes basé sur la technologie CRISPR-Cas9. Nous avons sélectionné les gènes dont l’inactivation affectait les niveaux de LAMP1 en surface et nous avons obtenu de nombreux gènes candidats qui sont à l’étude
More than sixty different proteins are inserted into the membrane of the lysosome, participating in the various functions of this organelle. But the intracellular trafficking pathways that lead lysosomal membrane proteins (LMPs) to this organelle are not well understood. Interestingly, some LMPs exhibit abnormal intracellular localisations in some cancers. This is the case of the glycoprotein LAMP1 which is overexpressed at the cell surface in several cancers, from where it plays several roles in tumour aggressiveness. Thanks to the Retention Using Selective Hooks (RUSH) system, allowing the synchronisation of the transport along the secretory pathway, we have shown that neosynthesized LAMP1 reaches the plasma membrane before entering endosomes. Comparing the routes followed by different LMPs also revealed that LAMP1 and LIMP2 are sorted at the Golgi apparatus, LIMP2 being concentrated in characteristic vesicular and clathrin-free structures. We have also shown that, surprisingly, this sorting at the level of the Golgi apparatus is independent of clathrin adapters recruitment signals carried in the C-terminal tails of these two LMPs. To investigate what mechanisms might be involved in the overexposure of LAMP1 at the cell surface of certain cancers, we also performed a gene knock-out screen based on CRISPR-Cas9 technology. We selected genes whose inactivation affected LAMP1 levels at the surface and obtained many candidate genes that are under study

Comment les cellules eucaryotes remodèlent constamment leur espace intracellulaire est l'un des phénomènes auto-organisés les plus étonnants dans la nature. Pour ce faire, ces cellules exploitent la diffusion brownienne des macromolécules et cargos sur de petites échelles d’espace combinée avec des phénomènes de transport actif le long des filaments du cytosquelette entraînées par des protéines motrices.Malgré l'effort important de la communauté physico-mathématique sur ces problématiques biologiques, il est encore très difficile de rationaliser le mouvement des organites (et en général de la matière) à l'intérieur de la cellule.Dans cette thèse, nous abordons ce problème en généralisant l'analyse théorique d'un modèle physico-mathématique paradigmatique du transport hors-équilibre de protéines motrices (appelé TASEP) afin d'étudier l'impact d'un volume fini et d’une concentration finie de moteurs sur leur distribution dans le cytosol et le long du cytosquelette. En particulier, cela nécessite d'inventer une nouvelle méthodologie afin de résoudre ce problème où le mouvement de diffusion des moteurs dans le cytoplasme est couplé avec le transport collectif et dirigé de ces mêmes moteurs le long d'un ou plusieurs filaments du cytosquelette. De nouveaux phénomènes et régimes intéressants apparaissent par rapport aux études récentes apparus dans la littérature. En outre, la méthodologie développée ici, permet une analyse rapide et efficace des comportements de ces systèmes complexes pour lesquels la simulation numérique peut être longue en temps.La thèse est organisée comme suit. Le premier chapitre est consacré à l’introduction au sujet et à la définition des notions biologiques et physiques nécessaires pour le travail de recherche présenté ensuite.Le deuxième chapitre aborde une solution approchée pour le cas de transport réalisé sur un seul filament cytosquelettique plongé dans le cytosol, où le volume fini et la concentration finie de moteurs modifient qualitativement et quantitativement les diagrammes de phase décrivant la densité moyenne et le flux de moteurs le long du filament. Nous discutons ensuite les conditions physiques pour lesquels cette solution approchée n’est plus valable. Pour surmonter cette difficulté, dans le chapitre trois, nous décrivons une nouvelle méthode, inspirée par la « méthode des images » pour calculer les solutions de l'équation de Poisson en électrostatique, qui permet pour la première fois (à notre connaissance) de calculer analytiquement la distribution de moteurs qui diffusent en volume, c.à.d. le cytosol, sans aucune hypothèse d’approximation. En particulier, le procédé peut être facilement généralisé à tout type de distribution ou réseau de filaments et à plusieurs mécanismes de transport collectif le long des filaments. Cela permet d’explorer ainsi des régimes et des phénomènes nouveaux qui peuvent difficilement être étudiées par des simulations stochastiques en raison de la complexité des processus et de l'extension spatiale du système. Le chapitre quatre se concentre sur cette méthodologie innovante de calcul. Le chapitre cinq discute d’une variété de problèmes ouverts ainsi que d’ouvertures liées au thème étudié. Nous terminons cette thèse avec des conclusions générales se concentrant sur les implications physiques, biophysiques et biologiques de l’étude effectué.Les nombreux résultats obtenus ont un impact sur notre compréhension générale des processus de transport complexe, collectif et non-linéaire dans des phénomènes et situations où les moteurs peuvent se déplacer parmi des espaces avec des différentes dimensions physiques, avec des implications intéressantes pour la biologie, la mécanique statistique des systèmes hors-équilibre thermodynamique, de la théorie physico-mathématique du trafic et de la logistique
How cells constantly remodel their intracellular space is one of the most astonishing self-organized phenomena in Nature. In order to do that, eukaryotic cells exploit the Brownian diffusion of macromolecules or organelles on small scales combined with active transport phenomena along cytoskeletal filament driven by motor proteins. Despite the important effort in the physico-mathematical community working on these biological issues, it is still very difficult to rationalize the motion of organelles (and in general of matter) inside the cell. In this thesis, we approach this problem by generalizing the theoretical analysis of a paradigmatic physico-mathematical model of non-equilibrium transport of motor proteins (called TASEP) to study the impact that a finite volume and a finite concentration of transporters have on their distribution in the cytosol and along the cytoskeleton. In particular, this requires inventing a new methodology in order to solve the problem where diffusive motion or transporters in the cytoplasm is coupled with directed collective transport along one or many cytoskeletal filaments. New interesting phenomena and regimes appear with respect to recent studies in literature. Moreover, the methodology developed so far, allow a fast and efficient investigation of complex systems behaviors for which numerical simulation can result very time consuming.The thesis is organized as follows. The first chapter is dedicated to an introduction on the topic and to the definition of biological and physical notions necessary for the research work presented. The second chapter tackles an approximate solution for the case of directed transport on a single cytoskeletal filament embedded in the cytosol, where the finite volume and the finite concentration of particles modify qualitatively and quantitatively the phase diagrams describing the average density and flux of transporters along the filament. We then discuss the physical conditions for which this approximated solution is no more valid. In order to overcome this difficulty, in chapter three we describe a novel method, inspired by the “images-method” to compute solutions of the Poisson equation in electrostatics, which allows for the first time (at our knowledge) to compute analytically the distribution of transporters in volume, i.e. the cytosol, without any approximated assumption. Importantly, the method can be easily generalized to any kind distribution or network of filaments and to other mechanisms of collective transport along the filaments. This makes possible to explore stationary regimes and new phenomena that can be hardly studied by stochastic simulations due to the complexity of the processes and the spatial extension of the system. Chapter four focuses on the innovative methodology of computation. Chapter five discusses miscellanea of problems and openings related to the topic studied. We end this thesis with general conclusions focusing on physical, biophysical and biological implications.The various results obtained have an impact on our general understanding on complex, collective and non-linear transport processes in situations and phenomena where transporters can move in spaces with different physical dimensions with interesting implications for biology, non-equilibrium statistical mechanics and the physico-mathematical theory of traffic and logistics

Le système endomembranaire ou système de sécrétion est constitué de compartiments spécifiques et distincts et de vésicules qui assurent le transport entre ces différents compartiments. Les protéines sécrétées, solubles ou membranaires, sont introduites de façon co-traductionnelle dans le réticulum endoplasmique (RE). Du RE, ces protéines sont transportées tout au long du système endomembranaire de sécrétion jusqu'à leur compartiment cible: l'appareil de Golgi, la vacuole le tonoplaste, la membrane plasmique ou le compartiment extracellulaire. Des travaux récents ont permis d'identifier des signaux spécifiques d'adressage et de rétention qui par leur interaction avec des récepteurs, permettent le transport de certaines protéines vers leur localisation finale. Nos travaux font appel aux approches de la biologie cellulaire et moléculaire pour l'étude du transport et de l'adressage des protéines dans le système endomembranaire de sécrétion chez les plantes. Nous avons modifié par mutagénèse dirigée les signaux d'adressage d'une protéine recombinante modèle, la sporamine. De plus nous avons développé un système d'expression stable de ces protéines recombinantes dans des cellules de tabac (nicotiana tabacum CV BY2). Nous avons ainsi obtenu des cellules transgéniques exprimant fortement une même protéine modèle transportée vers la vacuole (sporamine), vers le milieu extracellulaire (dpro-sporamine) ou retenue dans la fraction microsomale (SpoHDEL ou dproHDEL). L'étude de la localisation intracellulaire de SpoHDEL a permis de montrer l'accumulation de cette protéine dans un compartiment présentant une activité IDPase

Le récepteur d’adressage vacuolaire BP80 assure le transport des préprotéases solubles à destination de la vacuole lytique. BP80 reconnaît son ligand au niveau du TGN. Le complexe formé est empaqueté dans des vésicules de transport puis transporté jusqu’au compartiment prévacuolaire (PVC). Le ligand transite jusqu’à la vacuole lytique alors que le récepteur recycle jusqu’au TGN. Nous avons initié une approche de microscopie confocale pour étudier BP80. Nous avons créé une chimère correspondant à la fusion entre la GFP et les domaines transmembranaire et cytosolique de BP80 nommée GFP-PS1. Cette chimère GFP-PS1 reproduit parfaitement le trafic de BP80. Nous avons réalisé différentes protéines chimériques dérivant toutes du reporter GFP-PS1 et portant une ou deux mutation(s ) sur des signaux de tri potentiels présents sur la portion cytosolique de BP80. Par cette approche, nous avons identifié deux signaux importants qui participent à des événements de recyclage et d’endocytose de BP80
BP80 is a vacuolar receptor responsible for sorting proaleurain from the trans-Golgi network. The complex receptor-ligand is packed into shuttle vesicles that are directed and fused to a prevacuolar compartment where the lower pH induces the dissociation between the receptor and the proaleurain. This latter matured and released in the lytic vacuole. Beside the fact that BP80 uses clathrin coated vesicles for its traffic, we have no other indication on the signals in the cytoplasmic tail used by BP80 traffic. In an attempt to identify trafficking signals, we fused the GFP to the transmembrane and the cytosolic domains of BP80 and called the resulting fusion protein GFP-PS1. Like the native vacuolar receptor, GFP-PS1 accumulates and cycles in the same cell compartment. We then introduced single or two mutation(s) in the cytosolic portion of GFP-PS1. Using this approach, we identify two important sorting signals, which participates to recycling and endocytic events of BP80