Thèses : « Tirosino fosfatasi »

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Castiglioni, S. « HD-PTP, una nuova tirosin fosfatasi implicata nella regolazione della motilità endoteliale ». Doctoral thesis, Università degli Studi di Milano, 2008. http://hdl.handle.net/2434/61880.

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Muniz, Fernanda Magalhães Correa. « Perfil da proteína tirosina fosfatase de baixo peso molecular em células osteoblásticas ». Universidade de São Paulo, 2008. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/59/59138/tde-15052009-184053/.

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Résumé :

Eventos como fosforilação e desfosforilação estão presentes nos processos de crescimento e diferenciação celular. As proteínas tirosina fosfatases estão envolvidas nestes processos. Estas enzimas são encontradas em animais, plantas e ocorrem em diversas formas, diferindo no peso molecular, substrato específico e sensibilidade a inibidores. As enzimas que possuem baixo peso molecular (entre 18-20 KDa), hidrolisam p-nitrofenilfosfato e são sensíveis ao p-hidroximercuribenzoato são chamadas como proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular relativo (PTP-BMr) ou fosfatases ácidas. Vários dados sugerem que tipos de células de osso, como osteoblastos, podem expressar esta enzima ativa. Aqui, culturas de osteoblastos derivadas da medula removida do fêmur de rato foram investigadas para padronizar a metodologia de obtenção da PTP-BMr. A expressão e atividade catalítica desta enzima em diferentes estágios de crescimento de osteoblastos também foram verificadas. Foi observado que são necessários de 16-19 dias de cultura para obter maiores níveis de atividade da PTP-BMr em extrato citoplasmático. O nível de expressão do gene da PTP-BMr foi determinado por PCR em tempo real e uma maior quantificação de RNAm foi obtida em 16 dias de crescimento de osteoblasto. A caracterização bioquímica parcial confirma uma banda de atividade em gel de poliacrilamida com peso molecular de 17,6 KDa, e pH ótimo de 5,5. A hidrólise do p-nitrofenilfosfato demonstra uma pequena cooperatividade relativa (n=1,2) com K0,5= 0,12 e Vmax= 3,5U/mg. Esta atividade foi fortemente inibida (60 a 75%) por molibdato de amônio (10mM); fosfato de sódio (10mM); ortovanadato de sódio (10mM) e p-hidroximercuribenzoato de sódio (10mM). Estas propriedades são típicas desta classe. A interação entre osteoblastos e diferentes superfícies pode ativar ou desativar genes. Este presente projeto investigou se a interação com superfície de titânio pode modificar o perfil de atividade da PTP-BMr. Quando em presença de uma superfície de titânio há um maior aumento na atividade catalítica do que nos níveis de RNAm da PTP-BMr o que sugere uma estimulação da enzima a qual pode estar auxiliando no processo de formação óssea.
Events as phosphorilation and desphosphorilation are experienced in cell growth and differentiation processes. Tyrosine phosphatases proteins are involved in these processes. These enzymes are found in animals, plants and occur in multiple forms, differing in relative molecular weight, substrate specificity and sensitivity to inhibitors. The enzymes that have low molecular weight (between 18-20KDa), hydrolize p-nitrophenilphosphate and are sensible to p-hidroximercuribenzoate are known as low molecular weight relative tyrosine phosphatase proteins (PTP-LMWr) or acid phosphatase. Several data suggest that bone cell types, such as osteoblasts, may express this enzyme activity. Here, osteosblast cultures derived from medulla removed from rat femur were investigated to standardize the methodology of PTP-LMW obtainment. The expression and the catalytic activity of this protein in different stages of osteoblast growth were checked as well. It was observed that 16-19 culture days are necessary to obtain greater levels of activity of PTP-LMW in the cytoplasmatic extracts. The gene expression level of PTP-LMW was determined by quantitative real-time PCR, and a greater quantity of mRNA was observed within sixteen days of osteoblast growth. The partial biochemistry characterization confirms a single active band in poliacrilamide gel with molecular weight of about 17.6KDa, and a pH-optimum around 5.5. p-nitrophenilphosphate hydrolysis shows a small cooperative behavior (n=1.2) with K0.5=0.12mM and Vmax=3.5U/mg. This activity was strongly inhibited (about 60-95%) by ammonium molybdate (10mM); sodium phosphate (10mM); sodium orthovanadate (10mM) and sodium p-hydroximercuribenzoate (10mM). These properties are typical for this enzyme class.

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Purificação, Marcela. « Identificação de potenciais substratos de PTPA, tirosina-fosfatase de Mycobacterium tuberculosis ». Florianópolis, SC, 2013. http://repositorio.ufsc.br/handle/123456789/103214.

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Résumé :

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-graduação em Biotecnologia
Made available in DSpace on 2013-07-16T03:34:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 249429.pdf: 3363259 bytes, checksum: 38f8dd99b759ea476f6268236b2e2462 (MD5)
Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) de diversos microrganismos possuem importantes papéis na determinação da patogenicidade por modificação do equilíbrio entre fosforilação/defosforilação dentro do hospedeiro. Deste modo, a identificação de substratos das PTPs torna-se um passo essencial para compreensão de seus papéis fisiológicos, e também contribuem para o desenvolvimento de novos fármacos. Neste trabalho, a metodologia de 'mutant substrate-trapping' foi utilizada como ferramenta para identificação de potenciais substratos fisiológicos de PtpA, uma das duas únicas tirosina-fosfatases presentes em Mycobacterium tuberculosis. A mutação do Asp126 no sítio ativo de PtpA converteu uma enzima ativa em um 'mutant substrate-trapping': PtpA-D126A. Ambas as enzimas, ativa/não mutada ('wild-type' - wt) e mutante D126A, foram purificadas e caracterizadas por estudos cinéticos e estruturais. O mutante D126A mostrou ser uma boa ferramenta para 'mutant substrate-trapping', apresentando valor de Km semelhante à proteína ativa, todavia com Vmax reduzido, mantendo os possíveis substratos mais tempo unidos ao seu sítio ativo. Para identificar prováveis substratos de PtpA, ensaios in vitro foram realizados, por incubação de PtpA-D126A com diferentes extratos de macrófagos humanos da linhagem THP-1. Os experimentos foram realizados na escala de Ressonância Plasmônica de Superfície e posteriormente passados a miligramas de proteína. Os complexos PTP-substrato foram isolados por imobilização covalente da PtpA-D126A à resina de agarose e analisados por SDS-PAGE. A identificação por espectrometria de massa dessas proteínas, bem como das proteínas de E. coli co-eluídas com PtpA-D126A durante cromatografias de afinidade e exclusão molecular, revelou alguns possíveis substratos de PtpA. Outros ensaios estão programados para confirmação dos resultados e identificação de substratos fisiológicos da proteína tirosina-fosfatase PtpA de M. tuberculosis.

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Matôzo, Huita do Couto. « Estudos estruturais do domínio catalítico da proteína tirosina fosfatase eta de rato ». Universidade de São Paulo, 2008. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-16012009-042410/.

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Résumé :

A proteína tirosina fosfatase eta de rato (rPTPeta), é uma RPTP transmembranar do tipo classe I. A rPTP eta e seu homólogo DEP-1 provenientes, respectivamente, de ratos e de humanos, estão inibidas em células neoplásicas. Este fenótipo maligno é revertido após reconstituição exógena, o que sugere que a capacidade restauradora da rPTP eta pode ser uma ferramenta importante na terapia de alguns tipos de câncer. Portanto, o objetivo deste projeto incluiu o estudo molecular, biofísico e estrutural do domínio catalítico da rPTPeta (rPTPetaDC). Para isso, sub-clonamos no vetor pET-28a(+) o inserto que codifica para a região C-terminal da rPTPeta . Em seguida, bactérias E. coli da linhagem BL21 (DE3) foram transformadas com o plasmídeo e a proteína recombinante expressada e purificada. A His6-rPTPetaDC purificada teve a cauda de histidina subseqüentemente removida por digestão com trombina. O ponto isoelétrico de 7,3 da proteína de 41kDa foi medido experimentalmente e a sua funcionalidade acessada pelo ensaio de hidrólise do pNPP. A enzima apresentou uma atividade específica de 9nmol/min/microg a qual é compatível com as atividades específicas descritas para as RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 e SHP2. A estrutura secundária e a estabilidade da rPTPetaDC recombinante foi analisada por dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. A rPTPetaDC mostrou-se estável a 18 graus Celsius e propriamente enovelada (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. Anexo A). A proteína foi, em seguida, submetida a diferentes condições de cristalização e a estudos estruturais em solução. Nas condições de 0,1M de MES, pH 6,5 e 20% PEG 10000 cresceram cristais que difrataram na resolução de 1,87Å. Os cristais pertencem ao grupo espacial P2(1)2(1)2(1) com parâmetros de célula unitária: a=46,46; b=63,07; c=111,64 Å, e com uma única molécula por unidade assimétrica (Matozo, et al., Acta crystallogr. F, 2006. Anexo B). A estrutura da rPTPetaDC, em solução, foi analisada usando-se a técnica de SAXS e medidas de anisotropia de fluorescência. Os dados de SAXS mostraram que a proteína, forma dímeros alongados, com Rg de 2,65nm e Dmax de 8,5nm. A conformação da rPTPetaDC analisada por modelos de homologia sugere que seu dímero está mais próxima da estrutura cristalográfica dimérica da RPTPalfa-D1. Alem disso, a caracterização da rPTPetaDC por anisotropia de fluorescência demonstrou que o Kd do dímero da rPTPetaDC é de 21,6 + 2,0uM e a variação da energia livre de Gibbs dímero-monômero é de 7,2kcal/mol (Mtozo, et al., Biophys. J., 2007. Anexo C ).
The rat protein tyrosine phosphatase eta, rPTPeta, is a transmembrane RPTP, with an intracellular portion composed of a unique catalytic region. The rPTPeta and the human homolog DEP-1 are down-regulated in rat and human neoplastic cells, respectively. However, the malignant phenotype is reverted after exogenous reconstitution of rPTPeta, suggesting that its function restoration could be an important tool for gene therapy of several types of cancer. Therefore, the objective of our project aimed on the molecular, biophysical and structural study of the catalytic domain of rPTPeta, rPTPetaDC. We began our study cloning the rPTPetaDC into PET28a(+) vector, followed by its expression in Escherichia coli, and purification. The His6-tag from the rPTPetaDC purified was subsequently removed by thrombin digestion. PhastGel IEF electrophoresis demonstrated that the isoelectric point of the 41kDa was 7.3. To assess the functionality of the rPTPetaDC we used the pNPP hydrolysis assay and observed that the enzyme has a specific activity of 9nmol/min/ug. The experimentally determined rPTPetaDC specific activity showed to be in the same range as the previously reported activities for RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 and SHP2. The secondary structure and stability of the recombinant protein was analyzed by circular dichroism and fluorescence spectroscopy. The results demonstrated that rPTPetaDC was stable at 18 Celsius and properly folded (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. In attachment A). Then, the purified protein was submitted to different crystallization conditions and structural studies in solution. Crystals appeared at 0.1M MES, pH 6.5 and 20% PEG 10,000 and diffracted with resolution of 1.87Å. The crystals belong to spatial group P2(1)2(1)2(1) with unit cell parameters of a=46.46, b=63.07, c=111.64Å and contained one molecule for asymmetric unit (Matozo, et al., Acta crystallog. F, 2006. In attachment B). Also, the structural of rPTPetaDC, in solution, was analyzed by SAXS and fluorescence anisotropy. SAXS data showed that the protein forms elongated dimers in solution with an Rg of 2.65nm and a Dmax of 8.5nm. The rPTPetaDC conformation in solution, studied by homology models, suggested that the rPTPetaDC dimer architecture is more closely related to the crystal structure of RPTPalfa-D1. The characterization of rPTPetaDC by fluorescence anisotropy measurements demonstrated that the Kd of the dimer is 21.6 + 2.0uM and the energy Gibbs dimer-monomer is equal to 7.2kcal/mol (Matozo, et al., Bioph. J., 2007. In attachment C).

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Pinheiro, Karina Cristina Seregatte. « Papel da proteina tirosina fosfatase de celulas V79 na resposta ao estresse causado pelo peroxido de hidrogenio ». [s.n.], 2002. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/314044.

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Résumé :

Orientadores : Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-03T11:58:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinheiro_KarinaCristinaSeregatte_M.pdf: 2536223 bytes, checksum: 84daa316e88c5a44bbbb304adbae7323 (MD5) Previous issue date: 2002
Resumo: Neste trabalho foi avaliada a citotoxicidade do peróxido de hidrogênio sobre as células V79, bem como o efeito deste oxidante sobre a fosfatase total isolada destas células. A viabilidade celular foi avaliada através de 4 parâmetros: incorporação do vermelho neutro (NRU) - (integridade lisossomal); conteúdo de ácidos nucléicos (NAC) - (número de células); redução do MTT (integridade mitocondrial) e atividade fosfatásica (metabolismo celular), tendo sido obtidos os seguintes valores de ICso 970, 1470, 840 e 870 IJM para NRU, NAC, MTT e fosfatase, respectivamente. Para os parâmetros NRU e NAC observou-se efeito diferente do peróxido, dependendo da concentração, como aumento da incorporação do corante pelos lisossomos e do número de células até as concentrações de 500 e 750 IJM respectivamente. O efeito de potenciais inibidores de fosfatases sobre a fosfatase total das células V79 revelou que a principal hidrolase presente no extrato corresponde a uma proteína tirosina fosfatase. Estes resultados foram reforçados pela sensibilidade desta enzima ao peróxido (ICso = 10mM). A presença de antioxidantes reverteu a ação inibitória do peróxido de hidrogênio. Do mesmo modo, a atividade fosfatásica também foi inibida, em maior grau, pelo pervanadato (ICso = 1001JM) o qual também atua como oxidante. O efeito inibitório do H202 e o pervanadato sobre a fosfatase foi aumentado após diálise do extrato celular. As células V79 apresentam alta concentração de glutationa reduzida, sugerindo que a maior resistência destas células frente ao peróxido de hidrogênio pode ser devido à presença deste antioxidante. Tanto o peróxido quanto o pervanadato apresentaram maior efeito inibitório após diálise, reforçando a importância da glutationa reduzida
Abstract: In this work was evaluated the hydrogen peroxide cytotoxicity on V79 cells, and the effect of this oxidant on the total phosphatase trom these cells. The cell viability was analyzed through 4 parameters: neutral red uptake (NRU) (Iisossome integrity); nucleic acid content (NAC) - (cell number); MTT reduction (mitochondria function) and phosphatase activity (cell metabolism). The following ICso values were obtained: 970, 1470, 840 and 870 J.lM for NRU, NAC, MTT and phosphatase, respectively. Hydrogen peroxide presented different effect on the NRU and NAC depending on its concentration. In concentrations up to 500 and 750 J.lM, was observed increase of dye uptake and cell number, respectively. The inhibiton studies using phosphatase inhibitors showed that the major phosphatase present on the V79 cells extract is a protein tyrosine phosphatase. This result was reinforced by the high sensibility of this phosphatase when hydrogen peroxide (ICso = 10 mM) and pervanadate (ICso = 100J.lM) were addictioned in the reaction medium. In the presence of antioxidant this effect was prevented. Finally, the concentration of reduced glutathione was determined, V79 cells presented high content of this compound then, our results suggest that the low toxicity of this compound on these cells could be due to the action of this antioxidant. Other result reinforce this hypothese, both oxidant (hydrogen peroxide and pervanadate) presented higher inhibitory effect of the phosphatase activity after dialyse
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

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Martins, Priscila Graziela Alves. « Busca de inibidores da fosfotirosina fosfatase YopH de Yersinia enterocolitica e avaliação citotoxicológica e antitubercular de 6 compostos previamente descritos como inibidores das tirosinas fosfatases PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis ». reponame:Repositório Institucional da UFSC, 2015. https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/169634.

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Résumé :

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2015.
Made available in DSpace on 2016-10-19T13:19:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334243.pdf: 5585985 bytes, checksum: 4f3d8bd503e7a8f2e8284a04905635ec (MD5) Previous issue date: 2015
Proteínas tirosina fosfatases (PTP) têm um importante papel na transdução de sinal e no controle de diversas funções celulares. Bactérias patogênicas como as do gênero Yersinia e do complexo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), utilizam suas PTP para subverter as células de defesa do hospedeiro. As bactérias patogênicas do gênero Yersinia possuem em comum a produção de uma PTP chamada YopH que modula a resposta inflamatória do hospedeiro à bactéria através de processos que envolvem a inibição da fagocitose, quebra de adesões focais e subversão da função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. As doenças humanas causadas pelas espécies patogênicas de Yersinia variam desde síndromes gastrointestinais à peste bubônica, sendo esta última uma doença grave que ainda não foi erradicada e é associada a milhares de mortes no passado. O Mtb causa a tuberculose, doença que afeta principalmente o trato respiratório. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde, a tuberculose foi responsável por 1,5 milhões de mortes somente no ano de 2013. Durantes a invasão das células de defesa, o Mtb produz duas PTP, a PtpA e a PtpB. Estas fosfatases, assim como a YopH, tem por função burlar o mecanismo de defesa do hospedeiro. A PtpA é responsável por modular a apoptose celular e impedir a acidificação do fagossomo e a fusão deste com o lisossomo. Já a PtpB, impede a produção de IL-6 e previne a morte do macrófago pela ativação da via de sinalização de Akt e bloqueio da atividade da caspase-3. A busca de inibidores da YopH de Yersinia spp. e das fosfatases do Mtb é de grande interesse para a produção de possíveis fármacos que poderiam ser utilizados no tratamento das doenças provocadas por estas bactérias. No presente trabalho, uma biblioteca de 398 compostos foi triada com o objetivo de identificar novos inibidores da YopH. Dentre os inibidores encontrados, 22 apresentaram valores de IC50 inferiores a 10 µM, sendo que 3 estão na faixa de nanomolar (o que os coloca entre os melhores inibidores descritos para esta fosfatase até o momento). Foram encontrados tanto inibidores competitivos (12 compostos) como não competitivos (6 compostos) da YopH e cinco compostos (delfinidina, AAA e os três complexos de vanádio) apresentaram valores de Ki na faixa de nanomolar. Avaliou-se também a citotoxicidade em células THP-1 e HepG2 além da atividade antitubercular de seis inibidores das fosfatases de Mtb (PtpA e PtpB) previamente relatados por nosso laboratório em 2012. Identificou-se dois compostos que não são citotóxicos (compostos 43 e 95) e dois compostos que apresentaram atividade em ensaios de infecção intracelular (compostos 95 e 96). De acordo com todos os resultados obtidos no presente trabalho, identificamos novas chalconas como eficientes inibidores da YopH além de 3 complexos de vanádio com uma marcante inibição em escala nanomolar. Quanto aos inibidores da PtpA e PtpB, o composto 95 mostrou-se não citotóxico e com atividade nos ensaios de infecção intracelular. Este composto poderia ser utilizado como molde na busca de outros compostos mais ativos ajudando assim no desenvolvimento de novas terapias contra o Mycobacterium tuberculosis.

Abstract : Protein tyrosine phosphatases (PTP) have an important role in signal transduction and in the control of many cell functions. Pathogenic bacteria from Yersinia genus and Mycobacterium tuberculosis (Mtb) complex, utilize their PTP to subvert host?s defense cells. Pathogenic bacteria from Yersinia genus have in common the production of a PTP named YopH, this enzyme modules the host inflammatory response against the bacteria through processes that evolves the phagocytosis inhibition, focal adhesion disruption and impairing the function of B and T lymphocytes preventing the adaptive immune response. Diseases caused by pathogenic species of Yersinia range from gastrointestinal syndromes to bubonic plague. Bubonic plague is a not eradicated disease that is associated with thousands of deaths in the past. Mtb causes tuberculosis, a disease that affects mainly the respiratory tract. According to World Health Organization data, only in 2013 tuberculosis caused 1.5 million deaths. During the defense cell invasion, Mtb produces two PTP, PtpA and PtpB. These phosphatases act like YopH, they help the bacteria to evade the host defense mechanism. PtpA modulates the cellular aptotosis and it also impairs the phagosome acidification and its fusion with lysosome. PtpB prevents the production of IL-6 and macrophage death by activation Akt signaling pathway and by blocking caspase 3 activity. The search for inhibitors of YopH from Yersinia and Mtb phosphatases is of great interest for the production of drugs that could be used in the treatment of the diseases caused by these bacteria. In this work, an in-house library of 398 compounds was screened with the objective to search new YopH inhibitors. Out of the inhibitors found, 22 presented IC50 values below 10 µM, three of those in nanomolar range (this characteristic put these three compounds between the best described inhibitors for this phosphatase). We found competitive inhibitors (12 compounds) and non-competitive inhibitors (6 compounds) for YopH and five compounds (Delphinidin, AAA and three vanadium complexes) presented Ki values in nanomolar range. Cytotoxicity assays were made with two human cell lines THP-1 and HepG2 we also assayed the antitubercular activity of six inhibitors of Mtb PTP. The inhibitory activity against PtpA and PtpB of these six compounds was previously described in 2012 by our lab. The cytotoxicity and antitubercular assays resulted in two non-cytotoxic compounds (compound 43 and 95) and two compounds that are activity in intracell infection assays (compounds 95 and 96). In this present work we show new chalcones as eficient inhibitors of YopH, we also identified 3 vanadium complex with remarkable inhibition in nanomolar scale. According to the results obtained to PtpA and PtpB inhibitors, we identified the compound 95 which is no cytotoxic and has activity in intracell assays. This compoud could be used for the design of new compound with improved activity helping in the development of new therapies against Mycobacterium tuberculosis.

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Miranda, Marcio Andre. « Efeito de flavonoides na fosfoproteina tirosina fosfatase : mecanismos cineticos e relações estrutura-atividade ». [s.n.], 2000. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/314321.

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Résumé :

Orientador: Hiroshi Aoyama
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-07-26T20:20:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Miranda_MarcioAndre_M.pdf: 8835038 bytes, checksum: edacc540a33bba6dedd9caa95ae4f01c (MD5) Previous issue date: 2000
Resumo: Enzimas importantes em muitos sistemas celulares são inibidas ou ativadas por flavonóides. No entanto, não existe nenhum dado literário referente ao efeito dos flavonóides sobre as fosfoproteínas tiro sina fosfatase (PTP). Este trabalho propõe o estudo dos flavonóides sobre a atividade da fosfoproteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (LMrPTP) de rim bovino relacionando a sua estrutura com o seu efeito sobre a atividade enzimática. A atividade enzimática foi determinada em pR 5,0 utilizando pnitrofenilfosfato (p-NPP), flavina mononuc1eotídio (FMN) e tirosina fosfato (Tyr-P) como substratos, a 37°C, por 20 minutos. Quercetina mostrou ser um ativador da enzima na concentração de 400 JlM, da ordem de 260,20 e 10% para p-NPP, FMN e Tyr-P respectivamente. Já a murina mostrou ser um excelente inibidor competitivo da atividade enzimática, com constantes de inibição da ordem de 58, 56,5 e 55 JlM/ L para p-NPP, FMN e Tyr-P respectivamente. Diferentemente do efeito ativador da quercetina, o efeito inibidor da murina foi dependente do pR. Estudos de estabilidade térmica na ausência e presença de agentes protetores ou redutores indicam que os flavonóides interagem com o sítio ativo mas não afetam as cisteínas. A interação entre a enzima e os flavonóides envolve fortemente um componente eletrostático, uma vez que na presença de NaCI houve a perda do efeito ativador da quercetina e a ativação por murina em concentrações superiores a 125mM. Para as mesmas condições, outros flavonóides foram testados, mas não apresentaram efeito significativos na atividade da LMrPTP, como a rotina e o kaempferol. Estes resultados sugerem a importância da posição dos grupos -aR dos flavonóides (nas posições 3' e 4' para a quercetina, 2' e 4' para a murina) para os distintos efeitos dos flavonóides. A ausência do grupo -aR na posição 3' (para o kaempferol) e a presença de um glicosídio (rotinose) no grupo -aR na posição 3 (para a rotina) promovem a supressão do efeito ativador do flavonóide sobre a atividade da enzima
Abstract: Important enzymes in many cellular systems may be inhibited or activated by flavonoids. However, there are no references conceming to the effect of flavonoids on phosphoprotein tyrosine phosphatases. This work aims to study the relationship between flavonoids structure and their effects on the bovine kidney low molecular weight phosphoprotein tyrosine phosphatase (LMrPTP). Enzyme activity was determined at pH 5.0 with p-nitrophenylphosphate (p-NPP), flavin mononucleotide (FMN), and tyrosine phosphate (Tyr-P) as substrate, at 37°C, for 20 mino Quercetin was found to be an activator, at 400 JlM, for p-NPP, FMN, and Tyr-P in the following order: 2.6-, 0.2-, and O.l-fold. Morin was a strong competitive inhibitor, which inhibition constant values were determined to be 58, 56.5, and 55 JlM for p-NPP, FMN, and Tyr-P, respectively. Ln contrast to the enzyme activation by quercetin, the inhibition by morin was pHdependent. Preincubation and ionic strength did not significantly alter the effect of the flavonoids on the enzyme activity. At the same conditions, other related flavonoids, such as rutin and kaempferol had no effect on the LMrPTP. Our results suggest the importance of the -OH groups positions (3' and 4' for quercetin, and 2' and 4' for morin) for the distinct flavonoids effects. The absence of the 3' -OH (kaempferol) and the presence of rutinose at the 3-0H (rutin) suppress the effect of quercetin
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

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Martins, Priscila Graziela Alves. « Busca de inibidores da fosfotirosina fosfatase YopH de Yersinia enterocolitica e avaliaÃ§Ã£o citotoxicolÃ³gica e antitubercular de 6 compostos previamente descritos como inibidores das tirosinas fosfatases PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis ». reponame:Repositório Institucional da UFSC, 2015. https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/162807.

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Résumé :

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de CiÃªncias BiolÃ³gicas, Programa de PÃ³s-GraduaÃ§Ã£o em BioquÃmica, FlorianÃ³polis, 2015.
Made available in DSpace on 2016-05-24T17:52:39Z (GMT). No. of bitstreams: 1 334243.pdf: 5585985 bytes, checksum: 4f3d8bd503e7a8f2e8284a04905635ec (MD5) Previous issue date: 2015
ProteÃnas tirosina fosfatases (PTP) tÃªm um importante papel na transduÃ§Ã£o de sinal e no controle de diversas funÃ§Ãµes celulares. BactÃ©rias patogÃªnicas como as do gÃªnero Yersinia e do complexo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), utilizam suas PTP para subverter as cÃ©lulas de defesa do hospedeiro. As bactÃ©rias patogÃªnicas do gÃªnero Yersinia possuem em comum a produÃ§Ã£o de uma PTP chamada YopH que modula a resposta inflamatÃ³ria do hospedeiro Ã bactÃ©ria atravÃ©s de processos que envolvem a inibiÃ§Ã£o da fagocitose, quebra de adesÃµes focais e subversÃ£o da funÃ§Ã£o dos linfÃ³citos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. As doenÃ§as humanas causadas pelas espÃ©cies patogÃªnicas de Yersinia variam desde sÃndromes gastrointestinais Ã peste bubÃ´nica, sendo esta Ãºltima uma doenÃ§a grave que ainda nÃ£o foi erradicada e Ã© associada a milhares de mortes no passado. O Mtb causa a tuberculose, doenÃ§a que afeta principalmente o trato respiratÃ³rio. Segundo dados da OrganizaÃ§Ã£o Mundial da SaÃºde, a tuberculose foi responsÃ¡vel por 1,5 milhÃµes de mortes somente no ano de 2013. Durantes a invasÃ£o das cÃ©lulas de defesa, o Mtb produz duas PTP, a PtpA e a PtpB. Estas fosfatases, assim como a YopH, tem por funÃ§Ã£o burlar o mecanismo de defesa do hospedeiro. A PtpA Ã© responsÃ¡vel por modular a apoptose celular e impedir a acidificaÃ§Ã£o do fagossomo e a fusÃ£o deste com o lisossomo. JÃ¡ a PtpB, impede a produÃ§Ã£o de IL-6 e previne a morte do macrÃ³fago pela ativaÃ§Ã£o da via de sinalizaÃ§Ã£o de Akt e bloqueio da atividade da caspase-3. A busca de inibidores da YopH de Yersinia spp. e das fosfatases do Mtb Ã© de grande interesse para a produÃ§Ã£o de possÃveis fÃ¡rmacos que poderiam ser utilizados no tratamento das doenÃ§as provocadas por estas bactÃ©rias. No presente trabalho, uma biblioteca de 398 compostos foi triada com o objetivo de identificar novos inibidores da YopH. Dentre os inibidores encontrados, 22 apresentaram valores de IC50 inferiores a 10 ÂµM, sendo que 3 estÃ£o na faixa de nanomolar (o que os coloca entre os melhores inibidores descritos para esta fosfatase atÃ© o momento). Foram encontrados tanto inibidores competitivos (12 compostos) como nÃ£o competitivos (6 compostos) da YopH e cinco compostos (delfinidina, AAA e os trÃªs complexos de vanÃ¡dio) apresentaram valores de Ki na faixa de nanomolar. Avaliou-se tambÃ©m a citotoxicidade em cÃ©lulas THP-1 e HepG2 alÃ©m da atividade antitubercular de seis inibidores das fosfatases de Mtb (PtpA e PtpB) previamente relatados por nosso laboratÃ³rio em 2012. Identificou-se dois compostos que nÃ£o sÃ£o citotÃ³xicos (compostos 43 e 95) e dois compostos que apresentaram atividade em ensaios de infecÃ§Ã£o intracelular (compostos 95 e 96). De acordo com todos os resultados obtidos no presente trabalho, identificamos novas chalconas como eficientes inibidores da YopH alÃ©m de 3 complexos de vanÃ¡dio com uma marcante inibiÃ§Ã£o em escala nanomolar. Quanto aos inibidores da PtpA e PtpB, o composto 95 mostrou-se nÃ£o citotÃ³xico e com atividade nos ensaios de infecÃ§Ã£o intracelular. Este composto poderia ser utilizado como molde na busca de outros compostos mais ativos ajudando assim no desenvolvimento de novas terapias contra o Mycobacterium tuberculosis.

Abstract : Protein tyrosine phosphatases (PTP) have an important role in signal transduction and in the control of many cell functions. Pathogenic bacteria from Yersinia genus and Mycobacterium tuberculosis (Mtb) complex, utilize their PTP to subvert host?s defense cells. Pathogenic bacteria from Yersinia genus have in common the production of a PTP named YopH, this enzyme modules the host inflammatory response against the bacteria through processes that evolves the phagocytosis inhibition, focal adhesion disruption and impairing the function of B and T lymphocytes preventing the adaptive immune response. Diseases caused by pathogenic species of Yersinia range from gastrointestinal syndromes to bubonic plague. Bubonic plague is a not eradicated disease that is associated with thousands of deaths in the past. Mtb causes tuberculosis, a disease that affects mainly the respiratory tract. According to World Health Organization data, only in 2013 tuberculosis caused 1.5 million deaths. During the defense cell invasion, Mtb produces two PTP, PtpA and PtpB. These phosphatases act like YopH, they help the bacteria to evade the host defense mechanism. PtpA modulates the cellular aptotosis and it also impairs the phagosome acidification and its fusion with lysosome. PtpB prevents the production of IL-6 and macrophage death by activation Akt signaling pathway and by blocking caspase 3 activity. The search for inhibitors of YopH from Yersinia and Mtb phosphatases is of great interest for the production of drugs that could be used in the treatment of the diseases caused by these bacteria. In this work, an in-house library of 398 compounds was screened with the objective to search new YopH inhibitors. Out of the inhibitors found, 22 presented IC50 values below 10 ÂµM, three of those in nanomolar range (this characteristic put these three compounds between the best described inhibitors for this phosphatase). We found competitive inhibitors (12 compounds) and non-competitive inhibitors (6 compounds) for YopH and five compounds (Delphinidin, AAA and three vanadium complexes) presented Ki values in nanomolar range. Cytotoxicity assays were made with two human cell lines THP-1 and HepG2 we also assayed the antitubercular activity of six inhibitors of Mtb PTP. The inhibitory activity against PtpA and PtpB of these six compounds was previously described in 2012 by our lab. The cytotoxicity and antitubercular assays resulted in two non-cytotoxic compounds (compound 43 and 95) and two compounds that are activity in intracell infection assays (compounds 95 and 96). In this present work we show new chalcones as eficient inhibitors of YopH, we also identified 3 vanadium complex with remarkable inhibition in nanomolar scale. According to the results obtained to PtpA and PtpB inhibitors, we identified the compound 95 which is no cytotoxic and has activity in intracell assays. This compoud could be used for the design of new compound with improved activity helping in the development of new therapies against Mycobacterium tuberculosis.

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Traina, Fabiola. « Caracterização de uma nova proteina com repetições de anquirina, ANKHD1, na hematopoese normal e leucemica ». [s.n.], 2007. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/311980.

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Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-10T10:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Traina_Fabiola_D.pdf: 10463418 bytes, checksum: a1c92a0820404ccf5ce6623bff80018a (MD5) Previous issue date: 2007
Resumo: Importante passo para a compreensão dos processos fisiopatológicos das neoplasias é a identificação de genes ativamente expressos e das funções biológicas de cada proteína codificada por estes genes. Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) foi inicialmente identificada em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), no ano de 2003. Entretanto, seu padrão de expressão e sua função ainda não haviam sido caracterizados. A ANKHD1 é uma proteína ortóloga à Multiple Ankyrin repeat and single KH domain (Mask) da Drosophila melanogaster. Mask foi identificada através de um rastreamento genético utilizado para detectar novas proteínas associadas à proteína tirosina fosfatase Corkscrew (CSW), homóloga à Src Homology-2 domain-containing protein tyrosine Phosphatase-2 (SHP2) humana. SHP2 é uma fosfatase de tirosina citoplasmática codificada pelo gene PTPN11 e exerce papel fundamental no desenvolvimento da hematopoese normal e leucêmica. Os objetivos gerais do presente estudo foram caracterizar o padrão de expressão gênica e protéica de ANKHD1 em células hematopoéticas normais e leucêmicas e sua participação nas vias de sinalização celular. Neste estudo, foi demonstrada a elevada expressão gênica e protéica de ANKHD1 em linhagens de leucemias agudas humanas (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi e Namalwa) e em amostras de 38 pacientes com diagnóstico de leucemia aguda, quando comparadas às células hematopoéticas normais. A expressão protéica de ANKHD1 em diferentes tecidos humanos normais (rim, baço, estômago, intestino delgado, músculo esquelético, fígado, pulmão e linfonodo) foi detectada em intensidades variáveis. A associação da ANKHD1 com SHP2 foi identificada, através de Western Blotting, em células de leucemia mielóide crônica em fase blástica (K562) e células LNCaP. Entretanto, esta associação não foi detectada nas linhagens leucêmicas KG1, HL60, Daudi e Jurkat. A ANKHD1 foi localizada no citoplasma de células hematopoéticas normais e leucêmicas. Detectou-se a fosforilação de ANKHD1 em serina em células leucêmicas, mas não em células hematopoéticas normais. Através de ensaio de duplo híbrido em levedura, utilizando-se uma biblioteca de cDNA de medula óssea humana normal, detectou-se a interação de ANKHD1 com as proteínas SIVA1 e SIVA2, proteínas pró-apoptóticas altamente expressas em linhagens de leucemia linfóide aguda. Análises preliminares indicaram que a inibição da expressão protéica de ANKHD1, através de RNAi, induziu à apoptose celular em células leucêmicas, sugerindo uma função anti-apoptótica à ANKHD1. Em conclusão, o presente estudo identificou ANKHD1 como uma nova proteína altamente expressa em leucemias agudas, associada à SHP2 e SIVA em diferentes células, e, possivelmente, envolvida com o fenótipo anormal da célula leucêmica através de uma função anti-apoptótica. Os achados aqui descritos sugerem que ANKHD1 pode ser uma molécula alvo para a terapia da leucemia no futuro, e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 em diferentes células hematopoéticas normais e leucêmicas
Abstract: One step in the path towards building a comprehensive molecular portrait of human cancer is the definition of actively expressed genes and the function of their coding proteins. The Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 protein (ANKHD1) was first described in humans in a prostate carcinoma cell line LNCaP, in 2003; however, its expression pattern and its function have not yet been described. ANKHD1 is an orthologous protein of the Drosophila melanogaster, MASK (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), where it was first identified using a genetic screen designed to discover proteins that interact with the protein tyrosine phosphatase Corkscrew (CSW), which is a homolog to the SH2-containing protein tyrosine phosphatase (SHP2) in humans. SHP2 is a cytoplasmic protein-tyrosine phosphatase, coded by the PTPN11 gene and plays an important role in the development of normal hematopoiese and leukemogenesis. The aim of the present study was to characterize the gene and protein expression pattern of ANKHD1 in normal hematopoietic cells and in leukemia cells, and its role in signaling pathways. In the present study, the overexpression of ANKHD1 mRNA and its protein was demonstrated in human leukemia cell lines (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi and Namalwa) and in 38 patients with a diagnosis of acute leukemia, compared to normal hematopoietic cells. The ANKHD1 protein was found to have a variable expression in different normal tissues (kidney, spleen, stomach, small intestine, skeletal muscle, liver, lung and lymph node). An association of ANKHD1 and SHP2 was found, through imunopreciptation and Western Blotting, in the chronic myeloid leukemia blastic phase cell line (K562) and in LNCaP cells. However, this association was not detected in the leukemia cell lines, KG1, HL60, Daudi and Jurkat. ANKHD1 was found located in the cytoplasm of normal hematopoietic cells and leukemia cells. ANKHD1 was found to be phosphorylated at serine in leukemic cells, but not in normal hematopoieitic cells. Through the yeast two-hybrid system, using a cDNA library from normal human bone marrow, the interaction of ANKHD1 with SIVA1 and SIVA2 was detected. SIVA isoforms are pro-apoptotic proteins, overexpressed in acute lymphoblastic leukemia cell lines. Preliminary studies showed that the inbition of ANKHD1 expression, through RNAi, resulted in increased apoptosis in leukemic cells, which suggests an anti-apoptotic function for ANKHD1. In conclusion, the present study identified ANKHD1 as a new protein that is overexpressed in leukemic cells. The protein interacts with SHP2 and SIVA in different cells and is probably associated with the abnormal phenotype of the leukemia cell through its anti-apoptotic function. These findings suggest that ANKHD1 may be a molecular target for a rational therapy for leukemia in the near future, and open a new field of investigation to better define the specific roles of ANKHD1 in different normal and leukemic hematopoietic cells
Doutorado
Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento
Doutor em Fisiopatologia Medica

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Assis, Cristiane Fernandes de. « Importancia da proteina tirosina fosfatase para a viabilidade de celulas leucemicas tratadas com quinonas ». [s.n.], 2003. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/314034.

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Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-03T16:41:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Assis_CristianeFernandesde_M.pdf: 3042510 bytes, checksum: f14f76bf214fea214d8604a04d205472 (MD5) Previous issue date: 2003
Resumo: o objetivo geral deste trabalho foi correlacionar o efeito citotóxico da hidroquinona (HQ) e da tetrahidroxiquinona (THQ) sobre as células HL60 com alteração da atividade de PTPs. As qui nonas apresentaram efeito inibitório sobre fosfatases de membrana e citosol das células HL60. A viabilidade das células HL60 foi avaliada através de 3 parâmetros: redução do MTT, atividade fosfatásica e conteúdo de proteínas. Para a HQ foram obtidos os seguintes valores de ICso: 20 e 50jJM para fosfatase e MTT, respectivamente. Quando as células foram tratadas em presença da GSH os valores de ICso para HQ foram 80jJM para fosfatase e 50jJM para MTT. Em relação à função mitocondrial e atividade fosfatásica, as células quando tratadas com THQ apresentaram um ICso 50jJM. Entretanto, a THQ em presença da GSH foi menos tóxica como revelado pelos valores de ICso encontrados (240JJM para fosfatase e 160JJM para o MTT). As células HL60 tratadas com HQ e THQ reduziram o NBT, indicando positividade na diferenciação de 103 e 89%, respectivamente. A fragmentação do DNA observada na presença da HQ (35%) e THQ (24%) indica indução de apoptose. Nossos resultados mostram que o efeito citotóxico das qui nonas sobre as células HL60 foi inespecífico e dependente da metabolização das mesmas, com produção de compostos mais reativos. Portanto, o estresse oxidativo causado pela HQ e THQ pode inicialmente alterar vias de sinalização que têm a participação de proteínas tirosina fosfatases, já que estas enzimas respondem negativamente a baixos níveis de agentes oxidantes
Abstract: The aim of this work was to correlate the cytotoxic effect of hydroquinone (HQ) and tetrahydroxiquinone (THQ) on HL60 cells with protein tyrosine phosphatases activities changing. The quinones presented inhibitory effect in the phosphatases isolated from HL60 cells (membrane and cytosol). The cell viability was evaluated through 3 parameters: MTT reduction, phosphatase activity and protein content. For the HQ the following ICso values were obtained: 20 and 50IJM for phosphatase and MTT, respectively. When these cells were treated in presence of GSH the ICso values for HQ were 80IJM for phosphatase and 50IJM for MTT. In relation to the mitochondrial function and phosphatase activity, when the cells were treated with THQ, the ICso was 50IJM for both parameters. However, THQ in presence of GSH was less toxic as revealed through to ICso values of (240IJM for phosphatase and 160IJM for MTT). HL60 cells treated with HQ and THQ reducted NBT, indicating differentiation positivity of 103 and 89%, respectively. DNA fragmentation was observed in the presence of HQ (35%) and THQ (24%) revealing apoptose induction. Ours results showed that cytotoxic effect of quinones on HL60 cells was inespecific and depended on the compounds metabolization, producing more toxic metabolites. Finally, the oxidative stress caused by HQ and THQ could initially changes signaling pathways which PTPs are involved, because these enzymes are negatively regulated by low levei of oxidant agents
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

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Rodrigues, Vanessa Kiraly Thomaz. « Estudos estruturais e computacionais das proteínas tirosina fosfatase A e B de Mycobacterium tuberculosis ». Universidade de São Paulo, 2016. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-30012017-151045/.

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Résumé :

Tuberculose (TB) é um grave problema de saúde pública, sendo a segunda maior causa de morte entre doenças infecto contagiosas. Em 2014, 9,6 milhões de casos e, aproximadamente, 1,5 milhão de mortes foram reportados. O Programa Nacional de Controle da Tuberculose preconiza para o tratamento a administração simultânea de quatro medicamentos. Contudo, casos de tratamento inadequado favorecem o surgimento de cepas multirresistentes e extensivamente resistentes aos medicamentos disponíveis. Diante disso, torna-se urgente a necessidade de investigar novos alvos moleculares e desenvolver novos fármacos que sejam úteis e eficazes para o tratamento da infecção. As proteínas tirosina fosfatases (PTPs) constituem uma grande família de enzimas responsáveis pela hidrólise do fosfato ligado aos resíduos de tirosina em proteínas. A importância destas fosfatases reside no fato de estarem envolvidas na regulação de uma série de funções celulares, tais como crescimento, interação intercelular, metabolismo, transcrição, motilidade e resposta imune. A partir da análise do genoma do Mycabacteirum tuberculosis, foram identificadas duas proteínas tirosinas fosfatases (PtpA e PtpB), responsáveis pela sua sobrevivência nos macrófagos do hospedeiro. Ambas as enzimas têm sido exploradas como alvo molecular para o desenvolvimento de novos fármacos para a tuberculose. Nessa dissertação, as sequências gênicas que codificam para as enzimas PtpA e PtpB de M. tuberculosis foram clonadas com sucesso nos vetores de expressão. A expressão solúvel das proteínas permitiu o estabelecimento de um protocolo padronizado de purificação. Ensaios de cristalização foram conduzidos e cristais de proteínas obtidos tiveram os dados cristalográficos coletados. Para a enzima PtpB foi possível determinar a estrutura cristalográfica em alta resolução em complexo com um grupo fosfato no sítio catalítico. Essa estrutura foi então utilizada na etapa posterior de descoberta de novos candidatos a inibidores. Os trabalhos computacionais conduzidos incluíram uma combinação de estratégias para a identificação de pontos de interação relevantes para o processo de reconhecimento molecular e ligação bem como para a construção de modelos farmacofóricos 3D específicos para cada enzima. Esses dados foram utilizados para a seleção de um conjunto de 8 candidatos a inibidores da PtpA e 5 candidatos a inibidores da PtpB. Portanto, estudos de biologia molecular estrutural e química medicinal foram empregados com sucesso para o estabelecimento de uma plataforma produtiva dos alvos selecionados bem como para a seleção de novos candidatos a inibidores.
Tuberculosis (TB) is a serious public health problem and the second leading cause of death among infectious diseases. In 2014, 9.6 million cases, and approximately 1.5 million deaths were reported. The National Program for Tuberculosis Control recommends the simultaneous administration of four drugs as treatment for the disease. However, inadequate treatment determines the emergence of multidrug- and extensively-resistant strains to available drugs. Therefore, new molecular targets and drugs are urgently needed for the treatment of the infection. The protein tyrosine phosphatases (PTPs) are a large family of enzymes responsible for the hydrolysis of phosphate group bound to tyrosine residues in proteins. The importance of these molecules is related to the regulation of a number of cellular functions, including growth, intercellular interaction, metabolism, transcription, motility and immune response. Based on Mycabacteirum tuberculosis genome analysis, two protein tyrosine phosphatases (PTPA and PtpB) were related to mycobacterium survival in host macrophages. Both enzymes have been explored as a molecular target for the development of new drugs for TB. In this dissertation, the gene sequences encoding the enzymes PtpA and PtpB from M. tuberculosis were successfully cloned in expression vectors. The soluble expression of the proteins allowed the establishment of a standardized purification protocol. Crystallization assays were conducted, protein crystals were obtained, and crystallographic data were collected. We determine the crystallographic structure of PtpB in complex with a phosphate group in the catalytic site at high resolution. This structure was then used in the subsequent step for the discovery of new inhibitor candidates. Computational studies included a combination of strategies for identifying interaction points relevant to the process of molecular recognition and binding as well as the construction of 3D pharmacophore models specific for each enzyme. These data were used to select a set of 8 and 5 compounds as PtpA and PtpB inhibitor candidates, respectively. Therefore, structural molecular biology and medicinal chemistry studies have been successfully conducted for the establishment of a platform aimed to the production of the selected targets as well as for the selection of new inhibitor candidates.

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Souza, Luiz Felipe Schmitz de. « Síntese de carboxi-chalconas com ação inibitória de proteínas tirosina fosfatase de Mycobacterium tuberculosis ». reponame:Repositório Institucional da UFSC, 2014. https://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/128901.

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Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química, Florianópolis, 2014.
Made available in DSpace on 2015-02-05T20:28:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 327744.pdf: 3387181 bytes, checksum: f953d00b12dd357296a0d6cf6ed03852 (MD5) Previous issue date: 2014
Este trabalho teve como objetivo principal a síntese e caracterização de 22 chalconas derivadas do 4-carboxibenzaldeído, e avaliação da sua atividade biológica frente às enzimas PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis. As chalconas foram sintetizadas através do método de condensação de Claisen-Schmidt, utilizando quatro condições reacionais distintas. Todas as chalconas foram caracterizadas através de espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) de 1H e 13C, ponto de fusão e espectros de massa (EM). As chalconas obtidas por via ácida (VA) forneceram primeiramente produtos esterificados, que foram hidrolisados para obter as chalconas com carboxila livre, que foram confirmadas pelo ponto de fusão. Entre as 22 chalconas obtidas, 13 são inéditas Q1VA, Q2VA, Q5VA, Q18VA, Q16VB, Q17VB, Q20VB, Q22VB, Q26VB, Q7VBR, Q3MC, Q4MC e Q9MC. As chalconas Q22VB e Q26VB foram as que apresentaram melhor atividade biológica frente às enzimas PtpA e PtpB de Mycobacterium tuberculosis. O composto Q23VB, análogo ao composto (E)-4-(3-(naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en-il) benzóico (QPadrão) anteriormente publicado pelo grupo e que tem alta atividade frente a estas enzimas, não teve atividade significativa.

Abstract : This work aimed to the synthesis and characterization of 22 chalcones derived from 4 - carboxybenzaldehyde , and evaluation of their biological activity against PTPA and PTPB Mycobacterium tuberculosis enzymes . The chalcones were synthesized by the method of Claisen -Schmidt condensation using four different reaction conditions . All chalcones were characterized by nuclear magnetic resonance spectra ( NMR) 1H and 13C NMR , melting point and mass spectra ( MS). The chalcones obtained via acid (VA) provided first esterified product , which was hydrolyzed to obtain chalcones with free carboxyl , which was confirmed by melting point. Among the 22 chalcones obtained , 13 are new Q1VA , Q2VA , Q5VA , Q18VA , Q16VB , Q17VB , Q20VB , Q22VB , Q26VB , Q7VBR , Q3MC , Q4MC and Q9MC . The Q22VB and Q26VB chalcones showed the best biological activity against PTPA and PTPB Mycobacterium tuberculosis enzymes . The compound Q23VB , analogous to compound (E)-4-(3-(naftalen-2-il)-3-oxoprop-1-en-il) benzóico (QPadrão) previously published by the group and has high activity against these enzymes had no significant activity.

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Palazzetti, Chiara. « Attività enzimatica ed inibizione della tirosin-fosfatasi A (MptpA) di Mycobacterium tuberculosis in funzione del pH ». Master's thesis, Alma Mater Studiorum - Università di Bologna, 2021. http://amslaurea.unibo.it/24374/.

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La tubercolosi è una malattia infettiva causata dal batterio patogeno Mycobacterium tuberculosis. Tale micobatterio è in grado di secernere due importanti tirosin-fosfatasi, MptpA e MptpB, che esplicano un importante ruolo come fattori di virulenza permettendo la sopravvivenza del batterio all’interno dell’ospite mediante evasione della risposta immunitaria. In particolare, MptpA è un membro della famiglia delle tirosin-fosfatasi a basso peso molecolare ed è composta da 163 amminoacidi (17,9 kDa). L’enzima impedisce la normale maturazione del fagosoma e la fusione fagosoma-lisosoma, attraverso la defosforilazione della proteina VPS33B, inibendo così la risposta cellulare all’infezione. Obiettivo del seguente lavoro di tesi è stato analizzare il comportamento catalitico di MptpAW152F, variante caratterizzata dalla presenza di un solo triptofano, in funzione del pH. È stata inoltre valutata l’eventuale inibizione dell’attività enzimatica ad opera di alcuni composti naturali, i glucosinolati e di un inibitore di sintesi (L335-M34). Lo studio cinetico effettuato in presenza del substrato fosfotirosina ha evidenziato la presenza di un secondo sito allosterico, adiacente al sito attivo dell’enzima, che influenza l’attività di MptpAW152F. Questo risulta essere un promettente bersaglio per la progettazione di nuovi farmaci ed inibitori selettivi. La valutazione di alcuni tra questi, come l’inibitore sintetico L335-M34 ha riportato risultati promettenti. I saggi di attività in pre-steady-state in funzione del pH e le analisi SPR hanno permesso di indagare ulteriormente l’affinità di legame tra MptpAW152F e la fosfotirosina e di evidenziare il riarrangiamento strutturale dell’enzima da una forma aperta ad una forma chiusa, cataliticamente attiva.

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Magrin, Elisa. « Fosfo-tirosin-fosfatasi (PTPs) : trasduttori positivi e negativi delle vie del segnale mediate da recettori di membrana ». Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2012. http://hdl.handle.net/11577/3422177.

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Résumé :

The tyrosine phosphorylation in eukaryotic proteins is a key event for transducing enviromental cues into cellular responses ranging from cell-to-cell communication to proliferation, differentiation, cell death and survival. This mechanism of signal transduction is mediated by the opposing and concerted action of Protein Tyrosin Kinases (PTKs), which add phosphoryl groups to target proteins, and Protein Tyrosin Phosphatases (PTPs), which remove them; both classes of enzymes can take part in activatory and inhibitory signalling processes. Tyrosin phosphorylation calls also into action the Src-homology 2 domain (SH2), which is contained in a myriad of proteins with varied functions and that directs protein-protein interaction by “sensing” the phosphorylated state of tyrosine residues, taking part in the modulation of signal transduction. This three-part system has recently been baptized as the “writer “ (PTK), “eraser” (PTP) and “reader” (SH2) tollkit, emphasizing how the combination and dynamic interplay of the elements can generate diverse and complex regulatory outputs. The aim of this work was to determine how the tyrosine phosphorylation is involved in the cellular response to extracellular signals; we investigated the events which trigger an altered pathway in diseases, mainly the role of non-receptor PTPs in three different pathological conditions. In Polycytemia Vera (PV) and Essential Thrombocythemia (ET), which are Philadelphia-negative myeloproliferative disorders (Ph-MPDs), our results demonstrate that in resting platelets the dephosphorylation of the Src-Tyr527 is due the SHP-2 constitutive activity, a non-receptor PTPs, leading to the Src preactivation. The anomalous activation of the kinase is implicated in the hypersensivity of Ph-MPDs and likely involved in the functional abnormalities of PV and ET platelets. In Heparin-Induced-Thrombocytopenia (HIT), immunological reaction that lead to the activation of FcγRIIA in platelets, we have not identified any correlation between the polymorphisms of receptor and HIT, but our results demonstrate that the phosphorylation of FcγRIIA-ITAM motif is due the type of ligand and that influences the responses in the platelets. We stimulated normal platelets with either IV.3, functional blocking antibody against FcγRIIA, or complexes of IgG molecules, and we have not highlighted phosphorylation of the ITAM or aggregation, but we observed a mildly shape change. Interestingly, the pre-incubation of the platelets with PTP-1B, the largest PTPs in platelets, in association with IV.3 and IgG as agonists, leads to phosphorylation of the ITAM and to aggregation. This mechanism may be involved in the clearance of IgG-containing complexes from the circulation by platelets. Finally, we demonstrate for the first time that the PDGF (platelet-derived growth factor)-induced proliferation in epatic stellate cells (HSCs), primary effector cells in liver fibrosis, is mediated by the PTPs SHP-2 and SHP-1: SHP-2 acts as positive regulator of PDGF-dependent signalling, whereas SHP-1 is a negative regulator and lead to the dephosphorylation of the PDGF-receptor. An altered activity and/or expression of these two PTPs causes an inhibited cell proliferation of HSCs, thus they may be a target for new antifibrotic therapies for patients with liver fibrosis. The three pathological models analyzed in this work highlight the key role of PTPs in signalling pathways; they are not to be trivially dismissed as negative regulators because they can organize cellular responses to different stimulations. Furher studies on PTPs-induced signalling regulation may identify new pharmacological therapies
La fosforilazione tirosinica di proteine degli organismi eucarioti è il meccanismo chiave di trasduzione del segnale indotto da stimoli ambientali a livello cellulare, e si esplica in eventi di proliferazione, differenziazione, morte cellulare e sopravvivenza. Questo processo è mediato dall’azione concertata di protein tirosin chinasi (PTKs), che trasferiscono un gruppo fosfato alle proteine bersaglio, e protein tirosin fosfatasi (PTPs), che lo rimuovono; entrambe le classi di questi enzimi possono prender parte ad eventi attivatori e inibitori del signalling. La fosforilazione in tirosina determina il coinvolgimento anche del dominio SH2 (Src-homology 2 domain), presente in numerose proteine con svariate funzioni, che coordina l’interazione proteina-proteina proprio grazie ai residui tirosinici fosforilati, prendendo quindi parte alla modulazione del segnale di trasduzione. Il sistema formato da PTKs, PTPs e dominio SH2 è noto come “writer” (PTK), “eraser” (PTP) e “reader”(SH2) tollkit, denominazione che vuole sottolineare come la relazione e la combinazione di questi tre elementi riesca a determinare una fine e complessa regolazione a livello di signalling. Questo lavoro di tesi intende esaminare il coinvolgimento della fosforilazione tirosinica nel mediare le risposte cellulari a diversi stimoli extracellulari e valutare quali sono i fattori responsabili della sua alterazione in determinate situazioni patologiche ed in particolare il ruolo delle PTPs non recettoriali in tre specifiche patologie. In Policitemia Vera (PV) e Trombocitemia Essenziale (ET), disordini mieloproliferativi Philadelphia-negative (Ph-MPDs), i nostri dati dimostrano che la mancata fosforilazione del sito inibitorio, Y527, della tirosin chinasi Src in piastrine non stimolate è dovuto alla costitutiva attivazione di SHP-2, una PTP non recettoriale, determinando una forma pre-attivata di Src. Questa forma di Src è implicata nella ipersensibilizzazione piastrinica ed è responsabile, almeno parzialmente, delle funzionalità anormali delle piastrine di PV e ET. Nella Trombocitopenia Indotta da Eparina (HIT), reazione autoimmune che porta all’attivazione del recettore FcγRIIA piastrinico, pur non avendo evidenziato una correlazione tra il polimorfismo del recettore e HIT, noi abbiamo indagato il diverso stato di fosforilazione della sequenza ITAM di FcγRIIA e conseguente risposta piastrinica in relazione al tipo di ligando. Stimolando infatti le piastrine di donatori con l’anticorpo monoclonale IV.3, noto per essere un inibitore di FcγRIIA, e con delle IgG complessate, non abbiamo evidenziato fosforilazione dell’ITAM del recettore nè aggregazione, anche se le piastrine vanno incontro ad un cambiamento di forma. In presenza però dell’inibitore di PTP1B, la fosfatasi più abbondante in questo tipo di cellule, gli stessi stimoli portano alla fosforilazione di ITAM e le piastrine vanno incontro ad aggregazione. Questo meccanismo potrebbe essere implicato nel ruolo svolto dalle piastrine nella clereance dei complessi contenenti IgG presenti in circolo. Infine noi abbiamo dimostrato per la prima volta che la risposta proliferativa dopo stimolazione di PDGF (platelet-derived growth factor) delle cellule stellate epatiche (HSCs), principali cellule coinvolte nella fibrosi epatica, è mediata dalle fosfatasi SHP-2 e SHP-1: SHP-2 partecipa come trasduttore positivo del segnale mediato da PDGF, mentre SHP-1 ha effetto negativo sul segnale mediato da PDGF catalizzando la defosforilazione del recettore di PDGF. L’alterazione della loro attività e/o espressione porta ad una inibizione della proliferazione cellulare di HSCs, perciò entrambe le fosfatasi si propongono come possibili bersagli di potenziali farmaci antifibrotici. In tutti i modelli patologici studiati, è chiaro che le PTPs rivestono un ruolo fondamentale nel signaling cellulare; la loro presenza non solo non ha significato esclusivamente negativo ma è necessaria per organizzare la risposta a diversi tipi di stimolo. Lo studio della regolazione del signaling indotto dalle PTPs potrebbe quindi aprire strade alternative per individuare nuove terapie farmacologiche

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Sousa, Roberta Regina Ruela de. « Estudo por oxido-redução de uma proteina tirosina fosfatase (CD45) purificada de membrana de linfocitos humanos ». [s.n.], 2005. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/314761.

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Résumé :

Orientador: Hiroshi Aoyama
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-06T06:33:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sousa_RobertaReginaRuelade_M.pdf: 3257089 bytes, checksum: 29f24a432f8c0bfd7dd71af48cc7608a (MD5) Previous issue date: 2005
Resumo: As proteínas tirosina fosfatases (PTP) (EC 3.1.3.48) são enzimas regulatórias chaves que participam na transdução de sinal e são essenciais na regulação do crescimento, diferenciação, ciclos celulares, na transcrição gênica, resposta imune e outros processos. Esta classe de enzimas, que contém cisteína no sítio ativo, pode ser inativada por agentes oxidantes. Neste trabalho, estudamos os efeitos de peróxido de hidrogênio e t-butil hidroperóxido, compostos que induzem estresse oxidativo, na atividade de uma PTP purificada de membranas de linfócitos humanos, indicativamente a CD45. A PTP foi purificada de membranas de linfócitos humanos através de cromatografias de troca iônica (DEAE Sepharose) e exclusão molecular (Sephacryl S-200). A purificação enzimática foi acompanhada por SDS-PAGE e eletroforese bidimensional. A atividade enzimática foi determinada através de incubação a 37°C por 30 min em pH 5,0 em presença de 5 mM de p-nitrofenil fosfato (pNPP) como substrato. A enzima obtida da cromatografia de exclusão molecular apresentou uma massa molecular relativa de aproximadamente 200 kDa, reconheceu mais eficientemente tirosina fosfato (cerca de 3,2 vezes) como substrato quando comparado ao pNPP, e foi inibida por inibidores específicos de PTP, tais como vanadato (40%), pervanadato (100%), p-cloromercuribenzoato (20%) and Cu2+ (95%). Ácido okadáico, um inibidor específico de serina e treonina proteína fosfatases, não afetou a atividade da PTP de membranas de linfócitos. Estes resultados de caracterização sugerem fortemente que a PTP purificada de membranas de linfócitos humanos é a CD45. Peróxido de hidrogênio e t-butil hidroperóxido inibiram a atividade dessa proteína com valores de IC50 (concentração do composto que produz 50% de inibição enzimática) de 50 µM e 16 mM, respectivamente. Glutationa reduzida (GSH) protegeu parcialmente a enzima contra estes oxidantes, porém proteções totais foram obtidas quando se adicionava 250 mM de desferoxamina ao meio de ensaio. Nossos resultados sugerem que essa proteína pode ser regulada por alteração do estado de oxidação dos grupos funcionais do sítio ativo e que esta regulação poderia fornecer um mecanismo de controle celular através de espécies reativas de oxigênio
Abstract: Protein phosphatases, that dephosphorylate proteins in residues of threonine, serine and tyrosine, are a class of enzymes that can be stressed by compounds present in oxidant or reductant environments. In particular, the protein tyrosine phosphatases (PTP) (EC 3.1.3.48) are key regulatory enzymes that participate in signal transduction and are essential for regulating cellular growth, differentiation, cell cycle, gene transcription, immune response and other processes. This class of enzymes, which contain cysteine in the active site, can be inactivated by oxidant reagents. In this work we have studied the effect of hydrogen peroxide and t-butyl hydroperoxide, compounds that induce oxidative stress, on a purified PTP (CD45) from membrane human lymphocytes. PTP was purified from human lymphocyte membranes through ion exchange (DEAE Sepharose) and molecular exclusion (Sephacryl S-200) chromatographies. The enzyme purification was followed by SDS-PAGE and 2D electrophoresis. The enzyme activity was determined by incubation at 37oC for 30 minutes at pH 5.0 in presence of 5 mM p-nitrophenylphosphate (pNPP) as substrate. The enzyme obtained from molecular exclusion chromatography had a relative molecular mass of approximately 200 kDa, recognized more efficiently tyrosine phosphate (about 3.2-fold) as substrate when compared with p-NPP, and was inhibited by specific PTP inhibitors, such as, vanadate (40%), pervanadate (100%), p-chloromercuribenzoate (20%) and Cu2+ (95%). Okadaic acid, a specific serine and threonine protein phosphatases inhibitor, did not significantly affect the lymphocyte membrane PTP activity. These characterization results strongly suggest that the membrane PTP purified from human lymphocytes was the CD45. Hydrogen peroxide and t-butyl hydroperoxide inhibited the CD45 activities with IC50 (concentration of compound that produces 50% enzyme inhibition) values of 50 µM and 16 mM, respectively. Reduced glutathione (GSH) partially protected the enzyme against these oxidations, but full protections were observed when 250 mM deferoxamine were added to the assay medium. Our results suggest that CD45 can be regulated by altering the oxidation state of active site functional groups, and that this regulation could provide a mechanism of cell control by reactive oxygen species
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

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Mena, Durán Armando V. « Interacción de la proteína-tirosina fosfatasa SHP-1 y la proteína-tirosina kinasa FLT3 constitutivamente activada en las enfermedades malignas mieloides : Un nuevo factor pronóstico ». Doctoral thesis, Universitat de València, 2008. http://hdl.handle.net/10803/10044.

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Résumé :

La búsqueda de factores pronósticos que permitan entender la heterogeneidad en laevolución de los pacientes diagnosticados de neoplasias mieloides ha dado paso a ladenominada "terapia adaptada al riesgo". Un buen ejemplo de ello son las mutacionesque afectan al dominio transmembranoso (ITD) y el dominio tirosina cinasa (D835) delreceptor de superficie celular de las células hematopoyéticas fms-like 3 (FLT3) queconstituye un conocido factor pronóstico en las leucemias aguda mieloblásticas (LMAs)y, en menor medida, en los síndromes mielodisplásicos (SMDs). En un análisis de 208pacientes diagnosticados de LMA hemos detectado en un 24% de pacientes mutacionesque afectan a FLT3, 42% en pacientes diagnosticados de leucemia promielocítica y 17%en leucemias secundarias. Cuatro pacientes mostraban mutaciones tanto ITD comoD835. 94% de los pacientes que presentaban mutaciones de FLT3 eran clasificables enel riesgo intermedio citogenética descrito por el MRC. Desde un punto de vistapronóstico, la presencia de mutaciones de FLT3 se asoció con una peor supervivencialibre de enfermedad y supervivencia libre de evento tanto en la serie global como en lospacientes con citogenética de riesgo intermedio. Por otra parte nuestro grupo habíadescrito recientemente el valor pronóstico que la expresión de SHP-1, una tirosinafosfatasa clave en la hematopoyesis y de la que se han descrito alteraciones molecularesque la implican en la fisiopatología de la policitemia vera familiar, neutropeniacongénita, SMD y LMA, puede tener en los pacientes con síndromes mielodisplásicos(Mena-Duran et al, Br J Haematol 2005). Así aquellos pacientes en los que <50% de losprogenitores hematopoyéticos expresaban SHP-1 por inmunohistoquímica progresabanmás rápidamente a leucemia aguda y tenían una supervivencia recortada. Chen et al.(JBC, 2005) mostró que FLT3 silencia la actividad de la tirosina fosfatasa SHP-1 através de un mecanismo desconocido. En una serie de 235 pacientes diagnosticados deLMA y SMD en los que se ha estudiado la existencia de mutaciones de FLT3 ademáshemos estudiado la expresión del gen PTPN6 (SHP-1) por inmunohistoquímica y PCRen tiempo real. La asociación de mutaciones de FLT3 y abolición de la expresión deSHP-1 se asoció a una supervivencia recortada en pacientes jóvenes que ademáspresentaban una forma biológica de enfermedad más agresiva hiperleucocitaria.Nuestros resultados abren la posibilidad de que el desarrollo de fármacos queincrementen la actividad fosfatasa pueden jugar un papel importante en la terapia de lasneoplasias mieloides.
Many prognostic factors are shaping the so-called adapted risk therapy in acutemyelogenous leukemia (AML) and myelodysplastic syndromes (MDS). Our group hasconfirmed the the prognostic value of mutation analysis of fms-like 3 receptor (FLT3)in 208 patients diagnosed with acute myelogenous leukemia. Patients having ITDand/or D835 mutations had shorter event free survival and disease free survival. On theother hand, we show that SHP-1, a tyrosine-phosphatase (PTP) which has an importantrole in hematopoiesis and that has been involved in the pathogenesis of familialpolicytemia vera, inherited neutropenia, myelodysplastic syndromes or acutemyeloblastic leukemia, has an important prognostic value in MDS. Those patientsshowing less than 50% of their hematopoietic precursors stained by SHP-1immunohistochemistry progressed to acute leukemia more rapidly and had a shortenedoverall survival. Chen et al (2005, JBC) showed that FLT3 was able to silence theexpression of SHP-1 by an unknown mechanism. Then, what would be the prognosticor even therapeutical implications of having both FLT3 mutations and lower expressionof SHP-1 for AML and SMD patients? Our study in 85 patients shows a negative effecton overall survival and seems to be correlated with yourger age and an aggressivehyperleukocytosis. On the other hand, drugs that may enhance PTPase activity mighthave a role in myeloid neoplasia therapy.

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Picardi, Paty Karoll. « Relação entre a atividade da proteina tirosina fosfatase e a ação citotoxica de antimalaricos sobre linfocitos humanos ». [s.n.], 2002. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/314045.

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Orientadores : Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-02T23:21:13Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Picardi_PatyKaroll_M.pdf: 10576328 bytes, checksum: 4b3d1020e8bfdcab6dde7ac5f6e92049 (MD5) Previous issue date: 2002
Resumo: O objetivo deste trabalho foi verificar o efeito de antimaláricos na atividade das fosfatases isoladas de linfócitos humanos e a ação destes fármacos na viabilidade dos linfócitos. A atividade fosfatásica foi determinada através da dosagem do pnitrofenol e a viabilidade celular foi avaliada através de 3 parâmetros: redução do MTT (integridade mitocondrial), dosagem de proteína (indicação do número de células) e atividade fosfatásica (metabolismo celular). A cloroquina não apresentou efeito significativo sobre as fosfatases de membrana, citoplasmáticas e da fração total. No entanto, o efeito inibitório de 25% sobre as fosfatases citoplasmáticas e de 30% fração total foi observado após pré incubação da enzima na presença da quinina. Ao contrário dos outros antimaláricos, a desferoxamina ativou as fosfatases da fração total (40%) e de membrana (70%). Nos estudos de citotoxicidade a cloroquina mostrou baixa citotoxicidade analisando a atividade da fosfatase total (ICso=360j.lM) e quantificação de proteína (ICso=346j.1M), quando comparada com a maior toxicidade observada para o teste do MTT (lCso=75j.1M). A quinina também apresentou uma toxicidade maior para a mitocôndria (aumento de 130% na redução do MTT), quando comparado com a quantificação da proteína e atividade fosfatásica (inibição de 40%). Nossos resultados sugerem que a ação citotóxica dos antimaláricos (quinina e cloroquina) pode ser devido a dois fatores: inibição direta de proteínas fosfatases, já que estudos cinéticos mostraram que as fosfatases predominantes em linfócitos são proteínas tirosina fosfatases e proteínas serinaltreonina fosfatases ou inibição de enzimas dependentes de grupamento sulfidrila e alteração de organelas como mitocôndria por induzirem estresse oxidativo. A desferoxamina teve uma ação ativadora sobre as proteínas fosfatases de membrana, provavelmente agindo na CD45. A presença de antioxidantes (GSH e ácido ascórbico) causou ativação das fosfatases, porém, em presença da quinina, cloroquina e desferoxamina essa ativação foi ainda maior
Abstract: The aim of this work was to verify the effect of antimalarial drugs in phosphatases isolated from human Iymphocytes and the action of these pharmaceutical drugs on Iymphocytes viability. Phosphatase activity was determined through the pnitrophenol assay and cell viability through 3 parameters: MTT reduction (mitochondrial integrity), protein content (cell number index) and phosphatase activity (cell metabolism). Phosphatases from membrane and cytoplasm were not affected by chloroquine. However, an inhibitory effect on cytoplasmic phosphatases (30%) on total fraction (25%) was observed after pre-incubation of the enzyme in presence of the quinine. In contrast to other antimalarials desferoxamine, the phosphatases actived from the total fraction and membrane, 40 and 70%, respectively. In the citotoxicity studies, chloroquine showed low citotoxicity when the activity of total phosphatase (IC50=360_M) and protein content (IC50=346_M) were analysed, when compared to the toxicity observed with MTT test (IC50=75_M). Quinine also had a high toxicity for the mitochondria (130% increased MTT the reduction), when compared to protein quantification and phosphatase activity (40% inhibition). Our results suggest that the cytotoxic action of antimalarials (quinine and chloroquine) can be due to two factors: direct inhibition of protein phosphatases, since kinetic studies had shown that the predominant phosphatases in Lymphocytes are protein tyrosine phosphatases and protein serine/treonine phosphatases or inhibition of sulfhydryl group dependent enzymes and alteration of organelas such as mitochondria by inducing oxidative stress. Desferoxamine had an activator action in membrane protein phosphatases of, probably acting on the CD45. Antioxidant substances (GSH and ascorbic acid) caused activation of phosphatases, but, in presence of quinine, cloroquine and desferoxamine this activation was more significative
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

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Vernieri, Ermelinda. « Design and synthesis of peptides that modulate apoptotic process ». Doctoral thesis, Universita degli studi di Salerno, 2014. http://hdl.handle.net/10556/1788.

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2013 - 2014
Oncogenic activation of tyrosine kinases is a common feature in cancer, and its regulation represents an excellent antitumoral target. Tyrosine phosphorylation is also controlled by protein-tyrosine phosphatases (PTPs). Recent evidence has shown that PTPs can function as tumour suppressors. An improved understanding of how these enzymes function and how they are regulated might aid the development of new anticancer agents. It has been shown that cross-regulation of kinases/phosphatases and caspases allows for fine-tuning of the apoptotic threshold, as well as the opportunity to amplify apoptotic signals. The signaling pathways involved in the control of cell proliferation, adhesion and migration are governed by the balanced action of protein tyrosine kinases (PTKs) and protein-tyrosine phosphatases (PTPs). For this reason my PhD thesis focused the attention on three different targets PTPRJ a receptor protein tyrosine phosphatase, GRK2 G protein-coupled receptor kinase 2, CaMKII, Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase II. PTPRJ is down regulated in tumor cells and its over-expression suppresses cell growth, both in vivo and in vitro, concomitant with the reduction of the activity of MAP-kinase (ERK1/2) and phosphorylation of PLC-. Therefore, the identification of agonist peptides would be a valid approach in antitumoral therapy. By means of a phage display library screening, we recently identified two peptides able to bind and activate PTPRJ, [CHHNLTHAC]-OH and [CLHHYHGSC]-OH. Focused the attention on [CHHNLTHAC]-OH my research project was based on the design of different peptide libraries using several approaches like Alanine scanning approach and changes in disulfur bridge. GRK2, G protein-coupled receptor kinase 2 is a relevant signaling node of the cellular transduction network, playing major roles in the physiology of various organs/tissues including the heart and blood vessels. Emerging evidence suggests that GRK2 is up regulated in pathological situations such as heart failure, hypertrophy, hypertension and is involved in the progression of cellular cycle. Therefore, its inhibition offers a potential therapeutic solution to these diseases. During my PhD thesis a SAR study and a NMR conformational analysis of peptides derived from HJ loop of GRK2 and able to selectively inhibit GRK2 were performed. Moreover, we explored the GRK2 inhibitory activity of a library of cyclic peptides derived from the HJ loop of GRK2. The design of these cyclic compounds was based on the conformation of the HJ loop within the X-ray structure of GRK2. One of these compounds, potently and selectively inhibited the GRK2 activity, being more active than its linear precursor. CaMKII, Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase II constitutes a family of closely related multifunctional serine/threonine kinases that transduces elevated Ca 2+ signals in cells to a number of target proteins ranging from ion channels to transcriptional activators. Among processes regulated by CaMKII are neuronal growth and functions related to brain development, synaptic plasticity as well as the formation and maintenance of memory, cell proliferation and apoptosis, proper function of the immune system, and the central control of energy balance. Current knowledge about CaMKII control on physiological or pathological functions is largely based on experiments with pharmacological inhibitors. As part of our current interest in the study of CaMKII-dependent cell signaling, we directed our efforts toward the identification of novel CaMKII peptide inhibitors. Starting from a potent CaMKinase II inhibitor, CaM-KNtide, we designed different CaM-KNtide analogues and evaluated the inhibitory activity and specificity. [edited by author]
XII n.s.

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Anjos, Karla Graziela Santana dos. « Avaliação enzimática e funcional de fosfatases associadas à virulência em trofozoítos de entamoeba histolytica ». reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, 2013. https://www.arca.fiocruz.br/handle/icict/7112.

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Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2013-10-11T12:22:59Z No. of bitstreams: 1 Karla Graziela. Avaliação enzimática...pdf: 7967639 bytes, checksum: aadcd19e00e6ff487dba2f6a89822b03 (MD5)
Made available in DSpace on 2013-10-11T12:22:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Karla Graziela. Avaliação enzimática...pdf: 7967639 bytes, checksum: aadcd19e00e6ff487dba2f6a89822b03 (MD5) Previous issue date: 2013
Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil
Entamoeba histolytica, o agente etiológico da amebíase, constitui a segunda maior causa de morte por protozooses, sendo considerado um grave problema de saúde pública, particularmente em países em desenvolvimento. A morte celular induzida por este parasito entérico é dependente de contato e mediada por proteínas específicas, as quais modulam diversos eventos fisiológicos no hospedeiro. Dentre os mecanismos reguladores de tais respostas está a desfosforilação de grupos fosfotirosil de proteínas, através da atuação de proteína tirosina fosfatases (PTPases), tanto expressas na superfície celular como secretados pelo trofozoíto. Alguns estudos demonstram uma rápida diminuição nos níveis de fosforilação de resíduos tirosina em proteínas de células-alvo após o contato com E. histolytica. Estas PTPases têm sido descritas como tendo importante papel na patogênese da amebíase. O objetivo deste estudo foi analisar o perfil de atividade fosfatásica em diferentes cepas de E. histolytica, assim como caracterizar a sua sensibilidade a conhecidos inibidores de proteína tirosina fosfatases, e os efeitos destes moduladores em mecanismos envolvidos na patogênese, a exemplo de fagocitose e efeito citopático. Inicialmente, a sensibilidade aos moduladores da via de sinalização celular em trofozoítos de E. histolytica (cepas ICB – 452, ICB – CSP e HM1:IMSS) foi caracterizada através de avaliação da proliferação celular, onde inóculos de parasitos foram incubados em presença ou ausência de inibidores de PTPases. Dentre os moduladores testados, o derivado de vanádio bisperoxo (1, 10 - fenantrolina) oxovanadato de potássio (bpVphen) e o óxido de fenilarsina (PAO) demonstraram efetiva capacidade antiproliferativa. Estas células apresentaram uma maior sensibilidade ao PAO em comparação ao bpV(phen), com valores de IC50 para a cepa HM1:IMSS de 0,9 μM e 38,4 μM, respectivamente. A análise bioquímica revelou que há uma maior atividade secretória e ectofosfatásica na linhagem HM1:IMSS (24,48 nM p-NP/40 min./3 x 106 células e 297 nM p-NP/40 min./2 x 105 células, respectivamente), e uma redução desta atividade foi detectada na presença dos derivados de vanádio na superfície do parasito (31,3 nM p-NP/40 min./2 x 105 células). O mesmo não foi observado após a adição de PAO. A análise da eritrofagocitose e da destruição da monocamada de células epiteliais da linhagem MDCK, importantes marcadores de virulência neste patógeno, demonstrou significativa redução destes processos em trofozoítos tratados com os inibidores ortovanadato de sódio (OVS) e o bpV(phen), indicando a participação de PTPases nos mesmos. Estas mesmas alterações foram observadas após o tratamento do parasito com PAO, porém dados ultraestruturais de citoquímica enzimática não indicam a redução da atividade fosfatásica por este composto. Estes dados foram confirmados após a avaliação da atividade das frações purificadas de homogenatos solubilizados de trofozoítos de E. histolytica, onde detectou-se a redução dos níveis de atividade enzimática após a adição de vanadato e seus derivados à reação, o que não pôde ser observado após o acréscimo de PAO. Os resultados obtidos indicam que PTPases estão diretamente envolvidas em importantes funções celulares exercidas por trofozoítos de Entamoeba histolytica. Ademais, novos estudos que visem à elucidação dos possíveis modos de ação do composto PAO neste patógeno poderiam contribuir, consideravelmente, com o entendimento da biologia do parasito e, consequentemente, dos mecanismos patogênicos da amebíase.
The microaerophilic protozoan Giardia lamblia inhabits the upper small intestine mucosa of vertebrate hosts, where it is exposed to different concentrations of oxygen. Despite the fermentative metabolism, Giardia trophozoites consume O2 and produce oxygen free radicals and therefore mechanism for detoxification are required. Devoid of glutathione, Giardia express high concentrations of cystein-rich proteins (CRP, also known as variable surface protein or VSP), as an antioxidant defense. This mechanism involves redox cycling for maintenance of a reduced intracellular environment and protection from oxidative stress. In this regard, substances that interfere in the antioxidant response of this protozoan could comprise a powerful chemotherapeutic strategy for Giardia lamblia infection. Here, we analyzed the effects of DETC, a superoxide dismutase (SOD) inhibitor, on parasite proliferation, thiol expression, lipid peroxidation, free radicals detection and cell architecture. DETC inhibited parasite proliferation at levels similar to metronidazole and induced peroxidation of membrane, possibly by the increase of reactive species.Ultrastructural alteration were also observed. Since this protozoan is devoid of SOD, here present data indicate SOD-independ DETC effects. Thiol groups detection with the fluorescent probe o-phthaldialdehyde (OPA). Cells treated with DETC displayed washed out cytoplasm and structures indicative of autophagy. The peripheral vesicles also had an increased volume, presumably caused by homophilic fusion. Taken together these data indicate that DETC enhance the oxidative stress in Giardia trophozoites by reacting with thiol groups.

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Panico, Karine. « Interações moleculares da protéina tirosina fosfatase de dupla especificidade 3 em células HeLa submetidas a estresse genotóxico ». reponame:Repositório Institucional da UFABC, 2012.

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Bleicher, Lucas. « Implementação da análise de acoplamentos estatísticos e sua aplicação à família de proteínas tirosina fosfatases ». Universidade de São Paulo, 2009. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/76/76132/tde-26032009-130135/.

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A Análise de Acoplamentos Estatísticos é uma técnica computacional capaz de identificar resíduos importantes para a estrutura e função de proteínas em uma família por meio da quantificação de conservação posicional, correlação entre posições e identificação de grupos de resíduos correlacionados entre si. Neste trabalho, a análise de acoplamentos estatísticos foi implementada e aplicada ao estudo das proteínas tirosina fosfatases. Em conjunto com as proteínas tirosina quinases (PTKs), que adicionam um grupo fosforil a um resíduo de tirosina em uma proteína, as proteínas tirosina fosfatases (PTPs), que o removem, são responsáveis por diversos processos de sinalização celular. Elas são um caso de evolução convergente, onde um subgrupo (as proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular) não apresenta homologia às chamadas PTPs \"clássicas\", capazes de defosforilar apenas resíduos de tirosina, e às fosfatases de especifidicade dupla, capazes de defosforilar também resíduos de serina e treonina, além de substratos não-protéicos. Em comum, as três subfamílias apresentam apenas o motivo CX5R, característico para todas as PTPs. Através do estudo das três subfamílias utilizando a análise de acoplamentos estatísticos, foi possível obter uma descrição detalhada de suas características conservadas e correlacionadas, relacionando-as ao conhecimento acumulado sobre proteínas tirosina fosfatases e a questões em aberto como a regulação por dimerização, a especificidade e mutações relacionadas a patologias. Foi possível também apresentar um método capaz de distinguir proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular das arsenato redutases, derivadas das primeiras por evolução divergente. Adicionalmente, a técnica foi aplicada ao estudo das hexoquinases, às superóxido dismutases e às peroxidases. A tese descreve também estudos desenvolvidos pelo autor na área de cristalografia de proteínas a determinação das estruturas da Transtirretina humana em complexo com genisteína, da holo-Hexoquinase PI de S. cerevisae, do complexo IL-22/IL-22R1 e da Laminarinase de R. marinus.
The statistical coupling analysis is a computational technique which can identify important residues for the structure and function of proteins in a family by quantifying positional conservation, correlation between positions and identifying groups of self-correlating residues. Its implementation in this research group was applied to the study of the protein tyrosine phosphatases. Together with the protein tyrosine kinases (PTKs), which add a phosphoryl group to a tyrosine residue in proteins, the protein tyrosine phosphatases (PTPs), which remove it, are responsible for a variety of cell signaling processes. They are a case of convergent evolution, since one subgroup (the low molecular weight protein tyrosine phosphatases) are not homologous to the classical phosphatases, which can only dephosphorilate tyrosine residues, and the dual-specificity phosphatases, which can also dephosphorilate serine and threonine residues, and also non-proteinaceous substrates. All three sub-families have, in common, the CX5R motif, a characteristic of all PTPs. By applying the statistical coupling analysis to the study of the three sub-families, it was possible to obtain a detailed depiction of their conserved and correlated characteristics, relating them to the accumulated knowledge on protein tyrosine phosphatases and open questions such as protein regulation by dimerization, specificity and disease-related mutations. It was also possible to present a method to distinguish between low molecular weight phosphatases and arsenate reductases, which are derived by the former by divergent evolution. In addition, the technique was applied to the study of hexokinases, superoxide dismutases and peroxidases. The thesis also describe studies developed by the author in the field of protein crystallography the structure determination of human transthyretin in complex with genistein, holo-hexokinase PI from S. cerevisae, the IL-22/IL-22R1 complex and the laminarinase from R. marinus.

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Marin, Talita Miguel. « Mecanismos de ativação da quinase de adesão focal por estimulo mecanico em miocitos cardiacos : importancia da tirosino-fosfatase SHP-2 ». [s.n.], 2006. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/310217.

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Orientador: Kleber Gomes Franchini
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-07T07:19:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_TalitaMiguel_M.pdf: 14587191 bytes, checksum: b8bac41b29ca5081a5bcb225f83e4773 (MD5) Previous issue date: 2006
Resumo: Arrazoado. A Quinase de Adesão Focal (FAK) é ativada e contribui para a regulação da sinalização que determina as alterações fenotípicas de cardiomiócitos estimulados mecanicamente. A regulação da atividade da FAK é complexa e depende de mecanismos intramoleculares e da cooperação com a tirosino-quinase Src. Há evidências de que a tirosino-fosfatase SHP-2 contribui para a regulação do nível de fosforilação em resíduos de tirosina e, portanto da atividade da FAK em miócitos ventriculares de ratos neonatos em cultura (MVRNs). Este estudo objetivou examinar se a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK em MVRNs. Examinamos se em MVRNs controle (i.e. não submetido a estímulo mecânico), a atividade da SHP-2 contribui para o baixo nível de fosforilação em tirosina da FAK e se em MVRNs submetidos a estímulos mecânicos a inibição da atividade da SHP-2 paralela a dissociação FAK/SHP-2 exerce papel permissivo na elevação da fosforilação da FAK. Material e Métodos. Utilizou-se modelo de sobrecarga pressora por coarctação da aorta em ratos (miocárdio-VE) e estiramento in vitro em MVRNs. As abordagens experimentais incluíram técnicas de imunoprecipitação, western blot, imunohistoquímica, atividade de tirosino fosfatase in vitro, expressão de SHP-2 recombinante e avaliação da expressão do gene da cadeia pesada de beta-miosina (ß- miosina). Resultados. A coarctação da aorta (miocárdio-VE) e o estiramento (MVRNs) aumentaram a fosforilação da FAK no resíduo tirosina 397, em miocárdio-VE (200%) e em MVRNs estirados (75%). A FAK imunoprecipitada de amostras controles, encontrou-se associada a SHP-2 e o estímulo mecânico acompanhou-se de redução dessa associação, no miocárdio (60%) e em MVRNs (84%). Experimentos com imunohistoquímica e microscopia confocal demonstraram co-localização da FAK e da SHP-2 em MVRNs controle. Ocorreu redução da atividade de tirosino-fosfatase em imunoprecipitados de anticorpo anti-FAK (25%) e anticorpo anti-SHP-2 (25%) de miocárdio-VE de animais submetidos à coarctação da aorta, e anti-FAK (20%) e anti-SHP-2 (40%) de MVRNs estirados. A SHP-2 recombinante foi capaz de reduzir (70%) in vitro a fosforilação da FAK ativada por estímulo mecânico. Ocorreu aumento (125%) da quantidade de FAK fosforilada em MVRNs controles tratados com TFMS (inibidor seletivo da atividade da SHP-2); naqueles submetidos ao estiramento, o aumento em relação aos MVRNs estirados, mas não tratados com TFMS, foi menor (40%). Ocorreu paralelamente, diminuição (40%) da associação FAK/SHP-2 e aumento da expressão do gene fetal da cadeia pesada da ß - miosina (110%) em MVRNs tratados com TFMS; Os MVRNs tratados concomitantemente com TFMS e PP2 (inibidor farmacológico da FAK), apresentaram atenuação desse aumento (25%). Conclusão. Os dados sugerem que a SHP-2 modula o nível de fosforilação da FAK em MVRNs, exercendo papel inibitório na ativação da FAK, contribuindo para o seu baixo nível de fosforilação em MVRNs e miocárdio na ausência de estímulo mecânico. A diminuição da associação FAK/SHP-2, da atividade específica da SHP-2 em MVRNs ou miocárdio submetidos a estímulos mecânicos e o aumento da fosforilação da FAK mediante tratamento dos MVRNs com TFMS, indicam que a redução da atividade da SHP-2 e da associação a FAK, é um importante mecanismo que colabora para o aumento de fosforilação da FAK em MVRNs submetidos a estímulos mecânicos sustentados. O aumento da expressão da cadeia pesada da ß ¿ miosina conseqüente à inibição da atividade da SHP-2 e a atenuação desse aumento, perante a concomitante inibição da atividade da FAK, corrobora nossa hipótese de que a SHP-2 modula a ativação da FAK em cardiomiócitos, influenciando a reprogramação gênica característica da ativação da sinalização hipertrófica, por estímulo mecânico
Abstract: Mechanical forces drive changes in cardiac myocyte function and structure that occur in response to hemodynamic overload. Focal Adhesion Kinase (FAK) has been implicated in the sensing and transduction of mechanical forces into biochemical events in cardiac myocytes. This study was performed to examine whether the protein tyrosine-phosphatase SHP-2 plays a role in baseline and stretch induced FAK activation and signaling in cultured neonatal rat ventricular myocytes (NRVMs).NRVMs were subjected to cyclic stretch up to 60 min, studied by coimmunoprecipitation, immunoblotting, tyrosine-phosphatase activity assay, RT-PCR, and used in assays utilizing recombinant SHP-2 catalytic domain. Analysis was extended to NRVMs treated with Shp2 inhibitor TFMS and with FAK/Src Inhibitor PP2. FAK had a relatively low basal level of phosphorylation at Tyr397 in non-stretched NRVMs. Cyclic stretch (1HZ, 10%) induced rapid and sustained (up to 60 min) increases in phosphorylation of FAK at Tyr397. The results of coimmunoprecipitation assays indicated that FAK and SHP-2 are associated in non-stretched NRVMs, but cyclic stretch markedly reduced (to 25% and 60% after 10 and 60 min, respectively) the amount of SHP-2 recovered from the anti-FAK antibody precipitates. The tyrosine phosphatase activity of the anti-SHP-2 immunocomplex taken from non-stretched cardiac myocytes was relatively high, but it was markedly reduced (to 60% after 10 and 60 min) in samples of stretched cells. The recombinant PTP domain of SHP-2 was demonstrated to be able to dephosphorylate the native FAK immunoprecipitated from NRVMs. The inhibition of SHP-2 activity by the pharmacological inhibitor TFMS markedly increased FAK phosphorylation at Tyr397 in non-stretched NRVMs to levels comparable to those seen in stretched cells. Treatment with TFMS lasting for 4h was accompanied by a marked increase (to 200) the expression of beta-myosin heavy chain mRNA in non-stretched NRVMs. This effect was attenuated by 25% in NRVMs simultaneous treated with the FAK/Src inhibitor PP2.In conclusion, the present data demonstrated that the basal FAK phosphorylation at Tyr397 is modulated by SHP-2 and that inhibition of SHP-2 during cyclic stretch has a permissive role on FAK activation by mechanical stress. Our results also establish the tight regulation of FAK phosphorylation by SHP-2 as a potential counter-regulatory signaling in the control of the hyperthophic genetic program in cardiac myocytes
Mestrado
Medicina Experimental
Mestre em Fisiopatologia Médica

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Medeiros, Luciana de Campos Leite. « Expressão e caracterização da proteina tirosina fosfatase de soja e analise do perfil kinomico de raizes em germinação ». [s.n.], 2008. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/314329.

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Orientadores: Hiroshi Aoyama, Celso Eduardo Benedetti
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-11T20:43:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Medeiros_LucianadeCamposLeite_D.pdf: 2382438 bytes, checksum: d3106e1ce3acaecc348d589d473d3411 (MD5) Previous issue date: 2008
Resumo: Em nosso laboratório foram purificadas quatro isoformas de fosfatases ácidas, a partir de sementes de soja quiescentes, tendo sido também estudadas suas propriedades cinéticas e físico-químicas. Estudos físicos e estruturais destas enzimas requerem uma grande quantidade da proteína pura, o que exigiria várias purificações convencionais, que, em geral, são bastante trabalhosas. Devido a este fato e a existência de poucas de tais proteínas clonadas e expressas, nos propusemos a clonar e expressar uma proteína tirosina fosfatase (PTP) de soja. O estudo da cinética da PTP recombinante revelou que esta enzima possui características típicas de uma fosfatase e maior especificidade para tirosina-fosfato em relação a outros substratos analisados. Foi feito o estudo de desnaturação térmica da enzima, através de dicroísmo circular, que mostrou que a enzima recombinante apresenta baixa estabilidade térmica. Identificamos por western blot a presença da GmPTP nos diferentes tecidos de soja, germinados tanto no claro como no escuro. Estes resultados, confrontados com os obtidos no PCR quantitativo, mostram uma expressão aumentada do tecido raiz, quando comparada aos outros tecidos avaliados, que está em concordância com o encontrado na literatura, referente à importância fisiológica da enzima neste tecido. Níveis adequados de fósforo são necessários para o crescimento e desenvolvimento de todos os organismos para o bom funcionamento de funções como estrutura molecular, geração de energia e regulação metabólica. A demanda por fósforo e sua conseqüente absorção do solo pelas raízes, aumenta dramaticamente durante o período de rápido crescimento e divisão, por exemplo, na germinação de sementes. Sendo assim, como supridores importantes de fósforo para o metabolismo da planta, podemos citar as fitases e fosfatases, que, além de contribuírem para prover nutrientes, as fosfatases também desempenham papel importante no controle de diferentes funções da planta, particularmente na regulação das cascatas de transdução de sinal. Utilizamos microarranjos de quinases como ferramenta para avaliação do quinoma da raiz nas plântulas de soja germinadas na presença e ausência de luz. Assim, concluímos que fatores ambientais, como a presença de luz e disponibilidade de nutrientes fazem com que diferentes vias estejam ativas e que diferentes fitormônios estejam agindo predominantemente. Relacionando as condições de germinação das plântulas de soja com esses fatores e às quinases mais ativadas no chip, propomos um modelo de sinalização onde o hormônio ácido abscísico responde ao estresse através da ativação de vias como as de MAPKs e de cálcio, causando modulação da atividade de fosfatases e quinases, resultando em respostas como proliferação e rearranjo do citoesqueleto das raízes. Neste trabalho, nós descrevemos a clonagem, expressão de uma de soja, sua caracterização cinética, localização tecidual e investigação da possível relação com a sinalização disparada pela presença ou ausência de luz. A investigação e caracterização de PTPs em plantas podem fornecer informações relevantes no campo de pesquisa do metabolismo vegetal. Sendo assim, nós disponibilizamos dados bioquímicos relevantes os quais sugerem que as plântulas de soja contêm PTP típicas que são principalmente expressas em raízes e aparentemente desempenham papel importante durante a germinação da semente.
Abstract: Our group previously described the purification and characterization of four acid phosphatase isoforms obtained from mature soybean seeds, and determined the kinetic and physico-chemical properties of these enzymes. Structural and physical studies demand high amounts at purity levels of these enzymes, requiring efforts in laborious conventional purifications. Due to this fact and to the existence of few plant proteins that already has been cloned and expressed, we proposed to clone and express a protein tyrosine phosphatase (PTP) from soybean. The kinetic studies of the recombinant PTP revealed an enzyme with phosphatase typical features and higher specificity toward Tyr-phosphate when compared to other analysed substrates. The analysis of thermal inactivation of the enzyme was carried out by circular dichroism, which showed that GmPTP had low thermal stability. The immunolocalization of GmPTP, by western blot, identified the enzyme in different soybean tissues, which were germinated in the presence and absence of light. These results are in agreement with those obtained from the quantitative PCR results, that showed a higher expression of GmPTP in roots when compared with other evaluated tissues. The physiological importance of this tissue to the plant metabolism corroborates our results, because adequate levels of phosphorus are required for the good operation of metabolic functions, as growth and development. The phosphorus demand and the consequent soil absorption through the roots dramatically increase in periods of high growth rate, for instance, during germination. Therefore, phytases and phosphatases are important suppliers for plant metabolism and besides the contribution to provide nutrients, phosphatases could play an important role in regulation of signal transduction cascades. Kinase microarrays were employed as a strong tool to analyse the root kinome in soybean plantlets germinated in light and dark conditions. We concluded that abiotic factors as light presence and nutrients availability were responsible for the activation of different pathways and different phytormones prevalence. Relating the germination conditions of soybean plantlets to these factors and to the analysis of the most activated kinases on the chip, we propose a signaling model to explain that, when the hormone abscisic acid is the main response of stress stimuli, it triggers the activation of MAPK and calcium signaling, and the resulting modulation of kinases and phosphatases activities led to proliferation and cytoskeleton rearrangement in roots. In this work, we described the cloning and expression of a soybean PTP, its kinetic characterization, tissue distribution and investigation of a putative relationship with the signaling pathway triggered by light and dark. The investigation and characterization of PTPs from plants can add relevant information in the plant metabolism research field. Therefore, we provided a wealth biochemical data which suggest that soybean plantlets contain typical PTP, which is mainly expressed in roots and apparently plays a critical role during germination.
Doutorado
Bioquimica
Doutor em Biologia Funcional e Molecular

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Souza, Tatiana Salles de. « Perfil de atividade da proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa e da fosfatase ácida resistente ao tartarato em osteoblastos humanos durante o ciclo e diferenciação celular ». Universidade de São Paulo, 2005. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/25/25142/tde-22062007-145730/.

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O objetivo deste trabalho foi determinar o perfil de atividade enzimática da proteína tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa (PTPBMr) e da fosfatase ácida resistente ao tartarato (TRAP) em osteoblastos humanos durante o ciclo e a diferenciação celular, correlacionando com os níveis de estresse oxidativo intracelulares. A atividade enzimática das fosfatases foi determinada nos períodos de 6, 18, 24, 48 e 72 horas (ciclo celular) e 7, 14, 21, 28 e 35 dias (diferenciação) utilizando o p-nitrofenilfosfato e na presença do inibidor específico phidroximercuribenzoato (pHMB) para a PTP-BMr, e na presença de tartarato e pHMB para a TRAP. A caracterização da diferenciação celular foi determinada medindo o nível de atividade da fosfatase alcalina e a coloração de Von Kossa. O estresse oxidativo foi determinado através da quantificação da glutationa reduzida e oxidada através dos ensaios de cromatografia líquida de alta performance eletroquímica e DTNB. Durante o ciclo celular a atividade específica (AE) da fosfatases foi fortemente diminuída, especificamente da TRAP e PTP-BMr, sendo praticamente zero após 18 horas da adição de soro, sugerindo que a diminuição na atividade destas enzimas seja necessária para a entrada na fase S. Durante a diferenciação celular observou-se um aumento progressivo da expressão de FALC, TRAP e PTP-BMr nos períodos de 7 e 14 dias, sendo máxima no 21o dia, declinando a seguir. Durante a proliferação, os estados mais reduzidos foram observados nos períodos de 18 e 48 horas e durante a diferenciação o estado mais reduzido foi observado no 21o dia. Desta forma, o presente trabalho mostra que as células da linhagem hFOB 1.19 representam um adequado modelo de estudo para análise da participação de fosfatase no ciclo e diferenciação celular, bem como que as atividades da PTP-BMr e TRAP são claramente moduladas durante o ciclo celular e a diferenciação de osteoblastos humanos, esta última dependente de adequado nível de glutationa reduzida.
Low molecular weight protein tyrosine phosphatase (LMW-PTP) and tartrate resistant acid phosphatase (TRAP) activity were determined in hFOB 1.19 human osteoblasts cell line during cell proliferation and differentiation. LMW-PTP and TRAP enzymatic activity were determined at 6, 18, 24, 36, 48 and 72 hours after fetal calf serum stimulation of subconfluent cultures and 7, 14, 21, 28 and 35 days after cell confluence and differentiation. The LMW-PTP and TRAP activity were measured using p-nitrophenylphosphate as substrate. The osteogenic potential of hFOB 1.19 cells was studied by measuring alkaline phosphatase activity, and mineralized nodule formation by Von Kossa staining. The oxitative stress was determined by HPLC and DNTB assays. During cell cycle progression, LMW-PTP and TRAP activities were strongly reduced, being almost undetectable after 18h of serum stimulation, while H3-thymidine incorporation progressively increased, suggesting that the decrease in the LMW-PTP and TRAP activities were necessary for entry into the S phase. During osteoblastic differentiation, the activity of LMW-PTP and alkaline phosphatase progressively increased until the 21th day, decreasing thereafter. In conclusion, this work demonstrates that hFOB 1.19 cells constitute a suitable model system for the study of the role played by LMW-PTP and TRAP in cell cycle progression and cell differentiation, and that LMW-PTP and TRAP activities are clearly modulated during osteoblastic proliferation and differentiation in vitro. The activities of these phosphatases during cell differentiation depended on the correct levels of reduced glutathione.

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Martins, Priscila Graziela Alves. « Caracterização de uma arsenato redutase de Trypanosoma cruzi e inibição de uma fosfotirosina fosfatase de Yersinia enterocolitica por chalconas sintéticas ». reponame:Repositório Institucional da UFSC, 2012. http://repositorio.ufsc.br/xmlui/handle/123456789/95853.

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Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biologicas, Programa de Pós-graduação em Bioquímica, Florianópolis, 2011
Made available in DSpace on 2012-10-26T06:32:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 290250.pdf: 1651252 bytes, checksum: 16dd2b4c210960ba463863c566109f87 (MD5)
Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas. Esta doença afeta de 15 a 16 milhões de pessoas na América Latina e, mesmo após um centenário de sua descoberta, ainda não se conseguiu desenvolver uma vacina e nem tratamentos totalmente eficazes. O presente trabalho apresenta a caracterização de uma arsenato redutase de T. cruzi. Esta enzima, apesar de ter significante homologia com fosfatases de dupla-especificidade, apresenta uma baixa capacidade de defosforilar o substrato p-nitrofenilfosfato. Quando testada em um sistema de oxi-redução, a PTP putativa de T. cruzi é capaz de reduzir o arsenato [As(V)] à arsenito [As(III)] e esta redução requer a presença da enzima glutaredoxina. Este é o primeiro trabalho que descreve uma arsenato redutase de T. cruzi. A fosfotirosina fosfatase YopH é um fator de virulência relevante na patogenicidade das bactérias Yersinia pestis, Y. pseudotuberculosis e Y. enterocolitica. A YopH tem a capacidade de modular a resposta inflamatória à bactéria através de processos que envolvem a quebra de adesões focais, liberação de fator de necrose, inibição da fagocitose, além de também impedir a função dos linfócitos B e T prevenindo a resposta imune adaptativa. Devido à sua importância, a YopH emerge como um potencial alvo terapêutico. Neste trabalho foram analisados 265 compostos sintéticos, dos quais 4 apresentaram valores de IC50 inferiores a 50 µM, sendo eles L46 (38,55 µM), P4 (15,08 µM), P11(9,92 µM) e R28 (20,29 µM). Estes compostos são chalconas e atuam como inibidores competitivos da YopH com Ki de 11,01 µM (L46), 3,13 µM (P4), 2,41 µM (P11) e 14,93 µM (R28).
Trypanosoma cruzi is the etiological agent of Chagas' disease. This illness affects 15 to 16 million people in Latin America and even after a century of its discovery,it has not managed to develop a vaccine and effective treatment. This work presents the characterization of an harsenate reductase from T. cruzi. This enzyme, despite having a significant homology with dual specificity phosphatases, has a low capacity to dephosphorylate the substrate p-nitrophenyl phosphate. When tested in an oxi-reduction system, the putative PTP from T. cruzi is able to reduce arsenate to arsenite and this reduction requires the presence of glutaredoxin. This is the first study that describes an arsenate reductase from T. cruzi. The phosphotyrosine phosphatase YopH is a relevant virulence factor in the pathogenicity of the bacteria Yersinia pestis; Y. pseudotuberculosis and Y. enterocolitica. YopH is able to modulate the inflammatory response to the bacteria through processes that involves the disruption of focal adhesion, release of tumor necrosis factor , inhibition of phagocytosis and also block the fuction of T and B lymphocyte preventing the adaptive immune response. Due to its importance, YopH emerges as a potencial therapeutic target. In this work, it was analysed 265 synthetic compounds, among these 4 presented IC50 values below 50 ìM which are L46 (38.55 ìM), P4 (15.08 ìM), P11(9.92 ìM) and R28 (20.29 ìM). These four compounds are chalcones and act as competitive inhibitors. They present the following Ki values: 11.01 ìM (L46), 3.13 ìM (P4), 2.41 ìM (P11) and 14.93 ìM (R28).

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Picardi, Paty Karoll. « Redução hipotalamica da PTP-1B melhora a sensibilidade a insulina e leptina em ratos normais e obesos ». [s.n.], 2007. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/311232.

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Résumé :

Orientador: Mario Jose Abdalla Saad
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-10T08:45:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Picardi_PatyKaroll_D.pdf: 1259568 bytes, checksum: e2ac94c827fe0b12673c8e88c5f9f7d7 (MD5) Previous issue date: 2007
Resumo: A proteína tirosina fosfatase (PTP1B) tem sido implicada na regulação negativa da sinalização da insulina e leptina. Camundongos knockout para PTP1B são mais sensíveis à insulina e leptina e resistentes à obesidade quando alimentados com uma dieta rica em gordura. Investigamos também a função da PTP1B hipotalâmica na regulação da ingestão alimentar ações da insulina e leptina e sinalização em ratos através de um seletivo decréscimo na expressão da PTP1B. Geramos uma redução seletiva e transiente redução da PTP1B através da infusão de um oligonucleotídeo antisense, para bloquear a expressão da PTPT1B em áreas hipotalâmicas de ratos ao redor do terceiro ventrículo, em ratos-controle e obesos. A diminuição seletiva da PTP1B hipotalâmica resultou em diminuição da ingestão alimentar, redução do peso corporal, da adiposidade, dos níveis de leptina após uma alimentação rica em gordura. Ainda melhorou a ação e sinalização da leptina e insulina no hipotálamo e também a ação da insulina em fígado e músculo. Nossos resultados mostram que a redução da PTPT1B hipotalâmica pode ser suficiente para promover redução apreciável do peso corporal, melhora na sensibilidade e sinalização da insulina e leptina e na homeostase da glicose em ratos DIO
Abstract: Protein tyrosine phosphatase (PTP1B) has been implicated in the negative regulation of insulin and leptin signaling. PTP1B knockout mice are hypersensitive to insulin and leptin and resistant to obesity when fed a high-fat diet. We investigated the role of hypothalamic PTP1B in the regulation of food intake, insulin and leptin actions and signaling in rats through selective decreases in PTP1B expression in discrete hypothalamic nuclei. We generated a selective, transient reduction in PTP1B by infusion of an antisense oligonucleotide designed to blunt the expression of PTP1B in rat hypothalamic areas surrounding the third ventricle, in control and obese rats. The selective decrease in hypothalamic PTP1B resulted in decreased food intake, reduced body weight, reduced adiposity and reduced leptin levels after high-fat feeding, improved leptin and insulin action and signaling in hypothalamus and also in insulin action in liver and muscle. Our results show that hypothalamic PTP1B reduction should be sufficient to promote appreciable weight reduction and improve insulin and leptin sensitivity and signaling and glucose homeostasis in DIO rats
Doutorado
Clinica Medica
Doutor em Clínica Médica

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Arantes, Guilherme Menegon. « Sobre as proteínas tirosina-fosfatases. Reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e simulação computacional dos mecanismos de reação enzimática ». Universidade de São Paulo, 2004. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-12092006-132038/.

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Résumé :

Proteínas tirosina-fosfatases (PTPs) catalisam a hidrólise de fosfotirosina de outras proteínas e, assim, regulam importantes processos bioquímicos. Dois representantes desta família são as fosfatases de dupla especificidade VHR e CDC25B. A primeira etapa de reação catalisada é um ataque nucleofílico da cadeia lateral de uma cisteína sobre o fósforo do substrato, com uma possível transferência de H+ de um ácido geral para o grupo de saída, formando uma PTP intermediária tiofosforilada e desfosforilando o substrato. Dúvidas ainda persistem sobre esta etapa, envolvendo os estados de protonação do substrato e do nucleófilo enzimático, a inatividade de certos mutantes e a identificação do ácido geral nas CDC25s. Procuramos solucionar estas questões por simulações computacionais das reações catalisadas pela VHR e pela CDC25B. Inicialmente, caminhos das reações de tiólise e alcoólise de ésteres de fosfato na fase gasosa foram determinados por cálculos de estrutura eletrônica ab initio e analisados como referências da reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e como modelos da atividade enzimática. Um potencial híbrido de mecânica quântica e mecânica molecular foi amplamente testado e calibrado, empregando estes caminhos de reação e outros dados ab initio. A calibração permitiu que conclusões semiquantitativas pudessem ser obtidas a partir das simulações enzimáticas. Potenciais de força média foram determinados com o potencial híbrido para desfosforilação de diferentes substratos catalisada pelas PTPs selvagens e por suas mutantes. Os resultados mostram que o mecanismo da reação catalisada segue uma adição e eliminação simultânea, com um estado de transição dissociativo com caráter de metafosfato. As barreiras calculadas são bastante próximas às energias de ativação experimentais. O substrato enzimático é um diânion desprotonado e o nucleófilo está ionizado. As reações do substrato ou do nucleófilo protonados apresentam barreiras, no mínimo, 15 kcal/mol mais altas que os valores experimentais. A VHR mutante cisteína para serina no sítio ativo é inativa, porque a serina está protonada. As CDC25s não utilizam um ácido geral para catálise, ao contrário das outras PTPs. Propostas de que o ácido geral poderia ser o próprio substrato ou um dos ácidos glutâmicos presentes no sítio ativo são energeticamente inacessíveis.
Protein tyrosine phosphatases (PTPs) catalyse the hydrolysis of phosphotyrosine from other proteins and, hence, regulate important biochemical processes. Two members from this family are the dual specificity phosphatases VHR and CDC25B. The first step of the catalysed reaction is the nucleophilic attack from the side chain of a cystein towards the substrate, with a possible H+ transfer from a general acid to the leaving group, forming a PTP thiophosphorylated intermediate and dephosphorylating the substrate. There are still some doubts about this step, involving the protonation states of the substrate and the nzymatic nucleophile, the inactivity of certain mutants and the identification of the general acid in CDC25s. We tried to solve this questions by computer simulations of the reactions catalysed by VHR and by CDC25B. Initially, reaction pathways of phosphate esters thiolysis and alcoholysis in the gas-phase were determined by ab initio electronic structure calculations and analysed as benchmarks for the intrinsic reactivity of phosphate esters and as models of the enzymatic activity. A hybrid potential of quantum mechanics and molecular mechanics was fully tested and calibrated, employing these reaction pathways and other ab initio data. The calibration allowed that semiquantitative conclusions could be obtained from the enzymatic simulations. Potentials of mean force were determined with the hybrid potential for the dephosphorylation of different substrates catalysed by the wild-type PTPs and their mutants. The results show that the catalysed reaction mechanism follows a concerted addition and elimination, with a dissociative transition state with metaphosphate-like. The calculated barriers are very close to the experimental activation energies. The enzymatic substrate is a deprotonated dianion and the nucleophile is ionised. The reactions of the protonated substrate or nucleophile have barriers, at least, 15 kcal/mol higher than the experimental results. The active site cystein to serine VHR mutant is inactive because the serine is protonated. The CDC25s do not employ a general acid for catalysis, differently from the other PTPs. Proposals that the general acid is the substrate or one of the glutamic acids present in the active site are not energetically accessible.

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Marin, Talita Miguel. « Efeito do silenciamento da tirosino-fosfatase Shp2 nas alterações fenotípicas dos miócitos cardíacos e efeito da deleção e mutações da Shp2 em corações de camundongos submetidos ao estresse mecânico ». [s.n.], 2010. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/310208.

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Résumé :

Orientador: Kleber Gomes Franchini
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-17T05:12:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marin_TalitaMiguel_D.pdf: 34867811 bytes, checksum: 839d8dbb3d76170bebebbc5e8619b847 (MD5) Previous issue date: 2010
Resumo: Estudos do nosso laboratório demonstraram que a quinase de adesão focal (FAK) é ativada e contribui para a regulação dos mecanismos de sinalização que determinam as alterações fenotípicas de cardiomiócitos submetidos a estímulos mecânicos. Em estudo anterior demonstramos através da inibição farmacológica da Shp2, que a mesma contribui para a regulação do nível de fosforilação em resíduos de tirosina (atividade) da FAK e regulação da expressão de genes associados ao fenótipo hipertrófico em células em cultura. O presente estudo foi realizado para examinar o impacto da depleção da Shp2,induzida por silenciamento gênico, na atividade da FAK e nas alterações fenotípicas de Miócitos Ventriculares de Ratos Neonatos (MVRNs) em condições basais e de estímulo mecânico e os efeitos da introdução de mutações no gene da Shp2, que resultem em perda, ganho ou deleção da proteína, sobre a atividade da FAK e sobre as alterações fenotípicas nos corações de camundongos. A depleção dos níveis protéicos da Shp2 por siRNA específico induziu ao aumento da fosforilação da Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, e S6 quinase Thr389, à re-expressão do gene fetal marcador molecular de hipertrofia cardíaca (?-MHC) e à um fenótipo hipertrófico dos MVRNS não estirados. A inibição da atividade do complexo FAK/Src através do tratamento dos MVRNs com PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine}aboliu o aumento na fosforilação da AKT, TSC2, e S6 quinase, bem como a hipertrofia dos MVRNs induzida pela depleção da Shp2. A inibição da mTOR (mammalian target of rapamycin) com rapamicina bloqueou o surgimentos da hipertrofia nos MNRNs tratados com siShp2. Os MVRNs tratados com PP2 ou com RNA de interferência, específico para a FAK, apresentaram-se deficientes na ativação e aumento da fosforilação da FAK, Src, ERK (extracellular signal-regulated kinase), AKT, TSC2, e S6 quiinase, e na indução de aumento da área celular em resposta ao estimulo mecânico de estiramento cíclico prolongado in vitro. A Hipertrofia em resposta ao estiramento prolongado também foi prevenida pelo tratamento dos MVRNs com rapamicina. Os resultados são consistentes em apontar que a perda ou diminuição da função da Shp2 (por depleção, mutação ou deleção gênica cardíaco-específica) induz ao aumento da ativação da FAK, AKT e via da mTOR/S6K , que são vias de sinalização sabidamente envolvidas nos processos hipertróficos do miocárdio. Interessantemente os animais portadores de mutação LS-Shp2 apresentaram redução de 50% da atividade fosfatase relacionada ao imunoprecipitado de Shp2 no miocárdio, recapitularam a desordem humana apresentando baixa estatura, dismorfia craniofacial, evidências morfológica, histopatológica, ecocardiográficas e molelculares de presença de cardiomiopatia hipertrófica. Notavelmente o tratamento desses animais com o inibidor específico da mTOR, rapamicina, foi capaz de reverter completamente o fenótipo hipertrófico dos animais LS-Shp2. Consistentemente, o ganho de função da Shp2 (no miocárdio), induzido por mutação NS (Noonan Syndrome), foi acompanhado de diminuição da atividade basal da FAK, bem como da AKT e de proteínas envolvidas na via da mTOR e de redução da área total e largura dos cardiomiócitos adultos quando comparados aos extraídos de animais selvagens. Em conjunto, os dados, aqui apresentados, indicam que a tirosino-fosfatase Shp2 contribui para regular o nível de fosforilação da FAK em cardiomiócitos e para a regulação da expressão de gêneses do programa hipertrófico e do tamanho celular através da modulação da atividade da FAK e mTOR. Sugere também, que a inibição prolongada de Shp2 pode, por si só, induzir ao aparecimento de hipertrofia cardíaca através da FAK pela modulação da via mTOR/S6K
Abstract: Focal Adhesion Kinase (FAK) has been implicated in the sensing and transduction of mechanical forces, which drive changes in cardiac myocyte function and structure, in response to hemodynamic overload, into biochemical events in cardiac myocytes. This study was performed to examine whether Shp2 (Src homology region 2, phosphatase 2) controls Focal Adhesion Kinase (FAK) activity and its trophic actions in cardiomyocytes. Our study was performed in neonatal rat ventricular myocytes subjected to depletion of Shp2 by RNA interference and genetically modified mice carrying mutations that induce gain and loss of function and Shp2 cardiac-specific conditional gene deletion.Depletion of Shp2 by specific small interfering RNA increased the phosphorylation of FAK Tyr397, Src Tyr418, AKT Ser473, TSC2 Thr1462, and S6 kinase Thr389 and induced hypertrophic gene expression pattern (?- MHC) and phenotype of nonstretched NRVMs. Inhibition of FAK/Src activity by PP2 {4-amino-5-(4-chlorophenyl)-7- (t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimidine} abolished the phosphorylation of AKT, TSC2, and S6 kinase, as well as the hypertrophy of NRVMs induced by Shp2 depletion. Inhibition of mTOR (mammalian target of rapamycin) with rapamycin blunted the hypertrophy in NRVMs depleted of Shp2. NRVMs treated with PP2 or depleted of FAK by specific small interfering RNA were defective in FAK, Src, extracellular signal-regulated kinase, AKT, TSC2, and S6 kinase phosphorylation, as well as in the hypertrophic response to prolonged stretch. The stretch-induced hypertrophy of NRVMs was also prevented by rapamycin. Subsequently we tested the hypothesis that the introduction of mutations in the Shp2 gene, causing protein deletion or loss of protein function, would contribute to increase the levels of tyrosine phosphorylation of FAK resulting in a hypertrophic phenotype in mice hearts. Likewise, we investigated the possibility that the introduction of a mutation in the Shp2 gene, which leads to gain of function, would result in decrease phosphorylation of FAK. The results were consistent in pointing out that the loss of protein or impairment of the function of Shp2 (gene deletion, depletion or mutation) induces increased activation of FAK, AKT and a the mTOR/S6K pathways, which are signaling pathways known to be involved in controlling cardiac growth and hypertrophy. Ls-Shp2 mice recapitulated the human disorder, with short stature, craniofacial dysmorphia, and morphological, histological, echocardiographic and molecular evidence of hypertrophic cardiomyopathy (HCM). Heart and/or cardiomyocyte lysates from LS-Shp2 mice showed decreased Shp2 catalytic activity, consistent with previous reports that LS mutants have dominant negative effects. Remarkably, the cardiac hypertropic phenotype in LS-Shp2 mice were completely reversed by treatment with the mTOR inhibitor, rapamycin. Consistently, the gain of function of Shp2 (induced by mutation) was accompanied by decreased basal activity of FAK and AKT and proteins involved in the mTOR signaling pathway. These findings demonstrate that basal Shp2 tyrosine phosphatase activity controls the size of cardiomyocytes by downregulating a pathway that involves FAK/Src and mTOR signaling pathways. Our results also establish the tight regulation of FAK phosphorylation by Shp-2 as a potential counter-regulatory signaling in the control of the hyperthophic genetic program in cardiac myocytes
Doutorado
Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento
Doutor em Fisiopatologia Medica

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Zonta, Francesca. « Ruolo anti-apoptotico della tirosin-chinasi Lyn nella leucemia linfatica cronica a cellule B ». Doctoral thesis, Università degli studi di Padova, 2015. http://hdl.handle.net/11577/3424269.

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Résumé :

B-chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the commonest leukemia in the Western world and is characterized by the clonal expansion of small CD5+ B lymphocytes in the pheripheral blood, bone marrow and lymphoid organs, due to defective apoptosis. One of the crucial factors for the survival of B-CLL cells is the anomalous activity of a few enzymes such as the lipide kinase PI3K, the Ser/Thr kinase PKC and the tyrosine-kinases Syk and Lyn. My research focus was Src family kinase Lyn, which is overexpressed, constitutively active and delocalized in the cytosol within an aberrant multiprotein complex, in association with the molecular chaperone Hsp90, which in turn accounts for the high level of tyrosine-phosphorylation, ultimately contributing to the cancer phenotype of B-CLL cells. The aim of my PhD work was to identify Lyn’s cytosolic substrates potentially involved in the apoptosis resistance mechanisms observed in leukemia cells. Using biochemical and biomolecular methods as well as a bioinformatics approach, two potential substrates of Lyn were identified, namely the cysteine protease caspase-8 and the protein phosphatase-2A (PP2A). Firstly, we established that in B-CLL, the inactive zymogen of caspase-8, procaspase-8, is phosphorylated at Tyr380 by the cytosolic pool of Lyn, which brings about its inhibition and its structural rearrangements in a dymeric cytosolic form. The phosphorylation of Tyr380 of caspase-8 is abolished by the use of both the Lyn inhibitor dasatinib and the Hsp90 inhibitor geldanamycin, the latter of which also leads to the disassembly of the aberrant cytosolic complex and the drop in the Lyn’s cytosolic activity, resulting in the caspase-dependent apoptosis. Secondly, we verified that Lyn negatively affects the activity of one of the key factors in the modulation of cell survival signals, PP2A. Phosphorylation of the catalytic subunit of PP2A at Tyr307 causes inhibition of the phosphatase activity not only per se but also strengthening the interaction of PP2A with its cellular inhibitor SET, which is also overexpressed in B-CLL cells. As a result, PP2A is stably preserved in an inhibited form, which contributes to the persistence of prosurvival signals, in particular those mediated by the serine/threonine kinase Akt. Moreover, to identify new compounds able to activate PP2A in order to contrast survival signals in B-CLL, we tested fingolimod (FTY720), which is already known as a PP2A activator, currently in use in the treatment of multiple sclerosis and recently emerging as a pro-apoptotic factor in different types of cancer cells. Notably, the mechanism of action consists in the ability of fingolimod to bind to SET and hence remove this cellular inhibitor of PP2A from its catalytic subunit. Since this drug is used as an immunosuppressive agent, by virtue of its provoking the degradation of the sphingosine-1-phosphate receptor, and shows cardiovascular side effects, it might prove unsuitable in a more complex therapeutic strategy. Therefore, fingolimod structural analogues which could not interfere with the sphingosine receptors, but could still destabilize the PP2A/SET complex were designed and synthesized. One of these compounds, MP07-66, showed an effectiveness similar to fingolimod, as to both the ability to disrupting the PP2A/SET complex and inhibit the protein kinase Akt, this latter being vital in preserving the survival signals. This compound also was able to induce apoptosis in leukemia cells, which effect was further enhanced by the combination with dasatinib by a synergistic mechanism, further confirming the role of phosphorylation in the stability of PP2A/SET. In conclusion, this work identifies PP2A and Caspase 8 as substrates of the cytosolic aberrant activity of Lyn, confirming the key role of this tyrosine kinase in supporting multiple anti-apoptotic signals in the B-CLL. The molecular mechanisms of apoptosis resistance here identified may be potential targets in the development of new therapies for clinical use.
La leucemia linfatica cronica a cellule B (LLC-B) è la forma più comune di leucemia nell’adulto ed è caratterizzata dall’accumulo di piccoli linfociti B CD5+ nel sangue periferico, nel midollo osseo e negli organi linfatici, dovuto sia a un aumento della proliferazione, che a un difetto dei meccanismi di morte cellulare programmata. Tra i fattori che contribuiscono alla sopravvivenza del linfocita neoplastico un ruolo fondamentale svolge l’attività anomala di diversi enzimi con attività fosfotransferasica che modulano le principali vie di segnalazione intracellulare, tra cui la lipide chinasi PI3K, la serina/treonina chinasi PKC, e le tirosin-chinasi Syk e Lyn. L’attività di ricerca svolta durante il mio dottorato si è concentrata sulla Src chinasi Lyn, la quale in questa patologia risulta sovra-espressa, iperattiva e delocalizzata nel citosol come componente di un complesso multiproteico aberrante. All’interno di questo complesso, Lyn è associata al chaperone molecolare Hsp90, il quale la preserva in conformazione attiva, così contribuendo all’elevata tirosin-fosforilazione basale tipica della LLC-B. Lo scopo della mia indagine è stato identificare le molecole substrato dell’anomala attività di Lyn, potenzialmente coinvolte nei fenomeni di resistenza all’apoptosi dei cloni leucemici. Grazie all’applicazione di metodi biochimici e biomolecolari, nonché a un approccio bioinformatico, abbiamo identificato due substrati proteici di Lyn, la proteasi caspasi 8 e la proteina fosfatasi 2A (PP2A). In primo luogo, abbiamo dimostrato che nelle cellule B di LLC, la procaspasi 8, zimogeno della caspasi 8, è fosforilata in Tyr380 ad opera di Lyn citosolico; tale fosforilazione comporta non solo l’inibizione dell’attività caspasica ma anche il riarrangiamento strutturale della proteasi stessa, che nei cloni leucemici localizza nel citosol in forma dimerica. Tale inibizione viene rimossa usando sia inibitori di Lyn, come il dasatinib, sia inibitori di Hsp90, come geldanamicina, quest’ultimo provocando la rottura del complesso citosolico e quindi il calo dell’attività di Lyn e in ultima analisi attivando le vie apoptotiche estrinseca ed intrinseca. In secondo luogo, abbiamo verificato che Lyn esercita un controllo negativo su uno dei fattori chiave della modulazione dei segnali che regolano la sopravvivenza cellulare, la serina/treonina fosfatasi PP2A. I nostri dati indicano l’esistenza di un meccanismo d’inibizione dell’attività fosfatasica di PP2A, che dipende sia dalla fosforilazione come tale in Tyr307 della subunità catalitica, ma anche dalla stabilizzazione dell’interazione della fosfatasi con il suo inibitore proteico cellulare SET, il quale è anch’esso sovra-espresso nelle cellule di LLC-B. La formazione di questo complesso stabile mantiene la fosfatasi in uno stato inattivo contribuendo quindi alla persistenza dei segnali di sopravvivenza mediati in particolar modo dalla serina/treonina chinasi Akt. Inoltre, allo scopo di individuare nuove molecole in grado di riattivare PP2A e quindi utili a contrastare i segnali di sopravvivenza delle cellule leucemiche, abbiamo verificato l’utilità di un noto attivatore di PP2A, il fingolimod (FTY720), già impiegato nella sclerosi multipla e ultimamente rivelatosi efficace nel causare la morte cellulare in vari tipi di modelli di neoplasia. Il meccanismo di azione risiede nella capacità di rimuovere l’inibitore SET dalla subunità catalitica di PP2A. Questo composto, tuttavia, possedendo attività immunosoppressiva a causa dell’induzione della degradazione del recettore della sfingosina ma anche effetti collaterali a carico del sistema cardio-vascolare, può rivelarsi inadeguato nell’ottica di una più complessa strategia terapeutica in campo oncologico. Quindi sono stati sviluppati degli analoghi strutturali che non interferissero con il recettore della sfingosina ma destabilizzassero il complesso della PP2A fosforilata e SET. In questo modo è stato identificato un composto (MP07-66), con un’efficacia sovrapponibile al fingolimod sia nel disgregare il complesso che nell’inibire la protein chinasi Akt, fondamentale nel preservare i segnali di sopravvivenza. Inoltre tale composto era in grado di indurre apoptosi su cellule leucemiche, il quale effetto veniva incentivato dalla presenza di dasatinib con meccanismo sinergico, ulteriormente confermando il ruolo della fosforilazione nella stabilità del complesso PP2A/SET. In conclusione, questo lavoro identifica PP2A e caspasi 8 quali substrati dell’attività citosolica aberrante di Lyn, confermando il ruolo chiave di questa chinasi nel supportare i molteplici segnali anti-apoptotici presenti nella LLC-B. I meccanismi molecolari di resistenza all’apoptosi qui identificati possono costituire dei potenziali bersagli per lo sviluppo di nuove terapie ad uso clinico.

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Granjeiro, Jose Mauro. « Estudo do efeito da serie homologa de surfatantes anionicos e cationicos e de compostos purinicos na atividade da proteina tirosina fosfatase de baixa massa molecular relativa do rim bovino ». [s.n.], 1998. http://repositorio.unicamp.br/jspui/handle/REPOSIP/249114.

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Orientador: Pedro Luis Onofrio Volpe
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Quimica
Made available in DSpace on 2018-07-23T14:30:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Granjeiro_JoseMauro_D.pdf: 4816887 bytes, checksum: 0c6babce668c64888f2439a267c14a09 (MD5) Previous issue date: 1998
Doutorado

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Novo, Debora Teixeira de Oliveira Mainardi. « Estudo da região promotora do gene da interleucina (IL-21) e do poliformismo do gene tirosina fosfatase, tipo não receptor 22 (PTPN22) : associação com auto-anticorpos em pacientes portadores de diabetes mellitos tipo 1A ». Universidade de São Paulo, 2011. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5135/tde-01122011-101804/.

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As citocinas têm papel importante como mediadores através das respostas imunológicas. A Interleucina-21, importante regulador dos linfócitos T e B, é produzida por linfócitos CD4 ativados, e está implicada na patogênese do diabetes autoimune em modelo animal, o NOD. A região promotora da IL-21, que contempla sítios de controle da expressão gênica em camundongos, o NFATc2, T-bet e c-MAF, foi estudada pela primeira vez em humanos portadores de diabetes tipo 1A, neste trabalho. Foi analisado também a freqüência do polimorfismo C1858T do gene PTPN22, que tem sido associado em estudos recentes como fator de risco importante para diabetes tipo1A e outras doenças autoimunes. Associou-se ainda, autoanticorpos pancreáticos e não-pancreáticos em diabéticos e grupo controle normal, e estes resultados foram analisados com ambos os genes. Foram estudados 612 DM1A e 792 indivíduos do grupo controle. Após extração de DNA genômico, a região 5proximal da região promotora do gene da Il-21, -448+83pb, foi seqüenciada em 309 brasileiros diabéticos tipo 1A e 189 indivíduos do grupo controle. A genotipagem do polimorfismo C1858T do gene PTPN22, por RFLP, foi realizada em 434 diabéticos e 689 controles, bem como os alelos HLA-DRB1. Foi encontrada uma variação alélica, em heterozigoze, na posição g.-241 T>A, em apenas uma paciente, que apresentou idade de diagnóstico aos 30 anos de idade. Esta variante alélica não foi encontrada nos 497 indivíduos (308 DM1A e 189 grupo controle). A freqüência dos alelos polimórficos (CT/TT) foi maior nos diabéticos (18.7%) que no grupo controle (10.6%), OR 1,94 e p<0,001. O polimorfismo C1858T do gene PTPN22 associou-se à maior freqüência dos autoanticorpos pancreático anti-GAD65 (p=0,002) e não-pancreático anti-TG (p=0,001), quando avaliados os dois grupos juntos, DM1A e grupo controle. Os diabéticos apresentaram maior freüência dos autoanticorpos como segue: autoanticorpos pancreáticos: anti-GAD65: 225 /482 (46.7%) vs 13/786 (1.7%), p<0.001; anti-IA2 : 204/469 (43.5%) vs 15/786 (1.9%), p<0.001. Autoanticorpos não-pancreáticos: FAN: 60/234 (25.6%) vs 13/239 (5.4%), p<0.001; anti-TPO: 64/279 (22.9%) vs 34/495 (6.9%), p<0.001; anti-TG : 65/278 (23.4%) vs 44/489 (9%), p<0.001; TRAb: 14/187 (7.5%) vs 1/327 (0.3%), p<0.001; anti-21-OH : 8/154 (5,2%) vs 1/160 (0,6%), p< 0,001. Os autoanticorpos a seguir foram realizados apenas nos pacientes diabéticos: anti-tTG 5/73% (6.8%), anti-Endom 10/176 (5.7%). Com exceção do anti-GAD65 e anti-TG, nenhum outro autoanticorpo associou-se ao polimorfismo do gene PTPN22. Os alelos HLA-DR3/DR$ predominaram nos diabéticos (p<0,001). Concluimos então que o polimorfismo C1858T do gene PTPN22 e os alelos HLA-DR3/DR4 estão associados ao risco de DM1A. Variantes alélicas na região 5 proximal do gene da IL-21 parece não ser predisponente à suscetibilidade ao DM1A e outras doenças autoimunes. Autoanticorpos órgão-específicos são mais freqüentes em diabéticos, principalmente nas glândulas adrenal e tireóide. O polimorfismo C1858T do gene PTPN22 está associado à maior freqüência dos autoanticorpos anti-GAD65 e antitireoglobulina
Objective: Cytokines are central mediators of inflammation through innate and adaptive immune responses. IL-21, a critical regulator of T and B cell function, is produced by various subsets of CD4+ T cells, and it has been implicated in the pathogenesis of non obese diabetes mouse. The proximal promoter of IL-21, which controls its Th-cell-subset-specific expression through the action of NFATc2, T-bet and c-MAF in animal models, was evaluated in type 1A diabetes (T1AD) patients for the first time. This study also analyzed the 1858T PTPN22 polymorphism, which has recently emerged as an important risk factor for T1AD and other autoimmune diseases. Moreover, islet and other organ-specific autoantibodies were quantified in T1AD patients and healthy controls and the results were correlated with both genes. Research design and methods: The case series comprised 612 T1AD patients and 792 healthy control (HC) individuals. Genomic DNA extraction was performed by salting-out in purified blood leukocytes. The region encompassing -448+83 bp of IL-21 gene was amplified and sequenced using genomic DNA from 309 Brazilian T1AD patients and 189 control individuals. RFLP genotyping of C1858T PTPN22 was performed in 689 controls and 434 T1D patients. HLA DR3/DR4 alleles were also evaluated. Results: A heterozygous allelic variant (g.-241 T>A) was found in only one patient, who was 30 years old at the onset of disease. This allelic variant was not found in 497 individuals (308 T1AD patients and 189 healthy controls). The PTPN22 1858T allele frequency was greater in patients (18.7%) than in controls (10.6%): odds ratio of 1.94; p<0.001. An association was found between C1858T polymorphism and higher frequency of GAD65 Ab (p=0.002) and TG Ab (p=0.011), among both T1AD and HC. Type 1 diabetes patients presented higher frequency of the following autoantibodies, compared with HC (p<0.001): GAD65 Ab (46.7% vs 1.7%); IA2 Ab (43.5% vs 1.9%); ANA (25.6% vs 5.4%); TPO Ab (22.9% vs 6.9%); TG Ab (23.4% vs 9.0%); TRAb (7.5% vs 0.3%); 21-OH Ab (5,2% vs 0,6%). The following antibodies were evaluated only in T1AD: tTG Ab (6.8%) anti-Endom (5.7%). Except by GAD65 Ab and TG Ab, no association was found between C1858T polymorphism and these autoantibodies.HLA-DR3/DR4 alleles predominated in T1D patients (p<0.001) Conclusions: C1858T PTPN22 polymorphism and the HLA-DR3 and/or DR4 alleles were associated with proneness to T1AD. Allelic variants at the 5\' proximal region of the IL-21 gene do not seem to predispose to susceptibility to T1AD and other autoimmune endocrine diseases. Autoantibodies specific to other organs and tissues are frequent in T1AD carriers, mainly to the thyroid glands. The 1858T PTPN22 polymorphism was associated with higher frequency of GAD65A and TGA.

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Colli, Máikel Luís. « Papel do PTPN2 e MDA5, dois genes candidatos para diabete melito tipo 1, nas respostas das células beta pancreáticas a citocinas pró-‐inflamatórias e ao RNA de fita dupla intracelular ». reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, 2010. http://hdl.handle.net/10183/26121.

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Na patogênese do diabete melito tipo 1 (DM1) vários genes e fatores ambientais, como as infecções virais, interagem para iniciar um ataque autoimune contra as células beta pancreáticas. Durante a fase inicial desse processo, as células beta desempenham um papel importante através da promoção de um “diálogo” com o sistema imune. Recentemente, o uso de técnicas de genotipagem em larga escala proporcionou um aumento significativo no número de genes conhecidos potencialmente associados ao desenvolvimento do DM1. Para compreender como esses novos genes candidatos modificam as respostas das células beta pancreáticas a mediadores inflamatórios e aos vírus, nós analisamos os dados de estudos prévios de array e um banco de dados online (www.t1dbase.org) para identificar os genes expressos nas células beta e modificados por citocinas ou pelo subproduto da replicação viral, RNA de fita dupla (RNAfd). Dois genes foram selecionados para serem estudados nesta tese, PTPN2 e MDA5. PTPN2 é uma proteína tirosina fosfatase que tem entre os seus alvos o STAT1, um fator de transcrição chave no processo de morte das células beta. Inicialmente, confirmamos a presença de PTPN2 pela quantificação do seu RNAm e produto protéico em uma linhagem de células beta (INS-1E), células beta primárias de rato purificadas por FACS e ilhotas humanas. Tratamento com citocinas ou RNAfd intracelular significativamente aumentou a sua expressão. O knockdown específico deste gene pela técnica de RNA de interferência aumentou significativamente a apoptose das células beta expostas a uma combinação de citocinas (interleucina-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) ou RNAfd intracelular, e converteu IFN-" isoladamente em um estímulo pró-apoptótico. O silenciamento do PTPN2 amplificou a fosforilação do STAT1. O duplo knockdown, PTPN2 + STAT1, protegeu as células beta contra a apoptose induzida por citocinas, sugerindo que PTPN2 age como um regulador negativo dos efeitos pró-apoptóticos do STAT1. Contudo, o silenciamento do PTPN2 não produziu nenhuma alteração maior na expressão de citocinas e quimiocinas. O segundo gene candidato, MDA5, é uma helicase associada com o reconhecimento de ácidos nucléicos virais intracelulares. A principal função do MDA5 é a detecção de infecções virais; sendo assim, esse gene foi avaliado apenas no contexto do mimético viral RNAfd. A transfecção de células INS-1E e células beta primárias de rato purificadas por FACS com RNAfd induziu um aumento significativo no RNAm codificando MDA5. O silenciamento do MDA5 e do RIG-I (outra helicase envolvida no reconhecimento do RNAfd intracelular) não modificou a frequência da apoptose induziu por RNAfd. Por outro lado, o knockdown do MDA5, mas não do RIG-I, significativamente reduziu a expressão de várias citocinas/quimiocinas produzidas pelas células beta expostas ao RNAfd intracelular. Concluindo, os dados apresentados sugerem que esses dois genes candidatos, através de suas funções nas células beta, podem ter importantes papéis no desenvolvimento do DM1. PTPN2 aparentemente previne a apoptose das células beta controlando a ativação do STAT1, enquanto MDA5 pode regular o ataque imune local através da diminuição no recrutamento e ativação das células do sistema imune.
In type 1 diabetes (T1D) several genes and environmental factors, such as viral infections, interact to trigger a chronic autoimmune assault against the insulin-producing pancreatic beta cells. During this process beta cells have an important role in maintenance/amplification of this autoimmune response via a cross-talk with the immune system. In recent years the development of high-throughput techniques for searching new genetic variants significantly increased the number of known genes potentially contributing for T1D. To clarify how these new candidate genes modify pancreatic beta responses to proinflammatory mediators and viruses, we used data from our previous array studies and an online beta cell database (www.t1dbase.org) to select candidate genes that are expressed in beta cells and modified by cytokines or the viral by-product double-stranded RNA (dsRNA). Two genes were identified, PTPN2 and MDA5, and further studied in this thesis. PTPN2 is a protein tyrosine phosphatase with several targets including STAT1, a key transcription factor involved in beta cell death. We confirmed at mRNA and protein levels the expression of PTPN2 in a beta cell linage (INS-1E), primary FACS-purified rat beta cells and human islets. Exposure to cytokines or to intracellular dsRNA increased PTPN2 expression. Knockdown of PTPN2, by using specific small interference (si)RNAs, exacerbated beta cell apoptosis after treatment with a combination of cytokines (interleukin-1! (IL-1!) + interferon-" (IFN-")) or intracellular dsRNA, and converted IFN-" alone in a pro-apoptotic stimulus. Importantly, PTPN2 silencing amplified STAT1 phosphorylation. The double knockdown of PTPN2 and STAT1 protected beta cells against cytokine-induced apoptosis, suggesting that PTPN2 acts as a negative regulator of the pro-apoptotic transcription factor STAT1. Knocking-down PTPN2, however, did not affect to any major extent the expression of cytokines and chemokines. The second candidate gene, MDA5, is an helicase involved in recognition of intracellular viral nucleic acids. Since MDA5 works as a receptor for detection of viral infection, this gene was only evaluated in the context of the viral mimetic dsRNA. Transfection of INS-1E cells and FACSpurified rat beta cells with dsRNA significantly upregulated the mRNA expression of MDA5. The silencing of MDA5 and RIG-I (another helicase involved in recognition of intracellular dsRNA) did not modify dsRNA-induced apoptosis. On the other hand, the knockdown of MDA5, but not of RIG-I, decreased the expression of several cytokines/chemokines in beta cells exposed to intracellular dsRNA. In conclusion, our data suggest that these two candidate genes may have important roles in the development of T1D via their actions at the beta cell level. PTPN2 seems to prevent beta cells apoptosis by controlling STAT1 activation, while MDA5 might regulate the local autoimmune assault via decreasing recruitment and activation of immune cells.

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Bertola, Débora Romeo. « Estudo do gene PTPN11 nos pacientes afetados pela síndrome de Noonan ». Universidade de São Paulo, 2006. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5141/tde-12042006-110700/.

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INTRODUÇÃO: A síndrome de Noonan é uma doença autossômica dominante caracterizada por baixa estatura, dismorfismos faciais (hipertelorismo ocular, inclinação para baixo das fendas palpebrais, ptose palpebral, palato alto e má-oclusão dentária), pescoço curto e/ou alado, defeitos cardíacos, principalmente a estenose pulmonar valvar, deformidade esternal e criptorquia nos pacientes do sexo masculino. O gene PTPN11, localizado no braço longo do cromossomo 12 (12q24.1), é responsável por aproximadamente 50% dos casos de síndrome de Noonan. OBJETIVO: Detectar a freqüência de mutações no gene PTPN11 em uma amostra de pacientes os quais preenchiam os critérios clínicos para a síndrome de Noonan e síndromes Noonan-like e estabelecer uma correlação genótipo-fenótipo. MÉTODOS: Cinqüenta probandos com síndrome de Noonan, 3 com síndrome de LEOPARD, 3 com síndrome de Noonan-like/lesões múltiplas de células gigantes e 2 com neurofibromatose-Noonan foram incluídos nesse estudo. O estudo molecular foi realizado através da técnica da cromatografia líquida de alta precisão desnaturante e, naqueles com um perfil anormal, a técnica do seqüenciamento do éxon em questão foi concretizada. RESULTADOS: Mutações missense no gene PTPN11 foram identificadas em 21 probandos com síndrome de Noonan (42%), em todos os três pacientes com a síndrome de LEOPARD, em um caso com síndrome de Noonan-like/lesões múltiplas de células gigantes e em um paciente com síndrome da neurofibromatose-Noonan. Este último probando também apresentava uma mutação no gene NF1. A única anomalia que atingiu uma diferença estatisticamente significante quando comparados os grupos de pacientes com e sem mutação foi o grupo de distúrbios hematológicos. Um paciente com síndrome de Noonan que apresentou uma doença mieloproliferativa possuía a mutação T73I. CONCLUSÃO: A síndrome de Noonan é uma doença heterogênea, uma vez que mutações no gene PTPN11 são responsáveis por 42% dos casos. Uma correlação genótipo-fenótipo definitiva não foi estabelecida, mas a mutação T73I parece predispor a distúrbios mieloproliferativos. Com relação às síndromes Noonan-like, o gene PTPN11 é o principal responsável pela síndrome de LEOPARD e também desempenha um papel na síndrome da neurofibromatose-Noonan. A síndrome de Noonan-like/lesões múltiplas de células gigantes, a qual faz parte do espectro da síndrome de Noonan, é também uma doença heterogênea.
INTRODUCTION: Noonan syndrome is an autosomal dominant disorder comprising short stature, facial dysmorphisms (ocular hypertelorism, downslanting palpebral fissures, palpebral ptosis, high arched palate and dental malocclusion), short and/or webbed neck, heart defects, mainly valvar pulmonary stenosis, sternal deformity and cryptorchidism in males. The PTPN11 gene, localized in the long arm of chromosome 12 (12q24.1), is responsible for approximately 50% of the cases. OBJECTIVE: To detect the PTPN11 gene mutation rate in a cohort of clinically well-characterized patients with Noonan and Noonan-like syndromes and to study the genotype-phenotype correlation. METHODS: Fifty probands with Noonan syndrome ascertained according to well-established diagnostic criteria, 3 with LEOPARD syndrome, 3 with Noonan-like/multiple giant cell lesion syndrome and 2 with neurofibromatosis/Noonan were enrolled in this study. Mutational analysis was performed using denaturing high-performance liquid chromatography followed by sequencing of amplicons with an aberrant elution profile. RESULTS: Missense mutations in the PTPN11 gene were identified in 21 probands with Noonan syndrome (42%), in all three patients with LEOPARD syndrome, in one case with Noonan-like/multiple giant cell lesion syndrome and in one with neurofibromatosis-Noonan syndrome. This last patient also showed a NF1 gene mutation. The only anomaly that reached statistical significance when comparing probands with and without mutations was the hematological abnormalities. A Noonan syndrome patient presenting a myeloproliferative disorder showed a T73I mutation. CONCLUSION: Noonan syndrome is a heterogeneous disorder, once PTPN11 gene mutations is responsible for 42% of the cases. A definitive genotype-phenotype correlation is not established, but the T73I mutation seems to predispose to a myeloproliferative disorder. Regarding Noonan-like syndromes, the PTPN11 gene is the main one in LEOPARD syndrome and also plays a role in neurofibromatosis-Noonan syndrome. Noonan-like/multiple giant cell lesion syndrome, part of the spectrum of Noonan syndrome, is also heterogeneous.

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Ferreira, Lize Vargas. « "Estudo do gene PTPN11 em pacientes com a síndrome de Noonan e crianças com baixa estatura idiopática" ». Universidade de São Paulo, 2005. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5135/tde-02092005-100524/.

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A síndrome de Noonan (SN), caracterizada por baixa estatura, aspectos dismórficos e cardiopatia congênita, foi associada ao gene PTPN11. Estudamos o PTPN11 em pacientes com SN, pais de portadores de mutação e crianças com baixa estatura idiopática (BEI) que apresentam estigmas sugestivos da SN, sem critérios suficientes para o diagnóstico. Encontramos mutações missense em heterozigoze no PTPN11 em 42,3% dos pacientes com SN. Não identificamos alterações nos pais de portadores de mutação no PTPN11 com fenótipo normal tampouco em crianças com BEI. A única diferença estatisticamente significante entre os grupos com e sem mutação foi a resposta em longo prazo ao hGH, melhor no grupo sem mutação
Noonan syndrome (NS), characterized by short stature, dysmorphic facial and thoracic features and congenital heart disease, was associated to PTPN11 gene. We studied the PTPN11 in patients with NS, parents of mutation-positive NS patients and idiopathic short stature children with signs related to NS without fulfilling the diagnostic criteria. We found missense mutations in 42.3% of the NS group. Parents of NS mutation-positive patients did not present mutations, nor did children with short stature. The only statistically significant difference between groups with and without mutations was response to long term use of hGH, better on the mutation-negative group

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Krempel, Paloma Gava. « Análise imunocitoquímica e de expressão gênica de efeitos do bevacizumabe em explantes de retina de ratos lister e em linhagem celular de glia de Müller humana ». Universidade de São Paulo, 2015. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/5/5149/tde-24082015-093845/.

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INTRODUÇÃO: As doenças retinianas associadas à neovascularização, tais como a degeneração macular relacionada à idade e as retinopatias diabética e da prematuridade são as principais e mais importantes causas da cegueira em todo o mundo. Nos últimos anos, injeções intravítreas de fármacos com ação antiangiogênica, como o bevacizumabe (BVZ), têm sido de grande valia tanto em pacientes na fase adulta quanto nos recém-natos. Todavia, estudos experimentais in vitro e in vivo sugerem que essas drogas promovam efeitos adversos sobre alguns processos celulares, interferindo diretamente em mecanismos fisiológicos que mantém a homeostase do tecido retiniano, incluindo os mecanismos de proliferação, diferenciação e morte celular. OBJETIVO: investigar o efeito do BVZ nos processos de transcrição e tradução de marcadores da gliose: GFAP e vimentina, de morte celular, caspase-3 e beclina-1, e dos proteoglicanos relacionados à manutenção e desenvolvimento de tecido retiniano: neurocam, fosfacam e sindecam-3. MÉTODOS: Dois modelos experimentais foram usados nesse estudo: 1) linhagem celular de Müller de Glia humana adulta (MIO-M1), cultivada em meio de cultura D-MEM na presença e ausência de BVZ por 12 e 24 horas nas concentrações de 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL e 2) explantes de retinas de ratos 2 dias pós-nascidos submetidos à 0,50 mg/mL da droga por 48 horas. Durante este período foram mantidos a 5% de dióxido de carbono à temperatura de 37°C. A análise de proteínas foi realizada por imunocitohistoquímica e Western Blotting e a expressão de RNAm, pela reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR Real Time). Foi utilizado o Teste de ANOVA - fator único para a comparação entre os grupos controle e tratados com BVZ de um mesmo período (12h ou 24h) e o teste t de Student para a comparação entre as mesmas concentrações de 12h e 24h, e para a comparação entre os grupos controle e tratado com BVZ dos explantes (p < 0,05). RESULTADOS: Nas células MIO-M1, o BVZ, aumentou a expressão gênica e diminui a tradução de VEGF na concentração de 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h. Para o GFAP, houve um aumento da transcrição em 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e aos outros grupos em 24h. Entretanto, houve diminuição da tradução para estes mesmos períodos e condições. Para a vimentina, houve aumento na transcrição em 0,50 mg/mL após 24h. Os achados de beclina-1 revelaram uma diminuição da transcrição e tradução em 0,25 mg/mL em 24h comparado a 12h. A transcrição entre os grupos do mesmo período aumentou nos grupos tratados com BVZ tanto em 12h quanto em 24h. A tradução da beclina-1 diminuiu em 0,25 mg/mL, mas aumentou em 0,50 mg/mL em 24h em relação à 12h. A comparação entre os grupos de 24h revelou aumento da tradução em 0,50 mg/mL. Para a caspase-3, houve diminuição da transcrição em 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h e entre nos grupos tratados com BVZ em 24h. A tradução revelou um aumento em 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h. No fosfacam, houve diminuição da transcrição em 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e entre os grupos tratados com BVZ e controles para 12h e 24h. A transcrição de neurocam diminuiu em 0,25 mg/mL e 0,50 mg/mL em 24h comparado a 12h e entre os grupos tratados com BVZ e controles em 12h e 24h. A tradução aumentou em 0,50 mg/mL em 24h em relação a 12h, mas diminuiu entre os grupos em 24h. Nos explantes, a transcrição e tradução de VEGF diminuiram no grupo tratado com BVZ após 48h. CONCLUSÃO: Nossos resultados relacionados às células MIO-M1 e ao explante de ratos, in vitro, nos permitem aventar o possível comprometimento ocasionado pela depleção do VEGF pelo BVZ na homeostase do tecido retiniano, in vivo, interferindo nas moléculas envolvidas na morte e diferenciação celular e na neuroproteção em indivíduos em fase adulta e recém-nato
Backgraound: Vasoproliferative retinal disorders such as age-related macular, degeneration, diabetic retinopathy and retinopathy of prematurity are major causes of blindness in the world. In recent years, intravitreal injections of drugs with antiangiogenic action, as bevacizumab, have been very useful for both patients in adulthood and in newborns. However, experimental studies, in vivo and in vitro, suggest that antiangiogenic drugs may promote side effects in cellular proceedings, interfering directly in physiological mechanisms of cellular proliferation, differentiation and death. POURPOSE: Investigate the bevacizumab effects in transcription and translation processes of gliosis, GFAP and vimentin, cellular death markers, caspase-3 and beclin-1, and proteoglycans involved in retinal tissue maintenance and development, neurocan, phosphacan and syndecan-3. METHODS: Two experimental models were used on this research: cellular lineage of adult and human Müller glial cell(MIO-M1) were cultivated on D-MEM medium with 0,25 and 0,50 mg/mL bevacizumab for 12 and 24 hours, and two days old rat retinal explants submitted to 0,50 mg/mL for 48 hours. During this period were stored in laboratory ovens at 5% carbon dioxide pressure and 37 °C average temperature. Molecular techniques were used to evaluate gene expression and protein content. Protein assessments were performed by immunocytochemistry and western blotting analysis, while Real Time PCR was used to measure mRNA content. ANOVA tests one factor were applied to compare the control and BVZ groups of the same period (12h or 24h) and t test from Student to compare the same conditions of 12h and 24h, and to compare the control and BVZ retinal explants groups (p<0.05). RESULTS: At MIO-M1 cells, BVZ increased the gene expression and reduced the translation of VEGF at concentration of 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours. For GFAP, there was an increase of transcription at 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours and to the other groups at 24 hours. However, there was a decrease in translation for these same periods and conditions. For vimentin, there was an increase in transcription at 0.50 mg / mL after 24 hours. The beclin-1 findings revealed a decrease of transcription and translation at 0.25 mg / ml compared at 24 h compared to 12h. Transcription among groups increased in BVZ treated groups at 12h and 24h. The translation of beclin-1 decreased at 0.25 mg / ml, but increased at 0.50 mg / mL at 24 hours compared to 12 hours. The comparison between the groups at 24h revealed an increased in translation at 0.50 mg / mL. For caspase-3, there was a decrease in transcription at 0.25 mg / ml and 0.50 mg / ml at 24 compared to 12 hours and among BVZ treated groups at 24h. Translation revealed an increase at 0.50 mg / mL at 24 hours compared to 12 hours. For fosfacam, there was a decreased in transcription at 0.50 mg / mL in 24 hours compared to 12 hours and among BVZ treated groups and controls at 12h and 24h. The transcription of neurocam decreased at 0.25 mg / ml and 0.50 mg / ml at 24 hours compared to 12 hours and among BVZ treated groups and controls at 12h and 24h. Translation increased at 0.50 mg / mL at 24 compared to 12 hours, but decreased among the groups at 24 hours. For explants, transcription and translation of VEGF decreased in the BVZ group treated after 48h. CONCLUSION: Our results related to the MIO-M1 cells and explants of rats,in vitro, allow us to suggest the possible impairment caused by depletion of VEGF by BVZ in the homeostasis of retinal tissue, in vivo, interfering in the molecules involved in cell death and cell differentiation and neuroprotection in individuals in adulthood and newborns

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ROVIDA, ELISABETTA. « L’oncogene fes e la fosfotirosino-fosfatasi citosolica a basso peso molecolare interferiscono con la proliferazione e l’adesione cellulare ». Doctoral thesis, 2000. http://hdl.handle.net/2158/776780.

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Il lavoro svolto si è concentrato su due principali argomenti: Meccanismi attraverso i quali la sovraespressione dell’oncogene fes determina la perdita della dipendenza dal fattore di crescita macrofagico specifico, Macrophage Colony-Stimulating Factor (Parte Prima). Ruolo della fosfotirosino fosfatasi citosolica a basso peso molecolare (Low Molecular Weight Phosphotyrosine Protein Phosphatase) nella modulazione di segnali evocati dal Macrophage Colony-Stimulating Factor e da stimoli adesivi (Parte Seconda).

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Martins, Maria de Fátima Araújo Esteves 1963. « Contributo para o estudo do papel da proteína tirosina fosfatase (ACP1) no contexto do lupus eritematoso ». Master's thesis, 2007. http://hdl.handle.net/10451/1112.

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« Efeito de flavonoides na fosfoproteina tirosina fosfatase : mecanismos cineticos e relações estrutura-atividade ». Tese, Biblioteca Digital da Unicamp, 2000. http://libdigi.unicamp.br/document/?code=vtls000205854.

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Videira, Rita Alexandra Barreiros Domingos. « Role of striatal-enriched protein tyrosine phosphatase STEP in the nigrostriatal pathway ». Master's thesis, 2012. http://hdl.handle.net/10400.6/2867.

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Protein tyrosine phosphorylation plays a central role in numerous neuronal processes. It has been implicated in axonal growth, synapse formation, cell-cell and cell-extracellular matrix interactions and differentiation. To regulate these processes, there is a balance between the level of phosphorylation caused by protein tyrosine kinases and the opposing action of protein tyrosine phosphatases. The striatal-enriched protein tyrosine phosphatase (STEP) is a brain-specific phosphatase involved in neuronal signal transduction. STEP is present in high levels in medium spiny neurons of the striatum - the dopaminoceptive neurons - where it is regulated by dopamine receptors. STEP mRNA is alternatively spliced into the membrane-associated STEP61 and the cytosolic STEP46. Both isoforms are expressed in the striatum, whereas the other brain areas only express STEP61. STEP pathway is altered in some neurodegenerative diseases, however, there is no information on the expression of STEP in Parkinson’s disease (PD). PD is characterized by the progressive degeneration of dopaminergic neurons from the substantia nigra that project to the striatum resulting in reduced striatal levels of dopamine, a neurotransmitter that regulates STEP activity. In this way, the main goal of the present research activity was to determine if changes in dopaminergic signaling, resultant from a selective dopaminergic lesion in Parkinson’s disease models, can influence the expression of STEP in the nigrostriatal pathway. Besides the strong expression of STEP in the striatum, we observed that STEP is also expressed by midbrain dopaminergic neurons and its expression varies along development, however, the expression profile is different in both regions. With this work we intended to deepen if STEP expression is regulated by the dopaminergic lesion using PD models. Recurring to a cellular and mouse model of the disease, we observed that levels of STEP are increased in PD. For the determination of this effect, neuron-astrocytes midbrain co-cultures were previously stimulated with MPP+ and, in parallel, young adult C57BL/6 mice were submitted to an intraperitoneal injection of MPTP. The extension of the lesion was determined in both models by assessing both the number of dopaminergic neurons and the levels of tyrosine hydroxylase. Since MPTP is converted to MPP+ in astrocytes, we further investigated if midbrain astrocytes can be modified by these stimuli and we also evaluated if the changes in STEP expression were associated with increased reactivity of astrocytes. In vitro, we did not observe STEP expression in astrocytes. However, in vivo, we observed increased levels of a marker of astrocyte reactivity in the substantia nigra in parallel with increased levels of STEP. These studies indicate that there is a relation between STEP expression and dopaminergic lesion and, perhaps this relation may be critical for the pathogenesis of PD and therefore it can be considered a potential therapeutic target.
A fosforilação proteica através dos resíduos de tirosina tem um papel importante em vários processos neuronais. Esta tem sido implicada no crescimento axonal, em interações célulacélula, célula-matriz extracelular e na diferenciação. Para regular estes processos existe um equilíbrio entre o nível de fosforilação provocado pelas cinases de resíduos de tirosina e a ação oposta provocada pelas fosfatases de resíduos de tirosina. A proteína fosfatase de resíduos de tirosina enriquecida no estriado (STEP – Striatal Enriched Protein Tyrosine Phosphatase) é uma fosfatase específica do cérebro e encontra-se envolvida na transdução de sinal neuronal. A STEP está presente em níveis elevados nos neurónios espiculados médios do estriado - neurónios dopaminoceptivos - que são regulados pelos recetores da dopamina. O ARN mensageiro da STEP origina alternadamente a STEP61, uma isoforma associada à membrana e a STEP46, uma isoforma citosólica. Ambas as isoformas são expressas no estriado enquanto que outras regiões do cérebro expressam apenas a isoforma STEP61. A via da STEP está alterada em algumas doenças neurodegenerativas, no entanto, não há informação sobre a expressão da STEP na Doença de Parkinson (DP). A DP é caracterizada pela progressiva degeneração dos neurónios dopaminérgicos da substantia nigra que projetam para o estriado, resultando em níveis reduzidos de dopamina no estriado, sendo esta considerada um neurotransmissor regulador da atividade da STEP. Assim, com este estudo pretendemos avaliar se alterações na sinalização dopaminérgica, resultantes de uma lesão dopaminérgica seletiva em modelos da Doença de Parkinson, influenciam a expressão de STEP na via nigroestriatal. Apesar da forte expressão da STEP no estriado, observou-se que esta também é expressa pelos neurónios dopaminérgicos do mesencéfalo e que a sua expressão varia ao longo do desenvolvimento. No entanto, o perfil de expressão da STEP é diferente em ambas as regiões. Com este trabalho, pretendeu-se aprofundar se a expressão de STEP é regulada por uma lesão dopaminérgica em modelos de DP. Recorrendo a modelos, in vitro e in vivo, foi possível observar que os níveis de STEP estão aumentados em modelos da DP. Para determinar este efeito, culturas mistas de neurónios e astrócitos do mesencéfalo foram previamente estimuladas com MPP+ e, em paralelo, ratos C57BL/6 adultos foram submetidos a uma injeção intraperitoneal de MPTP. A extensão da lesão foi determinada em ambos os modelos pela quantificação dos neurónios dopaminérgicos e pelos níveis de tirosina hidroxilase. Investigouse ainda se a lesão neuronal promovia um aumento da reatividade dos astrócitos e se este aumento de reatividade poderia afetar a expressão de STEP.

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« Relação entre a atividade da proteina tirosina fosfatase e a ação citotoxica de antimalaricos sobre linfocitos humanos ». Tese, Biblioteca Digital da Unicamp, 2021. http://libdigi.unicamp.br/document/?code=vtls000287614.

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« Papel da proteina tirosina fosfatase de celulas V79 na resposta ao estresse causado pelo peroxido de hidrogenio ». Tese, Biblioteca Digital da Unicamp, 2002. http://libdigi.unicamp.br/document/?code=vtls000294021.

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« Importancia da proteina tirosina fosfatase para a viabilidade de celulas leucemicas tratadas com quinonas / \ Cristiane Fernandes de Assis ». Tese, Biblioteca Digital da Unicamp, 2003. http://libdigi.unicamp.br/document/?code=vtls000302180.

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« Sobre as proteínas tirosina-fosfatases. Reatividade intrínseca de ésteres de fosfato e simulação computacional dos mecanismos de reação enzimática ». Tese, Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, 2004. http://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/46/46131/tde-12092006-132038/.

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ADORNATO, ILENIA. « Progettazione, sintesi e valutazione di nuove molecole attive come inibitori di enzimi coinvolti nello sviluppo del diabete mellito e delle sue complicazioni ». Doctoral thesis, 2018. http://hdl.handle.net/11570/3131222.

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Il diabete mellito è una complessa patologia caratterizzata da gravi alterazioni metaboliche e complicanze croniche. La ricerca oggetto di questa tesi è stata rivolta alla progettazione, sintesi, valutazione biologica e studio delle relazioni struttura attività di nuovi inibitori di enzimi coinvolti nell'insorgenza del diabete e delle sue complicanze, in particolare, una parte significativa di questa ricerca è stata finalizzata all'individuazione di nuovi inibitori della protein tirosina fosfatasi 1B (PTP1B), enzima che svolge un ruolo primario nello sviluppo dell'insulino-resistenza tipica del diabete di tipo 2 e dell' obesità. Un altro bersaglio biologico è stato l'aldoso reduttasi (ALR2), enzima che svolge un ruolo cruciale nella comparsa dei danni tissutali e vascolari responsabili dello sviluppo delle complicanze diabetiche croniche. L'inibizione della PTP1B e dell'ARL2 costituisce una promettente strategia per l'individuazione di nuovi candidati farmaci. Su queste basi, una seconda parte della ricerca è stata mirata alla progettazione di "designed multiple ligands" attivi come inibitori duplici di questi enzimi. Sia la progettazione di nuovi inibitori enzimatici, sia la razionalizzazione dei risultati sono state supportate da esperimenti di molecular modelling.

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Ferreira, Débora Alexandra Reste. « Role of Striatal-Enriched Protein Tyrosine Phosphatase (STEP) in the control of microglial ». Master's thesis, 2018. http://hdl.handle.net/10400.6/9742.

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Protein tyrosine phosphatases (PTPs) are key regulatory factors in inflammatory signaling pathways. The central nervous system has as resident immune cells the microglial cells, which participate in the initiation and propagation of the inflammatory response. STriatal-Enriched Protein Tyrosine Phosphatase (STEP) is a central nervous system specific phosphatase encoded by the PTPN5 gene. STEP mRNA is alternatively spliced into the membrane-associated STEP61 and the cytosolic STEP46. Accumulating evidence implicates STEP dysregulation in the molecular basis of several neuropsychiatric disorders. Published data about STEP, focus on expression and role at the neuronal level. To our knowledge, there are no published data on the expression of STEP by microglial cells or on the regulation of microglial reactivity by this phosphatase. Our results from PCR analysis show the expression of STEP mRNA in primary cultures of microglia obtained from rat brain. STEP expression was further confirmed by the immunocytochemical analysis and Western blot. On the other hand, STEP expression levels appear to be regulated by exposure to inflammatory stimuli. Microglia cultures exposed to the pro-inflammatory agent lipopolysaccharide (LPS) showed increased levels of STEP61 and STEP46. To examine the role of STEP in the control of microglia reactivity induced by LPS, we used a specific pharmacological inhibitor of STEP (TC-2153). STEP inhibition significantly reduced the number of microglial cells expressing inducible nitric oxide synthase (iNOS) and the number of phagocytic cells quantified after LPS stimulation. On the other hand, inhibition of STEP did not significantly affect the nitric oxide (NO) release and the expression of Interleukin 1 beta (IL-1ß) or tumor necrosis factor alpha (TNFa). Taken together, our results show that STEP is expressed by cells that do not belong to the neuronal lineage and suggest that STEP participates in some of the pathways involved in microglia reactivity.
As proteínas tirosina fosfatases (PTPs) são fatores reguladores nas vias de sinalização inflamatórias. O sistema nervoso central tem como células imunes residentes as células microgliais, as quais participam no início e na propagação da resposta inflamatória. A proteína fosfatase de resíduos de tirosina enriquecida no estriado (STEP), é uma fosfatase específica do sistema nervoso central codificada pelo gene PTPN5. O mRNA STEP origina por splicing alternativo a STEP61, isoforma associada à membrana e a STEP46, isoforma citosólica. A desregulação da STEP está implícita na base molecular de vários distúrbios neuropsiquiátricos. Os estudos publicados sobre a STEP centram-se na expressão e papel a nível neuronal. Tanto quanto é do nosso conhecimento não existem dados publicados sobre a expressão da STEP pela microglia ou sobre a regulação da reatividade microglial por esta fosfatase. Os nossos dados da análise de PCR mostraram a expressão do RNAm da STEP em culturas primárias da microglia obtidas a partir de cérebro de rato. A presença da proteína STEP foi também verificada por análise imunocitoquímica e Western blot. Por outro lado, os níveis de expressão da STEP parecem ser regulados por exposição a estímulos inflamatórios. Culturas de microglia expostas ao agente pró-inflamatório lipopolissacarídeo (LPS) apresentaram níveis aumentados de STEP61 e STEP46. Como forma de avaliar o papel da STEP no controlo da reatividade da microglia induzida por LPS, recorremos ao inibidor específico da STEP (TC-2153). O tratamento com este inibidor reduziu significativamente o número de células microgliais que expressam a sintase do óxido nítrico induzida (iNOS) e também o número de células fagocitícas quantificadas após a exposição ao LPS. Contudo, a inibição da STEP não afetou significativamente a libertação de óxido nitríco nem a expressão da interleucina-1beta (Il-1ß) ou do fator de necrose tumoral alfa (TNFa). Em suma, nossos resultados mostram que a STEP é expressa por células que não pertencem à linhagem neuronal, e sugerem que a STEP participa em algumas das vias envolvidas na reatividade da microglial.

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Sapinho, Guilherme Mendes. « Differential role of low molecular weight protein tyrosine phosphatase (total and slow isoform) in bone metastases from breast cancer ». Master's thesis, 2016. http://hdl.handle.net/10451/26728.

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Résumé :

Trabalho Final do Curso de Mestrado Integrado em Medicina, Faculdade de Medicina, Universidade de Lisboa, 2016
BACKGROUND: LMW-PTP has been related with tumorigenesis, having both oncogenic and anti-oncogenic roles. The differential roles of its main active isoforms (fast and slow) may account for these discrepancies. Considering that LMW-PTP is overexpressed in breast cancer, that it is central to bone metabolism, and that osteolytic metastases are a major cause of death in breast cancer patients, it is relevant to clarify the differential role of LMW-PTP main isoforms in bone metastases. The fast isoform has been described to be involved in the bone metastatic process, although the slow isoform has been recently reported to increase osteoclastogenesis. We aimed at 1) reviewing the literature concerning LMW-PTP and bone metastases and 2) studying the influence of LMW-PTP isoforms on osteoclast differentiation. METHODS: 1) We reviewed the literature and 2) we cultured osteoclast precursors (RAW 264.7) with conditioned media from knockdowns of the total LMW-PTP and the slow isoform in a breast cancer cell line (MDA-MB-231). TRAP staining and quantification were performed to assess osteoclast differentiation. RESULTS: Total LMW-PTP knockdown, but not slow LMW-PTP knockdown, significantly decreased RAW 264.7 osteoclast differentiation. CONCLUSIONS: Total LMW-PTP, but not its slow isoform, increases osteoclastogenesis. We suggest that the LMW-PTP fast isoform mediates bone metastization from breast cancer in an osteoblast-independent fashion, having promising clinical applications.
INTRODUÇÃO: A LMW-PTP foi associada ao desenvolvimento tumoral, embora lhe sejam atribuídas funções anti- e pró-tumorais. Os papéis diferenciais das isoformas ativas (fast e slow) parecem explicar estas discrepâncias. Considerando que a LMW-PTP é sobreexpressa no cancro da mama, que é fulcral para o metabolismo ósseo e que é uma causa de morte importante em doentes com cancro da mama, torna-se relevante clarificar o papel diferencial das suas principais isoformas na metastização óssea. A isoforma fast tem sido associada a este processo, apesar de recentemente se ter documentado que a slow aumenta a osteoclastogénese. Assim, pretendemos 1) rever a literatura sobre LMW-PTP e metástases ósseas e 2) estudar a influência das isoformas da LMW-PTP na diferenciação osteoclástica. MÉTODOS: 1) Revimos a literatura e 2) cultivámos precursores osteoclásticos (RAW 264.7) sob influência de meios condicionais de uma linha celular de cancro da mama (MDA-MB-231) subexpressando a LMW-PTP total e slow. Para avaliar a diferenciação osteoclástica foi feita coloração e quantificação de TRAP. RESULTADOS: A subexpressão da LMW--PTP total, mas não a da slow, diminuiu significativamente a diferenciação de RAW264.7 em osteoclastos. CONCLUSÕES: A LMW-PTP total, mas não a slow, aumenta a osteoclastogénese. Sugerimos que a isoforma fast seja um mediador da metastização óssea no cancro da mama, independente de osteoblastos, e com potenciais aplicações na clínica.
Financiado por uma bolsa Gulbenkian/FMUL, no âmbito do Programa “Educação pela Ciência” (projecto nº 20130042/PEC).

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Duarte, Irina Alho 1983. « The importance of low molecular weight protein tyrosine phosphatase in the progression of metastatic bone disease and therapeutic response ». Doctoral thesis, 2013. http://hdl.handle.net/10451/10545.

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Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Ciências Biopatológicas), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2013
Bone metastases are the leading cause of morbidity and mortality among patients with breast cancer. Two different therapeutic approaches are used in patients with advanced metastatic bone disease: anti-tumor and anti-resorptive therapeutics such as bisphosphonates that block osteoclasts activity. Among patients treated with bisphosphonates, around 25% are non-responders. Our studies were based in LMW-PTP, codified by ACP1, a polymorphic enzyme with two main isoforms, called fast and slow. This protein has been largely associated with cancer, although with contradictory roles. Recently, LMW-PTP has been involved in bone metabolism. Our first results showed that the LMW-PTP slow isoform is more expressed in breast cancer cells compared to non-tumor cells. The fast isoform has the opposite pattern. However, both isoforms are involved in migration through a RhoA dependent mechanism, decreasing the migratory potential of cells, confirming previous studies suggesting the importance of GTP/GDP RhoA balance in the migratory potential and not its absolute activity. Suppression of the slow isoform in a breast tumor cell line decreased osteoclastogenesis, and this mechanism involved at least Src inactivation and decrease of IL8 production in the tumor cell line. Studies in surgical samples of normal, primary and metastatic breast cancer tissue, confirmed involvement of the slow isoform in tumor behavior and showed an increase in the fast isoform expression, suggesting that in metastatic tissue, where the vicious cycle of bone metastasis is well established, the fast isoform is being regulated by the microenvironment and this microenvironment has the ability to increase the expression of this isoform, possibly as an enhancement mechanism in response to the osteoclastogenic potential of the slow isoform. Regarding therapeutic response to bisphosphonates, there were no differences according to ACP1 genotypes. Taken together, our results showed that the two main LMW-PTP isoforms may have different roles depending on tumor stage, with the fast isoform being more dependent on the tumor microenvironment. Regarding the ACP1 polymorphism, and according to our results, it cannot be used either as a therapeutic response marker or as a prognostic marker.
As metástases ósseas são a principal causa de morbilidade e mortalidade entre os pacientes com cancro da mama. São correntemente utilizadas duas abordagens terapêuticas diferentes em pacientes com doença metastática óssea avançada: terapêuticas anti-tumorais e terapêuticas anti-resorptivas, tais como bisfosfonatos, que inibem a actividade osteoclástica. Entre os pacientes tratados com bisfosfonatos, cerca de 25% não respondem à terapêutica. Os nossos estudos basearam-se na LMW-PTP, codificada pelo ACP1, um enzima polimórfico com duas isoformas principais, denominadas fast e slow. Esta proteína tem sido amplamente associada a diferentes tipos de cancro, embora o seu papel permaneça contraditório. Recentemente, a LMW-PTP foi associada ao metabolismo ósseo. Os nossos primeiros resultados mostraram que a isoforma slow da LMW-PTP é mais expressa em células de cancro da mama do que em células não tumorais. A isoforma fast apresentou padrão de expressão oposto. No entanto, ambas as isoformas estão envolvidas na migração através de um mecanismo dependente do RhoA, diminuindo o potencial migratório das células, e confirmando estudos prévios que sugerem a importância do equilíbrio GTP/GDP RhoA no potencial migratório e não a sua actividade absoluta. A supressão da isoforma slow numa linha celular tumoral da mama diminuiu a osteoclastogénese, e este mecanismo envolve, pelo menos, a inactivação da Src e a diminuição da produção de IL8 pela linha celular. Os estudos realizados em amostras cirúrgicas de tecido normal, primário e metastático de cancro da mama, confirmaram o envolvimento da isoforma slow no comportamento tumoral, e mostraram um aumento da expressão da isoforma fast, sugerindo que no tecido metastático, onde o ciclo vicioso de metastização óssea se encontra bem estabelecido, a isoforma fast está a ser regulada pelo microambiente e este microambiente tem a capacidade de aumentar a expressão desta isoforma, possivelmente como um mecanismo de potenciação em resposta ao potencial osteoclastogénico da isoforma slow. No que diz respeito à resposta terapêutica aos bisfosfonatos, não houve diferenças de acordo com os genótipos do ACP1. Globalmente, os nossos resultados mostraram que as duas isoformas principais da LMW-PTP podem ter diferentes funções, dependendo do estadio do tumor, com a isoforma fast a mostrar maior dependência do microambiente tumoral. Quanto ao polimorfismo do ACP1, e de acordo com os nossos resultados, este não pode ser usado como um marcador de resposta terapêutica nem como um marcador de prognóstico.
Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/44716/2008)

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Gonçalves, Joana José Fernandes. « Caracterização estrutural e funcional da interação entre inibidores e PtpA : um possível alvo contra a tuberculose ». Master's thesis, 2018. http://hdl.handle.net/10362/48561.

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A tuberculose (TB) é uma das mais antigas e mortais infeções que afetam a humanidade.1 A causa desta doença reside no agente patogénico aeróbico Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis), que afeta principalmente o sistema respiratório.2,3 A sobrevivência da M. tuberculosis no seu hospedeiro está diretamente relacionada com a secreção de proteínas tirosinas fosfatases que interferem na sinalização celular dos macrófagos.4 A proteína tirosina fosfatase A (PtpA) tem demonstrado ter um papel crucial neste processo, sendo, por isso, um alvo muito promissor ao desenvolvimento de novos fármacos anti-tuberculose.5 A estrutura cristalográfica da proteína nativa foi resolvida em 2005.6 Entre uma série de compostos testados, a família das chalconas tem sido identificada como potencial inibidora competitiva da PtpA. Estudos preliminares revelaram que o fator inibidor predominante nestes compostos reside na planaridade/hidrofobicidade da molécula, assim como na natureza dos grupos substituintes que estabelecem pontes de hidrogénio entre os resíduos do sitio ativo da PtpA.4,7,8 Neste trabalho estudou-se as propriedades inibitórias de quatro chalconas e duas tiosemicarbazonas por métodos biofísicos, enzimáticos e estruturais. A PtpA foi expressa e purificada com um rendimento médio de 20 mg/L de expressão, e foram resolvidas quatro estruturas da proteína incubada com ligandos, a resoluções máximas de 2,89 Å a 3,60 Å. Foi observada uma densidade eletrónica extra no centro ativo da proteína, que poderá estar relacionada com os ligandos. A experiência de SAXS revelou que a conformação da proteína não se altera na presença dos ligandos. Os ensaios enzimáticos, assim como as experiências de TSA, ITC e MST revelaram-se inconclusivos.

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Gonçalves, Joana Alexandra Lima. « The Impact of Protein Tyrosine Phosphatases on the activation of Intraepithelial Lymphocytes ». Master's thesis, 2021. http://hdl.handle.net/10316/94249.

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Dissertação de Mestrado em Investigação Biomédica apresentada à Faculdade de Medicina
A barreira epitelial do intestino abriga um conjunto de microorganismos comensais e patogénicos e também um vasto leque de antigénios alimentares. Os linfócitos intraepiteliais (IEL) são células T residentes no epitélio intestinal e constituem uma primeira linha de defesa contra infeções, preservando assim a integridade da barreira epitelial, assegurando a homeostase e reparação dos tecidos.A ativação desproporcionada de linfócitos pode produzir efeitos nefastos, justificando assim a necessidade de existir um mecanismo de ativação estritamente regulado. Enquanto a maioria dos linfócitos é mantido num estado quiescente, os linfócitos intraepiteliais apresentam-se num estado de ativação elevado, porém controlado, exibindo características de ambas células T efetoras e de memória. Neste estado de ativação elevado, os linfócitos intraepiteliais demonstram prontidão para atuar, no entanto parece existir uma barreira que impede estes linfócitos de executarem em pleno as suas funções efetoras. A ativação de células T convencionais é maioritariamente regulada pelo recetor de células T (TCR), no entanto os sinais que regulam a ativação dos linfócitos intraepiteliais são ainda desconhecidos e o papel do TCR nesta interação permanece controverso. O processo de ativação e subsequentes respostas imunológicas são maioritariamente regulados pela sinalização intracelular que se inicia com a ativação do TCR, que recruta inúmeras moléculas de sinalização onde se incluem as proteínas tirosina fosfatases e as proteínas tirosinas quinases. A ação desfosforilante das PTPs determina a ativação ou a inibição dos seus alvos, conferindo às PTPs um papel fundamental na regulação da sinalização pelo TCR. Deste modo, a desregulação da atividade das PTPs pode resultar numa deficiência nos mecanismos de ação e regulatórios do TCR e consequentemente em patologias de carácter autoimune. Este estudo procurou investigar o papel das PTPs no estado de ativação dos IELs e pretende avaliar se as PTPs representam um fator determinante no controlo da ativação destas células.Em resposta à estimulação do TCR, os IELs apresentam uma transdução de sinal intracelular deficiente, a jusante do TCR. Os resultados mostram que as PTPs são altamente expressas por IELs “naturais”, e uma análise mais profunda revela níveis muito elevados das proteinas PTPN22 e SHP-2 nestas células, em comparação com células T convencionais. Observou-se também uma maior atividade das PTPs em IELs naturais. Ao analisar a indução de colite em ratinhos, verificou-se que esta doença é prolongada em ratinhos-quimeras deficientes em PTPN22. Mais ainda, após a estimulação de ratinhos-quimera Ptpn22-/- com α-CD3, os IELs exibem um maior poder citotóxico. Em ratinhos wild-type tratados com um inibidor de PTP, ortovanadato de sódio (SOV), e estimulados com α-CD3, os IELs proliferam continuamente, aumentam a expressão de PD-1 e sustêm a produção de Granzima B (GzmB).Em conjunto, o nosso trabalho mostra o papel proeminente das PTPs nos IELs intestinais, e consequentemente esclarece a sua importância para a função e regulação destas células.
The intestinal epithelial barrier is home to an array of commensal and pathogenic microorganisms as well as a variety of food antigens. Intraepithelial lymphocytes (IELs) are highly specialized T cells, which reside within the intestinal epithelium, constituting a first line of defence against infection and ensuring tissue homeostasis. The potential detrimental effects of aberrant lymphocyte activation support the necessity for a strictly regulated lymphocyte activation mechanism. While most lymphocytes are kept in a quiescent state, intriguingly, IELs are sustained in a highly activated yet resting state, sharing many features with both effector and memory T cells. IELs are halted in a poised activation status, which hints at the presence of a cue for activation but also a blockade preventing IELs from mounting a fully-fledged effector response. Indeed, conventional T cell activation is mainly regulated by the T cell receptor whereas the cues that regulate IEL activation status are still unknown and the role of the TCR remains controversial. Upon TCR ligation, T cell activation is regulated by signal transduction downstream of the TCR, engaging several intracellular signalling molecules such as Protein Tyrosine Phosphatases (PTPs) and Protein Tyrosine Kinases (PTKs). The dephosphorylation action of PTPs determines the enhancement or inhibition of their specific targets, granting PTPs with a critical role in the regulation of TCR signalling. The dysregulation of PTP function could therefore result in the impairment of the TCR mechanisms of action and regulation and consequently, in T cell-mediated autoimmune disease. This study investigates the role of PTPs in the heightened but poised activation status of IELs and intends to ascertain whether PTPs are a key factor in the control of IEL activation. The analysis of IEL response to TCR stimulation has revealed that signal transduction is hampered downstream of the TCR. We found that PTPs are highly expressed in natural IELs and further analysis showed increased protein levels of the PTPs PTPN22 and SHP-2 in these cells, compared to peripheral T cells. Furthermore, we could show increased PTP activity in natural IELs. Analysis of an induced-colitis mouse model has shown that the disease is prolonged in Ptpn22-/- Bone Marrow (BM) chimeric mice. We also report that in Ptpn22-/- BM chimeras stimulated with α-CD3, IELs show increased cytotoxic potential. Furthermore, in WT mice treated with a general PTP inhibitor, Sodium Orthovanadate (SOV), and stimulated with α-CD3, IELs show continuing proliferation, increased PD-1 expression, and sustained Granzyme B (GzmB) production.Taken together, our work reveals that PTPs are prominent in intestinal IELs, suggesting they may make an important contribution to the function and regulation of these cells.

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