Littérature scientifique sur le sujet « Tirosin protein fosfatasi »

2013 - 2014
Oncogenic activation of tyrosine kinases is a common feature in cancer, and its regulation represents an excellent antitumoral target. Tyrosine phosphorylation is also controlled by protein-tyrosine phosphatases (PTPs). Recent evidence has shown that PTPs can function as tumour suppressors. An improved understanding of how these enzymes function and how they are regulated might aid the development of new anticancer agents. It has been shown that cross-regulation of kinases/phosphatases and caspases allows for fine-tuning of the apoptotic threshold, as well as the opportunity to amplify apoptotic signals. The signaling pathways involved in the control of cell proliferation, adhesion and migration are governed by the balanced action of protein tyrosine kinases (PTKs) and protein-tyrosine phosphatases (PTPs). For this reason my PhD thesis focused the attention on three different targets PTPRJ a receptor protein tyrosine phosphatase, GRK2 G protein-coupled receptor kinase 2, CaMKII, Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase II. PTPRJ is down regulated in tumor cells and its over-expression suppresses cell growth, both in vivo and in vitro, concomitant with the reduction of the activity of MAP-kinase (ERK1/2) and phosphorylation of PLC-. Therefore, the identification of agonist peptides would be a valid approach in antitumoral therapy. By means of a phage display library screening, we recently identified two peptides able to bind and activate PTPRJ, [CHHNLTHAC]-OH and [CLHHYHGSC]-OH. Focused the attention on [CHHNLTHAC]-OH my research project was based on the design of different peptide libraries using several approaches like Alanine scanning approach and changes in disulfur bridge. GRK2, G protein-coupled receptor kinase 2 is a relevant signaling node of the cellular transduction network, playing major roles in the physiology of various organs/tissues including the heart and blood vessels. Emerging evidence suggests that GRK2 is up regulated in pathological situations such as heart failure, hypertrophy, hypertension and is involved in the progression of cellular cycle. Therefore, its inhibition offers a potential therapeutic solution to these diseases. During my PhD thesis a SAR study and a NMR conformational analysis of peptides derived from HJ loop of GRK2 and able to selectively inhibit GRK2 were performed. Moreover, we explored the GRK2 inhibitory activity of a library of cyclic peptides derived from the HJ loop of GRK2. The design of these cyclic compounds was based on the conformation of the HJ loop within the X-ray structure of GRK2. One of these compounds, potently and selectively inhibited the GRK2 activity, being more active than its linear precursor. CaMKII, Ca2+/Calmodulin-dependent protein kinase II constitutes a family of closely related multifunctional serine/threonine kinases that transduces elevated Ca 2+ signals in cells to a number of target proteins ranging from ion channels to transcriptional activators. Among processes regulated by CaMKII are neuronal growth and functions related to brain development, synaptic plasticity as well as the formation and maintenance of memory, cell proliferation and apoptosis, proper function of the immune system, and the central control of energy balance. Current knowledge about CaMKII control on physiological or pathological functions is largely based on experiments with pharmacological inhibitors. As part of our current interest in the study of CaMKII-dependent cell signaling, we directed our efforts toward the identification of novel CaMKII peptide inhibitors. Starting from a potent CaMKinase II inhibitor, CaM-KNtide, we designed different CaM-KNtide analogues and evaluated the inhibitory activity and specificity. [edited by author]
XII n.s.

B-chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the commonest leukemia in the Western world and is characterized by the clonal expansion of small CD5+ B lymphocytes in the pheripheral blood, bone marrow and lymphoid organs, due to defective apoptosis. One of the crucial factors for the survival of B-CLL cells is the anomalous activity of a few enzymes such as the lipide kinase PI3K, the Ser/Thr kinase PKC and the tyrosine-kinases Syk and Lyn. My research focus was Src family kinase Lyn, which is overexpressed, constitutively active and delocalized in the cytosol within an aberrant multiprotein complex, in association with the molecular chaperone Hsp90, which in turn accounts for the high level of tyrosine-phosphorylation, ultimately contributing to the cancer phenotype of B-CLL cells. The aim of my PhD work was to identify Lyn’s cytosolic substrates potentially involved in the apoptosis resistance mechanisms observed in leukemia cells. Using biochemical and biomolecular methods as well as a bioinformatics approach, two potential substrates of Lyn were identified, namely the cysteine protease caspase-8 and the protein phosphatase-2A (PP2A). Firstly, we established that in B-CLL, the inactive zymogen of caspase-8, procaspase-8, is phosphorylated at Tyr380 by the cytosolic pool of Lyn, which brings about its inhibition and its structural rearrangements in a dymeric cytosolic form. The phosphorylation of Tyr380 of caspase-8 is abolished by the use of both the Lyn inhibitor dasatinib and the Hsp90 inhibitor geldanamycin, the latter of which also leads to the disassembly of the aberrant cytosolic complex and the drop in the Lyn’s cytosolic activity, resulting in the caspase-dependent apoptosis. Secondly, we verified that Lyn negatively affects the activity of one of the key factors in the modulation of cell survival signals, PP2A. Phosphorylation of the catalytic subunit of PP2A at Tyr307 causes inhibition of the phosphatase activity not only per se but also strengthening the interaction of PP2A with its cellular inhibitor SET, which is also overexpressed in B-CLL cells. As a result, PP2A is stably preserved in an inhibited form, which contributes to the persistence of prosurvival signals, in particular those mediated by the serine/threonine kinase Akt. Moreover, to identify new compounds able to activate PP2A in order to contrast survival signals in B-CLL, we tested fingolimod (FTY720), which is already known as a PP2A activator, currently in use in the treatment of multiple sclerosis and recently emerging as a pro-apoptotic factor in different types of cancer cells. Notably, the mechanism of action consists in the ability of fingolimod to bind to SET and hence remove this cellular inhibitor of PP2A from its catalytic subunit. Since this drug is used as an immunosuppressive agent, by virtue of its provoking the degradation of the sphingosine-1-phosphate receptor, and shows cardiovascular side effects, it might prove unsuitable in a more complex therapeutic strategy. Therefore, fingolimod structural analogues which could not interfere with the sphingosine receptors, but could still destabilize the PP2A/SET complex were designed and synthesized. One of these compounds, MP07-66, showed an effectiveness similar to fingolimod, as to both the ability to disrupting the PP2A/SET complex and inhibit the protein kinase Akt, this latter being vital in preserving the survival signals. This compound also was able to induce apoptosis in leukemia cells, which effect was further enhanced by the combination with dasatinib by a synergistic mechanism, further confirming the role of phosphorylation in the stability of PP2A/SET. In conclusion, this work identifies PP2A and Caspase 8 as substrates of the cytosolic aberrant activity of Lyn, confirming the key role of this tyrosine kinase in supporting multiple anti-apoptotic signals in the B-CLL. The molecular mechanisms of apoptosis resistance here identified may be potential targets in the development of new therapies for clinical use.
La leucemia linfatica cronica a cellule B (LLC-B) è la forma più comune di leucemia nell’adulto ed è caratterizzata dall’accumulo di piccoli linfociti B CD5+ nel sangue periferico, nel midollo osseo e negli organi linfatici, dovuto sia a un aumento della proliferazione, che a un difetto dei meccanismi di morte cellulare programmata. Tra i fattori che contribuiscono alla sopravvivenza del linfocita neoplastico un ruolo fondamentale svolge l’attività anomala di diversi enzimi con attività fosfotransferasica che modulano le principali vie di segnalazione intracellulare, tra cui la lipide chinasi PI3K, la serina/treonina chinasi PKC, e le tirosin-chinasi Syk e Lyn. L’attività di ricerca svolta durante il mio dottorato si è concentrata sulla Src chinasi Lyn, la quale in questa patologia risulta sovra-espressa, iperattiva e delocalizzata nel citosol come componente di un complesso multiproteico aberrante. All’interno di questo complesso, Lyn è associata al chaperone molecolare Hsp90, il quale la preserva in conformazione attiva, così contribuendo all’elevata tirosin-fosforilazione basale tipica della LLC-B. Lo scopo della mia indagine è stato identificare le molecole substrato dell’anomala attività di Lyn, potenzialmente coinvolte nei fenomeni di resistenza all’apoptosi dei cloni leucemici. Grazie all’applicazione di metodi biochimici e biomolecolari, nonché a un approccio bioinformatico, abbiamo identificato due substrati proteici di Lyn, la proteasi caspasi 8 e la proteina fosfatasi 2A (PP2A). In primo luogo, abbiamo dimostrato che nelle cellule B di LLC, la procaspasi 8, zimogeno della caspasi 8, è fosforilata in Tyr380 ad opera di Lyn citosolico; tale fosforilazione comporta non solo l’inibizione dell’attività caspasica ma anche il riarrangiamento strutturale della proteasi stessa, che nei cloni leucemici localizza nel citosol in forma dimerica. Tale inibizione viene rimossa usando sia inibitori di Lyn, come il dasatinib, sia inibitori di Hsp90, come geldanamicina, quest’ultimo provocando la rottura del complesso citosolico e quindi il calo dell’attività di Lyn e in ultima analisi attivando le vie apoptotiche estrinseca ed intrinseca. In secondo luogo, abbiamo verificato che Lyn esercita un controllo negativo su uno dei fattori chiave della modulazione dei segnali che regolano la sopravvivenza cellulare, la serina/treonina fosfatasi PP2A. I nostri dati indicano l’esistenza di un meccanismo d’inibizione dell’attività fosfatasica di PP2A, che dipende sia dalla fosforilazione come tale in Tyr307 della subunità catalitica, ma anche dalla stabilizzazione dell’interazione della fosfatasi con il suo inibitore proteico cellulare SET, il quale è anch’esso sovra-espresso nelle cellule di LLC-B. La formazione di questo complesso stabile mantiene la fosfatasi in uno stato inattivo contribuendo quindi alla persistenza dei segnali di sopravvivenza mediati in particolar modo dalla serina/treonina chinasi Akt. Inoltre, allo scopo di individuare nuove molecole in grado di riattivare PP2A e quindi utili a contrastare i segnali di sopravvivenza delle cellule leucemiche, abbiamo verificato l’utilità di un noto attivatore di PP2A, il fingolimod (FTY720), già impiegato nella sclerosi multipla e ultimamente rivelatosi efficace nel causare la morte cellulare in vari tipi di modelli di neoplasia. Il meccanismo di azione risiede nella capacità di rimuovere l’inibitore SET dalla subunità catalitica di PP2A. Questo composto, tuttavia, possedendo attività immunosoppressiva a causa dell’induzione della degradazione del recettore della sfingosina ma anche effetti collaterali a carico del sistema cardio-vascolare, può rivelarsi inadeguato nell’ottica di una più complessa strategia terapeutica in campo oncologico. Quindi sono stati sviluppati degli analoghi strutturali che non interferissero con il recettore della sfingosina ma destabilizzassero il complesso della PP2A fosforilata e SET. In questo modo è stato identificato un composto (MP07-66), con un’efficacia sovrapponibile al fingolimod sia nel disgregare il complesso che nell’inibire la protein chinasi Akt, fondamentale nel preservare i segnali di sopravvivenza. Inoltre tale composto era in grado di indurre apoptosi su cellule leucemiche, il quale effetto veniva incentivato dalla presenza di dasatinib con meccanismo sinergico, ulteriormente confermando il ruolo della fosforilazione nella stabilità del complesso PP2A/SET. In conclusione, questo lavoro identifica PP2A e caspasi 8 quali substrati dell’attività citosolica aberrante di Lyn, confermando il ruolo chiave di questa chinasi nel supportare i molteplici segnali anti-apoptotici presenti nella LLC-B. I meccanismi molecolari di resistenza all’apoptosi qui identificati possono costituire dei potenziali bersagli per lo sviluppo di nuove terapie ad uso clinico.

Orientador: Hiroshi Aoyama
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-06T06:33:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Sousa_RobertaReginaRuelade_M.pdf: 3257089 bytes, checksum: 29f24a432f8c0bfd7dd71af48cc7608a (MD5) Previous issue date: 2005
Resumo: As proteínas tirosina fosfatases (PTP) (EC 3.1.3.48) são enzimas regulatórias chaves que participam na transdução de sinal e são essenciais na regulação do crescimento, diferenciação, ciclos celulares, na transcrição gênica, resposta imune e outros processos. Esta classe de enzimas, que contém cisteína no sítio ativo, pode ser inativada por agentes oxidantes. Neste trabalho, estudamos os efeitos de peróxido de hidrogênio e t-butil hidroperóxido, compostos que induzem estresse oxidativo, na atividade de uma PTP purificada de membranas de linfócitos humanos, indicativamente a CD45. A PTP foi purificada de membranas de linfócitos humanos através de cromatografias de troca iônica (DEAE Sepharose) e exclusão molecular (Sephacryl S-200). A purificação enzimática foi acompanhada por SDS-PAGE e eletroforese bidimensional. A atividade enzimática foi determinada através de incubação a 37°C por 30 min em pH 5,0 em presença de 5 mM de p-nitrofenil fosfato (pNPP) como substrato. A enzima obtida da cromatografia de exclusão molecular apresentou uma massa molecular relativa de aproximadamente 200 kDa, reconheceu mais eficientemente tirosina fosfato (cerca de 3,2 vezes) como substrato quando comparado ao pNPP, e foi inibida por inibidores específicos de PTP, tais como vanadato (40%), pervanadato (100%), p-cloromercuribenzoato (20%) and Cu2+ (95%). Ácido okadáico, um inibidor específico de serina e treonina proteína fosfatases, não afetou a atividade da PTP de membranas de linfócitos. Estes resultados de caracterização sugerem fortemente que a PTP purificada de membranas de linfócitos humanos é a CD45. Peróxido de hidrogênio e t-butil hidroperóxido inibiram a atividade dessa proteína com valores de IC50 (concentração do composto que produz 50% de inibição enzimática) de 50 µM e 16 mM, respectivamente. Glutationa reduzida (GSH) protegeu parcialmente a enzima contra estes oxidantes, porém proteções totais foram obtidas quando se adicionava 250 mM de desferoxamina ao meio de ensaio. Nossos resultados sugerem que essa proteína pode ser regulada por alteração do estado de oxidação dos grupos funcionais do sítio ativo e que esta regulação poderia fornecer um mecanismo de controle celular através de espécies reativas de oxigênio
Abstract: Protein phosphatases, that dephosphorylate proteins in residues of threonine, serine and tyrosine, are a class of enzymes that can be stressed by compounds present in oxidant or reductant environments. In particular, the protein tyrosine phosphatases (PTP) (EC 3.1.3.48) are key regulatory enzymes that participate in signal transduction and are essential for regulating cellular growth, differentiation, cell cycle, gene transcription, immune response and other processes. This class of enzymes, which contain cysteine in the active site, can be inactivated by oxidant reagents. In this work we have studied the effect of hydrogen peroxide and t-butyl hydroperoxide, compounds that induce oxidative stress, on a purified PTP (CD45) from membrane human lymphocytes. PTP was purified from human lymphocyte membranes through ion exchange (DEAE Sepharose) and molecular exclusion (Sephacryl S-200) chromatographies. The enzyme purification was followed by SDS-PAGE and 2D electrophoresis. The enzyme activity was determined by incubation at 37oC for 30 minutes at pH 5.0 in presence of 5 mM p-nitrophenylphosphate (pNPP) as substrate. The enzyme obtained from molecular exclusion chromatography had a relative molecular mass of approximately 200 kDa, recognized more efficiently tyrosine phosphate (about 3.2-fold) as substrate when compared with p-NPP, and was inhibited by specific PTP inhibitors, such as, vanadate (40%), pervanadate (100%), p-chloromercuribenzoate (20%) and Cu2+ (95%). Okadaic acid, a specific serine and threonine protein phosphatases inhibitor, did not significantly affect the lymphocyte membrane PTP activity. These characterization results strongly suggest that the membrane PTP purified from human lymphocytes was the CD45. Hydrogen peroxide and t-butyl hydroperoxide inhibited the CD45 activities with IC50 (concentration of compound that produces 50% enzyme inhibition) values of 50 µM and 16 mM, respectively. Reduced glutathione (GSH) partially protected the enzyme against these oxidations, but full protections were observed when 250 mM deferoxamine were added to the assay medium. Our results suggest that CD45 can be regulated by altering the oxidation state of active site functional groups, and that this regulation could provide a mechanism of cell control by reactive oxygen species
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Eventos como fosforilação e desfosforilação estão presentes nos processos de crescimento e diferenciação celular. As proteínas tirosina fosfatases estão envolvidas nestes processos. Estas enzimas são encontradas em animais, plantas e ocorrem em diversas formas, diferindo no peso molecular, substrato específico e sensibilidade a inibidores. As enzimas que possuem baixo peso molecular (entre 18-20 KDa), hidrolisam p-nitrofenilfosfato e são sensíveis ao p-hidroximercuribenzoato são chamadas como proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular relativo (PTP-BMr) ou fosfatases ácidas. Vários dados sugerem que tipos de células de osso, como osteoblastos, podem expressar esta enzima ativa. Aqui, culturas de osteoblastos derivadas da medula removida do fêmur de rato foram investigadas para padronizar a metodologia de obtenção da PTP-BMr. A expressão e atividade catalítica desta enzima em diferentes estágios de crescimento de osteoblastos também foram verificadas. Foi observado que são necessários de 16-19 dias de cultura para obter maiores níveis de atividade da PTP-BMr em extrato citoplasmático. O nível de expressão do gene da PTP-BMr foi determinado por PCR em tempo real e uma maior quantificação de RNAm foi obtida em 16 dias de crescimento de osteoblasto. A caracterização bioquímica parcial confirma uma banda de atividade em gel de poliacrilamida com peso molecular de 17,6 KDa, e pH ótimo de 5,5. A hidrólise do p-nitrofenilfosfato demonstra uma pequena cooperatividade relativa (n=1,2) com K0,5= 0,12 e Vmax= 3,5U/mg. Esta atividade foi fortemente inibida (60 a 75%) por molibdato de amônio (10mM); fosfato de sódio (10mM); ortovanadato de sódio (10mM) e p-hidroximercuribenzoato de sódio (10mM). Estas propriedades são típicas desta classe. A interação entre osteoblastos e diferentes superfícies pode ativar ou desativar genes. Este presente projeto investigou se a interação com superfície de titânio pode modificar o perfil de atividade da PTP-BMr. Quando em presença de uma superfície de titânio há um maior aumento na atividade catalítica do que nos níveis de RNAm da PTP-BMr o que sugere uma estimulação da enzima a qual pode estar auxiliando no processo de formação óssea.
Events as phosphorilation and desphosphorilation are experienced in cell growth and differentiation processes. Tyrosine phosphatases proteins are involved in these processes. These enzymes are found in animals, plants and occur in multiple forms, differing in relative molecular weight, substrate specificity and sensitivity to inhibitors. The enzymes that have low molecular weight (between 18-20KDa), hydrolize p-nitrophenilphosphate and are sensible to p-hidroximercuribenzoate are known as low molecular weight relative tyrosine phosphatase proteins (PTP-LMWr) or acid phosphatase. Several data suggest that bone cell types, such as osteoblasts, may express this enzyme activity. Here, osteosblast cultures derived from medulla removed from rat femur were investigated to standardize the methodology of PTP-LMW obtainment. The expression and the catalytic activity of this protein in different stages of osteoblast growth were checked as well. It was observed that 16-19 culture days are necessary to obtain greater levels of activity of PTP-LMW in the cytoplasmatic extracts. The gene expression level of PTP-LMW was determined by quantitative real-time PCR, and a greater quantity of mRNA was observed within sixteen days of osteoblast growth. The partial biochemistry characterization confirms a single active band in poliacrilamide gel with molecular weight of about 17.6KDa, and a pH-optimum around 5.5. p-nitrophenilphosphate hydrolysis shows a small cooperative behavior (n=1.2) with K0.5=0.12mM and Vmax=3.5U/mg. This activity was strongly inhibited (about 60-95%) by ammonium molybdate (10mM); sodium phosphate (10mM); sodium orthovanadate (10mM) and sodium p-hydroximercuribenzoate (10mM). These properties are typical for this enzyme class.

Orientadores : Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-03T11:58:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pinheiro_KarinaCristinaSeregatte_M.pdf: 2536223 bytes, checksum: 84daa316e88c5a44bbbb304adbae7323 (MD5) Previous issue date: 2002
Resumo: Neste trabalho foi avaliada a citotoxicidade do peróxido de hidrogênio sobre as células V79, bem como o efeito deste oxidante sobre a fosfatase total isolada destas células. A viabilidade celular foi avaliada através de 4 parâmetros: incorporação do vermelho neutro (NRU) - (integridade lisossomal); conteúdo de ácidos nucléicos (NAC) - (número de células); redução do MTT (integridade mitocondrial) e atividade fosfatásica (metabolismo celular), tendo sido obtidos os seguintes valores de ICso 970, 1470, 840 e 870 IJM para NRU, NAC, MTT e fosfatase, respectivamente. Para os parâmetros NRU e NAC observou-se efeito diferente do peróxido, dependendo da concentração, como aumento da incorporação do corante pelos lisossomos e do número de células até as concentrações de 500 e 750 IJM respectivamente. O efeito de potenciais inibidores de fosfatases sobre a fosfatase total das células V79 revelou que a principal hidrolase presente no extrato corresponde a uma proteína tirosina fosfatase. Estes resultados foram reforçados pela sensibilidade desta enzima ao peróxido (ICso = 10mM). A presença de antioxidantes reverteu a ação inibitória do peróxido de hidrogênio. Do mesmo modo, a atividade fosfatásica também foi inibida, em maior grau, pelo pervanadato (ICso = 1001JM) o qual também atua como oxidante. O efeito inibitório do H202 e o pervanadato sobre a fosfatase foi aumentado após diálise do extrato celular. As células V79 apresentam alta concentração de glutationa reduzida, sugerindo que a maior resistência destas células frente ao peróxido de hidrogênio pode ser devido à presença deste antioxidante. Tanto o peróxido quanto o pervanadato apresentaram maior efeito inibitório após diálise, reforçando a importância da glutationa reduzida
Abstract: In this work was evaluated the hydrogen peroxide cytotoxicity on V79 cells, and the effect of this oxidant on the total phosphatase trom these cells. The cell viability was analyzed through 4 parameters: neutral red uptake (NRU) (Iisossome integrity); nucleic acid content (NAC) - (cell number); MTT reduction (mitochondria function) and phosphatase activity (cell metabolism). The following ICso values were obtained: 970, 1470, 840 and 870 J.lM for NRU, NAC, MTT and phosphatase, respectively. Hydrogen peroxide presented different effect on the NRU and NAC depending on its concentration. In concentrations up to 500 and 750 J.lM, was observed increase of dye uptake and cell number, respectively. The inhibiton studies using phosphatase inhibitors showed that the major phosphatase present on the V79 cells extract is a protein tyrosine phosphatase. This result was reinforced by the high sensibility of this phosphatase when hydrogen peroxide (ICso = 10 mM) and pervanadate (ICso = 100J.lM) were addictioned in the reaction medium. In the presence of antioxidant this effect was prevented. Finally, the concentration of reduced glutathione was determined, V79 cells presented high content of this compound then, our results suggest that the low toxicity of this compound on these cells could be due to the action of this antioxidant. Other result reinforce this hypothese, both oxidant (hydrogen peroxide and pervanadate) presented higher inhibitory effect of the phosphatase activity after dialyse
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad
Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas
Made available in DSpace on 2018-08-10T10:41:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Traina_Fabiola_D.pdf: 10463418 bytes, checksum: a1c92a0820404ccf5ce6623bff80018a (MD5) Previous issue date: 2007
Resumo: Importante passo para a compreensão dos processos fisiopatológicos das neoplasias é a identificação de genes ativamente expressos e das funções biológicas de cada proteína codificada por estes genes. Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 (ANKHD1) foi inicialmente identificada em células de adenocarcinoma de próstata humano (LNCaP), no ano de 2003. Entretanto, seu padrão de expressão e sua função ainda não haviam sido caracterizados. A ANKHD1 é uma proteína ortóloga à Multiple Ankyrin repeat and single KH domain (Mask) da Drosophila melanogaster. Mask foi identificada através de um rastreamento genético utilizado para detectar novas proteínas associadas à proteína tirosina fosfatase Corkscrew (CSW), homóloga à Src Homology-2 domain-containing protein tyrosine Phosphatase-2 (SHP2) humana. SHP2 é uma fosfatase de tirosina citoplasmática codificada pelo gene PTPN11 e exerce papel fundamental no desenvolvimento da hematopoese normal e leucêmica. Os objetivos gerais do presente estudo foram caracterizar o padrão de expressão gênica e protéica de ANKHD1 em células hematopoéticas normais e leucêmicas e sua participação nas vias de sinalização celular. Neste estudo, foi demonstrada a elevada expressão gênica e protéica de ANKHD1 em linhagens de leucemias agudas humanas (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi e Namalwa) e em amostras de 38 pacientes com diagnóstico de leucemia aguda, quando comparadas às células hematopoéticas normais. A expressão protéica de ANKHD1 em diferentes tecidos humanos normais (rim, baço, estômago, intestino delgado, músculo esquelético, fígado, pulmão e linfonodo) foi detectada em intensidades variáveis. A associação da ANKHD1 com SHP2 foi identificada, através de Western Blotting, em células de leucemia mielóide crônica em fase blástica (K562) e células LNCaP. Entretanto, esta associação não foi detectada nas linhagens leucêmicas KG1, HL60, Daudi e Jurkat. A ANKHD1 foi localizada no citoplasma de células hematopoéticas normais e leucêmicas. Detectou-se a fosforilação de ANKHD1 em serina em células leucêmicas, mas não em células hematopoéticas normais. Através de ensaio de duplo híbrido em levedura, utilizando-se uma biblioteca de cDNA de medula óssea humana normal, detectou-se a interação de ANKHD1 com as proteínas SIVA1 e SIVA2, proteínas pró-apoptóticas altamente expressas em linhagens de leucemia linfóide aguda. Análises preliminares indicaram que a inibição da expressão protéica de ANKHD1, através de RNAi, induziu à apoptose celular em células leucêmicas, sugerindo uma função anti-apoptótica à ANKHD1. Em conclusão, o presente estudo identificou ANKHD1 como uma nova proteína altamente expressa em leucemias agudas, associada à SHP2 e SIVA em diferentes células, e, possivelmente, envolvida com o fenótipo anormal da célula leucêmica através de uma função anti-apoptótica. Os achados aqui descritos sugerem que ANKHD1 pode ser uma molécula alvo para a terapia da leucemia no futuro, e permitirão direcionar novos estudos com o objetivo de melhor elucidar as funções específicas de ANKHD1 em diferentes células hematopoéticas normais e leucêmicas
Abstract: One step in the path towards building a comprehensive molecular portrait of human cancer is the definition of actively expressed genes and the function of their coding proteins. The Ankyrin Repeat Single KH Domain containing 1 protein (ANKHD1) was first described in humans in a prostate carcinoma cell line LNCaP, in 2003; however, its expression pattern and its function have not yet been described. ANKHD1 is an orthologous protein of the Drosophila melanogaster, MASK (Multiple Ankyrin repeat and single KH domain), where it was first identified using a genetic screen designed to discover proteins that interact with the protein tyrosine phosphatase Corkscrew (CSW), which is a homolog to the SH2-containing protein tyrosine phosphatase (SHP2) in humans. SHP2 is a cytoplasmic protein-tyrosine phosphatase, coded by the PTPN11 gene and plays an important role in the development of normal hematopoiese and leukemogenesis. The aim of the present study was to characterize the gene and protein expression pattern of ANKHD1 in normal hematopoietic cells and in leukemia cells, and its role in signaling pathways. In the present study, the overexpression of ANKHD1 mRNA and its protein was demonstrated in human leukemia cell lines (KG-1, HEL, K562, NB4, HL-60, Jurkat, MOLT4, Raji, Daudi and Namalwa) and in 38 patients with a diagnosis of acute leukemia, compared to normal hematopoietic cells. The ANKHD1 protein was found to have a variable expression in different normal tissues (kidney, spleen, stomach, small intestine, skeletal muscle, liver, lung and lymph node). An association of ANKHD1 and SHP2 was found, through imunopreciptation and Western Blotting, in the chronic myeloid leukemia blastic phase cell line (K562) and in LNCaP cells. However, this association was not detected in the leukemia cell lines, KG1, HL60, Daudi and Jurkat. ANKHD1 was found located in the cytoplasm of normal hematopoietic cells and leukemia cells. ANKHD1 was found to be phosphorylated at serine in leukemic cells, but not in normal hematopoieitic cells. Through the yeast two-hybrid system, using a cDNA library from normal human bone marrow, the interaction of ANKHD1 with SIVA1 and SIVA2 was detected. SIVA isoforms are pro-apoptotic proteins, overexpressed in acute lymphoblastic leukemia cell lines. Preliminary studies showed that the inbition of ANKHD1 expression, through RNAi, resulted in increased apoptosis in leukemic cells, which suggests an anti-apoptotic function for ANKHD1. In conclusion, the present study identified ANKHD1 as a new protein that is overexpressed in leukemic cells. The protein interacts with SHP2 and SIVA in different cells and is probably associated with the abnormal phenotype of the leukemia cell through its anti-apoptotic function. These findings suggest that ANKHD1 may be a molecular target for a rational therapy for leukemia in the near future, and open a new field of investigation to better define the specific roles of ANKHD1 in different normal and leukemic hematopoietic cells
Doutorado
Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento
Doutor em Fisiopatologia Medica

Orientadores: Carmen Verissima Ferreira, Hiroshi Aoyama
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Made available in DSpace on 2018-08-03T16:41:04Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Assis_CristianeFernandesde_M.pdf: 3042510 bytes, checksum: f14f76bf214fea214d8604a04d205472 (MD5) Previous issue date: 2003
Resumo: o objetivo geral deste trabalho foi correlacionar o efeito citotóxico da hidroquinona (HQ) e da tetrahidroxiquinona (THQ) sobre as células HL60 com alteração da atividade de PTPs. As qui nonas apresentaram efeito inibitório sobre fosfatases de membrana e citosol das células HL60. A viabilidade das células HL60 foi avaliada através de 3 parâmetros: redução do MTT, atividade fosfatásica e conteúdo de proteínas. Para a HQ foram obtidos os seguintes valores de ICso: 20 e 50jJM para fosfatase e MTT, respectivamente. Quando as células foram tratadas em presença da GSH os valores de ICso para HQ foram 80jJM para fosfatase e 50jJM para MTT. Em relação à função mitocondrial e atividade fosfatásica, as células quando tratadas com THQ apresentaram um ICso 50jJM. Entretanto, a THQ em presença da GSH foi menos tóxica como revelado pelos valores de ICso encontrados (240JJM para fosfatase e 160JJM para o MTT). As células HL60 tratadas com HQ e THQ reduziram o NBT, indicando positividade na diferenciação de 103 e 89%, respectivamente. A fragmentação do DNA observada na presença da HQ (35%) e THQ (24%) indica indução de apoptose. Nossos resultados mostram que o efeito citotóxico das qui nonas sobre as células HL60 foi inespecífico e dependente da metabolização das mesmas, com produção de compostos mais reativos. Portanto, o estresse oxidativo causado pela HQ e THQ pode inicialmente alterar vias de sinalização que têm a participação de proteínas tirosina fosfatases, já que estas enzimas respondem negativamente a baixos níveis de agentes oxidantes
Abstract: The aim of this work was to correlate the cytotoxic effect of hydroquinone (HQ) and tetrahydroxiquinone (THQ) on HL60 cells with protein tyrosine phosphatases activities changing. The quinones presented inhibitory effect in the phosphatases isolated from HL60 cells (membrane and cytosol). The cell viability was evaluated through 3 parameters: MTT reduction, phosphatase activity and protein content. For the HQ the following ICso values were obtained: 20 and 50IJM for phosphatase and MTT, respectively. When these cells were treated in presence of GSH the ICso values for HQ were 80IJM for phosphatase and 50IJM for MTT. In relation to the mitochondrial function and phosphatase activity, when the cells were treated with THQ, the ICso was 50IJM for both parameters. However, THQ in presence of GSH was less toxic as revealed through to ICso values of (240IJM for phosphatase and 160IJM for MTT). HL60 cells treated with HQ and THQ reducted NBT, indicating differentiation positivity of 103 and 89%, respectively. DNA fragmentation was observed in the presence of HQ (35%) and THQ (24%) revealing apoptose induction. Ours results showed that cytotoxic effect of quinones on HL60 cells was inespecific and depended on the compounds metabolization, producing more toxic metabolites. Finally, the oxidative stress caused by HQ and THQ could initially changes signaling pathways which PTPs are involved, because these enzymes are negatively regulated by low levei of oxidant agents
Mestrado
Bioquimica
Mestre em Biologia Funcional e Molecular

Tuberculose (TB) é um grave problema de saúde pública, sendo a segunda maior causa de morte entre doenças infecto contagiosas. Em 2014, 9,6 milhões de casos e, aproximadamente, 1,5 milhão de mortes foram reportados. O Programa Nacional de Controle da Tuberculose preconiza para o tratamento a administração simultânea de quatro medicamentos. Contudo, casos de tratamento inadequado favorecem o surgimento de cepas multirresistentes e extensivamente resistentes aos medicamentos disponíveis. Diante disso, torna-se urgente a necessidade de investigar novos alvos moleculares e desenvolver novos fármacos que sejam úteis e eficazes para o tratamento da infecção. As proteínas tirosina fosfatases (PTPs) constituem uma grande família de enzimas responsáveis pela hidrólise do fosfato ligado aos resíduos de tirosina em proteínas. A importância destas fosfatases reside no fato de estarem envolvidas na regulação de uma série de funções celulares, tais como crescimento, interação intercelular, metabolismo, transcrição, motilidade e resposta imune. A partir da análise do genoma do Mycabacteirum tuberculosis, foram identificadas duas proteínas tirosinas fosfatases (PtpA e PtpB), responsáveis pela sua sobrevivência nos macrófagos do hospedeiro. Ambas as enzimas têm sido exploradas como alvo molecular para o desenvolvimento de novos fármacos para a tuberculose. Nessa dissertação, as sequências gênicas que codificam para as enzimas PtpA e PtpB de M. tuberculosis foram clonadas com sucesso nos vetores de expressão. A expressão solúvel das proteínas permitiu o estabelecimento de um protocolo padronizado de purificação. Ensaios de cristalização foram conduzidos e cristais de proteínas obtidos tiveram os dados cristalográficos coletados. Para a enzima PtpB foi possível determinar a estrutura cristalográfica em alta resolução em complexo com um grupo fosfato no sítio catalítico. Essa estrutura foi então utilizada na etapa posterior de descoberta de novos candidatos a inibidores. Os trabalhos computacionais conduzidos incluíram uma combinação de estratégias para a identificação de pontos de interação relevantes para o processo de reconhecimento molecular e ligação bem como para a construção de modelos farmacofóricos 3D específicos para cada enzima. Esses dados foram utilizados para a seleção de um conjunto de 8 candidatos a inibidores da PtpA e 5 candidatos a inibidores da PtpB. Portanto, estudos de biologia molecular estrutural e química medicinal foram empregados com sucesso para o estabelecimento de uma plataforma produtiva dos alvos selecionados bem como para a seleção de novos candidatos a inibidores.
Tuberculosis (TB) is a serious public health problem and the second leading cause of death among infectious diseases. In 2014, 9.6 million cases, and approximately 1.5 million deaths were reported. The National Program for Tuberculosis Control recommends the simultaneous administration of four drugs as treatment for the disease. However, inadequate treatment determines the emergence of multidrug- and extensively-resistant strains to available drugs. Therefore, new molecular targets and drugs are urgently needed for the treatment of the infection. The protein tyrosine phosphatases (PTPs) are a large family of enzymes responsible for the hydrolysis of phosphate group bound to tyrosine residues in proteins. The importance of these molecules is related to the regulation of a number of cellular functions, including growth, intercellular interaction, metabolism, transcription, motility and immune response. Based on Mycabacteirum tuberculosis genome analysis, two protein tyrosine phosphatases (PTPA and PtpB) were related to mycobacterium survival in host macrophages. Both enzymes have been explored as a molecular target for the development of new drugs for TB. In this dissertation, the gene sequences encoding the enzymes PtpA and PtpB from M. tuberculosis were successfully cloned in expression vectors. The soluble expression of the proteins allowed the establishment of a standardized purification protocol. Crystallization assays were conducted, protein crystals were obtained, and crystallographic data were collected. We determine the crystallographic structure of PtpB in complex with a phosphate group in the catalytic site at high resolution. This structure was then used in the subsequent step for the discovery of new inhibitor candidates. Computational studies included a combination of strategies for identifying interaction points relevant to the process of molecular recognition and binding as well as the construction of 3D pharmacophore models specific for each enzyme. These data were used to select a set of 8 and 5 compounds as PtpA and PtpB inhibitor candidates, respectively. Therefore, structural molecular biology and medicinal chemistry studies have been successfully conducted for the establishment of a platform aimed to the production of the selected targets as well as for the selection of new inhibitor candidates.

A proteína tirosina fosfatase eta de rato (rPTPeta), é uma RPTP transmembranar do tipo classe I. A rPTP eta e seu homólogo DEP-1 provenientes, respectivamente, de ratos e de humanos, estão inibidas em células neoplásicas. Este fenótipo maligno é revertido após reconstituição exógena, o que sugere que a capacidade restauradora da rPTP eta pode ser uma ferramenta importante na terapia de alguns tipos de câncer. Portanto, o objetivo deste projeto incluiu o estudo molecular, biofísico e estrutural do domínio catalítico da rPTPeta (rPTPetaDC). Para isso, sub-clonamos no vetor pET-28a(+) o inserto que codifica para a região C-terminal da rPTPeta . Em seguida, bactérias E. coli da linhagem BL21 (DE3) foram transformadas com o plasmídeo e a proteína recombinante expressada e purificada. A His6-rPTPetaDC purificada teve a cauda de histidina subseqüentemente removida por digestão com trombina. O ponto isoelétrico de 7,3 da proteína de 41kDa foi medido experimentalmente e a sua funcionalidade acessada pelo ensaio de hidrólise do pNPP. A enzima apresentou uma atividade específica de 9nmol/min/microg a qual é compatível com as atividades específicas descritas para as RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 e SHP2. A estrutura secundária e a estabilidade da rPTPetaDC recombinante foi analisada por dicroísmo circular e espectroscopia de fluorescência. A rPTPetaDC mostrou-se estável a 18 graus Celsius e propriamente enovelada (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. Anexo A). A proteína foi, em seguida, submetida a diferentes condições de cristalização e a estudos estruturais em solução. Nas condições de 0,1M de MES, pH 6,5 e 20% PEG 10000 cresceram cristais que difrataram na resolução de 1,87Å. Os cristais pertencem ao grupo espacial P2(1)2(1)2(1) com parâmetros de célula unitária: a=46,46; b=63,07; c=111,64 Å, e com uma única molécula por unidade assimétrica (Matozo, et al., Acta crystallogr. F, 2006. Anexo B). A estrutura da rPTPetaDC, em solução, foi analisada usando-se a técnica de SAXS e medidas de anisotropia de fluorescência. Os dados de SAXS mostraram que a proteína, forma dímeros alongados, com Rg de 2,65nm e Dmax de 8,5nm. A conformação da rPTPetaDC analisada por modelos de homologia sugere que seu dímero está mais próxima da estrutura cristalográfica dimérica da RPTPalfa-D1. Alem disso, a caracterização da rPTPetaDC por anisotropia de fluorescência demonstrou que o Kd do dímero da rPTPetaDC é de 21,6 + 2,0uM e a variação da energia livre de Gibbs dímero-monômero é de 7,2kcal/mol (Mtozo, et al., Biophys. J., 2007. Anexo C ).
The rat protein tyrosine phosphatase eta, rPTPeta, is a transmembrane RPTP, with an intracellular portion composed of a unique catalytic region. The rPTPeta and the human homolog DEP-1 are down-regulated in rat and human neoplastic cells, respectively. However, the malignant phenotype is reverted after exogenous reconstitution of rPTPeta, suggesting that its function restoration could be an important tool for gene therapy of several types of cancer. Therefore, the objective of our project aimed on the molecular, biophysical and structural study of the catalytic domain of rPTPeta, rPTPetaDC. We began our study cloning the rPTPetaDC into PET28a(+) vector, followed by its expression in Escherichia coli, and purification. The His6-tag from the rPTPetaDC purified was subsequently removed by thrombin digestion. PhastGel IEF electrophoresis demonstrated that the isoelectric point of the 41kDa was 7.3. To assess the functionality of the rPTPetaDC we used the pNPP hydrolysis assay and observed that the enzyme has a specific activity of 9nmol/min/ug. The experimentally determined rPTPetaDC specific activity showed to be in the same range as the previously reported activities for RPTPu, RPTPalfa, PTPB1 and SHP2. The secondary structure and stability of the recombinant protein was analyzed by circular dichroism and fluorescence spectroscopy. The results demonstrated that rPTPetaDC was stable at 18 Celsius and properly folded (Santos, et al., Prot. Expr. Purif., 2005. In attachment A). Then, the purified protein was submitted to different crystallization conditions and structural studies in solution. Crystals appeared at 0.1M MES, pH 6.5 and 20% PEG 10,000 and diffracted with resolution of 1.87Å. The crystals belong to spatial group P2(1)2(1)2(1) with unit cell parameters of a=46.46, b=63.07, c=111.64Å and contained one molecule for asymmetric unit (Matozo, et al., Acta crystallog. F, 2006. In attachment B). Also, the structural of rPTPetaDC, in solution, was analyzed by SAXS and fluorescence anisotropy. SAXS data showed that the protein forms elongated dimers in solution with an Rg of 2.65nm and a Dmax of 8.5nm. The rPTPetaDC conformation in solution, studied by homology models, suggested that the rPTPetaDC dimer architecture is more closely related to the crystal structure of RPTPalfa-D1. The characterization of rPTPetaDC by fluorescence anisotropy measurements demonstrated that the Kd of the dimer is 21.6 + 2.0uM and the energy Gibbs dimer-monomer is equal to 7.2kcal/mol (Matozo, et al., Bioph. J., 2007. In attachment C).

A Análise de Acoplamentos Estatísticos é uma técnica computacional capaz de identificar resíduos importantes para a estrutura e função de proteínas em uma família por meio da quantificação de conservação posicional, correlação entre posições e identificação de grupos de resíduos correlacionados entre si. Neste trabalho, a análise de acoplamentos estatísticos foi implementada e aplicada ao estudo das proteínas tirosina fosfatases. Em conjunto com as proteínas tirosina quinases (PTKs), que adicionam um grupo fosforil a um resíduo de tirosina em uma proteína, as proteínas tirosina fosfatases (PTPs), que o removem, são responsáveis por diversos processos de sinalização celular. Elas são um caso de evolução convergente, onde um subgrupo (as proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular) não apresenta homologia às chamadas PTPs \"clássicas\", capazes de defosforilar apenas resíduos de tirosina, e às fosfatases de especifidicade dupla, capazes de defosforilar também resíduos de serina e treonina, além de substratos não-protéicos. Em comum, as três subfamílias apresentam apenas o motivo CX5R, característico para todas as PTPs. Através do estudo das três subfamílias utilizando a análise de acoplamentos estatísticos, foi possível obter uma descrição detalhada de suas características conservadas e correlacionadas, relacionando-as ao conhecimento acumulado sobre proteínas tirosina fosfatases e a questões em aberto como a regulação por dimerização, a especificidade e mutações relacionadas a patologias. Foi possível também apresentar um método capaz de distinguir proteínas tirosina fosfatases de baixo peso molecular das arsenato redutases, derivadas das primeiras por evolução divergente. Adicionalmente, a técnica foi aplicada ao estudo das hexoquinases, às superóxido dismutases e às peroxidases. A tese descreve também estudos desenvolvidos pelo autor na área de cristalografia de proteínas a determinação das estruturas da Transtirretina humana em complexo com genisteína, da holo-Hexoquinase PI de S. cerevisae, do complexo IL-22/IL-22R1 e da Laminarinase de R. marinus.
The statistical coupling analysis is a computational technique which can identify important residues for the structure and function of proteins in a family by quantifying positional conservation, correlation between positions and identifying groups of self-correlating residues. Its implementation in this research group was applied to the study of the protein tyrosine phosphatases. Together with the protein tyrosine kinases (PTKs), which add a phosphoryl group to a tyrosine residue in proteins, the protein tyrosine phosphatases (PTPs), which remove it, are responsible for a variety of cell signaling processes. They are a case of convergent evolution, since one subgroup (the low molecular weight protein tyrosine phosphatases) are not homologous to the classical phosphatases, which can only dephosphorilate tyrosine residues, and the dual-specificity phosphatases, which can also dephosphorilate serine and threonine residues, and also non-proteinaceous substrates. All three sub-families have, in common, the CX5R motif, a characteristic of all PTPs. By applying the statistical coupling analysis to the study of the three sub-families, it was possible to obtain a detailed depiction of their conserved and correlated characteristics, relating them to the accumulated knowledge on protein tyrosine phosphatases and open questions such as protein regulation by dimerization, specificity and disease-related mutations. It was also possible to present a method to distinguish between low molecular weight phosphatases and arsenate reductases, which are derived by the former by divergent evolution. In addition, the technique was applied to the study of hexokinases, superoxide dismutases and peroxidases. The thesis also describe studies developed by the author in the field of protein crystallography the structure determination of human transthyretin in complex with genistein, holo-hexokinase PI from S. cerevisae, the IL-22/IL-22R1 complex and the laminarinase from R. marinus.

INTRODUÇÃO: O câncer de tireoide é um dos agravos mais comuns ao sistema endócrino, com o maior aumento anual de incidência em diferentes países, principalmente devido à melhoria das tecnologias de diagnóstico, sendo mais proeminente em regiões com acesso aos cuidados de saúde amplamente disponíveis. Alguns eventos moleculares são descritos tanto na carciogênese da tireoide quanto na evolução do tumor glandular. Dados do Atlas do câncer no Genoma Humano dividiu os carcinomas papilíferos de tireoide nas categorias BRAF e RAS, com base nos resultados do exoma do sequenciamento de DNA, RNA e perfil proteômico, e padrões de metilação. OBJETIVOS: Observar nos estudos da literatura os marcadores genéticos relacionados ao câncer de tireóide. MÉTODOS MÉTODOS: Para alcançar os objetivos propostos neste estudo, o método eleito foi a Revisão Integrativa que inclui a análise de pesquisas relevantes que dão suporte para a tomada de decisão, permitindo a incorporação desses achados na prática clínica. A partir de então, foi feita uma busca, ocorrida entre fevereiro e março de 2022, em 5 bases de dados: LILACS (Literatura Latino-Americana e do Caribe em Ciências da Saúde) e SciELO (Scientific Electronic Library Online), PubMed (Central: PMC- National Library of Medicine National Institutes of Health), ScienceDirect e IBECS (Índice Bibliográfico Espanhol em Ciências da Saúde). A pesquisa por artigos foi feita através dos termos em língua inglesa: “thyroid cancer”, “risk markers” e “thyroid cancer genetics” junto ao operador booleano AND. Os resultados obtidos foram comparados, estabelecendo-se concordância quanto a formulação da amostra final. Os achados foram apresentados a partir do método de “nuvem de palavras”, utilizando o software wordle. Nuvem de palavras é uma forma de facilitar a demonstração de quais são as palavras mais frequentes quando pesquisado por determinado assunto ou tema. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Na etapa de seleção subsequente os artigos foram lidos na íntegra onde 213 artigos foram excluídos por não se apresentarem dentro do objeto estudo, e incluídos 14 trabalhos na versão final da revisão. A análise proteica demostrou projeção da estrutura molecular e homologia proteica dos seguintes marcadores moleculares de câncer de tireoide: proto-oncogene receptor tirosina quinase (RET); proto-oncogene do receptor de tirosina quinase neurotrófico 1 (NTRK1); homólogo de fosfatase tensina (PTEN); gene da proteína tumoral p53 (TP53); fosfoinositida 3-quinase/treonina proteína quinase (PI3K/AKT); catenina beta 1 (CTNNB1); gama de receptor ativado por proliferador de peroxissoma de caixa pareada 8 (PAX8-PPARG); oncogene viral de sarcoma de rato (RAS); proto-oncogene B-raf, serina/treonina quinase (BRAF); e receptor do hormônio estimulante da tireóide (TSHR). Experimentos utilizando o tipo de array identificaram três genes diferencialmente expressos, cuja expressão foi analisada por RT-PCR em 10 amostras de cada tipo de tecido. Dois deles foram capazes de diferenciar carcinomas papilíferos de tecido normal e bócio com 89% de precisão para o tumor maligno e 80% para os tecidos não malignos. Conclusão: Após a análise dos resultados desta RI, foi possível observar alguns marcadores de risco para câncer de tireóide. Desse modo, o presente trabalho contribui para o aprofundamento e desenvolvimento de novas reflexões dos estudos sobre marcadores genéticos canceriginos