Thèses sur le sujet « Terapie antitumorali »

Introduzione: il TSH, agendo attraverso cAMP/PKA, regola la crescita delle cellule follicolari tiroidee e richiede anche l' attivazione di mTOR per esercitare i suoi effetti mitogenici. I carcinomi tiroidei scarsamente differenziati e le linee cellulari tumorali tiroidee cresciute in vitro, perdono la dipendenza dal TSH per la loro crescita; essi mostrano, tuttavia, una incrementata attività di mTOR. Poiche' entrambe le vie di segnale di MAPK e PI3K svolgono un ruolo importante nella patogenesi del carcinoma tiroideo e possono convergere su mTOR, esse potrebbero rappresentare vie di segnale alternative responsabili dell'attivazione di mTOR e della proliferazione di cellule tumorali tiroidee. Materiali e Metodi: come modello di studio sono state usate le cellule non trasformate di tiroide di ratto (PCCL3) e linee cellulari umane di carcinoma tiroideo aventi mutazioni a carico degli oncogeni RET/PTC, RAS e BRAF. Obiettivi: Valutare, nei nostri modelli cellulari, se: 1) la via TSH/cAMP/PKA regola la attivazione di mTOR e la crescita cellulare mediata da tale chinasi; 2) le oncoproteine RET/PTC3, HRASSG12V e BRAFV600E, regolano la attivazione di mTOR; 3) la inibizione farmacologica di mTOR (usando la rapamicina) da sola o in combinazione con inibitori di MAPK e PI3K, esercita degli effetti sulla crescita e proliferazione cellulare. Risultati: 1) nelle PCCL3, la via TSH/cAMP/PKA à à à à ¨ cruciale nel mediare i segnali dipendenti da mTOR. Viceversa, le linee cellulari di carcinoma tiroideo sostituiscono la dipendenza, per la loro crescita e per la attivazione di mTOR, dal segnale TSH/cAMP/PKA alle vie di segnale dipendenti da MAPK e/o PI3K; 2) nelle PCCL3, tutte e tre le oncoproteine RET/PTC3, HRASSG12V e BRAFV600E inducono la attivazione di mTOR e quest'ultimo e' richiesto per la sintesi del DNA indotta dalle oncoproteine tiroidee; 3) nelle linee cellulari tumorali tiroidee, la rapamicina, in monoterapia, inibisce la crescita cellulare in modo variabile. Viceversa, una terapia mirata ad inibire contemporaneamente mTOR e/o MEK e/o AKT1/2 esercita effetti terapeutici benefici in tutte le linee cellulari analizzate, eccetto che in quelle strettamente dipendenti, per la crescita, da una sola via di trasduzione del segnale. Conclusioni: nelle linee cellulari tumorali tiroidee, nelle quali piu' vie di segnale (quali MAPK, PI3K ed mTOR) concorrono a conferire dipendenza per la crescita, terapie multiple mirate, potrebbero avere effetti terapeutici benefici massimali.
Introduction: In thyroid follicular cells, TSH, acting through cAMP, regulates cell growth and requires mTOR to exert its mitogenic response. In poorly differentiated thyroid carcinomas and in human thyroid cancer cell lines the TSH dependence for growth is lost, although mTOR pathway is still activated. MAPK and PI3K pathways are central in thyroid cancer pathogenesis and may converge to mTOR cascade. Thus, these cascades could be responsible for mTOR activation and thyroid cell proliferation. Material and Methods: we employed non-transformed thyroid rat cells (PPCL3) and human thyroid cancer cell lines harboring mutations in thyroid oncoproteins RET/PTC, RAS and BRAF. Aims: 1) to evaluate whether TSH/cAMP/PKA signaling pathway regulates mTOR activation and its proliferative response; 2) to study the role of the thyroid oncoproteins RET/PTC3, HRASG12V or BRAFV600E in regulating mTOR activity in our in vitro models; 3) to investigate the efficacy of combined targeting of MAPK, PI3K and mTOR signaling cascades in inhibiting growth and proliferation of human thyroid cancer cell lines. Results: 1) in PCCL3 cells, TSH/cAMP/PKA cascade was central in mediating mTOR signals. In contrast, thyroid cancer cell lines switched the control of mTOR activation from the TSH/cAMP/PKA signals to either MAPK and/or PI3K; 2) conditional expression of the oncoproteins RET/PTC3, HRASG12V and BRAFV600E induced mTOR activity in PPCL3 cells. Moreover, mTOR was required for DNA synthesis induced by all three oncoproteins; 3) rapamycin alone suppressed growth of human thyroid cancer cell lines to a variable degree, whereas the combination of mTOR, MEK and AKT1/2 inhibitors significantly suppressed growth in all cell lines analyzed, except for those addicted mainly to only one survival pathway. Conclusions: In thyroid cancer cells in which multiple parallel cascades (i.e. mTOR, MAPK and PI3K) mediate the survival signals, the multi-targeted therapy could be exploited to achieve optimal therapeutic benefits.

Una de las estrategias más satisafactorias empleadas en la lucha contra el cáncer es la utilización de la terapia génica para actuar en la inmunomodulación, es decir la actuación sobre el propio sistema inmunitario del paciente para que sea éste quien reconozca al tumor como algo foráneo, que no escape a la inmunovigilancia y lograr destruirlo. En esta tesis doctoral hemos explorado bajo este concepto las vacunas por terapia génica no viral, tanto preventivas como terapéuticas, trabajando bien con antígenos aislados y genes como con células y genes. Los experimentos en modelo de melanoma murino, se han divido en tres grandes bloques. 1) En las vacunas preventivas con antígenos, se obtuvieron diferentes tasas de reducción de volumen tumoral, acompañadas de producción de inmunnoglobulinas G específicas frente al tumor tratado. Se obtuvieron los mejores resultados en modelos de vacunación con acondicionamiento tisular en los que inicialmente se acondicionaba al animal con los antígenos purificados, transfectando posteriormente con plásmidos desnudos productores del gen de mGM-CSF. 2) En las vacunas preventivas celulares, transfectando células B16 con plásmidos portadores de los genes de mGM-CSF, mIL-12, mB7.2 y combinaciones entre ellos, se obtuvo la protección total frente al tumor en los animales vacunados con 3 dosis de 2x105 células transfectdas, irradiadas, no seleccionadas. Además se demostró que la vacunación había generado memoria inmunológica, al repetir la exposición al tumor en los mismos animales un año después y volver a lograr la protección total. Adicionalmente se realizaron experimentos de vacunación exclusivamente con las células transfectadas, seleccionadas y purificadas mediante bolas magnéticas. 3) Por último, se realizaron experimentos de vacunación terapéutica, en animales portadores de tumor, siguiendo el modelo de células transfectadas. Se probaron diferentes dosis celulares y el tratamiento previo con ciclofosfamida. Los mejores resultados de inhibición tumoral y prolongación de la supervivencia se obtuvieron en las vacunas con 2 millones de células/dosis. Finalmente se realizó una primera aproximación al estudio del bloqueo del éxito de la vacunación terapéutica, analizando la población de células T reguladoras en los animales tratados.
One of the most satisfactory strategies against cancer is the use of gene therapy for immunemodulation, that is acting over the patient's immune system in order to make it recognize the tumor and fight properly against it. In this thesis, we have explored the nonviral gene therpy vaccines under this concept, working with preventive as well as therapeutic models, with purified antigens and genes and also with whole cells and genes. The experiments have been performed with a murine melanoma model and been divided in three sets. 1) In preventive antigen vaccines, different rates of tumor growth inhibition were obtained, acompained by specific antitumor immunoglobulin G production. The best results were obtained with tissue conditioning, where the animals were firstly conditioned with purified tumor antigens and later the tissues were transfected in vivo with naked plasmids producing mGM-CSF. 2) In preventive cell vaccines, transfecting B16 cells with plasmids bearing mGM-CSF, mIL-12, mB7.2 genes alone or combined, total tumor protection was obtained vaccinating with 3 doses of 2x105 transfected, irradiated, non selected cells. This vaccine also showed immunological memory since a second challenge to the tumor in the same animals one year later also reached total protection. In addition, experiments vaccinating only with the selected population of transfected cells, by means of magnetic beads, were performed. 3) Finally, therapeutic vaccines were evaluated, continuing with transfected cells. Different cell doses and pretreatment with cyclophosphamide were tested. The best results of tumor growth inhibition and survival were obtained with 2 million transfected cells/dose. A first approach to the study of the blockade in therapeutic model success was performed analysing the regulatory T cell population in the treated animals.

Il cancro è la seconda causa di morte nel mondo e i casi riscontrati a livello globale crescono anno in anno. La mortalità, nonostante la continua ricerca nelle tecniche terapeutiche, ha ancora valori molto elevati, soprattutto nel caso dei tumori metastatici. La nanotecnologia è una branca della scienza applicata che è stata oggetto di numerosi approfondimenti per la sua applicazione nel campo della biomedicina e del trattamento antitumorale. Tra i nanomateriali si distinguono i nanotubi di carbonio, un allotropo del carbonio, grazie alle loro ottime proprietà elettriche, termiche, ottiche e meccaniche. Nel corso del seguente elaborato si analizzeranno due diverse possibili applicazioni di questi nanomateriali nell’ambito della terapia antitumorale. La prima metodologia associa i nanotubi ad altre due strategie già affermate per il trattamento del cancro: la tecnica dell’inibizione del checkpoint e la fototerapia. Il secondo metodo sfrutta la proprietà dei nanotubi di essere funzionalizzati allo scopo di essere trasformati in vettori per la distribuzione dei farmaci antineoplastici. Queste potenziali applicazioni collidono con le teorie di alcuni esperti, secondo i quali i nanotubi di carbonio causano tumori polmonari. Per questo motivo si analizzeranno, nel corso del lavoro di tesi, test ed esperimenti condotti su roditori con il fine di verificare questo possibile effetto cancerogeno dei nanotubi di carbonio.

Una nuova generazione di nanogels (NGs) in poly(N-vinyl pyrrolidone) (PVP) è stata ottenuta mediante beta–irraggiamento (e-beam) ad alta energia mediante elettroni accelerati, che permette in tempi brevi la reticolazione di polimeri in soluzione acquosa, utilizzando acceleratori di particelle lineari. Oltre al controllo dimensionale, l’aspetto innovativo di tale tecnica è la possibilità di ottenere nanogels sterili, la cui funzionalizzazione di superficie avviene in un unico step. Inizialmente, è stata provata la loro biocompatibilità e non genotossicità in sistemi biologici, caratteristiche fondamentali per la loro applicazione in campo biomedico. Inoltre, sono stati messi a punto dei protocolli per la bioconiugazione delle nanoparticelle con diverse molecole, grazie alla presenza dei gruppi amminici e carbossilici reattivi presenti sulla loro superficie. Dopo aver coniugato i nanogels con delle sonde fluorescenti (isotiocianato di fluoresceina e ammino-fluoresceina), è stata valutata l’affinità dei nanogels per i sistemi biologici in vitro, verificando la loro capacità di oltrepassare le membrane biologiche. La famiglia di nanogels funzionalizzati con gruppi amminici è stata bioconiugata con un anticorpo monoclonale fluorescente, in grado di riconoscere e legare la glicoproteina di membrana CD44. Per riuscire ad avere un’attività di “addressing” sito-specifico, tali nanoparticelle sono state coniugate con l’anticorpo monoclonale fluorescente anti-beta3, che riconosce l’integrina alpha v-beta3. Tramite wound-healing assay su cellule endoteliali ECV304 è stato dimostrato il targeting attivo mediato da tali nanoparticelle. Inoltre, è stato dimostrato che il meccanismo di internalizzazione dei nanogels preferenziale sfrutta la macropinocitosi. Per quanto riguarda la famiglia di nanogels funzionalizzati con gruppi carbossilici, questi sono stati ingegnerizzati per il rilascio controllato di un farmaco chemioterapico, ossia la Doxorubicina. Il meccanismo d’azione pensato, sfrutta l’aumento dei livelli di glutatione presente nel citoplasma delle cellule tumorali, che risulta essere superiore rispetto a quello presente nelle cellule normali. L’efficenza del sistema proposto è stata studiata su cellule MC3T3-E1 non tumorali e su cellule Hela tumorali. Infine, sono stati fatti esperimenti preliminari di coniugazione dei nanogels con acidi nucleici, seguiti da studi di riconoscimento enzimatico, per un futura applicazione dei nanogels in terapie basate sul silenziamento genico.

Lo scopo di questo lavoro di tesi consiste nel valutare l’efficacia di inibizione delle HDAC e la selettività per le cellule tumorali di nuove molecole basate su coniugati poliamminici (PC1, PC2, PC3, PC4, PC5). I modelli sperimentali utilizzati saranno una linea cellulare tumorale di glioblastoma umano (U87), paragonata a una linea cellulare sana di fibroblasti fetali umani (IMR90). Il progetto nasce dalla collaborazione con la Prof.ssa Anna Minarini del Dipartimento di Farmacia e BioTecnologie di Bologna e con il Dott. Andrea Milelli del Dipartimento di Scienze per la Qualità della Vita di Rimini che hanno progettato e sintetizzato i composti poliamminici utilizzati negli esperimenti condotti nel laboratorio di Ingegneria Cellulare e Molecolare “S. Cavalcanti” a Cesena. Gli obiettivi del progetto consistono nel valutare i potenziali vantaggi che sembrano offrire le poliammine se coniugate a molecole con specifiche funzioni antitumorali, quali l’acido idrossamico e il gruppo intercalante il DNA, naftalene-diimide. L’aggiunta della coda poliamminica al composto, infatti, permetterebbe alla molecola risultante di sfruttare il sistema di trasporto delle poliammine, tipicamente sovraespresso o iperattivo nelle cellule neoplastiche, favorendo così l’ingresso in cellula del farmaco e conferendogli selettività per le cellule tumorali. Inoltre, l’affinità elettrostatica che intercorre tra la coda policationica poliamminica e il DNA, carico negativamente, direzionerebbe con maggior efficacia l’intera molecola, compresa la parte intercalante e l’acido idrossamico (HDACi), verso il loro bersaglio, la doppia elica dell’acido nucleico e le HDAC. Gli effetti dei PC valutati in questo lavoro di tesi comprendono l’influenza dei farmaci sulla vitalità cellulare e l’efficacia di inibizione delle HDAC. Si effettueranno test di crescita cellulare in seguito ai trattamenti farmacologici per confrontare i diversi composti poliamminici, individuare quelli con maggior effetto citotossico e stabilire se il tipo di trattamento risulti idoneo per il proseguimento dell’indagine. Il grado di inibizione delle HDAC, relativo ai diversi farmaci, verrà valutato indirettamente mediante la tecnica del Western Blotting quantificando il livello di iperacetilazione istonica globale indotta. I vantaggi che queste nuove molecole potenzialmente possiedono e che andranno verificati con ulteriori studi, inducono ad attribuire loro un grande potenziale per la terapia antitumorale, come induttori dell’apoptosi e/o riprogrammazione dell’assetto epigenetico, risultante nella riattivazione di geni oncosoppressori silenziati nelle cellule neoplastiche. L’azione antitumorale di queste molecole potrà essere più efficace se combinata con altri farmaci, quali chemioterapici standard o demetilanti del DNA. Inoltre la variazione della coda poliamminica potrà essere utile per lo sviluppo di inibitori specifici per le diverse isoforme delle HDAC. La selettività per le cellule tumorali e l’affinità per il DNA di questi nuovi composti potrebbe infine limitare gli eventuali effetti collaterali in clinica.

Malignant melanoma is an extremely aggressive tumour, which originates from the neoplastic transformation of melanocytes. The therapy of metastatic melanoma, whose incidence is dramatically increasing, continues to be a challenge since, regardless of the treatment approach used (chemotherapy, immunotherapy or immuno-chemotherapy), a long-term survival is quite uncommon. In an attempt to improve the effectiveness of the anticancer drugs currently available and to decrease their systemic toxicity, in addition to exploit some biochemical characteristics rather specific of the melanoma cells, a useful approach might be also the use of prodrugs, targeted to the tumor cells, that would release the active drug directly into the tumor mass and/or their surrounding extracellular environment. Aim of my Ph.D. work was the synthesis and the biological evaluation of three types of new compounds, designed as possible agents useful in an anti-melanoma therapy. The first compound, which we synthesized and tested, was a peptide-paclitaxel conjugate containing three functional domains: a “targeting domain”, an “activation sequence” and the cytotoxic agent paclitaxel. The “targeting domain”, whose function was to direct the conjugate to the tumour mass, was represented by a cyclic peptide containing the RGD sequence that can bind selectively the αVβ3 integrin, a surface molecule overexpressed by both metastatic human melanoma cells and endothelial cells of tumour vessels. The “activation sequence”, which should allow a selective release of paclitaxel within the tumour mass, was represented by a short peptide, substrate of cathepsin B (a lysosomal and pericellular protease highly up-regulated in malignant tumours, including human melanomas). The third functional domain consisted of the anticancer drug paclitaxel. The second type of prodrug, which we designed and tested, was a 4-mercaptophenol derivative, containing a butenone moiety, the 4-[(4-hydroxyphenyl)sulfanyl]-3-buten-2-one, obtained in its E and Z geometric isomers. This compound has been designed considering that: a) the 4-mercaptophenol moiety would be a good substrate for tyrosinase, an enzyme expressed at high levels in melanoma cells, where it is involved in the biosynthesis of melanin, and able to oxidize a variety of natural and synthetic phenols, giving rise to alkylating and cytotoxic o-quinones; b) an α,β unsaturated side chain, reactive towards GSH (present in relatively high concentrations in melanoma cells) would decrease cellular antioxidant defense against the oxygen free radicals (ROS) generated as by-products during melanin synthesis, in normal as well in tumor cells. Therefore, our prodrug should act as a bifunctional agent, capable of generating cytotoxic o-quinone species (following its oxidation by tyrosinase) and reducing GSH levels. A third part of the present work has focused on the study of the naftoquinone alkannin and its two acetylated derivatives (1’-acetyl alkannin and 5,8,1’-triacetyl alkannin), as potential inhibitors of the human glutathione-S-transferase (GST) P1-1. This enzyme, which catalyzes the conjugation of GSH to a wide range of nucleophilic compounds, is expressed at high levels in many tumor cells, including melanoma cells, and is considered one of the factors responsible of tumor resistance towards anti-cancer agents. Therefore, a specific inhibitor of this enzyme could be useful in cancer therapy, making the tumor cells more sensitive to chemotherapeutic agents.
Il melanoma maligno è un tumore molto aggressivo, la cui incidenza è in costante aumento, che origina dalla trasformazione di cellule chiamate melanociti. La terapia del melanoma metastatico continua ad essere una difficile sfida, in quanto, indipendentemente dall’approccio terapeutico utilizzato (chemioterapia, immunoterapia o immuno-chemioterapia), i soggetti affetti raramente presentano una sopravvivenza a lungo termine. Per migliorare l'efficacia dei farmaci antitumorali attualmente disponibili e per diminuirne la tossicità sistemica, oltre a sfruttare alcune caratteristiche biochimiche relativamente specifiche delle cellule tumorali, e del melanoma in particolare, un approccio utile potrebbe anche essere quello di indirizzare verso le cellule tumorali dei profarmaci, che rilascino il farmaco attivo direttamente all’interno della massa tumorale e/o nel loro intorno extracellulare. I risultati riportati in questa tesi si riferiscono alla sintesi e alla valutazione biologica di tre nuovi tipi di composti progettati in questa ottica verso le cellule di melanoma. Il primo composto studiato è stato un coniugato peptidico del paclitaxel contenente tre domini funzionali: un dominio di "indirizzamento", una sequenza di "attivazione" e il paclitaxel, appunto, quale agente citotossico. Il dominio di “indirizzamento", la cui funzione era quella di dirigere il coniugato verso la massa tumorale, era rappresentato da un peptide ciclico contenente la sequenza RGD, in grado di legarsi selettivamente e con alta affinità all’integrina αVβ3, una molecola di superficie sovra-espressa sia dalle cellule di melanoma che dalle cellule endoteliali dei nuovi vasi tumorali. La sequenza di “attivazione ", che avrebbe dovuto consentire un rilascio selettivo del paclitaxel all’interno della massa tumorale, era rappresentata da una sequenza peptidica substrato della catepsina B, una proteasi a localizzazione lisosomiale e associata a membrana, altamente sovraespressa in molti tumori, compreso il melanoma. Il terzo dominio funzionale era costituito dal farmaco antitumorale vero e proprio, cioè dal paclitaxel, il cui legame con il peptide - nelle aspettative - avrebbe dovuto causarne la momentanea inattivazione fino al momento della sua effettiva liberazione in sede tumorale. Il secondo profarmaco testato è stato un derivato del 4-mercaptofenolo contenente una catena laterale butenonica, il 4-[(4-idrossifenil)sulfanil]-3-buten-2-one, ottenuto nei suoi due isomeri geometrici E e Z. Questo composto è stato progettato considerando che: a) la parte derivata dal 4-mercaptofenolo avrebbe dovuto essere un buon substrato per l’enzima tirosinasi (TYRase), un enzima espresso ad alti livelli nelle cellule di melanoma, perchè coinvolto nel processo di biosintesi della melanina, e in grado di ossidare una varietà di fenoli naturali e di sintesi, dando luogo a forme alchilanti e citotossiche come gli o-chinoni; b) la catena laterale butenonica (α,β insatura), essendo dotata di elevata reattività nei confronti del GSH, presente in concentrazioni relativamente elevate nelle cellule di melanoma, avrebbe dovuto sottrarre GSH alla cellula stessa, indebolendone di fatto le difese antiossidanti nei confronti dei radicali liberi dell’ossigeno (ROS) che si generano, come sottoprodotti, durante la sintesi di melanina sia in cellule normali che tumorali. Nelle aspettative, il profarmaco così progettato si sarebbe dovuto comportare come un agente bifunzionale in grado di formare o-chinoni citotossici in seguito alla sua ossidazione da parte della tirosinasi e in grado di ridurre al tempo stesso i livelli di GSH. Infine, un terzo approccio ha riguardato lo studio dell’alcannina (colorante naturale a struttura naftochinonica) e di due suoi derivati acetilati, quali possibili inibitori dell’enzima umano glutatione-S-transferasi (GST) di tipo P1-1, enzima espresso ad alti livelli in molti tumori tra cui appunto il melanoma. GSTP1-1 è un enzima coinvolto nel metabolismo di fase II degli xenobiotici, in quanto catalizza la coniugazione del GSH ad una vasta gamma di composti nucleofili, ma esso è anche ritenuto uno dei fattori promuoventi la farmaco-resistenza del tumore. Un inibitore specifico di questo enzima potrebbe essere quindi estremamente utile in una terapia antitumorale, rendendo le cellule tumorali più sensibili agli agenti chemioterapici.

A LDE é uma nanoemulsão rica em colesterol com composição semelhante às lipoproteínas naturais. Devido a sua capacidade de ligação aos receptores da lipoproteína de baixa densidade (LDL) cuja expressão é aumentada em células neoplásicas, a LDE pode ser usada como veículo de agentes quimioterápicos concentrando os mesmos no tecido tumoral. A base racional da quimioterapia combinada é utilizar medicamentos que atuem em diferentes partes dos processos metabólicos da célula, aumentando dessa forma a probabilidade de destruição de uma maior quantidade de células tumorais. O principal fator limitante do uso combinado dos quimioterápicos paclitaxel e etoposídeo é o efeito mielossupressor. O direcionamento específico do fármaco às células tumorais promovido pela LDE, tornaria possível a terapia antitumoral combinada LDE-oleato de paclitaxel e LDEoleato de etoposídeo, sem produzir os efeitos colaterais observados com o uso combinado das formulações comerciais. O presente estudo tinha como objetivo avaliar os efeitos da terapia antitumoral combinada LDE-oleato de paclitaxel e LDEoleato de etoposídeo em comparação com a terapia dos respectivos fármacos isoladamente, bem como com a terapia combinada do paclitaxel e etoposídeo comerciais. A atividade antitumoral foi determinada em camundongos portadores de melanoma após a administração de intraperitoneal de LDE-oleato de paclitaxel 15 mg/kg e LDE-oleato de etoposídeo 10 mg/kg. Nos grupos dos fármacos comerciais injetou-se paclitaxel 3,75 mg/kg e etoposídeo 2,5 mg/Kg, ou paclitaxel 7,5 mg/Kg e etoposídeo 5 mg/kg. Os fármacos foram administrados em dois esquemas terapêuticos: 11º, 13º, 15º; e 11°, 14°, 19° dias após a inoculação do tumor. Todos os grupos apresentaram aumento na taxa de sobrevida em comparação ao grupo controle. Por outro lado, nos grupos LDE-fármacos foi observada uma redução dos efeitos de mielossupressão, visto que as doses administradas nestes grupos foram 2 e 4 vezes maiores do que nos demais. Os tratamentos do melanoma nos dois protocolos terapêuticos mostraram-se eficazes na redução da massa tumoral, sendo seu efeito inibitório acima de 90% nos grupos LDE-fármacos e na combinação dos quimioterápicos comerciais de maior dose. O número de metástases foi menor nos grupos de combinação LDE-Fármacos. Os resultados mostraram que a terapia antitumoral combinada LDE-oleato de paclitaxel e LDE-oleato de etoposídeo foi mais eficaz que as terapias isoladas destes fármacos e que a terapia combinada com o paclitaxel e etoposídeo comerciais.
LDE is a cholesterol-rich emulsion with similar composition to the natural lipoproteins. Due to its ability of binding to the Low Density Lipoprotein (LDL) receptors and concentrate in neoplastic cells which present overexpression of these receptors, LDE may be used as vehicle to target antineoplastic drugs against cancer cells. Combined chemotherapy is a therapeutic strategy against cancer that usually uses drugs that act in different parts of cells metabolism, increasing the chances of destruction of the cancer cells. In addition, adverse effects can be reduced when combining agents with different toxicities at lower doses than the usual in single therapy. The major limiting factor in combining the chemotherapeutic agents paclitaxel and etoposide is their side effects such as leukopenia, thrombocytopenia and anemia. The ability of LDE to carry the drug into the cell may bring a strong possibility of combining LDE- paclitaxel oleate and LDE-etoposide oleate without producing the toxic effects observed in the combined use of the commercial formulations of these drugs. The current study was designed to evaluate the effects of combined antitumoral therapy of LDE- paclitaxel oleate and LDE-etoposide oleate in comparison to the combination of commercial paclitaxel and etoposide formulations and to the single therapy with the same LDEagents. Antitumoral activity was determined in melanoma-bearing mice after injection of LDE-paclitaxel oleate 15 mg/kg and LDE-etoposide oleate 10 mg/kg, or commercial paclitaxel 3.75 mg/kg and etoposide 2.5 mg/kg, or commercial paclitaxel 7,5 mg/kg and etoposide 5 mg/kg. Drugs were administered in two protocols: 11º, 13º, 15º; and 11°, 14°, 19° days after tumor implantation. All groups had an increase in the survival rate in comparison to the control group, however LDE combination groups showed reduction in the bone marrow toxicity, since the doses used were 2 and 4 fold greater that in the commercial drugs groups. The tumor growth inhibition rate was greater in both LDE-drugs combination groups and in the higher dosage of paclitaxel and etoposide combination (over 90% in comparisson to the control). There were also great reduction of metastatic nodes in LDE-drugs combination groups in comparison to the commercial drugs combination groups. Our results showed that the antitumor combined therapy of LDE-paclitaxel oleate and LDE-etoposide oleate was more effective than the therapies with LDE-paclitaxel oleate and LDE-etoposide oleate alone, and the combined therapy of commercial paclitaxel and etoposide formulations.

Considerando la importancia del cáncer en Chile y en el mundo, es necesario planear estrategias para estudiar y controlar esta enfermedad. Sin embargo, es difícil tener un pronóstico y tratamiento precisos del cáncer, debido a la complejidad del crecimiento de tumores y a la respuesta altamente variable de paciente en paciente. Por esta razón, es necesaria la identificación de biomarcadores del cáncer y su simulación numérica en un modelo apropiado para este sistema biológico. El objetivo del presente trabajo es proponer un nuevo modelo matemático multiescala, lo suficientemente estable con respecto a los valores de los parámetros, y lo suficientemente robusto para predecir el crecimiento de tumores acoplado con angiogénesis tumoral y con el uso de terapias antineoplásicas. A partir de trabajos anteriores del tema se obtienen las hipótesis esenciales que describen la evolución de la enfermedad y con esto se propone un sistema de ecuaciones en derivadas parciales que incorpora las nociones de quimiotaxis de manera de describir la competencia entre el déficit de nutrientes y la aparición de nuevos vasos sanguíneos. Los efectos de una terapia mixta son también uno de los ejes centrales de la modelación, lo cual se hace basado en protocolos aprobados por la U.S. Food and Drug Administration. Desde el punto de vista de la calibración del modelo se puede establecer que dos de tres estimadores se ajustan a la literatura actual (tiempo de explosión de la neoplasia y distribución de capas celulares), mientras que las diferencias en el tercero de ellos (total de células en la neoplasia) se puede justificar por la inclusión de las densidades de células que forman los vasos sanguíneos en el balance de masas. Respecto a los resultados se establece que efectivamente el tratamiento retrasa la vascularización de la enfermedad, pero, que los efectos de químicos antiproliferación no se ajustan a la realidad dejando un margen de mejora de las ecuaciones. Se deja explícito que mediante la experimentación real con cantidades celulares el modelo puede ser contrastado y evaluado de mejor manera, sin embargo, los resultados permiten decir que se va por un camino correcto para entender desde un prisma matemático la enfermedad.

Mestrado em Bioquímica - Métodos Biomoleculares
A unidade estrutural uracilo é uma estrutura promissora para a descoberta de novos agentes terapêuticos, uma vez que apresenta uma diversificada atividade biológica. Os derivados de uracilo substituídos na posição C-5, entre os quais se destaca o 5-fluorouracilo, apresentam atividade antitumoral significativa. De igual modo os derivados porfirínicos têm sido amplamente estudados como fotossensibilizadores em terapia fotodinâmica (PDT), destacando-se entre os naturais a clorofila a, precursora de alguns agentes como é o caso da clorina e6 e da feoforbida a. A conjugação de unidades de hidratos de carbono a outras moléculas tem demonstrado conferir-lhes solubilidade e seletividade para com determinadas células alvo, tornando estes conjugados adequados para administração intravenosa. Atualmente, já se encontram descritos alguns estudos envolvendo derivados de uracilo conjugados e ou fundidos a derivados porfirínicos e a hidratos de carbono. A conjugação destas moléculas poderá ser um meio para potenciar as propriedades fotossensibilizadoras dos derivados porfirínicos, tornando-os potenciais agentes terapêuticos para PDT antitumoral e antimicrobiana. A PDT tem-se destacado no tratamento de diversas doenças, particularmente no tratamento de tumores e infeções bacterianas. A ação fotodinâmica envolve a combinação da luz visível, oxigénio molecular e um fotossensibilizador, levando à formação de espécies reativas de oxigénio que induzem danos nos tecidos e consequentemente pode conduzir à morte celular. Neste trabalho, é descrita uma estratégia sintética para preparar novos derivados de clorofila a extraída da Spirulina maxima conjugada a diferentes unidades de uracil-alditóis, bem como a avaliação da atividade biológica destes conjugados, nomeadamente atividade antibacteriana e antitumoral. Os compostos preparados, 3 e 9a-c, foram caracterizados estruturalmente por espetrometria de massa e por RMN de 1H, tendo em alguns casos sido necessário recorrer a técnicas bidimensionais (COSY de 1H/1H), bem como por outras técnicas espetroscópicas. Para avaliação da atividade antibacteriana, selecionaram-se duas estirpes bacterianas: Staphylococcus aureus (Gram-positivo) e Escherichia coli (Gram-negativo). Os resultados obtidos mostraram que os compostos 3 e 9a, a uma concentração de 5,0 μM, inativaram eficientemente a bactéria S. aureus ( 7 log) após 180 min de irradiação com luz branca a uma irradiância de 2,7 mW.cm-2. Os compostos 9b e 9c, nas mesmas condições experimentais de irradiação, foram menos eficazes mostrando uma redução da abundância bacteriana de apenas cerca de 2 log. No ensaio com E. coli verificou-se que nenhum dos compostos estudados, 3 e 9a, foram capazes de inativar a bactéria de Gram-negativo. Nos estudos da avaliação da atividade antitumoral foram selecionadas duas linhas celulares da próstata humana, PNT-2 e PC-3. Os compostos 9a e 9b foram testados a uma concentração de 0,1; 1,0 e 10 μM, tendo sido incubados durante 4 h no escuro e irradiados durante 20 min com luz vermelha a uma irradiância de 1,28 mW.cm-2. Ambos os compostos, na concentração de 10 μM, foram capazes de reduzir a viabilidade das células cancerígenas PC-3, mas também das células pré-neoplásicas (PNT-2). O composto 9a consegue ainda reduzir as células PC-3 de forma significativa na concentração de 1,0 μM. No estudo preliminar de uptake intracelular do composto 9a observou-se não existir uma diferença significativa na concentração intracelular entre as linhas PNT-2 e PC-3 ao fim de 4 h de incubação. Os estudos biológicos realizados permitem concluir que a eficiência dos compostos para inativar S. aureus é dependente da unidade de açúcar utilizado (o derivado conjugado com a xilose é melhor PS do que os derivados de galactose e glucose), mas não parece ser determinante para reduzir a viabilidade das células do cancro da próstata (PC-3) na concentração de 10 μM.
Uracil is considered a lead compound, since it has been used as an important platform for chemical modifications in order to improve and to diversify its biological activity. C-5 substituted uracil derivatives, among which the 5-fluorouracil outstands, exhibits relevant antitumoral activity. Among the natural porphyrin derivatives, chlorophyll a is the precursor of some photosensitizing agents in photodynamic therapy (PDT), such as chlorin e6 and pheophorbide a. The conjugation of carbohydrates moieties to other molecules has been shown to confer solubility and selectivity to the new entities to target cells, making these conjugates suitable for intravenous administration. Currently, some studies involving uracil derivatives conjugated to and/or fused to porphyrin derivatives and carbohydrates are described in literature. The conjugation of these molecules may be used to potentiate the photosensitizing properties of the porphyrin derivatives, making them potential therapeutic agents for antitumor and antimicrobial PDT. PDT has been used with success in the treatment of various diseases, particularly in the treatment of tumors and bacterial diseases. Photodynamic action involves the combination of visible light; molecular oxygen and a photosensitizer, leading to the formation of reactive oxygen species, which will induce tissue damage and consequently leads to cell death. In this study, we report an efficient access to new derivatives of chlorophyll a, extracted from Spirulina maxima, bearing different uracil-alditols moieties, as well as the evaluation of their antibacterial and antitumoral activity. The prepared compounds, 3 and 9a-c, were structurally characterized by mass spectrometry and by 1H NMR recurring to mono- and bidimensional techniques (COSY 1H/1H ), and other spectroscopic techniques. To evaluate the antibacterial activity, two bacteria strains, Staphylococcus aureus (Gram-positive strain) and Escherichia coli (Gram-negative strain) were selected. The results showed that compounds 3 and 9a, at a concentration of 5.0 μM, were able to inactivate efficiently the S. aureus bacterium ( 7 log) after 180 min of irradiation with white light at an irradiance of 2.7 mW.cm-2. Compounds 9b and 9c, under the same experimental conditions, were much less efficient showing a reduction of only 2 log. In the E. coli assay it was found that none of the studied compounds 3 and 9a, were able to photoinactivate Gram-negative bacterium. In the antitumoral activity evaluation studies, two human prostate cell lines, PNT-2 e PC-3, were selected. Compounds 9a and 9b were tested at a concentration of 0.1, 1.0 and 10 μM, and incubated for 4 h in the dark and irradiated for 20 min with red light at an irradiance of 1.28 mW.cm-2. Both compounds, at a concentration of 10 μM, were able to reduce the viability of PC-3 cancer cells and pre-malignant cells (PNT-2). Compound 9a was further able to significantly reduce PC-3 cells at a concentration of 1.0 μM. In the preliminary intracellular uptake study of compound 9a, there was no significant difference in intracellular concentration between the PNT-2 and PC-3 cell lines after 4 h of incubation. These conducted studies allow us to conclude that the efficiency of the compounds to photoinactivate S. aureus is dependent on the sugar moiety (the xylose derivative is better PS than the galactose and glucose derivatives), but does not seem be determinant to reduce the viability of prostate cancer cells (PC-3) at a concentration of 10 μM.

O presente estudo teve como objetivo investigar se existe uma correlação entre ansiedade, depressão e níveis séricos de citocinas de pacientes com câncer colorretal em diferentes estágios da terapia antitumoral. Para tanto, utilizamos um total de 100 indivíduos, divididos em cinco grupos amostrais. Grupo 1. Voluntários saudáveis livres de qualquer doença psiquiátrica ou associada com alterações do sistema imune (n=20); Grupo 2. Pacientes com diagnóstico de adenocarcinoma colorretal confirmado e que não foram submetidos à ressecção cirúrgica (n=20); Grupo 3. Pacientes submetidos à ressecção cirúrgica e que não iniciaram a terapia adjuvante (n=20); Grupo 4. Pacientes em tratamento quimioterápico há cerca de 3 meses, independentemente do esquema de quimioterapia aplicado (n=20); Grupo 5. Pacientes que concluíram o esquema de quimioterapia adjuvante há cerca de 6 meses (n=20). Depressão e ansiedade foram analisados utilizando Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS) e níveis séricos de IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-?, TGF-? e Fractalcina foram mensurados por CBA. Níveis clinicamente relevantes de ansiedade e/ou depressão foram verificados em todos os pacientes com CCR em diferentes estágios da terapia antitumoral. Um padrão de produção semelhante foi observado para as citocinas pró-inflamatórias avaliadas. IL-1, IL-6, IL-8, TNF-? e Fractalcina foram encontradas em níveis elevados nos pacientes com CCR em estágio pré (G2) e pós-operatório (G3). Estes níveis foram, contudo, reduzidos durante (G4) e após (G5) o tratamento quimioterápico. Além disso, verificamos níveis diminuidos de IL-10 no soro dos pacientes dos grupos 2 e 3 (pré e pós-operatório). Ao analisarmos a correlação entre a pontuação HADS e os níveis séricos de citocinas, observamos uma associação positiva de ansiedade e/ou depressão com as concentrações de IL-1, IL-6, IL-8, TNF-? e Fractalcina e negativa com IL-10 em pacientes nos diferentes estágios da terapia antitumoral. Estes resultados indicam haver uma importante correlação entre os níveis séricos de citocinas pró-inflamatórias, ansiedade e depressão em pacientes com câncer colorretal, sugerindo que tais citocinas estão envolvidas na patofisiologia dessas comorbidades
This study aimed to investigate whether there is a correlation between anxiety, depression and serum cytokine levels in colorectal cancer in different stages of the antitumor therapy. A sample of 100 subjects was divided in 5 groups. Group 1: Healthy volunteers free of any psychiatric or immune system disease (n=20); Group 2: Patients with colorectal cancer who did not undergo surgical resection (n=20); Group 3: Patients who underwent surgical resection and who did not start adjuvant therapy (n=20); Group 4: Patients undergoing chemotherapy for about 3 months, regardless of chemotherapy protocols applied (n=20); Group 5: Patients who have completed adjuvant chemotherapy regimen for about 6 months (n=20). Depression and anxiety were analyzed using the Hospital Anxiety and Depression Scale (HADS), and serum levels of IL-1, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, TNF-?, TGF-?, and Fractalkine were measured by CBA. Clinically relevant levels of anxiety and/or depression were found in all CRC patients in different stages of the antitumor therapy. A similar pattern of production was observed for proinflammatory cytokines. Elevated levels of IL-1, IL-6, IL- 8, TNF-?, and Fractalkine were found in CRC patients in pre (G2) and postoperative (G3) stages. However, these levels were reduced during (G4) and after (G5) chemotherapy. Furthermore, we found decreased levels of IL-10 in serum of patients in CRC patients in pre and postoperative stages. By analyzing the correlation between HADS scores and serum cytokine levels, we observed a positive association of anxiety and/or depression with the concentrations of IL-1, IL-6, IL-8, TNF-?, and Fractalkine, and negative with IL-10 in patients in different stages of the antitumor therapy. These results indicate an important link between serum levels of proinflammatory cytokines, anxiety and depression in CRC patients, suggesting that such cytokines are involved in the pathophysiology of these comorbidities

[EN] This thesis is divided in two parts covering the fields of medicinal chemistry and science materials, respectively. In the first part, the semisynthesis of new derivatives of the antitumor drug 20-(S)-Camptothecin (CPT) and its biological properties, in terms of antitumor activity, stability and oral bioavalability are developed. More specifically, the application of the Tscherniac-Einhorn (T-E) reaction is described as an effective and high performance methodology to obtain a wide variety of novel lipophilic 9-amidomethylCPT and 9-imidomethylCPT derivatives. The results showed that the introduction of bulky aliphatic imide moiety in position 9, with the methoxylation of the C-10, provides an improvement of the in vitro and in vivo antitumor activity and two-times more oral permeability comparing with CPTs analogues clinically approved. Beyond the synthesis of new analogues, the T-E reaction is postulated as a useful pathway to activate position 9 with novel functionalities such as formylation and aminomethylation which have been previously reported with low or erratic yields. Within the area of semisynthetic procedures, the hexacyclic derivative, 9, 10-[1,3]-DioxoCPT was isolated quantitatively showing that the presence of cyclic acetal moiety improves the in vitro and in situ oral bioavailability keeping the antitumor activity ratio. In the second part of this thesis, within the interdisciplinary field of biology and science materials, the development of micro and mesoporous materials under biomimetic conditions is explained. The work of this section shows that small bifunctional molecules are available for the hydrolysis and condensation of silicon monomers while incorporating defined organic molecules that work as structure directing agents (SDA) leading mesostructured materials. Similarly to the biological process developed by silicateins, the mixture of ethanolamine and tromethamine simulates the active center of these proteins by a synergic combination of the buffering and the catalytic activity working at neutral pH, atmospheric pressure and in absence of external energy source. Thus, ZSM5 and MCM41 type materials, with high interest in various industrial applications, are obtained by a sol-gel process at neutral pH in opposition to the standar method based on strong acid or alkaline conditions. The possibilities of this methodology to insert active metal centers were tested in terms of catalytic activity in Meerwein-Ponndorf-Verley reaction and epoxidation reaction of cyclohexene. The results showed similar conversion rates comparing to materials synthesized under standard conditions.
[ES] La presente Tesis Doctoral esta dividida en dos partes que abarcan los campos de la química médica y la ciencia de los materiales respectivamente. En la primera parte se desarrolla la obtención de nuevos derivados del agente antitumoral 20-(S)-Camptotecina (CPT) y el estudio de sus propiedades biológicas en términos de actividad antitumoral, estabilidad y biodisponibilidad oral. Más concretamente se ha descrito la aplicación de la reacción de Tscherniac-Einhorn (T-E) como una metodología efectiva y de alto rendimiento para la obtención de una extensa variedad de derivados 9-amidometílicos y 9-imidometílicos de alto carácter lipofílico. Los resultados obtenidos mostraron que la introducción de un grupo alifático voluminoso tipo imida, en posición 9, junto con la metoxilación de la posición 10, proporcionaba elevada actividad antitumoral in vitro e in vivo y duplicaba los valores de absorción intestinal dentro de los ensayos de biodisponibilidad oral en comparación con derivados de CPT clínicamente aprobados. Más allá de la síntesis de nuevos análogos, la reacción de T-E se postula como una metodología eficaz para proporcionar nuevas funcionalizaciones en la posición 9, por ejemplo, se obtienen formilaciones o aminometilaciones con altos rendimientos frente a otras rutas sintéticas menos eficientes o erráticas para este tipo de modificaciones. Dentro de los procesos semisintéticos planteados, el derivado hexacíclico 9,10-[1,3]-DioxoCPT es sintetizado de forma cuantitativa, mostrando que la presencia del acetal cíclico mejora sustancialmente la permeabilidad del agente, tanto in vitro como in situ, manteniendo los rangos de actividad antitumoral. En la segunda parte de la presente Tesis Doctoral, dentro del campo interdisciplinar entre la biología y la síntesis de materiales, se ha desarrollado la síntesis de materiales micro- y mesoporosos en condiciones biomiméticas. El trabajo desarrollado en esta sección demuestra que moléculas pequeñas bifuncionales son capaces de hidrolizar y condensar monómeros de silicio, incorporando al mismo tiempo moléculas orgánicas capaces de actuar como agentes directores de estructura (ADS) dando lugar a materiales mesoestructurados. Al igual que el proceso biológico desarrolla la formación de estructuras inorgánicas mediante las proteínas conocidas como silicateinas, la mezcla de etanolamina y trometamina, simulan el mecanismo del centro activo de estas mismas proteínas, mediante una combinación sinérgica, donde la actividad tamponadora y catalítica es efectiva a la hora de incorporar y ordenar ADS en condiciones de pH neutro, presión atmosférica y en ausencia de fuente de energía externa. De esta manera, materiales micro- y mesoporosos tipo ZSM5 o MCM41, de alto interés en diferentes aplicaciones industriales, son obtenidos mediante un procedimiento sol-gel a pH neutro en oposición a las metodologías estándar que requieren condiciones fuertemente ácidas o alcalinas para la hidrólisis de los precursores de silicio. Las posibilidades de dicha metodología para la incorporación de centro activos metálicos fueron ensayadas en términos de actividad catalítica en reacciones tipo Meerwein-Ponndorf-Verley y reacciones de epoxidación de ciclohexeno. Los resultados mostraron porcentajes de conversión similares a los obtenidos con materiales sintetizados en condiciones convencionales.
[CAT] La present Tesi Doctoral està dividida en dues parts que comprenen els camps de la química mèdica i la ciència dels materials, respectivament. En la primera part es desenvolupa l'obtenció de nous derivats de l'agent antitumoral 20-(S)-Camptotecina i l'estudi de les seues propietats biològiques en terms d'activitat antitumoral, estabilitat i biodisponibilitat oral. Més concretament s'ha descrit l'aplicació de la reacció de Tscherniac-Einhorn (T-E) com una metodologia efectiva i d'alt rendiment per a l'obtenció d'una extensa varietat de derivats 9-amidometilats i 9-imidometilats d'alt caràcter lipofilic. Els resultats obtinguts van mostrar que la introducció d'un grup alifàtic voluminós, tipus imida, en posición 9, junt amb la metoxilació de la posició 10, proporcionava elevada activitat antitumoral in vitro i in vivo i duplicava els valors d'absorció intestinal dins dels assajos de biodisponibilitat oral en comparació amb els derivats de CPT clínicament aprovats. Més enllà de la síntesi de nous anàlegs, la reacció de T-E es postula com una metodologia eficaç per a proporcionar noves funcionalitzacions en la posició 9, per exemple, s'obtenen formilacions o aminometilacions amb alts rendiments enfront d'altres rutes sintètiques menys efectives o erràtiques. Dins dels procesos semisintètics plantejats, el derivat hexaciclic 9,10-[1,3]-DioxoCPT es sintetitzat de forma quantitativa, mostrant que la presència de l'acetal cíclic millora substancialment la permeabilitat del fàrmac, tant in vitro com in situ, mantenint els rangs de activitat antitumoral de la CPT. En la segona part de la present Tesi Doctoral, dins del camp interdiciplinari entre la biología y la ciencia dels materials, s'ha desenvolupat la síntesi de materials micro i mesoporosos en condicions biomimètiques. El treball desenvolupat en aquesta secció demostra que molècules bifuncionals son capaços d'hidrolitzar i condensar monòmers de silici, incorporant al mateix temps molècules orgàniques capaces d'actuar com agents directors d'estructura (ADS) donant lloc a materials mesoestructurats. De la mateixa forma que el procés biològic desenvolupa la formació d'estructures inorgàniques per mitjà de les proteïnes conegudes com silicateines, la mescla d'etanolamine i trometamine, simulen el mecanisme del centre actiu d'aquestes mateixes proteïnes mitjançant una combinació sinèrgica, on l'activitat tamponadora i catalítica és efectiva a l'hora d'incorporar i ordenar ADS en condicions de pH neutre, pressió atmosfèrica i en absència de font d'energia externa. D'aquesta manera, materials micro- i mesoporosos tipus ZSM5 o MCM41, d'alt interés en diferents aplicacions industrials, són obtinguts per mitjà d'un procediment sol-gel a pH neutre en oposició a les metodologies estàndard que requereixen condicions fortament àcides o alcalines per a la hidrólisis dels precursors de silici. Les posibilitats d'aquesta metodología per a la incorporació de centres actius metàl¿lics van ser assajades en termes d'activitat catalítica en reaccions tipus Meerwein-Ponndorf-Verley i reaccions d'epoxidació de ciclohexen. Els resultats van mostrar percentatges de conversió semblants als obtingunts amb els materials sintetitzats en condicions convencionals.
Rodríguez Berna, G. (2016). Estudios semisintéticos y biológicos de 20-(S)-Camptotecina en terapia antitumoral y obtención de materiales porosos en condiciones biomiméticas [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/62158
TESIS

The development of immunotherapy for cancer has long been a challenge. Although multiple clinical trials have resulted in the development of measurable immune responses only a minority of patients has experienced clinical benefit, such as tumor regression. The use of a transgenic attenuated Trypanosoma cruzi strain (CL-14) as a vaccine vector expressing the cancer testis antigen NY-ESO-1 (CL-14-NY-ESO-1), proposed by our group, was able to prevent tumor growth in a vaccine model. Here we report that CL-14-NY-ESO-1 induces both memory effector and effector CD8+ T lymphocytes that efficiently prevent tumor development. Additionally, the better prognosis correlates with the high production of cytokines IFN- and IL-2 and the presence of greater numbers of specific cells against tumor including cells with cytotoxic profile. However, the therapeutic effect of such vaccine is rather limited. To increase T cell response induced by transgenic parasite we propose, in therapeutic protocol, the blockade of inhibitory signals mediated by Cytotoxic T Lymphocyteassociated Antigen 4 (CTLA-4). The results show the enhanced of the frequency of NY-ESO- 1-specific effector CD8+ T cells producing IFN-, and promote lymphocyte migration to the tumor infiltrate. As a result, therapy with CL-14-NY-ESO-1 associated with anti-CTLA-4 is highly effective in controlling the development of an ongoing melanoma.
O desenvolvimento da imunoterapia contra o câncer é um grande desafio. Embora vários estudos clínicos resultaram no desenvolvimento de resposta imune mensuráveis, apenas uma minoria dos pacientes obtiveram beneficio clínico, tal como a regressão tumoral. A utilização de uma cepa atenuada do Trypanosoma cruzi (CL-14) como vetor vacinal expressando o antígeno cancer testis NY-ESO-1 (CL-14-NY-ESO-1), proposta pelo nosso grupo, foi capaz de prevenir o crescimento do tumor em um modelo profilático. Neste trabalho nós elucidamos que o CL-14-NY-ESO-1 promove a formação de ambos linfócitos T CD8+ de memória efetora e efetores, que impedem eficazmente o desenvolvimento do tumor. Além disso, o melhor prognóstico correlaciona com a alta produção das citocinas IFN- e IL-2 e a presença de maior número de células específicas contra o tumor, inclusive células com perfil citotóxico. No entanto, o efeito terapêutico de tal vacina é bastante limitado. A fim de prolongar a resposta efetora induzida pelo CL-14-NY-ESO-1 nós propomos, em um protocolo terapêutico, o bloqueio dos sinais inibitórios mediados pelo Antígeno Associado ao Linfócito T citotóxico-4 (CTLA-4). Os resultados demonstram o aumento da frequência das células T CD8+ específicas contra o tumor, das células T produtoras de IFN- e ainda a promoção da migração dos linfócitos para o infiltrado tumoral. Como resultado, a terapia com CL-14-NYESO- 1 associado com o anti-CTLA-4 é altamente eficaz no controle do desenvolvimento de melanoma em curso.

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Among the main alternatives for cancer treatment, chemotherapy is one of them, but most chemotherapeutic agents act nonspecifically, damaging several types of body cells. DNA intercalators are standout among the existing chemotherapeutics, for example, among these compounds, acridine derivatives have inhibitory activity against nuclear regulatory enzymes, such as topoisomerase, and there is a strong interaction with pairs of DNA bases. Therefore, researchers are seeking to find new candidates intercalators of DNA drugs and a significant number of molecules have been evaluated for their antitumor and intercalators properties. This paper proposed the synthesis of novel spiro-acridines derivatives; it was conducted to evaluate their interaction with BSA, DNA, and inhibition of the enzyme topoisomerase IIα. Thus, eleven new spiro-acridínicos compounds were synthesized and were determined their physicochemical characteristics and demonstrated the possible reaction mechanisms for obtaining these compounds. The compounds were obtained in parallel and convergent manner, initially the diphenylamine suffered an acylation followed by cyclization, leading to 9-metilacridina that by successive reactions led to 9-carboxaldehyde acridine. In parallel, 2- cianoacetohidrazina reacted with aromatic aldehydes substituted in acid and ethanol, leading to N-acylhydrazones intermediates substituted, finally, the two intermediates were condensed, through a Knovenagel reaction and suffered spontaneous cyclization, leading to spiro-acridine derivates. The compounds show yields ranging from 24% to 86.75%, and melting points ranging between 3 and 5 °C. Most of the compounds were characterized and had their chemical structures elucidated by spectroscopic H-NMR and C-NMR; IR and MS. By 1^H NMR analysis were observed singlets referring to NH, protons coming from the formation of the C = N bond (imino carbon) and C = C (vinyl carbon) corroborating the structural elucidation of all compounds. The 13^C NMR spectra showed the absorptions of carbon atoms characteristic of spiro-acridine derivatives, especially the chemical shift showed by the quaternary carbon evidenced on the signals from 69.33 to 71.59, demonstrating the occurrence of spontaneous cyclization of spiro-acridine derivatives. The compounds evaluated against the enzyme Topoisomerase IIα, presented different degrees of inhibition when compared with the mAMSA standard, and AMTAC 06 presented the best capacity for inhibition. The compounds that interacted with the DNA showed binding constants (Kb) 10^5M^-1, thus suggesting that the likely mechanism of action of these compounds may be related to the formation of a ternary complex between compound, DNA and Topoisomerase. The interactions with the BSA showed that all compounds evaluated were able to cause fluorescence extinction in a dose-dependent manner, and AMTAC 14 showed the highest fluorescence extinction capacity, probably due to its electronic effects.
Uma das principais abordagens para o tratamento do câncer é a quimioterapia, porém a maioria dos agentes quimioterápicos atua de forma não específica, lesando vários tipos de células do organismo. Entre os quimioterápicos existentes, destacam-se os intercaladores de DNA, como por exemplo, os derivados de acridina que possuem atividade inibitória frente a enzimas reguladoras nucleares, como as topoisomerase, além de uma forte interação com pares de bases do DNA. Por isto, pesquisadores vêm buscando a descoberta de novos candidatos a fármacos intercaladores do DNA e um número expressivo de moléculas tem sido avaliado quanto às suas propriedades antitumorais e intercaladoras. Este trabalho propôs síntetizar novos derivados espiro-acridínicos, analisar a interação destes com o BSA, DNA e a inibição da enzima topoisomerase IIα. Assim, onze novos compostos espiro-acridínicos foram sintetizados e determinados as suas características físico-químicas e demonstrados os possíveis mecanismos reacionais para a obtenção destes compostos. Os compostos foram obtidos de forma paralela e convergente, onde inicialmente a difenilamina sofreu uma acilação seguido de ciclização, obtendo-se a 9-metilacridina que por sucessivas reações foi obtido a 9-carboxialdeido acridina. Em paralelo, a 2-cianoacetohidrazina reagiu com aldeídos aromáticos substituídos em meio ácido e etanólico, conduzindo aos intermediários N- acilidrazônicos substituídos, por fim os dois intermediários foram condensados, através de uma reação de Knovenagel e ciclizaram espontaneamente, conduzindo aos derivados espiro- acridínicos. Os compostos apresentaram rendimentos que variaram de 24% a 86,75% e as faixas de fusão oscilaram entre 3 e 5ºC. A maioria dos compostos tiveram suas estruturas químicas caracterizadas e elucidadas através de técnicas espectroscópicas de RMN de 1^H RMN de 13^C ; IV e EM. Através da análise do RMN de 1^H foram observados singletos referentes ao grupo NH, prótons oriundos da formação da ligação C=N (iminico) e C=C (vinílico) corroborando para a elucidação estrutural de todos os compostos. Os espectros de RMN de 13^C evidenciaram as absorções dos átomos de carbono característicos dos derivados espiro-acridinicos, principalmente o deslocamento que mostrou o carbono quaternário evidenciado nos sinais entre 69.33 a 71.59 o qual demonstra a ocorrência da ciclização espontânea dos derivados espiro-acridinicos. Os compostos avaliados frente a enzima Topoisomerase IIα, apresentaram diferentes graus de inibição quando comparados com o padrão mAMSA, sendo o AMTAC 06 o que apresentou a melhor capacidade de inibição. Os compostos que interagiram com o DNA apresentaram constantes de ligação (Kb) 10^5M^-1, sugerindo dessa forma que o provável mecanismo de ação desses compostos pode estar relacionado a formação de um complexo ternário entre composto, DNA e Topoisomerase. As interações com a BSA, mostraram que todos os compostos avaliados foram capazes de causar a extinção da fluorescência de forma dose-dependente, sendo o AMTAC 14 o que apresentou a maior capacidade de extinção da fluorescência, provavelmente devido aos seus efeitos eletrônicos.

Copper is an essential metal for our organism and it belongs to the group 11 in the periodic table. Thanks to its chemical and physical features it is an effective candidate within diagnostic imaging and antitumor therapy as radioactive isotope and metal complex, respectively. 64Cu is a β+ emitter radioactive isotope, ideal to be used in PET (Positron Emission Tomography) imaging. This technology allows to obtain body images in order to identify and quantify biological and biochemical in vivo processes. Several copper compounds were synthesized and studied but only one complex with a thiosemicarbazone ligand entered in clinical trial and no copper-64 compound is still put in the market. Copper is a much studied metal even as therapeutic agent, since its concentration is very high in tumor tissues and it is involved in the angiogenetic process associated to cellular growth. These remarks, with the cisplatin success as anticancer agent and the relative interest created around the chance to develop new therapeutic agents, led to design and synthesize copper complexes able to act selectively into the tumor tissue, even against cisplatin resistant cells and without systemic toxic effects. With the aim to design new chelating systems able to be used as diagnostic agents in nuclear medicine with the radioactive isotope 64Cu and as potential anticancer agents, a neutral square-planar [Cu(DTC-Ln)2] complexes library was developed where DTC = dithiocarbamate. Dithiocarbamates are ligands, just widely studied inside our research group, able to coordinate the metal center by means of two sulfur atoms. They have the chance to be conjugated with bioactive molecules in order to obtain potential specific target systems. Moreover, recently some dithiocarbamates showed to form spontaneously stable Cu(II) complexes, able to inhibit the proteasoma chymotrypsinic-like activity inducing apoptosis in several cancer cells. Therefore use of a very wide range of structurally different dithiocarbamate ligands has the aim to evaluate possible relationship between the chemical structure and the cytotoxic activity. The complexes were prepared with the application of several synthetic procedures using CuCl2•2H2O as starting material. The complexes were completely characterized via elemental analysis, spectroscopic techniques (IR and UV-Vis) and ESI(+) mass spectrometry. In vitro citotoxicity against several human cancer cells, resistant and not to cisplatin, was tested for all copper complexes. Then, coordination chemistry was transferred to a radioactive tracer level with the radionuclide copper-64 and it was evaluated if this labeling system could be applied as radiopharmaceutical. In particular, the synthetic procedures were optimized and labeling efficiency and in vitro stability were tested. Finally, a series of uptake experiments were performed with human breast cancer cells (MCF-7) both with the cold complexes and the analogous radioactive complexes in order to learn more about the accumulation patterns whereby this class of compounds shown its citotoxic activity. Also gallium presents chemical and physical characteristics which make it a very interesting metal both in diagnostics and in therapy. In fact, gallium-68 is a β+-emitter isotope which can be easily produced by means of a portable generator and it allows to obtain high quality PET images, comparable with PET images made with fluorine-18, the most used radionuclide in diagnostic imaging, and so gallium-68 gained an increasing interest for nuclear medicine applications. Several gallium complexes were synthesized and studied and some of these were very effective and they entered in clinical trial. But, despite these promising results, no gallium compound is still put in the market. Gallium is a very employed metal just in therapy, thanks to its anticancer properties and for many decades ordinary gallium salts are used as antitumor agents. The excellent results obtained led to the design of metal based complexes able to act selectively against cancer cells, without without systemic toxic effects. With the aim to project new chelating systems for a radiopharmacetical application with gallium-68 and to develop new anticancer agents a neutral [Ga(DTC-Ln)3] complexes library was prepared with dithiocarbamate ligands, chosen for their interesting properties, just listed above. The complexes were prepared with the application of several synthetic procedures using Ga(NO3)3•6H2O as starting material. The compounds were characterized by means of elemental analysis, spectroscopic techniques (IR, NMR) and X-ray diffraction. In vitro citoxicity was tested against two human cancer cell lines for some of these complexes and, finally, it was evaluated the yield of these compounds in pH dependence in order to perform some considerations before transferring coordination chemistry to a radioactive tracer level with gallium-68 which is obtained from the generator by means of an acid solution.
Il rame è un metallo essenziale per il nostro organismo appartenente al gruppo 11 della tavola periodica. Grazie alle sue caratteristiche chimiche e fisiche è un valido candidato nell'ambito della diagnostica per immagini come isotopo radioattivo e nella terapia antitumorale come complesso metallico. Il 64Cu è un isotopo radioattivo β+ emittente ottimo per essere utilizzato nella diagnostica per immagini di tipo PET. Questa tecnica permette infatti l'ottenimento di immagini del corpo umano allo scopo di identificare e quantificare in vivo processi biologici e biochimici. Diversi composti di rame sono stati sintetizzati e studiati ma solo un complesso con un legante tiosemicarbazone è entrato in fase avanzata di sperimentazione clinica e nessun prodotto a base di 64Cu è ancora stato immesso in commercio. Il rame risulta essere un metallo molto studiato anche in ambito terapeutico, dal momento che la sua concentrazione è particolarmente elevata nei tessuti tumorali ed è coinvolto nel processo di angiogenesi associato alla crescita tumorale. Queste osservazioni, unite al successo ottenuto dal cisplatino come agente antitumorale e al conseguente interesse nato attorno alla possibilità di sviluppare nuovi composti metallici come agenti terapeutici, hanno portato alla progettazione e alla sintesi di complessi di rame in grado di agire selettivamente a livello del tumore, senza effetti tossici a livello sistemico e attivi anche nei confronti di linee cellulari resistenti al cisplatino. Con l'obiettivo di progettare dei nuovi sistemi chelanti in grado di essere utilizzati da un lato a scopo diagnostico in medicina nucleare con l'utilizzo del isotopo radioattivo 64Cu e dall'altro a scopo terapeutico come potenziali antitumorali, è stata sviluppata una libreria di complessi neutri a geometria quadrato planare di Cu2+ con leganti bidentati del tipo [Cu(DTC-Ln)2] dove DTC = ditiocarbammato. I ditiocarbammati sono dei leganti, ampiamente studiati all'interno del nostro gruppo di ricerca, in grado di legare il metallo attraverso due atomi di zolfo, con la possibilità di essere derivatizzati con molecole biologicamente attive per ottenere dei potenziali sistemi target specifici. Recentemente, inoltre, alcuni ditiocarbammati hanno dimostrato di formare spontaneamente complessi stabili di Cu(II)(10), in grado di inibire l’attività chimotripsinica del proteasoma inducendo apoptosi in differenti tipi di cellule tumorali. L'utilizzo di una serie molto ampia di leganti ditiocarbammici strutturalmente diversi ha, quindi, l'obiettivo di valutare possibili relazioni tra la struttura chimica e l’attività citotossica. I complessi sono stati preparati attraverso l'applicazione di diverse vie sintetiche che utilizzano come materiale di partenza CuCl2•2H2O. I complessi ottenuti sono stati caratterizzati mediante analisi elementare, tecniche spettroscopiche (IR e UV-Vis) e spettrometria di massa ESI(+). Di tutti i composti ottenuti è stata testata la citotossicità in vitro nei confronti di linee cellulari tumorali resistenti e non al cisplatino, composto a base metallica di riferimento. Successivamente la chimica di coordinazione è stata trasferita a livello di tracciante con il radionuclide 64Cu ed è stato valutato se questo sistema di marcatura può essere applicato in ambito radiofarmaceutico. In particolare, sono state ottimizzate le procedure sintetiche ed è stata testata l’efficienza di marcatura e il profilo di stabilità in vitro del sistema. Infine sono stati effettuati una serie di esperimenti di uptake in cellule di tumore alla mammella MCF-7 sia con i composti non radioattivi che con gli analoghi radiomarcati allo scopo di approfondire i meccanismi di accumulo cellulare attraverso i quali questa classe di composti esplica la sua attività citotossica. Anche il gallio ha caratteristiche chimiche e fisiche che lo rendono un metallo molto interessante sia a livello diagnostico che terapeutico. Infatti, il 68Ga è un isotopo radioattivo β+ emittente che può essere facilmente prodotto mediante generatore portatile e consente di ottenere immagini PET di ottima qualità, paragonabili a quelle ottenute con il 18F isotopo attualmente di elezione nella diagnostica, riscuotendo un interesse sempre più elevato. Diversi complessi di gallio sono stati sintetizzati e studiati, alcuni sono risultati molto efficaci potendo così entrare in fase avanzata di sperimentazione clinica. Ma nonostante i promettenti risultati nessun composto è ancora stato immesso in commercio. Il gallio risulta essere un metallo molto impiegato anche in terapia, grazie alle sue proprietà antineoplastiche e da diversi decenni semplici sali di gallio sono utilizzati come antitumorali. Gli ottimi risultati ottenuti hanno portato alla progettazione di complessi metal based in grado di agire selettivamente a livello del tumore, senza effetti tossici a livello sistemico e attivi anche nei confronti di linee cellulari resistenti al cisplatino. Con l'obiettivo di progettare dei nuovi sistemi chelanti per una applicazione radiofarmaceutica con l’isotopo 68Ga da un lato e lo sviluppo di nuovi agenti antitumorali dall’altro, è stata sviluppata una libreria di complessi neutri di Ga3+ con leganti bidentati del tipo [Ga(DTC-Ln)3] con leganti ditiocarbammici, selezionati per le loro caratteristiche già elencate in precedenza. I complessi sono stati preparati attraverso l'applicazione di diverse vie sintetiche che utilizzano come materiale di partenza Ga(NO3)3•6H2O. I composti ottenuti sono stati caratterizzati mediante analisi elementare, tecniche spettroscopiche (IR, NMR) e diffrattometria ai raggi X. Di alcuni complessi è stata testata la citotossicità in vitro nei confronti di due diverse linee cellulari tumorali ed, infine è stata testata la resa di formazione dei complessi in funzione del pH al fine di eseguire delle valutazioni preliminari prima di trasferire la chimica di coordinazione a livello di tracciante con l’isotopo radioattivo 68Ga che viene eluito da generatore per mezzo di soluzione acida.

O melanoma maligno é a forma mais agressiva dos tumores cutâneos. Sendo o responsável por mais de 75% das mortes relativas á este tipo de câncer. O principal quimioterápico utilizado no tratamento do melanoma é a dacarbazina (DTIC), entretanto, as taxas de resposta são insatisfatórias. O composto DM-1 é um análogo estrutural da curcumina, e por esta razão possui propriedades biológicas semelhantes, como agente antiproliferativo e próapoptótico. A terapia de captura de nêutrons por boro (BNCT) atua por meio da deposição do isótopo 10Boro nas células tumorais e após a irradiação de nêutrons térmicos há produção de partículas alfa e lítio que destroem a célula. Neste trabalho estudou-se o mecanismo de ação destas três terapias, DTIC, DM-1 e BNCT no tratamento do melanoma e seus efeitos em células normais in vitro com a finalidade de obtenção de modalidades terapêuticas diferentes para o tratamento desta neoplasia. A IC50 foi obtida pela metodologia de MTT, além da análise da progressão do ciclo celular e marcadores de morte celular por citometria de fluxo. O composto DM-1 e a BNCT apresentaram efeito citotóxico seletivo para as linhagens de melanoma, com alta produção de radicais livres peroxidados. Nas mesmas condições, estes efeitos foram mínimos em células normais, diferente do tratamento com DTIC. Houve diminuição da proporção de matriz extracelular e colágeno solúvel sintetizado em células de melanoma tratadas com DM-1, BNCT e DTIC, entretanto, o quimioterápico ocasionou isoladamente diminuição também em células normais. O potencial elétrico mitocondrial das células de melanoma foi diminuído nos três protocolos de tratamento, assim como houve aumento na quantidade de DNA fragmentado. Este efeito não foi encontrado em células normais tratadas com DM-1 e BNCT. O composto DM-1 foi capaz de induzir apoptose via intrínseca e extrínseca, avaliado pela Anexina V e por marcadores de cinética e de morte celular. A terapia de BNCT induziu apoptose e necrose, indicando que esta terapia atua por diferentes vias em cada linhagem celular. BNCT e DM-1 induziram aumento na expressão dos marcados próapoptóticos, como Bax, citocromo c, caspase 3 e 8 clivadas, além de diminuir os valores na expressão de ciclina D1 e Ki-67, relacionados com a progressão do ciclo celular e proliferação. O quimioterápico DTIC apresentou alguns indícios de apoptose em células de melanoma, mas seus efeitos em células normais foram extensivos, ocasionando morte e parada do ciclo celular em melanócitos, células endoteliais e fibroblastos. O composto DM-1 apresentou formação de corpos apoptóticos, modificações no citoesqueleto e clivagem de caspase 9 e Parp em linhagens de melanoma humano. Desta forma, o composto DM-1 e a BNCT mostraram-se ferramentas terapêuticas mais eficazes no controle da progressão e no aumento da morte celular em células de melanoma. O poder efetivo da terapia de BNCT e do composto DM-1 faz com que a possibilidade de terapias combinatórias tenha resultados extremamente favoráveis na modulação da resposta proliferativa desses tumores.
Malignant melanoma is the most aggressive skin cancer. It is responsible for more than 75% of deaths. The main and most active chemotherapy in the melanoma treatment is represented by dacarbazine (DTIC), however, response rates are disappointing. The DM-1 compound is a curcumin structural analogue and it has similar biological properties, such as an antiproliferative and pro-apoptotic agent. Boron Neutron Capture Therapy (BNCT) works through the deposition of the isotope 10Boron in tumor cells, with subsequent irradiation of thermal neutrons, which produce alpha particles and lithium that destroy the cell. In this study, the action mechanism of these three therapies, DTIC, DM-1 and BNCT in the melanoma treatment and its effects in vitro on normal cells were studied in order to obtain different therapeutic modalities for cancer treatment. The IC50 was obtained by MTT method, besides the analysis of cell cycle progression and cell death markers by flow cytometry. The DM-1 and BNCT showed selective cytotoxic in melanoma cell lines, with high of free radicals production. In the same conditions, these effects were minimal in normal cells, unlike the treatment with DTIC. There was a decrease in the proportion of extracellular matrix and soluble collagen synthesized in melanoma cells treated with DM-1, BNCT and DTIC, however, only DTIC also resulted in decreased in normal cells. The mitochondrial electrical potential of melanoma cells was decreased in the three treatment protocols, as there was an increase in the amount of fragmented DNA. This effect was not found in normal cells treated with DM-1 and BNCT. The compound DM-1 was able to induce apoptosis by the intrinsic and extrinsic pathways, as assessed by Annexin V, cell death and kinetic markers. BNCT induced apoptosis and necrosis, indicating that this therapy acts through different pathways in each cell line. DM-1 and BNCT induced an increase of pro-apoptotic markers, such as Bax, cytochrome c, cleaved caspase 3 and 8 expression, and they reduced cyclin D1 and Ki-67, expression related to the progression of the cell cycle and proliferation. The DTIC has shown some signs of apoptosis in melanoma cells, but its effect on normal cells were extensive, causing death and cell cycle arrest in melanocytes, fibroblasts and endothelial cells. The DM-1 showed apoptotic bodies formation, cytoskeleton changes and caspase 9 and Parp cleavage in human melanoma cell lines. Thus, the DM-1 and BNCT showed as therapeutic tools more with high effectiveness in controlling the cell cycle progression and cell death increase in melanoma cells. The effectiveness of BNCT and DM-1 makes the possibility of combinatorial therapies, with extremely favorable results in the modulation of the proliferative response of these tumors.

Beta-lapachona ( -lap) es un agente antitumoral que induce apoptosis selectivamente en células tumorales. El mecanismo preciso de citotoxicidad de -lap no es aún completamente comprendido. Aquí reportamos que -lap produce un retraso en la progresión del ciclo celular en la transición G1/S, aumenta la fosforilación de la quinasa de control Rad53p y disminuye la supervivencia celular en la levadura de gemación Saccharomyces cerevisiae. Además, -lap induce la fosforilación de histona H2A en la posición serina 129. Estas respuestas de control de ciclo son reguladas por las quinasas Mec1p y Tel1p. Mec1p se requiere para la fosforilación de Rad53p/histona H2A y supervivencia celular tras tratamiento con -lap en cultivos asincrónicos, pero no para el retraso en la transición G1/S. La mutación tel1 aumenta la sensibilidad a -lap en una cepa defectiva en mec1, y compromete las respuestas de los puntos de control de ciclo. La fosforilación de Rad53p y el retraso en G1/S son completamente dependientes de un complejo Mre11p-Rad50p-Xrs2p (XMR) funcional, y mutantes en el complejo XMR son extremadamente sensibles al tratamiento con -lap. Finalmente, XRS2 y TEL1 trabajan epistáticamente respecto a la sensibilidad a -lap y Xrs2p se fosforila en un modo dependiente de Tel1p tras el tratamiento. El tratamiento con -lap también genera la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la cual es bloqueada eficientemente por dicumarol, un inhibidor de NADH deshidrogenasas (NADH-DH). El tratamiento con dicumarol no afecta a la viabilidad ni a las respuestas de control activadas por la droga. Identificamos un mutante, defectivo en la NADH-DH mitocondrial Nde2p, que es resistente a la toxicidad de -lap. -lap induce la producción de ROS en este mutante, sin afectar la viabilidad o la progresión de ciclo. El mutante nde2 presenta un retraso en la entrada en fase S del ciclo celular, e hipersensibilidad a agentes que dañan el ADN. Nuestros datos indican que Nde2p es un determ
Menacho, MA. (2007). Mecanismos moleculares involucrados en la citotoxicidad del agente antitumoral beta-lapachona [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/1877
Palancia

O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos de ação da combinação dos quimioterápicos bevacizumab e erlotinib em modelos de câncer coloretal in vitro e in vivo e o potencial antigenotóxico, antimutagênico e antiproliferativo do ditelureto de difenila in vitro, visando a aplicação destes agentes na terapia antitumoral. As combinações de bevacizumab com uma pequena molécula inibidora de EGFR, erlotinib, são significativamente mais ativas que o bevacizumab sozinho em modelos CRC independente da presença de KRAS mutado. Nossos resultados mostram que o tratamento com bevacizumab provocou níveis aumentados de VEGFR1, VEGFR2 e EGFR fosforilados ativos em todos modelos de celulares, bem como nas células endoteliais associadas ao tumor que são atenuadas na presença de erlotinib e que erlotinib regula a secreção de anfiregulina e TGF-alfa in vitro como in vivo independentemente do status KRAS e sensibilidade ao bevacizumab, aumentando assim a atividade antitumoral. Ditelureto de difenila (DTDF) é um composto orgânico de telúrio que demonstrou atividades antioxidantes interessantes, tanto in vitro como in vivo. No presente estudo, DTDF não foi citotóxico e genotóxico em concentrações variando de 0,01 a 0,1 μM. O pré-tratamento com DPDT por 2h nestas concentrações mostrou propriedades antioxidantes, antigenotóxicas e antimutagênicas contra peróxido de hidrogênio (H2O2), tert-butil hidroperóxido (t- BOOH), metil metanossulfonato (MMS) ou radiação ultravioleta (C) em células V79. Os nossos resultados demonstraram que as células tratadas com o DTDF nas concentrações de 0,01, 0,05 e 0,1 μmol não aumentaram os níveis de TBARS e produção de ROS. Entretanto, observou-se um aumento da intensidade dos ROS e na atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) após o tratamento com o DTDF, sugerindo um efeito pró-oxidante desse composto. Além disso, DTDF mostrou propriedades antitumorais em várias linhagens celulares de câncer. Em conjunto, nossos resultados elucidam aspectos importantes do mecanismo de ação dos agentes bevacizumab, erlotinib e DTDF, destacando as atividades promissoras dessas drogas que, empregadas como agentes únicos ou em associação com quimioterápicos, podem contribuir para melhoramento dos protocolos de terapia antitumoral.
This study investigated the mechanisms of action of the combination of chemotherapeutics bevacizumab and erlotinib in colorectal cancer models in vitro and in vivo and the antigenotoxic, antimutagenic and anti-proliferative potential of diphenyl ditelluride, aiming the application of these agents in antitumor therapy. The combinations of bevacizumab with a small molecule EGFR-inhibitor, erlotinib, are significantly more active than bevacizumab alone in CRC models with different KRAS status and bevacizumab sensitivity. Our results show that bevacizumab treatment provoked increased levels of active, phosphorylated VEGFR1, VEGFR2 and EGFR in all tumor models as well as in the tumor-associated endothelial cells which is attenuated in the presence of erlotinib and that erlotinib down-regulates the secretion of amphiregulin and TGF-alpha in vitro as in vivo irrespective of KRAS status, increasing the antitumor activity. Diphenyl ditelluride (DPDT) is an organotellurium compound that demonstrated interesting antioxidant activities both in vitro and in vivo. In the present study, DPDT was not cytotoxic and genotoxic at concentrations ranging from 0.01 to 0.1 μM. The pre-treatment for 2h with DPDT showed antioxidant, antigenotoxic and antimutagenic properties against hydrogen peroxide (H2O2), t-butyl hydroperoxide (t-BOOH), methyl methanesulphonate (MMS) or ultraviolet (UV)C radiation in V79 cells. Our results demonstrated that DPDT-treated cells at concentrations of 0.01, 0.05 and 0.1 μmol did not change TBARS levels and ROS generation. However, the observed increased intensity of ROS foci and increased superoxide dismutase activity (SOD) following DPDT treatment suggest pro-oxidative effect of this compound. Furthermore, DPDT showed anticancer properties in several cancer cell lines. Taken together, our findings elucidate important aspects of the mechanism of action of the agents bevacizumab, erlotinib and DPDT, highlighting the promising activities of these drugs which, employed as single or in association, might contribute for the antitumor therapy.

O câncer tem levado a óbito milhões de pessoas em todo o mundo. Apesar dos conhecimentos a respeito dos mecanismos moleculares desta patologia estarem aumentando rapidamente, poucos avanços estão sendo conseguidos nas clínicas de terapia e diagnósticos de tumores, o que torna de extrema importância o desenvolvimento de novas moléculas para fins terapêuticos e diagnósticos. Toxinas animais possuem uma diversidade de atividades biológicas e farmacológicas e têm se mostrado fonte rica de moléculas com potencial terapêutico. Diversos trabalhos têm sido realizados com toxinas de animais terrestres, mas toxinas de peixes venenosos marinhos são uma fonte potencial e ainda inexplorada de novas moléculas. Neste trabalho a peçonha bruta do peixe-escorpião Scorpaena plumieri (SPB) e uma enzima gelatinolítica (SPGP) purificada a partir desta peçonha, foram avaliadas quanto a sua aplicabilidade na detecção diferencial de tumores. Os resultados in vitro demonstraram que tanto SPB quanto SPGP possuem potente efeito antitumoral sobre células de glioblastoma p-53 selvagem (DL50= 3,90,98μg/mL e 8,00x10-122,94x10-12M, respectivamente) e células de carcinoma ascítico de Ehrlich (DL50=14,052,95μg/mL e 1,22x10-116,56x10-12M, respectivamente), sendo células de glioblastoma p53-mutante mais resistentes, para ambas as substâncias (DL50 > 125μg/mL para SPB e DL50 > 1,39x10-9M para SPGP). As alterações morfológicas observadas nestas linhagens quando tratadas com SPB e SPGP, e os dados da coloração com DAPI, indicam que o efeito antitumoral destas substâncias ocorre via apoptose. Sondas radioativas de SPB ([99mTc]SPB) e SPGP ([131/125I]SPGP) foram sintetizadas com alta atividade específica e alta pureza radioquímica. Estudos de biodistribuição, realizados por injeções via endovenosa caudal, em camundongos implantados nos coxins plantares com tumor de Ehrlich mostraram que a SPB não é captada significativamente pelo tumor. Por outro lado, a SPGP foi significativamente captada pela pata com tumor, em todos os tempos avaliados (p<0,05). A administração intratumoral da [125I]SPGP elevou os níveis desta molécula no tumor e reduziu a captação em outros órgãos. Estudos em animais com edema demonstraram que a SPGP apresenta um tempo de residência maior na região tumoral do que em regiões inflamatórias. Estudos hematológicos e histopatológicos realizados demonstraram que a SPB e SPGP não apresentam toxicidade aguda, mesmo em concentrações dez vezes maiores que as utilizadas nos experimentos de biodistribuição e detecção de tumores. Estes resultados são inéditos e mostram o potencial da SPGP como molde para o desenvolvimento de fármacos e radiofármacos para terapia e diagnóstico de tumores.
Cancer has killed millions of people worldwide. Despite the increasing knowledge about the molecular basis of tumor development, few advances have been reached in clinical therapy and diagnoses, which shows the importance of new drugs development for therapeutic and diagnosis purpose. Venomous creatures have been studied as potential sources of pharmacological agents and physiological tools. A lot of work has been done about biological activity of terrestrial animals, but comparatively less research has been undertaken on venomous marine creature, particularly fish, which means that marine toxins represent a vast and unexplored source of novel molecules with therapeutical potential. In this work, the scorpionfish Scorpaena plumieri crude venom (SPB) and a gelatinolytic protease purified from this venom (SPGP) were evaluated for their applicability for in vivo tumor detection. In vitro results showed that both, SPB and SPGP, possess a powerful antitumor effects on p53-wild-type glioblastoma cells (LD50= 3,90,98μg/mL and 8,00x10-122,94x10-12M, respectively) and Ehrlich ascites carcinoma cells (LD50=14,052,95μg/mL and 1,22x10-116,56x10-12M, respectively). P53- mutant glioblastoma cells were more resistant to both, SPB and SPGP treatment (LD50 > 125μg/mL and LD50 > 1,39x10-9M, respectively). The morphological changes observed in the cell lines treated with SPB and SPGP, and the data of DAPI staining, indicate that the antitumor effect of these substances occurs via apoptosis. Radioactive probes of SPB ([99mTc] SPB) and SPGP ([125I] SPGP) with high specific activity and high radiochemical purity were synthesized. Data of biodistribution studies, performed by intravenous injections in Swiss mice bearing Ehrlich carcinoma cells, showed that SPB has poor uptake in tumor region. On the other hand, SPGP had a substantial uptake in tumor at all analyzed times. Intratumoral administration of [125I]SPGP increased its uptake by the tumoral region and substantially reduced the uptake by other organs. Biodistribution studies in animals with edema confirmed that SPGP presents longer residence time in tumoral region than into inflammation site. Hematologic and histopathologic studies showed that SPB and SPGP did not present acute toxicity, even at concentrations ten times higher than those used in biodistribution studies. These results indicate the potential of SPGP as template for the development of new drugs and radiopharmaceuticals for tumors diagnosis and therapy.

L'adenocarcinoma ductal de pàncrees és un càncer molt agressiu que actualment representa la quarta causa de mort per càncer als països occidentals. Les teràpies clàssiques, basades en la resecció quirúrgica, la radioteràpia i el tractament amb quimioteràpics com la gemcitabina, no són efectives en la gran majoria del pacients. En aquests darrers anys s'està estudiant l'aplicació de la teràpia gènica com a teràpia alternativa o adjuvant per al tractament d'aquesta neoplàsia. Una aproximació important és la que es basa en la transferència del gen de la timidina quinasa del virus Herpes simplex tipus 1 (TK) i l'administració de la pro-droga ganciclovir (GCV). Un dels atractius que presenta aquest sistema TK/GCV és que disposa d'un mecanisme amplificador de la mort cel·lular, que va més enllà d'eliminar la cèl·lula tumoral modificada genèticament amb el gen TK i que es coneix com l'efecte adjacent. S'ha proposat, que aquest efecte podria ser degut al trànsit dels metabòlits tòxics del GCV a través dels canals intercel·lulars que formen les unions gap.
En aquesta tesi hem realitzat una caracterització de l'expressió de les molécules constitutives de les unions gap, les connexines, en l'adenocarcinoma de pàncrees; i hem estudiat el seu paper en l'eficàcia de dues estratègies terapèutiques basades en l'administració de compostos anàlegs de nucleòsids: el sistema suïcida TK/GCV i el quimioteràpic gemcitabina. S'ha estudiat també la possible contribució de l'E-cadherina, element clau de les unions adherents epitelials, en l'efecte citotòxic d'aquestes teràpies i amb especial èmfasi en el sistema TK/GCV.

Cancer diseases are increasing worldwide and more than 20 million new cancer cases per year are expected by 2025. At these days the treatment of neoplastic forms took advantage of classic approaches, based on chemotherapeutics and radiotherapeutics agents. However they are characterized by numerous limitations as remarkable side effects, toxicity and selection of resistant phenotypes to such therapies. This prompted the development of so-called targeted therapies, where selective chemical entities (small molecules, monoclonal antibodies, miRNAs, siRNAs etc.) hit a single molecular target of the tumor phenotype. Despite, these therapies have proven to be efficient alternatives they also present several limitations that make them quite ineffective. In order to overcome these remarkable drawbacks, he modulation of the gene expression, that exploits the ability of nucleic acids to assume different conformations, defined as non-canonical, became extremely interesting. Among these non-canonical conformations, extremely fascinating are the tetrahelical conformations known as G-quadruplex (G4) and i-Motif (iM), that seem to be involved in the blockage of the cancer development. G4 structures occur at DNA and RNA sequences presenting a high abundance of consecutive guanines that interact each other through Hoogstein hydrogen bonds to generate a planar structure called G-tetrads. Stacking interaction between two or more G tetrads create the overall structure. Bioinformatics studies revealed that prevalently these regions are contained along the telomeres and within the untranslated region (UTR) or within the promoter sites of several oncogenes (approximately 40%) directly implicated in the development of tumor phenotypes. The UTR domains, as the promoter regions, are double-stranded DNA sequences. Therefore the complementary strand results enriched in cytosine, that under specific environmental conditions can folds into a tetrahelical conformation, known as i-Motif. Unlike the G4s, the building block of the entire structure is a dimer of cytosine mainly stabilized by the presence of three Hoogstein hydrogen bonds. The in vivo formation of G4 and iM leads to a steric hindrance at the DNA level; this suggests an inhibition/activation effect on the elongation process of the telomere or on the gene expression process Under the supervision of Dr. Laurence J. Hurley, the structural characterization of the cytosine rich sequence contained within the NHE(III)1 region of MYC promoter was completed. In particular, was assessing the effect of the loop composition on the stability and folding process of the already characterized iM. Since it was proved that this conformation in vivo is involved in the transcriptional activation, the possibility to target it by using a selected compound (IMC-30) was considered. Furthermore, we took into consideration the possibility to use this compound (IMC-30) as an anticancer drug by testing its ability to induce the apoptosis process in a cancer cell line in which the selected gene was overexpressed. Besides the several evidence reported for the tetrahelical conformations assumed by the GC-rich promoter regions, more recently the efforts moved forward to the G-rich tract contained in the untranslated (UTR) domains, both the 5’- and the 3’-UTR, of the primary transcript. Since, they can act as modulators of the translation process. Based on this evidence, in this project, the guanine rich sequences contained in the 5'-UTR region, both at the DNA and RNA levels, of the BCL2 gene were considered. In particular, the structural characterization study was initially carried out on the minimal sequences (dBcl2_G and rBcl2_G), then the effect exerts by the presence of additional nucleotides on the folding process towards the G-quadruplex was taken into consideration (dBcl2_G + 3 WC, rBcl2_G + 3 WC and rBcl2_48). Additionally, the cytosine rich tract contained on the DNA complementary strand was considered and characterized. Our data have shown that the dBcl2_G and rBcl2_G are able to assume multiple G4 conformations. While, the presence of additional nucleotides strongly modulates their ability to assume the non-canonical conformation. Indeed, we proved that the presence of 3 WC pairing partially prevents the formation of G4 both in the DNA and in the RNA, while the addition of a greater number of bases (rBcl2_48) leads to the formation of a different conformation that competes with the G4 structure. Regarding the cytosine rich string, its conformational equilibria have been taken into consideration both in a mildly acidic environment and in an environment that mimics the physiological condition. Finally, we implemented our work, by screening a library of compounds on each tested sequences in order to find a ligand that selectively recognizes and stabilizes one conformation. From the acquired data it emerged the feasibility to stabilize/induce the iM using the Bisanthrene compound and its derivative Bis 1-8. For the guanine rich sequences, Sanguinarine and Chelerythrine provide the best results on each tested tracts, therefore they cannot be considered selective compounds. Similarly, also the Bisanthrene derivatives recognize and interact with each tested guanine tracts, although with different selectivity.
Oggigiorno una delle “piaghe” che affligge maggiormente la popolazione mondiale è il cancro. Il trattamento di queste forme neoplastiche sfrutta agenti chemioterapici e radioterapici, caratterizzati da numerose limitazioni legate ai notevoli effetti collaterali, alla tossicità e alla selezione di fenotipi resistenti a tali terapie. Ciò ha portato allo sviluppo delle targeted therapy, che sfruttano entità chimiche (small molecules, anticorpi monoclonali, miRNA, siRNA ecc.) selettive per un bersaglio molecolare caratteristico del fenotipo tumorale. Nonostante più mirati anche questi approcci presentano degli effetti collaterali Pertanto la modulazione dell’espressione genica che sfrutta la capacità degli acidi nucleici di assumere differenti conformazioni, definite non canoniche, ha destato sempre più interesse. Tra le possibili strutture non canoniche di notevole interesse sono le conformazioni tetraelicoidali note come G-quadruplex (G4) e i-Motif (iM). La struttura G4 è propria di sequenze di DNA e RNA contenenti un’elevata abbondanza di guanine consecutive che, mediante legami a idrogeno di tipo Hoogstein, generano delle strutture planari chiamate tetradi. Dall’’impilamento di due o più tetradi si genera la struttura a tetraelica. Poiché il DNA è una doppia elica, il filamento complementare a queste regioni G ricche presenta un’elevata abbondanza di citosine. Anche questi domini in particolari condizioni ambientali, possono generare una conformazione tetraelicoidale, nota come i-Motif. A differenza del G4, il building block dell’intera struttura è un dimero di citosine stabilizzato dalla presenza di tre legami a idrogeno. In vivo l’esistenza di queste conformazioni, genera una sorta d’ingombro sterico a livello del DNA e ciò presuppone un effetto d’inibizione/attivazione del processo di elongazione del telomero o del processo trascrizionale. Sotto la supervisione del Dott. Laurence J. Hurley, è stata implementata la caratterizzazione strutturale della stringa di citosine contenute nel promotore del gene MYC. In seguito un selezionato ligando è stato testato con l’idea di poter modulare il processo di folding/unfolding alla base dell’attivazione trascrizionale. Infine, l’effetto mediato da questo composto sul processo apoptotico è stato preso in considerazione lavorando su una selezionata linea cellulare. Di notevole interesse sono le regioni GC-ricche contenute nella porzione non tradotta del trascritto primario (mRNA). Sulla base di ciò, in questo progetto, sono state prese in considerazioni, le stringhe di guanina e citosina contenute nella regione del 5’-UTR, sia a livello del DNA sia del RNA, del gene BCL2. Inizialmente è stato condotto uno studio di caratterizzazione sulle sequenze minimali dBcl2_G, dBcl2_C e rBcl2_G. In seguito è stato preso in considerazione l’effetto della presenza di nucleotidi adiacenti sul processo di folding verso il G-quadruplex (dBcl2_G + 3WC, rBcl2_G + 3WC e rBcl2_48). I dati ottenuti dimostrano che le sequenze dBcl2_G e rBcl2_G sono in grado di assumere molteplici conformazioni G4. La presenza di nucleotidi addizionali modula la loro capacità di assumere queste conformazioni. In particolare, la presenza di tre appaiamenti WC impedisce parzialmente la formazione del G4 sia nel DNA, che nel RNA mentre, l’aggiunta di un maggior numero di basi (rBcl2_48) sposta l’equilibrio conformazionale verso una conformazione in forte competizione con il G4. Per la sequenza ricca di citosine, l’equilibrio conformazionale è stato valutato sia in ambiente blandamente acido, che in un ambiente che mima la condizione fisiologica. Infine, poiché negli ultimi anni è stata dimostrata la capacità di alcuni ligandi sintetici/naturali, di spostare gli equilibri conformazionali del DNA, dalla classica forma a doppio filamento, verso queste conformazioni tetraelicoidali, una selezionata libreria di composti è stata, scrinata allo scopo di individuare un ligando in grado di riconoscere e stabilizzare selettivamente una conformazione al pari di un'altra.

O efeito antiproliferativo do calcitriol foi detectado principalmente em linhagens de carcinoma mamário expostas in vitro a alta concentração hormonal (10 - 100nM), que é associado com hipercalcemia em seres humanos. Nossa hipótese era que a administração intratumoral de calcitriol permitiria maior concentração do hormônio e ativação da via genômica. Para testar esta hipótese, um modelo de enxerto tumoral que reproduz o mais próximo das características moleculares do tumor primário, foi estabelecida. As amostras de câncer de mama recolhidos foram enxertados em camundongos nude e depois da sexta semana, semana, os enxertos tumorais foram tratados semanalmente com injeções intra-tumorais de veículo (controle) ou o calcitriol 0,06 mcg (dose que pode permitir que picos séricos de calcitriol na faixa terapêutica prevista) durante seis semanas. A proliferação e apoptose do enxerto tumoral Veículo (controlo) ou o calcitriol 0,06 mcg (dose que pode permitir que o soro de pico, assim como, a expressão dos genes alvos foram avaliadas através de reações imunohistoquímica ou RT-PCR. A expressão de VDR foi detectada em todas as amostras, assim como uma tendência para maior expressão de mRNA CYP24A1 (indução 10-18 vezes) em amostras tratadas com calcitriol, indicando que a via genómica foi induzida pelo hormonio. O elevado índice proliferativo, avaliado pela expressão de Ki67, foi detectado. No entanto, não havia diferenças na expressão de marcadores de proliferação (incorporação de BrdU, Ki67 e CDKN1B expressão) nem marcadores de apoptose (caspase-3 clivada e BCL2 expressão) entre os enxertos tumorais tratados por veículo e calcitriol tratado. Além disso, não houve diferença entre os grupos detectada na expressão de mRNA do CDKN1A. Em resumo, os efeitos antitumorais não foram observados neste modelo de enxerto tumoral. A indução do gene alvo CYP24A1 pode ter em parte impedido os efeito antitumorais da vitamina D
Antiproliferative effects of calcitriol were mainly detected in breast carcinoma lineages exposed in vitro to high hormone concentrations (10-100 nM), which is associated with hypercalcemia in human beings. Our hypothesis was that intra-tumoral administration of calcitriol would allow higher issue concentration of the hormone and activation of the genomic pathway. To test this hypothesis, a tumorgraft model, that more closely reproduces the molecular characteristics of the primary tumor, was established. Freshly collected breast cancer samples were grafted in nude mice and after the 6th week, tumorgrafts were treated weekly with intra-tumoral injections of vehicle (control) or calcitriol 0.06 mcg (dose that may allow peak serum calcitriol levels in the predicted therapeutic range) for six weeks. Tumorgraft proliferation and apoptosis, as well as expression of target genes, were evaluated through immnunohistochemistry reactions or RT-PCR. VDR expression was detected in all samples as well as a trend towards higher expression of CYP24A1 mRNA (10-18 fold induction) in calcitriol treated samples, indicating that the genomic pathway was induced by the hormone. A high proliferative index, evaluated by Ki67 expression, was detected. However, there were neither differences in the expression of proliferation markers (BrdU incorporation, Ki67 and CDKN1B expression) nor in apoptosis markers (cleaved caspase 3 and BCL2 expression) between vehicle and calcitriol treated tumorgrafts. In addition, no difference between groups was detected for the expression of CDKN1A mRNA. In summary, calcitriol antitumoral effects were not observed in this tumorgraft model. Calcitriol induction of the target gene CYP24A1, might have in part, precluded vitamin D antitumoral effects

Scopo dell’attività di ricerca è stata l’identificazione e la validazione di nuove molecole in grado di bloccare la corrente condotta dal canale ionico hERG1, con la prospettiva di un loro possibile utilizzo in ambito clinico nella terapia antitumorale. Il canale hERG1 rappresenta infatti un target interessante in quanto risulta essere espresso in maniera alterata in numerosi tumori umani e regolare diversi aspetti della fisiologia della cellula tumorale. Il canale hERG1 è tuttavia considerato un anti-target nello sviluppo di nuovi farmaci dal momento che esso ha un ruolo fondamentale nella fisiologia cardiaca, essendo il principale regolatore della ripolarizzazione ventricolare: il blocco della conduzione del canale hERG1 può causare severi effetti collaterali, tra cui sindrome del QT lungo e torsione di punta, una forma di aritmia con esiti spesso fatali. Risulta quindi necessario identificare o sintetizzare nuovi composti in grado di bloccare il canale hERG1, esenti da effetti cardiotossici o arritmogenici, che possano essere in futuro utilizzati in ambito clinico. Sono state proposte diverse strategie per superare i problemi che potrebbero essere causati dall’utilizzo di bloccanti di hERG1; la strategia adottata in questo progetto di ricerca si è incentrata sull’identificazione di bloccanti selettivi dell’isoforma hERG1B, la quale risulta essere maggiormente espressa in diverse forme di leucemia e nei neuroblastomi umani. I risultati ottenuti in questo lavoro sperimentale dimostrano che il canale hERG1 può essere bloccato da composti di diversa natura chimica, sia analoghi dei classici farmaci antiaritmici, antibiotici già utilizzati nella pratica clinica o molecole inizialmente sviluppate contro altri bersagli. Lo screening, effettuato tramite la tecnica del patch-clamp, di composti chimici differenti ha fornito importanti informazioni per quanto riguarda i siti di legame di queste molecole, confermando e ampliando la nostra conoscenza dei residui aminoacidici cruciali nella struttura hERG1. I risultati ottenuti con gli analoghi della Dofetilide, un farmaco anti-aritmico di classe III, potrebbero inoltre rappresentare un punto di partenza prezioso per lo sviluppo di nuovi farmaci antiaritmici privi dei gravi effetti collaterali riportati per la Dofetilide. Abbiamo inoltre dimostrato che la claritromicina, un antibiotico appartenente alla classe dei macrolidi già utilizzato in ambito clinico, risulta essere, nelle nostre condizioni sperimentali, leggermente più efficace nel bloccare la corrente condotta dal canale hERG1B, suggerendone così un possibile utilizzo come adiuvante nella chemioterapia. Infine, gli esperimenti condotti utilizzando il CD-160130, un composto con struttura pirimido-indolica, hanno dimostrato che è possibile inibire selettivamente l’isoforma hERG1b. Il CD-160130 ha infatti dimostrato una significativa attività anti-leucemia sia in vitro che in vivo in leucemie mielodi e linfoidi acute ed un marcato effetto pro-apoptotico in combinazione con alcuni farmaci chemioterapici, entrambi riconducibili a un’inibizione del canale ionico hERG1. Abbiamo inoltre dimostrato che il composto CD-160130 risulta essere privo di effetti collaterali sia mielotossici che cardiotossici, e che non produce allungamento della durata del potenziale d’azione cardiaco. Nel complesso, i dati sperimentali discussi in questa tesi fornisco nuove indicazioni per lo sviluppo di composti con una ben definita selettività per le diverse isoforme dei canali hERG1

Relatório de Estágio do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas apresentado à Faculdade de Farmácia
O cancro é a doença do século XXI. Uma doença mortífera, com uma incidência notória na população e com um impacto indiscutível.Os tratamentos disponíveis ainda são bastante limitados, principalmente em cancros avançados e em cancros refratários, onde as terapêuticas tradicionais se revelam insuficientes.Esta realidade levou ao desenvolvimento da imunoterapia, que consiste no uso do sistema imunitário do próprio doente para reconhecer e agir contras as células tumorais. As células T CAR são um exemplo de uma imunoterapia, que se baseia na recolha de células T do doente, que são alteradas de modo a possuírem um recetor de antigénio quimérico, o CAR. Estas células são produzidas para diferentes alvos tumorais consoante o cancro em questão.Esta terapia inovadora tem demonstrado elevadas taxas de remissão e promete revolucionar o tratamento e o paradigma do cancro. O Estágio Curricular é parte integrante do Mestrado Integrado em Ciências Farmacêuticas e proporciona aos estudantes um primeiro contacto com o mundo profissional. Neste contexto tive a oportunidade de realizar dois estágios distintos, um em Farmácia Comunitária, na Farmácia Laranjeira, e outro em Assuntos Regulamentares, na Phagecon - Serviços e Consultoria Farmacêutica, Lda. De forma a descrever e a avaliar a minha experiência, apresento este relatório que expõe os principais pontos fortes, pontos fracos, oportunidades e ameaças (análise SWOT) destes dois estágios.Será sempre um orgulho saber que pertenci à tão nobre Faculdade de Farmácia da Universidade de Coimbra.
Cancer is considered the disease of 21st century. A deadly disease, with an evident rate in the population and with an unquestionable impact. Available treatments are still very limited, especially in advanced cancers and in refractory cancers, where traditional therapies are insufficient. This reality led to the development of immunotherapy, which consists of using the patient's own immune system to recognize and act against tumour cells. CAR T cells are an example of an immunotherapy, which is based on the collection of patient T cells, that are modified to have a chimeric antigen receptor, the CAR. These cells are produced for different targets depending on the cancer. This innovative therapy has shown high rates of remission and promises to revolutionize cancer’s paradigm.The Curricular Internship is a part of the Integrated Master’s Degree in Pharmaceutical Sciences and allows the future pharmacists to have the first contact with the professional world. In this context I had the opportunity to do two different internships, one in Community Pharmacy, at Farmácia Laranjeira, and another in Regulatory Affairs, at Phagecon - Serviços e Consultoria Farmacêutica, Lda. In order to describe and evaluate my experience, I will present this report which summarises the main strengths, weaknesses, opportunities and threats (SWOT analysis) of these two internships.It will always be a pleasure to know that I belonged to the so honourable Faculty of Pharmacy of the University of Coimbra.

L'interesse per la modulazione del metaboloma della nicotinamide adenina dinucleotide (NAD) sta guadagnando interesse a causa del suo potenziale terapeutico in diverse patologie umane. La soppressione della via di recupero della nicotinamide da parte degli inibitori della nicotinamide fosforibosil transferasi (NAMPT), tuttavia, ha dato risultati inconcludenti nei pazienti neoplastici perché diverse vie metaboliche aggirano il blocco enzimatico convergendo direttamente sulla nicotinamide mononucleotide adenil transferasi (NMNAT) per la sintesi di NAD. Sfortunatamente, inibitori NMNAT-specifici non sono stati identificati. Qui, il nostro gruppo, riporta l'identificazione di Vacor come substrato metabolizzato dall'azione consecutiva di NAMPT e NMNAT2 nell'analogo del NAD, Vacor adenina dinucleotide (VAD). Ciò porta all'inibizione di entrambi gli enzimi, nonché delle deidrogenasi NAD-dipendenti: ciò causa una rapida deplezione del NAD, blocco della glicolisi, a cui conseguono mancanza di energia e morte per necrosi delle cellule cancerose che esprimono NMNAT2. Al contrario, la mancanza di espressione NMNAT2 conferisce completa resistenza a Vacor. Sorprendentemente, Vacor stimola la formazione di VAD e la soppressione della crescita in xenotrapianti di neuroblastoma e melanoma NMNAT2-positivi. I nostri dati mostrano un primo tentativo di sfruttare l'intero percorso di recupero della nicotinamide come strategia antimetabolica nel trattamento delle neoplasie. // Interest in the modulation of nicotinamide adenine dinucleotide (NAD) metabolome is gaining great momentum because of its therapeutic potential in different human disorders. Suppression of nicotinamide salvage by nicotinamide phosphoribosyl transferase (NAMPT) inhibitors, however, gave inconclusive results in neoplastic patients because several metabolic routes circumvent the enzymatic block converging directly on nicotinamide mononucleotide adenylyl transferases (NMNATs) for NAD synthesis. Unfortunately, NMNAT inhibitors have not been identified. Here, we report the identification of Vacor as a substrate metabolized by the consecutive action of NAMPT and NMNAT2 into the NAD analog Vacor adenine dinucleotide (VAD). This leads to inhibition of both enzymes, as well as NAD-dependent dehydrogenases, thereby causing unprecedented rapid NAD depletion, glycolytic block, energy failure, and necrotic death of NMNAT2-proficient cancer cells. Conversely, lack of NMNAT2 expression confers complete resistance to Vacor. Remarkably, Vacor prompts VAD formation and growth suppression in NMNAT2-positive neuroblastoma and melanoma xenografts. Our data show the first evidence of harnessing the entire nicotinamide salvage pathway for antimetabolic strategies.

Tese de mestrado, Química (Química), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015
O cancro é a segunda maior causa de morte nos países desenvolvidos, prevendo-se que o número de mortes devido a esta doença aumente 70% nas próximas duas décadas. As terapias mais utilizadas para tratamento desta doença são a cirurgia, radioterapia e quimioterapia, podendo também recorrer-se à imunoterapia e terapia hormonal. Os fármacos usados em quimioterapia podem ser divididos em vários grupos de acordo com a sua estrutura, modo de ação e a sua interação com outros fármacos. A cisplatina e os seus análogos tornaram-se os metalofármacos mais utilizados na terapia de diversos tipos de cancro, sendo usados sozinhos ou isolados em muitos regimes terapêuticas, independentemente da sua falta de selectividade, da limitação severa na dosagem devido a efeitos secundários agressivos e ao desenvolvimento de resistência ao tratamento. A busca de novos metalofármacos tem como objetivo ultrapassar as desvantagens apontadas anteriormente, e simultaneamente desenvolver novos fármacos que tenham sucesso no tratamento de tumores resistentes aos compostos de cisplatina. Neste trabalho descreve-se a síntese e caracterização de novos compostos orgânicos e inorgânicos, desenvolvidos com o objectivo contribuir para o desenvolvimento de novos agentes anti-tumorais pertencentes da família dos metalofármacos. Foram sintetizados e caracterizados três compostos pertencentes à família das tiosemicarbazonas (HL1, HL2 e HL3), por condensação entre a 4-feniltiosemicarbazida e os aldeídos heteroaromáticos indole-3-carboxaldeído, N-metilindole-3-carboxaldeído e 2-benzofurancarboxaldeído. Por reação entre estas tiossemicarbazonas e cis-[Ru(bipy)2Cl2] na presença de triflato de prata, obtiveram-se três novos complexos de ruténio (II), complexos 1, 2 e 3, cuja estrutura, octaédrica, foi formulada como [Ru(bipy)2(HL)][CF3SO3]2 com o ligando coordenado na forma neutra ao ião ruténio pelo átomo de enxofre e pelo átomo de azoto imínico. Por reação entre os tiossemicarbazonas HL1, HL2 e HL3 e CuCl2, foram sintetizados três novos complexos de cobre, complexos 4, 5 e 6, tendo sido possível propor a formulação [Cu(HL)2]Cl, para os complexos 4 e 5, com o cobre no estado de oxidação (I) e a tiossemicarbazona coordenada na sua forma neutra (HL) pelo átomo de enxofre e pelo átomo de azoto imínico. A caracterização de todos os compostos sintetizados, tiossemicarbazonas e complexos, foi feita recorrendo às técnicas espectroscópicas de Ressonância Magnética Nuclear (1H, 13C/APT, DEPT-135 e técnicas bidimensionais), ESI-MS, FTIR, espectroscopia de UV-Visível, análises elementares (% C, H, N) e adicionalmente, no caso dos complexos 1, 2 e 3, foi ainda estudado o comportamento redox dos compostos por voltametria cíclica. Avaliou-se ainda a potencialidade das tiossemicarbazonas e dos complexos de Ru(II) sintetizados como agentes anti-tumorais, estudando a sua citotoxicidade em linhas de células tumorais da mama (MDA-MB-231) e do ovário (A2780). A tiossemicarbazona HL2 e o complexo 2 apresentaram resultados muito prometedores de citotoxicidade às 72h de incubação com células A2780, com valores de IC50 de 4.5±1.7µM e 0.15±0.04µM respetivamente. Estes dois compostos revelaram-se também extremamente citotóxicos nas células altamente agressivas do cancro da mama triplo-negativo, MDAMB231, com valores de IC50 que ultrapassaram largamente o da cisplatina, 4.49±1.4µM e 0.11±0.02 µM respetivamente, na avaliação às 72h de incubação. Estes resultados indicam que esta família de compostos é promissora como potenciais agentes anti-tumorais.
Cancer is the secondmajorcause of death in developed countries. It is expected that the number of deaths due to this disease increases by 70% over the next two decades. The most common therapies for treatment of this disease are surgery, radiation and chemotherapy being hormone therapy and immunotherapy also used. Chemotherapeutic drugs’ can be divided into several groups according to their structure, mode of action and their interaction with other drugs. Cisplatin and its analogues have become the metallodrugs most used in the clinic for various types of cancer, being used alone or combined in many therapeutic regimens, irrespective of their lack of selectivity, strict limitations on dosage due to harsh side effects and development of resistance to treatment. The search for new metallodrugs aims to overcome the disadvantages set out above, and simultaneously to develop new drugs that can be successfully used to treat cisplatin resistant tumors. This work describes the synthesis and characterization of new organic and inorganic compounds, developed with the aim of finding new anti-cancer agents. Three compounds belonging to the family of thiosemicarbazones (HL1, HL2 and HL3) were synthesized by condensation between 4-phenylthiosemicarbazide and heteroaromatic aldehydes, namely indole-3-carboxaldehyde, N-methylindole-3-carboxaldehyde and 2-benzofurancarboxaldehyde. By reaction between these thiosemicarbazones and cis-[Ru(bipy)2Cl2] in the presence of silver triflate, three new octahedral complexes of ruthenium(II), complexes 1, 2 and 3, were obtained and formulated as [Ru(bipy)2(HL)][CF3SO3]2, with the ligand coordinated in neutral form to the ruthenium cation, through the sulfur and the imino nitrogen atoms. By reaction between thiosemicarbazone HL1, HL2 and HL3 and CuCl2 three new copper complexes, complex 4, 5 and 6, were synthesized. It was possible to formulate complexes 4 and 5 as [Cu(HL)2]Cl, with copper in the oxidation state (I) and thiosemicarbazone coordinated in its neutral form (HL) through the sulfur and the imino nitrogen atoms. The characterization of all synthesized compounds, thiosemicarbazones and complexes was done using spectroscopic techniques such as Nuclear Magnetic Resonance (1H, 13C/APT, DEPT-135 and two-dimensional techniques), FTIR, UV-Visible, ESI-MS, Elemental Analysis (C, H, N, S) and additionally, in the case of complexes 1, 2 and 3, their redox behavior was also studied by cyclic voltammetry. The potential of thiosemicarbazones and Ru(II) complexes synthesized was evaluated as anti-tumor agents, studying their cytotoxicity in human tumor cell lines of breast cancer (MDA-MB-231) and ovarian cancer (A2780). The thiosemicarbazone HL2 and the complex 2 showed very promising results, after a 72h incubation period, with IC50 values of 4.5±1.7µM and 0.15±0.04µM, respectively, against A2780 cells. These two compounds proved to be also highly cytotoxic in the extremely aggressive cancer cell line (triple-negative breast) MDAMB231, with IC50 values of 4.49±1.4µM e 0.11±0.02 µM (respectively), greatly exceeding that of cisplatin. These results indicate that this family of compounds is quite promising as potential antitumor agents.

Os cancros da mama e da próstata são das patologias mais prevalentes na sociedade atual, tendo elevado impacto social e económico. Assim, o desenvolvimento de estratégias terapêuticas eficientes e seguras neste contexto é de elevado interesse e tem estimulado investigadores em todo o mundo a desenvolver novos compostos capazes de combater estas patologias. Uma vez que grande parte destes tipos de tumores é, pelo menos numa fase inicial, dependente de hormonas esteroides para se desenvolver, as estratégias de descoberta de novas moléculas para os tratar passam frequentemente por preparar compostos esteroides análogos das hormonas endógenas que possam bloquear o crescimento tumoral, por antagonismo dos seus receptores ou por inibição da biossíntese dessas hormonas endógenas. Assim, o objectivo deste trabalho foi o desenvolvimento de esteroides da série estrano, potencialmente úteis no tratamento de tumores hormono-dependentes da mama e da próstata. Para isso, foram sintetizados, principalmente através de reacções de oxidação, e caracterizados estruturalmente por IV e RMN vários derivados esteroides da série estrano, análogos do estradiol e da estrona, e foi efectuada a avaliação da sua ação antiproliferativa em células MCF-7 e LNCaP através do ensaio MTT. Adicionalmente também foram estudados os efeitos destes compostos em células NHDF, saudáveis, para aferir a sua toxicidade selectiva perante as células tumorais. Os resultados obtidos mostraram que alguns compostos tinham ações antiproliferativas interessantes, potencialmente exploráveis, especialmente nas células LNCaP. Adicionalmente evidenciou-se, entre outros aspectos, que a introdução de um grupo 9α-OH ao esqueleto da estrona teve diferentes tipos de implicações na proliferação das células estudadas, que a introdução de uma dupla ligação em C9=C11 e de uma lactona no anel D (17a-oxa-D-homoderivados) parecem não ter efeito muito relevante nas ações antiproliferativas, e que nas células LNCaP, exceptuando para os derivados D-homo, a ação antiproliferativa mais marcada está associada à presença de grupos OH em C3 ou em C9.

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2015
Nas últimas décadas, os compostos derivados de plantas têm sido estudados de forma a permitir a sua utilização na terapêutica de diversas doenças, entre elas o cancro. Estes compostos têm mostrado ser seguros e eficazes na medida que conseguem demonstrar a possibilidade de novas abordagens terapêuticas através da regulação de vários mecanismos fisiológicos, principalmente a modulação da auto-renovação das células cancerígenas estaminais, alteração do metabolismo cancerígeno e a modificação do microambiente tumoral. Os metabolitos secundários obtidos a partir das plantas medicinais e os seus derivados semi-sintéticos continuam hoje em dia a ter um papel importante na terapêutica do cancro. Esta revisão descreve os fármacos anti- cancerígenos já existentes no mercado, os fármacos que se encontram em ensaios clínicos e os fármacos que ainda necessitam de investigação mas que apresentam resultados promissores. Conclui-se que com a aposta da indústria farmacêutica nos compostos derivados de plantas e com a melhoria da tecnologia de deteção e de análise destes mesmos compostos, proporciona-se uma clara expansão do espectro de acção e da eficácia da terapia antitumoral já existente.

Questa tesi di Dottorato si sviluppa nell’ambito della Multidrug Resistance, ovvero la resistenza multifarmaco, molto frequente in ambito oncologico. Infatti, una delle cause principali del fallimento della chemioterapia antitumorale è lo sviluppo da parte delle cellule tumorali, durante la terapia stessa, di resistenza verso uno o più farmaci caratterizzati da struttura chimica e meccanismo di azione molto differenti tra loro. Questo fenomeno è chiamato Multidrug Resistance ed è dovuto ad una sovraespressione di proteine di trasporto transmembrana appartenenti alla famiglia di trasportatori ABC. Queste proteine funzionano da pompe di estrusione utilizzando l’energia fornita dall’idrolisi dell’ATP per espellere dalla cellula tumorale contro gradiente di concentrazione il chemioterapico che così non riuscirà più a mantenere o raggiungere la concentrazione terapeutica efficace. La Pgp è la proteina di trasporto più studiata. E’ una glicoproteina di membrana ed è normalmente espressa nelle cellule sane dove ha una funzione fisiologica protettiva, essendo deputata all’espulsione di molecole lipofile e xenobiotici tossici. Sfortunatamente è sovraespressa nelle cellule tumorali in seguito ad una alterazione dell’espressione del gene MDR1, e ciò sfocia nella MDR. Il sito di legame di questa proteina è molto largo e contiene amminoacidi in grado di stabilire col substrato sia legami elettrostatici che idrofobici. E’ capace quindi di ospitare simultaneamente anche più ligandi con strutture molto diverse. La Pgp può essere quindi considerata come un possibile target terapeutico per superare la MDR. Il concetto è quello di cosomministrare il farmaco antitumorale con un modulatore della pompa (chiamato chemiosensibilizzante) che ne blocchi l’attività, in modo da ripristinare all’interno della cellula tumorale la giusta concentrazione di farmaco. Negli ultimi anni sono stati individuati diversi modulatori della Pgp ed alcuni di essi hanno raggiunto le prove cliniche anche se ancora nessun composto è stato approvato in terapia. E’ molto difficile stabilire relazioni struttura-attività per modulatori della Pgp perchè, così come i substrati, anche essi presentano le strutture più svariate. Comunque sono stati individuati dei requisiti strutturali importanti per conferire alle molecole buona attività anti-MDR, ovvero: elevata lipofilia, la presenza di gruppi accettori di legami ad idrogeno, gruppi aromatici e uno o più atomi di azoto protonabili a pH fisiologico. Inoltre, confrontando la struttura del Verapamile, primo composto riconosciuto attivo contro l’MDR, e della Pervilleina A, alcaloide tropanico con marcata attività anti-MDR appare evidente che queste molecole hanno una struttura comune in cui un atomo di azoto basico è legato, tramite linker, a due gruppi idrofobici aromatici. Sulla base di tutte queste considerazioni è da diversi anni che il gruppo di ricerca dove ho svolto il mio progetto di dottorato è coinvolto nella progettazione e sintesi di modulatori della Pgp con lo scopo di ottenere un ligande potente e selettivo, in grado di contrastare la MDR. Sono state quindi progettate diverse serie di molecole mantenendo tale motivo strutturale, ma variando la natura dei linker e dei residui aromatici. Nello specifico nel mio progetto di dottorato mi sono occupata della sintesi di molecole appartenenti • serie contenenti due funzioni esteree nelle quali variano la lunghezza e la flessibilità del linker utilizzato, oltre alla natura dei gruppi aromatici; • serie prive di residui esterei, ovvero analoghi ammidici isosterici e derivati alchilpiperazinici. L’attività anti MDR dei composti sintetizzati viene valutata tramite un test preliminare basato su un metodo spettrofluorimetrico, che misura l’uptake nucleare del chemioterapico fluorescente Pirarubicina (cosomministrata con varie concentrazioni della molecola in esame) in una linea cellulare eritroleucemica antraciclina-resistente che esprime solo la Pgp. Si ottiengono così una misura della potenza e dell’efficacia del composto. Come ulteriore approfondimento abbiamo ritenuto interessante valutare la stabilità in vitro di un set di molecole (data la presenza di due gruppi esterei nella struttura) in condizioni fisiologiche, cioè in PBS, e all’azione degli enzimi idrolitici del plasma. Inoltre la Pgp non è l’unica pompa di efflusso coinvolta nella resistenza crociata ai farmaci antitumorali. Hanno un ruolo molto importante anche altre due pompe appartenenti alla stessa famiglia di trasportatori ABC, ovvero MRP1 e BCRP. Quindi abbiamo ritenuto interessante valutare la selettività rispetto alle tre pompe coinvolte nella MDR. I risultati ottenuti indicano che i modulatori della Pgp sintetizzati nel corso degli anni a seguito di successive ottimizzazioni molecolari sono dotati di elevata potenza e efficacia, confermando indubbiamente che la presenza di un atomo di azoto basico collegato a due residui aromatici con linker di diversa natura ma di opportuna lunghezza sono caratteristiche importanti per avere inibizione della Pgp. Inoltre abbiamo trovato stereoselettività ed enantioselettività nell’interazione con la Pgp, caratteristica piuttosto rara in questo tipo di interazione.