Thèses sur le sujet « Terapia specifica »

Tra i pazienti con diagnosi iniziale di cardiomiopatia ipertrofica afferiti a Centri di Riferimento per le Cardiomiopatie, l’AC è la malattia non riconosciuta più comune con una prevalenza complessiva del 9%, e che aumenta con l'età (dall'1% nella fascia di età tra i 40-49 anni al 26% sopra gli 80 anni). Nella popolazione generale ≥55 anni più del 7% ha almeno un reperto ecocardiografico suggestivo di AC e l’ispessimento del setto interatriale è quello più frequente. I pazienti con elevato sospetto di AC (≥3 reperti) rappresentano l’1% della popolazione generale e il 4,9% di quelli con cuore non dilatato, ipertrofico e con FE normale.
Among patients with initial diagnosis of HCM, cardiac amiloidosis has a prevalence of 9% and it increases with age. In the general population > 55 yo more than 7% has echocardiographic suspicion of the disease and echocardiography has an important role in the early diagnosis of the disease

Introduzione. L'infezione perinatale da HIV-1 è acquisita quando il sistema immunitario del bambino è in fase di sviluppo ed è caratterizzata da un'elevata e non controllata replicazione virale. La terapia antiretrovirale altamente efficace (HAART), che genericamente prevede l'utilizzo di inibitori della proteasi e della trascrittasi inversa, riduce efficientemente la carica virale di HIV-1 sotto livelli non rilevabili e aumenta il numero di cellule T CD4+ circolanti nei bambini come negli adulti. Al fine di incrementare le scarse informazioni sul trattamento precoce con HAART e sull'immunoricostituzione in bambini HIV-1-infetti, è stata analizzata la dinamica virale e la risposta immunitaria in bambini trattati precocemente con HAART e l'immunoricostituzione in bambini HIV-1-infetti che hanno mostrato una risposta discordante alla terapia. Metodi. Coorte in HAART precoce: sono stati studiati 6 neonati HIV-1-infetti che hanno iniziato HAART entro i 3 mesi di età. HIV-1 RNA plasmatico, HIV-1 DNA cellula-associato, HIV-1 mRNA unspliced e multiply spliced e anticorpi anti-HIV-1 sono stati analizzati in campioni sequenziali di sangue periferico. La risposta immunitaria cellulare HIV-1-specifica è stata misurata mediante saggio EliSpot. Coorte discordante: le sottopopolazioni cellulari T CD4+ e CD8+ sono state studiate al baseline e dopo circa 2 anni di HAART in 14 bambini HIV-1-infetti che hanno mostrato una soppressione della viremia plasmatica (rispondenti virologici, VR) e in 16 bambini non rispondenti virologici alla terapia (VNR). Risultati. Coorte in HAART precoce. In tutti i bambini è stata osservata una riduzione della viremia plasmatica. In 4 bambini è stato rilevato l’HIV-1 DNA; di questi 2 erano anche positivi per l’HIV-1 mRNA. Solo 2 bambini hanno prodotto propri anticorpi anti-HIV-1 mentre gli altri, dopo la perdita degli anticorpi materni, sono rimasti persistentemente sieronegativi. In nessun paziente è stata osservata una risposta immunitaria cellulare HIV-1-specifica. L’interruzione di terapia è stata effettuata in un paziente HIV-1-sieropositivo ed in uno sieronegativo. L’aumento della viremia plasmatica nel bambino sieronegativo è stato più rapido ed elevato rispetto a quello osservato nel paziente sieropositivo. Coorte discordate. Durante HAART è stato riscontrato un aumento delle cellule T CD4+ sia nei bambini VR sia nei VNR; tale incremento era più elevato nel primo gruppo rispetto a quello rilevato nel secondo. Tutte le sottopopolazioni cellulari T CD4+ (naive, central memory, effector/memory e CD38+) sono aumentate significativamente nei bambini VR mentre nei VNR l’incremento significativo avveniva solo nelle cellule naive. In entrambe i gruppi si è osservato un aumento nelle cellule T CD8+ naive e nella forma epitomale di riarrangiamento del recettore delle cellule T (TREC), un indicatore della funzionalità timica. Le cellule T CD8+CD38+ attivate sono diminuite nei bambini VR mentre sono rimaste elevate nei VNR. I livelli plasmatici di lipopolisaccaride (LPS), un indicatore della translocazione microbica, erano aumentati nei pazienti VNR. Conclusioni. La somministrazione precoce di HAART nel neonato modifica il naturale corso dell’infezione da HIV-1. Tale regime, sebbene controlli la replicazione virale, riduce la viremia plasmatica sotto i livelli soglia necessari ad induce una risposta immunitaria HIV-1-specifica e non previene l’istaurazione di una latenza virale che impedisce l’eradicazione dell’infezione. Un prolungato trattamento con HAART nei bambini HIV-1-infetti permette, inoltre, un aumento delle cellule T naive che è indipendentemente dalla risposta virologica alla terapia. Una viremia persistente, comunque, impedisce l’espansione delle cellule T CD4+ memory suscettibili all’infezione virale e, insieme alla translocazione microbica, contribuisce a mantenere elevati i livelli di immuno-attivazione.
Background. Perinatal HIV-1 infection is acquired in the milieu of a developing immune system, leading to high levels of uncontrolled viral replication. Highly active antiretroviral therapy (HAART), which is usually a combination of protease and reverse transcriptase inhibitors, efficiently reduces HIV-1 load to undetectable levels and increases the number of circulating CD4 T cells in children as well as adults. To add to the scarce information available on early HAART treatment and immune reconstitution in HIV-1-infected children, we investigated the viral dynamics and the immunological response in early HAART treated-children and the immune reconstitution in HIV-1-infected children with discordant response to therapy. Methods. Early HAART cohort: 6 HIV-1-infected infants who started HAART within 3 months of age were studied. Plasma HIV-1 RNA, cell-associated HIV-1 DNA, unspliced and multiply spliced HIV-1 mRNAs, HIV-1 antibodies were assessed in sequential peripheral blood samples. HIV-1 cellular immune response was measured by EliSpot assay. Discordant cohort: CD4+ and CD8+ T cell subsets in 14 HIV-1-infected children with suppression of HIV-1 plasma viraemia (virological responders, VR) and in 16 virological non responders (VNR) to therapy were studied at baseline and after approximately 2 years of HAART. Results. Early HAART cohort. All children showed a decline in plasma viraemia to undetectable levels. HIV-1 DNA persisted in 4 children, but only 2 of these had detectable HIV-1 mRNA. All viral parameters remained persistently negative in 2 children. Only 2 children produced HIV-1 antibodies, while the others, after having lost maternal antibodies, remained seronegative. No HIV-1 cellular immune response was observed in any child. Therapy interruption was performed in 2 children: one HIV-1-seropositive and one HIV-1-seronegative with persistently undetectable levels of all viral parameters. Rebound of HIV-1 plasma viraemia in the seronegative child was more rapid and higher than that observed in the seropositive child. Discordant cohort. During therapy, CD4+ T cells increased in both groups, but were higher in the VR than in the VNR group. All CD4+ T cell subsets (naive, central memory, effector/memory and CD38+) increased significantly in VR children, while there was a significant increase only in naive cells in VNR children. Naive CD8+ T cells and T cell receptor rearrangement excision circles (TREC), an indicator of thymic output, increased in both VR and VNR children. Activated CD8+CD38+ T cells decreased in VR but remained high in VNR children. Levels of circulating lipopolysaccharide (LPS), an indicator of microbial translocation, further increased in VNR children. Conclusions. Early ART treatment in infants modifies the natural course of infection by controlling HIV-1 replication and reducing viral load to below the threshold levels required for onset of HIV-1 immune response, but does not prevent the establishment of a reservoir of latently infected cells that precludes virus eradication. Moreover, a long-term HAART treatment induced an increase in naive T cells in all HIV-1-infected children, regardless of their virological response. However, the persistence of viraemia resulted in an impaired expansion of memory CD4+ T cells susceptible to HIV-1 infection, and together with the microbial translocation sustained the persistence of a high level of immune activation.

Hepatitis B virus (HBV) recurrence after orthotopic liver transplantation (OLT) is associated with poor graft and patient survival. Treatment with HBV-specific immunoglobulins (HBIG) in combination with nucleos(t)ide analogs is effective in preventing HBV reinfection of the graft and improving OLT outcome. However, the combined immunoprophylaxis has several limitations, mainly the high cost and the lack of standard schedules about duration. So far, the identification of markers able to predict the reinfection risk is needed. Although the HBV-specific immune response is believed to play an essential role in disease outcome, HBV-specific cellular immunity in viral containment in OLT recipients is unclear. To test whether or not OLT recipients maintain robust HBV-specific cellular immunity, the cellular immune response against viral nucleocapsid and envelope-protein of HBV was assessed in 15 OLT recipients and 27 individuals with chronic and 24 subjects with self-limited HBV infection, respectively. The data demonstrate that OLT recipients mounted fewer but stronger clusters of differentiation (CD)8 T cell responses than subjects with self-limited HBV infection and showed a preferential targeting of the nucleocapsid antigen. This focused response pattern was similar to responses seen in chronically infected subjects with undetectable viremia, but significantly different from patients who presented with elevated HBV viremia and who mounted mainly immune responses against the envelope protein. In conclusion, virus-specific CD4 T cell–mediated responses were only detected in subjects with self-limited HBV infection. Thus, the profile of the cellular immunity against HBV was in immune suppressed patients similar to subjects with chronic HBV infection with suppressed HBV-DNA.

Hepatitis B virus (HBV) recurrence after orthotopic liver transplantation (OLT) is associated with poor graft and patient survival. Treatment with HBV-specific immunoglobulins (HBIG) in combination with nucleos(t)ide analogs is effective in preventing HBV reinfection of the graft and improving OLT outcome. However, the combined immunoprophylaxis has several limitations, mainly the high cost and the lack of standard schedules about duration. So far, the identification of markers able to predict the reinfection risk is needed. Although the HBV-specific immune response is believed to play an essential role in disease outcome, HBV-specific cellular immunity in viral containment in OLT recipients is unclear. To test whether or not OLT recipients maintain robust HBV-specific cellular immunity, the cellular immune response against viral nucleocapsid and envelope-protein of HBV was assessed in 15 OLT recipients and 27 individuals with chronic and 24 subjects with self-limited HBV infection, respectively. The data demonstrate that OLT recipients mounted fewer but stronger clusters of differentiation (CD)8 T cell responses than subjects with self-limited HBV infection and showed a preferential targeting of the nucleocapsid antigen. This focused response pattern was similar to responses seen in chronically infected subjects with undetectable viremia, but significantly different from patients who presented with elevated HBV viremia and who mounted mainly immune responses against the envelope protein. In conclusion, virus-specific CD4 T cell–mediated responses were only detected in subjects with self-limited HBV infection. Thus, the profile of the cellular immunity against HBV was in immune suppressed patients similar to subjects with chronic HBV infection with suppressed HBV-DNA.

Le infezioni del tratto urinario (UTIs) sono fra le più frequenti infezioni umane. Escherichia coli è l’agente eziologico più comunemente isolato, responsabile dell’85% delle batteriurie asintomatiche e dei casi di cistiti acute non complicate. L’adesione di E.coli uropatogeni (UPEC) alle cellule uroepiteliali è determinato da specifiche interazioni tra le adesine del patogeno e i recettori della cellula ospite. Tali infezioni rappresentano anche una delle più frequenti complicanze di molte patologie neurodegenerative. Sebbene la maggiore suscettibilità dei pazienti neuropatici alle UTIs sia stata da sempre ricondotta alla discinesia vescicale conseguente a questa condizione patologica, recenti evidenze scientifiche supportano l’idea che l’alterazione morfo-fisiologica dell’urotelio secondaria a traumi midollari, caratterizzata da perdita delle cellule a ombrello e rapido differenziamento delle cellule dello strato intermedio, possa determinare la maggiore predisposizione alle UTIs. A tal riguardo, la linea di ricerca ha previsto lo studio dell’espressione di markers di differenziamento uroteliale e dei principali componenti delle placche uroteliali. Dai dati emersi appare evidente che in seguito a trauma midollare si genera una compromissione della integrità superficiale dell’urotelio, con variazione dell’espressione delle citocheratine e delle uroplachine, che renderebbero l’epitelio vescicale più vulnerabile all’attacco dei batteri. L’uroepitelio non ricopre solo la funzione di barriera di permeabilità, ma è in grado di comunicare con il sistema nervoso, di ricevere stimoli chimici e fisiologici e di rilasciare molecole segnale. Dal momento che abbiamo recentemente dimostrato un legame tra recettori metabotropici per il glutammato (mGluRs) e sistema immune, si è voluto verificare se tali recettori, già identificati in molti organi periferici, venissero espressi anche in vescica e potessero influire sui meccanismi di difesa dell’urotelio. Noi descriviamo per la prima volta la presenza degli mGluRs in vescica di topo e di uomo e, in relazione ai risultati ottenuti dall’effetto del trattamento farmacologico di tali recettori sul meccanismo di internalizzazione batterica nelle cellule uroteliali, riteniamo che i farmaci modulatori degli mGluRs possano costituire nuovi target terapeutici nel trattamento delle UTIs.
The urinary tract infections (UTIs) are among the most frequent human infections: among bacteria, Escherichia coli is the commonest isolated, responsible of 85% of asymptomatic bacteriuria and acute cystitis. The adhesion of uropathogenic E.coli (UPEC) to the uroepithelial cells is determined by specific interactions between the pathogen adhesins and host cell receptors. These infections are also one of the most frequent complicances which occur in many neurodegenerative diseases. Although the increased susceptibility of neuropathic patients to UTIs has always been attributed to the bladder dyskinesia resulting from this condition, recent scientific evidences support the idea that the morphological and physiological alterations of the urothelium subsequent to the spinal cord injury and characterized by umbrella cells loss and rapid differentiation of intermediate layer cells can determine the increased predisposition to UTIs. In this regard, our research has been focused on the study of urothelial differentiation markers and on the expression of components of the urothelial plaques. The results suggest that following a spinal cord injury the urothelium surface integrity is lost thus the subsequent alterated expression of cytokeratins and uroplakines would make the bladder epithelium more vulnerable to bacterial attack. The uroepithelium well as representing the main barrier to assure the permeability is also able to actively communicate with the nervous system either receiving chemical and physiological stimuli or releasing signal molecules. Since recentely we demonstrated a link between metabotropic glutamate receptors (mGluRs) and the immune system, we wanted to even further investigate whether these receptors, already identified in many peripheral organs, are also expressed in bladder and if they could affect the urothelium defense mechanisms. For the first time, here we describe the presence of mGluRs in the mouse and human bladder and, according to results obtained, how these receptors when modulated with selective ligands, exert effects on bacterial internalization mechanism into urothelial cells. We believe that mGluRs drugs modulators can provide new therapeutic strategies for the treatment of UTIs.

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Introdu??o: a confian?a no equil?brio ? definida como ?a habilidade de um indiv?duo de manter o equil?brio durante a realiza??o das atividades de vida di?ria? e ? afetada pelas cren?as pessoais. Portanto, um sujeito que relata uma baixa confian?a no equil?brio pode apresentar pior desempenho do equil?brio postural. Uma das ferramentas mais utilizadas para quantificar a confian?a no equil?brio de indiv?duos da comunidade ? a escala Activities-specific Balance Confidence (ABC), tanto na vers?o original (ABC-16) quanto na vers?o curta (ABC-6). A escala ABC foi traduzida e adaptada para a popula??o de idosos brasileiros. Entretanto, o estudo de suas propriedades psicom?tricas ainda se faz necess?rio, al?m da defini??o de pontos de corte capazes de diferenciar idosos com e sem d?ficits no equil?brio postural. Objetivos: avaiar as propriedades psicom?tricas das escalas ABC-16 e ABC-6 e determinar pontos de corte capazes de diferencias idosos comunit?rios com d?ficits no equil?brio postural. M?todos: trata-se de um estudo metodol?gico que seguiu as recomenda??es do Consensus-based Standards for the Selection of Health Measurement Instruments (COSMIN) realizado de abril a novembro de 2017. O n?vel de confian?a no equil?brio foi avaliado pela ABC-16 e ABC-6. Para mensurar a confiabilidade interobservador, duas avalia??es foram realizadas por avaliadores distintos com 30 minutos de intervalo entre elas. Ap?s uma semana, um dos avaliadores reaplicou a escala para verificar a confiabilidade intraobservador. A ordem dos avaliadores foi determinada aleatoriamente. Um terceiro avaliador aferiu o equil?brio postural dos indiv?duos por meio da Escala de Equil?brio de Berg (EEB), as quatro condi??es do modified Clinical Test of Sensory Interaction and Balance (mCTSIB) e o teste de Apoio Unipodal (AU); o medo de cair por meio da Falls Efficacy Scale-International (FES-I), e a mobilidade por meio do teste de caminha de 4 metros (TC4m). O teste de correla??o de Spearman foi utilizado para determinar as validades de construto e crit?rio das escalas ABC-16 e ABC-6. A consist?ncia interna das escalas foi avaliada por meio do coeficiente ? de Cronbach, enquanto que as confiabilidades das escalas ABC-16 e ABC-6 foram mensuradas pelo Coeficiente de Correla??o Intraclasse (CII). Uma an?lise de regress?o linear foi utilizada para identificar as poss?veis vari?veis preditoras da confian?a no equil?brio e o teste de Mann-Whitney foi adotado para testar as diferen?as entre os sexos e entre os idosos com e sem queixas de tontura. Resultados: as escalas ABC-16 e ABC-6 mostraram uma correla??o estatisticamente significativa com a maioria das medidas de equil?brio postural, com a FES-I e o TC4m. A escala ABC-6 tamb?m apresentou correla??o estatisticamente significativa com o padr?o ouro para confian?a no equil?brio, a escala ABC-16 (r=0.958, p<0,001). A consist?ncia interna pelo ? de Cronbach da ABC-16 e da ABC-6 foi de 0.943 e 0.901, respectivamente. Para a ABC-6, observou-se confiabilidades intra e interexaminador de ICC=0.956 e ICC=0.946, respectivamente. J? para a escala ABC-16, encontramos confiabilidades intra e interexaminador de 0.972 e 0.968, respectivamente. A curva Receiver Operating Characteristics (ROC) indicou um valor de ?67% como o melhor ponto de corte para identificar idosos com d?ficits no equil?brio na escala ABC-16 (sensibilidade: 81%; especificidade: 77.4%), e ?44% (sensibilidade: 87.5%; especificidade: 82.1%) na escala ABC-6. Conclus?o: tanto a escala ABC-16 quanto a ABC-6 apresentam, no geral, uma boa validade, e excelentes confiabilidades intra e interobservador e consist?ncia interna. Portanto, estas escalas s?o adequadas para a avalia??o da confian?a no equil?brio de idosos brasileiros residentes na comunidade. Al?m disso, os pontos de corte para as escalas encontrados podem ser ?teis no rastreio de idosos residentes na comunidade com d?ficits no equil?brio postural e maior risco de cair.
Introduction: Balance confidence is described as ?a person?s ability to maintain balance while performing activities of daily living? and is affected by an individual?s beliefs. Therefore, an individual who report a low confidence in balance may present lower postural balance performances. One of the most used tools to quantify the balance confidence of the community-dwelling individual is the Activities-specific Balance Confidence (ABC) scale, in its original (ABC-16) and short (ABC-6) versions. The ABC scale was translated and adapted to the Brazilian older adults. However, the study of the psychometric properties is still required and also cut-off points for both scales have not been provided yet. Objectives: To investigate the psychometric properties of the ABC-16 and ABC-6, and to determine cut-off points capable to identity community-dwelling older adults with deficits in postural balance and higher risk of falling. Methods: This is a psychometric study that followed the Consensus-based Standards for the Selection of Health Measurement Instruments (COSMIN). This study took place from April 2017 to November 2017. The level of balance confidence was assessed by the ABC-16 and ABC-6. To assess the interrater reliability, two evaluations with a 30-minute interval was performed by distinct evaluators. After one week, one of the evaluators re-applied the ABC-16 to verify the intrarater reliability. The order of the evaluators was chosen randomly. A third examiner assessed the postural balance of the individuals through the Berg Balance Scale (BBS), the modified Clinical Test of Sensory Interaction on Balance (mCTSIB) and the Unilateral Stance (US), the fear of falling through the Falls Efficacy Scale-International (FES-I), and mobility through the 4-m walk test (4MWT). Results: The ABC-16 and ABC-6 showed a statistically significant correlation with most of the measures of postural balance, FES-I and 4MWT. The ABC-6 also presented statistically significant correlation with the gold standard, the ABC-16 (r=0.958, p<0,001). The internal consistency analysis of the ABC-16 and ABC-6 yielded a Cronbach?s ? value 0.943 and 0.901, respectively. Both ABC-16 and ABC-6 presented excellent intra and interrater reliability. The Receiver Operating Characteristics (ROC) curve indicated a value of ?67% as the best cut-off point to identify older adults with balance impairments in the ABC-16 (sensitivity: 81%; specificity: 77.4%), and ?44% (sensitivity: 87.5%; specificity: 82.1%) in the ABC-6. Conclusion: Both ABC-16 and ABC-6 have an overall good validity, and excellent internal consistency, and intra and inter-rater reliability. Therefore, these scales are suitable tools for assessing balance confidence in the Brazilian community-dwelling elderly people.

El desenvolupament de noves teràpies s’està duent a terme arreu del món per poder fer front a les necessitats clíniques que actualment no disposen de tractament. En particular, els avenços en productes medicinals de teràpia avançada (ATMP) són una gran promesa per al tractament de malalties sense altres opcions terapèutiques. Tanmateix, els investigadors i les autoritats reguladores que implementen aquestes teràpies lluiten per estandarditzar tant els protocols com els productes finals. Entre els reptes s’inclouen l’elevada intervariabilitat de donants i mecanismes d’acció complexos. A més, és necessari demostrar l’activitat biològica d’aquestes teràpies mitjançant assajos de potència. Aquesta tesi consisteix en el desenvolupament i caracterització de dos ATMP basats en cèl·lules multipotents estromals mesenquimals (MSC) i cèl·lules T específiques de virus (VST). D'una banda, s’ha fet l’avaluació d'un test de potència i identitat per la producció de MSC aïllades de la gelatina de Wharton (WJ) i de la medul·la òssia (BM). L’objectiu proposat per MSC era realitzar: a) un assaig de potència per avaluar la capacitat immunomoduladora de les MSC; b) la revisió de l’expressió del HLA-DR pels criteris de definició de les MSC; i c) l'aplicació d’una eina per gestionar el risc. En aquest treball es presenta l’optimització d’un assaig d’immunopotència, validat i aprovat per l’autoritat competent per a l’alliberament de producte. S’ha estudiat l’expressió del HLA-DR, marcador suposadament negatiu, en les BM-MSC de grau clínic. Els resultats van mostrar una correlació entre l’expressió del HLA-DR i els nivells d’IL-17F i IL-33. L'expressió del HLA-DR no va afectar la identitat de les MSC, ni el potencial de diferenciació ni la capacitat immunomoduladora. Per reforçar aquests resultats, es van realitzar estudis interlaboratori obtenint resultats similars. L'ús de suplements basats en sèrum humà o lisat plaquetari no mostrava diferències en l'expressió de HLA-DR en MSC. També es va implementar la gestió de riscos com a eina de qualitat per detectar debilitats d’un bioprocés. Aquests enfocaments s’han dut a terme per MSC en assajos clínics. D'altra banda, es va realitzar el desenvolupament d'un protocol d'expansió ex vivo de VST. La teràpia amb VST està destinada a pacients immunocompromesos, susceptibles de patir una reactivació o infecció de novo de l’herpesvirus entre d’altres. És el cas del citomegalovirus (CMV), que pot produir una infecció lleu en individus sans, però té una elevada morbiditat i mortalitat en individus immunocompromesos. Els medicaments antivirals disponibles poden produir toxicitat i no sempre són efectius. La immunoteràpia adoptiva ofereix una alternativa als pacients en una situació crítica i sense altres opcions terapèutiques. Per satisfer aquesta demanda es va elaborar un protocol de fabricació de VST fàcilment transferible als estàndards farmacèutics. Amb el mètode proposat, després d’un cocultiu de 14 dies amb cèl·lules dendrítiques polsades amb pp65, es van obtenir un gran nombre de VST. El cultiu es basava en la tecnologia G-Rex i es suplementava amb IL-2, IL-7, IL-15, i anticossos anti-CD3 i anti-CD28. El producte final es va caracteritzar àmpliament i estava format per limfòcits T CD4+ i CD8+, on la subpoblació majoritària corresponia a les cèl·lules T efectores de memòria, població coneguda per proporcionar una funció efectora. Cal destacar la citotoxicitat de les cèl·lules expandides específicament enfront al pp65. Els estudis d’al·loreactivitat amb HLA totalment incompatibles, van mostrar una lisi cel·lular per sota del 5%. En resum, s’ha descrit un protocol transferible a les normes de correcta fabricació actuals i un producte segur i eficaç in vitro, funcional després de la descongelació. El darrer fet, facilitaria la generació d’un banc al·logènic de VST. Les perspectives de futur inclourien la fabricació de cèl·lules T específiques per a múltiples virus.
Innovative therapies are being developed worldwide to tackle unmet clinical needs. In particular, progress in advanced therapy medicinal products (ATMP) has shown great promise for the treatment of diseases with no other option available. However, researchers and regulatory authorities deal with the sophisticated nature of these medicines, and struggle to standardise both production protocols and final product formulation. Challenges related to the living nature of these products include high donor intervariability and complex mechanisms of action, which are sometimes not completely understood. Additionally, these newly therapies need to demonstrate biological activity with potency assays. This dissertation comprises the development and characterisation of two different ATMP based on multipotent mesenchymal stromal cells (MSC) and virus-specific T cells (VST). On the one hand, assessment of identity and potency for product release of MSC isolated from Wharton’s jelly (WJ) and bone marrow (BM) in the context of current good manufacturing practice (cGMP) production is performed. In this regard, we aimed at proposing: a) a potency assay for assessing immunomodulation capacity of MSC; b) the revision of HLA-DR expression profile for MSC definition criteria; and c) the application of risk management methodologies in the assessment of product quality. The optimisation of an immunopotency assay, validated, and approved by the competent authority for product release is presented. Moreover, other quality attributes of MSC are addressed. Regarding BM-MSC, the apparently random expression of HLA-DR, a marker that was expected negative in expansion cultures of MSC, is studied in clinical grade productions. Our findings showed correlation of HLA-DR expression with levels of IL-17F and IL-33. Expression of HLA-DR did not affect MSC identity, differentiation potential nor immunomodulatory capacity. To further strengthen these outcomes, interlaboratory studies were performed obtaining similar results. Furthermore, the use of either human sera or platelet lysate supplements showed no differences in terms of HLA-DR expression. A risk management assessment methodology was also implemented as a tool for quality by design to detect weaknesses of an established bioprocess involving MSC products already in clinical trials. On the other hand, regarding T lymphocytes, the development of a protocol for ex vivo expansion of VST was performed. VST therapy is intended for immunocompromised patients, which are susceptible of reactivation or de novo infection of herpesviruses among others. This is the case of cytomegalovirus (CMV) that undergoes a mild infection in healthy individuals but has been associated to a high morbidity and mortality in immunocompromised individuals. Unfortunately, available antiviral drugs can produce toxic side effects and are not always effective. Adoptive immunotherapy offers an alternative approach for those patients in a critical situation with no other therapeutic option. Therefore, we developed a protocol for VST scale-up manufacture easily transferable to pharmaceutical standards. Following with the method proposed, we obtained large number of CMV pp65-specific T cells after 14-day co-culture with pp65 pulsed dendritic cells. Culture was based on G-Rex bioreactor technology and supplemented with IL-2, IL-7, IL-15, anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. The final product was extensively characterised in terms of identity, purity and potency. VST product was comprised of both CD4+ and CD8+ T lymphocytes, and effector memory T cells represented the major subset, which are known to provide effector function. Most importantly, we successfully demonstrated pp65 specific cytotoxicity of the expanded cells. Interestingly, complete HLA mismatch alloreactivity resulted in less than 5% cell lysis. In summary, a feasible protocol transferable to cGMP was described for an in vitro safe and effective product, which remain functional after thawing, thus providing practical evidence for the generation of an allogeneic third-party bank. Future perspectives would include the manufacture of multivirus-specific T cells.

La terapia CAR-T rappresenta un approccio promettente, ma ha riportato una ridotta efficacia nella leucemia mieloide acuta (AML), a causa dell’eterogeneità del tumore, dell’assenza di antigeni target AML-specifici e del ruolo del microambiente leucemico nella protezione dei blasti e delle cellule staminali leucemiche (LSC). La nicchia midollare, nella quale risiedono le LSC, è coinvolta in attività che promuovono la progressione leucemica e sopprimono l’ematopoiesi sana. Quindi ipotizziamo che bersagliare le LSC nascoste nella nicchia potesse migliorare l’efficacia delle CAR-T. Per testare la nostra ipotesi, abbiamo agito su due fronti: 1) promuovere una migrazione efficiente delle CAR-T nella nicchia midollare, 2) selezionare un antigene target ristretto ai blasti leucemici e alle LSC. Prima, abbiamo proposto una strategia per guidare le cellule CD33.CAR CIK (Cytokine-Induced Killer), una sottopopolazione di cellule T effettrici, verso la nicchia leucemica. La chemochina CXCL12, rilasciata dalle cellule mesenchimali stromali (MSC), nella nicchia midollare, e il suo recettore CXCR4, sono coinvolti nella regolazione della migrazione dei leucociti all’interno della nicchia. Quindi, abbiamo ipotizzato che sfruttare questo asse potesse migliorare la capacità di homing delle CD33.CAR-CIK nella nicchia e favorire l’eradicazione della leucemia. Tuttavia i protocolli di manipolazione ex vivo delle CD33.CAR-CIK riducono l’espressione di CXCR4, compromettendo la capacità delle cellule infuse di raggiungere la nicchia. Quindi per implementare la capacità di homing delle CD33.CAR-CIK nel microambiente midollare, abbiamo sviluppato delle CD33.CAR-CIK overesprimenti CXCR4, nella sua forma wild-type o iperattiva mutata. Le CIK ingegnerizzate con i costrutti CD33.CAR-CXCR4 hanno mostrato un consistente aumento dell’espressione di CXCR4, senza riportare alterazioni fenotipiche e nelle funzioni effettrici CAR-associate. Inoltre, rispetto alle CD33.CAR-CIK, le cellule CD33.CAR-CXCR4WT -CIK ed in particolare le CD33.CAR-CXCR4MUT-CIK hanno dimostrato non solo una superiore risposta chemotattica in vitro verso il CXCL12 ed i surnatanti delle MSC, ma anche un aumentato homing in vivo. In seguito, per promuovere lo sviluppo di un approccio CAR-T più efficace e sicuro, abbiamo proposto di re-indirizzare il CAR verso un antigene espresso selettivamente dalle cellule AML, ma assente sulle cellule staminali ematopoietiche (HSC). TIM-3 è un immune checkpoint, svolge un ruolo centrale nella regolazione delle risposte immunitarie nell’AML e costituisce un marcatore selettivo per le LSC, senza essere espresso dalle HSC. Abbiamo disegnato un CAR di terza generazione diretto contro TIM-3, utilizzando la porzione scFv derivante da un anticorpo monoclonale anti-TIM-3. In vitro, le TIM-3.CAR-CIK hanno dimostrato di eliminare sia le linee AML che i blasti primari, senza dare tossicità verso le cellule TIM-3+ sane, come le CIK attivate, i monociti e le cellule NK. Inoltre, le TIM-3.CAR-CIK hanno eliminato in maniera selettiva le LSC (CD34+ CD38-). Infine, le TIM-3.CAR-CIK hanno mantenuto le loro capacità effettrici nonostante multiple ristimolazioni in vitro, gettando le basi per lo studio di questo costrutto in vivo. Complessivamente, entrambi gli approcci, uno implementando l’homing delle CAR-CIK alla nicchia midollare e l’altro conferendo una superiore selettività, potrebbero migliorare l’efficacia della terapia CAR-T nel contesto dell’AML.
Chimeric Antigen Receptor (CAR) T-cell therapy has produced remarkable clinical responses in patients affected by acute lymphoblastic leukemia. Unfortunately, CAR T-cells have not been equally successful in acute myeloid leukemia (AML) due to tumor heterogeneity, lack of truly AML-restricted target antigens and the role of leukemia microenvironment in blasts protection and leukemia stem cells (LSCs) maintenance. Specifically, the bone marrow (BM) niche, where LSCs reside, is involved in leukemia promoting activities whilst suppressing normal hematopoiesis. Therefore, we hypothesized that targeting LSCs at their location may enhance the potency and selectivity of CAR-T cells. To address this issue, we have designed two aims: 1) promote rapid and efficient localization of CAR T-cells within the BM niche, 2) select a leukemia-restricted antigen to specifically target AML blasts and LSCs. First, we proposed to harness CD33.CAR-redirected Cytokine-Induced Killer (CIK) cells, an alternative effector T-cell population with acquired NK-like cytotoxic activity as well as minimal alloreactivity, to selectively route their activity to leukemia transformed niche. The chemokine ligand 12 (CXCL12), released by mesenchymal stromal cells (MSCs) within the medullary niche, and its chemokine receptor 4 (CXCR4) are two pivotal players regulating leukocytes trafficking to the BM. In AML, CXCL12 interacts with CXCR4 overexpressed on blasts, promoting their migration and homing in the niche. Hence, taking advantage of this axis might facilitate CD33.CAR-CIK cells homing to the BM and therefore leukemia eradication. However, ex vivo manipulation protocols of CD33.CAR-CIK cells consistently downregulate CXCR4 expression and may affect the capacity of adoptively infused cells to migrate to BM and exert their anti-leukemic action. Therefore, to improve CD33.CAR-CIKs homing in the BM microenvironment we have developed CD33.CAR-CIK cells overexpressing CXCR4, in its wild-type or hyperactive mutant form. Notably, CIK cells engineering with CD33.CAR-CXCR4 constructs led to a consistent increase in CXCR4 expression, without altering CIK cells phenotype and CAR-related effector functions. Interestingly, compared to conventional CD33.CAR-CIK cells, CD33.CAR-CXCR4WT and especially CD33.CAR-CXCR4MUT-CIK cells demonstrated significantly superior in vitro chemotactic response toward CXCL12 and MSC-derived supernatants, and greater in vivo BM homing ability and persistence. Furthermore, to develop an effective anti-AML CAR T-cell therapy, it is fundamental to identify a LSC-specific marker, sparing the normal counterpart of hematopoietic stem cells (HSCs). T-cell immunoglobulin and mucin protein 3 (TIM-3) is an immune checkpoint molecule, it plays a central role in immune responses in AML and it is an LSC-specific marker, lacking expression on HSCs. Therefore, we designed a third-generation anti-TIM-3.CAR using the single-chain fragment variable (scFv) derived from an antagonistic ligand-blocking anti-TIM-3 antibody. In vitro, TIM-3.CAR-CIK cells efficiently killed both AML cell lines and primary AML blasts, but not normal TIM-3+ activated CIK cells, monocytes and NK-cells. Notably, we observed selective elimination of primary LSC-enriched population (CD34+ CD38-). Furthermore, TIM-3.CAR-CIK cells maintained their effector functions despite multiple in vitro restimulations, setting the basis for further exploration in in vivo models. Overall, both approaches, one improving CAR-CIK cells homing to the transformed niche and the other conferring superior safety and selectivity, might improve the efficacy of anti-AML CAR-CIK therapy.

O objetivo deste estudo foi comparar o desempenho psicolingüístico de crianças com Distúrbio Específico de Linguagem (DEL) com o de crianças que apresentam desenvolvimento típico de linguagem (DTL), apontando os marcadores psicolingüísticos mais significativos do distúrbio e também comparar a eficácia de dois métodos de intervenção - Modelo de Intervenção no Meio e Modelo Neuropsicolingüístico - no desempenho psicolingüístico das crianças com DEL. Participaram desta investigação 12 pré-escolares de ambos os gêneros, com idade entre 4:0 - 6:11 anos, sendo metade deles pertencentes ao grupo experimental - crianças com DEL, submetidos à intervenção - e os demais ao grupo controle - crianças com DTL, não submetidos à intervenção. A quantificação do rendimento dos sujeitos nas distintas dimensões psicolingüísticas foi obtida mediante a utilização de diversos instrumentos, com o propósito de avaliar o nível primário, secundário e terciário da recepção e produção lingüística. Posteriormente às avaliações préintervenção, o grupo experimental foi distribuído aleatoriamente em dois grupos e submetido a dois diferentes modelos terapêuticos (primeiro ciclo), com duração de quatro meses. Ao fim deste ciclo foi reavaliado, submetido a quatro meses de terapia em que os Modelos foram alternados e os grupos novamente reavaliados. A análise estatística revelou a existência de diferença estatisticamente significante entre o desempenho do grupo experimental e controle em vários níveis de análise e produção lingüística, sendo os marcadores mais significativos encontrados os que envolvem a discriminação auditiva, análise fonológica, recepção e organização morfossintática, memória de curto prazo e habilidades pragmáticas quanto ao uso de turnos expansivos. Já a comparação da eficácia dos dois Modelos de intervenção propostos revelou que as distintas habilidades psicolingüísticas responderam de forma diferente aos mesmos, sugerindo que a combinação das estratégias dos Modelos investigados possa ser o melhor caminho quando se deseja intervir nos quadros de crianças cujas dificuldades encontram-se situadas nos níveis de análise e produção lingüística investigados neste trabalho.
This study aimed to compare the psycholinguistic performance of children with Specific Language Impairment (SLI) to children with Typical Language Development (TLD), pointing out the most significant psycholinguistic markers, and to compare the effectiveness of two intervention methods, Milieu Teaching Approach and Neuropsycholinguistic Model, in the psycholinguistic performance of children with SLI. The subjects were 12 pre-school boys and girls, 4:00 to 6:11 years old; half of them took part in the experimental group - children with SLI submitted to intervention - and the others in the control group - children with TLD not submitted to intervention. The subject performance quantification in distinct psycholinguistic dimensions was obtained through several tools in order to evaluate the primary, secondary and tertiary levels of linguistic reception and production. After pre-intervention evaluations, the experimental group was randomly distributed into two study groups and submitted to two different therapeutic models (first cycle) during four months. At the end of this cycle, it was evaluated again, submitted to four-month therapy with alternating Models and re-evaluated. Statistical analysis showed the existence of statistically significant difference in the performance between the experimental group and the control one in several levels of linguistic analysis and production. The most significant markers involve auditory discrimination, phonological analysis, morphosyntactic reception and production, short-term memory and pragmatic abilities in relation to the use of expansive turns. The comparison of the effectiveness between the two proposed Models showed that distinct psycholinguistic abilities responded differently to themselves, which suggests that the combination of strategies of the studied Models be the best way to intervene in the performance of children whose difficulties lie in the investigated analysis and linguistic production levels of this study.

The development of novel technologies is allowing a complete description of the heart structure and function, including geometrical, myocardial tissue viability and electrical activation information. The joint analysis of this information helps to improve clinical interventions such as radio-frequency ablation of cardiac arrhythmias. However, the acquired data and related indices need to be integrated onto a common reference space for its analysis. This integration is not straightforward due to the different characteristics of acquisition systems. The aim of this thesis was to develop and evaluate different mapping strategies for the integration and joint analysis of multi-modal data of the heart. A new integration methodology was developed and compared with state-of-the-art techniques in several applications with synthetic and clinical data, within the framework of three different clinical scenarios: a) integration of electrical with tissue viability; b) analysis of electrical activation data; and c) validation of myocardial tissue characterization with histological data.
El desarrollo de nuevas tecnologías permite una completa descripción de la estructura y funcionalidad cardíaca incluyendo la geometría la viabilidad del tejido y la información de activación eléctrica. Un análisis conjunto de esta información permite mejorar intervenciones clínicas como la ablación por radio frecuencia en arritmias. Sin embargo, los datos adquiridos deben ser integrados en un mismo sistema de referencia para su análisis. Esta integración no es trivial debido a las diferentes características de adquisición de datos. El objetivo de esta tesis es desarrollar y evaluar diferentes estrategias para la integración y el análisis de datos multimodales del corazón. La nueva metodología de integración ha sido comparada y evaluada con otras técnicas en datos sintéticos y clínicos. Se han evaluado en tres escenarios clínicos distintos: a) integración de datos eléctricos con viabilidad de tejido; b) análisis de activación eléctrica; y c) validación de la caracterización del tejido con datos histológicos.

The aim of this work is describe common methods of biological feedback therapy that is used to treat some psychosomatic diseases. Subsequently, the description is focused on minimal brain dysfunction treatment by the help of EEG biofeedback. Properties and technical requirements for this therapy are concretized. The last part of this thesis is dedicated to the design and realization of practical software tool for EEG biofeedback therapy which is made in LabView 7.1. The M535 acquisition unit and NI USB-6221 measuring device are used for hardware solution.

Charles University Fakulty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biophysics and Physical Chemistry Candidate: Bc. Barbora Parýzková Supervisor: Mgr. Pavel Bárta, Ph.D. Title of diploma thesis: Radiolabelled receptor-specific peptides for cancer diagnosis and therapy. The presented diploma thesis is based on literature review and it deals with receptor- specific radioactive labeled peptides and their usage in the cancer diagnostic and treatment. It focuses on general knowledge about radiopharmaceuticals, further on the descriptions of either diagnostic or therapeutic radionuclides as well as on currently used chelating agents. The particular attention is paid to peptides like somatostatin and cholecystokinin and their usability in Nuclear Medicine for the imaging and treatment of certain malignancies. The other stated peptides in this diploma thesis are bombesin, vasoactive intestinal peptide and alpha melanocyte stimulating hormone. Keywords: receptor-specific peptides, radiolabelling, radionuclides for diagnosis and therapy, radiotherapy, radiodiagnostics, octreotide.

Dissertação de mestrado em Bioquimica apresentada ao Departamento Ciências da Vida da Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
O adenocarcinoma do pâncreas é a quarta causa de morte do mundo ocidental sendo, dos tumores sólidos, o mais letal. Pacientes diagnosticados com cancro do pâncreas apresentam um prognóstico extremamente pobre com uma sobrevivência média inferior a 6 meses e uma taxa de sobrevivência de 3% a 5%. A cirurgia continua a ser a única forma de tratamento. Infelizmente, apenas 10 a 20% dos pacientes apresentam tumores operáveis aquando do diagnóstico. Para casos de tumores pancreáticos localmente avançados, inoperáveis e metastáticos não existe cura sendo a quimioterapia o tratamento usado. O cancro do pâncreas devido à sua genética é considerado um dos cancros mais complexos tendo mais mutações que qualquer outro tipo de tumor. Esta patologia apresenta ainda um padrão de expressão único de microRNAs que permite distinguir com 95% de precisão tumores pancreáticos de pancreatite e de tecido saudável. Existem ainda outras moléculas que se encontram sobre-expressas neste tipo de tumores, que apresentam um elevado potencial quer terapêutico quer de diagnóstico, nomeadamente os receptores de EphA4. A terapia génica é uma estratégia terapêutica promissora para o tratamento do cancro. Os vectores não virais, como os lipossomas catiónicos, apresentam-se como uma forma simples e segura de entrega de agentes terapêuticos nas células alvo. A adição de PEG e de ligandos (como peptídeos) aos lipossomas são melhoramentos que, respetivamente, permitem a sua administração intravenosa e conferem-lhes especificidade. O objectivo deste projecto consistiu em desenvolver uma nova formulação de lipoplexos, baseada em lipoplexos de EPOPC:Chol/DNA, que possuísse a capacidade de entregar, de forma específica, material genético (nomeadamente pDNA que codifique um gene terapêutico e/ou LNAs contra microRNAs sobre-expressos) às células do cancro do pâncreas, através da sua administração intravenosa. A formulação de lipoplexos HSA-EPOPC:Chol/DNA 4/1 (+/-) apresentou uma elevada actividade biológica, mesmo na presença de soro. A aplicação de uma estratégia combinada envolvendo agentes quimioterapêuticos e lipoplexos demonstrou que alguns fármacos têm a capacidade de aumentar substancialmente a actividade biológica dos lipoplexos. Além disso, esta formulação demonstrou também uma elevada eficiência de entrega de LNAs às células. Contudo, quando os lipoplexos foram preparados com LNAs pré-incubados com pDNA a eficiência dos LNAs diminuiu significativamente. Foram também desenvolvidas estratégias de pós-peguilação e de direcionamento para os receptores EphA4 usando peptídeos (APY ou KYL), por forma a obter complexos estáveis e específicos. De todas as formulações desenvolvidas apenas a formulação EPOPC:Chol/DNA 4/1 (+/-) contendo 2 mol% de CerC8-PEG apresentou elevada actividade biológica, semelhante à obtida com os lipoplexos controlo. As restantes formulações de lipoplexos, contendo DSPE-PEG-MAL, com ou sem peptídeos, apresentaram uma baixa actividade biológica, muito provavelmente porque estes lipoplexos não são capazes de sair da via endocítica. Os resultados obtidos neste trabalho indicam que estratégias combinadas, envolvendo agentes de quimioterapia e terapia génica, poderão ser de grande importância para o desenvolvimento de novas estratégias antitumorais para aplicação no cancro do pâncreas. No que diz respeito aos sistemas de transporte e entrega de material genético, os lipoplexos baseados em EPOPC:Chol/DNA, contendo pequenas quantidades de Cer-PEG, apresentam um elevado potencial para aplicação in vivo. Contudo, é necessário fazer trabalho adicional para desenvolver uma formulação que possua a capacidade de entregar, de forma específica e eficiente, o material genético às células do cancro do pâncreas.
Pancreatic adenocarcinoma is the most lethal solid tumor, being the fourth cause of death in the western world. Pancreatic cancer patients have an extremely poor prognosis with a median survival inferior to 6 months and a survival rate of 3-5%. Surgery remains the only treatment offering an advantage in terms of overall survival but, unfortunately, only 10-20% of the patients present resectable disease at the time of diagnosis. For locally advanced, unresectable, and metastatic disease, treatment is palliative being chemotherapy the standard approach. The genetics of pancreatic cancer makes it one of the most complex malignant diseases, with more mutations than any other common tumor type. An unique miRNA signature was identified in pancreatic cancer distinguishing this cancer from normal and benign pancreas and pancreatitis with 95% of accuracy. Other molecules that are overexpressed in pancreatic tumors present a great potential as tools for diagnose and therapy, namely EphA4 receptors. The broad field of gene therapy promises a number of innovative treatments that are likely to become important in preventing death from cancer. Cationic liposomes are non-viral vectors and represent a simple and, most importantly, a safe way to deliver therapeutic molecules into the target cells. PEG molecules and ligands (such peptides) are common improvements allowing intravenous applications and conferring specificity, respectively, to the liposomes. The purpose of this work was the development of a new lipoplex formulation, based on EPOPC:Chol/DNA lipoplexes, that had the ability to specifically deliver genetic material (namely pDNA encoding a therapeutic gene and/or LNAs against miRNAs overexpressed in PDAC) to pancreatic cancer cells, by using an intravenous administration pathway. The HSA-EPOPC:Chol/DNA 4/1 (+/-) lipoplex formulation showed a high biological activity, even in the presence of serum. The application of a combined strategy involving chemotherapeutic agents and lipoplexes demonstrated that some drugs had the ability to strongly increase the transfection activity of lipoplexes. It was also observed that the HSA-EPOPC:Chol/LNA 4/1 (+/-) formulation is an efficient carrier to deliver LNAs, although this efficiency had been significantly reduced when LNAs were pre-incubated with pDNA. It was also developed a post-pegylation strategy and a targeting approach to the EphA4 receptors using peptides (APY or KYL). From all the developed formulations only the EPOPC:Chol/DNA 4/1 (+/-) lipoplexes with 2mol% of CerC8-PEG presented high biological activity, similar to that obtained with the positive control lipoplexes. The lipoplex formulations containing DSPE-PEG-MAL molecules, with or without peptide, had low transgene expression, most probably due to their entrapment in the endolysomal pathway. Overall, the obtained results indicate that combined strategies involving chemotherapeutic agents and gene therapy approaches could be of great importance for the development of new antitumor strategies for application in pancreatic cancer. Regarding the gene delivery systems, the EPOPC:Chol/DNA-based lipoplexes incorporating low amounts of Cer-PEG presented high potential for in vivo applications. However, more work should be done in order to develop a formulation that had the ability to specifically and efficiently deliver genetic material into pancreatic cancer cells.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2011
Despite the success of antiretroviral cocktails, a cure for HIV-1 remains elusive. This is mainly due to the existence of persistent cellular reservoirs infected with non-transcriptional, latent HIV-1. An effective treatment against HIV-1 would target both active and latent HIV-1-infected cells, and eliminate them without harming non-infected cells. In order to achieve this, we have developed a therapeutic plasmid with a Tat/Rev-dependent toxin expression. This vector contains a HIV-1 transcriptional activator to specifically activate latent infected cells. We confirmed the expression of all vector components necessary to achieve our goal. We then assessed the potential of this therapeutic plasmid to specifically eliminate infected cells by transduction of a T-lymphoma cell line that has a HIV-1 latent provirus integrated in its genome. We demonstrated that our therapeutic plasmid is not only capable of reactivating latent HIV-1 expression by itself, but it also can induce cell death efficiently and specifically in HIV-1 infected cells. Cell death was 60% higher in infected cells than in non-infected cells, indicating that our therapeutic vector was able to fulfill the objective proposed in this work. Therefore, the data presented here represents a promising approach for the development of a gene therapy that could become a viable and successful treatment against HIV-1.
O vírus da imunodeficiência humana (VIH) é o agente responsável pelo síndroma de imunodeficiência adquirida (SIDA), caracterizado por uma supressão do sistema imunitário levando à ocorrência de doença oportunistas. Desde a sua descoberta em 1983, o VIH terá sido responsável mais de 25 milhões de mortes em todo o mundo, sendo um dos temas mais investigados actualmente. O VIH é um lentivírus pertencente à família Retroviridae. É um vírus de cadeia de RNA positiva que se encontra encapsidado e que sofre transcrição reversa no interior da célula, originando um intermediário de DNA que é integrado na forma de um provírus no genoma da célula hospedeira. O genoma proviral do VIH codifica nove grelhas de leitura abertas das quais 3 codificam poliproteínas estruturais (Gag, GagPol e Env). Sendo o VIH um retrovírus complexo, este codifica ainda 6 proteínas acessórias responsáveis pela regulação e coordenação do seu fenótipo (Tat, Rev, Nef, Vpr, Vpx e Vif). A proteína Tat (transactivador da transcrição viral) é responsável pelo aumento da expressão do mRNA viral acima de níveis basais. A Tat liga-se a uma estrutura secundária presente no mRNA nascente, recrutando factores de transcrição que vão aumentar o elongamento do mesmo. A proteína Rev (proteína reguladora viral) tem um papel determinante no splicing e no transporte dos mRNAs virais para o citoplasma. Apesar dos avanços no desenvolvimento de terapias contra o VIH-1 através do uso de fármacos antiretrovirais, estes não são capazes de eliminar completamente o vírus do organismo. O maior obstáculo à erradicação do VIH-1 é a existência de reservatórios virais persistentes no hospedeiro. Reservatórios virais são todas as células infectadas com VIH-1 que não são eliminadas do hospedeiro, principalmente devido à capacidade do VIH-1 estabelecer um estado de latência no interior da célula. A latência viral do VIH-1 é caracterizada como um estado de infecção não expressivo que permite a evasão do vírus à resposta do sistema imune, e à acção de fármacos antiretrovirais. Estes reservatórios podem servir como fonte de produção viral. Os principais reservatórios de VIH-1 são os linfócitos T CD4+ de memória, que possuem um tempo de meia-vida prolongado. Deste modo eliminar estes reservatórios virais é extremamente importante. Um tratamento eficaz contra o VIH-1 deve ter como base o desenvolvimento de uma terapia que seja capaz de atingir todas as células infectadas com VIH-1, incluindo as células com VIH latente, sem causar danos a células não infectadas. Deste modo o desenvolvimento de terapias alternativas tal como a terapia génica, mostra especial interesse. A terapia génica consiste na transferência de transgenes para células alvo promovendo a alteração do seu fenótipo. Até ao momento vários tipos de transgenes foram testadas no combate ao VIH-1 (toxinas, anticorpos, interferência de RNA, etc.). O uso de lentivírus como veículos para a transferência e expressão destes transgenes, apresentam diversas vantagens. Os lentivírus são capazes de infectar células que não se encontram activamente a dividir, e apresentam baixa imunogenecidade. No entanto o aparecimento de estirpes replicativamente competentes e mutantes de inserção são um problema. Deste modo, o uso de vectores lentivirais de terceira geração, em que os componentes lentivirais encontram-se divididos por 4 plasmídeos diferentes e a introdução de sinais específicos do tipo celular, permitem aumentar a especificidade e segurança dos vectores lentivirais. O objectivo proposto para este trabalho é o desenvolvimento de uma nova estratégia terapêutica que nos permita eliminar especificamente células infectadas com VIH-1, incluindo os reservatórios latentes. Para atingir este objectivo foi construído um plasmídeo lentiviral que transporta um activador de transcrição (proteínas dedos de zinco e Tat) e uma toxina capaz de induzir a morte celular de células na presença da proteína viral Rev. Uma vez que pretendemos atacar células latentes, na qual a expressão de Rev é inexistente, colocámos no mesmo vector, um activador de transcrição. Este activará a expressão viral, forçando a saída de latência e expondo a célula latente à acção da toxina e consequente morte celular. Esta estratégia pretende promover a morte de células infectadas tomando partido do mecanismo de replicação do VIH-1. De modo a testar esta estratégia, foi inicialmente construída uma proteína de fusão composta pelo domínio activador VP64 e uma proteína dedos de zinco. Foram seleccionadas duas proteínas de dedos de zinco com afinidade para o genoma viral. Estas construções foram testadas para avaliar a sua capacidade de activar a transcrição do VIH-1. Observámos que as proteínas dedos de zinco utilizadas não activaram a transcrição viral, chegando mesmo a inibi-la. Deste modo, determinámos que estas construções não tinham a capacidade de activar a transcrição do VIH-1 e decidimos utilizar a proteína Tat para assumir esta função. Uma vez que a Tat é o activador da transcrição viral do VIH, passámos directamente para o desenvolvimento do vector lentiviral. Utilizámos um vector lentiviral que possui um local de ligação da proteína Rev (RRE) como base para as nossas construções. Este vector tem a particularidade de que, ao iniciar a sua transcrição, os seus mRNAs só são transportados para o citoplasma para tradução na presença de Rev, garantindo que células não infectadas não são afectadas pela expressão dos transgenes. Este vector possui ainda 2 splicing sites do VIH entre os quais foram clonados os genes das toxinas, em fusão com uma proteína repórter fluorescente verde. Estes só são expressos na presença de Rev que se liga aos locais de splicing do mRNA evitando a remoção desta região. Para a construção dos nossos vectores utilizámos a toxina da diphteria (DTA) e a timidina kinase do vírus herpes simplex (HSV-TK), como toxinas de eleição. A DTA promove a morte celular directamente, enquanto a HSV-TK precisa de presença do pró-fármaco Ganciclovir para matar a célula. Clonámos também a proteína Tat em conjunto com uma proteína repórter vermelha sob o controle de um promotor constitutivo, para activar a transcrição dos VIHs latentes e marcar células transduzidas com o nosso vector lentiviral. Todos os componentes do vector encontram-se funcionais, com excepção da, proteína repórter vermelha. Ao testarmos a capacidade do nosso vector eliminar células infectadas num contexto replicativo e de latência, verificámos um aumento de quase 60 % de morte específica de células infectadas. Deste modo concluímos que este trabalho apresenta uma abordagem promissora para o desenvolvimento de uma nova estratégia de terapia genética contra o VIH-1.

Bladder carcinoma (BCa) is among the most common carcinomas in the Western world. Despite the availability of effective therapies, there is currently an urgent need to develop a stratification method, which would enable the accurate identification of patients responsive to therapy. In the theoretical part of my diploma project I describe the heterogeneity of BCa and the currently applied immunotherapeutic approaches. I specifically focused on the Bacillus Calmette-Guérin (BCG) vaccine instillation. For decades another use of BCG has been a prophylactic vaccination against tuberculosis (TB) infection. BCG serves as a model treatment because it is highly efficient when prescribed to the responsive patient. However, an effective stratification is yet to be developed for BCa and latent tuberculosis infection (LTBI) diagnosis and/or monitoring. In the experimental part of my project, I developed and tested a 10-parameter panel for T cell- specific activation test (TAT) applicable for a stratification of BCa patients as well as for the detection of LTBI. I tested the panel on positive controls using flow cytometry (FCM) method because it allows for detection and measurement of dozens of markers at a single cell level. It is easily applicable to available urine and blood samples obtained from BCa...

Thesis abstract Author's name: Vendula Perglerová School: Charles University in Prague, Philosophical Faculty, Department of Education Program: Master full-time study of education Title: Specifics of work with adolescent drug abusers Consultant: PhDr. M. Vítečková, Ph.D. Number of pages: 97 Key words: addiction, drug, adolescent drug users, therapy, case study The aim of this thesis is to understand the mechanisms of addiction in adolescent drug users, to describe their specifics and to provide on this basis a guide to choosing effective means of help in treatment of adolescent drug abusers. It monitors the process of origination and progress of substance addiction. It illustrates possibilities of treatment in individual phases of the addiction process. It introduces a concrete treatment program targeted on adolescent drug abusers. Practical part describes five individual cases of adolescent drug abusers, examines causes of substance abuse in each of them and characterizes individual treatment approach based on them.

The aim of this thesis is to analyse certain aspects connecting religion and narration (which is understood here as a common human faculty to think and express oneself in the form of narratives). The first part of the thesis is concerned with methodology; first of all, the issues of defining narrative are introduced and a more elaborate definition is presented. A complete methodology is then formulated with a help of several authors (mainly James W. Pennebaker and Mary Douglas) in order to distinguish particularities and functions of creating narratives in religious contexts. Two main points are stressed here: that the content of the narratives is often concerned with problematic aspects of experience and that the expression of these narratives is beneficial for their creators. The second part focuses on several religious institutions concerned with creation of narratives which are interpreted with the outlined methodology. In this manner, the act of confession in Catholicism, prayer in Christianity and certain healing rituals are described and interpreted. Conclusions of this thesis should help the reader get a basic idea of the way created narratives in religious contexts affect their authors.

This thesis is focused on therapeutic communities in the treatment system of drug addicted clients and on their methods, programs and mission of employed therapists to achieve better restoration of the drug addicted clients. The aim of this work is to widely describe the treatment process in therapeutic communities and zoom in an enviroment and whole treatment system which creates safety place for each member of the community. The thesis is divided into a theoretical and practical part. Theoretical part describes today's czech experience in therapeutic communities, whereas the importance is laid on introducing therapeutic methods and programs effectively used in social work with drug addicts.Practical part forms own qualitative research, precedented with intership in the therapeutic community Karlov.

The diploma thesis entitled Specific needs of patients during negative pressure wound therapy, consists of two main parts, a theoretical and a practical part. The theoretical part includes findings from research and publications dealing with the issues of wound healing through local application of vacuum therapy, treatment with other methods of wet healing, the impact of long-term non-healing wounds on human needs and the role of the nurse in this scenario. The practical part of the diploma thesis refers to the quantitative research carried out by 46 respondents who were treated with a negative vacuum method, another method of wet healing or a combined form.

Dissertação de Mestrado em Biotecnologia Farmacêutica apresentada à Faculdade de Farmácia
Polyglutamine diseases are a group of nine neurodegenerative diseases caused by the abnormal expansion of the CAG trinucleotide in the coding region of the gene, which originates a mutant protein with a typical segment of polyglutamines. The mutant protein becomes toxic and it leads to progressive neuronal dysfunction and death that gradually limits patients’ lives. Polyglutamine diseases include Huntington's Disease, Dentatorubral Pallidoluysian Atrophy, Spinal and Bulbar Muscular Atrophy, and Spinocerebellar Ataxias type 1, 2, 3, 6, 7, and 17. There is no effective treatment for these diseases or therapeutic alternatives that can limit their progression yet. However, the monogenic nature of polyglutamine diseases makes them ideal candidates for the development of gene therapies. Furthermore, the identification of single nucleotide polymorphisms that are associated with the expanded repeats in each of these diseases allows to selectively target the mutant allele. Therefore, it is possible to preservethe normal allele and the levels of the native protein for an adequate cell performance by genetic silencing of the mutant allele. The main objectives of this monograph were to identify the single nucleotide polymorphisms that are associated with the expanded repeats, as well as the specific allele silencing therapies already studied for each polyglutamine diseases. This research was done by using bibliographical research and genetic databases. Keywords: Polyglutamine disease; CAG expanded trinucleotide; Single nucleotidepolymorphism; Genetic polymorphism; Gene therapy; Allele specific silencing.
As doenças de poliglutaminas consistem num conjunto de nove doenças neurodegenerativas, causadas pela expansão anómala do trinucleótido CAG na região codificante do gene, que dá origem a uma proteína mutante com um segmento característico de poliglutaminas. A proteína mutante torna-se tóxica e, frequentemente, origina disfunção e morte neuronal progressiva que vai limitando progressivamente a vida dos doentes. As doenças de poliglutaminas incluem a Doença de Huntington, a Atrofia Dentato-Rubro-Pálido-Luisiana, a Atrofia Muscular Bulboespinal e as Ataxias Espinocerebelosas tipo 1, 2, 3, 6, 7 e 17. Atualmente não existe tratamento eficaz para estas doenças, nem alternativas terapêuticas que possam limitar a sua progressão. No entanto, o caráter monogénico das doenças de poliglutaminas torna-as candidatas ideais para o desenvolvimento de terapias génicas. Para além, disso, a identificação de polimorfismos de nucleótido único que se encontram associados às repetições expandidas, em cada uma destas doenças, permite alcançar de forma seletiva o alelo mutante. Desta forma, recorrendo ao silenciamento genético do alelo mutante é possível manter o alelo normal e os níveis da proteína nativa necessários para um adequado desempenho celular. Assim, os principais objetivos desta monografia foram, através de pesquisa bibliográfica e recorrendo a base de dados genéticas, identificar os polimorfismos de nucleótido único que se encontram associados às repetições expandidas, bem como as terapias de silenciamento alelo específicas já estudadas para cada uma das doenças de poliglutaminas. Palavras-chave: Doenças de poliglutaminas, Expansão do trinucleótido CAG; Polimorfismo de nucleótido único; Polimorfismo genético; Terapia génica; Silenciamento aleloespecífico.

Tese de doutoramento do Programa Interuniversitário de Doutoramento em Envelhecimento e Doenças Crónicas, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra
Glioblastoma (GBM) is the most malignant primary tumor of the central nervous system. Despite all efforts, the median survival time for GBM patients remains approximately between 12 to 15 months under therapy. GBM is a diffuse astrocytoma, highly proliferative, angiogenic, and locally invasive, that develops resistance to the alkylating agents used in chemotherapy, such as temozolomide (TMZ), which is considered part of the gold standard treatment. This limited success appears to be related with several mechanisms, namely: 1) the occurrence of gene mutations, that cause permanent activation and/or inhibition of several molecular signalling pathways involved in tumor growth and proliferation, such as protein kinase C (PKC) activation, cell survival, tumor suppressor genes and apoptosis; 2) the presence of a population of cells known to be chemo and radioresistant, the glioma stem-like cells (GSCs), that are responsible for generating tumor heterogeneity and recurrence after therapy, and; 3) the inexistence of a specific therapeutic target for non-GSCs and GSCs that would permit the development of more specific therapeutic approaches for this neoplasia. Therefore, in this work we aimed to: 1) study the PKC activation contribution to the aggressiveness of GBM, emphasizing the importance of combined therapeutic protocols, including TMZ with PKC inhibitors, namely tamoxifen (TMX); 2) characterize the GSCs and study their plasticity to understand glioma stem-like cells state and its differentiation properties, in order to contribute to the prevention of tumor recurrence; and 3) evaluate the potential of specific cell surface markers as therapeutic targets to non-GSCs and GSCs, allowing the accessibility of therapeutic agents most exclusively to the tumor niche, by a liposome-mediated drug delivery approach. First, using two GBM cell lines, the U87 and U118 cells, we observed that the combination of TMX and TMZ alters the phosphorylation status of PKC, by western blot. We found that TMX is an inhibitor of the p-PKC and that this combination is more effective in the reduction of proliferation and in the increase of apoptosis than each drug alone, by flow cytometry, which presents a new therapeutic strategy in GBM treatment. We then concluded that the combination of TMX and TMZ seems to potentiate the effect of each other in GBM cell lines. In order to study the heterogeneity between GBM cells and further understand the variability in the chemotherapeutic response, we next isolated and characterized a human GBM cell line, termed GBM11, obtained by surgical biopsy from a patient bearing a recurrent GBM, and compared the effect of TMX in monotherapy and in combination with TMZ on this GBM cell line with that observed in U87 and U118 cell lines. We observed that the effect of TMX plus TMZ or with TMX alone on GBM11 cells proliferation, death or migration capability, by flow cytometry and scratch assays, was similar, suggesting that, for recurrent tumors, the best choice of second-line treatment may be TMX alone, which may also reduce putative side effects of combined treatment with TMZ. The chemo- and radioresistance of GBM are also due to GSCs which contribute to tumor growth and relapse, highlighting this cell population as a main focus for GBM therapeutic research. We considered that the understanding of GBM stem state plasticity is of utmost importance to identify the mechanisms involved in GSCs resistance to therapy, which may justify tumor recurrence and so, constitute a step forward to the identification of new approaches to treat GBM. Our results demonstrated that, in four GBM cell lines and in the respectively GSC lines, the plasticity of the GBM stem-like cell state is based on the modulation of specific markers expression associated with this state, such as SOX2 or as Connexin 46 and 43, through immunofluorescence, western blot and PCR real time assays. Moreover, by immunohistochemistry analyses, we observed that this dynamic expression is in accordance with the upregulation of these stem-like cell markers in human samples of higher glioma grades, namely GBM, compared to lower grades, suggesting a direct correlation with the poor prognosis of GBM patients. As so, due to the plasticity of the stem-like cells status, the strategy of targeting both GSCs and non-GSCs may represent a promising approach in order to overcome tumor aggressiveness, and eventually to avoid the known chemotherapeutic side effects, which could improve the survival time and quality of life of GBM patients. In this regard, we next evaluate the potential of the cell surface nucleolin (NCL), described as overexpressed in cancer cells, as a target to specifically recognize non-GSCs and GSCs, taunting a possible therapeutic target for drug delivery in two different GBM cell lines. For that, we used a previously designed F3-peptide-targeted sterically stabilized pH-sensitive liposome (SLpH), which specifically recognizes nucleolin, as a tool to target overexpressed-nucleolin cells. Overall, we showed that NCL overexpression ensures an efficient drug delivery in both cells with stem-like and non-stem-like phenotypic characteristics, by flow cytometry assays, which could validate NCL as a potential therapeutic target in GBM. Altogether, our results showed: 1) a synergistic effect of TMX and TMZ in GBM cell lines and a more efficient effect of TMX alone in recurrent GBM compared to the combined therapy; 2) the plasticity of stem-like cell state through the reversibility of stem-like cell markers expression, and the identification of putative markers associated with this reversibility, the SOX2 and Cx46 and 43, which constitutes a step closer to the understanding of stem cell behaviour; and 3) that the success of targeting both non-GSCs and GSCs, through the nucleolin target, may be the basis for developing a specific treatment for GBM.
O Glioblastoma (GBM) é o tumor primário mais maligno do sistema nervoso central. Apesar de todos os esforços, o tempo médio de sobrevivência para doentes com GBM permanece aproximadamente entre os 12 a 15 meses sob terapia. O GBM é um astrocitoma difuso, altamente proliferativo, angiogénico e localmente invasivo, que desenvolve resistência aos agentes alquilantes utilizados na quimioterapia, como a temozolomida (TMZ), que é considerada parte do tratamento padrão. Este sucesso limitado parece estar relacionado com vários mecanismos, tais como: 1) a ocorrência de mutações genéticas que causam ativação permanente e / ou inibição de várias vias de sinalização molecular envolvidas no crescimento e proliferação de tumores, como a ativação da proteína cínase C (PKC), na sobrevivência celular, na inibição de genes supressores de tumores e apoptose; 2) a presença de uma população de células conhecidas como quimio- e radiorresistentes, as células de glioma do tipo estaminal (GSCs), que são responsáveis ​​pela heterogeneidade tumoral e recorrência após a terapia e; 3) a inexistência de um alvo terapêutico para não-GSCs e GSCs que permita o desenvolvimento de abordagens terapêuticas mais específicas para esta neoplasia. Assim, neste trabalho, objetivámos: 1) estudar a contribuição da ativação da PKC para a agressividade do GBM, enfatizando a importância de protocolos terapêuticos combinados, incluindo a TMZ com inibidores de PKC, nomeadamente o tamoxifeno (TMX); 2) caraterizar as GSCs e estudar a plasticidade das propriedades destas células estaminais do GBM, no sentido de compreender o estado estaminal do glioma e, consequentemente, entender as propriedades de diferenciação, contribuindo para a recorrência do tumor; e 3) avaliar o potencial de marcadores de superfície celular específicos, como alvos terapêuticos para as não-GSCs e GSCs, a fim de permitir a acessibilidade de agentes terapêuticos mais exclusivamente ao nicho do tumor, por meio de uma abordagem de administração de fármacos mediada por lipossomas. Inicialmente, usando duas linhas celulares de GBM, a U87 e a U118, observámos que a combinação de TMX e TMZ altera o estado de fosforilação da PKC, por western blot. Descobrimos que o TMX é um inibidor da p-PKC e que esta combinação é mais eficaz na redução da proliferação e no aumento da apoptose do que cada fármaco em monoterapia, através de ensaios de citometria de fluxo, o que pode representar uma nova estratégia terapêutica no tratamento do GBM. Concluímos, então, que a combinação de TMX e TMZ potencializa o efeito entre si nas linhas celulares de GBM. No sentido de estudar a heterogeneidade entre células de GBM e compreender melhor a variabilidade da resposta à quimioterapia, isolámos e caracterizámos uma linha celular de GBM humana, denominada GBM11, obtida através de uma biópsia cirúrgica de um doente com glioblastoma recorrente, e comparámos o efeito do TMX em monoterapia e em combinação com a TMZ, nesta linha celular, com o observado nas linhas celulares U87 e U118. Na verdade, observámos que o efeito do TMX e TMZ ou do TMX sozinho nas células de GBM11 sobre a proliferação celular, morte ou capacidade de migração, através de ensaios de citometria de fluxo e migração, era semelhante, o que pode sugerir que, para os tumores recorrentes, como o caso do GBM11 previamente tratado com TMZ, a melhor escolha do tratamento de segunda linha pode ser apenas TMX, a fim de reduzir os efeitos secundários putativos do tratamento combinado com TMZ. A quimio- e a radiorresistência do GBM devem-se, também, à existência de GSCs, que contribuem para o crescimento tumoral e recorrência destacando-se, assim, esta população celular como o foco principal da investigação terapêutica no GBM. Consideramos que a compreensão da plasticidade do estado estaminal no GBM é de extrema importância para identificar os mecanismos e fatores envolvidos na resistência das GSCs à terapia, o que pode justificar a recorrência do tumor e, portanto, constituir um progresso na identificação de novas abordagens terapêuticas. Os nossos resultados demonstraram, em quatro linhas celulares de GBM e nas respetivas linhas de GSCs, a plasticidade do estado estaminal com base na modulação da expressão de marcadores específicos associados, tais como o SOX2 e outros marcadores como a Conexina 46 e 43, através de ensaios de imunofluorescência, western blot e PCR em tempo real. Além disso, através de ensaios de imunohistoquímica, verificámos que essa expressão dinâmica está de acordo com a regulação positiva destes marcadores celulares em graus superiores de amostras humanas de glioma, nomeadamente no GBM, comparativamente a graus inferiores, sugerindo uma correlação direta com o mau prognóstico de doentes com GBM. Assim, devido à plasticidade do estado estaminal, a estratégia de atingir designadamente ambas as GSCs e não-GSCs pode representar uma abordagem importante no sentido de diminuir a agressividade do tumor e, eventualmente, evitar os efeitos colaterais quimioterapêuticos conhecidos, o que pode melhorar o tempo e a qualidade de vida de doentes com GBM. Neste sentido, avaliámos o potencial da nucleolina (NCL) de superfície celular, descrita como estando sobre-expressa nas células tumorais, como um alvo terapêutico para o reconhecimento específico de ambas as não-GSCs e GSCs, contribuindo para a entrega direcionada de fármacos encapsulados em nanopartículas, em duas linhas celulares de GBM. Para isso, utilizámos um lipossoma previamente desenhado, sensível ao pH e estericamente estabilizado, contendo na sua constituição um péptido F3, capaz de reconhecer especificamente a nucleolina constituindo, assim, uma ferramenta- alvo para as células com sobre-expressão de nucleolina. Em suma, demostrámos que a sobre-expressão de nucleolina per se pode identificar ambas as não-GSCs e GSCs, através de ensaios de citometria de fluxo, mediando a entrega direcionada intracelular, o que pode validar a NCL como um potencial alvo terapêutico no GBM. Em conclusão, o presente estudo demonstrou: 1) um efeito sinergístico do TMX e TMZ em linhas celulares de GBM e um efeito mais eficiente do TMX em monoterapia numa situação de GBM recorrente em comparação com a terapia combinada; 2) a plasticidade do estado estaminal através da reversibilidade da expressão dos marcadores de células do tipo estaminal e a identificação de dois marcadores putativos associados a essa reversibilidade, o SOX2 e a Cx46 e 43, constituindo um passo mais próximo na compreensão do comportamento das células estaminais; e 3) que o sucesso em atingir especificamente células não-GSCs e GSCs, através da sobre-expressão de nucleolina, poderá ser a base de desenvolvimento de um tratamento específico para o GBM.
Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico (CNPq), Brasil; Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Brasil; Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ); Pró-Saúde - Associação Beneficente de Assistência Social e Hospitalar, Brasil; FEDER/COMPETE/ FCT PTDC/EBB-EBI/120634/2010 e PDTC/QUI-BIQ/120652/2010