Littérature scientifique sur le sujet « Tecniche in vitro »

L’articolo mette a fuoco i rischi che, o per l’imperizia dell’operatore, o per le procedure previste dalla tecnica di fecondazione, sono responsabili della morbilità e mortalità della donna e/o del nascituro. Uno dei rischi per la donna è legato alla stimolazione ovarica che si attua con una induzione farmacologica e che provoca la cosiddetta “iperstimolazione ovarica” e tumori della mammella e dell’ovaio. Altri rischi sono legati alle complicanze delle procedure di fecondazione artificiale e che riguardano soprattutto la fase di recupero delle ovocellule, la coltura in vitro, il trasferimento dei gameti e degli embrioni nelle vie genitali della donna. Il prelievo degli ovociti viene eseguito sotto controllo ecografico con rischio di dolori pelvici o addominali, infezioni ed emorragie, mentre il trasferimento dei gameti si esegue con la laparoscopia con complicanze legate all’anestesia. Il primo rischio per l’embrione è che non arrivi a vita autonoma per mancato trasferimento nelle vie genitali della donna, il mancato attecchimento nell’utero, l’aborto spontaneo o provocato, la maggiore incidenza di morbilità o di mortalità perinatale. Altri fattori negativi sono dovuti alla micromanipolazione dei gameti. Inoltre, dall’analisi della letteratura si evince che i nati da fecondazione artificiale presentano maggiori malformazioni congenite e una più elevata incidenza di prematurità. A tutti questi problemi si aggiunge l’inadeguata informazione fornita alle coppie che ricorrono alla fecondazione artificiale sui rischi, sugli effetti collaterali, sulle percentuali di successo.

Le tecniche di fecondazione artificiale - la cui finalità prima doveva essere il superamento della sterilità di coppia- sono divenute in realtà occasione privilegiata per ottenere "materiale umano" su cui sperimentare. Gli embrioni rimasti in soprannumero o ottenuti con fecondazioni in vitro apposite, possono essere utilizzati in studi di biologia cellulare, di genetica molecolare, di citogenetica, e biochimici. In questo articolo, l'Autore, dopo una accurata analisi della situazione attuale, valuta se esista o meno l'esigenza di utilizzare gli embrioni umani nella sperimentazione, tenendo presente che, in quanto individui umani fin dalla fecondazione, essi esigono lo stesso rispetto dovuto a chi è già nato.

La surrogazione di maternità diventa un mezzo per realizzare il desiderio di procreare e, utilizzando moderne tecnologie riproduttive, provvede alla gestazione da parte di una donna per conto di una o più persone, che saranno il genitore o i genitori del nascituro. L’articolo tenta di valutare il fenomeno nell’ottica della morale cattolica, presentando la maternità surrogata nel contesto dell’uso di tecniche di inseminazione/fecondazione artificiale in vitro e il trasferimento dell’embrione, che in genere sono un passo fondamentale della procedura. La Chiesa cattolica esprime disapprovazione per la maternità surrogata, sottolineando che essa viola la dignità umana e distorce il carattere originario della maternità/paternità. Questa pratica non tiene conto della complementarietà dei sessi, del rispetto reciproco e del diritto degli sposi a diventare padre o madre insieme all’altro coniuge. Un essere umano ha il diritto di essere concepito in un matrimonio come frutto di uno specifico atto d’amore tra gli sposi. Altrettanto, la Chiesa giudica in maniera negativa l’utilizzo delle procedure medico-tecniche che permettono il trapianto dell’embrione nell’utero in caso di surrogazione gestazionale, sottolineando che minacciano seriamente la sua sopravvivenza. Inoltre, la surrogazione di maternità è vista come procedura disumanizzante, perché tratta la madre surrogata come «strumento umano usato per fini di riproduzione».

Nello scenario di una nuova agricoltura, le tecniche di miglioramento genetico sono chiamate a svolgere un ruolo importante al fine di rendere i processi produttivi sostenibili anche sotto il profilo ambientale ed economico. Nei prossimi anni sarà necessario produrre di più in condizioni di risorse naturali decrescenti e al tempo stesso assicurare produzioni anche attraverso una riduzione degli input chimici. Negli ultimi cinquant’anni l’integrazione di diverse tecniche e lo sviluppo di metodi di rigenerazione in vitro e di strategie molecolari ha consentito la definizione di nuovi strumenti di miglioramento genetico. Le conoscenze genomiche degli ultimi decenni hanno, infatti, innovato gli strumenti per la realizzazione di programmi di miglioramento genetico, sia in termini di disponibilità di marcatori per selezione assistita o per selezione genomica, sia in termini di conoscenze sulla funzione dei geni responsabili di caratteri agronomici fondamentali, tra i quali la resistenza a stress biotici. I nuovi metodi molecolari, che consentono di ottenere piante cisgeniche, o con sequenze modificate mediante genome editing, si affiancano ai metodi tradizionali di miglioramento genetico superando i limiti dell’incrocio e della selezione, soprattutto con riferimento alla lunghezza dei tempi ed alla impossibilità di prevederne il risultato in termini di caratteristiche modificate. Nella nota vengono descritti i principali metodi di miglioramento genetico e le principali strategie utilizzabili per migliorare la resistenza delle piante agli insetti.

AbstractL'epidemiologia delle gravidanze multiple si è notevolemente modificata nel corso degli ultimi due decenni in virtù del perfezionamento e della diffusione delle tecniche di riproduzione assistita. L'utilizzazione di induttori farmacologici della ovulazione (specie le gonadotropine ed il citrato di clomifene) e l'impianto in utero di più embrioni fecondati in vitro, sono fattori che maggiormente hanno contribuito a fare impennare verso l'alto il numero di nati da gravidanze plurigemine. L'incidenza di parti trigemini, ad esempio, considerata gli inizi degli anni '70 di circa 1:10,000 parti, oggi si è elevata sino ad 1:3,500 circa.Presentiamo i dati relativi a 132 soggetti nati da gravidanze plurigemine all'Istituto Materno Infantile dell'Università di Palermo, al fine di valutarne la sopravvivenza e la morbilità anche in relazione al tipo di gravidanza (spontanea o indotta). In tal senso abbiamo preso in considerazione esclusivamente i nati nella nostra struttura con età gestazionale uguale o superiore a 26 settimane, escludendo quindi i nati da gravidanze plurime nati in altre strutture e trasferiti dopo la nascita (Tabella).Delle 57 gravidanze plurime, 37 (64.9%) sono risultate certamente indotte, solo farmacologicamente (54.1 %) o con varie tecniche di riproduzione assistita (45.9%). Le gravidanze indotte costituiscono nel nostro campione il 92.9% delle gravidanze con ordine di gemellarità superiore o uguale a 3 e solo il 55.8% delle gravidanze bigemine. Sul complesso delle gravidanze indotte conosciute, la quota percentuale delle plurigemine è risultata del 59.1% 102 neonati (77.3%) sono nati da taglio cesareo, 30 (22.7%) da parto eutocico.

La gestione infermieristica riveste un ruolo importante per la sopravvivenza dell'accesso vascolare per emodialisi, soprattutto quando per la sua realizzazione sono stati utilizzati materiali protesici etcrologhi. Scopo di questo studio è di valutare in vitro e in vivo gli eventuali effetti collaterali e l'efficacia di due disinfettanti tra i più comunemente usati (ipoclorito di sodio allo 0,057 Amukine Med® e iodopovidone al 10% Braunol®,) per le medicazioni dei cateteri venosi centrali. Lo studio è stato effettuato da gennaio 2003 a gennaio 2004. In tale periodo abbiamo valutato in vitro mediante esame morfologico gli effetti sui cateteri incubati a breve e lungo termine nei 2 disinfettanti e in vivo l'incidenza di reazioni cutanee locali e la positività dell'esame colturale del tampone cutaneo, in 17 malati uremici con “Tesio cat®” Medcomp (spisilicone) come accesso vascolare per emodialisi. Non si sono notate differenze morfologiche significative nello studio in vitro tra i campioni trattati con i due disinfettanti. Il contatto prolungato dello spisilicone con Amukine Med e Braunol anche in ambiente libero non ha determinato alterazioni morfologiche della parete all'esame macro e microscopico. Nello studio in vivo, condotto su due gruppi composti da 10 pazienti nel gruppo Amukine Med e 7 pazienti in quello con Braunol, sono state effettuate 1088 medicazioni (640 con Amukine Med pari al 58,8% medicazioni totali e 448 con Braunol pari al 41,2% medicazioni totali) pari al 40,5% delle sedute dialitiche con ambo le tecniche di disinfezione. Dagli esami colturali (271 tamponi) in 71 casi è stata riportata crescita batterica; 68 Staphilococcus Epidermidis; 2 Escherichia Coli (gruppo Amuchina Med) 1 Pseudomonas Aeruginosa (gruppo Braunol). Negli ultimi 3 casi (1/68 mesi d'esposizione) era presente sepsi locale. Non si sono rilevate differenze nell'incidenza di infezioni locali o di effetti collaterali indotti dai due disinfettanti.

Le tecniche di riproduzione assistita (ART) offrono la possibilità di una maternità surrogata alle coppie sterili o senza figli. Alla fine degli anni ‘80, specialisti qualificati in India hanno approfittato della disponibilità di madri surrogate e dell’assenza di regole per creare un mercato di maternità surrogata per i clienti sia indiani sia esteri. Il Ministero della Salute è intervenuto con le linee guida solo dopo forti proteste di gruppi di donne e cittadini, facendo seguito alle storie su ostelli surrogati, bambini abbandonati e sfruttamento. Nel frattempo, le cliniche dell’infertilità si sono moltiplicate, offrendo gameti di donatori, fecondazione in vitro e maternità surrogata ad un costo molto inferiore rispetto ai paesi occidentali. Dai primi anni del 2000, l’India è divenuta la destinazione più popolare per la pratica della maternità surrogata. In risposta alle proteste e consapevole del divieto di accordi di maternità surrogata negli altri paesi, il Governo indiano ha emanato le linee guida ART che erano via via restrittive; ma tali disposizioni non sono state in grado di arginare il business ormai florido. Infine, nel 2016, il governo ha proposto un disegno di legge per porre fine alla maternità surrogata commerciale. Il regolamento Bill 2016 considera esclusivamente gli accordi di maternità surrogata, non considerando tutti gli altri aspetti della riproduzione assistita e delle cliniche coinvolte. La legislazione è stata rivolta principalmente alle questioni sociali e agli elementi di sfruttamento della maternità surrogata commerciale, più che al processo tecnico. Se approvata, tale legge vieterà efficacemente maternità surrogata commerciale in India. ---------- Assisted Reproductive Technologies (ART) offer the possibility of unrelated surrogacy arrangements to infertile couples and childless human relationships. In the late 80s, qualified specialists in India took advantage of the availability of willing surrogates and the absence of regulations, to create a market in commercial surrogacy for clients from within the country and abroad. The Ministry of Health stepped in with guidelines only after strong protests from women’s groups and citizens, following media stories of surrogate hostels, abandoned children and exploitation. Meanwhile, ‘infertility’ clinics mushroomed, offering donor gametes, in-vitro fertilization and surrogacy services at a fraction of the cost in western countries. By early 2000s, India had emerged as the most popular destination for commercial surrogacy arrangements. In response to protests from doctors, citizens and human rights groups, and mindful of the ban on commercial surrogacy arrangements in most developed countries, the Government issued ART guidelines that were progressively restrictive; but these did not have the teeth to rein in the lucrative business that commercial surrogacy had transformed into. Finally, in 2016, the Government proposed a Bill that would bring an end to commercial surrogacy. The Surrogacy (Regulation) Bill 2016 addressed surrogacy arrangements exclusively, taking it out of proposed ART Bill that was aimed at comprehensively regulating all other aspects of assisted reproduction and the clinics involved. The legislation was directed mainly at the social issues and exploitative elements specific to commercial surrogacy arrangements, rather than the technical process. If passed, the Surrogacy Bill will effectively ban commercial surrogacy in India.

La fibrosi cistica (FC) è una malattia autosomica recessiva causata da mutazioni nel gene CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator). Finora sono state descritte circa 2000 mutazioni, ma per la maggior parte di esse è difficile definirne l’effetto senza complesse procedure in vitro. Abbiamo effettuato il campionamento (mediante brushing), la cultura e l’analisi di cellule epiteliali nasali umane (HNEC) utilizzando una serie di tecniche che possono aiutare a testare l’effetto delle mutazioni CFTR. Abbiamo eseguito 50 brushing da pazienti FC e controlli, e in 45 casi si è ottenuta una coltura positiva. Utilizzando cellule in coltura: i) abbiamo dimostrato l’espressione ampiamente eterogenea del CFTR nei pazienti e nei controlli; ii) abbiamo definito l’effetto di splicing di una mutazione sul gene CFTR; iii) abbiamo valutato l’attività di gating di CFTR in pazienti portatori di differenti mutazioni; iv) abbiamo dimostrato che il butirrato migliora in modo significativo l’espressione di CFTR. I dati provenienti dal nostro studio sperimentale dimostrano che l’uso del modello ex-vivo di cellule epiteliali nasali è un importante e valido strumento di ricerca e di diagnosi nella studio della FC e può anche essere mirato alla sperimentazione ed alla verifica di nuovi farmaci. In definitiva, in base ai nostri dati è possibile esprimere le seguenti conclusioni: 1) il prelievo delle cellule epiteliali nasali mediante brushing è applicabile senza alcuna anestesia ed è ben tollerato da tutti i pazienti affetti da FC (bambini e adulti), è scarsamente invasivo e facilmente ripetibile, è anche in grado di ottenere una sufficiente quantità di HNECs rappresentative, ben conservate, idonee allo studio della funzionalità di CFTR; 2) la conservazione delle cellule prelevate è possibile fino a 48 ore prima che si provveda all’allestimento della coltura e ciò permette di avviare studi multicentrici con prelievi in ogni sede e quindi di ottenere una ampia numerosità campionaria; 3) la coltura di cellule epiteliali nasali può essere considerata un modello adatto a studiare l’effetto molecolare di nuove mutazioni del gene CFTR e/o mutazioni specifiche di pazienti “carriers” dal significato incerto; 4) il modello ex-vivo delle HNECs consente inoltre di valutare, prima dell’impiego nell’uomo, l’effetto di farmaci (potenziatori e/o correttori) sulle cellule di pazienti portatori di mutazioni specifiche di CFTR; tali farmaci possono modulare l’espressione genica del canale CFTR aprendo così nuove frontiere terapeutiche e migliori prospettive di vita per pazienti affetti da una patologia cronica come la Fibrosi Cistica; 5) la metodologia da noi istituita risulta essere idonea alla misura quantitativa, mediante fluorescenza, dell’attività di gating del canale CFTR presente nelle membrane delle cellule epiteliali nasali prelevate da pazienti portatori di differenti genotipi; in tal modo è possibile individuare: a) pazienti FC portatori di 2 mutazioni gravi con un’attività < 10% (in rapporto ai controlli -100%), b) soggetti FC portatori contemporaneamente di una mutazione grave e di una lieve con un’attività tra 10-30%, c) i cosiddetti portatori “carriers”- eterozigoti - con un’attività tra 40-70%. In conclusione la possibilità di misurare l’attività del canale CFTR in HNECs fornisce un importante contributo alla diagnosi di FC, mediante individuazione di un “cut-off diagnostico”, ed anche alla previsione della gravità fenotipica della malattia; quindi quanto rilevabile dalla misura del suddetto canale permette di prospettare per il futuro la possibilità di valutare meglio i pazienti per i quali il test del sudore ha dato risultati ambigui (borderline o negativi). La metodica da noi sperimentata consente anche di monitorare i pazienti durante il trattamento farmacologico, valutando in tal modo i reali effetti delle nuove terapie.

The aim of the first part of the PhD was the study and the improvement of the in vitro differentiation conditions of pluripotent human liver stem cells, HLSCs, into hepatocytes. After the evaluation that these cells cultivated in collagen sponge and in static conditions do not allow a good distribution in all the scaffold and that cells remain in a indifferential status, dynamic cultures were performed by using a bioreactor to assure a correct medium perfusion. Moreover, we performed co-coltures of HLSCs with hepatic stellate cells (Ito) in a medium for hepatocytes and in a medium for stem cells to investigate how the variation of a medium can influence the stem condition of cells. Morphological, histological, cells proliferation and genic expression analysis demonstrated how the use of a bioreactor and the employment of a stem cells medium, guarantee first of all HLSC’s organization in typical liver clusters up to the sponges deepest layers and the increase of the functional differentiation in a population of mature hepatocytes. In the second part of the PhD, the in vitro stem cells differentiation in Langerhans Islet by using biomaterials was studied. During the first step of the study we used Beta cells in order to understand in which form of benzilic ester scaffold cells can grow better. The more appropriate conditions concerns the use of sponges. However, cells showed a low proliferation rate and so we used Mesenchymal Stem Cells (MSC). Co-coltures of MSC with Beta cells by using different medium are still in progress to evaluate the differential status of Mesenchymal Stem Cells.
Nella prima parte del dottorato è stato effettuato lo studio e il miglioramento delle condizioni del differenziamento in vitro di cellule staminali pluripotenti presenti nel fegato, le HLSC, in senso epatico. Dopo aver valutato che la semina in condizioni statiche di tali cellule in spugne di collagene non permetteva una buona distribuzione in tutto lo scaffold e queste rimanevano per lo più indifferenziate, sono state effettuate delle colture dinamiche utilizzando un bioreattore per garantire una corretta perfusione del terreno di coltura. Inoltre sono state effettuate sia delle co-colture di HLSC con le cellule Ito del fegato sia semina in un terreno normalmente utilizzato per la coltura di epatociti e in un medium per cellule staminali, per valutare come la variazione di un terreno di coltura potesse influire sulla staminalità delle cellule. Sono state effettuate analisi morfologiche, istologiche, di proliferazione cellulare e di espressione genica delle colture. Queste hanno dimostrato come l’utilizzo di un bioreattore e di un terreno per cellule staminali possa permettere l’organizzazione delle HLSC in clusters tipici del fegato fino a strati profondi della spugna e l’aumento del differenziamento funzionale in una popolazione di epatociti maturi. Un’altra parte del dottorato è stata improntata nello studio del differenziamento in vitro di cellule staminali in Isole di Langerhans all’interno di biomateriali. Durante una prima fase di studio si sono utilizzate cellule Beta del pancreas per capire in quale forma di scaffold a base dell’estere benzilico dell’acido ialuronico potessero crescere meglio. La situazione migliore riguardava l’uso di spugne. Avendo però le cellule una scarsa capacità proliferativa, si è deciso di utilizzare come alternativa le Cellule Staminali Mesenchimali (MSC) e sono state effettuate prove di co-colture con cellule Beta utilizzando terreni diversi per valutare lo stato differenziativo delle MSC. Tali prove sono ancora in corso.

The increase of chronic diseases, such as cardiovascular diseases, is leading to a high burden on the healthcare system. Moreover, the rise in life expectancy determined a demographic change accompanied by a boost of noncommunicable diseases and a corresponding demand for healthy aging. Diet is a well-established modifiable lifestyle factor able to reduce the risk of chronic diseases, but also the complications associated with an overall beneficial impact on health status. In the last years, evidence has been increasing on the protective role of dietary bioactives, non-nutritive substances mainly found in plants. In particular, (poly)phenols are the most studied compounds over the last 20 years. Several clinical trials showed a protective effect of these bioactives through the modulation of different health outcomes. However, it is less clear the mechanisms through which (poly)phenols may exert their beneficial effect. This is mainly due to their wide diversity, their extensive and complex metabolism, but also to the paucity of reliable, sensitive and validated biomarkers able to bridge the gap between the intake of (poly)phenols and the different endpoints under investigation. Thus, there is a need of more evidence based nutrition able to fill this gap. Within this context, the aim of the present PhD thesis was to evaluate the role of different (poly)phenolic compounds in the modulation of several functional and metabolic biomarkers, through in vivo and in vitro approaches. The first part of the thesis was dedicated to assessing the effect of different (poly)phenols and their metabolites on cardiovascular risk biomarkers by using two different in vitro models of atherosclerosis. Specifically, the first model was a co-culture model of human vascular endothelial cells (HUVECs) and THP-1 used to study the capacity of different (poly)phenols in counteracting THP-1 adhesion process and resolve a TNF-alpha mediated pro-inflammatory process through the modulation of different adhesion molecules. The second in vitro model consisted in a monoculture of monocytes (THP-1) derived macrophages used to study the capacity of (poly)phenolic compounds to reduce lipid accumulation (pivotal step of atherogenesis) and modulate the expression of different genes involved in lipid metabolism. The results obtained have shown the capacity of different (poly)phenols and their metabolites to reduce the THP-1 adhesion to HUVEC, the inflammatory process, including the production of adhesion molecules. In addition, (poly)phenols have shown to reduce lipid accumulation in macrophages and this reduction was accompanied by a modulation of lipid metabolism related genes. The second part of the thesis was carried out at the Departments of Nutrition and Environmental Toxicology, University of California (Davis, USA) and devoted to investigate the role of certain phenolic compounds in the modulation of metabolic features of the adipose tissue, critically involved in the reduction of cardiovascular risk through both in vivo and in vitro models. Specifically, by using 3T3-L1 pre-adipocytes cell line, it has been studied the effect of anthocyanins and their metabolites in the promotion of mitochondrial function and differentiation from white to brown adipocytes. Furtherly, the effect of anthocyanins and metabolites was also investigated in vivo by using an animal model of C57BL/6J mice fed with a high-fat diet. The results obtained documented the capacity of anthocyanins and their metabolites to promote mitochondrial biogenesis and beiging of white adipose tissue via regulation of mitochondrial dynamics both in 3T3-L1 adipocytes cell line and in mice fed with a high fat diet. In the third part of the thesis, the study was devoted to the evaluation of markers able to provide more insight on a novel hypothesis about the effect of (poly)phenols on intestinal permeability and related markers. Specifically, the effect of a polyphenol-rich diet (PR-diet) was evaluated on markers of oxidative stress and vascular function in a group of older subjects with increased intestinal permeability. This last part was carried out in the context of the MaPLE (Microbiome mAnipulation through Polyphenols for managing Leakiness in the Elderly) European project, in which a positive modulation of intestinal permeability was documented. The analysis performed failed to show an effect of the intervention on markers of oxidative stress (e.g. cell resistance to DNA damage and endogenous DNA damage) and vascular function (e.g. serum levels of sVCAM-1 and sICAM-1) in this target vulnerable subjects. In conclusion, this PhD thesis contributed to increase evidence about the beneficial effects of (poly)phenolic compounds through the exploitation of different biomarkers in in vitro and in vivo models. In particular, the in vitro studies contributed to elucidate several biological mechanisms (i.e. related to inflammation, oxidative stress and lipid accumulation/metabolism) of single metabolites and parent compounds also at physiological relevant concentrations. Finally, the studies performed on the animal model and in humans, contributed to demonstrate the potential impact of dietary polyphenols in vivo where more factors can affect and/or interfere on the final effect. The overall results seem to further support the potential benefit of these dietary bioactives even if depending on marker/outcome under study. Future in vitro, but above all, in vivo studies should be designed to better clarify the effectiveness of (poly)phenols by considering the actual dose, their complex pharmacokinetics and extensive metabolism. However, the selection, analysis, exploitation and combination of traditional and candidate biomarkers is highlighted as a critical aspect to address.

Lo scopo di questa tesi è lo sviluppo di una protesi valvolare sensorizzata per la valutazione e il monitoraggio dei parametri funzionali della valvola e di conseguenza la realizzazione un prototipo di PHV (Prosthetic Heart Valve) che integri all’interno delle protesi valvolari in commercio una tecnologia utile alla realizzazione di queste specifiche. Il segnale di impedenza intravalvolare (IVI) è ottenuto grazie ad un sistema di elettrodi utili alla generazione di un campo elettrico locale e alla successiva registrazione della differenza di potenziale. Il lavoro sperimentale è stato suddiviso in due parti: una prima parte deputata alla scelta della posizione ottimale degli elettrodi rispetto ai lembi, al piano e all’anello valvolare, al fine di determinare due prototipi, ed una seconda parte in cui sono stati testati i prototipi in una situazione più fisiologica, cioè in un tratto di aorta bovina, ed è stata simulata una dinamica valvolare alterata. Il maggior segnale di impedenza riscontrato è stato ottenuto ponendo gli elettrodi ortogonalmente al cardine dei lembi valvolari e sovrapponendo elettrodo di eccitazione e ricezione al fine di ottenere un campo elettrico costante e ricezione puntuale della variazione del campo. Infine è stato riscontrato che il segnale di impedenza intravalvolare è in grado di riflettere alterazioni simulate dei lembi.

Milk and dairy products are an excellent source of bioavailable calcium thanks to the presence of casein phosphopeptides (CPPs), that with their phosporylated serines, bind calcium ions, keeping them in a soluble and bio-absorbable state. Digestion and absorption are limiting steps for the peptide bioavailability; thus the in vitro digestion procedures combined with the use of intestinal cell models allowed to mimic the physiological milieu, where digestion occurs and the interactions between peptides and intestine determine their fate. The purpose of this PhD thesis was to identify the biological potential of casein phosphopeptides after in vitro digestion. The first step was about the bio accessibility property of a CPP purified mixture using a culture of intestinal human cells. Next step was about the bioactivity study of a complete food containing CPPs, represented by Grana Padano (GP) and Trentin Grana (TN) at 13, 19 and 26 months of ripening. Present data show that after in vitro digestion, preformed aggregates (CPP + Ca) in a commercially mixture still maintain their conformation and retain their bioactivity as promoters of
calcium uptake in intestinal cells, regardless of calcium mechanism transport (TRPV6 in Caco2 cells and depolarizing L-type calcium channels in HT-29 cells). GP and TN digestates, were also able to induce a calcium uptake in a co-culture of Caco2 and HT-29, a model of human intestinal epithelium more complete and useful. Moreover, they shown the capacity to induce the bone mineralization in human osteoblast-like cells. Since the biological potential after digestion was verified, CPPs could be considered as a nutraceutical and GP and TN cheeses as potential functional foods.

The Ph.D. project has been structured in three different parts: The first one focused on setting up and characterizing a 70/30 Caco2/HT-29 co-culture as an in vitro model to mimic the physiology of the human intestinal epithelium starting from the two parental cell populations already differentiated. The co-culture morpho-functional features were analyzed at confluence (T0) and 3, 6, 10 and 14 days after T0 (T3, T6, T10 and T14, respectively). Morphological analysis revealed: at T6, the presence of microvilli, a complete paracellular junctional apparatus and mucus; at T14, abundant microvilli and mucus absence. The functional analysis showed: an increase of Alkaline Phosphatase, Aminopeptidase N and Dipeptidyl Peptidase IV specific activity with days in culture, indicative of a progressive acquisition of a differentiated intestinal phenotype; permeability values comparable to the ones of the human small intestine and indicative of a good status of the tight junctions. This co-culture could be considered a more versatile, suitable and simpler in vitro model of human small intestinal epithelium, than the previous published ones, able to reach the intestinal differentiated phenotype already after six days from the confluence. The second part focused on the validation of the 70/30 Caco2/HT-29 co-culture as model to study absorption and nutrient/food-intestine interactions at molecular and biochemical level. Five different experimental water biscuits and breads were subjected to an in vitro gastrointestinal digestion and the obtained digestates were administered to the co-culture at physiological doses, calculated starting from the daily recommended dose in relation to the total surface area of intestinal absorption, and in excess. The effect of digestates administration on co-culture cell viability, paracellular permeability, oxidative status and anorectic hormones production were evaluated: all the digestates were not able to affect co-culture viability or to modify the paracellular permeability; all the water biscuit digestates were able to reduce intracellular ROS formation due to the natural presence of antioxidant compounds in the flours used to prepare them; all the bread samples were able to modulate the co-culture anorectic hormone production. These studies showed the suitability of the co-culture to study a wide range of interactions between nutrients/food/nutraceuticals and intestine. The third part focused on setting up and characterizing an in vitro cellular model of obese/overweight intestine using the 70/30 Caco2/HT-29 co-culture. The nutrient excess was mimed increasing the frequency of medium change compared to the standard condition and the co-culture morpho-functional features were analyzed at 3, 7, 11 and 15 days after confluence (T3, T7, T11 and T15, respectively). The obtained in vitro model, after 15 days of post-confluence and compared to our standard co-culture, showed a higher: i) inflammatory and oxidative status; ii) paracellular permeability; iii) microvilli enzyme activity; iv) production of anorectic hormones. These features were comparable to the ones revealed in vivo in the intestine of obese subjects, thus validating the present cellular model to study obesity-associated modifications at the molecular level.

È noto che il melanoma si sviluppa in conseguenza di alterazioni multifattoriali. Fin ad oggi numerosi studi indicano che l’alterazione di p16 individuato come gene soppressore del tumore, ha un ruolo importante nello sviluppo e/o nella progressione del melanoma umano. La crescita non regolata delle cellule del melanoma è stata associata con mutazioni nella via del ciclo cellulare che riguarda la fase G1: p16-cyclin D/cdk4-pRb. Recentemente le terapie anticancro si sono focalizzate sul ripristino della funzione oncosoppressoria di p16 e di altre proteine coinvolte nello stesso pathway che regola il ciclo cellulare nel melanoma (per esempio, c-myc, p27). Tra i nuovi agenti antitumorali stanno emergendo gli inibitori dell’ Istone deacetilasi (HDAC), che mostrano capacità nell’arrestare lo sviluppo di cellule tumorali essendo forti induttori di differenziamento cellulare ed attivando il processo apoptotico. Recentemente, si è studiata la capacità degli inibitori di HDAC di modulare le proteine che regolano il ciclo cellulare (per esempio, p21CIP1) e di determinare la down-regolazione dei fattori che inducono la proliferazione cellulare incontrollata. In questo studio abbiamo esaminato l'effetto dell’ acido valproico (VPA) in vitro, su due linee cellulare di origine umane di melanoma: M14 e JR8. Abbiamo osservato che il VPA induce arresto del ciclo cellulare e apoptosi del 50% nelle cellule M14 e del 55% nelle cellule JR8, con conseguente sensibilizzazione del tumore al trattamento di etoposide e cis-Platino. Il VPA, determinando il 75% d’arresto delle cellule in G1 del ciclo cellulare, favorisce l’aumento d’espressione di p16 sia a livello genico che proteico, in concomitanza ad una aumentata espressone delle proteine p21 e della ciclina D1. Per valutare la possibilità di usare il VPA come co-adiuvante nel protocollo terapeutico per il melanoma, sono state disegnate due differenti sequenze di somministrazione in vivo, di VPA e cis-Platino. Il trattamento concomitante del tumore (M14) in vivo, con VPA+cis-Platino determina una inibizione della crescita tumorale del 48%, confrontato con il controllo ed un effetto anti-metastatico di circa il 45%. La sequenza di trattamento con la combinazione cis-PlatinoVPA ha inibito la crescita tumorale di circa il 61% inducendo un significativo effetto anti-metastatico di circa il 70%. Inoltre l'espressione del gene p16 aumentava di circa 2,5 volte nei tumori trattati con il VPAcis-Platino confrontato con il controllo e il tumore trattato in singolo con il cis-Platino. L'abilità dell’acido valproico di ristabilire la fase G1 del ciclo cellulare nel melanoma sia in vitro che in vivo suggerisce una sua potenziale applicazione nei protocolli terapeutici del melanoma.
It is known that melanoma develops as a consequence of multifactorial alterations. To date several studies indicate the effective implication of p16 as a tumor suppressor gene with a major role in either the development or progression of human melanoma. Deregulation of melanoma cell growth has been widely associated with mutations in the p16-cyclin D/cdk4-pRb pathway. Recently anticancer therapies are focused on restoration of p16 CDK inhibitory function and other proteins unregulated in melanoma cell cycle pathway (e.g., c-myc, p27). A combined strategy for restoration of normal homeostasis in the melanoma skin with targeted delivery of apoptosis-inducing agents does not seems to be far obtain. New class of antitumoral agents are emerging: histone deacetylase (HDAC) inhibitors have attracted much interest because of their ability to arrest cell growth, induce cell differentiation, and in some cases, induce apoptosis of cancer cells. Recently, attention has been focused on the ability of HDAC inhibitors to induce perturbation in cell cycle regulatory protein (e.g., p21CIP1) and down-regulation of survival signalling pathway. In the present study, we have examined the effect of valproic acid (VPA) on M14 and JR8 human melanoma cell lines. Here we observed that VPA induces cell cycle arrest and apoptosis sensitising melanoma cells to cis-Platin and etoposide treatment. VPA was able to induce G1 arrest (up to 75 %) in association with up-regulation of p16, p21 and cyclin-D, inducing apoptosis (50 %) in M14 and JR8 (55%) cells. To evaluate the possibility of VPA to be used as co-adjuvant in the chemotherapy protocol for melanoma, two different sequences of in vivo administration of VPA and cis-Platin were designed. The concomitant treatment of tumour (M14) in vivo, with VPA+cis-Platin induced a growth inhibition of 48% compared to control with an anti- metastatic effect of about 45%. The treatment sequence with VPAcis-Platin combination inhibited tumour growth in M14 of about 61% and induced an anti-metastatic effect of about 70%. Moreover p16 gene expression was found up-regulated 2,5-fold in tumor treated with the sequence VPAcis-Platin compared to control and cis-Platin single treated tumor. The ability of valproic acid to re-established the G1 pathway in melanoma both in vitro and in vivo suggests a potential application of VPA in melanoma therapeutic protocols.

The aim of this study was the in vitro reconstruction of "soft and hard tissue". Adult Stem Cells were seeded onto three-dimensional scaffolds with appropriate differentiation factors. In particular, the following constructs were prepared: (a) hyaluronic acid or fibrin scaffolds seeded with Skin Precursors Cells (SKPs) and Adipose Derived Stem Cells (ADSCs) for the regeneration of nervous tissue; (b) hydroxyapatite scaffold seeded with ADSCs to regenerate a vascularized bone tissue substitute; (c) hyaluronic acid biomaterial seeded with Dental Pulp Stem Cells (DPSCs) to generate a dental pulp-like tissue. First of all, the differentiation of stem cells was assessed in monolayer cultures by means of immunofluorescence analysis. Subsequently, the same differentiation conditions were applied on three-dimensional cultures. Proliferation test, scanning electron microscopy morphological analysis and gene expression analysis by Real Time PCR were performed at different time points. Furthermore, the genetic stability of the differentiated cells was verified by means of karyotype and CGH array analysis. The overall data showed: (a) the neuronal and glial commitment of SKPs and ADSCs on hyaluronic acid and fibrin scaffolds and the chromosomal stability of these three-dimensional cultures. (b) The concurrent osteogenic and endothelial commitment of ADSCs on hydroxyapatite scaffold and the in vitro generation of a tissue-engineered bone graft with a great osteointegration potential. (c) The concurrent glial, neuronal, and endothelial commitment of DPSCs onto non-woven hyaluronic acid scaffold, defining a possible model to restore the nervous and vascular components of the dental pulp tissue.
In questo lavoro sono stati ricostruiti in vitro 'soft and hard tissue' seminando Cellule Staminali Adulte su supporti tridimensionali in presenza di opportuni fattori differenziativi. In particolare, sono stati preparati i seguenti costrutti: (a) tessuto nervoso a partire da cellule staminali di pelle (SKP) e tessuto adiposo (ADSC) seminate su un supporto a base di acido ialuronico o fibrina; (b) tessuto osseo vascolarizzato utilizzando ADSC seminate su scaffold a base di idrossiapatite e (c) tessuto simil-dentale associando le cellule staminali della polpa dentale (DPSC) a un biomateriale a base di acido ialuronico. Lo studio ha previsto una fase preliminare in monostrato, in cui il differenziamento delle cellule staminali è stato valutato mediante analisi di immunofluorescenza. Stabilita la plasticità  delle cellule staminali ai fattori differenziativi, sono stati effettuati gli esperimenti nelle tre dimensioni. A diversi tempi, i costrutti sono stati sottoposti a test di proliferazione, ad analisi morfologica mediante microscopia elettronica a scansione e ad analisi dell'espressione genica mediante Real Time PCR. Inoltre sono state condotte analisi di citogenetica mediante cariotipo e CGH array per verificare la stabilità  genetica delle cellule durante il differenziamento. I dati raccolti hanno mostrato: (a) il differenziamento neuronale e gliale delle SKP e delle ADSC su supporti a base di acido ialuronico e fibrina mediante un processo che non altera l’assetto cromosomico delle cellule differenziate. (b) Il co-differenziamento osteogenico ed endoteliale delle ADSC su supporti a base di idrossiapatite e la generazione in vitro di un sostituto osseo bioingegnerizzato privo di alterazioni geniche e dalla promettente osteointegrazione. (c) Un possibile modello per la rigenerazione della polpa dentale che associa le DPSC a un supporto tridimensionale a base di acido ialuronico sottoforma di tessuto non tessuto, dove il co-differenziamento gliale, neuronale ed endoteliale delle DPSC favorisce la rigenerazione della componente nervosa e vascolare del tessuto pulpare.

Background: The tumor microenvironment (TME) is a complex system, shaped by direct interactions among different cell types and by the interactions between cells and extracellular matrix (ECM). Given the emerging importance of the TME in modulating cells’ morphology and function, more sophisticated tumor models incorporating TME features are needed to elucidate cellular, molecular, and immunologic mechanisms of tumor response or resistance. An intensive investigation of in vitro models able to study tumor biology has led to the generation of different three-dimensional (3D) culture methods that better mimic in vivo conditions compared to the usual 2D culture methods. The 3D mono- and co-cultures are able to reproduce some “in vivo features” such as 3D cell morphology, which permits cells to better execute their function and enables them to deposit significant increased amount of ECM. Aim of this study is the development of an accurate in vitro 3D tumor model to study the impact of tumor ECM on the cells of the microenvironment. The understanding of the specific contributions that ECM proteins make to the tumor microenvironment became crucial due to the emergency of find alternative cures to the many cancer harboring patients resistant to the existing therapies. Methods: Our experimental approach can be divided in two main experimental plans: • the development of tumor spheroid model, helpful to understand the beginning stage of the nascent tumor; at day 7, 14 and 21 of spheroids culture we evaluated ECM deposition through immunofluorescence (IF) analysis of collagen type VI; we also analyzed how much the 3D co-culture model we generated was similar compared to the in vivo microenvironment regarding gene expression; • the development of a scaffold obtained by murine tumor tissue decellularization, utilized for the study of the advanced tumor stage, with a more complex ECM compared to the spheroid model; some scaffolds underwent to collagen type VI IF analysis while other scaffolds were used for recellularization experiments with B16f10 or NIH/3T3 cell lines. Some scaffolds were also used for scanning electron microscopy analysis (SEM). Results and Discussion: Spheroids generated by the co-culture of B16f10 and NIH/3T3 cells were the only ones lasting for 21 days and the only ones where collagen type VI was detected, compared to spheroids made just by B16f10. These results let us deduce that ECM deposition is fibroblast-dependent. According to the 3D morphology classification of Kenny et al. 2007, B16f10 + NIH/3T3 derived spheroids we generated belong to the Mass class, characterized by cells organized in a regular manner around the center of the colony; B16f10 derived spheroids seems to belong instead to the Grape-like class, characterized by colonies with poor cell-cell contacts and distinguished by their grape-like appearance. B16f10-spheroid’s morphology clearly show a lack of robust cell-cell adhesion, result that has to be overlapped with the absence of collagen type VI. Therefore, fibroblasts are needed for the generation of an early tumor stage 3D model because of their major role as ECM producers and tumor micro-environment organizers. We even investigated spheroid gene expression signature. We focused on the genes that were expressed at the same level between the tumor cells derived from the 3D coculture and the actual in vivo tumor microenvironment. Clusters analysis highlights the similarity between the 2 groups showing 23.1% of the found pathways referring to cancer microenvironment, giving grand importance to the spheroid as in vitro model compared to the 2D systems. To define an in vitro 3D model suitable to the experimentation on advanced solid tumor phase, murine B16f10 derived tumors were processed for decellularization and studied to verify the efficacy as a natural scaffold for 3D culture system. As observed also from other research groups, cell attachment was limited to the border of the tissue, and it seems cells were not able to pass through the ECM. Control experiment with polyurethane demonstrate the capability of cells to infiltrate a synthetic matrix. To have a better understanding of the ECM structure, frozen sections of decellularized tissue were analyzed by confocal microscope for detection of collagen type VI. Interestingly, both immunofluorescence and histochemistry analysis showed an increase of ECM in decellularized tissue compared to the not decellularized one. This may be due to a slight collapse of the tumor structure since cells have been removed from it. We implemented the ECM observation with the support of SEM: after the decellularization treatment the extracellular fibres are exposed and as hypothesized, the lack of cells makes the fibres twist on themselves, generating a complex net, probably impenetrable from cells. To create a method to measure the collapse of the extracellular matrix that a decellularization treatment may provokes, we compared a fresh and a decellularized specimen of mouse pulmonary parenchyma, where structural modifications are easy to be detected. In this way we were able to quantify the collapse of the ECM through alveoli area reduction. Conclusions: The development of the spheroid made by tumor and fibroblast cells is a more realistic environment compared to the usual 2D culture and to the spheroid made simply by tumor cells. Fibroblasts are needed for the generation of a better 3D model because of their major role as ECM producers and tumor micro-environment organizers. The limit of the spheroid model is the time, since, to date, the system does not provide oxygen import, necessary for the tumor bulk growth. Tumor derived 3D scaffolds by decellularization most truthfully represents the real in vivo scenario of a tumor 3D model, but the recellularization lack is very often a big limit. Our data demonstrate that the decellularizzation process provokes the collapse of the matrix that does not allow the tissue to be utilized as scaffold for in vitro cell experimentation. Here we also provide, for the first time, a method to test the damage that the treatment provokes on the samples, avoiding the loss of precious materials.

My PhD project has developed in two main research areas, both related to antimalarial drug discovery. The first part was focused on the study of the antimalarial and anti-inflammatory activity of medicinal plants used in Burkina Faso to treat malaria; the second part was dedicated to the development of new tools to measure in vitro the pharmacodynamic characteristics of current or new drugs to predict early on their clinical behavior. The work was conducted in the Laboratory of Parasitology, Department of Public Health- Microbiology -Virology of the University of Milan and at the Liverpool School of Tropical Medicine, Liverpool, UK. The antiplasmodial activity, the inhibition of cytokine production, and the antiproliferative activities of three different plants, Canthium henriquesianum (K. Schum), Gardenia sokotensis (Hutch) and Vernonia colorata (Willd) were investigated. Crude and organic plant extracts were tested in vitro for antimalarial activity against chloroquine susceptible (D10) and resistant (W2) strains of P. falciparum. Cell cytotoxicity was assessed on Human Dermal Fibroblast (HDF) and melanoma cells by the MTT assay. The selectivity index (SI) was used as the ratio of the activity against the parasites compared to the toxicity of the plant extract against HDF. C. henriquesianum aqueous extract had a moderate antimalarial activity (IC50<50µg/ml) with a good selectivity index (SI(HDF/D10)˃7). C. henriquesianum diisopropyl ether extract was the most potent inhibitor of parasite growth with an IC50 9.5 µg/ml on W2 and 8.8 µg/ml on D10 and limited toxicity (SI(HDF/D10)<2). On the contrary, G. sokotensis and V. colorata aqueous extracts were shown to be weakly active on the plasmodium parasites (IC50≥ 50µg/ml) with limited toxicity. In addition, when the production of IL-1β and TNFα by human THP1 monocyte was assayed by ELISA, it was found that the extract of C. henriquesianum induced a dose-dependent inhibition of IL-1β, but not TNFα production, thus confirming its traditional use as antipyretic. By NMR analysis, we identified the chromone as the compound mostly represented in the diisopropyl ether extract of C. henriquesianum. Chromone however was less active as antimalarial than the crude extracts and it did not inhibit cytokine production at not toxic doses, indicating that other molecules in the total extracts contribute to the anti-inflammatory activity. In conclusion, out of the three plants examined, only C. henriquesianum seems to possess antimalarial activity in vitro and the capacity to inhibit pyrogenic cytokine production. Gardenia sokotensis extract showed moderate cytotoxic activity on melanoma cell line and it could be further investigated for its antitumor activity. The second part was related to the in vitro study with the objective to develop new tools to measure in vitro the pharmacodynamic features of different antimalarials. Three type of assays were used: dose response curves to measure IC50 and IC90 variables and calculate the slope of the curve; time to kill kinetics using SYBR Green I-based fluorescence (MSF) assay and high content in vitro assays using the Perkin Elmer Operetta High Content Screening microscope to measure the stage specificity of antimalarial action. These tests were first set up with current antimalarials, but the intent is to use them to prioritize the development of new drugs. The results of the dose–response curves confirmed that DHA, atovaquone and CQ are more potent antimalarials compared to pyrimethamine., with a IC50 less than 4 nM for DHA and atovaquone; and 10 nM for CQ. The slope factor, which represents the steepness of the curve, appears to be characteristic of drug class and was >1 for all the drugs suggesting that binding does not follow the law of mass action with a single site and the ligand binds cooperatively to a multivalent receptor. Time to kill studies indicated that DHA has a noticeable effect before 5h as well as CQ and the parasites are irreversibly inhibited after 12hrs of exposure to the drug. The results from the High Content Screening showed that for all the compounds, at the highest dose, the surviving parasites after 48 h are 80-90% young forms and only10-20% mature parasites. No major changes are seen in the distribution of young vs mature forms at doses lower than the IC50. However, at higher doses the percentage of young is increasing and in parallel the percentage of mature forms is decreasing. This indicates that a small number of parasites was able to complete the cycle and re-invade new RBC.The Operetta technique seems to be able to quickly assess the potency as well as the stage specificity of a drug. It should be able to predict the parasite reduction ratios (PRR) without the need to perform the time to kill assays which are more laborious, time consuming and less adaptable to high throughput screenings (HTS). The compounds that inhibit the ring stage would be predicted to have faster time-kill profiles and would be prioritized for further studies in the process of antimalarial drug development.