Thèses sur le sujet « Targeting tumorale »

Les métastases sont responsables de 90% des décès attribués au cancer justifiant qu'une large part des recherches actuelles en cancérologie soit consacrée à l'étude des mécanismes responsables de leur formation. Il a récemment été démontré que des clusters ou agrégats de cellules tumorales circulantes (CTCs) détectés dans la circulation sanguine des patients présentent un potentiel métastatique largement plus important que des cellules tumorales circulantes isolées. Il a également été montré que leur présence est corrélée avec un pronostic péjoratif pour les patients atteints de plusieurs types de cancers d'origine épithéliale. Ces observations ouvrent des perspectives diagnostiques et thérapeutiques prometteuses mais qui nécessitent de mieux comprendre comment se forment et se maintiennent ces clusters. Dans ce contexte notre laboratoire a développé un essai semi-automatisé in vitro basé sur la vidéo-microscopie permettant d'étudier les mécanismes impliqués dans l'agrégation de cellules tumorales dans des conditions ancrage indépendantes. Cet essai a permis de démontrer l'implication de la protéine de jonction adhérente E-cadhérine et des protéines de jonctions desmosomales DSG2 et DSC2 dans l'agrégation de cellules tumorales. L'objectif de mes travaux de thèse a été de poursuivre l'exploration de l'implication des protéines de jonctions intercellulaires de type épithélial dans l'agrégation des cellules tumorales en conditions ancrage-indépendantes et de chercher à identifier de nouveaux régulateurs. Dans un premier temps j'ai pu démontrer et explorer le rôle des jonctions communicantes (ou jonctions gap), ainsi que de la P-cadhérine dans l'agrégation des cellules tumorales mammaires et colorectales. Au cours de la seconde partie de mes travaux, j'ai développé une stratégie basée sur la classification de lignées tumorales selon leur comportement au cours du processus d'agrégation. Afin d'établir les paramètres de cette classification, nous avons exploré les capacités agrégatives de 28 lignées cellulaires tumorales d'origine épithéliale. Cette étude nous a permis de mettre en évidence une forte diversité de comportement au cours de ce processus et de définir des classes de lignées intégrant les aspects dynamiques du processus d'agrégation ainsi que la structure des agrégats obtenus. La combinaison de cette classification avec les données d'expression aujourd'hui disponibles pourrait permettre l'identification de nouveaux régulateurs originaux de l'agrégation. Nos résultats ont mis en évidence de nouveaux régulateurs de l'agrégation cellulaire tumorale ancrage-indépendante ainsi qu'une large diversité de comportement de différentes lignées cellulaires tumorales. Nos travaux ouvrent ainsi des perspectives vers une meilleure compréhension des mécanismes impliqués, vers l'application à l'étude des cellules tumorales circulantes provenant de patients et également au ciblage thérapeutique de ces clusters
Metastases are responsible for 90% of cancer-related deaths justifying the current cancer research's substantial part dedicated to study their formation's mechanisms. It has been recently demonstrated that clusters (or aggregates) of circulating tumor cells (CTCs) identified in patient's blood samples have a far higher metastatic potential than isolated circulating tumor cells. It also has been shown that their detection is correlated with a poor prognosis for patients suffering from epithelial cancers. These observations open up promising diagnostic and therapeutic perspectives but that still requires further investigation on the mechanisms of clusters formation. In this context our laboratory developed an in vitro semi-automated assay based on video microscopy enabling the study of mechanisms involved in tumor cell anchorage-independent clustering. This assay allowed to demonstrate the involvement of adherent junction protein E-cadherin and desmosomal junction proteins DSG2 and DSC2 during tumor cell clustering. The aim of my work was to investigate epithelial intercellular junction's proteins involvement in tumor cell aggregation in anchorage-independent conditions and to search for new regulators. In the first instance I explored and demonstrated the role of communicating junctions (or gap junctions) and P-cadherin in tumor cell aggregation of breast and colorectal cancer cell lines. In the second part, I developed a strategy based on tumor cell lines classification depending on their characteristics of the aggregation process. With the aim of determining the parameters of this classification, I examined aggregation abilities of 28 tumor cell lines derived from epithelial cancers. This study provides evidence for a high variability during this process and allows defining cell lines categories integrating both aggregation process dynamic aspects and aggregates structure. The combination of this classification with current available expression data could lead to the identification of original new aggregation regulators. Together, these results have underscored new anchorage-independent tumor cell aggregation regulators and a wide range of behaviors of different tumor cell lines observed. Our work provides opportunities into a better understanding of involved mechanisms, towards an application to study circulating tumor cells from patients and also a therapeutic targeting of these clusters

Le cancer représente la second cause de décès au monde. Le développement de traitements innovants contre le cancer repose aujourd’hui sur l’identification de biomarqueurs des tumeurs et le développement de produits thérapeutiques capables de reconnaitre ces marqueurs de façon spécifique. Ces produits thérapeutiques de nouvelles générations ont le potentiel d’éliminer spécifiquement les cellules tumorales et donc de réduire les effets secondaires des traitements ainsi que les risques de rechute. Malheureusement, un certain nombre de patients ne peuvent bénéficier de ces traitements, du fait de l’absence de biomarqueurs connus à la surface de leur tumeur. Ce projet a ainsi pour ambition de développer de nouvelles thérapies ciblées en exploitant une nouvelle classe de biomarqueurs et ainsi de venir enrichir l’arsenal thérapeutique disponible pour le traitement des cancers
Cancer is the second cause of death worldwide. Recent advance in cancer treatments involved the identification of cancer biomarkers and the development of efficient therapeutic products able to specifically recognize them. This new class of products has the ability to specifically target tumor cells, with the major advantages to decrease or abolish treatments side effects and relapses of the disease. Unfortunately, a certain number of patients do not respond to those treatments lacking the expression of those biomarkers on their tumor. This project aims at developing new targeted therapies by exploiting a new class of cancer biomarkers, which would potentially extend the therapeutics options against cancer

Les facteurs de croissance endothéliaux (VEGFs) sont produits par les tumeurs qui sont hypoxiques. Principaux responsables de la néo-vascularisation pathologique, ils régulent le stroma tumoral. Les nouvelles stratégies qui ciblent et inhibent le VEGF ouvrent vers la thérapie anti-cancéreuse moderne. Elles ont pour but de contrôler l'angiogenèse tumorale plutôt que la détruire. Le défi est donc de piéger sélectivement le VEGF produit en excès, dans le microenvironnement tumoral, sous l'effet de l'hypoxie. La thèse présentée dans ce manuscrit est consacrée à la réalisation d'une nouvelle stratégie ciblante par l'intermédiaire de cellules, aussi appelée " Cheval de Troie ". Elle combine dans la même entité, une unité de ciblage et un système de délivrance spécifique d'un gène/molécule thérapeutique. Dans le but d'adresser la thérapie aux cellules cancéreuses sans affecter les cellules saines, un modèle de cellules endothéliales de type précurseur (CEPs) a été utilisé comme cellules ciblantes capables d'atteindre spécifiquement le site tumoral. Les CEPs ont été " armées " pour exprimer un gène thérapeutique chargé d'inhiber le VEGF. La neutralisation a été obtenue par la production d'une forme soluble du récepteur-2 du VEGF (VEGFR2 soluble), agissant comme inhibiteur. Caractéristique des tumeurs solides se développant, l'hypoxie a été choisie pour déclencher/éteindre l'expression et la sécrétion du VEGFR2 soluble, en introduisant, en amont du gène thérapeutique, une séquence régulatrice : HRE. Adressé au site tumoral par les CEPs, le régulateur de l'angiogenèse qu'est la forme soluble du VEGFR2, est exprimé de manière conditionnée et réversible, à l'hypoxie. Ceci ouvre à de nouvelles stratégies de normalisation contrôlée et stable des vaisseaux tumoraux en vue de l'utilisation de thérapies combinées.

Cell death and bystander effect are crucial for both the efficacy of cancer therapy and the modulation of anti-tumour immune response. The ‘bystander effect’ refers to a process whereby untreated cells exhibit either the deleterious or beneficial indirect effects as a result of signals received from nearby targeted cells. Various molecular players and pathways have been suggested to mediate the bystander effects, nevertheless to date it is not known which are the key molecules and cellular mechanisms underpinning cell death signal propagation. Several reports suggest the involvement of both nitric oxide (NO) and reactive nitrogen species (RNS) in mediating the bystander effect. Nevertheless their role in the process has not been totally defined since these molecules can either inhibit or sustain tumour progression. Additionally, the methods conventionally applied for NO tracking do neither necessarily reflect real-time NO production nor allow studies into intact three-dimensional tumour mass. The primary aim of this study was to investigate and characterize cell signals responsible for the bystander effect within the tumour microenvironment, paying particular attention to NO. To this purpose, we exploited intravital microscopy by taking advantage of the novel fluorecent probe for NO (CuFL) and the dorsal skinfold chamber model on living tumour-bearing mice subjected to photodynamic therapy (PDT). Notably, the PDT-triggered bystander effect was associated to the generation of very fast NO and Ca2+ waves within the whole tumour mass, supported the hypothesis that constitutive NOS activity might be crucial for the beneficial spread of bystander response and death signals propagation. Additionally, we demonstrated that PDT triggered apoptosis in bystander cells, through gap junction intercellular communication. Finally, our results, provide the first direct evidence of NO involvement in bystander responses within a three-dimensional tumour mass, and strikingly corroborate the notion that connexin gap junction are instrumental for mediating bystander death signals propagation.
La morte cellulare e l’effetto bystander rappresentano degli elementi decisivi per l’efficacia della terapia antitumorale nonchè per la modulazione della risposta immunitaria contro il cancro. Per “effetto bystander” si intende il processo per il quale le cellule non soggette a determinati trattamenti farmacologici subiscono indirettamente gli effetti terapeutici, siano essi positivi o negativi, risultanti dal trattamento esclusivo delle cellule vicine. Nonostante siano state proposte diverse molecole e vie di segnalazione coinvolte nell’effetto bystander, i messaggeri molecolari essenziali ed i meccanismi che sottendono alla propagazione dei segnali di morte non sono ancora noti. Diversi studi suggeriscono un coinvolgimento dell’ossido nitrico (NO) e delle specie reattive dell’azoto (RNS) nell’effetto bystander tuttavia, il loro ruolo nel processo non è tuttora totalmente chiaro, considerato che essi possono sia inibire che sostenere la progressione del tumore. Inoltre, i metodi tradizionalmente usati per lo studio dell’ossido nitrico non riflettono necessariamente la produzione di NO in tempo reale nè consentono studi su complesse masse tumorali tridimensionali. L’obiettivo principale di questo studio è stato quello di individuare e caratterizzare i segnali cellulari responsabili dell’effetto bystander all’interno del microambiente tumorale, rivolgendo particolare attenzione all’NO. A questo scopo, abbiamo utilizzato delle tecniche di microscopia intravitale, avvalendoci di una nuova sonda fluorescente per l’NO (CuFL) e del modello sperimentale delle camerette dorsali impiantate su topi affetti da tumore e sottoposti a terapia fotodinamica (PDT). Da questo studio è emerso che l’effetto bystander indotto dalla terapia fotodinamica è associato alla generazione all’interno della massa neoplastica di onde molto rapide di segnali di NO e di Ca2+. Questi eventi avallano l’ipotesi che l’attività delle isoforme costitutive dell’enzima NOS possa esercitare un ruolo cruciale nella diffusione delle risposte bystander e nella trasmissione dei segnali di morte. Questo lavoro inoltre ci ha consentito di dimostrare che la terapia fotodinamica è in grado di indurre l’apoptosi delle cellule vicine non trattate (bystander) attraverso i meccanismi di comunicazione intercellulare mediati dalle giunzioni comunicanti. Infine, i risultati ottenuti hanno fornito la prima evidenza diretta della partecipazione dell’NO all’effetto bystander all’interno di una massa tumorale tridimensionale e corroborano efficacemente l’ipotesi che le giunzioni comunicanti formate da connesine siano essenziali per garantire la propagazione dei segnali di morte osservati nell’effetto bystander.

Le traitement du cancer par thérapie génique nécessite d’une part des gènes suicides efficaces et, d’autre part, l’adressage spécifique de ces gènes aux cellules cancéreuses. J'ai d'abord caractérisé un nouveau gène suicide dérivé de la désoxycytidine kinase humaine (dCK) : le M36. Comparé à la dCK, le M36 permet une meilleure sensibilisation des certaines cellules cancéreuses aux traitements avec différents chimiothérapeutiques comme la gemcitabine et la cytarabine. Ces résultats sont particulièrement encourageants pour l'élimination des cellules cancéreuses résistantes à ces traitements du fait d’un défaut de la dCK. Dans une deuxième partie, je me suis intéressée à l'adressage spécifique des transgènes aux cellules cancéreuses par les vecteurs lentiviraux. J'ai travaillé à la preuve de concept qu’une enveloppe (Env) VIH modifiée peut permettre un tel ciblage. J'ai généré une Env qui a fortement diminué son tropisme naturel et qui comporte un motif liant le marqueur tumoral modèle HER2
Cancer gene therapy requires the use of an effective suicide gene and the specific targeting of cancer cells. In my PhD work, I have first characterized a new potential suicide gene derived from human deoxycytidine kinase (dCK): M36. Compared to dCK, M36 improves sensitization of certain cancer cells to treatment with chemotherapeutic compounds as gemcitabine and AraC. These results are particularly encouraging for the elimination of cancer cells resistant to the treatment because of a defect with dCK. In a second part, I have worked at the proof of concept that a modified HIV envelope can allow specific targeting of cancer cells by lentiviral vectors. During this work, I have generated a CD4i envelope with a strongly diminished natural tropism and that carries a motif known to bind the model cell surface cancer marker HER2. This envelope constitutes a good starting material to be improved by evolution in cell culture to obtain specific targeting of HER2+ cells

L’angiogénèse tumorale correspond à la formation de nouveaux vaisseaux sanguins afin d’alimenter la tumeur et d’amplifier son développement. Cette étape constitue un facteur pronostique défavorable pour les patients et son inhibition représente un fort intérêt thérapeutique. Parmi les acteurs participant à l’angiogénèse tumorale, on retrouve l’enzyme de dégradation héparanase au sein du microenvironnement tumoral de nombreux cancers. Ces travaux de thèse ont pour objectif de développer des inhibiteurs spécifiques de l’héparanase à partir de polysaccharides sulfatés pour le traitement de l’angiogénèse tumorale. La première partie de ces travaux a été consacrée à l’élaboration de polysaccharides sulfatés de bas poids moléculaires issus de sources animales (Héparine, Chrondroïtine sulfate), algales (Fucoïdanes, Carraghénane-λ-ι-κ) ou bactérienne (Dextran sulfate). Nous avons utilisé pour cela un procédé de dépolymérisation radicalaire assisté par ultrasons, développé en 2013 au laboratoire, que nous avons associé à un procédé de modification chimique appelé glycol-split. Les composés produits ont été évalués pour leurs activités d’inhibition de l’héparanase et de la coagulation sanguine. Ce criblage a notamment permis l’identification d’un dérivé de bas poids moléculaire issu de Carraghénane-λ possédant une forte inhibition de l’héparanase pour une faible inhibition de la coagulation. La deuxième partie de ces travaux s’est ensuite concentrée sur l’évaluation du potentiel anti-angiogénique des inhibiteurs de l’héparanase. Dans ce but, nous avons dans un premier temps évalué le rôle de l’hypoxie et/ou le manque de nutriments sur la production d’héparanase par des cellules de cancers mammaires. Dans ces conditions de stress, nous avons observé que la lignée MCF-7 excrétait une forte quantité d’héparanase. L’analyse en Matrigel 3D du réseau angiogénique formé par des cellules microvasculaires HskMEC, en présence du surnageant de MCF-7 riche en héparanase, a montré une forte stimulation de l’angiogénèse. Les mêmes tests réalisés en présence des inhibiteurs de l’héparanase ont montré une inhibition de l’angiogénèse qui semblait corrélée avec l’inhibition de l’héparanase
Tumor angiogenesis is defined by the spouting of new blood vessels from preexisting ones in order to sustain and amplify the tumor development. This crucial step is associated with poor prognosis for patients and it’s inhibition is therefore considered as a primising way to treat cancer. Among several actors participating in the angiogenesis process, the degradative enzyme heparanase is active in the tumor microenvironment of many cancers. The work presented in this thesis aim to develop specific heparanase inhibitors using sulfated polysaccharides for the treatment of tumor angiogenesis. The first part of this work is dedicated to the conception of low molecular weights sulfated polysaccharides obtainable from animal source (Héparine, Chondroïtine sulfate), algal source (Fucoidan, Carrageenan-λ-ι-κ) and bacterial source (dextran sulfate). To do so, we used a depolymeriation process based on free radicals associated to ultrasonic waves developed in 2013 in the laboratory. This depolymerization method was then coupled with a chemical process called glycol-split. The produced compounds were evaluated for their capacity to inhibit heparanase and blood coagulation. This screening phase lead to the identification of a low molecular weight compound produced from λ-carrageenan endowed with a strong heparanase inhibition power and a low impact on the blood coagulation. The second part of this work was then focused on the evaluation of the anti-angiogenic properties of our best heparanase inhibitors. To do so, we first evaluated the role of hypoxia and lack of nutrients on the heparanase production from breast cancer cell lines. In these higly stressful conditions, we observed that the MCF-7 cell line secreted a huge amount of heparanase. 3D Matrigel angiogenesis network formation using Hsk-MEC microvascular cells in the presence of MCF-7 heparanase rich supernatant showed a strong angiogenesis stimulation. Same tests realized in the presence of heparanase inhibitors showed an angiogenesis inhibition power that seemed correlated with heparanase inhibition

L'objectif de cette thèse a été d'optimiser la réponse immunitaire anti-tumorale induite par les cellules dendritiques (DC) et les cellules iNKTs, en réponse à la prise en charge du KRN7000 (a-galactosyl-céramide) par la molécule CD1d située sur les DCs. Le premier axe de travail visait à synthétiser de nouveaux analogues du KRN7000, en fonctionnalisant la position C6 du sucre et en greffant un groupement phényl sur l'une des chaînes grasses. Les études in vitro ont montré que les modifications apportées par rapport au KRN7000 n'ont pas altéré la prise en charge des molécules obtenues par les DCs. Dans tous les cas, une sécrétion de cytokines a pu être observée. Des études complémentaires visant à décrire le profil cytokinique in vivo sont en cours. Le second axe a consisté en la mise au point d'une stratégie de vectorisation du KRN7000 afin de favoriser sa présentation aux DCs, en l'associant à des molécules d'intérêt comme un peptide spécifique d'une tumeur, une molécule de ciblage des DCs ou des ligands des TLRs. Dans les conditions utilisées, le phénomène d'anergie induit classiquement par l'administration répétée du KRN7000 n'a pas pu être levé. Cependant, nous avons montré d'une part que le KRN7000 vectorisé dans les liposomes est toujours pris en charge par les cellules dendritiques, et d'autre part qu'une réponse immunitaire se traduisant par la production de cytokines par les cellules iNKTs est induite.

Il a été démontré que l’acidité de l’environnement tumoral jouait un rôle dans la résistance aux chimiothérapies. L’utilisation de nanovecteurs, tels que les nanocapsules lipidiques (LNC), permet non seulement d’améliorer le temps de biodistribution de substances actives, mais aussi de cibler l’environnement tumoral tout en protégeant les actifs de cet environnement acide. L’objectif de cette thèse porte ainsi sur l’optimisation et l’évaluation de LNC furtives et pH-sensibles dans le contexte du mélanome.Dans un premier temps, ces travaux ont consisté à caractériser la vascularisation de mélanomes humain et murin. Ces études ont permis de comparer différentes tumeurs (densité, taille et structure) et de déterminer si l’usage de nanomédecines est approprié dans ce contexte.La seconde partie s’est orientée sur l’élaboration de polymères combinant furtivité et pH-sensibilité. Ces copolymères composés de N-vinylpyrrolidone (NVP)et de vinylimidazole ont été synthétisés par polymérisation RAFT et post-insérés à la surface des LNC. Ces modifications ont donné lieu à des LNC présentant des charges de surface pH-dépendantes,entrainant une augmentation de leur internalisation à pH acide dans des cellules de mélanome. Finalement, des études de biodistribution ont mis en évidence l’intérêt de la NVP dans le développement de nanovecteurs furtifs. En conclusion, les copolymères développés ont permis de prolonger le temps de circulation, mais aussi d’apporter des propriétés pH-sensibles qui pourraient améliorer l’internalisation tumorale des LNC in vivo et donc de potentialiser l’effet d’une thérapie anticancéreuse
Tumor acidity has been shown to play a major role in resistance to chemotherapy. The use of nanomedicines, as lipid nanocapsules (LNC), allows to protect drugs from this acidic environment. They can also improve the biodistribution of therapeutics and to target the tumor environment. The aim of this thesis concerns the evaluation and characterization of stealth and pH-sensitive LNC in the context of melanoma. Firstly, these works consisted in characterizing the vascularization of human and mice melanoma. These studies allowed to compare different tumors (density, size and structure), and determine if the used of nanocarrier is suitable in the context of melanoma.The second part of this thesis described the development and the characterization of new copolymers, combining stealth and pH-sensitive properties. These copolymers, composed of Nvinylpyrrolidone(NVP) and vinylimidazole, were synthesized by RAFT polymerization and were post in sertedonto LNC surface. These modifications allowed to obtain charge reversal nanocarriers, leading to increase their melanoma cell uptake underacid pH. Finally, biodistribution of these modified nanoparticles was studied in vivo and highlighted the interest of NVP in the development of stealth nanocarriers. To conclude, the developed copolymers able to extend nanocarrier circulation time and to provide pH-responsive properties which should increase the tumor internalization of LNC invivo and potentiate the effect of anticancer drugs

La recherche contre le cancer est aujourd’hui tournée vers les thérapies ciblées. Dans ce contexte, la nucléoline et la nucléophosmine sont fortement impliquées dans la croissance tumorale et l’angiogenèse associée et surexprimées dans les cellules tumorales et endothéliales activées. Elles apparaissent donc comme des cibles de choix. Le pseudopeptide HB-19 lie la nucléoline de surface, inhibe la croissance cellulaire de nombreuses lignées de cellules tumorales et induit la mort de ces cellules tumorales par apoptose. D’autre part, il inhibe, in vitro et in vivo, plusieurs étapes de l’angiogenèse tumorale. Ces deux activités mènent, in vivo, à l’inhibition de la croissance tumorale dans de nombreux modèles de croissance tumorale chez la souris. Dans le but d’améliorer les activités observées avec HB- 19, des pseudopeptides dérivés de ce dernier ont été synthétisés. Ainsi le NucAnt 6L (N6L) montre une activité 5 à 10 fois supérieure à celle de HB-19 selon les modèles. Son activité anti-métastatique a également été démontrée. L’étude du mécanisme d’action des pseudopeptides a permis d’identifier deux nouveaux récepteurs: les héparanes sulfates et la nucléophosmine. L’importance du TIMP-3 dans son activité anti-métastatique a également été soulignée. Enfin, aucune toxicité n’a été observée chez les souris aux doses employées et la synthèse de N6L peut être effectuée à l’échelle industrielle. N6L apparaît donc comme un composé prometteur pour une thérapie anti-cancéreuse
The cancer research is nowadays interested in targeting therapies. In this context, nucleolin and nucleophosmin are proteins highly involved in tumor growth and angiogenesis and over-expressed in activated endothelial and tumor cells. So, they appear as very promising targets. The pseudopeptide HB-19 binds to cell surface-expressed nucleolin, inhibits different tumor cell growth and induces cell death by apoptosis. Furthermore, it inhibits, in vitro and in vivo, several steps of angiogenesis. These two activities lead, in vivo, to the suppression of tumor growth and angiogenesis in several mice models. In order to improve the activities observed with HB-19, new compounds derived from HB-19 were synthesized. So, NucAnt 6L (N6L) show 5 to 10 fold stronger anti-tumoral activity than HB- 19 depending of the model. Study of their action mechanism allowed us to identify two new receptors: nucleophosmin and heparan sulfates. The importance of TIMP-3 in anti-metastatic activity has also been highlighted. Finally, no toxicity has been observed in mice treated with N6L which can easily industrially be synthesized. N6L appears to be a promising compound for anti-cancer therapies

La risonanza magnetica per immagini è una delle tecniche diagnostiche più sofisticate attualmente utilizzate in clinica. I mezzi di contrasto di contrasto (MC) possono essere somministrati per ottenere una migliore risoluzione delle immagini dei tessuti detectabili, nonché per ridurre il rischio di diagnosi errate causate dalla limitata sensitività di questa tecnica. Attualmente, soltanto alcuni MC a base di gadolinio sono approvati per un utilizzo in ambito clinico. Tuttavia, a causa di alcune problematiche legate alla loro tossicità, la loro somministrazione è consentita soltanto in particolari pazienti e con il minimo dosaggio. In questa tesi è riportata la sintesi e la validazione di un nuovo tipo di MC a base di manganese: Mn@HFn-RT. Il manganese è un metallo endogeno paramagnetico in grado di produrre un contrasto positivo simile al gadolinio e con una inferiore tossicità per l’uomo. Ioni di manganese sono stati caricati efficacemente all’interno del guscio di una proteina ricombinante chiamata H-ferritina, che si è dimostrato essere riconosciuta dalle cellule che overesprimono il recettore TfR1, come accade nella maggior parte delle cellule tumorali. Mn@HFn-RT è stato caratterizzato, dimostrando un’eccellente stabilità colloidale, un’ottima relassività ed un buon profilo di sicurezza. Da esperimenti condotti in vitro è stato possibile confermare la capacità di Mn@HFn-RT di raggiungere efficacemente le cellule tumorali, e si è inoltre dimostrata la sua abilità di favorire il riconoscimento di masse tumorali in vivo: infatti, Mn@HFn-RT somministrato con un basso dosaggio di metallo, ha dimostrato una ottima clearance ed è stato in grado di far risaltare una massa di tumore al seno impiantato in topo. Per tali motivi, Mn@HFn-RT può essere considerato un promettente MC per la risonanza magnetica.
Magnetic resonance imaging is one of the most sophisticated diagnostic tools in clinic. Contrast agents (CAs) may be exploited to afford much clearer images of detectable organs and to reduce the risk of misdiagnosis, due to the limited sensitivity of the technique. Actually, only a few gadolinium-based CAs are approved for clinical use. Nevertheless, concerns over their toxicity remain and their administration is approved only under strict control. In the present study it is reported the synthesis and validation of a novel manganese-based CA, Mn@HFn-RT. Manganese is an endogenous paramagnetic metal able to produce a positive contrast like gadolinium, however it is estimated to cause lower toxicity for human body. MN ions have been efficiently loaded inside the shell of a recombinant human protein called H-ferritin that is recognized by cells overexpressing TfR1, including the majority of cancer cell. Mn@HFn-RT was characterized, showing excellent colloidal stability, superior relaxivity and good safety profile. From in vitro experiments it was possible to confirm the ability of Mn@HFn-RT to efficiently target cancer cells and thus favor the detection of the tumor region in a breast cancer in vivo model with very low metal dosages and showing rapid clearance. Mn@HFn-RT looks a promising CA candidate to be developed for MRI.

Dans l’optique de développer de nouveaux agents bio-inspirés pour la détection et/ou le traitement des cellules cancéreuses, nos travaux se sont tournés vers la synthèse de macromolécules peptidiques complexes ayant la capacité de reconnaître les cellules tumorales. Ces travaux visent à développer des molécules permettant de cibler des particularités cellulaires présentes sur les cellules tumorales dans le but d’obtenir un traitement personnalisé via une vectorisation active permettant une augmentation de l'efficacité thérapeutique et une réduction intrinsèque de la toxicité du traitement. Pour cela, ces biomolécules doivent posséder à la fois un site de reconnaissance pour la liaison avec des protéines présentes à la surface de la cellule cible et un ou plusieurs éléments utilisés pour détecter et/ou détruire la cible. Ces systèmes ont été élaborés à partir d'un châssis moléculaire cyclodécapeptidique présentant des propriétés conformationnelles particulières. Plusieurs approches ont été envisagées. La première a consisté à rechercher de nouveaux ligands de récepteurs tumoraux en s'inspirant du domaine de reconnaissance d'un anticorps monoclonal thérapeutique. Dans ce contexte, nous avons proposé la conception de mimes du Rituximab ciblant l'antigène CD20 utilisé dans le traitement des lymphomes Non-Hodgkinien. Dans la seconde approche, nous avons développé des vecteurs destinés à des applications d'imagerie tumorale. Pour cela, des châssis multivalents présentant des ligands peptidiques RGD ciblant l'intégrine alpha-v-beta-3 ont été conjugués avec différents agents de détection puis évalués par des techniques d'imagerie telles que la TEP, la TEMP et l’imagerie optique. Toujours dans un but de diagnostic des cellules tumorales, nous nous sommes par la suite tournés vers l’application à la capture cellulaire. Pour cela, une surface d’or à été modifiée via la formation d’une monocouche organisée SAM (« Self-assembled monolayer ») présentant des cyclodextrines. Un gabarit peptidique adéquat a ainsi permis la capture et le relargage sélectif de cellules tumorales mesurées par la technique de microbalance à quartz. Ces mêmes vecteurs, validés pour le diagnostic ont par la suite été couplés à des peptides cytotoxiques issus d’une protéine pro-apoptotique « Bax ». Enfin, une dernière partie a été consacrée à la recherche de nouveaux composés comportant plusieurs éléments de ciblage tumoraux. Ces molécules présentent deux ligands de ciblage des récepteurs surexprimés sur la membrane et peuvent ainsi permettre une meilleure sélectivité vis-à-vis des tissus tumoraux
In order to develop new agents for cancer diagnosis and treatment, our work aims to synthesize complex peptide macromolecules that are able to specifically recognize cancer cells. Our goal is to increase the therapeutic efficiency and reduce the toxicity of currently available drugs using "targeted strategies". In this context, we designed sophisticated macromolecules encompassing a cell recognition domain and one or several components used to detect and/or destroy the target. This system was prepared starting from a cyclodecapeptidic scaffold presenting particular conformational properties. Different approaches were considered. First of all our work was to investigate new tumor receptor ligands based on the recognition domain of a therapeutics monoclonal antibody. We proposed the design of Rituximab mimics which targets the CD20 antigen used for the treatment of Non-Hodgkin lymphoma. In a second approach, we prepared new vectors for tumor imaging. For this purpose, multivalent scaffolds containing RGD peptide that targets alpha-v-beta-3 integrin were combined with several detection elements and evaluated by using PET, SPECT and optical imaging techniques. We also used this peptide vector for the selective cell capture and release from flowing suspensions, using a gold surface modified with a cyclodextrin-containing self-assembled monolayer (SAM). A scaffold containing ferrocenyl and -RGD- ligands permitted the selective capture and release of tumor cells. This experiment was monitored by QCM-D. This vector has been next grafted to a cytotoxic peptide that was discovered from a pro-apoptotic protein named “Bax”. Finally, we designed new molecules which include an additional ligand for the cell’s surface to increase the selectivity and the affinity of tumor tissue

De part, leur implication dans la prolifération cellulaire, l'invasion et leur surexpression dans de nombreux cancers, les récepteurs à tyrosine kinase de la famille HER constituent des cibles de choix en oncologie. Parmi ces récepteurs, le récepteur HER3 semble pertinent car il est impliqué dans la tumorigenèse de nombreux cancers (sein, ovaire, pancréas, mélanome…) et il est associé à un mauvais pronostic. De plus, la surexpression du récepteur HER3 est souvent associée à l'apparition de résistance aux thérapies ciblées. Nous avons sélectionné plusieurs anticorps anti-HER3 humains et murins respectivement par « phage display » et fusion cellulaire. Ces derniers reconnaissent spécifiqument le récepteur HER3. Parmi les nombreux anticorps découvert, nous avons sélectionné un anticorps anti-HER3 humain H4B-121 et 2 anticorps anti-HER3 murins 9F7-F11 et 16D3-C1. Ces derniers ont la capacité à faire régresser des tumeurs épidermoide, pancréatique et triple négative chez la souris, en présence ou en abscence de neuréguline et indépendamment du status HER2 et P53/PTEN. Cette inhibition est possible grâce à un blocage du cycle cellulaire en phase G1, une inhibition de la prolifération ainsi qu'une induction de l'apoptose. Ces trois anticorps sont capables de bloquer l'hétérodimérisation des récepteurs HER2/HER3 ainsi que la phosphorylation du récepteur HER3. Ils sont aussi capables d'inhiber la phosphorylation de la protéine AKT ainsi que de ses cibles (MDM2, FOXO et XIAP). De plus, nous avons montré que nos anticorps sont capables de lyser les cellules tumorales par ADCC (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity). Cette étude démontre que ces anticorps anti-HER3 représentent une nouvelle thérapie pour les cancers du pancréas et du sein triple négatif
Due to their implication in the cellular proliferation, the invasion and their surexpression in numerous cancers, the tyrosine kinase receptors of HER family constitute one of the best targets in oncology. Within this family, the human epidermal growth factor receptor 3 (HER3) plays a role in tumorigenesis of different cancers (Breast, melanoma, pancreas and ovary). This receptor is implicated in drug resistance and he is over expressed in cancers that are not eligible for the currently approved targeted therapies. To this end, we generated specific antibodies (Abs) against domain 1 (D1) and domain 3 (D3) of HER3 that recognize epitopes that do not overlap with the neuregulin-binding site. The fully human H4B-121 Ab and the mouse monoclonal Abs 16D3-C1 and 9F7-F11 inhibited tumor growth in nude mice xenografted with epidermoid, pancreatic, or triple-negative breast cancer cells independently of NRG addiction, HER2 status and p53/PTEN mutations. The combination of one anti-HER3 Ab and trastuzumab improved tumor growth inhibition in mice xenografted with HER2(low) cancer cell lines, for which trastuzumab alone shows no or moderate efficiency. Ab-induced disruption of tumor growth was associated with G1 cell cycle arrest, proliferation inhibition, and apoptosis of cancer cells. Anti-HER3 Abs blocked HER2/HER3 heterodimerization and HER3 phosphorylation at the cell membrane, leading to inhibition of phosphorylation of the downstream AKT targets murine double minute 2, X-linked inhibitor of apoptosis, and forkhead box O1. Anti-HER3 Abs can also induice antibody dependant cell-mediated cytotoxicity. This study demonstrates that anti-HER3 D1 and D3 Abs could represent a new option for immunotherapy of pancreatic and triple-negative breast cancers

Des progrès récents dans l’utilisation préclinique et clinique des petits ARN interférents (siRNA) ont montré leur potentiel en tant qu’inhibiteur de la synthèse protéique dans de nombreuses pathologies comme le cancer. L’administration des siRNA rencontre un certain nombre de problèmes liés à leur dégradation rapide dans les milieux biologiques, ainsi qu’à leur difficulté à pénétrer au sein des cellules cibles en raison de leur hydrophilie et de leur charge négative. Une des clés de l’amélioration de l’efficacité thérapeutique de ces molécules repose sur l’emploi de vecteurs. Au cours de cette thèse, des lipoplexes capables de protéger les siRNA contre la dégradation et de favoriser leur transport jusqu’aux cellules cibles ont été développés et optimisés. Pour ce faire, des lipoplexes recouverts d’HA ont été formulés pour la vectorisation active de siRNA vers des cellules tumorales surexprimant le récepteur CD44. Dans la première partie de cette thèse, la formation des lipoplexes a été étudiée, ainsi que les paramètres influençant leur organisation supramoléculaire. L'insertion de l'HA dans la structure du liposome au moment de la formation des vésicules a entraîné une augmentation de la taille des liposomes en fonction de la concentration d’HA. Leur complexation avec les siRNA a encore augmenté la taille des particules obtenues. L’ajout des acides nucléiques lors de la formation des lipoplexes a provoqué un déplacement d'une partie du conjugué HA-DOPE de la structure des lipoplexes, comme montré par électrophorèse capillaire. La titration calorimétrique isotherme et les études de diffraction des rayons X ont démontré que, sous l’effet des interactions électrostatiques avec les siRNA, un réarrangement des bicouches lipidiques a lieu, conduisant à la formation de vésicules oligolamellaires, confirmé visuellement par cryo-microscopie. Enfin, le positionnement convenable de l’HA sur la surface des lipoplexes et sa capacité de se lier spécifiquement aux récepteurs de CD44 ont été démontrés par la technique de résonance plasmonique de surface. Dans la deuxième partie de cette thèse, la capture cellulaire et localisation intracellulaire des lipoplexes-HA ont été évalués par cytométrie en flux et microscopie de fluorescence, et ont montré que les lipoplexes modifies par l’HA sont internalisés plus rapidement que les lipoplexes non modifiés, et une fois dans des cellules, ils sont localisés principalement à l’intérieur des endosomes. La capacité des lipoplexes à transporter des molécules de siRNA intactes au cytoplasme a été confirmée par 81 % d'inhibition d'expression de luciferase in vitro sur la lignée cellulaire de cancer du poumon A549-luc. In vivo, le traitement avec les lipoplexes-HA transportant un siRNA anti-luciferase a mené à une diminution statistiquement significative de l’expression de luciferase, ce qui a été confirmé par la réduction de l'expression d’ARNm de la luciferase dans le poumon des animaux traités avec les lipoplexes-HA. L'analyse de la distribution des lipoplexes dans les poumons a montré que les lipoplexes modifiés par l’HA sont distribués de façon plus importante et plus homogène dans le tissu pulmonaire que les lipoplexes non modifiés. Dans la troisième partie de cette thèse, la diffusion des lipoplexes-HA de siRNA dans le mucus a été étudié, afin d’évaluer la faisabilité de l’administration pulmonaire de ces particules. Les études utilisant la technique de « multiple particle tracking (MPT) » ont montré que la présence d’HA combinée à l'ajout de siRNA ont permis l’obtention de deux formulations de lipoplexes présentant une pénétration efficace dans le mucus, les lipoplexes-HA and les lipoplexes-PEG/HA. En conclusion, un système efficace de lipoplexes utilisant siRNA pour l'inhibition de l'expression génique ciblant les récepteurs CD44 a été développé. Les résultats obtenus confirment que les HA-lipoplexes sont capables de libérer efficacement le siRNA dans le cytoplasme des cellules in vitro et in vivo
Recent progresses in the preclinical and clinical use of small interfering RNA (siRNA) have shown their potential as an inhibitor of protein synthesis in many diseases such as cancer. The administration of siRNA encounters a number of problems related to their rapid degradation in biological media, and their difficulty in penetrating targeted cells due to their hydrophilicity and negative charge. A key to improving the therapeutic efficacy of these molecules is based on the use of vectors. In this thesis, lipoplexes that can protect siRNA against degradation and facilitate their transport into target cells were developed and optimized. To do this, lipoplexes covered with HA were formulated for active vectorization of siRNA to tumor cells overexpressing the receptor CD44.In the first part of this thesis, the formation of lipoplexes was studied, and the parameters influencing their supramolecular organization. Insertion of HA within the liposome structure during vesicle formation resulted in the increase in liposome size as a function of HA concentration. Their complexation with siRNA has further increased the size of the particles obtained. The addition of siRNAs when forming lipoplexes caused a displacement of a portion of the HA-DOPE conjugate from the lipoplexes structure, as shown by capillary electrophoresis. The isothermal titration calorimetry and X-ray diffraction studies showed that a rearrangement of the lipid bilayers occur under the effect of electrostatic interactions with siRNAs, leading to the formation of oligolamellar vesicles, which was visually confirmed by cryo-microscopy. Finally, the proper positioning of the HA on the surface of the lipoplexes and its ability to specifically bind to the CD44 receptors has been demonstrated by the surface plasmon resonance technique.In the second part of this thesis, cellular uptake and intracellular localization of HA-lipoplexes were assessed by flow cytometry and fluorescence microscopy, and showed that lipoplexes modified by HA are internalized more rapidly than unmodified lipoplexes, and once in the cells, they are mainly localized within the endosomes. The ability of lipoplexes to transport intact siRNA molecules to the cytoplasm was confirmed by 81% of luciferase in vitro expression inhibition on the lung cancer cell line A549-luc. In vivo, treatment with HA-lipoplexes carrying anti-luciferase siRNA led to a statistically significant decrease in expression of luciferase, which was confirmed by reducing the mRNA expression of luciferase in lungs of animals treated with HA-lipoplexes. The analysis of the distribution of lipoplexes in the lungs showed that lipoplexes modified with HA are distributed more evenly in the lung tissue than unmodified lipoplexes.In the third part of this thesis, the movement of siRNA HA-lipoplexes in the mucus was studied to assess the feasibility of administering these particles directly to the lungs. Studies using the technique of "multiple particle tracking (MPT)" showed that the presence of HA combined with the addition of siRNA allowed the preparation of two lipoplexes formulations with efficient mucus-penetration, HA-lipoplexes and PEG/HA-lipoplexes.In conclusion, an efficient siRNA lipoplex system for inhibiting gene expression targeted TO the CD44 receptorS has been developed. The results confirm that the HA-lipoplexes are able to effectively release in vitro and in vivo the siRNA molecules in the cytoplasm of cells

Dans ce travail, nous avons pu sélectionner par la méthode SELEX un aptamère à ARN modifié, appelé Apt1, qui se lie avec une haute affinité au récepteur CD44. L'aptamère sélectionné a été modifié avec par des 2'-F-pyrimidines afin d’augmenter sa stabilité vis-à-vis des nucléases pour une application thérapeutique. Cet aptamère a été ensuite greffé sur des liposomes contenant des séquences de siRNA dirigées contre un gène rapporteur, dans le but d’un ciblage actif des cellules tumorales exprimant le récepteur CD44. Cette fonctionnalisation a été réalisée par la conjugaison d’un dérivé 3'-thiol de Apt1 et un dérivé maléimide de phospholipides, directement à la surface des liposomes, ou bien séparément puis par post-insertion sur les liposomes. Les liposomes ainsi formulés présentent une forte affinité pour les cellules exprimant le CD44 sans déclencher de réponse inflammatoire au sein de ces cellules. En outre, nous montrons que l'inhibition du gène rapporteur est augmentée et prolongée lorsque l’aptamère est couplé aux liposomes chargés aux siRNA, in vitro ainsi qu’in vivo sur un modèle murin orthotopique de cancer du sein. De tels vecteurs de siRNA constituent donc un outil prometteur pour le ciblage actif de tumeurs exprimant le récepteur CD44. L'étape suivante consistera charger ces vecteurs par des séquences de siRNA permettant de réprimer des oncogènes
In this work we succeeded to select a modified RNA aptamer, named Apt1, to bind the human CD44 receptor protein with high affinity using the Systemaic Evolution of Ligands by EXponential enrichment (SELEX) method. The selected aptamer was modified with 2'-F-pyrimidines to increase its stability against nucleases for therapeutic applications. Furthermore, we designed and characterized aptamer-functionalized liposomes loaded with siRNA molecules against a reporter gene as a model drug delivery system for the active targeting CD44-expressing tumor cells in vitro and in vivo. Such functionalization was performed by conjugation of 3'-thiol-modified Apt1 to maleimide-modified phospholipids, either on the surface of liposomes, or separately, followed by post-insertion onto liposomes. The targeted liposomes displayed high affinity for CD44-positive cells without triggering any inflammatory response within these cells. Moreover, we show that a higher and prolonged inhibition of the targeted gene can be achieved when siRNA-loaded liposomes are functionalized by the aptamer, both in vitro and in vivo on a murine orthotopic breast cancer model. Such a delivery system may thus be a useful tool for the active targeting of CD44-expressing tumors and silencing oncogenes in vivo

The present research project was aimed at developing smart nano-systems able to selectively respond with morphological alterations to external physio-pathologic stimuli. These systems are intended for diagnostic or therapeutic applications in tumor treatment. The responsiveness of these systems is intended to improve the site-selective targeting efficiency and reduce uncontrolled disposition in healthy tissues. Smart nano-systems have been obtained using gold nanoparticles (AuNPs) as platform. AuNPs have been surface coated with responsive polymeric components to endow stealth properties in physiologic conditions after injection in the bloodstream. The tumor interstitium is characterized by altered pH and temperature with respect to normal tissues. Thus, when the nano-system reaches the tumour, the responsive coating can undergo morphological modifications which modulate the interface properties of the nanoparticles. This will promote their interaction with the biological surfaces (i.e. cells, tissues). In the project here discussed, different functionalization strategies of AuNPs have been investigated in order to develop nano-carriers provided with multimodal targeting to the tumor. Gold nanoparticles were surface decorated with targeting agents and thermosensitive or pH-sensitive polymers. This allowed producing nano-carriers in which bio-recognition can be controlled by temperature or pH. In physiological conditions, the polymer on particles surface can hide the targeting moiety while in the tumor tissue the thermosensitive or pH sensitive polymer chains collapse provoking the targeting agent exposition and thus promoting cellular internalization. As a result, the multimodal targeting will decrease aspecific biorecognition and increase site-specificity. Gold nanoparticles were produced by Laser ablation technique in aqueous solution without addition of surfactants or stabilizing agents. This finely controlled method allows for obtaining AuNPs with a size of 18 nm. The components used for gold nanoparticles surface functionalization have been thiolated since sulphidril groups promptly react with metal gold with high yield. AuNPs have been surface decorated with biotin-SH and the 8 kDa thermosensitive polymer N-isopropylacrylamide-co-acrylamide-SH (pNIPAm-co-Am-SH), characterized by a low critical solution temperature (LCST) of 37 °C. The nanosystem obtained was tested by ELISA enzymatic assay to evaluate its ability to bind selectively avidin, chosen as model target, as a function of temperature. The results showed that the system behavior is thermally controlled since functionalized gold nanoparticles can only bind avidin when temperature is increased above the polymer LCST at which it collapses. Furthermore, the investigation highlighted the role of the biotin amount and of the biotin/polymer molar ratio on gold nanoparticles surface in affecting the system performance. The system has been further investigated, according to the information acquired, with the biotinylated thermosensitive AuNPs. Gold nanoparticles were surface functionalized with folic acid-SH and the thermosensitive polymer pNIPAm-co-Am-SH to achieve temperature controlled targeting towards cancer cells overexpressing folate receptor (HiFR). Stability studies performed in PBS showed that thermosensitive polymer is paramount to avoid nanoparticles aggregation in the presence of salts. At temperature below polymer LCST, gold nanoparticles are very stable while above the LCST, only a mild aggregation was detected. Folated thermosensitive AuNPs have been tested in vitro with tumor cells overexpressing and non-expressing the folate receptor. The results showed that folated thermosensitive nanoparticles incubated with HiFR cell lines are internalized by cells and dispose in the citosol only at temperature above the polymer LCST. The concept of multimodal targeting was extended to the development of pH-sensitive gold nanoparticles, using polymers able to respond with morphological alterations to environmental pH changes. Ideally, acid-sensitive polymers adequate for this purpose should be soluble and in coil form at pH 7.4 and convert into insoluble globular state, as a consequence of their protonation, in acidic tumor environment. To this aim, different pH-sensitive polymers were produced in order to have an array of materials with satisfactory pKa (in the physiopathological range) to chose from for gold nanoparticles functionalization. The materials were designed in order to endow acid sensitiveness to the decorated nanoparticles in the physic-pathological range. A 2-(methacryloyloxy)ethyl 3-chloro-4-hydroxybenzoate monomer (MOECHB) was chosen and pH responsive materials were obtained by living radical polymerization technique, namely reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT). One homopolymer and various random and block copolymers using the 2-(methacryloyloxy)ethyl 3-chloro-4-hydroxybenzoate and hydrophilic monomers, namelly metoxy(polyetilenglycole methacrylate (mPEGMA475) or glycerol methacrylate (GMA), were synthesized. All the polymers obtained were characterised by potentiometric titration to determine the pKa value, and turbidimetric analysis to measure the cloud point. Furthermore, their pH-dependant behavior was investigated by dynamic light scattering at various pH conditions. One random and two block copolymers, composed by MOECHB and GMA, were selected for further investigation. Decreasing pH from 7.4 to 6.5, as in physiopathologic condition, they showed a conversion from the soluble to the aggregated state. One additional block copolymer, made by MOECHB and mPEGMA475, will be also evaluated: in the same physiopathologic condition, it outlined morphological modification, albeit without aggregation. The results displayed that pH responsiveness is modulated by the 2-(methacryloyloxy)ethyl 3-chloro-4-hydroxybenzoate/hydrophilic monomer molar ratio in the polymer backbone and by the polymer molecular weight.
Il presente progetto di ricerca ha riguardato lo sviluppo di un nano-sistema intelligente, capace di rispondere selettivamente a stimoli esterni di tipo fisiopatologico con alterazioni morfologiche. Tali sistemi sono stati disegnati per un impiego in diagnostica o nella terapia antitumorale. La responsività di questi sistemi ha lo scopo di migliorare l’ efficienza del direzionamento selettivo e di ridurre la distribuzione aspecifica nei tessuti sani. Sistemi intelligenti sono stati ottenuti a partire da nanoparticelle d’ oro (AuNPs), a cui sono stati associati polimeri responsivi, che conferiscono loro caratteristiche stealth in condizioni fisiologiche in seguito ad iniezione nel torrente circolatorio. E’ noto che l’ interstizio tumorale è aratterizzato da valori di pH e temperatura alterati rispetto al tessuto sano. Di conseguenza, quando il nano-sistema raggiunge il tumore, il rivestimento polimerico può² subire modifiche morfologiche che modulano le proprietà delle nanoparticelle. Questo promuoverà la loro interazione con le superfici biologiche, quali cellule e tessuti. Nel progetto qui discusso, sono state valutate diverse strategie di funzionalizzazione di AuNPs, allo scopo di sviluppare nano-carriers caratterizzati da un direzionamento multi-modale al tumore. Nanoparticelle d’ oro sono state derivatizzate superficialmente con agenti di direzionamento e polimeri termosensibili o pH sensibili, affinchè il riconoscimento selettivo del tessuto tumorale da parte dei nano-carriers sia controllato dalle condizioni di temperatura o di pH circostanti. In condizioni fisiologiche i polimeri presenti sulla superficie delle AuNPs schermano l’ agente di targeting, mentre nel tessuto tumorale grazie alla temperatura o pH alterati, essi collassano determinando l’ esposizione del direzionante e promuovendo l’ endocitosi cellulare. Come conseguenza, il direzionamento multi-modale diminuirà il bio-riconoscimento aspecifico a favore invece della sito-specificità. Le nanoparticelle d’ oro utilizzate in questo progetto sono state prodotte mediante laser ablation in soluzione acquosa, senza utilizzo di sostanze surfattanti e stabilizzanti. Attraverso questo processo controllato e riproducibile si sono ottenute dispersioni di particelle diluite, con diametro medio di 18 nm. Per la funzionalizzazione superficiale di nanoparticelle d’ oro i materiali utilizzati sono stati tiolati, nota l’ elevata capacità di coniugazione di gruppi sulfidrilici su superfici d’ oro metallico. Il primo sistema sviluppato in questo progetto di tesi ha riguardo l’ impiego di nanoparticelle d’ oro in grado di rispondere a stimoli termici. AuNPs sono state modificate superficialmente con biotina-SH e con un polimero termosensibile di 8 kDa, N-isopropylacrylamide-co-acrylamide-SH (pNIPAm-co-Am-SH), caratterizzato da una low critical solution temperature (LCST) di 37 °C. Il sistema ottenuto è stato testato mediante saggio enzimatico di tipo ELISA per valutarne la capacità di binding selettivo ad avidina, scelta come modello, in funzione della temperatura. I risultati hanno mostrato che il comportamento del sistema è controllato dalla temperatura, in quanto le nanoparticelle sono in grado di legare l’ avidina solo quando la temperatura è superiore all’ LCST del polimero, ovvero quando il polimero stesso collassa. Lo studio ha inoltre evidenziato che la quantità assoluta di biotina e i rapporti molari biotina/polimero sulla superficie delle nanoparticelle condizionano in modo rilevante le performance del sistema Sulla base delle ottimizzazioni realizzate con le nanoparticelle direzionate con biotina, il sistema è stato modificato superficialmente con acido folico e lo stesso polimero termosensibile (pNIPAm-co-Am-SH), allo scopo di ottenere un direzionamento verso cellule tumorali sovraesprimenti il recettore per il folato (HiFR). Gli studi di stabilità in PBS hanno mostrato come il polimero termosensibile sia indispensabile per impedire l’ aggregazione delle particelle in presenza di sali. A temperatura inferiore all’ LCST del polimero le nanoparticelle sono stabili, ed aggregano solo marginalmente a temperatura superiore. AuNPs termosensibili e funzionalizzate con acido folico sono state testate in vitro su due diverse linee celluari, sovraesprimenti e non il recettore per l’ acido folico. Gli studi hanno mostrato che solo le particelle termosensibili modificate con acido folico e incubate con linee cellulari HiFR, a temperatura superiore all’ LCST del polimero, vengono internalizzate dalle cellule e si distribuiscono nel citosol. Il concetto di targeting multi-modale è stato successivamente ampliato per lo sviluppo di nanoparticelle d’ oro pH-sensibili, utilizzando polimeri in grado di rispondere con cambiamenti morfologici ad alterazioni del pH ambientale. Idealmente, polimeri acido sensibili adeguati allo scopo devono essere solubili ed in conformazione estesa a pH 7.4, ma subire una conversione allo stato globulare insolubile in seguito a protonazione nell’ ambiente acido tumorale. Per raggiungere questo obiettivo sono stati sintetizzati diversi polimeri pH-sensibili, in modo tale da disporre di una gamma di materiali caratterizzati da valori di pKa e cloud point adeguati allo scopo, tra cui poter selezionare il più¹ adatto per la funzionalizzazione superficiale di nanoparticelle d’ oro. I materali sono stati disegnati per conferire alle AuNPs proprietà di acido-sensibilità nel range fisiopatologico. E’ stato selezionato e sintetizzato un monomero acido-sensibile, 2-(metacriloilossi)etil 3-cloro-4-idrossibenzoato (MOECHB), a partire dal quale sono stati poi prodotti polimeri pH responsivi. La metodica adottata per la reazione di polimerizzazione fa parte delle cosiddette tecniche di polimerizzazioni viventi, ovvero la reversible addition fragmentation chain transfer (RAFT). Sono stati sintetizzati un omopolimero e diversi copolimeri sia random che a blocchi utilizzando MOECHB e monomeri idrofilici, nello specifico metossi(polietilenglicole metacrilato) (mPEGMA475), e glicerolo metacrilato (GMA). Tutti i polimeri ottenuti sono stati caratterizzati mediante titolazione potenziometrica per determinarne il pKa, e sottoposti ad analisi turbidimetrica per misurare il punto di intorbidimento (cloud point). Il loro comportamento pH-dipendente è stato inoltre investigato mediante analisi di dynamic light scattering (DLS) effettuate a diversi valori di pH. Sono stati selezionati un copolimero random e due copolimeri a blocchi, composti da MOECHB e GMA, per ulteriori studi di funzionalizzazione di nanoparticelle d’ oro. Infatti questi materiali hanno mostrato una conversione da una forma solubile ad una aggregata insolubile per diminuzione del pH della soluzione da 7.4 a 6.5, che mima le condizioni fisiopatologiche. Un ulteriore copolimero a blocchi di MOECHB con mPEGMA475 sarà valutato, in quanto nelle medesime condizioni ha mostrato modifiche morfologiche, sebbene non si sia osservata la formazione di prodotti insolubili. I risultati delle analisi hanno evidenziato infine che la responsività al pH è modulata dal rapporto molare 2-(metacriloilossi)etil 3-cloro-4-idrossibenzoato/monomero idrofilico nella composizione polimerica, così come dal peso molecolare del polimero.

Le ciblage de l’activité de l’IFNα est une stratégie développée afin d’augmenter l’index thérapeutique de cette cytokine, dont l’efficacité requiert de fortes doses au site d’action, responsables d’une toxicité systémique. Du fait de l’expression ubiquitaire de son récepteur, le ciblage de l’IFNα par immunocytokine est limité. En se basant sur le concept d'immunocytokine et utilisant un IFNα muté, peu actif, une efficacité de ciblage de 3 log a pu être obtenue, dans le système humain et murin, grâce au rétablissement de l'activité de l'IFNα sur les cellules ciblées. Ces IFNα ciblés sont doués d'une activité biologique, notamment antitumorale, dont la cible cellulaire reste à déterminer. Une stratégie inverse, en cours d'optimisation, permet d'inhiber l’activité des IFN-I spécifiquement sur les cellules ciblées. Cette double stratégie de ciblage de l’activité et de l’inhibition de l’IFN devrait permettre de déterminer les cibles des effets bénéfiques et néfastes des IFN-I, avec des applications thérapeutiques éventuelles
Targeting IFN activity is a strategy developed to increase the therapeutic index of thiscytokine, whose efficiency requires high doses to site of action, responsible for systemictoxicity. Due to the ubiquitous expression of its receptor, the targeting efficiency of IFNbasedimmunocytokine is limited. Using a mutated IFNα, poorly active, a 3 log targetingefficiency was achieved, in the human and mouse system, by restoring the activity of IFNα ontargeted cells. The biological activity of these targeted IFNα include an antitumoral effect,the cellular target remains to be determined. A reverse strategy being optimized, can inhibitIFN-I activity specifically on targeted cells. This dual targeting strategy of the activity andinhibition of IFN should identify the targets of beneficial and deleterious effects of IFN-I,with possible therapeutic applications

L'immunothérapie basée sur le blocage des points de contrôle immunitaire (ICBs) est un traitement prometteur pour les patients atteints de mélanome ; cependant, seule une petite sous-population en tire un bénéfice à long terme. Un des défis pour améliorer l'efficacité et étendre le bénéfice des ICBs aux patients non répondeurs est de concevoir des approches innovantes permettant de transformer les tumeurs dites "froides ou désertes pour les cellules immunitaire" en tumeurs dites "chaudes ou infiltrées par les cellules immunitaires" qui sont éligibles aux ICBs. Nous avons étudié l'impact du ciblage du gène de l'autophagie Beclin1 sur le paysage immunitaire des tumeurs de mélanome B16-F10. Nos résultats ont démonté que ce ciblage inhibait significativement la croissance tumorale B16-F10 et augmentait l'infiltration des leucocytes CD45+. Le phénotypage immunitaire a révélé une augmentation de l'infiltration de cellules NK (Natural Killer) actives, de macrophages inflammatoires et résidents de type 1, de cellules dendritiques et de lymphocytes T CD8+ actifs. L’inhibition de la croissance tumorale Becn1- n'était plus observée par la déplétion des CD8+ de l'hôte, soulignant ainsi leur rôle dans le contrôle du développement de ces tumeurs. Nos résultats ont démontré que La régulation du paysage immunitaire des tumeurs Becn1- était associée à une modulation du réseau de cytokines/chémokines dans le microenvironnement tumoral (TME). Ainsi, les tumeurs Becn1- présentaient une signature de cytokines inflammatoires (comprenant CCL5, CXCL10 et IFNg) qui pourrait être responsable de l'établissement de microenvironnement inflammatoire permissif aux cellules CD8. Nous avons révélé que la surexpression de l'IFNg dans le TME des tumeurs Becn1- était responsable de l'induction de PD-L1 sur les cellules tumorales par la voie d'activation JAK/STATs. En conclusion, cette étude met en évidence Beclin1 comme une cible majeure, capable d'induire l'infiltration des cellules effectrices immunitaires dans les mélanomes en induisant une signature inflammatoire. Elle fournit également la preuve de concept pour combiner des inhibiteurs d'autophagie avec les ICBs comme une approche de pointe pour améliorer leur efficacité
Immune Checkpoint Blockades (ICBs)-based immunotherapy has emerged as a promising treatment for melanoma patients; however only a small subset of patients reaps a long term benefit. One of the major challenges to enhance the efficacy and extend the benefit of ICBs to non-responder patients is to design innovative approaches allowing the switch of “immune desert cold tumors” to “immune infiltrated hot tumors" which are eligible for ICB-based therapies. Here, we investigated the impact of targeting the early autophagy gene Beclin1 on the immune landscape of B16-F10 melanoma tumors. We found that targeting Beclin1 (Becn1-) significantly inhibited B16-F10 tumor growth and increased the infiltration of CD45+ leukocytes into the tumor bed. Immune phenotyping revealed an increased infiltration of active Natural Killer (NK) cells, inflammatory and resident type 1 macrophages, dendritic cells, and active CD8+ T lymphocytes. The inhibition of Becn1- tumor growth was no longer observed by depleting host CD8+ T cells, thus highlighting their major role in the control of Becn1- B16-F10 tumor development. We showed that Beclin1-dependent regulation of the immune landscape was associated with profound modulation of the cytokine/chemokine network in the tumor microenvironment (TME). Importantly, we revealed that Becn1- tumors displayed an inflammatory cytokine signature (comprised, but not restricted to, CCL5, CXCL10 and IFNg) that could be responsible for the switch from cold non T-inflamed to hot T-inflamed tumors. Mechanistically, we reported that the overexpression of IFNg in Becn1- TME was responsible for the induction of Programed Death ligand-1 (PD-L1) on tumor cells through the activation of JAK/STATs pathway. Overall, this study highlights Beclin1 as a valuable target, able to drive immune effectors cells into the melanoma tumors by inducing an inflammatory signature. This study provides the proof of concept for combining drugs inhibiting early autophagy process along with ICBs as a cutting-edge approach to improve their efficacy

Les mélanomes muqueux sont rares avec un potentiel métastatique important. L’immunothérapie est un traitement prometteur dans ce sous-type agressif de mélanome. L’analyse de biomarqueurs de réponse à une immunothérapie anti-PD1 chez 23 patients présentant un mélanome muqueux non opérable et/ou métastatique a montré que l’activation du complexe d’initiation de la traduction, eIF4F, était fortement prédictive de cette réponse. Cette activation a été mesurée par un test de proximité entre les sous-unités eIF4E et eIF4G. Les autres marqueurs admis, tels que l’expression tumorale de PD-L1 ou les caractéristiques de l’infiltrat lymphocytaire intra-tumoral, n’ont pas de valeur pronostique significative dans cette cohorte.La glycolyse anaérobie est la voie métabolique que la plupart des cellules tumorales privilégient lors de lacancérogenèse. Ce phénomène est appelé « effet Warburg ». Au cours de la mélanomagénèse, il existe un continuum entre l’expression croissante de l’hexokinase 2 (ou HK2, première enzyme de la glycolyse) et l’agressivité tumorale. Dans cette étude, nous avons montré que l’inhibition d’expression d’HK2 (par siARN) induisait, in vitro, une diminution majeure de la migration et de l’invasion tumorales indépendamment du métabolisme glucidique ou de l’expression initiale d’HK2. Par une technique de profilage des polysomes, nous avons observé que HK2 régulait la traduction de l’ARNm de SOX10, un facteur de transcription impliqué dans l’initiation et la progression du mélanome. Nous avons alors réalisé une immunoprécipitation de l’ARN après induction de liaisons protéine-ARN par du formaldéhyde, nous permettant ainsi de démontrer que la protéine HK2 se liait à l’ARNm de SOX10
Mucosal melanoma is a rare tumor with a high metastatic potential. Immunotherapy has promising results in this aggressive subtype of melanoma. In a cohort of 23 patients with non-resectable and/or metastatic mucosal melanoma who received anti-PD1 immunotherapy, we showed that the activation of the eukaryotic translation initiation complex, eIF4F, was a strong prognostic biomarker of response. This activation was assessed with a proximity ligation assay between eIF4E and eIF4G. The other biomarkers, such as the PD-L1 tumoral expression or the characteristics of tumor-infiltrating lymphocytes, had no prognostic value in this cohort.Aerobic glycolysis is usually the main metabolic pathway in tumor cells during cancerogenesis. This specificprocess is called “Warburg effect”. During melanomagenesis, we observed a positive correlation between the expression level of hexokinase 2 (HK2, first enzyme of glycolysis) and the tumor invasiveness. In this study, we showed that inhibition of HK2 expression (by siRNA) induced, in vitro, a major decrease of migration and invasion potential independently of the basal glycolytic metabolism or HK2 expression level in the cell lines. Moreover, performing a polysome profiling analysis, we demonstrated that HK2 was regulating the translation of SOX10 mRNA, a transcription factor involved in initiation and progression of melanoma. We, then, realized an RNA immunoprecipitation in formaldehyde and showed that HK2 was an RNA-binding protein, able to interact with the SOX10 mRNA

Ce travail est axé sur l’amélioration des propriétés de biospécificité de sondes polymères fluorescentes, d’architectures contrôlées synthétisées par polymérisation RAFT, pour deux applications principales : le ciblage de tumeurs cancéreuses in vivo et le marquage de protéines pour des études in cellulo. Pour une imagerie ciblée de l’angiogénèse tumorale in vivo, des systèmes de ciblage multivalents à deux niveaux ont été élaborés en combinant à la fois i) des polymères bien contrôlés synthétisés par polymérisation RAFT et par le procédé PISA, ii) des clusters peptidiques tétravalents présentant une forte affinité pour les intégrines αvβ3 et iii) des fluorophores émettant dans le rouge lointain/proche-infrarouge pour un suivi in vitro et in vivo par microscopie optique. Deux types de sondes ont été synthétisés, des conjugués linéaires et des nanoparticules chevelues. La présentation multivalente du cluster peptidique permet d’augmenter considérablement l’affinité pour les intégrines αvβ3. Les premières évaluations biologiques indiquent une internalisation cellulaire des sondes polymères médiée par les clusters peptidiques ainsi qu’un marquage sélectif des cellules sur-exprimant les intégrines αVβ3. Pour le marquage de protéines, deux stratégies ont été explorées : le marquage de protéines natives par couplage covalent de sondes ω-fonctionnelles et le marquage de protéines recombinantes par des sondes porteuses d’un ligand spécifique. Pour la première stratégie, une fonction ester activé a été introduite en extrémité ω de sondes polymères par chimie thiol-ène pour marquer les résidus lysines des protéines natives. Cette approche a abouti à un poly-marquage difficile à contrôler mais offrant une brillance élevée. Pour la seconde stratégie, un groupement acide nitrilotriacétique (NTA) a été introduit en extrémité α des sondes polymères afin de marquer spécifiquement les protéines taguées Histidines. Cette approche a permis un marquage efficace de différentes protéines et permet de contrôler précisément le nombre de sondes par protéine ainsi que leur site de fixation sur la protéine. Finalement, suite à ces travaux, une nouvelle stratégie de synthèse de polymères séquencés par addition successive de monomères hétéro-bifonctionnels en utilisant des réactions chimiques très efficaces, sélectives et orthogonales a été proposée et validée
This work is focused on improving the biospecificity properties of fluorescent polymer probes, with controlled architectures, for two main applications: the in vivo targeting of cancer tumors and the labeling of proteins for in cellulo studies. For a targeted imaging of tumor angiogenesis in vivo, targeting systems presenting two levels of multivalency were developed by combining both i) well-controlled polymers synthesized by RAFT polymerization and the PISA process, ii) peptide tetravalent clusters exhibiting a high affinity for the αvβ3 integrins and iii) fluorophores emitting in the far red / near-infrared for a monitoring in vitro and in vivo by optical microscopy. Two types of probes were synthesized, linear conjugates and hairy nanoparticles. Multivalent presentation of the peptide cluster induced a significant increase of the affinity for αvβ3 integrins. The first biological evaluations also indicated an efficient cellular internalization of polymer probes mediated by the peptide clusters and a selective labeling of cells over-expressing αvβ3 integrins. For protein labeling, two strategies were explored: the labeling of native proteins by covalent coupling of ω-functional polymer probes and the labeling of recombinant proteins by probes bearing a specific ligand at one chain-end. For the first strategy, an activated ester function was introduced at the ω-end of polymer probes by thiol-ene chemistry to label the lysine residues of native proteins. This approach resulted in a poly-labeling, difficult to control but providing highly bright bioconjugates. For the second strategy, a nitrilotriacetic acid group (NTA) was introduced at the α-end of polymers probes to specifically label Histidine tagged proteins. This approach enabled an efficient labeling of different proteins with a more precise control of the number of probes per protein and of the binding site. Finally, following this work, a new synthetic strategy of sequenced polymers by successive addition of hetero-bifunctional monomers using highly efficient, selective and orthogonal chemical reactions was proposed and validated

The functional and morphological alterations of the vascular endothelium of the lymphatic system, the micro-environmental alterations such as the amplification of the enzyme kit, the overexpression of specific receptors, the increase in the redox potential, temperature and the lowering of the pH, are typical characteristics of tumor tissues. These features can be exploited successfully for the development of suitable supramolecular and colloidal systems with passivelly and activelly guided delivery of anticancer drugs at the site of action. Here we aimed at investigating a novel pH responsive liposomal platform to achive selective tumor targeting to ensure the accumulation of the drug in adequate therapeutic concentration. Liposomes were decorated with a novel non-peptidic cell penetrating enhancer (CPE) that simulates the action of the natural peptides known from the literature studies. A synthetic procedure was developed to obtain a oligoarginyl-dendron derivative to be included in the lipid bilayer of the liposomes. The derivative TetraBoc-Arg(pbf)-[G-2]-distearoyl glycerol (Arg4-DAG) consists of a central polyester core to which arginines were conjugated on one side and that was terminated with a distearoyl glycerol chain on the other. The resulting macromolecule possesses a amphiphilic character in virtue of its two combined moieties: 1) the hydrophobic distearoyl tail acting as lipidic anchor for lipid bilayer association , 2) the positively charged peripheral arginines, which provides for high cationic density and mimic the basic aminoacid residues of TAT peptide, thus conferring the biological activity to the system. The intermediates and the final product were characterized by 1H, 13C NMR and mass spectrometries. Liposomes obtained with a 2:1 HSPC/cholesterol molar ratio were generated with increasing ratio of the CPE with respect to lipids using the post insertion technique which provided for the increase of liposome zeta potential from +8 mV to +24 mV as the ratio of CPE increased from 1% to 4%, then reaching a plateau. The biological properties of fluorescently labelled CPE coated liposomes were investigated on HeLa cancer cells. Flow cytometry analysis and confocal microscopy study confirmed the high capacity of the liposomes to associate with cells. A 30 times higher efficiency of cancer cell association was found with respect to naked liposomes. The CPE coated liposomes demonstrated a remarkable ability to deliver in the cytosol albumin and calcein. BSA was chosen as protein model, whereas calcein was selected because it is a strongly hydrophilic molecule, so as to mimic the behavior of water soluble drugs. Both molecules were incorporated into the hydrophilic core of liposomes. The calcein was not release from the liposomes for at least 16 days, whereas BSA was completely released in 7 days. In order to confer to liposomes sensitivity to pH alterations for controlled access to cancer cells, a pH sensitive polymer of mPEG-oligosulphadimethoxine (mPEG5kDa-SDM8) was synthesized by radical polymerization of sulfadimethoxine methacrylate from 2-bromo-isobutyryl-methoxyPEG (mPEG-Br) 5kDa. mPEG5kDa-SDM8 possesses a pKa of 7.12 which ensures a deprotonated state with negative charge at physiological pH (7.4) and a protonated neutral state at pH 6.5, which corresponds to the tumor environment. Zeta potential analysis performed on Arg4-DAG coated liposomes decorated with the mPEG5kDa-SDM8 polymer confirmed that the most finely regulated shielding/unshielding capacity is obtained when the two modules are equimolar, both at 4% in moles with respect to lipids. This formulation was found to be stable even in the presence of serum proteins, which does not alter the charge-to-charge interaction between the oligo-sulfadimethoxine of the pH responsive polymer and oligo-arginines of the CPE as observed by zeta potential analysis. The SPR study also confirmed this result, proving the polymer association with the CPE coated liposomes at pH 7.4 and the release at pH 6.5 mimicking the tumor, which corresponds to a sheddable physical PEGylating under controllable conditions. Finally, the biological studies confirmed the ability of the pH responsive polymer to shield the CPE on the liposomal surface under physiological conditions (pH 7.4), which prevents the internalization of both the unloaded pH responsive vesicles, and the calcein loaded vesicles, whereas revealing it when exposed to tumor mimicking acid environment, allowing for liposome cell entry and payload intracellular delivery.
Alterazioni funzionali e morfologiche dell'endotelio vascolare del sistema linfatico, alterazioni micro-ambientali quali l'amplificazione del kit enzimatico, sovraespressione di recettori specifici, aumento del potenziale redox, temperatura e abbassamento del pH, sono caratteristiche tipiche dei tessuti tumorali. Queste caratteristiche possono essere sfruttate con successo per lo sviluppo di sistemi colloidali sopramolecolari in grado di direzionare passivamente o attivamente farmaci antitumorali al sito d'azione. In questo lavoro è stata indagata una nuova piattaforma liposomiale sensibile al pH per il direzionamento selettivo al tumore e assicurare l'accumulo del farmaco in concentrazione terapeutica adeguata. I liposomi sono stati decorati con un nuovo promotore di internalizzazione cellulare non-peptidico che simula l'azione dei peptidi naturali conosciuti dagli studi di letteratura. È stata messa a punto una nuova procedura di sintesi per ottenere il derivato dendronico oligoargininico da includere nel doppio strato lipidico dei liposomi. Il derivato TetraBoc-Arg (PBF) - [G-2] -distearoil glicerolo (Arg4-DAG) è costituito da un nucleo centrale di poliestere a cui le arginine sono state coniugate su un lato e che è stato terminato con una catena distearoil glicerolo dall'altro. La macromolecola risultante possiede un carattere anfifilico in virtù delle sue due frazioni combinate: 1) la coda idrofoba distearoil, elemento lipidico di ancoraggio per associazione al doppio strato lipidico, 2) la carica positiva conferita dalle arginine periferiche, che mimano i residui amminoacidici fondamentali del peptide TAT, conferendo così l'attività biologica del sistema. Gli intermedi e il prodotto finale sono stati caratterizzati da 1H, 13C NMR e spettrometria di massa. I liposomi ottenuti con un rapporto molare 2:1 HSPC/colesterolo sono stati generati con crescente rapporto del CPE rispetto ai lipidi, utilizzando la tecnica di ‘post-insertion’, che ha determinato l'aumento del potenziale zeta dei liposomi da +8 mV a +24 mV, all’aumentare del rapporto di CPE dall'1% al 4%, raggiungendo quindi il plateau. Le proprietà biologiche dei liposomi rivestiti con il CPE fluorescente sono state studiate su cellule tumorali HeLa. L’analisi citofluorimetrica e lo studio di microscopia confocale hanno confermato l'elevata capacità dei liposomi di associare con le cellule. Rispetto al liposomi nudi, è stata rilevata una maggiore efficienza di associazione alla cellula tumorale di 30 volte. I liposomi rivestiti col CPE hanno dimostrato una notevole capacità di veicolare albumina e calceina nel citosol. BSA è stata scelta come proteina modello, mentre calceina è stata scelta perché è una molecola fortemente idrofila, in modo da simulare il comportamento di farmaci idrosolubili. Entrambe le molecole sono state incorporate nel nucleo idrofilo di liposomi. La calceina non è stata rilasciata dai liposomi per almeno 16 giorni, mentre BSA è stata completamente rilasciata in 7 giorni. Al fine di conferire ai liposomi responsività ad alterazioni di pH per l'accesso controllato alle cellule tumorali, è stato sintetizzato un polimero sensibile, pH mPEG-oligosulphadimethoxine (mPEG5kDa-SDM8), mediante polimerizzazione radicalica di sulfadimetossina metacrilato su una catena di 2-bromo-isobutirril-methoxyPEG (MPEG-Br ) 5kDa. mPEG5kDa-SDM8 possiede un pKa di 7,12 che garantisce uno stato deprotonato con carica negativa a pH fisiologico (7.4) e uno stato neutro protonato a pH 6,5, che corrisponde all'ambiente tumorale. L’analisi di potenziale Zeta eseguita su liposomi decorati con Arg4-DAG e con il polimero mPEG5kDa-SDM8 ha confermato che la capacità di schermatura/deschermatura più finemente regolata si ottiene quando i due moduli sono equimolari, entrambi a 4% in moli rispetto al lipidi. Questa formulazione è risultata stabile anche in presenza di proteine ​​del siero, che non alterano l'interazione carica-carica tra l'oligo-sulfadimetossina del pH del polimero reattivo e oligo-arginine del CPE come osservato mediante analisi potenziale zeta. Anche lo studio SPR ha confermato questo risultato, dimostrando l'associazione del polimero con i liposomi rivestiti col CPE a pH 7.4 e il rilascio a pH 6,5, che corrisponde ad una peghilazione fisica reversibile in condizioni controllabili. Infine, gli studi biologici hanno confermato la capacità del polimero pH sensibile di schermare il CPE sulla superficie liposomiale in condizioni fisiologiche (pH 7,4), che impedisce l'internalizzazione delle vescicole non responsive al pH sia non caricate, sia caricate con calceina, mentre il polimero espone il CPE sulla superficie dei liposomi in presenza di un ambiente acido che simula il tumore, consentendo l'ingresso ai liposomi nelle cellule e la veicolazione del loro contenuto a livello intracellulare.

Parce qu’ils reconnaissent les antigènes tumoraux de manière très spécifique, les anticorps monoclonaux (mAb) sont devenus un outil majeur pour le traitement de nombreux cancers. Malgré l’amélioration des taux de rémission, les mAbs présentent des inconvénients dont un poids moléculaire important freinant leur pénétration tumorale, un polymorphisme génétique rendant le traitement parfois inopérant, et une production par voie biologique coûteuse. La conception de mimes synthétiques de mAbs de petite taille est donc un moyen attractif de contourner ces problèmes. Afin de développer des mimes de grande efficacité et de haute spécificité, nous avons réalisé une étude approfondie de l’interaction anticorps/antigène appliquée à l’interaction rituximab/CD20 impliquée dans le traitement de certains lymphomes. La conception de ces mimes d’anticorps est basée sur des constructions macromoléculaires associant de courtes séquences peptidiques composant le paratope du rituximab. La sélection des peptides les plus affins dans le processus de reconnaissance a été effectuée par une technique d’analyse de surface, la résonance plasmonique de surface (SPR – Biacore). Ces études ont nécessité le développement de surfaces antigéniques dont la densité surfacique en CD20 a été optimisée pour réaliser du criblage peptidique. La caractérisation de ces surfaces fonctionnelles par microbalance à quartz (QCM-D), ellipsométrie spectroscopique (SE), et SPR a permis d’acquérir de nombreuses informations dont l’influence de la distance inter-CD20 sur la reconnaissance du mAb. Suite au criblage, les séquences peptidiques des zones d’interaction du paratope avec lesquelles le CD20 vient interagir ont pu être déterminées avec une grande précision. Elles ont par la suite été assemblées sur un châssis moléculaire pour la confection des mimes de mAb synthétiques
As they recognize tumor antigens in a very specific manner, monoclonal antibodies (mAbs) became a major tool for the treatment of many cancers. Despite the improvement in remission rates, mAbs suffer from limitations that relate mainly to their high molecular weight, their high cost, and the polymorphism of their Fc region. The design of small synthetic mAb mimics is therefore an attractive way to bypass these problems. To design efficient and specific mimics, we studied in detail an antibody / antigen interaction, especially rituximab / CD20 interaction occurring in the treatment of some lymphoma. MAb mimics are macromolecular constructs composed of short peptide sequences included in the Rituximab paratope. The selection of the peptides deeply involved in the recognition of the tumor cell was carried out by using a surface sensitive technique called surface plasmon resonance (SPR - Biacore). To perform this selection, it was first necessary to develop an antigenic surface for peptide screening. The characterization of this surface by quartz crystal microbalance (QCM-D), spectroscopic ellipsometry (SE), and SPR made it possible to acquire a lot of information such as the dependence of the inter-CD20 spacing on the mAb recognition process. Following the screening, the peptide sequences of the paratope areas involved in CD20 recognition could be determined with high precision, and then be used to prepare synthetic mAb mimics

En dépit des progrès réalisés ces dernières décennies, le cancer demeure un problème majeur de santé publique. La plupart des chimiothérapies conventionnelles exploitent les propriétés cytotoxiques d'agents non sélectifs qui affectent les cellules à division rapide, qu'elles soient cancéreuses ou non, ce qui peut aboutir à une toxicité importante et de sévères effets secondaires. Pour pallier à ce problème, l'utilisation de ligands de ciblage pour délivrer spécifiquement l'agent cytotoxique aux cellules malignes tout en épargnant les tissus sains est une approche prometteuse. Parmi les différents ligands exploités, l'acide folique fait l'objet d'une attention particulière due à la surexpression préférentielle de son récepteur par de nombreux types de cellules cancéreuses. Cependant, les essais cliniques menés sur des molécules reposant sur cette stratégie indiquent que leur efficacité dépend surtout du niveau d'expression du récepteur ciblé. Dans ce contexte, j'ai développé deux approches permettant d'augmenter l'efficacité du ciblage des récepteurs à l'acide folique. D'une part, j'ai réalisé la validation biologique de nouveaux conjugués conçus pour délivrer conjointement deux agents anticancéreux. D'autre part, j'ai mis au point un traitement capable d'augmenter, in vitro et in vivo, l'expression des récepteurs à l'acide folique à la surface des cellules tumorales. Cela aboutit à l'internalisation d'une plus grande quantité de vecteur, qui se traduit in vivo, par une inhibition plus importante de la croissance tumorale, sans toxicité sur les cellules saines
Despite significant advances obtained during the last decades, cancer is still lack of effective treatments. Indeed, most conventional chemotherapies relies on non-selective agents that kill indifferently healthy and tumor cells with high rate of division. This can lead to elevated toxicity and severe side effects. In this context, therapeutic approaches that exploit targeting ligands to selectively deliver cytotoxic drugs to malignant cells are currently promising. Among these different ligands, folate conjugates are subject to special attention due to the preferential overexpression of the folate receptor on several human cancer cell types that can mediate specific attachment and internalization of folate-derived imaging and therapeutic agents. However, clinical trials carried on such molecules revealed that their efficiency is mainly governed by folate receptor expression level on tumor cells. In this respect, I developed two approaches to increase efficacy of folate receptor targeting. On one hand, I realized biological validation of new targeting devices designed for the simultaneous delivery of two therapeutic agents. On the other hand, I developed a treatment to enhance in vitro and in vivo folate receptor expression at the surface of malignant cells. This treatment allows the internalization of a larger amount of a folic acid conjugate, previously synthesized and validated in our laboratory. That results in a drastically improvement of the in vivo tumor growth inhibition, without toxicity toward healthy cells

Trabalho Final do Mestrado Integrado em Medicina apresentado à Faculdade de Medicina
O adenocarcinoma ductal do pâncreas (ACDP) é um dos tipos de carcinoma mais letais do mundo. A sua agressividade deve-se à sua apresentação tardia e disseminação precoce, sendo que cerca de 80% destes tumores são irressecáveis na altura do diagnóstico. O ACDP apresenta uma particularidade histológica: as células pancreáticas tumorais estão cercadas por uma abundante reacção desmoplásica, também chamada de estroma, formada por grandes quantidades de matriz extracelular e diversas células como células estreladas pancreáticas, células endoteliais e imunes e factores de crescimento. O estroma interage activamente com as células pancreáticas tumorais através de diversos mecanismos, estabelecendo um micro-ambiente tumoral particular que promove a proliferação tumoral, a disseminação metastática e a resistência à quimioterapia. Actualmente, a terapêutica aplicada ao ACDP irressecável é baseada em agentes de quimioterapia, que prolongam a sobrevivência por apenas alguns meses. Há uma grande necessidade de desenvolver novos tratamentos para melhorar o mau prognóstico do ACDP. Com a descoberta do seu papel no ACDP, o estroma tem emergido como um novo e promissor alvo terapêutico, com bons resultados em ensaios pré-clínicos. Estão a decorrer ensaios clínicos, usando variadas moléculas do estroma como alvo terapêutico, e que têm revelado tanto resultados promissores como decepcionantes. A modulação da interação entre as células tumorais e o estroma, ao invés da sua depleção, parece ser o próximo passo na terapêutica do ACDP. Esta revisão pretende sumariar o papel do estroma na progressão e resistência à terapia do ACDP, bem como explorar as recentes descobertas nas terapêuticas que têm o estroma como alvo terapêutico, analizando as suas promessas e fracassos.
Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is the one of most lethal cancer types in the world. Its aggressiveness is due to its usually late presentation and early dissemination, with about 80% of tumors being unresectable by the time of diagnosis. PDAC presents a particular histological feature: the pancreatic cancer cells are surrounded by and abundant desmoplastic reaction, also called stroma, formed by large quantities of extracellular matrix and diverse cells such as pancreatic stellate cells, immune and endothelial cells and growth factors. The stroma establishes an intense crosstalk with pancreatic cancer cells, through diverse mechanisms, establishing a peculiar cancer microenvironment that promotes cancer proliferation, metastatic spread and chemotherapy resistance. Current unresectable PDAC management is based in chemotherapy agents, which prolong survival for only a few months. There is a great necessity to develop new treatments to improve PDAC’s poor prognosis. With the unveiling of its role in PDAC growth, stroma has emerged has a new promising target in this field, with good results in preclinical trials. Clinical trials are ongoing in several stroma targeting modalities, with both hopeful and disappointing results. The modulation of the stroma-tumor crosstalk, rather than its depletion, has the potential to become the next step in PDAC management. This review intends to summarize the role of stroma in PDAC progression and chemotherapy resistance, and to explore recent discoveries in stroma targeting therapies, analyzing its promises and failures.