Thèses sur le sujet « T. viride »

Au cours d’une réponse immunitaire primaire, les lymphocytes T CD8 mémoires émergent à partir d'un environnement de forte activation immunitaire. Les cellules régulatrices T CD4 FoxP3+ (LTregs) jouent un rôle clé de suppression de la réponse immunitaire. Nous montrons que les LTregs sont nécessaires pour la génération d’une réponse mémoire T CD8 fonctionnelle. En absence de LTregs lors du priming, les LT CD8 mémoires générées prolifèrent faiblement et ne parviennent pas à se différencier après une réactivation antigénique en effecteurs cytotoxiques secondaires fonctionnelles. Nous suggérons que les LTregs agissent tôt, lors de la phase d'expansion des LT CD8, en réduisant l’exposition des précurseurs mémoires T CD8 à l'interleukine-2. Ce nouveau rôle crucial des LTregs a des implications pour le développement optimal de vaccin.Chez les patients sous traitement antirétroviral efficace et prolongée (ART), le VIH peut persister dans un petit pool de cellules T CD4 mémoires quiescentes de longue durée de vie infectées par du virus latent intégré. Ce réservoir latent comprend différentes sous-populations mémoires. Nos résultats suggèrent une contraction progressive de la taille du réservoir latent autour d'un noyau formé de sous-populations T CD4 mémoires moins différenciées (centrales mémoires TCM et souches mémoires TSCM). Ce processus très lent semble dépendre de la taille initiale et du taux de décroissance qui diffère entre les sous-populations mémoires infectées de manière latente. Nos résultats suggèrent également une extrême stabilité du sous-réservoir TSCM, dont la taille est directement liée à l'exposition cumulée au virus plasmatique avant le début du traitement ART, soulignant l'importance d'une initiation précoce du traitement antirétroviral efficace. La présence de cette dynamique intrinsèque dans le réservoir latent peut avoir des implications pour la conception de stratégies optimales de purge thérapeutique contre le VIH
During the primary immune response, CD8 memory emerges from an environment of strong immune activation. The FoxP3 regulatory CD4 T-cell subset (Treg) is known as a key suppressive component of the immune system. We report that Tregs are required for the generation of functional CD8 memory. In the absence of Tregs during priming, the resulting memory cells proliferate poorly and fail to differentiate into functional cytotoxic secondary effectors following antigen reactivation. We find that the Tregs act early, during the expansion phase of primary CD8 effectors, by fine tuning interleukin-2 exposure of CD8 memory precursors. This crucial new role of Tregs has implications for optimal vaccine development. In patients who are receiving prolonged antiretroviral treatment (ART), HIV can persist within a small pool of long-lived resting memory CD4 T cells infected with integrated latent virus. This latent reservoir involves distinct memory subsets. We provide results that suggest a progressive reduction of the size of the blood latent reservoir around a core of less-differentiated memory subsets (central memory and stem cell-like memory).This process appears to be driven by the differences in initial sizes and decay rates between latently infected memory subsets. Our results also suggest an extreme stability of the TSCM sub-reservoir, the size of which is directly related to cumulative plasma virus exposure before the onset of ART, stressing the importance of early initiation of effective ART. The presence of these intrinsic dynamics within the latent reservoir may have implications for the design of optimal HIV therapeutic purging strategies

La destruction du compartiment T CD4 induite par le VIH‐1 est essentiellement périphérique. Cependant, l'atteinte des précurseurs lymphocytaires T, pour laquelle existent des arguments, est encore mal connue. L'objectif de ce travail a été d'explorer le rôle de la protéine Nef, hors contexte d'infection virale, dans la différenciation lymphoïde. Nef, produite très tôt après l'infection par le VIH‐1, possède un rôle‐clé dans la pathogénie, comme en témoigne la reproduction, chez la souris transgénique pour Nef, d'une maladie proche de la maladie humaine. Dans les lymphocytes matures infectés, Nef module l'expression du récepteur CD4, des molécules du CMH de classe I et induit un état d'activation T. Nef interagit également avec de nombreux partenaires cellulaires impliqués dans des voies de signalisation cytokinique, de contrôle de l'apoptose et de l'ontogénie T. Au cours de ce travail, nous avons montré que l'expression de Nef en absence d'autres gènes viraux bloquait le potentiel T et NK des précurseurs hématopoïétiques humains par un mécanisme apoptotique indépendant des caspases et lié à une perturbation du potentiel mitochondrial. Grâce à l'utilisation du système de culture OP9‐DL1 permettant l'identification des premiers stades de différenciation des cellules T, nous avons montré que la génération de cellules T à partir de CD34+ est affectée à un stade CD3+CD5+CD1a+ qui a initié le réarrangement D‐J du TCRβ. Les stades suivant du développement T sont aussi affectés, en effet, une réduction quantitative du nombre de CD4 ISP et de DP CD4+CD8+ TCRαβ a été observée. Nef diminue aussi la génération de cellules NK CD56+ alors que la production de cellules B n'est pas affectée. Des analyses par dilution limite montrent une réduction significative de la fréquence des précurseurs T/NK parmi les cellules CD34+ exprimant Nef. Nous avons par ailleurs montré une augmentation de 15 à 25% de cellules apoptotiques dans les cellules exprimant Nef‐WT par rapport aux autres conditions. Cette apoptose n'est pas caspase dépendante et La voie Fas/Fas‐L ne semble pas entrer non plus en jeu. Nous avons par ailleurs pu déterminer que l'atteinte apoptotique des précurseurs passait par une déstabilisation mitochondriale, ceci grâce à un marquage DIOC6. L'ensemble des résultats regroupés dans de ce travail permet d'approfondir les connaissances des mécanismes d'interférence du VIH avec l'hématopoïèse et plus précisément des actions de Nef sur l'hématopoïèse humaine.

RmI est une molécule hybride contenant 1,03 copie du génome du virus du polyome liée à une insertion cellulaire d'ADN de souris par des répétitions virales directes de 182 pb. Dans ce travail, nous avons examiné la recombinaison intramoléculaire de RmI en utilisant différents recombinants contenant cette molécule. Après transfection dans diverses lignées cellulaires, la recombinaison a été mise en évidence par la production de plages de lyse, ou directement par la méthode de Southern. Nous avons montré que des molécules de taille génomique étaient produites à une fréquence élevée dans des cellules de souris et qu'il s'agissait là d'un événement de recombinaison réciproque. Il semble que la présence de la protéine virale grand T soit nécessaire à cet événement de recombinaison.

Le lymphocyte T est une cellule clé de l'immunité spécifique. Dans le but de créer un outil de compréhension et de prédiction de certains mécanismes immunitaires, une modélisation de la réponse immunitaire du lymphocyte T est proposée. L'activation du lymphocyte par la reconnaissance d'un peptide apprêté par une cellule présentatrice d'antigène est une étape essentielle de cette réponse immunitaire. Cette activation a été modélisée par un système d'équations différentielles ordinaires, de type cinétique chimique, représentant l'évolution temporelle des concentrations de différentes protéines lymphocytaires (TCR/CD3, CD28, CD69, CD25, IL-2). Afin de considérer une quantité d'antigène variable dans l'organisme, un modèle de prolifération virale a aussi été écrit, basé sur des exemples de modèles proies/prédateurs, obtenant ainsi un système d'équations différentielles ordinaires mettant en jeu un virus donné, les cellules cibles du virus, saines ou infectées, et l'action des lymphocytes T cytotoxiques. Un couplage de ces deux modèles (activation lymphocytaire T et prolifération virale) permet une approche de simulation de la réponse lymphocytaire T spécifique à une infection virale.

Les traitements intensifs qui précèdent l'injection de cellules souches hématopoïétiques allogéniques et T¬' déplétées ont pour conséquence la disparition des Lymphocytes T (LT) périphériques, La privation des réponses mémoires T expose les patients à des risques viraux tels que le Cytomégalovirus (CMV), le virus d'Epstein-Barr (EBV) ainsi que les Adénovirus responsables de défaillances d'organes sévères et de mortalité. Je me suis intéressée aux moyens de reconstituer chez le receveur un répertoire T permettant de limiter les épisodes infectieux après greffe. J'ai choisi de développer un protocole de thérapie cellulaire sous forme d'injection de LT spécifiques à visées préventive et curative des risques viraux post-greffe. Des cellules dendritiques ont été transduites par deux adénovirus recombinants (pour une protéine du CMV ou de PEBV) puis cultivées en présence de LT autologues. Les LT cytotoxiques (CUL) générés ont un fort potentiel cytotoxique vis-à-vis de fibroblastes autologues infectés soit par le CMV soit par l'Adénovirus type 5 et la lignée B autologue. Par contre ces cellules étaient dépourvues de potentiel alloréactif. Pour vérifier l'absence d'altération du répertoire T au cours des stimulations, j'ai évalué la composition clonale des LT CD8 CMV-spécifiques avant et après stimulation. Ces cellules ont été analysées par immunoscope qui a montré que la diversité TCR-Vbêta était conservée après stimulation et les CTL ainsi générés sont utilisables en immunothérapie
Intensive treatment prior to the injection of hematopoietic stem cells (HSC) have a dual effect on the immune system: one hand, they damage the majority of peripheral T cells and with them most of the immunological memory of the patient and, secondly they are capable of altering anatomical areas involved in their differentiation. For allogeneic transplantation, these effects are exacerbated by immunosuppressive therapy given for prevention of graft versus host disease (GVHD), as well as by the latter if it occurs. Deprived of immunological memory, private as part of this capacity to rapidly regenerate a new T tell repertoire during the shorter or longer period of recovery, the patient will be exposed to risks of infection. Several ways of research are currently being developed to try to prevent and treat post-transplantation complications. We considered the opportunities for immune-intervention by adoptive transfer of T cells after transplantation, i. E. The means to accelerate the constitution in the recipient of a T tell repertoire to limit the infections episodes. These tell therapies can be considered as injections of either total T lymphocytes of the donor either T cells selected for their specificities. The first solution exhibiting at high risk of GVHD, we are mainly interested in the second, i. E. The immediate contribution of T cells with selected specificities for virures following the hematopoietic stem cells transplantation partially matched T depleted. We studied the role of specific T cells in the fight against infectious complications after transplantation

L'hépatite chronique virale C est associée à une défaillance du système immunitaire. Nous nous sommes intéressés aux cellules NK et aux lymphocytes Treg, partenaires de la réponse immunitaire innée. Le nombre des NK, particulièrement les CD56dim, est significativement diminué chez les patients infectés, dans le foie plus que dans le sang, et s'accentue avec la fibrogenèse. Le nombre de CD3-CD56+brightNKG2A+ circulantes est corrélé à la sévérité de l'inflammation et de la fibrose et celui des CD3-CD56+dimNKG2A+ inversement corrélé à la charge virale. Les NK sont fonctionnelles, en capacité de produire de l'IFN-γ et d'engager un processus de cytolyse. L'expression de CD158 est significativement diminuée à la surface des NK hépatiques mais conservée dans les NK circulantes. L'expression de NKG2A,C,D dans les NK circulantes et hépatiques est identique à celles de patients non infectés. Les Treg intrahépatiques FoxP3+ sont quasi-exclusivement de phénotype CD4+. En analyse multivariée, le nombre de FoxP3+ est indépendamment associé à celui de CD8+, surtout dans les lésions nécrotico-inflammatoires et une corrélation forte est observée entre les transcrits CD8, FoxP3, IL-10 et TGF-β, suggérant que les Treg bloquent l'expansion et la cytotoxicité des TCD8 par contact cellulaire ou par le biais de cytokines immunosuppressives. L'équilibre entre FoxP3 et CD8 est rompu dans les grades et stades Métavir A>2 et F>3, avec un effondrement du rapport FoxP3/CD8. L'inflammation hépatique chronique s'accompagne de fibrose, aboutissant à la cirrhose, principale cause de CHC. Dans les cirrhoses virales C avec ou sans CHC, les lymphocytes CD3+, CD4+, CD8+, CD20+, CD56+, TCRγδ +, FoxP3+ sont plus nombreux dans la fibrose que dans le parenchyme. Le nombre de CD20+, CD3+, CD4+, CD8+ et l'expression d'IFN-γ et RANTES sont plus élevés dans les cirrhoses qui développent un CHC. En analyse multivariée, CD8 est le seul facteur indépendament associé à la récidive tumorale et à une diminution de la survie sans récidive à 5 ans. Les CD20+, CD3+, CD4+, CD8+, CD56+, TCRγδ+, FoxP3+ sont significativement moins nombreux dans le CHC que dans la cirrhose. Mais les FoxP3+ sont significativement plus nombreux et les CD56+ moins nombreux dans le CHC que dans le nodule parenchymateux, sans modification des LT, conduisant à une augmentation du rapport FoxP3/CD8 dans la tumeur. Les CD56+ diminuent de la cirrhose au CHC. Aucune corrélation n'est observée entre la densité intra-tumorale des lymphocytes étudiés et la récidive carcinomateuse. Conclusion. Un infiltrat inflammatoire dense au sein de la cirrhose C, particulièrement riche en CD8, favorise le développement et/ou la récidive du CHC.

Le répertoire T CD8 préimmun correspond aux lymphocytes T spécifiques d'antigène circulant en périphérie, et n'ayant pas encore été activés. Ces cellules sont très rares, et de ce fait, n'ont jusqu'ici pas pu être étudiées de façon approfondie. Nous avons dans un premier temps développé un protocole d'enrichissement basé sur la technologie des tétramères. Nous avons pu détecter et énumérer des lymphocytes T CD8 naïfs spécifiques d'antigènes dans le sang de sujets sains. Nous avons ensuite utilisé cet outil pour évaluer le répertoire T préimmun de patients chroniquement infectés par le virus de l'hépatite C (cHCV). Nous avons démontré que celui-ci est significativement perturbé, avec des cellules hypersensibles à l'activation TCR et une proportion importante de lymphocytes T de phénotype mémoire alors qu'ils n'ont pourtant pas rencontré leur antigène cible. Ces anomalies disparaissent après résolution de l'infection, soulignant l'intérêt d'instaurer précocément un traitement antiviral chez ces patients. Enfin, nous avons observé dans un modèle de souris transgéniques (OTI) une proportion importante de T inexpérimentés de phénotype mémoire chez les animaux non-immunisés déficients en cxcr3. Nos travaux démontrent que les lymphocytes T inexpérimentés peuvent perdre leur naïveté dans différentes situations pathologiques. Ces résultats devraient être pris en considération pour l'optimisation de futures stratégies d'immunothérapie, notamment lorsque des patients dits "inflammatoires" sont la cible de vaccinations. Enfin, nos résultats soulignent la difficulté d'interpréter les données d'immunophénotypage en l'absence d'information sur la spécificité antigénique
The CD8 preimmune repertoire is defined as the set of circulating antigen-specific T CD8 lymphocytes that have not been activated yet by their cognate antigen. Because those cells are very rare, they have not been evaluated in humans. We developed a tetramer-based enrichment protocol that allowed for the first time direct detection and enumeration of those rare naive antigen-specific CD8 T cells in healthys. We then used this tool to characterize the CD8 preimmune repertoire in patients with chronic hepatitis C viral infection. We found that their naive CD8 T cells are dysregulated, being hypersensitive to TCR signals, and with increased proportions of memory-phenotype (MP) cells in inexperienced populations. These perturbations are reversible after viral clearance, highlighting the added benefit of early antiviral treatment. Finally, using a transgenic model (OTI), we observed high proportions of MP inexperienced T cells in the blood of cxcr3-deficient unimmunized mice. This suggests that CXCR3-dependent lymphocyte trafficking could account for some preimmune repertoire alterations. Altogether, our work demonstrates that inexperienced T cells can lose their naiveté in several pathological situations. The impact of these findings will need to be considered when designing future immunotherapeutic strategies - especially when « inflammatory » patients are being targeted. Additionally, we highlight the challenge of interpreting T-cell immunophenotyping studies without getting knowledge into antigen-specific populations

Le but de ce travail était d'évaluer le rôle des LIH au cours de l'HCC. Méthodes: Les LIH étaient évalués par cytométrie de flux, immunohistochimie et par RT-PCR en temps réel. La diversité des récepteurs à l'antigène (TCR) était étudiée par analyse moléculaire de la région CDR3 (technique "immunoscope"). Résultats: La distribution des LIH est modifiée au cours de l'HCC (augmentation des lymphocytes T conventionels, diminution des lymphocytes T[gamma][delta], NK et TNK). Une corrélation était observée entre le nombre de lymphocytes T CD8 exprimant des marqueurs de cytoxicité et la sévérité de la maladie. L'analyse moléculaire de leur TCR retrouvait un répertoire divers, typique d'une population polyclonale. Conclusion: Nos résultats montrent que les lymphocytes T CD8 sont les principaux effecteurs des lésions hépatiques au cours de l'HCC. Leur caractère polyclonal et leur absence d'efficacité antivirale suggère qu'il s'agit en majorité de lymphocytes non spécifiques recrutés dans le foie.

Notre étude porte sur l'évaluation des lymphocytes T intra hépatiques (UH), spécifique ou non du virus de l'hépatite C (YHC), obtenus à partir des biopsies hépatiques des patients atteints d'hépatite C chronique (HCC). Yu le nombre des UH extraits d'une biopsie insuffisante pour permettre une analyse fonctionnelle, nous avons mis en place un protocole expérimental qui n'implique aucune stimulation antigénique. La diversité de récepteurs à l'antigène (TCR) est étudiée par analyse moléculaire de la région COR3 avec la technique d'analyse par RT-PCR et par immunotluorescence pour les récepteurs des V[ Bêta] β. Il n'existe pas une expansion préférentielle d'une population V[ Bêta] β parmi les 24 familles V[ Bêta] β étudiées. L'étude montre que la réponse intra hépatique au cours de l'infection est poly clonaI. L'utilisation de la technique des tétramères CMH classe 1 tluorescents chargés avec des peptides YHC (core 35, NS3, NS5), nous a permis d'évaluer en cytométrie la fréquence d'une population de L T C08 spécifiques. La stimulation chronique peut induire l'expression sur les cellules L T C08+ des récepteurs inhibiteurs NKRs (naturel killer) susceptible d'avoir une fonction soit effectrice ou inhibitrice. L'expression de KIRs est absente sur les cellules vierges, mais est exprimée sur les cellules mémoire régulant négativement les fonctions effectrices, tandis que l'hétero dimer inhibiteur C094/NKG2A est exprimé sur les cellules effectrices/mémoire et dépend du TCR. Nous avons observé une corrélation positive entre la fréquence intra hépatiques des cellules L T CD8+ exprimant NKG2A et le degré de sévérité ces lésions hépatiques
Our study was the evaluation of the lymphocytes T will intra hepatic (UH) specific or no of the virus ofhepatitis C (YHC) obtained starting from the hepatic biopsies of the patients infected bychronic hepatitis C (HCC). Considering the number of the UH extracted from an insufficient biopsyto allow a functional analysis, we set up an experimental protocol which does not imply any specific antigenic stimulation. The diversity ofT cell receptor(TCR) was studied by molecular analysis of area COR3 with the technique of analysis by RT-PCR and immunotluorescence for the receptor Y beta. Ooes not exist a preferential expansion of a population Yb respect with un' other among the 24 families Yb studitrl. The study shows that the answer will intra hepatic during the infection is poly clonally. The use of the technique of the tetramers classifies 1 tluorescent CMH class 1 charged with peptides YHC (core 35, NS3, NS5), us made it possible to evaluate in cytometry of tlow the frequency of a population of specific L T COS Chronic stimulation can coat the expression on cells L T C08+ of the inhibiting receivers NKRs (natural killer) likely is functions effector that inhibiting the expression of KIRs misses on the virgin cells, but is expressed on the cells memory controlling theeffectors functions negatively, while the hétero dimer inhibiting C094/NKG2A is expressedon the cells effector/memory and depends on the TCR distribution L T C08 expressing NKG2A (receptor ofmolecules HLA-E) and molecules of the group KIR (CD I58a and b) which bind molecules HLA-C. We observed a positive correlation between the frequency intra- hepatic of cells TC08+ expressing NKG2A and the degree of severity of the lesions

L'hepatite virale c (hvc) represente un reel probleme de sante publique compte tenu de sa prevalence et du risque important d'evolution vers la cirrhose et le carcinome hepato-cellulaire. Ma these a pour objet de caracteriser la diversite, le phenotype et la fonction des populations lymphocytaires t intra-hepatiques et peripheriques au cours de l'hepatite chronique virale c. Nous avons evalue la diversite des lymphocytes t + intra-hepatiques et peripheriques, par analyse moleculaire de l'heterogeneite des regions hypervariables cdr3 des transcrits codant pour la chaine du recepteur a l'antigene des lymphocytes t(tcr). Cette etude montre que les lymphocytes t intra-hepatiques expriment une grande diversite de tcr. La reponse immune intra-hepatique developpee par l'hote au cours de la pathologie est de type polyclonale et multi-specifique. Nous avons ensuite etudie par cytometrie de flux et rt-pcr quantitative les caracteristiques phenotypiques et fonctionnelles des populations lymphocytaires t intra-hepatiques et peripheriques et ce en relation avec les parametres virologiques, histologiques et biochimiques des patients infectes par le virus de l'hepatite c. L'analyse par cytometrie montre une correlation etroite et significative entre la frequence de lymphocytes conventionnels cd3 +cd56 - intra hepatiques et les marqueurs de la severite de la maladie (scores histologiques de knodell et de metavir, et le taux de transaminases). Une correlation significative a egalement ete retrouvee entre le lymphocytes t cd3 +cd56 - peripheriques et les marqueurs de la severite de la maladie. L'analyse par rt-pcr quantitative des transcrits specifiques des populations lymphocytaires t montre que les quantites de transcrits cd3, tcr, cd8, cd69, perforine et plus particulierement celle des transcrits cd8 sont significativement correlees au taux de transaminases, au score de knodell et a l'index d'activite metavir. Ces resultats renforcent ceux obtenus par cytomertrie et suggerent une fois de plus un role deletere des lymphocytes t conventionnels cd3 +tcr +cd8 + intra-hepatiques au cours de la phase chronique de la pathologie.

Cybr (Cytohesin binder and regulator) is an adaptor protein involved in the assembly and recruitment of protein complexes associated with intracellular trafficking and signaling. Cybr has attracted attention as a potential key contributor to molecular mechanisms governing cells of the immune system due to its exclusive expression in cells of hematopoietic origin. Cybr interacts with members of the ADP ribosylation factor (ARF)-activating cytohesin family, mainly cytohesin-1, and it is involved in the cytohesin-1-mediated adhesion of LFA-1 to ICAM-1. Cybr expression is highly and rapidly responsive to, and regulated by, many cytokines and other soluble effectors of the immune system suggesting a potential functional role in the vesicle formation, endocytic trafficking, regulation of TCR signalling and regulation of dendritic cell (DC)/T cell interaction during the antigen presentation. To characterize the in vivo physiological role of this molecule, a Cybr-deficient mouse strain was created. Cybr deletion does not profoundly affect the development of the immune system, but Cybr-KO mice display a reduced or delayed capacity to respond to different stimuli and in stress conditions. This project aimed at investigating the biological function of Cybr in cell-mediated immune response to tumors induced by the retroviral complex constituted by the Moloney murine sarcoma virus/Moloney murine leukemia virus (M-MSV/MuLV, hereafter indicated as M-MSV). Intramuscular injection of M-MSV in immunocompetent C57BL/6 (B6) mice causes sarcomas that spontaneously regress because of a strong immune reaction primarily mediated by cytotoxic T lymphocytes (CTL) specific for viral antigens. Conversely, Cybr-deficient mice injected with M-MSV developed larger tumors than B6 mice, which additionally regressed with a slower kinetics. To disclose the biological bases of this behavior, M-MSV-injected Cybr-deficient and wild type mice were characterized for the lymphocyte phenotype and function in tumors, lymph nodes and spleens at the peak of tumor growth (day 11 to 15). We found a reduced number of CD4+ and CD8+ T cells, as well as of antigen-specific CTL, in the tumor infiltrating cells (TIL) of Cybr-deficient mice. However, this defect was recovered after a short temporal shift. Similarly, a three-day delay was also reported in the onset of lytic activity in Cybr-deficient respect to wild type CTLs. On the contrary, wild type or Cybr-deficient memory T cells from tumor regressor mice did not show any difference in terms of lytic activity. Overall, these data indicate that Cybr deficiency has a significant impact on the activation of naive T cells and expansion of primed T cells, but do not clarify whether Cybr mostly influence priming and/or cell adhesion or trafficking and migration of immune system cells. To address this issue, we transferred naive Cybr-KO or wild type GFP T cells in tumor-bearing RAG2-/- γc-/- mice, that lack T, B and NK cells and do not spontaneously regress M-MSV-induced tumors. Despite T cell transfer, tumors continued to growth indicating that transferred naive T cells were not able to mount a fully effective immune response in this setting. This was probably due to a suboptimal recruitment and priming phase in lymph nodes, that were found to be hypoplastic. To provide a mechanistic insight, reconstitution of nu/nu athymic B6 mice with T cell-depleted bone marrow from either wild type or Cybr-KO mice, followed by adoptive transfer of naive or memory T cells from Cybr-KO/GFP or B6/GFP animals, will provide the appropriate experimental set up to assess the role of Cybr in the APC or T cell compartments. Taken together, outlined results indicate that Cybr deficiency has a significant impact on antigen-specific immune response, but further studies have to be performed to fully dissect the role played by this molecule in the priming phase and in the delayed onset of lytic activity
Cybr (cytohesin binder and regulator) è una proteina adattatrice coinvolta nell’assemblaggio e nel reclutamento di complessi proteici associati con il trafficking intracellulare e la trasduzione del segnale. Grazie alla sua esclusiva espressione in cellule di origine ematopoietica, Cybr ha attirato l’attenzione come potenziale proteina chiave nei meccanismi molecolari che controllano le cellule del sistema immunitario. Cybr interagisce con i membri della famiglia delle citoesine attivanti gli ADP ribosylation factors (ARF), specialmente con citoesina-1, e regola l’adesione citoesina-1 mediata di LFA 1 a ICAM-1. La sua espressione è rapidamente regolata da molte citochine e da altri effettori solubili del sistema immunitario. Alcuni ruoli funzionali proposti per questa molecola sono la partecipazione nella formazione delle vescicole, nel trafficking endocitico, nella regolazione del signaling del TCR e nell’interazione tra cellule dendritiche e cellule T durante la presentazione dell’antigene. Al fine di caratterizzare il ruolo fisiologico di questa molecola in vivo, è stato creato un ceppo di topi deficienti per Cybr. Questi topi, nonostante un normale sviluppo del sistema immunitario, mostrano una ridotta o ritardata capacità di rispondere a diversi stimoli e in condizioni di stress. Questo progetto di ricerca si è prefisso di investigare la funzione biologica di Cybr nella risposta immunitaria cellulo-mediata nei confronti di tumori indotti dal complesso retrovirale costituito dai virus sarcomatogeno e leucemogeno murini di Moloney (M-MSV/MuLV, in seguito indicato come M-MSV). L’inoculo intramuscolare di M-MSV in topi C57BL/6 (B6) immunocompetenti causa lo sviluppo di sarcomi che regrediscono spontaneamente grazie ad una forte risposta immunitaria mediata principalmente da linfociti T citotossici (CTL) specifici per gli antigeni virali. Al contrario, topi Cybr-deficienti inoculati con M-MSV sviluppano tumori di dimensioni maggiori e che regrediscono più lentamente rispetto ai controlli. Per comprendere i motivi di questo diverso andamento, dopo l’inoculo del complesso retrovirale in topi Cybr-deficienti e wild type, sono stati caratterizzati a livello fenotipico e funzionale i linfociti presenti nei tumori, nei linfonodi drenanti e nelle milze al momento della massima crescita tumorale (giorni 11-15). Abbiamo riscontrato un ridotto numero di linfociti T CD4+ e CD8+ e di CTL antigene specifici nella popolazione infiltrante il tumore nei topi Cybr-deficienti. Tuttavia questa differenza si è ridotta alla fine del periodo analizzato. Inoltre, un ritardo simile è stato riportato nello sviluppo dell’attività litica nei CTL provenienti da topi Cybr-KO rispetto a topi wild type. Al contrario, linfociti T memoria wild type e Cybr-KO non hanno mostrato nessuna differenza in termini di attività litica. Complessivamente, questi dati indicano che la deficienza di Cybr ha un significativo impatto nell’attivazione delle cellule T naive e nella loro espansione dopo il priming, ma non definiscono se questa proteina influenzi maggiormente la fase di priming e/o adesione cellulare o il trafficking e la migrazione delle cellule del sistema immunitario. Per chiarire questi aspetti, sono stati trasferiti linfociti T naive provenienti da topi Cybr-KO/GFP o B6/GFP in topi RAG2-/-γc-/- inoculati con il complesso retrovirale. Questi topi mancano di cellule T, B e NK e non regrediscono spontaneamente i tumori M-MSV indotti. Nonostante l’infusione di cellule T, i tumori hanno continuato a crescere, indicando che le cellule T naive non sono state in grado di montare una risposta immune pienamente efficace in questo modello, un aspetto probabilmente dovuto ad un reclutamento e priming sub ottimali nei linfonodi, che sono risultati ipoplastici. Al fine di rispondere a questi quesiti biologici, topi B6 nu/nu atimici ricostituiti con tessuto midollare depleto di linfociti T provenienti da topi wild type o Cybr-KO e successivamente infusi con linfociti T naive o memoria provenienti da topi Cybr-KO/GFP o B6/GFP, dovrebbero costituire un modello sperimentale ottimale per investigare il ruolo di Cybr sia nel comparto T che nel comparto APC. Nell’insieme, i risultati ottenuti indicano che la deficienza di Cybr ha un significativo impatto nella risposta immune antigene-specifica, ma studi addizionali devono essere condotti al fine di definire con maggior precisione il ruolo di Cybr nella fase di priming e nel ritardo dello sviluppo dell’attività litica

La propagation du VIH-1 dans l'organisme est un processus dépendant du bourgeonnement de particules correctement assemblées. Pour ce faire, le virus utilise une stratégie de détournement de certaines protéines cellulaires. Le VIH-1 se transmet de deux façons dans un organisme : par particules libres ou par transfert de cellule à cellule via une structure appelée synapse virologique. Ce dernier moyen de propagation est le plus efficace et prédominant in vitro. Nous avons précédemment identifié Dlgl, l'homologue humain de la protéine « Dises Large » de la Drosophile, comme un nouveau partenaire de la protéine Gag du VIH-1. Nous avons ensuite étudié le rôle de Dlgl dans les deux modes de transmission du VIH-1, dans des cellules cibles naturelles du virus : des lignées de lymphocytes T exprimant ou non Dlgl et des lymphocytes T CD4 primaires. Nous avons montré que le virus se propage plus efficacement dans les cellules n'exprimant pas Dlgl. Ce phénotype ne résulte pas d'un effet sur la production virale en l'absence de Dlgl, mais plutôt d'une infectivité significativement augmentée des particules relâchées : les particules produites en l'absence de Dlgl- sont 4 fois plus infectieuses que celles produites en sa présence. Ceci corrèle avec une augmentation du contenu en cholestérol des virions produits en l'absence de Dlgl. A l'opposé, des analyses quantitatives ont révélé que l'absence de Dlgl n'empêche pas le transfert de matériel viral par contact cellulaire, ni la transmission cellule-cellule du VIH-1 avec infection productive de la cellule cible. D'après des observations en microscopie confocale, l'absence de Dlgl n'a pas non plus d'effet sur la formation de la synapse virologique. Dlgl peut donc être considéré comme un régulateur négatif de la transmission par particules libres du VIH-1, alors que la transmission cellule-à-cellule échappe à cette régulation
The spread of HIV-1 in an infected organism largely depends on proper virus assembly and budding for the efficient formation of infectious particles. To achieve this goal, the virus hijacks numerous cellular proteins that are generally partners of the virus structural proteins. HIV-1 can disseminate both by diffusion of cell-free particles and by direct transmission in cell contacts named virological synapses (VS}. The VS has been described as the most efficient and predominant means of HIV-1 spread in vitro. We have previously identified Dlgl -human homologue of Drosophila Discs Large protein- as a new partner of HIV-1 Gag. Here we studied the role of Dlgl in the two modes of transmission in natural host cells of HIV-1: primary CD4+ T cells and Dlgl-expressing or Dlgl-depleted Jurkat T cell lines. We provide evidence that HIV-1 multiplication was increased in Dlgl-depleted T cells. This increase did not result from higher virus yield, since a major increase in particle production upon Dlgl depletion was not observed. Higher multiplication resulted mainly from improved cell-free virus transmission: a fourfold enhancement of infectivity was observed in particles produced by Dlgl-depleted T cells. Moreover, this infectivity enhancement seemed to correlate with an increase of the virions cholesterol content. Conversely, quantitative cell-to-cell transfer analyses showed that Dlgl did not affect cell-to-cell virus transmission; its depletion did not modify "passive" transfer of HIV-1 material from cell-to-cell, or HIV-' transmission leading to productive infection via cell contacts. Immmunolabelling and confocal microscopy showed that Dlgl did not impair HIV-1-induced virological synapse formation. Collectively, these results demonstrate that Dlgl negatively regulates HIV-1 cell-free virus transmission whereas cell-to-cell spread of the virus circumvents this regulation

Alors que la douleur physiologique est essentielle à la survie de l'individu, les douleurs chroniques sont purement délétères pour l'organisme et la qualité de la vie. Malheureusement, les traitements actuels se limitent à des médicaments peu efficaces ou présentant un mauvais rapport bénéfice / risque. Il est donc urgent de mieux comprendre les mécanismes d'établissement et de persistance des douleurs chroniques, comme les douleurs neuropathiques, afin de concevoir des stratégies thérapeutiques efficaces contre ces pathologies. De nombreuses études ont montré que les canaux calciques de type T sont impliqués dans les états douloureux chroniques. Par exemple, le sous-type Cav3.2, est exprimé tout au long du circuit neuronal nociceptif. Dans le système nerveux périphérique, les canaux Cav3.2 ont un rôle pronociceptif et sont désormais validées comme cibles pour la recherche de thérapies innovantes. En revanche, le rôle du canal Cav3.2 au niveau central, et en particulier dans la moelle épinière, un point névralgique de convergence, d'intégration et de transmission des informations nociceptives, reste à explorer.Grâce à un modèle murin Cav3.2GFP-Lox knock-in créé par l'équipe, nous avons pu identifier/localiser précisément les neurones Cav3.2 positifs dans tout le système nerveux et induire une délétion tissulaire spécifique de Cav3.2 par l’action de la Cre recombinase, pour ensuite en évaluer les effets sur la sensibilité à la douleur. Dans la moelle épinière, nous avons constaté que Cav3.2 est fortement exprimé dans les neurones des laminae superficielles, et sont principalement des neurones excitateurs. La suppression de Cav3.2 spinal par une approche virale a démontré comportementalement : i) l’abolition de l’allodynie au froid et mécanique, de l’hyperalgésie mécanique, ainsi que des douleurs spontanées, en condition neuropathiques chez les mâles et les femelles, ii) une altération de la perception au chaud en condition neuropathique avec un effet différentiel dépendant du sexe, et iii) une réduction de l’anxiété associée aux douleurs chroniques, iv) la suppression des effets analgésiques d’un traitement systémique d’un bloqueur pharmacologique de canaux calciques de type T. Mécanistiquement, les enregistrements extracellulaires in vivo des neurones de projection spinaux démontrent une diminution de l'intégration et de la transmission des messages nociceptifs pathologiques des fibres périphériques C et A-delta lorsque le canal Cav3.2 est délété dans les réseaux spinaux. Cette approche de délétion a été développée avant et après l'induction du modèle de douleur neuropathique pour en évaluer les effets préventifs et curatifs.Les résultats démontrent que la délétion du canal spinal Cav3.2 a des effets préventifs et curatifs sur les symptômes des douleurs neuropathiques. Dans une perspective clinique pour le développement d'analgésiques basés sur les inhibiteurs calciques de type T, nous suggérons de cibler Cav3.2 spinal en plus des canaux dans les neurones afférents primaires par des molécules pénétrant le système nerveux central
Physiological pain is essential for individual survival, but chronic pains are purely deleterious for the organism and the life quality. Unfortunately, current therapies are limited to drugs with a low efficacy or with a bad benefit/risk ratio. It is thus urgently necessary to better understand the establishment and persistence mechanisms of those chronic pains, like neuropathic pain in order to design efficient therapeutic strategies against this pathology. Many studies have shown that T-type calcium channels are involved in chronic pain states, like Cav3.2 subtypes, all along the nociceptive circuit. In the peripheral nervous system, Cav3.2 channels have pronociceptive impact and are now approved as a target for innovative therapies development. In contrast, the role of Cav3.2 channel in the central nervous system, and especially in the spinal cord, a crucial hotspot of nociceptive information convergence, integration and transmission, remains to be explored.Thanks to a Cav3.2-GFP-Lox murine model created by the team, we were able to i/ identify and precisely localize Cav3.2 positive neurons in all the nervous system and ii/ induce tissue specific deletion of Cav3.2 by the Cre recombinase action, to evaluate effects on pain sensitivity. At the spinal level, we found that Cav3.2 is prominently expressed in lamina II neurons comprising mostly excitatory neurons. Knocking-out spinal Cav3.2 by a viral approach has demonstrated behaviorally i) an abolition of cold and mechanical allodynia, mechanical hyperalgesia and spontaneous pain like behaviors under neuropathic conditions in males and females, ii) an alteration of the hot perception, under pathological pain conditions, with a differential effect in a sex dependent manner, and iii) a modification of anxiety associated to chronic pain, iv) a suppression of the analgesia induced by a systemic treatment with a brain penetrant T-type channel blocker. Mechanistically, extracellular in vivo recordings of spinal projection neurons demonstrate a decrease in integration and transmission of pathologic nociceptive messages from peripheral C- and A-delta fibers by Cav3.2 ablation in spinal networks. This approach has been developed before and after induction of the pain model to evaluate the preventive and curative effect of the treatment.Altogether, the results demonstrate that spinal Cav3.2 channel deletion has preventive and curative effects regarding neuropathic pains symptoms. In a clinical perspective for the development of analgesics based on T-type calcium channel blockers, we suggest the utility of targeting spinal Cav3.2 additionally to channels in primary afferent neurons, a notion already well established

L'ATL est une prolifération tumorale de cellules lymphoïdes T matures activées ; cette maladie est caractérisée par un mauvais pronostic, du fait d'une resistance importante à la chimiothérapie conventionnelle. L'oncoprotéine TAX joue un rôle primordial dans la prolifération et la transformation des lymphocytes infectées par HTLV-1. Notre équipe a montré que l'arsenic synergise avec l'interferon pour induire dans les cellules leucémiques infectées, un arrêt du cycle cellulaire, une apoptose massive ainsi qu'une dégradation proteosomique spécifique de TAX. Cette dégradation semble être à la base de l'élimination des cellules initiatrices de leucémie (CIL) et l'éradication de l'ATL. Néanmoins, les mécanismes moléculaires du ciblage de TAX par l'arsenic/IFN restaient élusifs. Mon projet de thèse a eu pour objectif d'élucider ces mécanismes. Dans mon travail de thèse, nous avons confirmé, pour la première fois, que la survie des lignées cellulaires dérivées d'ATL est dépendante de l'expression continue de TAX indiquant la contribution majeure de la dégradation de cette oncoprotéine dans la réponse thérapeutique. De plus, la dégradation de TAX sous l'effet de l'arsenic/IFN est due à sa sumoylation et à son ubiquitination séquentielle, médiées par PML et RNF4 respectivement. Ces résultats ont permis de proposer un modèle sur l'effet de l'arsenic/IFN sur les modifications post-traductionnelles de TAX et les enzymes qui y sont impliqués. Par conséquent, le renforcement des CNS suivi par la dégradation des protéines symoylées pathogènes, par un traitement ciblé, pourrait avoir un large intéret thérapeutique
The HTLV-1 TAX Transactivator initiates transformation in adult T-cell leukemia/Lymphoma (ATL), a highly aggressive chemotherapy-resistant malignancy. The arsenic/Interferon combination, which triggers degradation of the tax oncoprotein, selectively precipates apoptosis of ATL cell lines and cures TAX-driven murine ATL. Yet, the role of tax loss in ATL response is disputed and the molecular mechanisms driving degradation remain elusive. Here we demonstrate that ATL-derived cells are addicted to continuous tax expression, implying that tax degradation underlies clinical responses to the arsenic/interferon combination in mice and patients. The latter enforces PML nuclear body (NB) formation and partner protein recruitment. In arsenic/interferon-treated ATL cells, TAX is recruited onto NBS, undergoes PML-dependent hyper-sumoylation by SUMO2/3,but not SUMO1, ubiquitination by RNF4 and proteasome-dependent degradation. Thus arsenic/Interferon is a targeted therapy of ATL, enforcing NB formation by arsenic/Interferon therapy could have broad therapeutic value to destroy pathogenic sumoylated proteins

L’allogreffe de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est un traitement standard pour hémopathies bénigne ou malignes et immunodéficience primaire. Cependant, sauf le GvHD et la rechute de la maladie, l’infection microbiologique notamment l’infection virale est la complication fréquente des allogreffes qui est souvent responsable de la morbidité et la mortalité. Ces infections surviennent souvent en l’absence de reconstitution immunitaire. Les traitements médicamenteux anti-viraux qui ne sont pas toujours efficace et avec une toxicité non inégligeable. Donc le traitement prometteux est l’immunothérapie cellulaire notamment celui-ci avec l’injection de lymphocytes T spécifiques anti-viraux (VSTs). A UTCT, la production de VSTs-ADV a été mis au point depuis 2010 et une protocole clinique avec VSTs-ADV est en cours. Donc mon travail est s’inscrit dans ce thème pour produire les VSTs-EBV afin de proposer une protocole clinique. Comme les lymphocytes T ont plusieurs sous-populations, chaque sous-population présente des caractères différentes et leur efficacité en immunothérapie est limité par leur caractère. Notamment avec la découverte de Lymphocytes T mémoire à cellules souches (TSCM) qui joue un rôle très important en immunothérapie anti-cancéreux ou anti-viraux, nous nous intéréssons à étudier la compostion de sous-populations de VSTs. A la fin, c’est toujours avantageux de produire le VSTs contre deux ou plusieurs virus simutanément avec une économie financielle et personnelle. Nous voulons produire le VSTs bispécifique. Dans ce travail, premièrement, nous montrons le résulat de la mise au point de la production de VSTs-EBV de grade clinique qui est confromé à la réglémentation européenne. 6 productions ont été réalisées avec un antigène synthétique préablement défini qui est compatible avec utilisation clinique. In vitro, ces VSTs-EBV montre une spécificité, efficacité et non toxicité. Deuxième, nous illustrons nos résulats sur l’étude déscriptive de sous-populations de VSTs-ADV et CMV. D’abord nous montrons la distribution de sous-populations de VSTs chez les donneurs saints (avant la séléction), puis nous analysons la distribution après séléction immunomagnétique et aussi après expansion in vitro avec cytokine IL-2. A la fin, nous montrons nos résultats préliminaires sur les 3 productions de VSTs bispécifique anti-ADV et anti-EBV. Et nous les comprarer avec les VSTs monospécifique au niveau de qualité de production et spécificité, efficacité et toxicité in vitro
Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is the standard treatment for malignant or non-malignant hematological disorders or primary immunodeficiencies. However, microbiological infections especially viral infections are the major cause for morbidity and mortality for the patients after HSCT except the GvHD and disease relapse. It comes often in the period of absence of cellular immunity when the antiviral treatment is not always efficiency with an important toxicity. So the alternative treatment is adoptive cellular immunotherapy by infusion of virus specific T cells (VSTs) which has been shown efficacy in virus infections control after HSCT. In UTCT, they have produced the VSTs-ADV with a good procedure conforming to the European laws for clinical use and a clinic trial is in processing. So my work was to produce the VSTs-EBV with the same model aiming to promote a clinic trial in future. Furthermore, there are several subsets of T lymphocytes. Each subset has their own unique feature which decides their efficacy in viral infection control. Especially the discovery of stem cell like memory T cells (TSCM) with an important self-renewed ability which is critical in successful immunotherapy in viral infection or tumor control inspire us to study the distribution of subsets for VSTs. Finally, it’s advantageous to produce the VSTs targeted two or more virus in the same time with one production which is more economical. So we are interested in producing the VSTs bi-specific to ADV and EBV. Here, we present firstly our results of six production of VSTs-EBV with a synthesized antigen which is compatible with clinic use and is defined in advance. Also the specificity, efficiency in eliminating the virus and the non toxicity with a weak alloreactivity are confirmed in vitro after a short-term cell culture with IL-2. Then we showed the results obtained with the T cell subset study in producing the VSTs-ADV for clinical trial and VSTs-CMV for validation of clinical grade medium TEXMACS for cell culture in producing the VSTs. We describe the distribution of T cell subsets in healthy donors (Before selection), also after selection and after expansion in vitro with IL-2. Finally, we present the preliminary results of producing the VSTs bi-specific with three donors, in total 3 VSTs-ADV, 3 VSTs-EBV and 3VSTs-ADV/EBV are generated. The comparison between the bi-specific VSTs and mono-specific VSTs in aspect of specificity, efficiency to eliminate the viral infection and toxicity of presenting the alloreactivity in vitro showed advantage to produce the bi-specific VSTs with one selection in keeping the same specific, efficiency and weak toxicity as mono-specific VSTs

Le VHB est un problème majeur puisque les 350 millions de porteurs chroniques existant ont un risque accru de développer une cirrhose ou un carcinome hépatocellulaire. Compte tenu du manque de système d'étude du VHB in vitro qui soit facile d'accès et pleinement satisfaisant, l'objectif était d'améliorer l'un de ceux qui utilisent des baculovirus VHB recombinants pour délivrer le génome VHB dans des cellules hépatocytaires. La pertinence de ce système pour réaliser des tests phénotypiques et étudier le « fitness » des mutants résistants aux antiviraux a ensuite été démontrée. Enfin, l'utilisation de ces baculovirus VHB recombinants dans des cellules HepaRG a permis de mettre en évidence une réponse IFN efficace de l'hépatocyte suite à la synthèse des protéines du VHB. Ceci constitue une donnée nouvelle dans l'étude des interactions virus/cellules puisque le VHB était considéré jusqu'à présent comme un virus silencieux vis-à-vis de la réponse innée cellulaire. L'ensemble de ces résultats a des implications importantes dans la compréhension des mécanismes de persistance du VHB et le développement de nouveaux modèles cellulaires d'infection.

Le virus humain lymphotrope de type-1 (HTLV-I) est lié à plusieurs pathologies humaines comme la Leucémie T de l'adulte et la paraparésie spastique tropicale ou myélopathie associée à HTLV-1 (TSP/HAM). L'activation de la voie NF-KB par l'oncoprotéine virale Tax joue un rôle clé dans l'induction et le maintien de la prolifération cellulaire ainsi que l'inhibition de l'apoptose. Les modifications post-traductionnelles de Tax par Pubiquitylation et la SUMOylation sont impliquées dans l'activation de la voie NF-KB, mais les mécanismes moléculaires qui gouvernent cette activation restent assez mal compris. Nous avons montré que Tax ubiquitylée n'est pas associée avec l'IKK active dans le cytoplasme mais qu'elle se lie avec les trois sous-unités d'IKK et les cible dans le centrosome. En fait Tax est différentiellement ubiquitylée : Tax ubiquitylée avec des chaînes K-48 est destinée à la dégradation par le protéasome et est ainsi stabilisée en présence de l'inhibiteur du protéasome PS-341, alors que Tax ubiquitylée avec des chaînes K-63 se localise dans le centrosome avec IKK-y, puis recrute IKK-α et IKK-β. Le centrosome constitue ainsi la plateforme d'interaction entre Tax et IKK. Nous avons également montré que la même molécule de Tax fait le trafic entre des corps nucléaires Ubc9 et le centrosome. En fait, Pubiquitylation de Tax cible Tax et NEMO dans des corps Ubc9 riches en SUMO. Par ailleurs, Tax induit la SUMOylation et le ciblage nucléaire de NEMO. En somme, nous avons montré que Pubiquitylation et la SUMOylation de Tax contrôlent le trafic bidirectionnel et dynamique de Tax et NEMO entre les corps nucléaires Ubc9 et le centrosome
The human T-lymphotropic virus type-1 (HTLV-I) is associated with several human pathologies such as adult T-cell leukemia/lymphoma and tropical spastic paraparesis/HTLV-I associated myelopathy. NF-Kβ activation by the viral oncoprotein Tax plays a crucial role in the induction and maintenance of cellular proliferation and inhibition of apoptosis. Tax post-translational modification by ubiquitylation and SUMOylation is involved in NF-KB activation but the molecular mechanisms underlying this activation remain unclear. We showed that ubiquitylated Tax does not interact with active IKK in the cytoplasm but binds the three IKK subunits and targets them to the centrosome. Actually, Tax is differentially ubiquitylated: K-48 ubiquitylated Tax is destined for proteasomal degradation and is stabilized upon treatment with the proteasome inhibitor PS-341. On the other hand, K-63 ubiquitylated Tax colocalizes with IKK-y in the centrosome where IKK-α and IKK-β are also recruited. Hence, the centrosome represents the platform for Tax/IKK interaction. We also showed that the same Tax molecules shuttle between Ubc9 nuclear bodies and the centrosome. Indeed, Tax ubiquitylation targets Tax and NEMO into Ubc9- and SUMO- rich nuclear bodies. Moreover, Tax induces NEMO SUMOylation and accumulation in the nuclear fraction. In conclusion, Tax ubiquitylation and SUMOylation control the bidirectional and dynamic trafficking of Tax and NEMO between the Ubc9 nuclear bodies and the centrosome

Le développement d'un traitement curatif du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) est devenu le défi majeur pour le futur mais les réservoirs et une réponse immunitaire insuffisamment efficace constituent des barrières pour l’élimination du virus. La réponse immune contre l’infection VIH dépend en partie de la capacité des cellules hôtes à présenter correctement les épitopes viraux pour induire une réponse spécifique des lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (CTL). Cette présentation des épitopes viraux qui pourrait être optimisée par vaccination, dépend du système HLA (Human Leukocyte Antigen) du patient présentant un déterminisme génétique individuel. Correctement pré-stimulés, les CD8 cibleraient et détruiraient efficacement les cellules productrices du virus. Les précédents essais vaccinaux stimulant la réponse CTL n’ont pas montré d’efficacité dans la réponse virologique, probablement parce qu’ils sont composés d’épitopes "génériques" et qu’ils ne prennent pas en compte la variabilité du VIH ni l’immunogénétique des patients.L’objectif de ce travail est d’identifier des épitopes archivés dans l’ADN proviral, susceptibles d’induire une réponse CTL en considérant la variabilité du VIH-1 et la variabilité immunogénétique des patients infectés par le VIH-1 en succès thérapeutique. L’idée, à terme, est d’utiliser les peptides correspondants comme base de vaccin thérapeutique et de permettre au système immunitaire de prendre le relai du traitement antirétroviral pour contrôler l’infection virale.Cent quarante patients infectés par le VIH-1, suivis au CHU de Bordeaux en succès thérapeutique depuis plus de 6 mois ont été inclus dans le projet Provir/Latitude 45 entre 2012 et 2017. Une cartographie de la répartition des sous-types viraux du VIH-1 en Aquitaine a d’abord été réalisée. L’analyse de plus de 3200 génotypes de résistance VIH-1 effectués entre 2012 et 2016 a permis de déterminer que le sous-type viral majoritaire infectant les patients vivants avec le VIH dans la région est le sous-type B, suivi du CRF02_AG qui est majoritaire parmi les sous-types viraux non B. Si l’on se focalise sur les patients inclus dans ce projet on retrouve des répartitions similaires. Suite à cette première analyse, un nouveau virus recombinant composé de CRF06_cpx et de sous-type B a pu être identifié. Il est référencé en tant que CRF98_cpx. Un des patients inclus au sein du projet est d’ailleurs infecté par ce virus. Afin d’identifier des épitopes candidats pouvant servir de base à un vaccin thérapeutique pour l’ensemble de la population ou pour un groupe de la population en fonction de leurs caractéristiques immunogénétiques, nous avons combiné les données des séquences virales avec le typage HLA des patients afin de prédire in silico l’affinité entre un HLA et un peptide via les algorithmes d’IEDB. Pour automatiser l’analyse des données, un logiciel, TutuGenetics, a été développé. Ce logiciel instrumentalise les algorithmes d’IEDB et permet d’étudier la variabilité de la présentation des épitopes par les différents HLA du patient grâce à un score MHC IC50 déterminé pour chaque couple HLA-séquence virale. Ce logiciel a été validé en comparant l’analyse des données issues du séquençage Next Generation Sequencing avec le séquençage Sanger. Finalement, pour les 140 patients inclus dans le projet Provir, TutuGenetics a effectué un découpage des séquences virales par pas de 8 à 10 acides aminés et les valeurs MHC IC50 ont été définies pour toutes les combinaisons HLA-épitope. Une analyse plus fine nous a ensuite permis de déterminer une liste de 15 épitopes avec une forte affinité in silico pour les HLA majoritaires finalement retenue pour une cocktail vaccinal.Ces données in silico vont dans une prochaine phase être confirmées in vitro via des tests d’immunologie fonctionnelle, puis in vivo chez le macaque
HIV (Human Immunodeficiency Virus) cure is the major challenge of the future but latent reservoir and inefficient immune response do not allow virus elimination. The immune response against HIV infection depends on host cells ability to correctly present viral epitopes to induce specific cytotoxic CD8+ T lymphocytes (CTL) response. This presentation of viral epitopes which could be improved by vaccination depends on the HLA (Human Leukocyte Antigen) system of the patient which is extremely variable. Accurately pre-stimulated, CTL would target and destroy efficiently virus-producing cells. Previous vaccine trials stimulating CTL response haven’t shown efficient virological response, presumably because epitopes used are generic without taking into account HIV-1 or patient’ immunogenetic variability.The aim of this work is to identify epitopes archived in the proviral DNA, considered to induce CTL response according to the HIV-1 and immunogenetic variability of the patients at therapeutic success. The goal is to use these peptides for a therapeutic vaccine and educate the immune system to control the viral replication without any antiretroviral treatment.One hundred and forty patients infected with HIV-1, followed at the University Hospital of Bordeaux, at therapeutic success for more than 6 months have been included in the Provir/Latitude 45 project between 2012 and 2017. A mapping of the distribution of viral subtypes of HIV-1 in Aquitaine was first performed. Analysis of more than 3200 HIV-1 genotypes conducted from 2012 to 2016 determined that the major viral subtype infecting patients living with HIV in the region is subtype B, followed by CRF02_AG which is predominant among the non-B viral subtypes. Focusing on the patients included in this project led us to find similar distributions. Following this initial analysis, a new recombinant virus composed of CRF06_cpx and subtype B could be identified. It is now referenced as CRF98_cpx. One of the patients included in the project is infected with this virus. In order to identify candidate epitopes that can serve as a therapeutic vaccine for the entire population or for a population group based on their immunogenetic characteristics, we combined the viral sequence data with the HLA typing of patients to predict the affinity in silico between an HLA and a peptide via IEDB algorithms. To automate data analysis, a software package, TutuGenetics, has been developed. This software exploits IEDB algorithms and makes it possible to study the variability of the presentation of epitopes by the different HLAs of the patient thanks to an MHC IC50 score determined for each HLA-viral sequence pair. This software has been validated by comparing the analysis of data from Next Generation Sequencing (NGS) with Sanger sequencing. Finally, for 140 patients included in the Provir project, TutuGenetics sliced the viral sequences in steps of 8 to 10 amino acids and MHC IC50 values were defined for all HLA-epitope combinations. A finer analysis allowed us to determine a list of 15 epitopes with high in silico affinity for major HLAs. These epitopes were selected by applying different filters and only HLA-peptide couples with more than 10 patients sequenced per position and by HLA were kept in this "Optimal_Provir" list.These in silico data will in a next phase be confirmed in vitro via functional immunology tests, then in vivo in macaques

Le HCMV entraîne des affections graves potentiellement cécitantes chez les patients immunodéprimés. Pour établir une persistance et pour échapper au système immunitaire, le HCMV a développé plusieurs mécanismes qui interfèrent avec la voie de présentation des antigènes viraux par le CMH classe I aux lymphocytes T CD8+. Nous avons montré que des cellules épithéliales pigmentaires de rétine humaines (cellules de l'EPR) infectées par le HCMV, ne sont pas lysées in vitro par des lignées cytotoxiques T CD8+ dirigées contre la protéine pp65 du virus, et ce à un stade précoce ou tardif de l'infection. Nous avons attribué cette absence de lyse dans une période tardive de l'infection (après 48h), à des gènes viraux précédemment identifiés comme intervenant dans la rétention des complexes CMH-peptide au niveau du réticulum endoplasmique. Plus précocément, le processus d'entrée virale par endocytose entraînerait la séquestration puis la dégradation de l'antigène dans des endosomes et ainsi l'absence de processing et de présentation des peptides aux lymphocytes T. .
HCMV infection can severely affect immunodeficient people. It is also among the most harmful infection faced by patients with acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), who can suffered from HCMV infection as a direct cause of retinitis or blindness. In this study, we report that HCMV-infected RPE cells were not lysed by HLA-A2 restricted cytotoxic CD8+T cell lines directed against the incoming viral protein pp65, contrary to U373MG astrocytoma cells albeit they expressed the tegument protein. We showed that the threshold amount of incoming pp65 in RPE cells was not responsible for resistance to CTL recognition. We produce evidence that upon HCMV infection, incoming pp65 was not available for recognition by T cells. Finally,.

L’infection par le cytomégalovirus est le plus souvent asymptomatique chez les sujets immunocompétents mais entraine une morbidité et une mortalité importantes chez les patients immunocompromis et en cas d’infection congénitale.

Après l’infection primaire, le virus persiste tout au long de la vie à l’état latent mais peut se réactiver de manière intermittente. Ceci est associé à l’expansion de lymphocytes T CD4+ fortement différenciés ayant des fonctions auxiliaires et cytolytiques. L’infection primaire est, par contre, caractérisée par une réplication virale intense qui dure plusieurs mois. Il a été montré que l’exposition prolongée à des concentrations élevées d’antigènes entraine une perte progressive de fonction par les lymphocytes T appelée épuisement et caractérisée par l’expression de récepteurs inhibiteurs. L’impact de la réplication virale intense observée au cours de l’infection primaire par le CMV sur la fonction des lymphocytes T CD4+ n’est pas bien connu.

La fonctionnalité des lymphocytes T CD4+ a été explorée chez l’humain et le singe rhésus au cours de l’infection primaire et comparée à celle de sujets porteurs chroniques du virus.

Les résultats montrent que l’infection primaire par le CMV est associée à la détection de lymphocytes T CD4+ circulants ayant une faible capacité de prolifération et de production de cytokines et d’IL-2 en particulier.

L’impact de la différenciation sur la fonction des lymphocytes a été exploré en détail chez l’humain. Il a été observé qu’un degré de différenciation plus élevé des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV joue un rôle dans la production réduite d’IL-2. Toutefois, la fraction moins différenciée (exprimant la molécule CD28) présente également une sécrétion d’IL-2 moindre au cours de l’infection primaire. Ceci fait partie d’une diminution globale de la production de cytokines au cours de l’infection primaire qui affecte également la sécrétion d’IFNγ et TNFα, entraine une polyfonctionnalité réduite et est indépendante de la différenciation. L’épuisement des lymphocytes T CD4+ spécifiques du CMV contribue à leur fonctionnalité moindre comme l’indique l’expression accrue du récepteur inhibiteur PD-1 et l’augmentation des réponses prolifératives en présence d’anticorps bloquant PD-1.

Le lien entre excrétion virale et fonction lymphocytaire a été étudié chez le macaque rhésus. L’infection par le CMV est observée chez les singes juvéniles et adultes mais pas chez les nourrissons. L’excrétion urinaire et salivaire est significativement plus fréquente et intense chez les singes juvéniles par rapport aux adultes. Comme chez l’humain au cours de l’infection primaire, les lymphocytes T CD4+ spécifiques du virus sont moins

polyfonctionnels et prolifèrent moins efficacement chez les singes juvéniles par rapport aux singes adultes. Ceci est associé à l’expression accrue du récepteur inhibiteur PD-1 chez les singes juvéniles. La réponse proliférative des lymphocytes T CD4+ est accrue en présence d’anticorps bloquant PD-1 ou d’IL-2 exogène. Enfin, une association inverse entre fonction lymphocytaire et excrétion urinaire a été mise en évidence chez les macaques adultes.

Ces résultats indiquent que l’infection par le CMV présente des caractéristiques semblables chez l’humain et le singe rhésus. L’infection primaire est associée à la détection de lymphocytes T CD4+ ayant une fonctionnalité moindre qu’au cours de l’infection chronique. L’expression du récepteur inhibiteur PD-1 typique des cellules épuisées est l’un des mécanismes impliqués et pourrait être la cible de stratégies immunomodulatrices visant à améliorer les fonctions lymphocytaires et le contrôle de la réplication virale. Les résultats présentés indiquent que l’infection naturelle chez le singe rhésus constitue un modèle potentiellement utile à l’étude de la réponse immune au CMV humain et à l’évaluation de stratégies immunomodulatrices.

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Cytomegalovirus infection is mostly asymptomatic in immunocompetent hosts but leads to severe morbidity and mortality in immunocompromised subjects and foetuses.

After primary infection, CMV establishes lifelong persistence but can reactivate intermittently. This is associated with the expansion of highly differentiated CD4+ T lymphocytes exhibiting helper functions and cytolytic activity.

Primary infection is characterised by an intense viral replication lasting several months. It has been shown that prolonged exposure to elevated antigen concentrations induces a progressive loss of function by T lymphocytes called exhaustion. This state of functional impairment is associated to the expression of inhibitory receptors. The consequence of the intense viral replication seen in primary CMV infection on CD4+ T cell function is unknown.

CD4+ T cell function has been studied in human and rhesus macaque during primary CMV infection. Chronic CMV carriers have been used as controls.

The results show that primary CMV infection is associated to the detection of circulating CD4+ T lymphocytes exhibiting weak proliferative capacities and reduced cytokine production affecting IL-2 in particular.

The impact of differentiation on lymphocyte function has been explored in detail in human. An increased proportion of terminally differentiated CD4+ T cells (CD28-) is observed during primary infection. These lymphocytes are unable to secrete IL-2 in response to CMV antigens. Interestingly, CD28+ CMV-specific CD4+ T cells also exhibit reduced IL-2 production during primary infection. This is part of a global reduction of cytokine production affecting IFNγ and TNFα as well. The impaired cytokine production is associated to reduced polyfunctionality and is independent of differentiation. Exhaustion of CMV-specific CD4+ T lymphocytes contributes to the reduced functionality as shown by an increased expression of the inhibitory receptor PD-1 and improved proliferative responses in the presence of PD-1 blocking antibodies.

The relationship between viral replication and lymphocyte function has been explored in rhesus macaques. CMV infection is observed in juvenile and adult monkeys but not in newborns. Excretion in urine and saliva is significantly more frequent and intense in juvenile monkeys than adults. As in primary infection in human, CMV-specific CD4+ T lymphocytes are less polyfunctional and have lower proliferative capacities in juveniles as compared to adults. This is associated with an increased expression of PD-1 in juvenile monkeys. CD4+ T cell proliferative responses are increased when PD-1 blocking antibodies or exogenous IL-2 are added to the culture medium. Finally, an inverse association between lymphocyte function and urinary excretion has been observed in adult macaques.

These results indicate that CMV infection shares common features in human and rhesus macaque. Primary infection is associated to the detection of CD4+ T lymphocyte displaying lower functional capacities as compared to chronic infection. Exhaustion contributes to the functional impairment and the inhibitory receptor PD-1 could be targeted by immunomodulatory strategies aiming at improving lymphocyte functions and controlling viral replication. Natural CMV infection in rhesus macaque might be useful as a model to evaluate the efficacy and safety of immunomodulatory approaches.
Doctorat en Sciences médicales
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Les profondes modifications de l'homéostasie lymphocytaire T observées durant la phase aiguë d'infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) et la réponse interféron (IFN) de type I sont des éléments clés de l'évolution de la physiopathologie. Pourtant, ces phénomènes sont encore mal compris du fait de la difficulté d'étudier cette phase chez l'Homme. Ce travail de thèse contribue à mieux définir ces modifications chez le macaque rhésus chinois infecté par le virus de l'immunodéficience simienne (SIV), modèle animal d'infection pathogène similaire à l'humain. J'ai tout d'abord mis en évidence que, chez l'Homme, les émigrants thymiques récents participent de manière non négligeable au réservoir viral Dans notre modèle animal, les thymocytes sont infectés de manière précoce. Cette infection induit, dès 3 jours post-infection, une accélération importante de la thymopoïèse aboutissant à une émigration massive de nouvelles cellules vers la circulation sanguine. De plus, ce phénomène est dépendant de la diversification de la sécrétion d'IFN-ot dans le thymus. L'étude des actions antivirales et antiprolifératives des différents sous-types d'IFN-a simiens a permis de montrer que ces cytokines présentent 4 profils différents d'activités antivirales vis-à-vis du SIVmac₂₅₁. Sur les 12 sous-types d'IFN-α, 3 ont une activité antivirale importante, 3 permettent un échappement tardif de la réplication virale et les 6 autres ont une activité moindre voire nulle. J'ai ensuite montré que cette diversification de sécrétion d'IFN-a était également observée au niveau des ganglions lymphatiques et de différents segments de l'intestin dès 3 jours post-infection. Cette sécrétion d'IFN-α coïncide avec la production de chimiokines dans ces organes pouvant être à l'origine de la modification des migrations cellulaires vers ce: organes. Ainsi, on observe un recrutement des cellules naïves et mémoires centrales vers les ganglions lymphatiques et un recrutement préférentiel des cellules effectrices et mémoires effectrices vers les intestins
Major modifications of T-cell homoeostasis and type I interferon (IFN) response occurring during the acute phase of human immunodeficiency virus (HIV) infection are key elements of the evolution of physiopathology. Indeed, these phenomena are poorly understood due to the difficulty to study this phase in humans. This thesis work contributes to a better definition of these modifications in simian immunodeficiency virus (SIV) infected rhesus macaques, an animal model of infection presenting a similar physiopathology as HIV infection in humans. First, in Humans, I showed that recent thymic emigrants significantly participate to HIV reservoir. In our animal model, early infection of thymocytes is observed. This infection induces, by 3 days post-infection, an acceleration of thymopoiesis that leads to a massive cell release in blood. Furthermore, this phenomenon is dependent on diversification of local IFN-α secrétion. The study of antiviral and anti-proliferative effects of the different simian IFN-α subtypes demonstrates that these cytokines have 4 different profiles of antiviral activity against SIVmac₂₅₁. Within the 12 simian IFN-a subtypes, 3 strongly inhibit viral replication in the cultures, 7 allow late viral escape after an initial inhibition of viral replication and the last 2 show no activity. Finally, I demonstrated that the observed diversification of IFN-α subtypes secretion is also found in lymph nodes and in various parts of the intestine by day 3 post-infection. This IFN-α secretion coincides with chemokines production in these organs probably leading to a modification of cellular migration within these organs. Thus, naive and central memory T-cells are recruited into lymph nodes while effector memory and effector T-cells are preferentially recruited in the gut

Les lymphocytes t cd8 + sont des effecteurs essentiels de la reponse immunitaire antivirale. Dans le cadre de l'infection par le virus de l'immunodeficience humaine (vih), ces cellules sont capables de detruire specifiquement les cellules infectees, et de controler la replication virale dans les cellules infectees sans les detruire, par la secretion de facteur(s) soluble(s) ou caf. Des macaques rhesus ont ete immunises par injection d'un plasmide adn codant pour la pseudoparticule vide du virus de l'hepatite b (hbv) presentant a sa surface la boucle v3 du vih-1 lai. Cette vaccination a permis l'induction de reponses humorales specifiques de l'antigene de surface de l'hbv (hbsag) et de la boucle v3 du vih-1 lai. Une reponse cytotoxique specifique de l'enveloppe du vih-1 a ete induite, d'un niveau equivalent a la reponse specifique de l'enveloppe virale du vih-1 observee chez les patients infectes. L'immunisation genetique a permis l'elargissement du repertoire de specificites de reconnaissance des lymphocytes t cd8 + sanguins. Apres immunisation, les animaux ont ete inocules par voie intraveineuse avec un virus chimere (shiv) presentant l'enveloppe du vih-1 lai dans le genome du virus de l'immunodeficience simienne. La reponse immunitaire induite par la vaccination adn ne protege pas les macaques contre cette epreuve virulente, mais permet une attenuation de la phase aigue de l'infection. Dans ce modele, une activation polyclonale fonctionnelle du systeme immunitaire au cours de la primo-infection a ete suggeree. Le controle non-lytique de la replication du vih par les lymphocytes t cd8 + a ete etudie in vitro. Cette etude a montre que la secretion du caf n'est pas restreinte aux seuls effecteurs cellulaires specifiques du vih. Un clone cytotoxique, specifique du virus de l'epstein-barr est capable de produire des facteurs solubles inhibiteurs de la replication du vih apres activation via son tcr. Ce controle de la replication du vih s'effectuerait apres la retrotranscription virale. L'ensemble de ce travail souleve la question de la relation entre l'activation du systeme immunitaire par le vih et l'induction d'une reponse t cd8 + efficace dans le cadre de la primo-infection par le vih.

Le retrovirus humain t-lymphotrope de type 1 (htlv-1) est l'agent etiologique d'une maladie neurodegenerative appelee paraparesie spastique tropicale / myelopathie associee a htlv-1 (tsp/ham). La tsp/ham est associee a la presence d'infiltrats lymphocytaires dans le systeme nerveux central (snc) et de proteines seriques dans le parenchyme nerveux. Le snc est normalement isole du reste de l'organisme par la barriere hemato-encephalique (bhe). La bhe est constituee de 3 types cellulaires : les astrocytes, les pericytes et les cellules endotheliales. Ces dernieres forment un capillaire continu et sont associees entre elles par des jonctions serrees. La bhe est alteree au cours de la tsp/ham. Aucun traitement s'opposant efficacement a la progression de la tsp/ham n'existe. Recemment une etude utilisant le valproate, un inhibiteur d'histones deacetylases, a ete rapportee. Ce traitement a permis une reduction importante de la charge provirale chez les individus infectes. Cependant les premiers jours de la therapie s'accompagnent d'une augmentation transitoire de la charge provirale et d'une aggravation transitoire du statut clinique du patient. Nous avons etudie les mecanismes a l'origine de la rupture de la bhe au cours de l'infection par htlv-1 in vitro. Nous avons ainsi demontre l'importance des cytokines secretees par les lymphocytes infectes et l'impact de l'infection des cellules endotheliales par htlv-1 sur l'integrite de la bhe. Puis, dans un modele simien, nous avons defini l'effet combine du valproate et de l'azt sur la charge provirale des animaux infectes naturellement pas stlv-1, l'homologue simien de htlv-1
Ham/tsp (htlv-1 associated myelopathy / tropical spastic paraparesis) is a neurodegenerative disease associated with htlv-1 infection. During ham/tsp, massive lymphocytic infiltration in the central nervous system (cns) has been reported, accompanied by plasma protein leakage. The blood-brain barrier (bbb) restricts exchanges between the cns and the blood. The bbb is composed by three cell types : astrocytes, pericytes and endothelial cells. These latter are sealed with tight junctions and form a continuous endothelium. Bbb integrity is compromised during ham/tsp. No treatment is available to prevent the progression of the disease. A recent study performed on htlv-1 ham/tsp patients demonstrated that valproate (an inhibitor of histone deacetylases) treatment causes a remarkable reduction of the htlv-1 proviral load. However, a transient and significant increase of the proviral load, combined with adverse clinical effects, was also observed in the patients after few days of treatment. We first studied the cellular and molecular mechanisms of bbb disruption by htlv-1 in an in vitro model. We demonstrated the importance of the cytokines secreted by infected lymphocytes and the consequences of the infection of the endothelial cells on bbb integrity. We also tested, in a simian model, the combinatory effect of valproate and azt on the proviral load of stlv-1 infected animals, the simian counter part of htlv-1

Etude des determinants antigeniques de l'hemagglutinine (h), de la nucleoproteine (np) et de la proteine fusion (f) du virus de la rougeole. Le potentiel immunogene de ces differentes proteines virales a ete estime. Il apparait que les proteines h et f procurent une protection des souris contre une encephalite rougeoleuse. Toutefois l'efficacite de la protection depend du systeme d'histocompatibilite des animaux. De plus, il semble necessaire d'etudier les epitopes impliques soit dans une immunite humorale (epitope b), soit dans une immunite cellulaire (epitope t) afin de pouvoir realiser des vaccins susceptibles de procurer une immunite efficace

Pendant plus de 20 suivant la découverte du rétro virus humain HTLV-1, l'identité de son récepteur cellulaire est demeurée inconnue. Différentes molécules ont été proposées mais leur rôle en tant que récepteur d'HTLV-1 rapidement infirmé. Récemment, il a été montré que le transporteur de glucose Glutl présentait des propriétés compatibles avec celles du récepteur d'HTLV-1 et que les héparanes sulfates protéoglycanes facilitaient l'infection virale. Parce qu'elle possédait également de nombreuses caractéristiques compatibles avec celles attendues du récepteur et qu'elle permettait de mieux expliquer le tropisme d'HTLV-1 que l'ubiquitaire Glutl, nous avons étudié le rôle de la Neuropiline-1 (NP1) au cours de l'entrée du virus. Nous avons montré que NP1 était capable de lier spécifiquement la sous-unité SU de l'enveloppe virale Env. Cette interaction semble jouer un rôle important au cours de la formation de syncytia Env-dépendants et de l'infection virale proprement dite. Nous avons également étudié quels pouvaient être les rapports entre la SU, NP1 et Glutl. Les 3 molécules forment un complexe trimoléculaire et colocalisent au niveau de la zone de contact entre une cellule infectée et une cellule cible. L'ensemble de ces résultats permet de conclure que NP1 joue également un rôle important dans l'entrée du virus. Nous discuterons des rôle potentiels de NP1, Glutl et des HSPG au cours de l'entrée virale et tenterons de réconcilier l'ensemble des données afin d'établir un modèle hypothétique du récepteur d'HTLV-1
Since the isolation of HTLV-1 in 1979, the identity of its cellular receptor(s) has remained an enigma. Several candidate receptors have been proposed over the years but none ever demonstrated all the properties expected for an HTLV-1 entry molecule. Very recently, the glucose transporter Glutl was found to display characteristics compatible with those of a HTLV-1 receptor. In addition, heparan sulfate proteoglycans were shown to play an important role during HTLV-1 entry. Because it also displayed properties compatible with an HTLV receptor and explained limited viral tropism better than ubiquitous Glutl, we studied the role of Neuropilin-1 (NP1) during viral entry. We found that NP1 could specifically bind the SU subunit of the viral envelope Env. The NP1/SU interactions appear functionally relevant as they play an important role during Env-mediated cell-to-cell fusion and viral entry. In the light of recent data on Glutl, we also studied possible interactions between NP1, Glutl and Env. We found that the SU can form a trimolecular complex with Glutl and NP1 and the 3 molecules colocalise at the junction between an infected and a target cell. Collectively, these results confirm that NP1 also plays a crucial role during HTLV-1 entry. We discuss the significance of these findings and try to reconcile the available data to draw a hypothetical model of the HTLV-1 receptor

L'hépatite virale est une maladie touchant aujourd'hui aux alentours de 200 millions de personnes dans le monde. C'est la première cause mondiale de greffe hépatique puisque son issue peut être le développement d'un hépatocarcinome. La maladie se déroule en 2 phases, une aigue, asymptomatique, dont environ 30% des maladies guérissent spontanément. Les autres vont voir leur maladie devenir chronique, avec installation d'une fibrose, puis d'une cirrhose et enfin un risque de 3% supplémentaires par an de développer un cancer du foie. Il n'existe à ce jour aucun vaccin préventif. Le traitement standard utilisé est une combinaison d'interféron alpha pégylé et de ribavirine et n'est efficace que dans 50% des cas pour le génotype 1, majoritaire. A ce jour, les mécanismes d'action du traitement lors de la phase chroniques sont très flous. Les objectifs de ce travail ont été d'étudier un panel varié de populations cellulaires périphériques et intrahépatiques au cours de l'hépatite C chronique afin notamment d'en évaluer les impacts causés par le traitement. Nous avons étudié finement les populations de cellules NK qui sont connues pour avoir certainement un rôle important dans la pathologie ainsi que pour subir de lourdes pressions du virus. Nous avons aussi étudié des facteurs immunitaires avant traitement potentiellement capables de nous indiquer quels malades répondront favorablement à la thérapie et quelles cellules produisaient de l'IFN en phase prétraitement. Nous avons étudié une multitude de paramètres immunologiques durant toutes les phases d'un traitement, avant pendant et 6, mois après, afin de pouvoir conclure sur les effets immunologiques de la bithérapie IFN+ribavirine. Enfin nous avons voulu caractériser et élucider la localisation et les rôles exacts des cellules T régulatrices périphériques et intrahépatiques au cours de l'hépatite C. Afin d'atteindre les buts que nous nous étions fixés, nous avons utilisé une assez vaste combinaison de technologies. Nous avons étudié les phénotypes des cellules par cytométrie de flux en 4 couleurs, mesuré l'expression d'une grande variété de gènes d'intérêts par RT-PCR, mesuré la sécrétion d'IFN spécifique du virus par elispot et enfin la sécrétion d'un panel de 6 cytokines de profil Th1 par CBA. Nous avons travaillé en étroite collaboration avec le département d'hépatogastroentérologie du CHU de Grenoble qui nous a fourni les échantillons sanguins et les biopsies hépatiques dont nous avions besoin. Nous avons tout d'abord étudié les populations NK intrahépatiques et périphériques ainsi que les corrélations entre leurs fréquences, leur phénotype et les paramètres cliniques. Cette étude a été réalisée sur des malades chroniques d'hépatite C, mais aussi des témoins sains et atteints d'hépatite B chronique afin d'en extraire les impacts virus-spécifiques. Nous avons trouvé une augmentation du ratio NK cytotoxiques/NK sécrétrices lors de l'hépatite virale C. Nous avons pu mettre en lumière 2 sous-population particulières de NK, l'une associées au contrôle du virus, CD3-CD56dimNKG2A+, et l'autre a contrario associée aux lésions hépatiques, CD3-CD56brightNKG23A+. Notre étude sur les facteurs prétraitement prédictifs de la réponse thérapeutique a permis de déterminer le taux basal d'expression de l'IFN comme étant corrélé positivement à la réponse au traitement. De plus, il est significativement plus élevé chez les malades chroniques que chez les contrôles sains. Nous avons voulu ensuite savoir dans quel type cellulaire il était exprimé chez les futurs répondeurs. Nous en avons conclu que les cellules productrices d'IFN avant thérapie étaient les lymphocytes TNK. Nous avons ensuite suivi la réponse immunitaire T au cours du traitement contre l'hépatite C. Nous avons mesuré l'activation des lymphocytes T CD4+ et CD8+ via l'expression du récepteur CD25 (IL-2R), leur sécrétion d'interféron  en présence de peptides viraux par le biais de la technique de l'elispot, l'expression des gènes antiviraux induits par les IFNs par RT-PCR et les évolutions de leur phénotype, en plus de celui des cellules NK, par cytométrie en flux. Pour se faire, nous avons eut accès à une cohorte de malades issus d'un essai clinique financé par l'ANRS en collaboration avec le département d'hépatogastroentérologie du CHU de Grenoble, le projet Gammatri. Celui-ci consistait en l'évaluation de l'impact de l'ajout d'interféron  en injection pour des patients non-répondeurs à la thérapie classique. Nous avons pu avoir des prélèvements sanguins réguliers des malades avant, pendant les 48 semaines de traitement et après un suivi à la semaine 72, d'où nous avons extrait les cellules mononuclées. Nous avons déduit de cette étude que le traitement n'augmentait pas ni n'améliorait la réponse immunitaire spécifiques au VHC. Au contraire, il semble l'annuler, certainement pour laisser le temps à d'éventuels mécanismes indépendants des cellules de l'immunité adaptative de se mettre en fonctions. Nous avons également mis au point un système de culture de lymphocytes en présence de protéines virales permettant de mesurer l'impact direct de molécules sur la réponse spécifique au virus. Ce système a été utilisé sur des cellules de malades non traités, mises en présence d'IFN et de ribavirine à des doses proches des doses reçues in vivo lors du traitement par les cellules intrahépatiques. Dans ce cadre-là, les techniques de PCR, de cytométrie en flux et d'elispot nous ont permis d'observer les modifications cellulaires induites par les molécules ajoutées. En étudiant les effets de l'interféron  et de la ribavirine sur les cellules T CD4+ et CD8+ et les cellules NK et TNK. Nous avons pu montrer que le traitement régulait négativement toutes les populations cellulaires testées à l'exception des cellules TNK, et ce seulement aux tout débuts de la culture. Enfin, nous avons étudié les lymphocytes T régulateurs (TReg) pour déterminer leur localisation et leurs rôles durant la maladie. Il s'est avéré que les TReg n'influençaient pas la charge virale, donc à priori n'inhibaient pas les cellules effectrices spécifiques du virus. En revanche, ils sont colocalisés dans les infiltrats hépatiques CD8+ et participent à la protection du foie des lésions en inhibant les cellules cytotoxiques par contact direct. Ceci ne dure néanmoins pas très longtemps puisqu'au-delà d’un certain état de fibrose (>Metavir A2/F3), les TReg n'ont plus aucun contrôle sur les lésions hépatique, ce qui pourrait être l'une des causes de l'apparition de la cirrhose. Pour conclure, l'influence du virus sur l'immunité de son hôte est extrêmement complexe et fait intervenir un très grand nombre de facteurs. De notre étude, il en est ressorti que les cellules ayant le plus de potentiel dans le contrôle du virus, et donc devraient être prioritairement ciblées par les futures thérapies, sont les cellules NK CD3-CD56dimNKG2A+, corrélées négativement avec la charge virale, et les lymphocytes TNK, étant les seuls à répondre positivement à la thérapie par une sécrétion d'IFN. De plus, il serait nécessaire d'entretenir l'activité des cellules TReg intrahépatiques au-delà du stade A2/F3 pour empêcher la formation de lésions cirrhotiques menant au cancer du foie. Enfin, la mesure du taux d'expression de l'IFN avant traitement pourrait être un bon prédicateur de la réponse thérapeutique et ainsi permettre de mieux prendre en charge les malades
About 200 million people are infected by hepatitis C virus worldwide. As the outcome of the disease may be hepatocellular carcinoma, it is the main cause of liver transplantations in the world. When you are infected by HCV, you are in the acute phase of the disease. It's generally asymptomatic and approximately 30% of infected patients resolve the infection spontaneously. Others will become HCV chronic carriers and may develop fibrosis which may evolute in cirrhosis. At this stage, there is an additional 3% per year risk to develop hepatocellular carcinoma. There is still no preventive vaccine. The standard therapy is a combination of pegylated IFN and ribavirin and is only effective in 50% cases of genotype 1 infected patients. Nowadays, we still don't know clearly how this therapy works during chronic phase. The objectives of this work were to study a various panel of cell populations, in peripheral blood and in the liver, during chronic hepatitis C to evaluate treatment impacts on these. We finely characterized the populations of NK cells, which are known to potentially play an important role during the disease and to undergo heavy viral pressures. We also studied predictive immunological parameters able to indicate to clinicians which patients develop a sustained virologic response and what cell populations product IFN before treatment. We have studied a variety of immunological parameters before, during, under and 6 months after a hepatitis C therapy to try to conclude on immunological impact of combination IFN and ribavirin. Finally, we decided to characterize and localize intrahepatic and peripheral TReg during hepatitis C. To achieve our goals, we used a wide range of technologies. We studied cellular phenotype by 4-colors flow cytometry, measured gene of interest expression by RT-PCR, quantified IFN secretion against HCV proteins by elispot and dosed cytokines secreted against HCV peptides by CBA. We worked in collaboration with the "département d'hépatogastroentérologie du CHU de Grenoble " which supplied blood samples and liver biopsies we needed. We first studied peripheral and intrahepatic NK cells population as well as correlations between their phenotype, frequencies and clinical parameters in chronic hepatitis C patients. We used healthy and hepatitis B controls. We found an increase of the of the cytotoxic/secretive NK cells ratio during hepatitis C. Two particular populations of NK cells were identified. One correlated to viral control, CD3-CD56dimNKG2A+, and the other with hepatic lesions, CD3-CD56brightNKG23A+. Our study on pretreatment predictive immunological parameters found that basal expression of IFN is positively correlated to a sustained virologic response. Moreover, this expression is significatively higher in chronical HCV carriers compared to healthy controls. Then, we investigated the type of cells producing IFN and we found that it was TNK cells. Following this, we monitored T cells response during therapy. We evaluated the activation of CD4+ and CD8+ T cells through CD25 (IL-2R) expression, their IFN secretion against HCV peptides with elispot, ISG expression using RT-PCR and the evolutions of their phenotype, including NK's and TNK's, by flow cytometry. Biological sample were obtained from a clinical trial funded by ANRS in collaboration with the hepato-gastroenterology department at the Grenoble hospital, Gammatri project. This consisted of adding IFN to the classical therapy to improve its response rate. We have had regular blood samples before, during and 6 months after the end of therapy. Our results showed that therapy didn't improve the response of HCV specific T cells neither increased it. In contrast, it rather suppressed T cells response, maybe to let T cells- independent mechanisms work. We also developed an in vitro culture system with HCV proteins which let us measure the direct impact of molecules on the subpopulations of HCV specific T cells. We used it with PBMC from non-treated patients cultured with physiological doses of IFNand ribavirin. The only population responding positively to treatment by secreting IFN was TNK and only during the very first hours in culture. Finally, we studied the regulatory T cell (TReg) to determine their location and roles during the disease. We didn't find any correlation between TReg frequencies and viral load, so it seems that TReg didn't inhibit HCV specific T cells. They are colocalized in CD8 infiltrates and may participate in hepatic preservation by inhibiting cytotoxic cells by direct contact. This protective effect only lasts until fibrosis reach the A2/F3 grade. Beyond, TReg lose their effect and this fact may be a cause of the onset of cirrhosis. To conclude, the influence of virus on the immunity of its host is extremely complex and involves a larger number of factors. In our study, we showed that cells with the better potential in virus control were CD3-CD56dimNKG2A+ NK cells, negatively correlated with viral load, and TNK, responding positively to therapy. It is necessary to study in details for the developments of the immunotherapy in the future. Moreover, it will be interesting to maintain TReg activity beyond A2/F3 grade to prevent the formation of cirrhotic lesions. The measure of IFN expression before the treatment may be a good predicator of sustained viral response and provide better care for patients

Des lymphocytes T activés infiltrent en permanence le SNC (Système Nerveux Central) mais sont rapidement éliminés par apoptose. La persistance de lymphocytes T activés dans le SNC pourrait être impliquées dans le développement de maladies inflammatoires du SNC, telles que la SEP (Sclérose En Plaques) et la TSP/HAM (myélopathie associée au virus HTLV-I), caractérisées par une infiltration du SNC par des lymphocytes T activés, une destruction de la myéline et une perte anoxale. Les lymphocytes T activés sont suspectés induire la mort des oligodendrocytes et des précurseurs d'oligodendrocytes impliqués dans la remyélinisation du SNC. Un des mécanisme suspectés est un effet "bystander" non MHC-restreint, via la libération de facteurs toxiques (FasL, TNF", NO. . . ) par les lymphocytes T activés. L'implication du récepteur de mort, Fas, et son ligand, FasL, est suspectée. Mais les mécanismes d'activation de Fas et les voies de signalisation mises en jeu ne sont par encore élucidés. Notre but a été de mettre en évidence que des lymphocytes T activés peuvent induire la mort de précurseurs du SNC par l'activation de Fas, et d'analyser les voies de signalisation mises en jeu. Nous avons établi un modèle d'inflammation du SNC mimant les interactions entre des lymphocytes T activés, soit par PMA-ionomycine, soit par une infection virale, et des cellules du SNC. Seuls, des lymphocytes T activés par une infection virale peuvent induire la mort de précurseurs du SNC. Cette mort par apoptose implique l'activation de Fas, mais est indépendante de FasL. Elle est caspasesdépendante et met en jeu la mitochondrie. D'autre part, les lymphocytes T activés par une infection virale sont responsables de l'acquisition de la susceptibilité à la mort, en induisant l'exposition de Fas à la surface des précurseurs du SNC. Cette susceptibilité à la mort est régulée par les métalloprotéases et leurs inhibiteurs endogènes. Ces résultats supportent l'hypothèse que la mort de précurseurs d'oligodendrocytes, induite par des lymphocytes T activés infiltrant le SNC de patients développant la SEP ou la TSP/HAM, pourrait contribuer à la démyélinisation et à l'incapacité de remyélinisation observée chez les patients.

Les recepteurs du complement cr1 (cd35, recepteur c3b) et cr2 (cd21, recepteur c3dg/ebv/cd23s/ifn-) permettent l'infection par le vih, de lignees lymphocytaires b et t, et des monocytes humains. Nous avons mis en evidence l'expression de cr1 et cr2 a la membrane des thymocytes humains. Le recepteur cr1 est exprime par 15% des thymocytes et le recepteur cr2 par 70% des thymocytes. Une sous-population de thymocytes (10 a 15%) exprime cr2 avec une intensite 10 fois superieure au reste des thymocytes, equivalente a celle des lymphocytes b. Etant donne toutes les caracteristiques fonctionnelles des recepteurs du complement a la membrane des lymphocytes b et des monocytes, cette donnee justifiait l'etude des proprietes fonctionnelles et immunoregulatrices de la molecule cd21 exprimee par les thymocytes humains. Nous avons caracterise les cellules exprimant cr2 dans le thymus: cr2 est exprime par les thymocytes a tous les stades de maturation, toutefois son expression diminue au fur et a mesure que les cellules se differencient. Les cellules exprimant cr2 sont des cellules de grande taille, incorporant le brdurd. L'expression de cr2 est plus forte a la membrane des cellules exprimant cd45ra qu'a la membrane des cellules exprimant cd45ro. Ces trois observations suggerent que, l'expression de cr2 serait liee a un etat d'activation de cellules quelque soit leur stade de maturation, et ouvrent des perspectives interessantes concernant le role de cr2 dans les phenomenes de selection. La capacite de cr2 a transmettre des signaux de phosphorylation et son eventuelle association a d'autres molecules membranaires, ont ete etudiees et ont montre que cr2 phosphoryle deux proteines de 50 et 18 kda, et pourrait etre associe a une proteine membranaire de 50 kda. Ces proprietes de cr2, si elles se confirment, pourraient indiquer que cr2 a un role dans la signalisation et par consequent dans la maturation des thymocytes humains. Cr1 et cr2 permettent l'infection par le vih-1 (rf) opsonise par les fragments de c3. L'infection est totalement bloquee par les recepteurs recombinants solubles cr1 et cr2, indiquant que l'infection serait independante de cd4. Leurs recepteurs ont un role dans l'entree du virus dans les cellules et pourraient jouer un role dans la pathogenese du sida. La stimulation du recepteur cr1 a la membrane des lymphocytes t cd4#+ peripheriques, infectes par le vih in vitro ou in vivo, entraine une augmentation de la replication virale. Le recepteur cr1 n'est pas modifie au cours de l'infection par le vih. Au cours du sida, l'interaction de cr1 avec les complexes immuns pourrait constituer un mecanisme supplementaire de reactivation virale

Dans cette thèse nous avons analysé les mécanismes de phosphorylation de la p56Ick et son activité kinase après stimulation des cellules Jurkat par des anticorps anti-CD4, les gp160 ou gp 120 du VIH et des anticorps anti-TcR/CD3. Nous avons essayé de rapprocher ce phénomène avec un modèle d'adhésion nécessitant la voie du CD4 et un modèle de sécrétion de cytokines (IL-2) par la stimulation du TcR/CD3. Ces deux voies de signalisation n'induisent pas le même effet cellulaire (IPs, Ca⁺⁺ prolifération), mais le point commun réside dans la phosphorylation de la p56Ick. Nous avons démontré que les lymphocytes T stimules par l'anticorps anti-cd4 ou la gp160 et ou la gp120 du VIH, augmentent l'activité kinase de p56Ick et augmentent la phosphorylation des sites tyrosine et serine. Cette augmentation s'effectue très rapidement dès les premières minutes qui suivent la stimulation sans changement de poids moléculaire de la p56Ick. L'utilisation d'un modèle d'adhésion montre que la voie CD4 induit un signal négatif qui nécessite l'hyperphosphorylation de la p56Ick. Une stimulation par la voie TcR/CD3 induit une modification des sites de phosphorylation sur serine et tyrosine associée avec un changement du poids moléculaire de la p56Ick. Par l'utilisation d'un inhibiteur de PKC nous avons analysé la forme de haut poids moléculaire et détermine les sites impliques dans la modification de l'état de phosphorylation de la molécule induit par la stimulation via CD3 et par le PMA. Ces deux sites de phosphorylation sont différents mais situes dans le même domaine SH2 de la kinase.

Ziel der Arbeit war, zu untersuchen, ob der gezielte Einsatz gentherapeutischer Methoden zu einer Verhinderung der Abstoßung allogener Transplantate bzw. zu einer Verhinderung der Induktion des Ischämie-/Reperfusionsschadens in verschiedenen Transplantationsmodellen der Ratte beitragen kann. Dabei wurden zwei Schwerpunkte gesetzt: Zum einen wurde auf den ex-vivo Gentransfer von therapeutischen Molekülen direkt in das Transplantat mit Hilfe von rekombinanten Adenoviren fokussiert. Zum anderen wurde das Potenzial von retroviral modifizierten, allospezifischen T-Zellen als Träger therapeutischer Gene zur Verhinderung der Transplantatrejektion untersucht. Diese Habilitationsschrift umfasst dreizehn Originalartikel in internationalen Zeitschriften, sechs Übersichtsartikel (Reviews) und vier Manuskripte, die bereits zur Veröffentlichung eingereicht sind.
The aim of the research was to investigate, whether the specific use of gene therapeutic methods can play a role in the prevention of allogeneic graft rejection or in the prevention of the induction of ischemia/reperfusion damage in various rat transplantation models. Doing this there were to main focusses: First we concentrated on the ex-vivo gene transfer of therapeutic molecules directly into the graft, which was done using recombinant adenoviruses. Then we investigated the potential of retrovirally modified, allospecific T-cells as carriers for therapeutic genes for the prevention of graft rejection. This publication consists of thirteen original papers in international journals, six reviews and four manuscripts that have been submitted for publication.