Littérature scientifique sur le sujet « Spettrometria massa »

SommarioLa metabolomica ha permesso un notevole avanzamento nella comprensione della fisiopatologia delle ghiandole surrenaliche. L’applicazione della spettrometria di massa alla misurazione dei metaboliti ha portato all’identificazione di pannelli con enormi potenzialità in ambito diagnostico, come ad esempio nell’identificazione della patologia surrenalica espansiva maligna, nella predizione delle recidive e nella diagnosi di sottotipo dell’ipersecrezione glucocorticoide e mineralcorticoide.

In questo lavoro è stato ottimizzato un metodo analitico per la determinazione dei residui per il focus dei pesticidi: Azoxystrobin, Boscalide, Carbendazim, Chloranthranilprole, Clothianidin, Diafentiuron, Difenoconazole, Dimetomorfe, Espinetoram, Espinosade A, Espinosade D, Fenylurozenoide, Metalaxy , Tiametossano nel terreno derivato dalla piantagione di pomodori, al fine di confrontare i livelli di contaminazione di questi composti nei campioni di terreno. Sono stati utilizzati il ​​metodo di estrazione QuEChERS modificato e la cromatografia liquida Ultra Performance accoppiata con la spettrometria di massa sequenziale, con sorgente di ionizzazione mediante elettronebulizzazione in modalità ESI (+/-). Il metodo consisteva nell’estrazione di 15,0 g di terreno con 15 ml di soluzione satura di idrossido di calcio pH 12,3 e 15 ml di acetonitrile, con conseguente ripartizione dell’effetto “salatura” attraverso 6,0 g di solfato di magnesio anidro e 1,5 g di cloruro di sodio . Le fasi sono state separate mediante centrifugazione a 3700 rpm per 7 min. Gli estratti sono stati diluiti con MeOH grado licrossolv® e iniettati in un cromatografo. Il metodo è stato convalidato in base ai parametri di linearità, LOD, LOQ, precisione e accuratezza. Linearità tra 0,2 e 20,0 µg L-1, coefficienti di determinazione maggiori di 0,99. I valori LOQ per il metodo erano 13 µg kg-1 per Spinosad e 7,0 µg kg-1 per gli altri pesticidi. Il metodo ha mostrato una buona precisione, con valori RSD <20%, e accuratezza, con recuperi tra il 70 e il 120% per la stragrande maggioranza dei composti analizzati. Le curve analitiche sono state preparate con estratti di terra bianca di riferimento, al fine di minimizzare l’effetto Matrix. Il metodo è stato ritenuto idoneo per l’analisi dei residui di pesticidi nel suolo, poiché soddisfa i parametri di validazione dei metodi cromatografici (European Comission, 2018). Dopo la convalida, il metodo è stato utilizzato per analizzare i residui di questi pesticidi in campioni di suolo provenienti da piantagioni di pomodori convenzionali, organiche e sostenibili. Rendere possibile confrontare i livelli di impatti ambientali generati. Oltre a convalidare il metodo analitico per i pesticidi-focus dello studio, è stato anche possibile convalidare 240 composti in più, tra autorizzati e non autorizzati per l’uso nella piantagione di pomodori.

The aim of this thesis concerning the setting of new methods to study methabolic pathaways in vivo using both stable isotope tracer (113C-leucine and D2O) both stable isotope at natural abundance. First chapter reports a new method to measure absolute and percentage of AA and DHA synthesis. Preterm infants were fed with a formula enriched in AA and DHA with a higher content of 13C than did the endogeusly sinthesized long chain fatty acids (LCP). The second chapter reports a new menthod to measure SP-B synthesis in vivo in humans by means of stable isotopes. We administered a 24 h infusion of 13C-Leucine as metabolic precursor of SP-B and 2H2O as precursor of dipalmitoyl phosphatidylcholine (DSPC).
Obiettivo di questa tesi è stato l’applicazione sia di isotopi stabili ad abbondanze naturali sia di traccianti marcati con isotopi stabili (113C-leucina e D2O) per lo studio di diverse vie metaboliche, quali la sintesi, di acidi grassi, nel bambino pretermine e la sintesi proteica e lipidica nell’adulto. Il primo studio ha visto l’utilizzo di una dieta arricchita con due acidi grassi che presentavano un’abbondanza naturalmente diversa di 13C rispetto a quella degli altri acidi grassi per determinare, per un lungo periodo di tempo, la sintesi assoluta e in percentuale di questi due acidi grassi nei bambini pretermine. Nel secondo studio abbiamo utilizzato leucina marcata con 13C e acqua marcata con deuterio per determinare il metabolismo della fosfatidilcolina disatura (DSPC) e della proteina specifica B del surfattante (SP-B).

Abstract Background and purposes The obstructive pulmonary diseases in the world – among which asthma and the chronic obstructive pulmonary disease (COPD) – have been growing constantly. In 2006 about 46 million persons suffered from asthma, and 9.5 millions were children; the COPD has also been growing constantly and, despite the fact that the incidence increases with age, it looks like several factors and previous childhood diseases can influence the subjects’ respiratory function and the evolution of the disease. Despite the many studies that have been carried out, it is not clear yet what are the mechanisms on which these respiratory diseases are based, and therefore further investigations must be made. Mass spectrometry, a sensitive and robust analytic technique, has found more and more applications in the clinical-diagnostic field, thanks to its capacity to determine the metabolites in the biological samples with a mass value or to identify their structure through fragmentation with extremely sensitive, specific and selective characteristics. The possibility to analyze complex blends, thanks to combination with gas or liquid chromatographic techniques, reduced analysis time, the qualitative identification but above all the quantitative dosages of several biomarkers in a single analysis, has made this technique preferable for clinical studies. Especially, besides the classical target approach used to quantify already known or presumably proper to certain pathologies specific compounds, over the past years a new type of approach has developed, the so called untargeted approach, known as “metabolomic”, which sees the study of the entire metabolic profile of a biological sample, by means of highly sensitive and precise analytic techniques, such as high resolution mass spectrometry (HMS). This approach allows the characterization of the general metabolic profile of a group of subjects with a specific pathology as compared to a group of control and extracts the discriminating variables, thanks to multivariate statistic analysis techniques. The untargeted analysis, which is not based upon prior hypotheses, can open the doors to new etiopathological hypotheses, besides helping identify the diagnostic and prognostic biomarkers. The purpose of this PhD thesis was to study the infant obstructive respiratory diseases by applying both of these approaches to urine or exhaled breath condensate (EBC) samples. The EBC is a biofluid which, given the extremely non invasive method of collecting it, represents an ideal biological matrix for studies of the kind, but, since the metabolite concentration is extremely low, is at the same time an analytically complex matrix. Methods and results In the first study, the HRMS metabolomic analysis of the EBC was employed to investigate upon the biochemical-metabolic profile of the EBCs of teenagers diagnosed with bronchopulmonary dysplasia (BPD)from birth as compared to a group of healthy teenagers. The samples were analyzed with the LTQ-OrbiTrap mass spectrometer and processed by means of the multivariate statistic analysis. The results have demonstrated that it is possible to discriminate the BPD group from the control group by marking out the EBC samples, obtaining a robust OPLS-DA model (R2: 0.95, Q2:0. 82), indicating how the teenagers who were affected by BPD from birth have a different biochemical-metabolic profile. The individuation of the glycerophospholipids, among the several discriminating variables, has suggested a possible involvement of the alveolar surfactant at the basis of the minor respiratory function in the BPD affected patients, even years later after the severe phase of the disease. The second study employed the HRMS metabolomic in order to obtain a first biochemical-metabolic characterization of children with frequent bronchospasm or with wheezing in preschool age, in view of a perspective study which would help appreciate which of these children will develop asthma when growing up, and, a posteriori, consider whether prognostic biomarkers exist. The preliminary results of this part of the study have been encouraging: thanks to the analysis of the urine samples with the hybrid Q-TOF mass spectrometer associated to the UPLC, we have had a clear distinction of the subjects affected by wheezing as compared to healthy children, through an OPLSA- DA model. The preliminary analysis has allowed to obtain a clear distinction between children who suffered from wheezing and healthy children, highlighting some discriminating molecules. The study is still ongoing since it presupposes the evaluation of the same subjects 18 and 36 months later. The third part of the study was related to the use of the target MS and was meant to evaluate and quantify some oxidative stress indicators in EBC samples belonging to subjects affected by asthma. A UPLC-MS/MS method was developed and validated for the quantitative analysis of the dimethyl arginine, ADMA and SDMA, in samples of EBC. The analysis was conducted by means of MRM technique in quadrupole mass spectrometry associated to UPLC, with a on line sample enrichment system. The analytic system has come out robust (r2>0.992, %Bias <3% intra- CV% inter-intra assay =20%, recovery between 97 and 102%), rapid (5 minutes chromatographic run) and sensitive, also suitable for the analysis of diluted biological samples, such as the EBCs. The quantification of these metabolites, conducted on samples of asthmatic and healthy children, has pointed out a rise of the ADMA in the EBCs of the asthmatic subjects, indicating a role of the ADMA in the tissue damage of the respiratory tract which typically characterizes the bronchial asthma. Conclusions This research has demonstrated that instrumentally highly sensitive mass spectrometry, which has allowed us to obtain significant information even from small quantities of samples and from extremely diluted matrixes, can be successfully applied to the study of obstructive respiratory diseases, making the follow up studies easier, and also helping medical doctors identify possible markers useful to the diagnosis and/or new therapeutic targets.
Background e obiettivi Le pneumopatie ostruttive nel mondo, tra cui asma e bronco pneumopatia cronica ostruttiva (COPD), sono in continua crescita. Nel 2006 circa 46 milioni di persone erano affette da asma, di cui 9.5 milioni erano bambini; anche la COPD è in continuo aumento e, anche se l’incidenza cresce con l’età anagrafica, sembra che diversi fattori e malattie pregresse dell’infanzia, possano influenzare la funzionalità respiratoria dei soggetti e l’evolvere della patologia. Nonostante i molti studi condotti, i meccanismi alla base di queste malattie respiratorie non sono ancora del tutto chiariti, e necessitano pertanto di ulteriori indagini. La spettrometria di massa, tecnica analitica sensibile e robusta, trova sempre più applicazioni in ambito clinico-diagnostico, grazie alla capacità di determinare i metaboliti presenti nei campioni biologici dai valori di massa o identificarne la struttura tramite frammentazione con caratteristiche di estrema sensibilità, specificità e selettività. La possibilità di analisi di miscele complesse, grazie all’accoppiamento con tecniche cromatografiche gassose o liquide, i tempi di analisi ridotti, l’identificazione qualitativa ma soprattutto i dosaggi quantitativi anche di numerosi biomarcatori in una singola analisi, ha reso questa una tecnica di elezione per studi clinici. In particolare oltre al classico approccio target per quantificare specifici composti già noti o che si suppone siano caratteristici di una patologia, negli ultimi anni si è sviluppato un nuovo tipo di approccio untargeted, noto come “metabolomica”, che vede lo studio dell’intero profilo metabolico di un campione biologico, attraverso tecniche analitiche altamente sensibili e ad elevata capacità, quali la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HMS). Tramite questo approccio è possibile caratterizzare il profilo metabolico generale di un gruppo di soggetti con una determinata patologia rispetto ad un gruppo di controllo ed estrapolare le variabili discriminanti, grazie a tecniche statistiche di tipo multivariato. L’analisi untarget, non basata su ipotesi a priori, può aprire la strada a nuove ipotesi eziopatologiche oltre ad aiutare nell’identificazione di biomarkers diagnostici e prognostici. Obiettivo di questo dottorato era studiare le pneumopatie ostruttive in età pediatrica mediante l’applicazione di entrambi questi approcci, su campioni di urine o condensato di aria espirata (EBC). L’EBC è un biofluido che, data la sua raccolta assolutamente non invasiva, costituisce una matrice biologica ideale per studi di questo tipo, ma essendo la concentrazione dei metaboliti estremamente bassa, risulta al tempo stesso una matrice analiticamente complessa. Metodi e risultati Nel primo studio, l’analisi metabolomica HMS dell’EBC è stata impiegata per indagare il profilo biochimico-metabolico degli EBC di adolescenti con diagnosi di broncodisplasia alla nascita (BPD) rispetto a quello di un gruppo di adolescenti sani. I campioni sono stati analizzati con lo spettrometro di massa LTQ-OrbiTrap e processati tramite analisi statistica multivariata. I risultati ottenuti hanno mostrato che è possibile discriminare il gruppo BPD dal gruppo di controllo attraverso la caratterizzazione dei campioni di EBC, ottenuta con un modello OPLS-DA robusto (R2:0.95, Q2:0.82 ), mostrando un differente profilo biochimico-metabolico negli adolescenti con BPD alla nascita. L’individuazione di glicerofosfolipidi, tra le variabili discriminanti, ha suggerito un possibile coinvolgimento del surfattante alveolare alla base della minore funzionalità respiratoria dei soggetti con BPD, anche dopo anni dalla fase acuta della malattia. Il secondo studio ha previsto l’utilizzo della metabolomica HRMS per ottenere una prima caratterizzazione biochimica-metabolica dei bambini con broncospasmo ricorrente o wheezing in età prescolare, in vista di uno studio prospettico per valutare quali di questi bambini svilupperà asma con la crescita, e considerare a posteriori se esistano dei biomarkers prognostici. I risultati preliminari di questa parte dello studio sono stati promettenti: grazie all’analisi di campioni di urina con lo spettrometro di massa ibrido Q-TOF associato ad UPLC, si è ottenuta une netta differenziazione dei soggetti con wheezing rispetto ai bambini sani, mediante un modello OPLSA- DA. L’analisi preliminare ha permesso di ottenere una netta separazione tra bambini con wheezing e bambini sani, mettendo in evidenza alcune molecole discriminanti. Lo studio è ancora in corso in quanto prevede la valutazione degli stessi soggetti a 18 e 36 mesi. La terza parte dello studio relativa all’utilizzo della MS target prevedeva la valutazione e quantificazione di alcuni indicatori di stress ossidativo in campioni di EBC di soggetti asmatici. È stato sviluppata e validata una metodica UPLC-MS/MS per l’analisi quantitativa di dimetilarginine, ADMA e SDMA, in campioni di EBC. L’analisi è stata condotta tramite tecnica MRM in spettrometria di massa quadrupolare associata ad UPLC, con sistema di arricchimento on-line del campione. Il sistema analitico è risultato robusto (r2>0.992, %Bias <3% intra- CV% inter-intra assay =20%, recovery% tra 97 e 102%), rapido (corsa cromatografica di 5 minuti), e sensibile, adatto anche ad analisi di campioni biologici diluiti quali gli EBC. La quantificazione di tali metaboliti condotta su campioni di bambini asmatici e sani, ha mostrato un aumento di ADMA negli EBC dei soggetti asmatici, indicando un ruolo dell’ADMA nel danno tissutale delle vie aeree tipico dell’asma bronchiale. Conclusioni Questa ricerca ha dimostrato che la spettrometria di massa ad elevata sensibilità strumentale, grazie alla quale è stato possibile ottenere informazioni significative anche da piccole quantità di campione e da matrici estremamente diluite, può essere applicata con buoni risultati alla studio di pneumopatie ostruttive, rendendo più facili studi di follow up, oltre che aiutare il medico nell’individuare possibili marcatori utili alla la diagnosi e/o nuovi target terapeutici.

L’interesse per lo sviluppo di nuovi metodi e per l’applicazione di tecniche ifenate è generato dalla necessità di caratterizzare campioni biologici complessi. Questo lavoro affronta l’applicazione e la messa a punto di tecniche ifenate allo scopo di: a) identificare un nuovo biomarcatore da associare al PSA (Prostate Specific Antigen) per la diagnostica del cancro prostatico, b) sviluppare una nuova tecnica ifenata per l’analisi di glicosfingolipidi. Negli studi di proteomica clinica, destinati all’identificazione di nuovi biomarcatori, i maggiori problemi sono legati all’incompatibilità dell’intervallo di sensibilità degli strumenti di rivelazione con l’intervallo di concentrazione delle specie proteiche e peptidiche presenti nei fluidi biologici. Pertanto, poiché l’intervallo di sensibilità degli strumenti di rivelazione non può essere variato, il passaggio cruciale è rappresentato dalla riduzione dell’intervallo di concentrazione tra le specie più abbondanti e le specie meno abbondanti nei fluidi biologici in esame. Nel caso del siero ciò è stato ottenuto grazie all’eliminazione della frazione contenente le proteine a maggior abbondanza mediante immunodeplezione selettiva. Le frazioni seriche a bassa abbondanza preparate da 30 pazienti affetti da cancro alla prostata (ADK) e da 30 soggetti controllo sono state analizzate tramite MALDI profiling. La metodica applicata ha permesso di individuare delle differenze statisticamente significative nell’espressione di alcune componenti proteiche, rivelate dalla presenza di picchi differenzialmente espressi negli spettri di massa ottenuti. Tuttavia, il punto fondamentale per il trasferimento dei risultati ottenuti in diagnostica clinica è rappresentato dall’identificazione delle specie proteiche contenute nel profilo di massa MALDI al fine di poter utilizzare tecniche immunometriche per la validazione dei dati e sviluppare metodi di dosaggio su larga scala applicabili in diagnostica clinica. Grazie all’ifenazione tra tecniche cromatografiche, quali la cromatogafia per gel filtrazione e la cromatografia a fase inversa, condotte rispettivamente su uno strumento HPLC e su uno strumento nano LC, e tecniche di spettrometria di massa MALDI, è stato possibile identificare il picco 2021 m/z, statisticamente variato, che corrisponde al peptide C3f, derivato dalla proteolisi del fattore del complemento C3, e la sua aumentata espressione in pazienti ADK+ a bassi valori di PSA, è stata confermata attraverso un esperimento di immunoblotting. I risultati sono stati validati su un secondo gruppo di pazienti e controlli. L’aumento di tale peptide indica una deregolazione del fattore del complemento C3 che viene inattivato a iC3b, il quale inibisce il ciclo della via alternativa del sistema del complemento impedendo l’associazione del fattore C3b al fattore B. Il peptide C3f potrebbe pertanto essere usato in associazione con il valore serico di PSA per ridurre il numero di pazienti “falsi negativi”. Un altro aspetto importante della ricerca biomedica e indirettamente della diagnostica clinica è rappresentato da una classe di molecole di segnale che si sono rivelate importanti in numerose patologie quali malattie cardiovascolari e neurodegenerative, tumori, malattie d’accumulo lisosomiale e sindrome metabolica. Nonostante il crescente interesse clinico, l’analisi dei glicosfingolipidi non gode di tecnologie ad alta automazione che permettano una facile identificazione e quantizzazione di specie con pesi molecolari spesso molto simili. Attualmente tale caratterizzazione avviene tramite l’utilizzo di precursori radioattivi, oppure di coloranti che non permettono una quantizzazione precisa, o di metodi III LC-MS di grande precisione ma dispendiosi in termini di tempo e di coinvolgimento dell’operatore. Attraverso l’ifenazione diretta HPTLC-MALDI, è stato possibile effettuare una fine analisi qualitativa e quantitativa del profilo glicosfingolipidomico estratto da mioblasti murini, distinguendo per ogni glicosfingolipide tutte le varianti a diversa catena di acido grasso presenti. Un aspetto importante è che lo sviluppo metodologico è stato accoppiato ad una analisi di campioni biologici i cui risultati sono stati confrontati con quelli precedentemente ottenuti attraverso l’utilizzo di precursori radioattivi e successiva analisi densitometrica su glicosfingolipidi estratti da mioblasti wild-type e overesprimenti la sialidasi NEU3. Pertanto, l’ifenazione proposta si è rivelata di grande applicabilità alla caratterizzazione dei glicosfingolipidi in quanto riduce i passaggi analitici necessari evitando l’uso di precursori radioattivi e di procedure di estrazione della banda dal gel di silice, e potrà essere applicata allo studio di diverse condizioni fisiologiche e patologiche per identificare potenziali biomarcatori.
The interest for the development of new methods and the application of hyphenated techniques for complex biological samples characterization is growing, nowadays, more and more. This work faces the application and setup of hyphenated techniques with two aims: a) to identify a new biomarker that can be associated to PSA (Prostate Specific Antigen) for prostate cancer (ADK) diagnosis, b) to develop a hyphenated technique for glycosphingolipids analysis. In clinical proteomics, the identification of new biomarkers is hampered by the discrepancy between the quantitative range of detection of instruments and the concentration range of proteins and peptides in biological fluids. Since the quantitative range of detection of instruments cannot be changed, the critical point is to reduce the dynamic range in examined biological fluids. In serum, this can be obtained by the elimination of high abundant proteins thanks to a selective immunodepletion. The serum low abundant protein fraction from 30 ADK patients and 30 controls was analyzed by MALDI profiling. The applied methodology was able to detect differentially abundant peaks in spectra of ADK vs no ADK controls. To transfer the obtained results in clinical diagnostic, the identification of species revealed by MALDI profiles is mandatory for two main reasons: data validation through the use of immunometric techniques and methodological development for a large scale test. Thanks to the hyphenation between chromatografic techniques, such as gel filtration on a HPLC and reverse phase on a nanoLC, and MALDI mass spectrometry, we were able to identify the highly changed 2021 m/z peak, that corresponds to C3f peptide and that derives from the proteolyses of Complement C3b. To confirm its increment in ADK patients with low PSA values an immunoblotting experiment was conducted. The results were validated on a second group of patients and controls. The increase of C3f expression could be related to a deregulation of C3 complement, cleft to iC3b, that inhibits the selffeeding cycle of the alternative pathway hampering the association of C3b to factor B. Therefore C3f peptide could be used in association to PSA serum value to decrease the number of “false negative”. An important aspect of the biomedical research and, indirectly, of clinical diagnostic is represented by a class of signal molecules that are important in a number of diseases, including neurological and cardiovascular disorders, cancer, lipid storage diseases, and the metabolic syndrome. Despite the increasing clinical interest, glycosphingolipids (GSLs) analysis cannot benefit by high-throughput techniques that allow an easy identification and quantitation of these species, characterized by similar molecular weights. Actually, their characterization is based on radioactive counts after metabolic radiolabeling, or on staining with proper dyes that doesn’t allow a precise quantitation. New approaches including LC-MS are largely used but they are time consuming and operator dependent. We develop the direct hyphenation HPTLC-MALDI, to obtain a precise qualitative and quantitative analysis of the glycosphingolipids profile from murine myoblasts, and to distinguish every fatty acid chain variant for each GSL. An important aspect is that the methodological setup was coupled to biological samples analysis and results were compared to those obtained through the use of radioactive precursors and densitometric analysis on GSLs extracted from wild type and NEU3 overexpressing murine myoblasts. The proposed hyphenation is of great applicability to the glycosphingolipids characterization because it reduces the V analytical steps, it avoids the use of radioactive precursors and silica scraping, and it could be applied to the study of different physiological and pathological conditions to identify potential biomarkers.

Mycotoxins are heterogeneous chemical compounds characterized by a low molecular weight and synthesized by the secondary metabolism of different molds. Fumonisins are water-soluble mycotoxins produced by Fusarium species spoiling corn and derived produc ts. These mycotoxins can be a health hazard when consuming contaminated cereals, but they can reach humans also indirectly through the consumption of food products derived from animals fed with contaminated feed. Fumonisins have been associated with several animal and human diseases: they are suspected risk factors for esophageal and liver cancers, neural tube defects and cardiovascular problems. Improved methods are needed to accurately assess fumonisins concentrations in food of vegetable and animal origin, in order to prevent acute and chronic human exposure. The aim of the present work was to evaluate the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis from foods and matrices of animal origin. Different methods for the identification and quantification of fumonisins and related products have been developed and validated to determine fumonisin B1 in milk, fumonisin B1, fumonisin B2 and their complete hydrolyzed products (HFB1 and HFB2) in pig liver and fumonisins B1 and B2 in complete and complementary dry dog food. The experimental procedures have been carefully studied, considering matrices features, number and type of molecules to detect. Therefore, several extraction, clean up and separation techniques were tested in order to obtain the better conditions of sample processing. The fit for purpose sample preparation, matched with high mass spectrometry sensibility and specificity, have allowed to achieve good results in any tested animal matrices. Hence, the developed methods were validated and have shown a high accuracy, sensibility and precision, fulfilling performance requirements of Decision 2002/657/EC and of European Project Standard, Measuring and Testing (SMT). In any developed method, the analytes were identified and quantified even at very low concentrations : the limits of quantification resulted lower than other similar works, performed with different detectors. These methods were applied to some commercial samples and to some samples collected for research projects in the Department of Veterinary Public Health and Animal Pathology (DVPHAP) of University of Bologna. Although the disclosed data must be considered completely preliminary and without statistical significance, they emphasize the presence of mycotoxins in animal products. The outcomes obtained from the processed samples (bovine milk, pig liver and dry dog food) suggest the efficacy of these methods also on other food matrices, confirming the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis. Moreover the results underline the need to set up a large scale monitoring in order to evaluate the presence of fumonisins in food of animal origin for human consumption.

Mycotoxins are heterogeneous chemical compounds characterized by a low molecular weight and synthesized by the secondary metabolism of different molds. Fumonisins are water-soluble mycotoxins produced by Fusarium species spoiling corn and derived produc ts. These mycotoxins can be a health hazard when consuming contaminated cereals, but they can reach humans also indirectly through the consumption of food products derived from animals fed with contaminated feed. Fumonisins have been associated with several animal and human diseases: they are suspected risk factors for esophageal and liver cancers, neural tube defects and cardiovascular problems. Improved methods are needed to accurately assess fumonisins concentrations in food of vegetable and animal origin, in order to prevent acute and chronic human exposure. The aim of the present work was to evaluate the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis from foods and matrices of animal origin. Different methods for the identification and quantification of fumonisins and related products have been developed and validated to determine fumonisin B1 in milk, fumonisin B1, fumonisin B2 and their complete hydrolyzed products (HFB1 and HFB2) in pig liver and fumonisins B1 and B2 in complete and complementary dry dog food. The experimental procedures have been carefully studied, considering matrices features, number and type of molecules to detect. Therefore, several extraction, clean up and separation techniques were tested in order to obtain the better conditions of sample processing. The fit for purpose sample preparation, matched with high mass spectrometry sensibility and specificity, have allowed to achieve good results in any tested animal matrices. Hence, the developed methods were validated and have shown a high accuracy, sensibility and precision, fulfilling performance requirements of Decision 2002/657/EC and of European Project Standard, Measuring and Testing (SMT). In any developed method, the analytes were identified and quantified even at very low concentrations : the limits of quantification resulted lower than other similar works, performed with different detectors. These methods were applied to some commercial samples and to some samples collected for research projects in the Department of Veterinary Public Health and Animal Pathology (DVPHAP) of University of Bologna. Although the disclosed data must be considered completely preliminary and without statistical significance, they emphasize the presence of mycotoxins in animal products. The outcomes obtained from the processed samples (bovine milk, pig liver and dry dog food) suggest the efficacy of these methods also on other food matrices, confirming the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis. Moreover the results underline the need to set up a large scale monitoring in order to evaluate the presence of fumonisins in food of animal origin for human consumption.

La tesi presentata riguarda lo sviluppo e la validazione di metodi analitici basati su cromatografia accoppiata a spettrometria di massa utilizzati per l'analisi di molecole target in matrici complesse. Gli analiti studiati hanno differenti applicazioni che vanno dalla chimica clinica alla nutraceutica. Visti gli standard richiesti per questi studi in termini di selettività, sensibilità ed accuratezza, il lavoro si è concentrato nella fase di sviluppo e validazione di metodi di analisi personalizzati, applicabili agli specifici sistemi investigati.
The present thesis deals with the development and validation of analytical methods based on chromatography coupled with mass spectrometry, which are aimed to the analysis of target molecules in complex matrices. The target compounds have different applications, ranging from the clinical chemistry to the nutraceutical field. Since the requested proper standards of selectivity, sensitivity and accuracy used to depend strongly on the selected application, several efforts have been dedicated to the phase of development and validation of highly customized analytical methods, suitable for the specific system under investigation.

Nel presente lavoro di Tesi è stato sviluppato un metodo analitico per la determinazione di anioni e cationi rispettivamente mediante cromatografia ionica accoppiata alla spettrometria di massa e cromatografia ionica con rivelazione conduttimetrica in campioni di aereosol atmosferico. Il metodo è stato validato valutando la linearità del segnale strumentale, limiti di rilevabilità e precisione strumentale, recuperi, accuratezza e ripetibilità della procedura analitica di preparazione dei campioni. Il metodo così ottenuto è stato applicato a campioni antartici raccolti in quattro campagne di campionamento condotte presso il sito costiero di "Mario Zucchelli Station" (estate 2010-11), il sito continentale di Concordia (estati 2011-12 e 2012-13) e presso nave Italica durante una campagna oceanografica (gennaio-febbraio 2012). I dati ottenuti sono stati quindi valutati al fine di studiare l'origine dell'aerosol marino e il comportamento durante il trasporto a lunga distanza.

Il particolato atmosferico è l’insieme di tutto il materiale solido e liquido disperso in atmosfera. Si classifica in base alle dimensioni delle particelle che lo compongono, alla sorgente di emissione che influisce anche sulla composizione chimica. Le sorgenti possono essere natuarali e/o antropiche. L’importanza di caratterizzare il particolato deriva dagli effetti che questo può avere non solo sull’uomo ma anche sul clima e sull’ambiente. Questo lavoro di tesi mira alla caratterizzazione qualitativa di campioni di aerosol provenienti dalla città di Belgrado (Serbia). Il campionamento è stato eseguito in un periodo di quattro mesi, da settembre a dicembre, e i campioni sono stati preparati e analizzati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) abbinata a spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS). Le analisi sono state effettuate operando in modalità positiva e negativa per consentire una più ampia caratterizzazione dei campioni. Questo ha portato all’isolamento di un numero molto alto di composti per i quali è stato possibile, grazie a vari software dedicati all’indagine metabolomica, indicare una formula bruta e in alcuni casi anche la formula di struttura e una denominazione. Sono inoltre state effettuate delle analisi statistiche al fine di interpretare le correlazioni tra gli analiti, e raggrupparli in classi di composti che caratterizzano una particolare fonte di emissione.