Thèses sur le sujet « Spettrometria di Massa Imaging »

BACKGROUND Cardiovascular diseases are the world’s number one death cause, accounting for 17.1 million deaths a year. There is still much unknown about cardiovascular diseases and their physiological underlying mechanism. Understanding the nature of complex biological processes occurring in both healthy and diseased heart tissue requires identifying the compounds involved and determining where they are located. Summary METHODS We have investigated a complementary mass spectrometry imaging (MSI) approach using matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) and secondary ion mass spectrometry (SIMS) on the major areas of rat heart: the pericardium, the myocardium, the endocardium, and the great vessels to study the native distribution and identity of atomics, lipids, peptides and proteins in rat heart sections. 40 layers of horizontal tissue slices were acquired and reconstructed into a 3 D dataset. RESULTS Surface rastering of heart tissue sections generated multiple secondary ions in a mass range up to 1500 m/z. In the negative spectra we identified cholesterol related ions that show high intensity in both atrias, the aorta, the pulmonary artery and the outline both ventricles. The m/z 105 (choline) signal localizes in both atrias, aorta, pulmonary artery, in the atrioventricular valves and semilunar valves but is not present in ventricles surface. DAG species with probable identifications as Oleic, Linoleic [OL]+ at m/z 602 and [OO]+ (Oleic, Oleic) at m/z 604, can be detected. The images of 3D reconstruction show a highly complementary localization between Na+, K+, ion at m/z 145 and ion at m/z 667. Na+ is localized to tissue regions corresponding to atrias, while K+ is strongly localized to tissue regions corresponding to ventricles surface.The ion at m/z 667 localized very precisely within the aortic wall and the ion at m/z 145 is primarily located to the atria regions. CONCLUSIONS To promote further research with cardiovascular disease, we report the identification of characteristic molecules that map the spatial organization in a rat heart’s structure. A series of images obtained from successive sections of animal heart could, in principle, be used to produce a molecular atlas. Such tissue atlases (based optical images) are widely used for anatomical and physiological reference. The specific aim of this project is to optimize the data obtained from Heart SIMS a analysis and the 3-D reconstructive techniques developed to aid in investigating and visualizing differential molecular localizations in heart rat structures. The results reported here represent the first 3D molecular reconstruction of rat heart by SIMS imaging.
Introduzione Le malattie cardiovascolari rappresentano nel mondo la prima causa di morte, contando 17.1 milioni di morti ogni anno. Attualmente i meccanismi fisiopatologici alla base delle patologie sono in larga parte ancora sconosciuti. Capire la natura dei complessi processi biologici in atto sia nel miocardio cardiaco sano che malato richiede l’identificazione e la localizzazione degli stessi elementi molecolari coinvolti. METODO Utilizzando tecniche complementari di spettrometria di massa d’immagine (SMI) quali la spettrometria di massa a ioni secondari (Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS) e la spettrometria di massa a desorbimento /ionizzazione laser assistita da matrice (Matrix-assisted laser desorption/ionization, MALDI) abbiamo analizzato le principali componenti del cuore del ratto: il pericardio, il miocardio, l’endocardio, le valvole e i grandi vasi al fine di studiare ed identificare l’originale distribuzione di atomi, lipidi, peptici e proteine nel tessuto cardiaco normale. Quaranta sezioni di tessuto cardiaco sono state acquisite e ricostruite ottenendo un database tridimensionale. RISULTATI L’analisi della superficie delle sezione di tessuto cardiaco ha generato molteplici ioni secondari con un intervallo di massa che raggiunge i 1500 m/z. Utilizzando la modalita’ negativa abbiamo identificato il colesterolo e gli ioni relativi ad esso che mostrato un alta intensita’ in entrambi gli atri, l’aorta, l’arteria polmonare e pericardio. La colina corrispondente a 105 m/z di massa molecolare risulta essere localizzata in entrambi gli atri, aorta, arteria polmonare, valvole atrioventricolari e valvole semilunari ma non risulta essere presente sulla superficie ventricolare. Sono state identificate molecole appartenenti al diacilglicerolo come acido Oleico, Linoleico [OL]+ corrispondenti alla massa molecolare di 602 m/z e [OO]+ (Oleico,Oleico) con massa molecolare di 604 m/z. Le immagini ottenute dalla ricostruzione tridimensionale mostrano una specifica localizzazione complementare tra il sodio, il potassio e gli ioni con massa molecolare di 145 m/z e 667 m/z. Il sodio e’maggiormente localizzato nelle regioni cardiache corrispondenti agli atri, mentre il potassio e’ maggiormente localizzato nelle regioni corrispondenti alla superficie ventricolari. Lo ione con massa molecolare di 667 m/z e’ localizzato con molta precisione all’interno della parete dell’aorta e lo ione con massa molecolare di 145 m/z e’ localizzato a livello delle regioni atriali. CONCLUSIONI Al fine di promuovere un’ulteriore ricerca in patologia cardiovascolare, riportiamo l’identificazione delle caratteristiche molecole che mappano l’organizzazione spaziale delle strutture cardiache del cuore del ratto. Una serie di immagini ottenute da sezioni successive del cuore potrebbero inizialmente essere utilizzate come un atlante molecolare e similmente, ad un atlante basato sulle immagini ottiche, essere ampiamente utilizzato come referente sia dal punto di vista fisiologico che anatomico. L’aiuto apportato da questo progetto e’ l’ottimizzazione dei dati ottenuti dall’analisi SIMS e lo sviluppo della tecnica per la ricostruzione tridimensionale al fine di investigare e visualizzare le differenti molecole localizzate nelle strutture del cuore di ratto. I risultati qui riportati rappresentano la prima ricostruzione tridimensionale ottenuta con immagini SIMS, del cuore di ratto.

The PhD thesis is focused on the evaluation of different Mass Spectrometry approaches for the study of the proteome of biological fluids and tissues. In detail, the ClinProt technology has been applied to amniotic fluids and urines respectively, to evaluate potential biomarkers for the preterm premature rupture of the membranes (pPROM) and to invetsigate molecular mechanisms of kidney adaptation to hypobaric hypoxia conditions at high and very high altitude. MALDI Imaging Mass Spectrometry (IMS) has been applied for the study of tissues. In detail, this part of the work evaluated the use of the detergents to enhance sensitivity and number of peaks detected for protein IMS analysis.

The aim of this thesis concerning the setting of new methods to study methabolic pathaways in vivo using both stable isotope tracer (113C-leucine and D2O) both stable isotope at natural abundance. First chapter reports a new method to measure absolute and percentage of AA and DHA synthesis. Preterm infants were fed with a formula enriched in AA and DHA with a higher content of 13C than did the endogeusly sinthesized long chain fatty acids (LCP). The second chapter reports a new menthod to measure SP-B synthesis in vivo in humans by means of stable isotopes. We administered a 24 h infusion of 13C-Leucine as metabolic precursor of SP-B and 2H2O as precursor of dipalmitoyl phosphatidylcholine (DSPC).
Obiettivo di questa tesi è stato l’applicazione sia di isotopi stabili ad abbondanze naturali sia di traccianti marcati con isotopi stabili (113C-leucina e D2O) per lo studio di diverse vie metaboliche, quali la sintesi, di acidi grassi, nel bambino pretermine e la sintesi proteica e lipidica nell’adulto. Il primo studio ha visto l’utilizzo di una dieta arricchita con due acidi grassi che presentavano un’abbondanza naturalmente diversa di 13C rispetto a quella degli altri acidi grassi per determinare, per un lungo periodo di tempo, la sintesi assoluta e in percentuale di questi due acidi grassi nei bambini pretermine. Nel secondo studio abbiamo utilizzato leucina marcata con 13C e acqua marcata con deuterio per determinare il metabolismo della fosfatidilcolina disatura (DSPC) e della proteina specifica B del surfattante (SP-B).

Mycotoxins are heterogeneous chemical compounds characterized by a low molecular weight and synthesized by the secondary metabolism of different molds. Fumonisins are water-soluble mycotoxins produced by Fusarium species spoiling corn and derived produc ts. These mycotoxins can be a health hazard when consuming contaminated cereals, but they can reach humans also indirectly through the consumption of food products derived from animals fed with contaminated feed. Fumonisins have been associated with several animal and human diseases: they are suspected risk factors for esophageal and liver cancers, neural tube defects and cardiovascular problems. Improved methods are needed to accurately assess fumonisins concentrations in food of vegetable and animal origin, in order to prevent acute and chronic human exposure. The aim of the present work was to evaluate the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis from foods and matrices of animal origin. Different methods for the identification and quantification of fumonisins and related products have been developed and validated to determine fumonisin B1 in milk, fumonisin B1, fumonisin B2 and their complete hydrolyzed products (HFB1 and HFB2) in pig liver and fumonisins B1 and B2 in complete and complementary dry dog food. The experimental procedures have been carefully studied, considering matrices features, number and type of molecules to detect. Therefore, several extraction, clean up and separation techniques were tested in order to obtain the better conditions of sample processing. The fit for purpose sample preparation, matched with high mass spectrometry sensibility and specificity, have allowed to achieve good results in any tested animal matrices. Hence, the developed methods were validated and have shown a high accuracy, sensibility and precision, fulfilling performance requirements of Decision 2002/657/EC and of European Project Standard, Measuring and Testing (SMT). In any developed method, the analytes were identified and quantified even at very low concentrations : the limits of quantification resulted lower than other similar works, performed with different detectors. These methods were applied to some commercial samples and to some samples collected for research projects in the Department of Veterinary Public Health and Animal Pathology (DVPHAP) of University of Bologna. Although the disclosed data must be considered completely preliminary and without statistical significance, they emphasize the presence of mycotoxins in animal products. The outcomes obtained from the processed samples (bovine milk, pig liver and dry dog food) suggest the efficacy of these methods also on other food matrices, confirming the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis. Moreover the results underline the need to set up a large scale monitoring in order to evaluate the presence of fumonisins in food of animal origin for human consumption.

Mycotoxins are heterogeneous chemical compounds characterized by a low molecular weight and synthesized by the secondary metabolism of different molds. Fumonisins are water-soluble mycotoxins produced by Fusarium species spoiling corn and derived produc ts. These mycotoxins can be a health hazard when consuming contaminated cereals, but they can reach humans also indirectly through the consumption of food products derived from animals fed with contaminated feed. Fumonisins have been associated with several animal and human diseases: they are suspected risk factors for esophageal and liver cancers, neural tube defects and cardiovascular problems. Improved methods are needed to accurately assess fumonisins concentrations in food of vegetable and animal origin, in order to prevent acute and chronic human exposure. The aim of the present work was to evaluate the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis from foods and matrices of animal origin. Different methods for the identification and quantification of fumonisins and related products have been developed and validated to determine fumonisin B1 in milk, fumonisin B1, fumonisin B2 and their complete hydrolyzed products (HFB1 and HFB2) in pig liver and fumonisins B1 and B2 in complete and complementary dry dog food. The experimental procedures have been carefully studied, considering matrices features, number and type of molecules to detect. Therefore, several extraction, clean up and separation techniques were tested in order to obtain the better conditions of sample processing. The fit for purpose sample preparation, matched with high mass spectrometry sensibility and specificity, have allowed to achieve good results in any tested animal matrices. Hence, the developed methods were validated and have shown a high accuracy, sensibility and precision, fulfilling performance requirements of Decision 2002/657/EC and of European Project Standard, Measuring and Testing (SMT). In any developed method, the analytes were identified and quantified even at very low concentrations : the limits of quantification resulted lower than other similar works, performed with different detectors. These methods were applied to some commercial samples and to some samples collected for research projects in the Department of Veterinary Public Health and Animal Pathology (DVPHAP) of University of Bologna. Although the disclosed data must be considered completely preliminary and without statistical significance, they emphasize the presence of mycotoxins in animal products. The outcomes obtained from the processed samples (bovine milk, pig liver and dry dog food) suggest the efficacy of these methods also on other food matrices, confirming the versatility and the performances of mass spectrometry, coupled with liquid chromatography, in fumonisins analysis. Moreover the results underline the need to set up a large scale monitoring in order to evaluate the presence of fumonisins in food of animal origin for human consumption.

L’interesse per lo sviluppo di nuovi metodi e per l’applicazione di tecniche ifenate è generato dalla necessità di caratterizzare campioni biologici complessi. Questo lavoro affronta l’applicazione e la messa a punto di tecniche ifenate allo scopo di: a) identificare un nuovo biomarcatore da associare al PSA (Prostate Specific Antigen) per la diagnostica del cancro prostatico, b) sviluppare una nuova tecnica ifenata per l’analisi di glicosfingolipidi. Negli studi di proteomica clinica, destinati all’identificazione di nuovi biomarcatori, i maggiori problemi sono legati all’incompatibilità dell’intervallo di sensibilità degli strumenti di rivelazione con l’intervallo di concentrazione delle specie proteiche e peptidiche presenti nei fluidi biologici. Pertanto, poiché l’intervallo di sensibilità degli strumenti di rivelazione non può essere variato, il passaggio cruciale è rappresentato dalla riduzione dell’intervallo di concentrazione tra le specie più abbondanti e le specie meno abbondanti nei fluidi biologici in esame. Nel caso del siero ciò è stato ottenuto grazie all’eliminazione della frazione contenente le proteine a maggior abbondanza mediante immunodeplezione selettiva. Le frazioni seriche a bassa abbondanza preparate da 30 pazienti affetti da cancro alla prostata (ADK) e da 30 soggetti controllo sono state analizzate tramite MALDI profiling. La metodica applicata ha permesso di individuare delle differenze statisticamente significative nell’espressione di alcune componenti proteiche, rivelate dalla presenza di picchi differenzialmente espressi negli spettri di massa ottenuti. Tuttavia, il punto fondamentale per il trasferimento dei risultati ottenuti in diagnostica clinica è rappresentato dall’identificazione delle specie proteiche contenute nel profilo di massa MALDI al fine di poter utilizzare tecniche immunometriche per la validazione dei dati e sviluppare metodi di dosaggio su larga scala applicabili in diagnostica clinica. Grazie all’ifenazione tra tecniche cromatografiche, quali la cromatogafia per gel filtrazione e la cromatografia a fase inversa, condotte rispettivamente su uno strumento HPLC e su uno strumento nano LC, e tecniche di spettrometria di massa MALDI, è stato possibile identificare il picco 2021 m/z, statisticamente variato, che corrisponde al peptide C3f, derivato dalla proteolisi del fattore del complemento C3, e la sua aumentata espressione in pazienti ADK+ a bassi valori di PSA, è stata confermata attraverso un esperimento di immunoblotting. I risultati sono stati validati su un secondo gruppo di pazienti e controlli. L’aumento di tale peptide indica una deregolazione del fattore del complemento C3 che viene inattivato a iC3b, il quale inibisce il ciclo della via alternativa del sistema del complemento impedendo l’associazione del fattore C3b al fattore B. Il peptide C3f potrebbe pertanto essere usato in associazione con il valore serico di PSA per ridurre il numero di pazienti “falsi negativi”. Un altro aspetto importante della ricerca biomedica e indirettamente della diagnostica clinica è rappresentato da una classe di molecole di segnale che si sono rivelate importanti in numerose patologie quali malattie cardiovascolari e neurodegenerative, tumori, malattie d’accumulo lisosomiale e sindrome metabolica. Nonostante il crescente interesse clinico, l’analisi dei glicosfingolipidi non gode di tecnologie ad alta automazione che permettano una facile identificazione e quantizzazione di specie con pesi molecolari spesso molto simili. Attualmente tale caratterizzazione avviene tramite l’utilizzo di precursori radioattivi, oppure di coloranti che non permettono una quantizzazione precisa, o di metodi III LC-MS di grande precisione ma dispendiosi in termini di tempo e di coinvolgimento dell’operatore. Attraverso l’ifenazione diretta HPTLC-MALDI, è stato possibile effettuare una fine analisi qualitativa e quantitativa del profilo glicosfingolipidomico estratto da mioblasti murini, distinguendo per ogni glicosfingolipide tutte le varianti a diversa catena di acido grasso presenti. Un aspetto importante è che lo sviluppo metodologico è stato accoppiato ad una analisi di campioni biologici i cui risultati sono stati confrontati con quelli precedentemente ottenuti attraverso l’utilizzo di precursori radioattivi e successiva analisi densitometrica su glicosfingolipidi estratti da mioblasti wild-type e overesprimenti la sialidasi NEU3. Pertanto, l’ifenazione proposta si è rivelata di grande applicabilità alla caratterizzazione dei glicosfingolipidi in quanto riduce i passaggi analitici necessari evitando l’uso di precursori radioattivi e di procedure di estrazione della banda dal gel di silice, e potrà essere applicata allo studio di diverse condizioni fisiologiche e patologiche per identificare potenziali biomarcatori.
The interest for the development of new methods and the application of hyphenated techniques for complex biological samples characterization is growing, nowadays, more and more. This work faces the application and setup of hyphenated techniques with two aims: a) to identify a new biomarker that can be associated to PSA (Prostate Specific Antigen) for prostate cancer (ADK) diagnosis, b) to develop a hyphenated technique for glycosphingolipids analysis. In clinical proteomics, the identification of new biomarkers is hampered by the discrepancy between the quantitative range of detection of instruments and the concentration range of proteins and peptides in biological fluids. Since the quantitative range of detection of instruments cannot be changed, the critical point is to reduce the dynamic range in examined biological fluids. In serum, this can be obtained by the elimination of high abundant proteins thanks to a selective immunodepletion. The serum low abundant protein fraction from 30 ADK patients and 30 controls was analyzed by MALDI profiling. The applied methodology was able to detect differentially abundant peaks in spectra of ADK vs no ADK controls. To transfer the obtained results in clinical diagnostic, the identification of species revealed by MALDI profiles is mandatory for two main reasons: data validation through the use of immunometric techniques and methodological development for a large scale test. Thanks to the hyphenation between chromatografic techniques, such as gel filtration on a HPLC and reverse phase on a nanoLC, and MALDI mass spectrometry, we were able to identify the highly changed 2021 m/z peak, that corresponds to C3f peptide and that derives from the proteolyses of Complement C3b. To confirm its increment in ADK patients with low PSA values an immunoblotting experiment was conducted. The results were validated on a second group of patients and controls. The increase of C3f expression could be related to a deregulation of C3 complement, cleft to iC3b, that inhibits the selffeeding cycle of the alternative pathway hampering the association of C3b to factor B. Therefore C3f peptide could be used in association to PSA serum value to decrease the number of “false negative”. An important aspect of the biomedical research and, indirectly, of clinical diagnostic is represented by a class of signal molecules that are important in a number of diseases, including neurological and cardiovascular disorders, cancer, lipid storage diseases, and the metabolic syndrome. Despite the increasing clinical interest, glycosphingolipids (GSLs) analysis cannot benefit by high-throughput techniques that allow an easy identification and quantitation of these species, characterized by similar molecular weights. Actually, their characterization is based on radioactive counts after metabolic radiolabeling, or on staining with proper dyes that doesn’t allow a precise quantitation. New approaches including LC-MS are largely used but they are time consuming and operator dependent. We develop the direct hyphenation HPTLC-MALDI, to obtain a precise qualitative and quantitative analysis of the glycosphingolipids profile from murine myoblasts, and to distinguish every fatty acid chain variant for each GSL. An important aspect is that the methodological setup was coupled to biological samples analysis and results were compared to those obtained through the use of radioactive precursors and densitometric analysis on GSLs extracted from wild type and NEU3 overexpressing murine myoblasts. The proposed hyphenation is of great applicability to the glycosphingolipids characterization because it reduces the V analytical steps, it avoids the use of radioactive precursors and silica scraping, and it could be applied to the study of different physiological and pathological conditions to identify potential biomarkers.

Abstract Background and purposes The obstructive pulmonary diseases in the world – among which asthma and the chronic obstructive pulmonary disease (COPD) – have been growing constantly. In 2006 about 46 million persons suffered from asthma, and 9.5 millions were children; the COPD has also been growing constantly and, despite the fact that the incidence increases with age, it looks like several factors and previous childhood diseases can influence the subjects’ respiratory function and the evolution of the disease. Despite the many studies that have been carried out, it is not clear yet what are the mechanisms on which these respiratory diseases are based, and therefore further investigations must be made. Mass spectrometry, a sensitive and robust analytic technique, has found more and more applications in the clinical-diagnostic field, thanks to its capacity to determine the metabolites in the biological samples with a mass value or to identify their structure through fragmentation with extremely sensitive, specific and selective characteristics. The possibility to analyze complex blends, thanks to combination with gas or liquid chromatographic techniques, reduced analysis time, the qualitative identification but above all the quantitative dosages of several biomarkers in a single analysis, has made this technique preferable for clinical studies. Especially, besides the classical target approach used to quantify already known or presumably proper to certain pathologies specific compounds, over the past years a new type of approach has developed, the so called untargeted approach, known as “metabolomic”, which sees the study of the entire metabolic profile of a biological sample, by means of highly sensitive and precise analytic techniques, such as high resolution mass spectrometry (HMS). This approach allows the characterization of the general metabolic profile of a group of subjects with a specific pathology as compared to a group of control and extracts the discriminating variables, thanks to multivariate statistic analysis techniques. The untargeted analysis, which is not based upon prior hypotheses, can open the doors to new etiopathological hypotheses, besides helping identify the diagnostic and prognostic biomarkers. The purpose of this PhD thesis was to study the infant obstructive respiratory diseases by applying both of these approaches to urine or exhaled breath condensate (EBC) samples. The EBC is a biofluid which, given the extremely non invasive method of collecting it, represents an ideal biological matrix for studies of the kind, but, since the metabolite concentration is extremely low, is at the same time an analytically complex matrix. Methods and results In the first study, the HRMS metabolomic analysis of the EBC was employed to investigate upon the biochemical-metabolic profile of the EBCs of teenagers diagnosed with bronchopulmonary dysplasia (BPD)from birth as compared to a group of healthy teenagers. The samples were analyzed with the LTQ-OrbiTrap mass spectrometer and processed by means of the multivariate statistic analysis. The results have demonstrated that it is possible to discriminate the BPD group from the control group by marking out the EBC samples, obtaining a robust OPLS-DA model (R2: 0.95, Q2:0. 82), indicating how the teenagers who were affected by BPD from birth have a different biochemical-metabolic profile. The individuation of the glycerophospholipids, among the several discriminating variables, has suggested a possible involvement of the alveolar surfactant at the basis of the minor respiratory function in the BPD affected patients, even years later after the severe phase of the disease. The second study employed the HRMS metabolomic in order to obtain a first biochemical-metabolic characterization of children with frequent bronchospasm or with wheezing in preschool age, in view of a perspective study which would help appreciate which of these children will develop asthma when growing up, and, a posteriori, consider whether prognostic biomarkers exist. The preliminary results of this part of the study have been encouraging: thanks to the analysis of the urine samples with the hybrid Q-TOF mass spectrometer associated to the UPLC, we have had a clear distinction of the subjects affected by wheezing as compared to healthy children, through an OPLSA- DA model. The preliminary analysis has allowed to obtain a clear distinction between children who suffered from wheezing and healthy children, highlighting some discriminating molecules. The study is still ongoing since it presupposes the evaluation of the same subjects 18 and 36 months later. The third part of the study was related to the use of the target MS and was meant to evaluate and quantify some oxidative stress indicators in EBC samples belonging to subjects affected by asthma. A UPLC-MS/MS method was developed and validated for the quantitative analysis of the dimethyl arginine, ADMA and SDMA, in samples of EBC. The analysis was conducted by means of MRM technique in quadrupole mass spectrometry associated to UPLC, with a on line sample enrichment system. The analytic system has come out robust (r2>0.992, %Bias <3% intra- CV% inter-intra assay =20%, recovery between 97 and 102%), rapid (5 minutes chromatographic run) and sensitive, also suitable for the analysis of diluted biological samples, such as the EBCs. The quantification of these metabolites, conducted on samples of asthmatic and healthy children, has pointed out a rise of the ADMA in the EBCs of the asthmatic subjects, indicating a role of the ADMA in the tissue damage of the respiratory tract which typically characterizes the bronchial asthma. Conclusions This research has demonstrated that instrumentally highly sensitive mass spectrometry, which has allowed us to obtain significant information even from small quantities of samples and from extremely diluted matrixes, can be successfully applied to the study of obstructive respiratory diseases, making the follow up studies easier, and also helping medical doctors identify possible markers useful to the diagnosis and/or new therapeutic targets.
Background e obiettivi Le pneumopatie ostruttive nel mondo, tra cui asma e bronco pneumopatia cronica ostruttiva (COPD), sono in continua crescita. Nel 2006 circa 46 milioni di persone erano affette da asma, di cui 9.5 milioni erano bambini; anche la COPD è in continuo aumento e, anche se l’incidenza cresce con l’età anagrafica, sembra che diversi fattori e malattie pregresse dell’infanzia, possano influenzare la funzionalità respiratoria dei soggetti e l’evolvere della patologia. Nonostante i molti studi condotti, i meccanismi alla base di queste malattie respiratorie non sono ancora del tutto chiariti, e necessitano pertanto di ulteriori indagini. La spettrometria di massa, tecnica analitica sensibile e robusta, trova sempre più applicazioni in ambito clinico-diagnostico, grazie alla capacità di determinare i metaboliti presenti nei campioni biologici dai valori di massa o identificarne la struttura tramite frammentazione con caratteristiche di estrema sensibilità, specificità e selettività. La possibilità di analisi di miscele complesse, grazie all’accoppiamento con tecniche cromatografiche gassose o liquide, i tempi di analisi ridotti, l’identificazione qualitativa ma soprattutto i dosaggi quantitativi anche di numerosi biomarcatori in una singola analisi, ha reso questa una tecnica di elezione per studi clinici. In particolare oltre al classico approccio target per quantificare specifici composti già noti o che si suppone siano caratteristici di una patologia, negli ultimi anni si è sviluppato un nuovo tipo di approccio untargeted, noto come “metabolomica”, che vede lo studio dell’intero profilo metabolico di un campione biologico, attraverso tecniche analitiche altamente sensibili e ad elevata capacità, quali la spettrometria di massa ad alta risoluzione (HMS). Tramite questo approccio è possibile caratterizzare il profilo metabolico generale di un gruppo di soggetti con una determinata patologia rispetto ad un gruppo di controllo ed estrapolare le variabili discriminanti, grazie a tecniche statistiche di tipo multivariato. L’analisi untarget, non basata su ipotesi a priori, può aprire la strada a nuove ipotesi eziopatologiche oltre ad aiutare nell’identificazione di biomarkers diagnostici e prognostici. Obiettivo di questo dottorato era studiare le pneumopatie ostruttive in età pediatrica mediante l’applicazione di entrambi questi approcci, su campioni di urine o condensato di aria espirata (EBC). L’EBC è un biofluido che, data la sua raccolta assolutamente non invasiva, costituisce una matrice biologica ideale per studi di questo tipo, ma essendo la concentrazione dei metaboliti estremamente bassa, risulta al tempo stesso una matrice analiticamente complessa. Metodi e risultati Nel primo studio, l’analisi metabolomica HMS dell’EBC è stata impiegata per indagare il profilo biochimico-metabolico degli EBC di adolescenti con diagnosi di broncodisplasia alla nascita (BPD) rispetto a quello di un gruppo di adolescenti sani. I campioni sono stati analizzati con lo spettrometro di massa LTQ-OrbiTrap e processati tramite analisi statistica multivariata. I risultati ottenuti hanno mostrato che è possibile discriminare il gruppo BPD dal gruppo di controllo attraverso la caratterizzazione dei campioni di EBC, ottenuta con un modello OPLS-DA robusto (R2:0.95, Q2:0.82 ), mostrando un differente profilo biochimico-metabolico negli adolescenti con BPD alla nascita. L’individuazione di glicerofosfolipidi, tra le variabili discriminanti, ha suggerito un possibile coinvolgimento del surfattante alveolare alla base della minore funzionalità respiratoria dei soggetti con BPD, anche dopo anni dalla fase acuta della malattia. Il secondo studio ha previsto l’utilizzo della metabolomica HRMS per ottenere una prima caratterizzazione biochimica-metabolica dei bambini con broncospasmo ricorrente o wheezing in età prescolare, in vista di uno studio prospettico per valutare quali di questi bambini svilupperà asma con la crescita, e considerare a posteriori se esistano dei biomarkers prognostici. I risultati preliminari di questa parte dello studio sono stati promettenti: grazie all’analisi di campioni di urina con lo spettrometro di massa ibrido Q-TOF associato ad UPLC, si è ottenuta une netta differenziazione dei soggetti con wheezing rispetto ai bambini sani, mediante un modello OPLSA- DA. L’analisi preliminare ha permesso di ottenere una netta separazione tra bambini con wheezing e bambini sani, mettendo in evidenza alcune molecole discriminanti. Lo studio è ancora in corso in quanto prevede la valutazione degli stessi soggetti a 18 e 36 mesi. La terza parte dello studio relativa all’utilizzo della MS target prevedeva la valutazione e quantificazione di alcuni indicatori di stress ossidativo in campioni di EBC di soggetti asmatici. È stato sviluppata e validata una metodica UPLC-MS/MS per l’analisi quantitativa di dimetilarginine, ADMA e SDMA, in campioni di EBC. L’analisi è stata condotta tramite tecnica MRM in spettrometria di massa quadrupolare associata ad UPLC, con sistema di arricchimento on-line del campione. Il sistema analitico è risultato robusto (r2>0.992, %Bias <3% intra- CV% inter-intra assay =20%, recovery% tra 97 e 102%), rapido (corsa cromatografica di 5 minuti), e sensibile, adatto anche ad analisi di campioni biologici diluiti quali gli EBC. La quantificazione di tali metaboliti condotta su campioni di bambini asmatici e sani, ha mostrato un aumento di ADMA negli EBC dei soggetti asmatici, indicando un ruolo dell’ADMA nel danno tissutale delle vie aeree tipico dell’asma bronchiale. Conclusioni Questa ricerca ha dimostrato che la spettrometria di massa ad elevata sensibilità strumentale, grazie alla quale è stato possibile ottenere informazioni significative anche da piccole quantità di campione e da matrici estremamente diluite, può essere applicata con buoni risultati alla studio di pneumopatie ostruttive, rendendo più facili studi di follow up, oltre che aiutare il medico nell’individuare possibili marcatori utili alla la diagnosi e/o nuovi target terapeutici.

La tesi presentata riguarda lo sviluppo e la validazione di metodi analitici basati su cromatografia accoppiata a spettrometria di massa utilizzati per l'analisi di molecole target in matrici complesse. Gli analiti studiati hanno differenti applicazioni che vanno dalla chimica clinica alla nutraceutica. Visti gli standard richiesti per questi studi in termini di selettività, sensibilità ed accuratezza, il lavoro si è concentrato nella fase di sviluppo e validazione di metodi di analisi personalizzati, applicabili agli specifici sistemi investigati.
The present thesis deals with the development and validation of analytical methods based on chromatography coupled with mass spectrometry, which are aimed to the analysis of target molecules in complex matrices. The target compounds have different applications, ranging from the clinical chemistry to the nutraceutical field. Since the requested proper standards of selectivity, sensitivity and accuracy used to depend strongly on the selected application, several efforts have been dedicated to the phase of development and validation of highly customized analytical methods, suitable for the specific system under investigation.

Nel presente lavoro di Tesi è stato sviluppato un metodo analitico per la determinazione di anioni e cationi rispettivamente mediante cromatografia ionica accoppiata alla spettrometria di massa e cromatografia ionica con rivelazione conduttimetrica in campioni di aereosol atmosferico. Il metodo è stato validato valutando la linearità del segnale strumentale, limiti di rilevabilità e precisione strumentale, recuperi, accuratezza e ripetibilità della procedura analitica di preparazione dei campioni. Il metodo così ottenuto è stato applicato a campioni antartici raccolti in quattro campagne di campionamento condotte presso il sito costiero di "Mario Zucchelli Station" (estate 2010-11), il sito continentale di Concordia (estati 2011-12 e 2012-13) e presso nave Italica durante una campagna oceanografica (gennaio-febbraio 2012). I dati ottenuti sono stati quindi valutati al fine di studiare l'origine dell'aerosol marino e il comportamento durante il trasporto a lunga distanza.

Renal cell carcinoma accounts for about 85% of primary kidney tumors and its incidence worldwide is increasing rapidly. Although the diagnosis of RCC is routinely performed by means of multiple imaging techniques, benign solid renal masses sometimes cannot be confidently differentiated from malignant ones. Moreover, the TNM (Tumor-Node-Metastasis) classification system, the Fuhrman grading system and serum markers are still the main factors used to predict the outcome of patients. For these reasons, RCC still remains a significant clinical challenge not only in terms of early diagnosis but also clinical management. Moreover, since the main alterations in regulation processes caused by tumorigesis not only involve genes but also proteins, MS-based protein profiling is considered an effective approach both for the discovery of multiple biomarkers and for the detection of disease specific modifications. Therefore, this PhD project has been focused on the study and characterisation of the urinary peptidome and proteome of RCC patients, patients affected by other kidney neoplasms and control subjects in order to evaluate potential molecular signatures capable of characterising renal cancers. For this purpose, sistematic analysis at the peptidome level employing a protein profiling approach based on MALDI-TOF mass spectrometry analysis combined with pre-purification step of urine samples using functionalized magnetic beads, has been performed. This technique has allowed, on one hand, to build models of potential biomarkers able to discriminate not only ccRCC patients from controls, but also to significantly distinguish malignant renal masses from benign forms and, on the other hand, to highlight alterations of endogenous peptides according to clinical data (stage, grade, dimension). The identification of discriminant and/or tumor progression related signals has been obtained through a nLC-ESI MS/MS approach on urine pools of 80 healthy volunteers and 80 RCC patients. For the proteomic analysis, a tryptic digestion of urine samples using the FASP (Filter Aided Sample Preparation) protocol followed by shotgun analysis by nanoUHPLC-ESI MS/MS has been performed. The relative label-free quantification has facilitated the investigation of protein alterations in ccRCC subjects. The subsequent functional analysis has highlighted the bological processes and the molecular functions in which the varied proteins are involved. Moreover, in the study of a complex system such as the kidney, a systematic comparison between different –omic sciences (peptidomics/proteomics) could highlight functions, biological processes and molecular targets that are implicated in the deregulation caused by the presence of the tumor and for this reason an integration of the collected data has been performed in order to identify potential targets and biological effectors that could improve the understanding of the intricate and multifactorial mechanisms underlying kidney malignancies.

Background. Hepcidin (Hep) has emerged as the primary regulator of iron homeostasis. Previous studies on assessing urinary levels of Hep are of limited availability. We have developed a new method for quantifying Hep in plasma by SELDI-TOF mass spectrometry, using the 25-AA peptide as reference standard. Aims: 1) to assess the performance of this new method in different conditions of iron metabolism disorders; 2) to assess the diagnostic validity of non invasive serum markers in identifying iron overload. Methods: the following groups of subjects were enrolled into the study: 1. type I hemochromatosis (HE)(n=10), NAFLD (n=17), chronic hepatitis C (n=10), healthy controls - previously enrolled in a general population epidemiological study - with normal ultrasound, normal LFTs, alcohol assumption <20 g ethanol/day, and negative for C282 mutations (n=155). The following parameters were assayed in each case: plasma Hep, C282Y and H63D mutations of the HFE gene by (Taqman chemistry); serum iron, ferritin (SF), transferrin saturation (TfSat), transaminases, GGT, glucose, insulin, total cholesterol, HDL-cholesterol, LDL-cholesterol, triglycerides. Results: Plasma Hep levels were significantly higher in HCV+ (26.3 + 7.2 nmol/L) pts compared to controls (12.3+ 1.0)(one-way ANOVA: F=3.2, p<0.05), and were positively correlated with SF (r=0.451, p<0.001). H63D heterozygous subjects revealed a pattern of iron overload (significantly higher serum iron, SF, TfSat, and lower Hep/SF ratio) compared to H63D wild type subjects. By analysing data with the Biomarker Pattern 5.0.2. Software, in order to identify the most significant discriminant markers between HE and controls, we obtained a four-terminal node algorithm which included as main splitters Hep/SF ratio, glucose and iron. These variables allowed a correct diagnosis of HE with a 100% sensitivity, 98.6% specificity and AUROC=0.993. Conclusions: The new plasma Hep mass spectrometry method yields accurate measurements which reflect pathologic and genetic influences; simple non invasive markers (Hep/SF ratio, glucose and iron) can predict the presence of HE.
Introduzione. L'Epcidina (Hep) si ritiene essere il principale regolatore dell'omeostasi del ferro. Precedenti studi sul dosaggio urinario dell'Hep sono limitati. Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per quantificare Hep nel plasma attraverso la spettrometria di massa SELDI-TOF, utilizzando come standard di riferimento il peptide di 25-AA. Obiettivi. 1) valutare la performance di questa nuova metodica in diverse condizioni di alterazione del metabolismo del ferro; 2) valutare la validità diagnostica di una marker sierico non invasivo per identificare il sovraccarico di ferro. Metodi. I seguenti gruppi di soggetti sono stati arruolati nello studio: 1. Emocromatosi di tipo I (HE) (n=10), NAFLD (n=17), epatite C cronica (n=10), controlli sani - precedentemente reclutati in uno studio epidemiologico sulla popolazione generale - con ecografia epatica non patologica, funzionalità epatica normale, introito alcolico <20 g etanolo/die, e negativi per la mutazione C282 (n=155). I seguenti parametri sono stati saggiati in ciascun caso: Hep plasmatica, mutazioni C282Y e H63D del gene HFE attraverso sonde Taqman; ferro sierico, ferritina (SF), satuazione della transferrina (TfSat), transaminasi, GGT, glucosio, insulina, colesterolo totale, colesterolo HDL, colesterolo LDL, trigliceridi. Risultati. I livelli plasmatici di Hep sono risultati significativamente più elevate nei soggetti HCV+ (26.3 + 7.2 nmol/L) rispetto ai controlli sani (12.3+ 1.0) (one-way ANOVA: F=3.2, p<0.05), e sono risultati positivamente correlati con SF (r=0.451, p<0.001). I soggetti eterozigoti per H63D hanno dimostrato un pattern di sovraccarico di ferro (livelli significativamente più elevati di ferro sierico, SF, TfSat, e un più basso rapporto Hep/SF) rispetto ai soggetti H63D-wild type. Dall'analisi dei dati con il Software Biomarker Pattern 5.0.2., per identificare il marker discriminante più significativo tra HE e i controlli, abbiamo ottenuto un algoritmo a 4 nodi che include come splitter principali il rapporto Hep/SF, il glucosio ed il ferro. Queste variabili sono sufficienti per diagnosticare correttamente HE con il 100% sensibilità, il 98.6% di specificità e AUROC=0.993. Conclusioni. La nuova applicazione della spettrometria di massa per dosare i livelli di Hep plasmatici fornisce misure accurate che rilevano basi patologiche e genetiche; semplici marker non invasivi (Hep/SF, glucosio e ferro) possono predire la presenza di HE.

Il particolato atmosferico è l’insieme di tutto il materiale solido e liquido disperso in atmosfera. Si classifica in base alle dimensioni delle particelle che lo compongono, alla sorgente di emissione che influisce anche sulla composizione chimica. Le sorgenti possono essere natuarali e/o antropiche. L’importanza di caratterizzare il particolato deriva dagli effetti che questo può avere non solo sull’uomo ma anche sul clima e sull’ambiente. Questo lavoro di tesi mira alla caratterizzazione qualitativa di campioni di aerosol provenienti dalla città di Belgrado (Serbia). Il campionamento è stato eseguito in un periodo di quattro mesi, da settembre a dicembre, e i campioni sono stati preparati e analizzati mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) abbinata a spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS). Le analisi sono state effettuate operando in modalità positiva e negativa per consentire una più ampia caratterizzazione dei campioni. Questo ha portato all’isolamento di un numero molto alto di composti per i quali è stato possibile, grazie a vari software dedicati all’indagine metabolomica, indicare una formula bruta e in alcuni casi anche la formula di struttura e una denominazione. Sono inoltre state effettuate delle analisi statistiche al fine di interpretare le correlazioni tra gli analiti, e raggrupparli in classi di composti che caratterizzano una particolare fonte di emissione.

L’insieme delle caratteristiche odorose e aromatiche del vino rappresenta l’aspetto sensoriale di maggiore rilevanza tra quelli riconducibili alla tipicità di vini ottenuti da uve di varietà differenti ed ottenute con tecniche colturali diverse. I composti volatili responsabili delle caratteristiche aromatiche del mosto e del vino sono numerosi e di diversa natura: molti si originano nel corso della fermentazione alcolica, e vengono pertanto generalmente definiti aromi di fermentazione, altri derivano dall’uva e costituiscono la componente aromatica varietale del vino. Quest’ultima è direttamente influenzata dalle varietà di uva impiegate per la vinificazione ed è costituita dai composti liberi e dai precursori aromatici glicosilati. Alcuni composti volatili vengono inoltre studiati come marcatori di particolari caratteri dei vini, come nel caso dei vini prodotti da uve di ibridi produttori diretti. In questa tesi sono stati utilizzati approcci diversi di cromatografia liquida e di gascromatografia accoppiate a tecniche di spettrometria di massa (GC/MS e LC/MS) per studiare i composti volatili, aromi e precursori aromatici nelle uve e nei vini. In particolare sono stati studiati: 1. La composizione aromatica di mosti ottenuti da uve Semillon in cui sono state messe a confronto quelli derivati da uve prodotte da viti defogliate e quelli derivati da uve prodotte da viti non defogliate; 2. il profilo aromatico di vini ottenuti da uve Fiano in cui sono stati messi a confronto un vino test prodotto nella zona di Avellino con vini prodotti in Puglia; 3. la presenza del 4-idrossi-2,5-dimetil-3-furanone (furaneolo) e del metil-2-aminobenzoato (antranilato di metile) come indicatori di vini prodotti da uve provenienti da ibridi produttori diretti. I profili dei composti volatili liberi e dei composti prodotti per idrolisi enzimatica sono stati studiati mediate analisi GC/MS eseguendo l’identificazione dei composti con l’utilizzo del database CRA-VIT contenente gli spettri di massa degli aromi delle uve e dei vini, lo studio del profilo dei precursori aromatici glicosilati in forma integra è stato eseguito mediante cromatografia liquida ad ultra prestazioni accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione (UHPLC/QTOF) e con l’utilizzo del database CRA-VIT GrapeMetabolomics sviluppato per lo studio della metabolomica delle uve e dei vini.

The research project is focused on the evaluation of proteome in biological fluids from patients with renal cell carcinoma and diabetic nephropathy by a ClinProt-MALDI-TOF approach. Currently there aren’t specific biomarkers for an earlier diagnosis of RCC and nephropathic development especially in T1D patients. The most promising MS-based screening methods for the discovery of multiple biomarkers in body fluids is ClinProt, which couple a prefractionation chromatographic step with MS analysis. Renal Cell Carcinoma (RCC) is the most common kidney malignancy and its incidence is increasing worldwide each year. Since patients have a poor prognosis due to a lack of sensitivity to radio- and chemio-therapies biomarkers for early diagnosis and monitoring the state of disease are urgently needed. Concerning the diabetic nephropathy, it is the major vascular complication of type 1 diabetes and it is the leading cause of the end stage renal disease worldwide. The earliest diagnostic sign for the presence of diabetic renal damage is an increase in the albumin excretion rate, but unfortunately it isn’t an accurate predictor. So the study was aimed to perform profiling studies on urine/serum of healthy subjects and patients (RCC and diabetics with nephropathy) linking solid phase extraction technique using functionalized magnetic beads to MS analysis. In addition the proteome investigation was extended on patients with a non-RCC tumor allowing to distinguish different renal diseases. These results provided basis for the development of clinically valid proteins/peptides patterns for RCC and diabetic nephropathy diagnosis, improving the knowledge of the pathological processes in disease development.

Gli esosomi, vescicole nanometriche rilasciate dalla maggior parte delle cellule presenti nei vari fluidi biologici, possono trasferire il loro carico di proteine e acidi nucleici alle cellule riceventi. Scopo del presente studio è stato quello di valutare la presenza di genomi virali,appartenenti alle famiglie dei PyVs e degli HPV, associati a NV (NV) in 72 pazienti sottoposti a trapianto renale, in campioni di sangue e urina L’individuazione dei genomi virali è stata effettuata mediante spettrometria di massa MALDI- TOF. consentendo la contemporanea rilevazione dei 18 genomi virali per i PyV e dei 16 HPV per ciascun campione sottoposto ad analisi. Nei soggetti reclutati, donatori e riceventi, è stato effettuato inizialmente l’isolamento delle NV in campioni di siero e urina utilizzando una metodica di precipitazione basata sul polietilenglicole (PEG). La determinazione del numero e delle dimensioni delle NV isolate è stata effettuata mediante NTA. La conseguente determinazione degli epitopi esosomiali e nano vescicolari supercifiali è stata condotta mediante metodica MACSplex. L’arricchimento nelle NV urinarie della frazione esoosmiale è emerso grazie all’elevata presenza dell’antigene CD9 sulla superficie delle NV stesse. Inoltre, l’utilizzo della digestione enzimatica mediata da DNAsi I ha permesso di testare quanto potesse essere aspecifica la rilevazione dei genomi virali identificati con la spettrometria di massa, qualora si palesassero delle copurificazioni inattese. L’analisi dei genomi virali è stata così condotta in parallelo testando i medesimi campioni trattati con DNAsi I e non. I risultati ottenuti sulla corte dei soggetti donatori e dei pazienti trapiantati hanno messo in luce, delle percentuali di positività spiccate per il genoma virale del BKV (60%) e del JCV (20%) nelle NV sieriche ma soprattutto in quelle urinarie (50% entrambi).
Advances in surgical techniques and the evolution of immunosuppressive therapy have undoubtedly improved survival rates, but post-transplant infections continue to cause morbidity and mortality in these patients. Exosomes, nanometric vesicles released by most of the cells present in the various biological fluids, can transfer their load of proteins and nucleic acids to the receiving cells. The aim of this study was to evaluate the presence of viral genomes, belonging to the families of PyVs and HPVs, associated with nanovescicles, in 72 patients undergoing renal transplantation, in samples of blood and urine. The identification of viral genomes was carried out through the development of a high-throughput method based on mass spectrometry MALDI- TOF. The method allowed the simultaneous detection of 18 viral genomes for PyV and 16 HPV for each sample tested. The isolation of the NV was initially carried out using a precipitation method based on PEG. The number and size of the isolated NV was determined by NTAs. The determination of exosomal epitopes was performed by the MACSplex method. The enrichment of the exosomial fraction in the urinary NVs was revealed by the high presence of the CD9 antigen on the surface of the NVs themselves. Moreover, the use of enzymatic digestion allowed to test how unspecific the detection of viral genomes identified with mass spectrometry could be, in case of unexpected copurifications. The results obtained on the transplanted patients have shown marked positive percentages for the viral genome of BKV (60%) and JCV (20%) in serum NV but especially in urinary ones (50% both). In conclusion, the investigation carried out in this project has led to the identification of the combination of isolation by immunomagnetic separation and enzyme treatment with DNAase I as the best method for the determination of viral genomes contained within exosomes (.i.e. SV12).

Gli acidi grassi volatili (VFA) sono importanti intermedi di reazione nel processo di digestione anaerobica, costituendo uno dei migliori parametri per il monitoraggio dei digestori nella produzione di biogas. Diversi metodi sono stati sviluppati per la determinazione della concentrazione dei singoli VFA, e la tecnica più largamente diffusa è quella della iniezione diretta in fase acquosa abbinata a gascromatografia in ionizzazione di fiamma (GC-FID). In questa tesi è stato sviluppato un metodo alternativo basato sulla estrazione dei VFA dal digestato con il solvente dimetilcarbonato (DMC). La procedura sviluppata prevede l’acidificazione del digestato, l’aggiunta di uno standard interno, l’estrazione con DMC e centrifugazione finale prima della analisi in gas cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa (GC-MS). I valori delle varie figure di merito del metodo determinati in fase di calibrazione sono risultati confrontabili con i dati di letteratura dei metodi convenzionali. Il metodo risulta adatto allo scopo proposto, e presenta alcuni aspetti vantaggiosi come la bassa quantità di campione richiesta per la analisi, la procedura di preparazione rapida e la minor contaminazione della strumentazione analitica. Il metodo è stato poi applicato a 17 campioni di digestato, provenienti da impianti di digestione anaerobica che lavorano in condizioni operative diverse e che alimentano biomasse di composizione eterogenea. Le condizioni di stabilità dei vari impianti sono state valutate sulla base di alcuni parametri come VFA totali, concentrazione di acido acetico e di acido propionico e loro rapporto, concentrazione totale di VFA a catena lunga (C4-C5). L’utilizzo del DMC e della tecnica GC-MS permette anche di individuare altri acidi organici ciclici ed aromatici nei campioni, per i quali studi futuri potrebbero evidenziarne un utilizzo come ulteriori indicatori di condizione del processo.

MicroRNAs are endogenous 23-nucleotides RNAs that can pair to particular sites in messenger RNAs of protein-coding genes to down regulate the expression of these genes thus altering cell physiology. Many studies have been done towards the identification of the miRNA targets at a transcriptomic level, and many algorithms have been developed to predict and identify the putative targets. But none of the approaches currently used to study miRNAs directly measures their influence on protein output, which is the most relevant readout of their regulatory effects. The importance of knowing miRNA targets relies on the fact that these molecules are involved in the temporal and spatial regulation of organism development and in many aspects of the cell physiology, and that a mutation in their expression can lead to different pathologies, such as neurodegenerative diseases and tumours. miR-124 is one of the most abundantly expressed miRNAs in the nervous system, being widely expressed in neurons in the brain, retina and spinal cord. Its expression can be detected in differentiating neurons and persists in mature neurons, suggesting that miR-124 plays important roles during neuronal development and normal physiology. Some of its targets have already been identified by classical methods, but a more comprehensive approach is required to go deeply in its mechanism of action. To identify the possible protein targets of this miRNA, we have adopted a SILAC-based approach, which enabled us to identify the quantitative changes in the protein abundances in Neuro2A cells, the neuroblastoma cells that we have used as model system for this study. These cells are progenitor-like cells, able to differentiate to neuronal-like cells following serum starvation. We have transduced them with a lentiviral vector harbouring a construct able to knockdown the expression of the miRNA of interest, completely labeled the proteome with the heavy forms of lysine and arginine, and then induced the differentiation and the expression of miR-124 by serum starvation for 24 hours. The increment of mi-R124 levels has been verified and the functionality of the vector has been checked by FACS analysis, confirming both the over-expression of the miR-124 after the induction by serum depletion and its knock-down in the presence of the lentivirale vector. The whole proteomes from control and starved cells have been firstly sub-fractionated in order to simplify the protein patterns and to increase the number of identifications. The fractions have been separated by SDS-PAGE, the excised gel bands have been tryptic digested and analysed by high accuracy mass spectrometry (LTQ-OrbiTRAP). The analysis of changes in the identified and quantified proteins will shed light on the mechanisms affected by miRNA-124 that rule neuronal differentiation of progenitors cells.

La valutazione del profilo steroideo mediante cromatografia liquida abbinata alla spettrometria di massa (LC-MS/MS è di grande utilità nella diagnosi e tipizzazione delle masse del surrene. Abbiamo analizzato il profilo steroideo basale e post test di soppressione al desametasone, in 302 pazienti con incidentaloma surrenalico, mediante un metodo LC-MS/MS per la quantificazione di 11 steroidi. Abbiamo poi valutato le associazioni con la salute cardiovascolare durante il periodo di follow-up. Lo scopo secondario prevedeva lo studio della steroidogenesi intra-tumore ed il confronto con il tessuto surrenalico normale corrispondente, mediante lo sviluppo di un nuovo metodo LC-MS/MS per la caratterizzazione di un pannello di 22 steroidi surrenalici. Da tale studio è emerso che i soggetti con adenoma unilaterale e secrezione disregolata di cortisolo avevano valori basali più elevati di cortisolo, 11-desossicortisolo e corticosterone e livelli ridotti di DHEA rispetto ai pazienti con adenoma non funzionante. I pazienti con secrezione disregolata hanno mostrato la mancata soppressione di cortisolo, 11-desossicortisolo e corticosterone post test al desametasone indipendentemente dalla morfologia della lesione. I livelli di cortisolo e corticosterone post test al desametasone erano inoltre associati con una prevalenza più elevata del peggioramento dell’ipertensione. Pazienti con adenoma unilaterale e secrezione disregolata avevano un’incidenza più elevata del peggioramento dell’ipertensione e per l’insorgenza di nuovi eventi cardiovascolari rispetto ai non secernenti, con il cortisolo post desametasone (Hazard Ratio 1.02, 95% CI 1.01-1.03, P<0.001) ed il corticosterone basale (Hazard Ratio 1.06, 95% CI 1.01-1.12, P<0.031) come maggiori predittori. Dallo studio della sterodogenesi tissutale è emerso il potenziale valore informativo di alcuni steroidi non tradizionali, le cui variazioni erano frequentemente riscontrate nel tessuto tumorale rispetto al tessuto surrenalico normale. I pazienti con incidentaloma surrenalico hanno mostrato un profilo steroideo differente in relazione allo status funzionale ed alla morfologia dei surreni che si associava a differenti livelli di rischio cardiovascolare.
The assessment of steroid profile by liquid-chromatography tandem mass spectrometry has proved to be of great usefulness in the diagnosis and characterization of the adrenal masses. We analyzed the circulating steroid profile in 302 patients with adrenal incidentaloma, by an LC-MS/MS method for the quantification of 11 steroids. We then assessed the associations with cardiovascular health during the follow-up period (median 39 months). The secondary aim was the exploratory study of intra-tumor steroidogenesis and the comparison with the corresponding normal tissue, through the development of a new LC-MS/MS method for the characterization of a panel of 22 adrenal steroids. We found that subjects with unilateral adenoma and dysregulated cortisol secretion had higher basal values of cortisol, 11-deoxychortisol and corticosterone and reduced DHEA levels compared to patients with non-functioning adenoma. Moreover, subjects with hyperplasia and dysregulated cortisol secretion had high cortisol and reduced androgen levels compared to non-functioning hyperplasia. Patients with dysregulated secretion showed no suppression of cortisol, 11-deoxycortisol and corticosterone post dexamethasone-test regardless of lesion morphology. After suppression-test, cortisol and corticosterone levels were also associated with higher prevalence of worsening hypertension. Patients with unilateral adenoma and dysregulated secretion had higher incidence of worsening hypertension and of onset of new cardiovascular events than non-secreting, with post-dexamethasone cortisol (Hazard Ratio 1.02, 95%CI 1.01-1.03, P<0.001) and basal corticosterone (Hazard Ratio 1.06, 95%CI 1.01-1.12, P<0.031) as major predictors. The study of tissue sterodogenesis revealed the usefulness of non-classical steroids, such as the metabolites of cortisol, progesterone, 16-hydroxyprogesterone and some 11-oxidized C19-androgens such as 11-hydroxydrostenedione, 11-ketoadrostenedione and 11-hydroxytestosterone whose variations were frequently found in adrenal lesions compared to normal adrenal tissue. We concluded that patients with adrenal incidentaloma showed a different steroid profile in relation to the functional status and morphology of the adrenals, which was associated with different levels of cardiovascular risk.

Negli ultimi anni sono emerse evidenze che supportano un ruolo di HPV nella patogenesi del cancro al polmone ed è stata riscontrata la presenza e l’espressione, attraverso distinte linee di ricerca, degli oncogeni di HPV nei tumori polmonari supportando l’ipotesi che forme oncogeniche del virus possano agire come cofattori nel processo carcinogenico. Per chiarire il ruolo di HPV nello sviluppo del tumore del polmone abbiamo utilizzato la linea cellulare polmonare A549 come modello cellulare e, dopo infezione con costrutti esprimenti gli oncogeni E6, E7 ed E6/E7 di HPV16, con un approccio di tipo proteomico, abbiamo studiato i cambiamenti nel profilo di espressione proteica delle diverse linee cellulari infettate, rispetto alla controparte normale, associate alla presenza degli oncogeni. Dall’analisi dei replicati dei gels bidimensionali tra le cellule non infettate e infettate stabilmente con HPV16E6/E7, si sono trovate 17 proteine differenzialmente espresse di almeno 2 volte, la cui intensità media normalizzata fosse statisticamente significativa (p<0.05). L’identificazione delle proteine è stata effettuata con esperimenti di spettrometria di massa MALDI-TOF-MS e nLC-ESI-Q-TOF-MS/MS. Le possibili relazioni e associazioni funzionali tra le proteine espresse differenzialmente nelle linee infettate con gli oncogeni di HPV16 sono state valutate tramite il programma bioinformatico Ingenuity Pathway Analysis. Il risultato, derivante da tutte e tre le diverse condizioni di infezione, suggerisce un coinvolgimento funzionale di processi di inibizione dell’apoptosi e le proteine Annexin IV, Gp96, Hsp27 e Tumor protein-translationally controlled 1 identificate come regolatori principali della sopravvivenza cellulare e inibizione della morte cellulare programmata.
In recent years data have accumulated implicating the involvement of oncogenic HPVs in bronchial carcinogenesis and the presence and expression of oncogenic HPV transcripts in non-small cell lung cancers have been reported throughout distinct studies. Taken together these data seem to support the hypothesis that oncogenic HPVs could act as co-factor in lung carcinogenesis. To further understand the role of HPV in the development of lung cancer we employed the lung cell line A549 stably infected with HPV16E6, HPV16E7 and HPV16E6/E7 constructs to investigate by a proteomic approach the protein profile changes associated with the expression of these oncogenes. Replicated 2-DE gels from uninfected and stably HPV16E6/E7 infected A549 cells were compared for changes in protein profile. We identified 17 different polypeptides whose average normalized spot intensity was statistically significant (p<0.05) and differed by 2- fold. The protein identification was achieved by peptide mass fingerprinting by MALDI-TOF-MS and nLC-ESI-Q-TOF-MS/MS peptide ladder sequencing Relationships between differentially expressed proteins and the HPV-induced infection mechanism have been clustered by knowledge-base database functional association network analysis. The results, deriving from the networks obtained from all three different infection conditions, suggested the functional involvement of a cell death inhibition pathway with central nodes including Annexin IV, Gp96, Hsp27 and Tumor protein-translationally controlled 1 as major key proteins for cell viability and inhibition of apoptosis pathway.

BACKGROUND Metabolomics is an emerging science, with promising application in medical practice. The metabolomic approach is based on the global identification, not driven by a priori hypothesis, of a high number of metabolites in a biological fluid; this allows the characterization of the metabolic profile typical of a certain condition, permitting to identify which metabolites or pattern of metabolites could be useful in discriminating different groups of subjects. By analysis of spectroscopic data, multivariate statistical analysis tools allow you to extract data relevant metabolic characterization of specific physiological and patho-physiological. Furthermore, the analysis needs metabolomics low amounts of biological sample, a feature that makes it applicable to multiple arrays but which especially makes it easy to use in the paediatric field. The impact of this science in the field of maternal and child studies is very important, to investigate whether there are metabolites useful to diagnose some of the most widespread diseases in childhood and to investigate whether there are correlations between the maternal condition and the development of diseases in the newborn. In the specific case we applied the metabolomic approach to some of the most common diseases of the scope for Childcare: food allergy, the preterm delivery, the development of BPD and defects of the β-oxidation of fatty acids. OBJECTIVES The aim of my PhD was to apply metabolomics analysis and mass spectrometry to investigate some of the most common diseases of children and maternal field (food allergy, pre-term birth, BPD development and defects of the β-oxidation of fatty acids) using different biological matrices: urine, amniotic fluid, plasma and blood spot. Two different approaches were applied: a target approach, very specific, that focuses on the qualitative and quantitative analysis of a single analyte, such as a marker disease or the substrate of an enzyme reaction; an untargeted approach (fongerprinting) focused on the analysis of a group of metabolites belonging to a specific metabolic pathway or a class of compounds. METHODS The untargeted approach was applied to two studies: the first to see on a group of children with suspected milk allergy to differentiate the allergic reaction in urine samples taken before the outbreak; the second to evaluate the metabolic profiles of amniotic fluid of patients with preterm delivery and development of BPD in order to be able to predict preterm birth and development of BPD in the child. The first is a prospective study including 30 children (19 males and 11 females, average age 4 years; they were all affected by IgE mediated cow’s milk protein allergy). The patients submitted to a milk oral challenge test and, accordingly, were divided in two groups: positives (15 children) and negatives (15 children). A urine sample was collected for each patient before the milk challenge test. The second is a pilot study including 32 infants of mothers who had undergone amniocentesis between the 21st and the 28th week of gestation have been included in the study: 10 preterm infants with BPD (A), 11 healthy preterm infants without BPD (B), and 11 healthy term infants (C). The metabolomic analysis of the urine and amniotic fluid was performed by means of Q-Tof (Synapt G2; Waters) high performance mass spectrometry platform coupled with a UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography, Waters) system, characterized by a high chromatographic resolution and a short analytic time. The sample were analysed by means of two different types of chromatographic columns (one column, HSS T3, with a reversed phase; the other with a polar phase, ACQUITY BEH HILIC). For each column the sample were analysed in positive and negative polarity. The results of the LC-MS analysis were processed with the MarkerLynx software and submitted to multivariate statistics methods. The variables which emerged from the statistic analysis were then confronted with the variables in the databases on the internet (HMDB and Metlin). As far as the targeted approach is concerned, it was applied to the study of the metabolism of the fatty acids during β-oxidation. 157 newborn children were taken into consideration, and they were divided in four groups, according to the gestational age (SG): group 1 (22-27 +6 SG); group 2 (28-31 +6 SG) group 3 (32-36 +6 SG) group 4 (37-41 +6 SG). 48-72 hours after birth, DBS (blood spot on blotting paper) and plasma samples were collected from each subject. For the analysis, unmarked acylcarnitine donated by Dr. Piero Rinaldo (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) were used, together with stable isotopes marked compositions, purchased from the ChromSystems Instruments & Chemicals (Munich, Germany), which were used as internal standards. The acetonitrile, the methanol, and the n-butanol were purchased from Carlo Erba (Milan, Italy); the trifluoroacetic acid (TFA) and the acetyl chloride from the Sigma-Aldrich (Milan, Italy). All the solvents were chromatographically pure. In order to quantify the acylcarnitine, calibration curves were built for each of them by the isotopic dilution method. For the statistic analysis the STATISTICA 6.0 (Stat Soft Inc, Tulsa, USA) and SPSS for Windows (version 21.0, IBM Corp., Armonk, NY) software packs were used. RESULTS The study on the prediction of the pre-term delivery and the BPD development based on the analysis of the amniotic fluid had led to the development of two data sets. The analysis of these two sets (one for each ionization method applied during the spectroscopic analysis) has allowed us to build two robust PLS-DA (Partial Least Square regression-Discriminant Analysis) models (R2=0.78 and Q2=0.56; R2=0.80 and Q2=0.56), which are able to clearly discriminate the AF samples belonging to the three groups of infants (A,B,C). A preliminary data analysis through PCA (Principal Component Analysis) had permitted to exclude the hypothesis that this discrimination could be due to the confounding effect of some important clinical variables (mother age at amniocentesis, gestational age at amniocentesis and therapy the mother submitted to during pregnancy). Last, in the study of the acylcarnitine and the amino acids, the reported results define the normal range of concentrations of the carnitine pool components, including isomers and isobaric metabolites in plasma and DBS samples, for infants of different gestational ages. The values obtained from the analysis of the samples do not fit a Gaussian distribution, therefore medians and percentiles (10°, 25°, 75°, 90°) of the concentrations of each metabolite were calculated for each group (G1, G2, G3, G4). We have also carried out the statistical analysis of the differences between the different groups. CONCLUSION The two untargeted studies have demonstrated that the metabolomic analysis is able to predict the milk oral challenge test response, on the basis of the urine metabolomic profile, and to predict pre-term birth and BPD development through the analysis of amniotic fluid. Especially as far as food allergy is concerned, 4 variables have emerged as particularly relevant in the differentiation of the two groups. Despite the fact that the confrontation of the chemical-physical characteristics of these variable with the metabolomic databases has not allowed the identification of the exact nature of the variables, it is worth underlining that the use of 2 of the most important identified variables leads to the creation of a decisional tree which allows the correct prediction in response to the test in all the subjects but one. Nevertheless, regardless of the complete identification of the involved metabolites, the most relevant result is the existence of a “metabolic fingerprint” that individuates children with higher risk of positive response to challenge test. The development and the validation of this method will allow us to avoid submitting to the oral challenge test children who are highly at risk of developing a generalized (systemic) allergic reaction. The study on the amniotic fluids had demonstrated that the metabolic profile of the amniotic fluid collected between the 21st and the 28th pregnancy week can discriminate the pregnancies subject to a pre-term delivery from those subject to an on term delivery, and identify the newborn children who will develop a BPD. These results support the hypothesis that some prenatal metabolic alterations may have a key role in the pre-term birth and in the development of BPD in the newborn. Nevertheless, further studies are necessary in order to confirm these preliminary results and to explain the interaction between the maternal-fetal environment and the development of BPD in the newborn. The results of the analysis of the acylcarnitine and the amino acids profile confirm the necessity to define specific normal intervals for every matrix and for each group of different gestational age; moreover, the comparison with results obtained by other Authors reveals the importance that each laboratory have its own reference values, both for diagnostic and research purposes. The use of HPLC-MS/MS method has allowed to complete the carnitine analysis in pre-term and on term newborn children, allowing for the first time the simultaneous analysis of more than 40 acylcarnitines, including some isomeric and isobaric forms. These characteristics and the obtained results make this test suitable for diagnostic purposes, such as second-tier test for expanded newborn screening
PRESUPPOSTI DELLO STUDIO La metabolomica è una scienza emergente, con promettenti applicazioni in campo medico. L’approccio metabolomico si basa sull’identificazione globale, non guidata da ipotesi a priori, di un elevato numero di metaboliti presenti in un fluido biologico; questo consente di caratterizzare il profilo metabolico di una determinata condizione e permette di identificare quali metaboliti o pattern di metaboliti possono essere utili nella discriminazione tra differenti gruppi di studio. Mediante l’analisi dei dati di spettroscopia e strumenti di analisi statistica multivariata consentono di estrapolare i dati metabolici rilevanti nella caratterizzazione di specifici stati fisiologici e pato-fisiologici. Inoltre, l’analisi metabolomica necessità di basse quantità di campione biologico, caratteristica che la rende applicabile a molteplici matrici ma che soprattutto la rende facilmente utilizzabile in ambito pediatrico. L’impatto di tale scienza nel campo degli studi materno-infantili è molto importante, sia per indagare se esistano metaboliti utili a diagnosticare alcune delle patologie maggiormente diffuse in età infantile sia per indagare se esistano delle correlazioni tra la condizione materna e lo sviluppo di malattie nel neonato. Nel caso specifico abbiamo applicato l’approccio metabolomico ad alcune delle più diffuse patologie dell’ambito materno infantile: l’allergia alimentare, il parto pre-termine, lo sviluppo di BPD e i difetti della β-ossidazione degli acidi grassi. SCOPO DELLO STUDIO Lo scopo del dottorato è stato quello di applicare l’analisi metabolomica basata sulla spettrometria di massa a diverse patologie che interessano l’ambito materno-infantile (allergie, parto pretermine in relazione allo sviluppo di BPD e al metabolismo degli acidi grassi attraverso la beta ossidazione) utilizzando diverse matrici biologiche: urine, liquido amniotico, plasma e spot di sangue. Si è proceduto all’applicazione di due diversi approcci: uno di tipo target, altamente specifico, che si focalizza sull’analisi qualitativa e quantitativa di un singolo analita, come un marcatore di malattia o il substrato di una reazione enzimatica; e uno di tipo untarget (fingerprinting) focalizzato sull’analisi di un gruppo di metaboliti appartenenti a una specifica via metabolica o una certa classe di composti. MATERIALI E METODI Per quanto riguarda l’approccio untarget questo è stato applicato a due studi: il primo mirato a vedere su una coorte di bambini con presunta allergia al latte se si potesse differenziare la reazione allergica in campioni di urine prelevate prima dello scatenamento; il secondo a valutare i profili metabolici di liquidi amniotici di pazienti con parto pretermine e sviluppo di BPD al fine di riuscire a predire la prematurità del parto e lo sviluppo di BPD nel bambino. Per il primo studio sono stati reclutati 30 bambini, di cui 19 maschi e 11 femmine, di età media pari a 4 anni affetti da allergia alle proteine del latte vaccino IgE mediata. I pazienti sono stati sottoposti a test di provocazione orale con latte ed in base all’esito del test, sono stati suddivisi in due gruppi: pazienti con risposta positiva (15 bambini) e i pazienti con risposta negativa (15 bambini). Un campione di urina è stato raccolto prima dell’esecuzione del test di provocazione; i campioni sono stati poi sottoposti ad analisi metabolomica basata su spettrometria di massa associata a cromatografia UPLC. Nel secondo caso si tratta di uno studio retrospettivo e trasversale che includeva 32 bambini nati da madri che avevano subito l'amniocentesi tra la 21° e la 28° settimana di gravidanza, e 12 bambini sani nati a termine attraverso il taglio cesareo da madri il cui campione di liquido amniotico era stato raccolto al momento del parto. I bambini sono stati poi suddivisi in tre gruppi differenti: A) neonati pretermine con BPD; B) neonati prematuri senza BPD e C) bambini nati a termine e senza sviluppo di BPD. L'analisi dei campioni di urina e liquido amniotico è stata eseguita tramite uno spettrometro di massa Q-Tof (Synapt G2; Waters) ad alta risoluzione interfacciato con un sistema cromatografico UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography) (Waters) caratterizzato da un’elevata risoluzione cromatografica e da un breve tempo analitico. I campioni sono stati analizzati utilizzando due diversi tipi di colonne cromatografiche (una colonna a fase inversa HSS T3 e una colonna a fase polare ACQUITY BEH HILIC). Per ciascuna colonna sono state impiegate due diverse modalità di ionizzazione (in positivo e in negativo). I dati ottenuti dall’analisi LC-MS sono stati elaborati con il software MarkerLynx e sottoposti a statistica multivariata. Le variabili emerse dall’analisi statistica sono state poi confrontate con quelle presenti nei database disponibili in rete. Per quanto riguarda l’approccio target, questo è stato applicato allo studio del metabolismo degli acidi grassi nella beta ossidazione. Sono stati arruolati 157 neonati e sono stati suddivisi in quattro gruppi a seconda della settimana gestazionale (SG): gruppo 1 (22-27+6 SG); gruppo 2 (28-31+6 SG); gruppo 3 (32-36+6 SG); gruppo 4 (37-41+6 SG). Tra le 48 e le 72 ore dalla nascita da ogni soggetto sono stati raccolti un campione di plasma e uno di sangue intero sotto forma di DBS (spot di sangue su carta bibula). Per l’analisi sono state utilizzate delle acilcarnitine non marcate donate dal Dott. Piero Rinaldo (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA) e dei composti marcati con isotopi stabili, acquistati da ChromSystems Instruments & Chemicals (Monaco, Germania) che sono stati utilizzati come standard interni. Acetonitrile, metanolo, n-butanolo sono stati acquistati da Carlo Erba (Milano, Italia); acido trifluoroacetico (TFA) e cloruro di acetile da Sigma-Aldrich (Milano, Italia). Tutti i solventi erano di purezza cromatografica. Per quantificare le acilcarnitine sono state costruite delle curve di calibrazione per ciascuna di esse usando il metodo delle diluizioni isotopiche. L’analisi statistica è stata eseguita utilizzando i pacchetti software STATISTICA 6.0 (Stat Soft Inc, Tulsa, USA) e SPSS per Windows (versione 21.0, IBM Corp., Armonk, NY). RISULTATI Nello studio relativo all’allergia alimentare si sono ottenuti 4 set di dati (derivanti dall'uso combinato di 2 modalità di ionizzazione e di 2 diverse colonne cromatografiche), per ciascuno dei quali è stato possibile elaborare un modello robusto in grado di discriminare tra i soggetti con test di provocazione orale positivo e quelli con test negativo. Nello specifico, 4 variabili sono emerse come particolarmente significative nella differenziazione tra i due gruppi. Sebbene il confronto delle caratteristiche chimico-fisiche di queste variabili con i database metabolomici, non abbia permesso di identificare l’esatta natura delle variabili stesse, è rilevante sottolineare come utilizzando 2 delle variabili più importanti identificate sia possibile creare un albero decisionale. Lo studio relativo alla previsione di parto pre-termine e sviluppo di BPD a partire dall’analisi dei liquidi amniotici ha portato allo sviluppo di due data set. L’analisi dei due data set ottenuti (uno per ciascuna modalità di ionizzazione applicata nell’analisi spettroscopica) ha permesso di costruire due robusti modelli di PLS-DA (Partial Least Square regression-Discriminant Analysis) (R2=0.78 and Q2=0.56; R2=0.80 e Q2=0.56), in grado di discriminare chiaramente i campioni di liquido amniotico appartenenti alle 3 classi oggetto di studio (A,B,C). Una preliminare analisi dei dati mediante PCA (Principal Component Analysis) aveva consentito di escludere che tale discriminazione potesse essere dovuta al ruolo confondente di alcune importanti variabili cliniche (età materna al momento del prelievo, epoca gestazionale e terapia assunta dalla madre in gravidanza). Infine, per lo studio riguardante le acilcarnitine e gli amminoacidi, i risultati riportati definiscono gli intervalli di normalità delle concentrazioni dei componenti del pool della carnitina, compresi metaboliti isomeri e isobari, in campioni di plasma e DBS, per neonati di diverse età gestazionali. I valori ottenuti dall’analisi dei campioni non si distribuiscono secondo una gaussiana, quindi per ogni gruppo (G1, G2, G3, G4) sono stati calcolati mediane e percentili (10°, 25°, 75°, 90°) delle concentrazioni di ciascun metabolita. È stata inoltre effettuata l’analisi statistica delle differenze fra i vari gruppi. CONCLUSIONE I due studi untarget hanno dimostrato che l’analisi metabolomica è in grado di predire la risposta al test di provocazione orale con latte a partire dal profilo metabolico urinario e il parto pre-termine associato o meno allo sviluppo di BPD sulla base invece dei profili del liquido amniotico. Nello specifico, nel caso dell’allergia alimentare, 4 variabili sono emerse come particolarmente significative nella differenziazione tra i due gruppi. Sebbene il confronto delle caratteristiche chimico-fisiche di queste variabili con i database metabolomici non ha permesso di identificare l’esatta natura delle variabili stesse, è rilevante sottolineare come utilizzando 2 delle variabili più importanti identificate sia possibile creare un albero decisionale che consente la corretta predizione della risposta al test in tutti i soggetti coinvolti eccetto uno. Tuttavia, anche a prescindere dalla completa identificazione dei metaboliti coinvolti, il dato rilevante è rappresentato dall’esistenza di un “fingerprinting metabolico” in grado di individuare preventivamente i bambini più a rischio di avere una risposta positiva al test di provocazione orale con alimenti. Lo sviluppo e la validazione di tale metodica permetterà di evitare di sottoporre al test di provocazione orale i bambini con alta probabilità di sviluppare una reazione allergica (sistemica) generalizzata. Lo studio condotto sui liquidi amniotici ha dimostrato che il profilo metabolico del liquido amniotico raccolto tra la 21a e 28a settimana di gravidanza può discriminare le gravidanze associate a parto pretermine da quelle associate a parto a termine, e identificare i neonati che svilupperanno BPD. Questi risultati supportano l’ipotesi che alcune alterazioni metaboliche prenatali possano giocare un ruolo chiave nella nascita pretermine e nello sviluppo di BPD nel neonato. Tuttavia, sono necessari successivi studi per confermare questi dati preliminari e per chiarire l’interazione tra l’ambiente materno-fetale e lo sviluppo di BPD nel neonato. I risultati ottenuti dall'analisi del profilo delle acilcarnitine e degli amminoacidi confermano la necessità di definire specifici intervalli di normalità per ogni matrice utilizzata e per ogni gruppo di diversa età gestazionale, inoltre il confronto con i risultati ottenuti da altri autori fa emergere l’importanza che ogni laboratorio disponga di propri valori di riferimento, sia ai fini diagnostici che di ricerca. L’utilizzo del metodo UPLC-MS/MS ha consentito un’analisi rapida e completa del pool della carnitina nel neonato a termine e pretermine, permettendo per la prima volta l’analisi simultanea di oltre 40 acilcarnitine, comprese alcune forme isomeriche e isobare. Tali caratteristiche, unitamente ai risultati ottenuti, ne confermano il possibile utilizzo a scopo diagnostico, ad esempio come estensione dello screening neonatale/test di secondo livello

La Xantomatosi Cerebrotendinea (CTX) e la Paraparesi Spastica di tipo 5 (SPG5) sono due malattie neurometaboliche rare legate a difetti nel catabolismo del colesterolo ad acidi biliari (BA). La CTX è causata da mutazioni della sterolo 27-idrossilasi (CYP27A1), un enzima della sintesi degli acidi biliari il cui deficit ha come conseguenza una ridotta produzione di acido chenodeossicolico (CDCA) ed un incrementata sintesi di colestanolo (un derivato saturo del colesterolo). I pazienti CTX sono caratterizzati da xantomi a livello cerebrale e tendineo e progressivi sintomi neurologici. Sin dagli anni ‘80 è stato riportato che la somministrazione di BA è efficace nel ridurre i livelli plasmatici di colestanolo, bloccando potenzialmente la progressione della malattia. Tuttavia, le attuali conoscenze sulla CTX derivano principalmente da casi report mentre sono rari studi su ampie popolazioni. Inoltre alcuni report hanno evidenziato che, nonostante il trattamento, alcuni pazienti mostrano un declino delle funzioni cerebrali nel lungo periodo. Per questi motivi una più ampia ricerca sul metabolismo del colesterolo nei pazienti CTX potrebbe essere utile al fine di consolidare le conoscenze su questa patologia. Il primo scopo di questa tesi era dunque quello di riportare le modificazioni dei principali processi metabolici del colesterolo osservate in un gruppo di pazienti CTX e le eventuali correlazioni tra queste, lo stato clinico dei pazienti ed il decorso della malattia. Per raggiungere questo obbiettivo tecniche di analisi in gascromatografia-spettrometria di massa (GC-MS) sono state utilizzate per dosare la concentrazione plasmatica di specifici ossisteroli e steroli non colesterolici la cui concentrazione è indicativa dei processi metabolici del colesterolo. L’analisi è stata condotta, in modo in gran parte retrospettivo, su una serie di campioni di plasma provenienti da 34 soggetti CTX e ha coperto un periodo di follow-up che, complessivamente, andava dal momento della diagnosi (in assenza di qualunque trattamento) fino a diversi anni di terapia sostitutiva con BA. La SPG5, invece, è una paraparesi spastica ereditaria (HSP) dovuta a mutazioni nel gene codificante per l’ossisterolo-7α-idrossilasi (CYP7B1), un enzima della via alternativa di sintesi di BA necessario per la conversione del 27-idrossicolesterolo (27-OHC) in acido colico e chenodeossicolico. I pazienti SPG5 mostrano elevati livelli plasmatici di 27-OHC e i tipici sintomi di una paraparesi spastica. Attualmente le informazioni sulla SPG5 sono molto limitate e non c’è una terapia definita indirizzata a limitare l’accumulo di 27-OHC. Il secondo scopo di questa tesi era dunque quello di indagare, sempre mediante GC-MS, il metabolismo del colesterolo in una coppia di fratelli SPG5, in qualità di soggetti probandi, e di verificare l’efficacia di farmaci ipocolesterolemizzanti (simvastatina e ezetimibe) nel ridurre il 27-OHC plasmatico. Riguardo i risultati ottenuti, i pazienti CTX hanno mostrato un profilo basale degli steroli caratterizzato da elevati livelli di 7α-idrossicolest-4-en-3-one (7αC4) (indicativi di un’iperstimolazione della via classica di sintesi degli BA), di latosterolo e fitosteroli (markers, rispettivamente, della biosintesi e dell’assorbimento di colesterolo), oltre che (come atteso) di colestanolo. Inoltre sono state evidenziate correlazione significative tra i valori di 7αC4 e colestanolo (ρ=0,51, p<<0,01) e tra i valori di 7αC4 e latosterolo (ρ=0,66, p<<0,01). Al contrario nessuna correlazione significativa è emersa tra i dati biochimici ed il fenotipo clinico dei pazienti. I livelli di tutti questi metaboliti sono significativamente diminuiti in seguito al trattamento con BA (p<0,01) e, successivamente, si sono mantenuti sostanzialmente stabili anche sul lungo periodo. Nel 36% dei pazienti, tuttavia, tale risposta non si è tradotta in una stabilizzazione dello stato clinico dei pazienti. Inoltre, il 24-idrossicolesterolo (24-OHC), un marker dell’omeostasi del colesterolo cerebrale, non ha mostrato particolari alterazioni nei suoi livelli plasmatici basali, né è stato possibile evidenziare un effetto del trattamento con BA sulla sua concentrazione. Questo dato è risultato assai differente da quanto invece osservato in un gruppo di 15 soggetti affetti da Alzheimer dove, sia i livelli di 24-OHC che di 27-OHC sono risultati nettamente ridotti rispetto a soggetti controlli ultrasettantenni. La correlazione tra alterazioni dell’omeostasi del colesterolo, fenotipo clinico e decorso della CTX rimane quindi poco chiara ed ulteriori studi si rendono necessari per chiarire questo aspetto. Riguardo alla SPG5, entrambi i pazienti hanno mostrato (come atteso) elevati livelli basali di 27-OHC e di 25-OHC (25-idrossicolesterolo), mentre non è stato possibile confermare alterazioni nei valori degli altri steroli ed ossisteroli dosati (7αC4, 24-OHC, latosterolo e fitosteroli). Simvastatina ed ezetimibe si sono mostrati efficaci nel ridurre il 27-OHC plasmatico, anche se non fino a livelli normali. Non è stato invece possibile evidenziare un chiaro effetto del trattamento sui valori plasmatici di 25-OHC. Ulteriori studi su un più ampio numero di pazienti saranno necessari al fine di verificare se l’accumulo di 27-OHC sia effettivamente la causa del danno al tratto cortico-spinale e se una terapia a lungo termine con statina/ezetimibe possa essere proposta come trattamento per la SPG5.

Finalità principale della Tesi è stata lo sviluppo di una linea di evidenza chimica che ha previsto la elaborazione di tre distinte procedure analitiche per la determinazione di caffeina con HPLC - MS, una delle quali messa a punto per matrici ambientali inorganiche (acque dolci e salate) e due delle quali specifiche per matrici biologiche (emolinfa e tessuti di Mytilus galloprovincialis). Esse sono state applicate a diversi casi di studio, cominciando dall’analisi di acque di mare prelevate al largo di Cesenatico (FC) e soggette in seguito ad aggiunta di varie concentrazioni di caffeina ai fini di analisi eco-tossicologiche. Le vasche, suddivise in quattro condizioni sperimentali, costituivano l’ambiente di esposizione di esemplari di Mytilus galloprovincialis, sottoposti a test con batterie di biomarker; campionando e analizzando le acque delle diverse vasche in diversi momenti nell’arco di una settimana di durata dell’esperimento, è stato possibile osservare una discrepanza significativa tra le concentrazioni predisposte e quelle effettivamente riscontrate, dovuta alla presenza di valori di fondo elevati (≈ 100 ng/l) nella matrice ambientale. Si è anche notata una cinetica di decadimento della sostanza di tipo esponenziale, più rapida dei casi di letteratura, ipotizzando che ciò avvenisse, oltre che per i normali fenomeni di termodegradazione e fotodegradazione, per l’attività di filtrazione dei molluschi. In seguito sono state raccolte aliquote di acqua presso i punti di immissione e di uscita dall’impianto di depurazione di Cervia (RA), nonchè campioni di acque superficiali, sia dolci che salate, riscontrando un ottimo abbattimento della sostanza da parte dell’impianto (≈ 99 %) e concentrazioni ambientali simili ai valori di fondo dell’esperimento (≈100 ng/l), inferiori rispetto a casi di letteratura per analoga matrice, anche a causa di intense precipitazioni atmosferiche in corrispondenza del prelievo. A suggello delle analisi relative alle acque si è provveduto ad esaminare anche acque di rubinetto, acque di rubinetto soggette a deionizzazione ed un’acqua minerale naturale imbottigliata e commercializzata, rilevando la presenza dello stimolante in ciascuno dei campioni (per ciò che concerne acque della rete idrica a valori simili a quelli ambientali, mentre per acque deionizzate ridotti di circa il 50% e per l’acqua imbottigliata testata abbattuti di oltre l’80%). Le ultime considerazioni sono state relative all’analisi di matrici biologiche mediante le procedure specificamente messe a punto; in questo caso, sia nell’emolinfa che nei tessuti prelevati dai mitili al termine dell’esperimento, si è osservato un bioaccumulo di caffeina che, per ciò che concerne la matrice fluida, è risultato correlato alla concentrazione di esposizione delle vasche, mentre relativamente ai tessuti si è evidenziato del tutto uniforme tra le condizioni sperimentali, facendo ipotizzare un bioaccumulo avvenuto nell’habitat marino, dovuto ai valori ambientali presenti.

Il progetto è stato svolto con l’obiettivo di trovare nuovi metodi alternativi ed a basso impatto ambientale per la caratterizzazione dei vini, commerciali e minori. Infatti, le analisi eseguite presso il Centro Interdipartimentale Grandi Strumenti (CIGS) di Modena, hanno permesso di analizzare i vini della famiglia dei Lambruschi, diventati ormai tra i vini più consumati ed esportati al mondo; i vini della famiglia delle Malvasie, che sempre più si stanno affermando sul mercato; i vini meno conosciuti dell’Emilia-Romagna, prodotti dal Centro di Ricerca delle Produzioni Vegetali (CRPV) di Cesena, sia rossi che bianchi. In particolare, per quel che riguarda i vini rossi, la metabolomica si è rivelata un approccio efficace, e l’utilizzo di strumenti di avanguardia quale lo spettrometro di massa ad alta risoluzione Orbitrap Q Exactive, ha permesso di individuare oltre 100 molecole di antocianine. Tra esse, oltre a quelle glicosilate, acetil-, coumaroil- e caffeoil-glicosilate, sono state individuate molte altre forme derivate, come ad esempio i di-glucosidi, che sono caratteristici delle viti americane, ma sono presenti in tracce anche nelle varietà di V. vinifera, così come le combinazioni con le catechine e le gallocatechine, a più alto peso molecolare. Infatti, i metodi analitici comuni quali spettrofotometria UV o cromatografia liquida UV, non permettono di vedere le molecole presenti in basse concentrazioni, a causa della minore sensibilità dei rivelatori. Inoltre, gli spettrofotometri UV permettono di individuare le molecole solo in base ai tempi di ritenzione di quest’ultime, che spesso co-eluiscono le une con le altre, nonostante il metodo cromatografico sia stato messo a punto in modo adeguato. Analizzando i dati tramite la Principal Component Analysis (PCA), l’Ancellotta è stata confermata, sia in termini di quantità sia come stabilità produttiva, come la varietà più interessante per la produzione di vino da taglio. Anche i Lambruschi Salamino, Grasparossa e Reggiano, sono facilmente distinguibili ed hanno dimostrato anch’essi un’ottima resa, in termini di colore. Dal punto di vista tecnologico, è stato possibile distinguere l’Ancellotta vinificata in rosso da quella vinificata in bianco. Infatti, quella vinificata in rosso, soprattutto nell’annata 2019, si distingue non solo per gli alti contenuti di antocianine glicosilate, che sono tipicamente le più ricercate dagli enologi, ma anche per la grande quantità di antocianine derivate citate precedentemente. Tra i vitigni minori, il Festasio si è rivelato il vino con delle caratteristiche molto simili a quelle dei vini già presenti in commercio, sia in termini qualitativi che quantitativi. Anche il Lambrusco di Fiorano (o Lambrusco del Pellegrino), tipico del Modenese, seppur con una colorazione meno abbondante, ha mostrato caratteristiche interessanti per la vinificazione del Lambrusco. Per quanto riguarda lo studio dei vini bianchi, è stata condotta un’analisi mediante Risonanza Magnetica Nucleare monodimensionale (1H-NMR), approccio tipico delle analisi “untargeted” delle matrici. Questo tipo di analisi, nonostante sia un’analisi più approssimativa rispetto alla spettrometria di massa, ha consentito di caratterizzare efficacemente i vini rossi minori descritti in precedenza, oltre ai vini bianchi minori di Caveccia, Vernaccia del Viandante, Bertinora e Vernaccina, un tempo diffuse soprattutto nelle province rivierasche del Mar Adriatico, e la Melara, originaria della provincia di Piacenza. In particolare, è stato possibile distinguere i vini minori dai vini già presenti in commercio, quali ad esempio i Lambruschi ed il Pignoletto. Di quest’ultimo, è stato inoltre possibile distinguere il prodotto commerciale, e quindi già rifermentato in bottiglia, dal prodotto non ancora rifermentato, con un contenuto alto di zuccheri residui, ed ancora di basso grado alcolico.
The project was carried out with the aim of finding new alternative and low environmental impact methods for the characterization of commercial and minor wines. In fact, the analyzes carried out at the Centro Interdipartimentale Grandi Strumenti (CIGS) in Modena permitted to analyze the wines of the Lambrusco family, which have now become among the most consumed and exported wines in the world; the wines of the Malvasia family, which are increasingly establishing on the market; the lesser known wines of Emilia-Romagna, produced by the Centro di Ricerca delle Produzioni Vegetali (CRPV) of Cesena, both red and white. Regarding to the red wines, metabolomics proved to be an effective approach, and the use of cutting-edge tools such as the high-resolution mass spectrometer Orbitrap Q Exactive, permitted to identify over 100 anthocyanin molecules. Among them, in addition to the most known forms such as glycosylated, acetyl-, coumaroyl- and caffeoyl-glycosylated, many other derivative forms were identified, such as di-glucosides, which are typical of American vines, but are present in traces also in the varieties of V. vinifera, as well as the combinations with catechins and gallocatechins, with higher molecular weight. In fact, with common analytical methods such as UV spectrophotometry or UV liquid chromatography, it is not possible to see the molecules present in low concentrations, due to the lower sensitivity of the detectors. In addition, UV spectrophotometers allow the identification of molecules only based on the retention times, which often co-elute with each other, even though the chromatographic method has been properly developed. By analyzing the data through the Principal Component Analysis (PCA), the Ancellotta was confirmed, both in terms of quantity and production stability, as the most interesting variety to produce blended wine. Even the Lambrusco Salamino, Grasparossa and Reggiano, are easily distinguishable and have also shown an excellent yield, in terms of color. From a technological point of view, it was possible to distinguish the Ancellotta vinified in red from that vinified in white. In fact, the red vinified one, especially in the 2019 vintage, stands out not only for the high contents of glycosylated anthocyanins, which are typically the most appreciated by winemakers, but also for the large amount of derived anthocyanins mentioned above. Among the minor vines, Festasio proved to be the wine with characteristics very similar to those of the wines already on the market, both in qualitative and quantitative terms, and it can be used as blended wine. Lambrusco di Fiorano (or Lambrusco del Pellegrino), typical of the Modena province, even if with a less abundant color, also showed interesting characteristics for the vinification of Lambrusco. As for the analysis of white wines, an analysis was conducted using mono-dimensional Nuclear Magnetic Resonance (1H-NMR), a typical approach of "untargeted" analysis. This type of analysis, despite being a more approximated analysis than mass spectrometry, allowed the characterization of the minor red wines described above, as well as the minor white wines of Caveccia, Vernaccia del Viandante, Bertinora and Vernaccina, once widespread especially in the coastal provinces of the Adriatic Sea, and the Melara, originally from the province of Piacenza. Moreover, it was possible to discriminate minor wines from wines already on the market, such as Lambrusco and Pignoletto. Of the latter, it was also possible to distinguish the commercial product, and therefore already refermented in the bottle, from the product not yet refermented, and thus with a higher content of residual sugars, and still low in alcohol.

Solo una piccola parte dell’enorme quantità di proteine presenti negli alimenti è allergenica, sia nella loro forma nativa sia nelle modifiche derivanti dai processi alimentari. È necessario sviluppare metodi analitici sensibili e veloci per rilevare la presenza di allergeni negli alimenti, nonché analizzare le modifiche indotte dai processi. Questa tipo di ricerca è importante se pensiamo agli sviluppi di nuove strategie analitiche a supporto della riduzione del potenziale allergenico degli alimenti. Oggigiorno, la spettrometria di massa e la cromatografia liquida (LCMS) sono ampiamente utilizzate per la caratterizzazione di proteine e peptidi allergenici, infatti è stato recentemente coniato il termine “allergenomica” per descrivere l’applicazione della proteomica all’analisi di allergeni. Tuttavia, la variabilità degli allergeni alimentari rende difficile sviluppare un metodo generico e universale per la loro caratterizzazione. Una sfida importante per le tecniche di MS è la preparazione del campione e gli aspetti correlati, come avviene ad esempio per gli allergeni da Apiaceae, per molti dei quali vi è una carenza di riferimenti e metodologie. Questo progetto di ricerca mira a dare un contributo alla determinazione degli allergeni alimentari tramite LCMS e a valutare l'effetto di alcuni processi sul potenziale allergenico del cibo attraverso cromatografia liquida nano hplc e spettrometria di massa in trappola ionica con sorgente di ionizzazione elettrospray (nanoHPLC-ESI-IT-MSn). Un approccio bioinformatico dedicato è stato sviluppato al fine di individuare i più importanti allergeni alimentari da formaggio spalmabile e da campioni vegetali della famiglia delle Apiaceae e allo scopo di descrivere gli effetti di diversi sistemi di condizionamento sul potenziale allergenico del formaggio spalmabile. In questo lavoro, il peptide FVAPFPEVF dell’ allergene di latte vaccino Bos d 9 e il peptide QEPVLGPVRGPFPIIV dell’allergene Bos d 11 sono stati identificati e proposti per la rilevazione di allergeni del latte e per le analisi future in questo campo come ad esempio per scopi di quantificazione. Inoltre, i risultati hanno dimostrato l'effetto di alcune tecniche di condizionamento sulla riduzione del potere allergenico totale del formaggio spalmabile, e hanno rilevato il trattamento il trattamento S1 (basato su sorbato di potassio) come una soluzione ottimale per ridurre la potenziale allergenicità di questo prodotto, sia in termini di intensità che in termini di variabilità allergeniche. Utilizzando una strategia simile, diversi esperimenti sono stati eseguiti per rilevare la presenza di allergeni di Apiaceae da campioni vegetali e caratterizzare uno o più potenziali marcatori per la loro rilevazione dal cibo utilizzando tecniche di LCMS. Tra questi, il peptide idrofilo FYETKDTDILAAFR dell’allergene Spi o Rubisco viene proposto come potenziale marcatore per il rilevamento di routine di allergeni da Apiaceae attraverso ESI-MSn. In questo caso altri aspetti riguardanti questo allergene dovrebbero essere studiati, come gli effetti da processi alimentari e il suo ruolo nelle reazioni allergiche (caratterizzazione degli epitopi). In quest'ultima fase, una particolare attenzione è stata prestata alla preparazione del campione e alla selezione di tamponi estraenti eco-compatibili, e alla ottimizzazione globale delle condizioni sperimentali dell’analisi LCMS.
Food contains a lot of proteins, but only a small fraction of them are allergens either in their native forms or in products resulting from food processing. There is a need for sensitive and rapid methods for detecting the presence of allergens in foods, as well as analyse the modifications induced by food processing. This research is important if we realize the potential of new analitycal strategies andnovel processing techniques that may reduce the allergenicity of foods. Nowadays, mass Spectrometry and Liquid Chromatography (LC) are extensively used for the characterization of allergenic proteins and peptides: the application of proteomics for the analysis of allergenic proteins has been recently termed allergenomics. Unfortunately, the variability of food allergens makes it difficult to develop a generic and universal method for their characterization. A major challenge for MS techniques is sample preparation and its related issues, as in the case of Apiaceae allergens, for many of which there is a lack of reference materials and methodologies. This PhD thesis research project aimed to make a contribution for the determination of food allergens by LCMS and to evaluate the effect of some food processing on allergenicity of food through nanoliquid chromatography and electrospray ionization-ion trap mass spectrometry (nanoHPLC-ESI-IT-MSn). A specific bioinformatic approach was developed, in order to characterize the most important food allergens from soft cheese and plant samples from the Apiaceae family and to describe the effects to the allergenic potential of soft cheese samples during several conditioning systems. In this work, the peptides FVAPFPEVF from cow’s milk (CM) allergen Bos d 9 and the peptide QEPVLGPVRGPFPIIV from CM allergen Bos d 11 were identified and proposed as valid marker peptides for CM allergens detection and for future analysis in this field, e.g. for quantification purposes. In addition, the results demonstrated the effect of some packaging conditions on reducing the total allergenic power of soft cheese, and showed the condition treatment S1 (based on potassium sorbate) as an optimal solution for reducing the total potential of soft cheese, both in terms of allergenic intensity and in terms of allergen variability. Using a similar strategy, several experiments were also performed for detecting the presence of Apiaceae allergens from plant samples and to characterize one or more potential markers for their detection in food using LCMS. Among those, the hydrophilic peptide FYETKDTDILAAFR from the allergen Spi o Rubisco is proposed as a potential marker for routine detection of Apiaceae allergens in food through ESI-MSn. Other aspects regarding this allergen should be investigated, such as its behaviour under food processing and its role in the allergenic reactions (epitope mapping). In this last step, a particular attention was given to the sample preparation and to the selection of eco-compatible extraction buffers, and to the overall optimization of LCMS experimental conditions.

This thesis has been focused on the proteomic characterization of human saliva from donors of different ages, starting from birth up to adult age, and pediatric brain tumor tissues. The first study has been performed in order to compare the acid-insoluble fraction of saliva from preterm with at-term newborns and adults and establish if differences exist. In the second study medulloblastoma and pilocytic astrocytoma pediatric brain tumor extracts have been compared. In both studies 2- DE analysis was coupled with high resolution tandem mass spectrometry (MS/MS). The proteomic characterization of the acid-insoluble fractions of saliva from preterm newborns allowed to integrate data previously obtained on the acid-soluble fraction by HPLC-electrospray ionization (ESI)-mass spectrometry (MS), and to evidence several differences between preterm newborns, at-term newborns and adults. Spots differentially expressed between the three groups, according to image analysis of the gels, were submitted to in-gel tryptic digestion and the peptide mixture analyzed by high performance HPLC-ESI-MS/MS for their characterization. By this strategy, we identified three over-expressed proteins in atterm newborns with respect to preterm newborns and adults (BPI fold-containing family A member 1, two proteoforms of annexin A1, and keratin type 1 cytoskeletal 13), and several over-expressed proteins in adults (fatty acid-binding protein, S100A6, S100A7, two proteoforms of S100A9, several proteoforms of prolactin-inducible protein, Ig kappa chain, two proteoforms of cystatin SN, one proteoform of cystatin S and several proteoforms of α-amylase 1). Moreover, for the first time, it was possible to assign by MS/MS four spots of human saliva 2-DE, already detected by other authors, to different proteoforms of S100A9. The strategy applied used a sequential staining protocol to the 2-DE gels, first with Pro-Q Diamond, that allows specific detection of phosphoproteins, and successively with total protein SYPRO Ruby stain. In the second study, proteomic analysis of two pediatric brain tumor tissues pointed out differences between medulloblastoma, the prevalent malignant tumor in childhood, and pilocytic astrocytoma, the most common, that only rarely shows a malignant progression. Due to the limited availability of bioptic tissue, the study was performed on pooled tumor tissues, and was focused on acid-insoluble fraction to integrate the characterization performed by a group of colleagues in Rome on the acid-soluble fraction by high performance HPLC-ESI-MS/MS. The results indicated that the two tumors exhibit different proteomic profiles and evidenced interesting differential expression of several proteins. Among them, peroxiredoxin- 1, peptidyl-prolyl cis–trans isomerase A, heterogeneous nuclear ribonucleoproteins A2/B1, mitochondrial isoform of malate dehydrogenase, nucleoside diphosphate kinase A, glutathione S-transferase P and fructose bisphosphate aldolase A resulted significantly over-expressed in medulloblastoma while glial fibrillary acidic protein, serotransferrin, α crystallin B chain, ferritin light chain, annexin A5, fatty acid-binding protein (brain), sorcin and apolipoprotein A-I resulted significantly over-expressed in pilocytic astrocytoma. In conclusion, the work done allowed to evidence the usefulness of using an integrated bottom-up/top-down approach, based on 2-DE-MS analysis and high performance MS in order to obtain a complete characterization of the proteome under investigation, revealing and identifying, not only peptides and small proteins, but also proteins with higher MW, that often it is not possible to identify by using exclusively a top-down ESI-MS approach.

Le proteine prive di una struttura terziaria stabile sono definite proteine intrinsecamente disordinate (IDP). La risultante plasticità conformazionale conferisce alle IDP l’abilità di interagire con numerosi partner. Di conseguenza, le IDP sono coinvolte nelle cascate di trasduzione del segnale e nei fenomeni di condensazione proteica (detti separazione di fase liquido-liquido), i quali originano i cosiddetti “organelli privi di membrana” (MLO). Gli MLO includono svariati condensati citoplasmatici e nucleari che svolgono funzioni biologiche cruciali nella cellula. Le IDP mantengono il proprio network di interazioni principalmente attraverso contatti elettrostatici, essendo le loro catene particolarmente ricche di residui cationici ed anionici. La distribuzione delle cariche opposte (o patterning delle cariche) è emersa come caratteristica chiave responsabile delle dimensioni complessive e della propensione alla condensazione delle IDP. Un parametro di sequenza, k, è stato introdotto per descrivere in maniera quantitativa il patterning delle cariche nelle catene polipeptidiche. Investigare l’importanza del patterning delle cariche in relazione alla conformazione delle IDP e alla separazione di fase è l’obiettivo principale di questa tesi, che si organizza in due sezioni. Nella prima sezione, è stato studiato l’effetto della distribuzione delle cariche sull’ensemble conformazionale di IDP modello, determinando parallelamente l’influenza del contenuto di proline e degli elementi di struttura secondaria. Tre regioni intrinsecamente disordinate modello (IDR), ovvero NTAIL, PNT4 e NFM, similmente cariche ma con differente contenuto di proline, sono state permutate così da ottenere, a partire da ciascuna sequenza wild-type (wt), due varianti di k che presentano una differente distribuzione dei residui carichi: un costrutto “Low k”, che mostra un’alternanza più regolare rispetto alla proteina wt dei residui dotati di carica opposta; una variante “High k” con una separazione più pronunciata delle cariche elettriche opposte. La composizione amminoacidica complessiva e le coordinate dei residui non carichi non sono state alterate. Le proprietà conformazionali della proteina wt e delle varianti di k sono state determinate combinando la cromatografia ad esclusione molecolare e la spettrometria di massa nativa. I dati sperimentali suggeriscono che la clusterizzazione delle cariche produce il rimodellamento dell’ensemble conformazionale delle IDP, il quale promuove la compattazione della catena polipeptidica e/o l’acquisizione di una forma più sferica in maniera proteino-specifica, secondo il contesto di sequenza. Nella seconda sezione, il patterning delle cariche è stato analizzato in relazione ai fenomeni di separazione di fase. Il dominio disordinato N-terminale (hNTD) della topoisomerasi I umana è stato scelto come IDR modello a causa dell’elevata densità di residui carichi e della sua propensione alla separazione di fase predetta attraverso metodi bioinformatici. Due mutanti di carica di hNTD, Mk-NTD e Hk-NTD, caratterizzati da una progressiva clusterizzazione dei residui cationici ed anionici, sono stati prodotti al fine di verificare l’impatto del patterning delle cariche sul processo di separazione di fase. Sono stati impiegati il salto di pH e l’aggiunta di RNA come stimoli efficienti per promuovere la condensazione delle proteine modello. Le analisi di turbidimetria e microscopia confocale hanno confermato che hNTD va incontro a separazione di fase attraverso interazioni elettrostatiche e che una più spiccata clusterizzazione dei residui amminoacidici con carica opposta intacca la morfologia dei condensati e la sensibilità a sali e RNA. Complessivamente, i risultati inclusi in questa tesi di dottorato aiutano a delineare il ruolo sfaccettato della distribuzione delle cariche nel determinare sia le proprietà della singola catena che quelle multi-catena.
Proteins lacking a stable tertiary structure are defined as intrinsically disordered proteins (IDPs). The resulting conformational plasticity gives IDPs the ability to rapidly and reversibly respond to environmental changes and to interact with multiple partners, acquiring an ordered structure upon binding or maintaining fuzzy conformations. As a consequence, IDPs are largely involved in signal transduction cascades and protein condensation phenomena (designated as liquid-liquid phase separation), which give rise to the so-called “membraneless organelles” (MLOs). MLOs include many cytoplasmatic and nuclear condensates, such as stress granules and the nucleolus, which exert crucial biological functions in the cell. IDPs maintain this interaction network primarily through electrostatic contacts, being their chains particularly enriched in cationic and anionic residues, together with prolines and glycines. Besides the net charge of the proteins, the distribution of opposite charges (or charge patterning) has emerged as a key feature dictating the overall size and condensation propensity of IDPs. A sequence parameter, k, has been introduced to quantitatively describe charge patterning in polypeptide chains. Investigating the relevance of charge patterning on IDP conformation and phase separation is the main objective of this thesis, which is organized into two sections. In the first section, the effect of charge distribution on the conformational ensemble of model IDPs was studied, in parallel assessing the influence of other sequence features such as proline content and secondary structure elements. Three model intrinsically disordered regions (IDRs), namely NTAIL, PNT4 and NFM, similarly charged yet with different proline fractions, were permutated in order to obtain from each wild-type (wt) sequence two k -variants with different distributions of charged residues: a “Low-k" variant, with a more regular alternation of oppositely charged residues than in the wt protein; a “High- k" variant with a more pronounced separation of opposite charges. The overall amino acid composition and the coordinates of uncharged residues were not altered. Conformational properties of wt and k-variants were assessed combining size-exclusion chromatography and native mass spectrometry. Experimental data confirm that charge clustering induces the remodeling of the IDP conformational ensemble, promoting chain compaction and/or increasing the spherical shape in a protein-specific manner, depending on the sequence context. In the second section, charge patterning was analyzed in relation to phase separation phenomena. The disordered N-terminal domain (hNTD) of human topoisomerase I was chosen as the model IDR for this study due the high density of its charged residues and the propensity for phase separation predicted by bioinformatic methods. It was observed that the charge pattern of NTDs follows a clear evolutionary trend, with vertebrates showing an extremely regular distribution of opposite charges, while yeasts and fungi present the strongest charge separation. Two hNTD charge permutants, named Mk-NTD and Hk-NTD, with progressive clustering of opposite charges, were recombinantly produced to assess the impact of different charge patterns on phase separation. The pH jump and the addition of RNA proved to be effective stimuli for the condensation of all model proteins. Turbidimetric and confocal microscopy analyses confirmed that hNTD undergoes phase separation through electrostatic interactions and that the increased clustering of residues with opposite charges impairs condensate morphology and sensitivity to salts and RNA. Overall, the results included in this thesis help delineate the multifaceted role of charge patterning in determining both single-chain and multiple-chain properties.

Wilson’s disease, SAPHO syndrome and Hereditary angioedema are three rare disorders characterized by a wide spectrum of different clinical manifestations, which involve several organs and apparatus, making the diagnosis extremely difficult. In this study, the salivary proteome and peptidome of subjects affected by these pathologies has been investigated using mass spectrometry, through an integrated top-down and bottom-up platform, and compared with groups of healthy controls, with the aim to assess whether qualitative and quantitative variations of salivary proteins and peptides could be associated to the immune derangement distinctive of each disease and in order to have suggestions on potential specific salivary biomarkers. The analysis of the salivary proteome from patients affected by Wilson’s disease allowed to characterize new oxidized proteoforms of S100A8 and S100A9 and two fragments of the polymeric immunoglobulin receptor named ASVD and AVAD. Higher levels of these proteins and peptides observed in the patients are most likely connected to the oxidative stress, the activation of the inflammatory processes, and the hepatic damage caused by the altered copper transport and its subsequent accumulation in the organism, which is at the origin of the pathology. The observed increase of the level of α-defensins 2 and 4 may give a contribution to the development of the disease by the improvement of the free copper. The proteome of patients affected by SAPHO syndrome revealed a significant decrease of cystatins, histatins, and aPRPs, which are involved in the protection against infections, suggesting a reduced ability of these subjects to contrast bacteria colonization, in particular P. acnes which is a possible trigger of this disease. In particular, the lower levels of histatins and the higher frequency of S100A12 observed in patients with respect to controls, may be connected with the dysregulation of the innate immunity and the neutrophil response typical of SAPHO syndrome. Cystatin SN abundance decrease correlated with the disease duration, suggesting its reduced production during the chronic phase of the ~ 5 ~ disease, while histatins showed positive correlation with serum levels of the C reactive protein. In saliva of Hereditary angioedema patients, the increased percentage of peptides generated by the proteolytic cleavage by metalloproteinases indicates the intense metalloproteinase activity possibly connected to the activation of inflammatory pathways. Interestingly, in consideration of the possible role of cystatin B in enhancing the production of nitric oxide, and the higher salivary levels measured in the patients, we suggest that cystatin B may give a contribution to the vasodilatation and the vasopermeability responsible for the oedema formation, which is the main feature of this pathology. In conclusion, the results obtained in these studies clearly highlighted that the salivary proteome showed some features specific of the three pathologies. Even though these results have been obtained in a small cohort of patients, due to the difficult recruitment of subjects affected by rare disorders, and need further validation by using orthogonal techniques, they strongly suggest that saliva, with easy and non-invasive collection characteristics, could be a biofluid suitable for diagnostic applications.

The controlled growth of nanostructured thin films represents a challenging field of research which is related to many different applications of great scientific relevance. The properties of many materials can be greatly enhanced by optimizing the nanoscale assembly processes: by modelling the nanoparticles which create and assemble a film it is possible to achieve very promising results, although it requires a bottom-up approach capable of tailoring the properties with a high level of control or a complex set-up. Plasma-based synthesis processes have been widely developed and applied for an increasing number of technologies leading to important achievements and many industrial-scale applications, in particular in the field of nanoscience. Plasma Assisted Supersonic Jet Deposition offers a novel approach for nanostructured thin films deposition by combining a reactive plasma with a supersonic jet. An argon-oxygen inductively coupled plasma offers a reactive environment where a metalorganic precursor (titanium isopropoxide for TiO2 depositions) is dissociated and oxidized. The gas is then left to expand from a small orifice into a lower pressure vacuum vessel forming a supersonic jet, where the TiO2 nanoparticles are accelerated onto a substrate by the gas carrier mixture. This deposition technique has proven useful for the deposition of nanostructured thin film having a desired morphology at competitive deposition rates. In order to achieve an effective improvement of the synthesis process, an accurate knowledge of the expanding plasma jet chemistry and physics is of fundamental importance. In this PhD project a deep characterization of the supersonic plasma jet was performed using different diagnostics. The plasma discharge in the reactor was monitored by optical emission spectroscopy, Langmuir probes and the measurement of voltage and current across the antenna of the ICP source. The supersonic plasma jet was characterized using a quadrupole mass spectrometer to sample the gas from the jet at different positions along its axis of symmetry. The detection of neutral species, radicals, ion fluxes and their energy distribution functions led to an understanding of the expanding plasma properties, its composition and its influence on thin films deposition. In addition to this, based on experimental observations, a MATLAB code was developed to reproduce the ion energy distribution functions numerically from first principle calculations. During this project plasma assisted supersonic jet deposition was also operated for the deposition of nanostructured TiO2 samples whose chemical, physical and morphological properties were analysed by FTIR, profilometry, ellipsometry, AFM and SEM.

L’evidenza di un’associazione fra esposizione a sostanze in grado di interagire con il sistema endocrino (interferenti endocrini, IE) e patologie umane quali infertilità e poliabortività, disturbi neuro-comportamentali o pubertà precoce ha indirizzato, negli anni recenti, molteplici attività di ricerca volte ad approfondire le conoscenze sulle potenziali vie e modalità di esposizione della popolazione a tali sostanze. Il presente lavoro di tesi si inserisce all'interno di tale emergente tematica con l’obiettivo di approfondire lo stato delle conoscenze sul ruolo delle acque ad uso potabile quale possibile fonte di esposizione agli interferenti endocrini. A tale scopo sono stati utilizzati alcuni tra i più innovativi metodi chimici e biologici, al fine di una valutazione quali-quantitativa di tali composti in campioni di acqua prelevati sia prima che dopo trattamento di potabilizzazione, verificando in tal modo anche l’efficacia di rimozione di tali specie. E' stato applicato un metodo chimico analitico molto sensibile, basato sulla cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa tandem (LC/MS/MS) per la ricerca e quantificazione di IE selezionati; inoltre sono stati applicati due specifici test biologici: l’E-SCREEN ASSAY, in grado di evidenziare l’eventuale presenza di xenobiotici estrogeno-mimetici nella matrice acquosa ed il test dei micronuclei (MC) per evidenziare la eventuale genotossicità degli stessi campioni d’acqua. Entrambi i test sono stati eseguiti esponendo ai campioni di acqua le cellule MCF-7, appartenenti alla linea cellulare epiteliale di adenocarcinoma umano. Tale lavoro fornisce informazioni sulla presenza/assenza di un certo numero di IE nelle acque analizzate, e la assenza di estrogenicità e genotossicità dei campioni di acque potabili in esame. Il lavoro sottolinea la importanza di utilizzare test biologici, a fianco di indagini di tipo chimico, nell'ambito del monitoraggio ambientale, dove le due tipologie di analisi giocano un ruolo complementare.

In this PhD thesis, the capability of analytical systems based on high-resolution mass spectrometry (HRMS) has been investigated for the determination of emerging contaminants in environmental matrices and foodstuff. Since the molecular structures of the emerging contaminants could be know as well as unknown, target, suspect and non-target analyses have to be developed in order to propose a “mass-based” advanced screening. Attention has been focused on the scale-up process in the identification confidence by developing different specific protocols. Two protocols based on HPLC/Q-TOF-MS have been developed for the simultaneous screening and confirmatory analysis of target and non-target cyanotoxins in freshwater intended for human consumption, PDE-5 inhibitors and analogues in food supplements marked as erectile dysfunction remedies. Both protocols have been optimized with the aim to obtain HRMS data of pseudomolecular ions and fragmentation patterns in tandem MS mode. In-house databases were implemented to simplify the data treatment. The application of these protocols in “non-target screening” mode has been attempted in real samples and in the frame of a collaborative trial organized by European NORMAN foundation as regard as the analysis of water contaminants. The exercise was complex and time consuming, and it has highlighted the strengths and weaknesses of the developed protocols. The crucial step in non-target screening was the assignment of reliable molecular formula to the m/z values. A specific workflow based on direct infusion and HRMS analysis by using an Orbitrap™ mass spectrometer has been developed for the characterization of PM2.5 organic fraction. The automatization of the data treatment using Mathematica based algorithms was accomplished for studying the chemical composition of PM2.5 organic fraction. Contextually, the possible use of the Atmospheric Pressure Photoionization source for characterizing PM2.5 organic fraction has been investigated on real samples.
In questa tesi di dottorato, le possibilità dell’uso della spettrometria di massa ad alta risoluzione (HRMS) sono state indagate nella determinazione di contaminanti emergenti in matrici ambientali ed alimentari. Dal momento che le strutture molecolari dei contaminanti emergenti potrebbero essere ancora sconosciute, la loro determinazione richiede analisi di tipo target, di composti sospetti e non-target devono essere sviluppati al fine di proporre una metodologia di screening avanzata basata sulla spettrometria di massa. L'attenzione è stata focalizzata sul processo di scale-up nella confidenza di identificazione, sviluppando protocolli analitici specifici. Due protocolli per la simultanea analisi target e di composti sospetti, basati sulla piattaforma HPLC-Q-TOF, sono stati sviluppati ad applicati nell'analisi di cianotossine in acqua dolce destinata al consumo umano e inibitori del PDE-5 negli integratori alimentari venduti come rimedi per la disfunzione erettile. Entrambi i protocolli sono stati ottimizzati con lo scopo di ottenere dai dati mass-spettrometrici in modalità tandemMS, gli ioni pseudomoleculari e lo spettro di frammentazione. Librerie sono state sviluppate e implementate per semplificare il trattamento dei dati. La possibile applicazione di questi protocolli nell'analisi di tipo non-target è stata tentata su campioni reali nell'ambito di una prova collaborativa organizzata dall'associazione Europea NORMAN, riguardante l'analisi di contaminanti nell'acqua. L'esercizio è stato complesso e richiedente molto tempo, e ha messo in evidenza i punti di forza e di debolezza dei protocolli sviluppati. Il passaggio cruciale nell'analisi non-target è l'assegnazione di formule molecolari veritiere ai valori m/z. Un workflow di analisi basato sulla infusione diretta del campione e l'acquisizione di massa utilizzando un Orbitrap ™ è stato sviluppato e automatizzato utilizzando algoritmi basati sul linguaggio di programmazione Mathematica, per studiare la composizione chimica della frazione organica del PM2.5. Contestualmente, l'eventuale uso della fotoionizzazione a pressione atmosferica (APPI) per la caratterizzazione frazione organica del PM2.5 è stata indagata su campioni reali.

Il carcinoma a cellule renali rappresenta la più frequente forma di tumore al rene, e il carcinoma a cellule chiare ne è il morfotipo più ricorrente (80% dei casi). Ad oggi la nefrectomia, totale o parziale, rimane il trattamento di elezione. E’ evidente, quindi, la necessità di indagare a fondo gli aspetti molecolari associati alla progressione del tumore, con il fine ultimo di produrre conoscenze utili alla diagnosi o trattamento delle lesioni stesse. In questo lavoro abbiamo utilizzato approcci proteomici complementari per lo studio dei processi associati all’insorgenza e alla progressione (stadio e grado) dei tumori: Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation – Mass Spectrometry Imaging (MALDI-MSI) e nLC-ESI MS/MS. Combinando l’utilizzo di fluidi biologici, che non richiedono tecniche invasive, e l’analisi diretta del tessuto tumorale, abbiamo approfondito lo studio delle modifiche proteomiche associate alla progressione del carcinoma renale a cellule chiare. Inizialmente abbiamo considerato le informazioni ottenibili da diversi fluidi biologici: urine e plasma. Abbiamo quindi valutato la distribuzione spaziale di peptidi triptici in aree del tumore a diversi gradi (MALDI-MSI), associandovi l’analisi di omogenati di tessuto per aumentare le informazioni quali-quantitative ottenibili (nLC-ESI MS/MS). Infine, abbiamo mostrato come informazioni relative alla dimensione e allo stadio della lesione siano rilevabili anche dalle urine del paziente. Attualmente sono in corso studi più approfonditi sui processi biologici coinvolti e dati preliminari suggeriscono un ruolo fondamentale dei processi metabolici nella progressione del tumore. Inoltre, è stato messo a punto un protocollo per l’analisi di N-glicani direttamente da tessuto, che sarà utilizzato per valutare la loro espressione in diverse aree del tumore. In conclusione, siamo fiduciosi che tutti i dati raccolti possano portare a una miglior comprensione dei processi coinvolti nella progressione del tumore renale a cellule chiare.
Renal Cell Carcinoma (RCC) is the most frequent form of kidney cancer and approximately 80% of cases are defined as clear cell RCC (ccRCC). Partial or total nephrectomy remain the gold standard for the routine treatment of ccRCC, therefore a better understanding of molecular aspects associated to tumour progression could be useful for its diagnosis, prognosis and treatment. Nowadays proteomic approaches are more readily used to investigate the processes that drive disease onset and progression. In this work, two complementary technologies, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation – Mass Spectrometry Imaging (MALDI-MSI) and nLC-ESI MS/MS, were used to detect alterations within tumour lesions and to perform protein identification and quantification. Likewise, employing both tissue and body fluids (urine-plasma) ensures a strong correlation with the disease, a high degree of lesion specificity whilst at the same time enables the use of more readily accessible samples. Therefore, the aim of this study was to investigate proteomic changes in different human specimens related to early pathological modifications and ccRCC progression. Our study on ccRCC started with the evaluation of the information that can be obtained from urine and plasma from patients with ccRCC. Then, MALDI-MSI was used to evaluate the spatial distribution of tryptic peptides directly on tissue, and the molecular data has been correlated to morphological annotation (grade). Moreover, in situ findings has been combined with those obtained from tissue homogenates and better understanding of molecular changes among the four grades has been provided. Finally, we demonstrate the possibility to detect in urine alterations determined by the stage of the lesion. Further work related to the study of ccRCC tissue is currently ongoing. At first, the biological role of the proteins resulted to be altered and the pathways involved in grade progression are under investigation. Preliminary data suggest the essential role of metabolic alterations in ccRCC progression. Moreover, a protocol for realised N-glycans analysis directly on tissue has been optimised and this protocol will be used to evaluate N-glycans trait on different ccRCC grade areas. In conclusion, it is hoped that the data obtained along with the additional work planned, could better clarify the biological processes involved in ccRCC progression.

Thiols are reduced sulphur molecules that occur both in plants and animals with relevant roles. The thiol group is strongly nucleophilic, thus participating in a lot of biological redox processes, as for example the modulation of oxidative stress and participation to enzymatic reactions. Low-molecular-weight (LMW) thiols are a class of highly reactive compounds mainly involved in the maintenance of the redox homeostasis in the cells, thanks to the reactivity of their nucleophilic sulfur groups. In plants, they are implicated in the responses to almost all stress factors, as well as in the regulation of cell metabolism. Moreover, they can conjugate or make complexes with xenobiotics and toxic compounds (detoxification processes) and deactivate them, and they can post-translationally modify regulatory enzymes. They also have important implications in food quality and safety, as well as in human health. The most studied LMW thiols are glutathione and its biosynthetically related compounds (cysteine, gamma-glutamylcysteine and cysteinylglycine). Other LMW thiols are described in the literature, such as cysteamine, homocysteine, and many species-specific volatile thiols but less is known about them. Research shows that exists a huge amount of thiols in plants, but many species-specific and organ-specific thiols remain to be identified. Some of these unknown LMW thiols have light dependence, suggesting that they could be related to the photosynthesis processes. Recent advances in technology should help in this challenging work, helping to know the physiological and metabolic function in plants. However, their identification remains challenging due to their low concentration in plant tissues. In order to discover new unidentified thiols, in this work it was carried out a derivatization with SBD-F (ammonium 7-fluoro 2,1,3-benzooxadiazole-4-sulfonate) of the plant extracts, and then, SBD-derivatives were analyzed by HPLC-fluorescence and LC-MS/MS in negative mode using an ion trap (Varian 500 MS), to obtain their fragmentation pattern. Known LMW thiols such as cysteine, homocysteine, glutathione, cysteamine, gamma-glutamylcysteine, N-acetylcysteine and cysteinylglycine were used as reference compounds and their fragmentation pattern was first studied in order to highlight a fragmentation rule and molecular markers to systematically identify the unknown LMW thiols. Also high resolution measurements were obtained on a Xevo G-2 Q-TOF mass spectrometer (Waters). After the derivatization with the fluorophore, thiols can be easily recognized in fragmentation spectra due to the presence of a clear signal arising from the SBD-S fragment (m/z 231). This fragment corresponds to the fluorophore attached to the sulphur group from the LMW thiol. This signal was then used as a marker to confirm the presence of thiol groups in unknown molecules. In this way, some molecules could be identified and further confirmed by Q-TOF analysis; as for example the presence of thioglucose and glutathione containing derivatives. This protocol now opens the way to the identification of unknown thiol molecules. In winemaking processes, LMW thiols and specifically GSH, have an antioxidant function, which is present in grapes, must and wine. They help contrasting the oxidative browning by protecting grapes, and also the must during fermentation and the wine during the aging processes. They have a key role in the antioxidant activity by protecting wines, mostly white ones, from the oxidative process during aging. Due to this fact, in this study it was also tried to develop and optimize an easy and fast method to quantify the amount of LMW thiols in several German grape varieties (white and red). These compounds were extracted and analyzed using the fluorescent dye SBD-F and HPLC-FL separation. Also using HPLC, the sugars and organic acids were also quantified. The results of this quantification show that there is a very good reproducibility either in sampling or in the measurement of these compounds in the grape berries. This method can be also applied in must, wine and yeast. The method allowed not only the quantification of GSH, but also of its related compounds: cysteine, gamma-glutamylcysteine and cysteinylglycine in the same chromatogram, showing also the correlation between them. This study on German grape varieties is then showing that GSH is the most important LMW thiol in grapes, whose content is largely depending on the variety. Given their role as an antioxidant and possible beneficial effects during the winemaking processes, GSH and related LMW thiols are an important factor to consider in the evaluation of the grapes used for making wine.
I tioli sono composti ridotti dello zolfo che svolgono importanti funzioni in animali e piante. Il gruppo -SH è fortemente nucleofilo, per tale motivo queste molecole sono spesso coinvolte in processi biologici di ossidoriduzione, come ad esempio la modulazione degli stress ossidativi e la partecipazione a varie reazioni enzimatiche. I tioli a basso peso molecolare (LMW) sono una classe di composti coinvolti principalmente nel mantenimento dell’omeostasi ossidoriduttiva nella cellula, tale caratteristica si deve alla reattività dei loro gruppi tiolici nucleofili. Nelle piante sono coinvolti nella risposta a quasi tutti i fattori di stress e nella regolazione del metabolismo cellulare. I tioli LMW possono legarsi o creare complessi con composti tossici disattivandoli (detossificazione), inoltre possono modificare, dopo la traduzione, enzimi regolatori. Queste molecole sono implicate nella qualità e salubrità degli alimenti e anche nella salute umana. I tioli LMW più studiati sono il glutatione e i suoi composti derivati (cisteina, gamma-glutamil-cisteina e cisteinil-glicina). In letteratura sonostati descritti altri tioli LMW come la cisteammina, l’omocisteina e molti altri tioli volatili specie-specifici di cui però poco è conosciuto. In particolare, nelle piante è dimostrata la presenza di moltissimi tioli specie-specifici e organo-specifici molti dei quali però non sono ancora stati identificati. Alcuni di questi tioli LMW sconosciuti sono luce-dipendenti e ciò suggerisce un loro coinvolgimento nel processo della fotosintesi. I miglioramenti nella tecnologia potrebbero aiutare lo studio e la conoscenza della funzione fisiologica e metabolica di questi composti. Tuttavia la loro identificazione è resa ardua dalla loro bassa concentrazione nei tessuti vegetali. In questo lavoro, allo scopo di scoprire nuovi tioli non ancora identificati, sono stati derivatizati con SBD-F degli estratti di piante e in seguito i derivatizzati sono stati sottoposti ad analisi HPLC a fluorescenza e LC-MS/MS in modalità negativa usando una trappola ionica (Varian 500 MS) per ottenere la frammentazione. Sono stati usati come riferimento i tioli LMW già noti come la cisteina, l’omocisteina, il glutatione, la cisteammina, la gamma-glutamil-cisteina, l’N-acetilcisteina e la cisteinil-glicina, i cui modelli di frammentazione sono stati inizialmente studiati per evidenziare la modalità di frammentazione e i marcatori molecolari che hanno consentito la identificazione sistematica di tioli LMW sconosciuti. Inoltre è stata ottenuta la misurazione ad alta risoluzione su spettrometro di massa Q-ToF (Waters) su Xevo G-2. Dopo la derivatizzazione con fluoroforo i tioli possono essere facilmente riconosciuti dallo spettro di frammentazione per la presenza di un chiaro segnale dato dal frammento SBD-S (m/z 231). Questo frammento corrisponde al fluoroforo legato al gruppo tiolico, ed è stato usato per marcare e confermare la presenza del gruppo tiolico nelle molecole sconosciute. In questo modo le molecole possono essere identificatee poi confermate dall’analisi Q-ToF come nel caso del tioglucosio e di derivati contenenti glutatione. Il protocollo che è stato definito con il presente lavoro permette ora l’identificazione di nuovi composti dello zolfo al momento sconosciuti. Nel processo di produzione del vino, i tioli LMW e il glutatione in particolare, hanno una importante funzione antiossidante che si manifesta nell’uva, nel mosto e nel vino. I tioli contribuiscono a contrastare l’imbrunimento ossidativo delle proteine nell’uva e soprattutto nel mosto durante la fermentazione e del vino nei diversi processi di lavorazione. I tioli giocano perciò un ruolo chiave nella conservazione del vino con la loro attività antiossidante, in particolar modo nei vini bianchi. Per questa ragione è stato condotto uno studio volto a sviluppare una metodologia semplice e rapida per la quantificazione dei tioli LWM totali. In tale studio sono state poste a confronto diverse varietà tedesche di uva da vino. I composti dello zolfo sono stati estratti ed analizzati utilizzando un colorante fluorescente SBD-F e separazione HPLC-FL. Sono stati quantificati anche gli zuccheri e gli acidi organici tramite HPLC. I risultati di questa quantificazione mostrano un’elevata riproducibilità tra i campioni e tra le misurazioni di questi composti nelle bacche. Il metodo è utilizzabile anche su mosto, vino e lieviti. Il metodo permette non solo la quantificazione del glutatione ma anche di altri composti relativi nello stesso cromatogramma e mostra una correlazione tra di essi. Il confronto di varietà differenti mostra la presenza di GSH nella maggior parte dei tioli dell’uva, mentre il loro contenuto è molto influenzato dalla varietà. In considerazione del loro ruolo di antiossidanti, il GSH e i tioli LMW possono avere un ruolo favorevole nella vinificazione e sono perciò un fattore fondamentale che deve essere preso in considerazione nelle decisioni che riguardano il processo di produzione del vino.

Cancer is a group a diseases that involves abnormal cell growth with potential to invade or spread to other parts of the body, and it represents the second leading cause of death in developed countries. Cisplatin is one of the most chemotherapeutic drug. In spite of its great efficacy, it shows several side effects and most patients develop a resistance to cisplatin. To overcome the cisplatin resistance, drugs are often administered in combination in order to exploit the drug synergy. After discovery of cisplatin, the research focused on metal complexes less toxic, more effective and that exploit synergistic effect when used in combination. In this work I studied new copper, zinc and vanadium complexes with biological activity. I tested in vitro the studied compounds alone and in combination with drug currently in use against a panel of wild type tumour cell lines and their cisplatin-resistant sublines. I applied chemometric tools such as experimental design (ED) and artificial neural networks (ANNs) to the biochemical data collected. Finally, I used the artificial neural networks to evaluate the cell culture cross-contamination. I selected a new family of copper(II) complexes with 1,10-phenanthroline (phen), 1,10-phenanthrolin-5,6-dione (phendione), and 1,10-phenanthrolin-5,6-diol (phendiol) for the synthesis of new antiproliferative agents. Considering that the DNA is an important target for several cytotoxic metal complexes, I studied the interaction of these Cu(II) complexes with DNA. I tested the ligands and complexes against normal and tumour derived human cell lines. I tested combinations of the studied complexes and cisplatin for their potential synergistic effect against a panel of wild type tumour cell lines and their cisplatin-resistant sublines. I evaluated the selectivity of drug combinations testing the compounds also against ex vivo cultures of human normal cell lines. Considering that the synergy may arise from a chemical reaction among the drugs, I studied the possible formation of new adducts between cisplatin, copper(II) complexes and glutathione. I studied the phospholipid profile of wild type human cancer cell lines and their cisplatin-resistant sublines, given that changes in lipid composition and distribution on the cell membranes have been observed in cancer cells. The in vitro cultured cell lines are widely used as model in biomedical research and the cross-contamination of cell lines represents a highly relevant problem. The ex-post discovery of erroneous results and conclusions led to paper retraction and many high-impact journals started to adopt a zero-tolerance policy requiring confirmation of cell line identity as prerequisite for publication. On the base of these considerations, I decided to develop and validate a method for evaluation of cell culture cross-contamination. I also studied zinc and vanadium complexes. Zinc is an essential metal ion involved in a wide variety of biological processes and several proteins bind zinc for their proper functioning. I studied zinc complexes with the drug methimazole (MeImHS) and its anion (MeImS) in order to provide information for the structure prediction and reactivity of Zn-metalloproteins and -metalloenzymes. Vanadium plays a number of roles in biological systems and vanadocene dichloride was the first discovered vanadium species with antitumour activity. Considering that the mechanism of the anticancer agent vanadocene dichloride is closely related to the biotransformation in the blood plasma, I studied the speciation of vanadocene dichloride in the plasma under physiological conditions. In order to prepare new metal complexes, I also synthesized and characterized a new group of Schiff base ligands derived from salicyladehyde and six natural amino acids. For the analysis of the collected data, I used the ED to set up the experiments for the evaluation of the synergistic effect of drug combinations, and for the study of the possible formation of new adducts between cisplatin, glutathione and studied complexes. I used ANNs for predict and quantify the synergism of drugs, and for the evaluation of cell culture cross-contamination levels.

In this thesis we applied proteomic techniques to basic biological topics as well as to clinically relevant issues both in diagnostic and in investigative perspectives. The procedure we employed consisted of electrophoretic separation of the relevant proteins, in-gel-proteolytic fragmentation and finally identification either of precise sites of labelling in irreversible protein PTM by Tgase 2 or of the protein itself in clinically oriented oncologic studies. In protein PTM we have analysed three substrate proteins, troponin, tubulin and mutant dyphtheria toxin. We obtained evidence that TnT was the subunit modified in native troponin and that glutamine 13 is the site of Q-labelling, while the protein is not a K substrate. Data on tubulin and DT are not yet so advanced. Both proteins are however substrates of Tgase 2. Tubulin is better substrate when in the aggregated form and is labelled in the C-terminal region. Moderate crosslinking also occurred. The protein when we focused on is the DT mutant CRM197, which instead undergoes massive crosslinkage forming protein aggregates whose accumulatioon is competed by incorporation of external amines, confirming the occurrence of g-glutamyl-e-lysine isopeptide bonds. In the oncologic studies we used the bi-dimensional electrophoresis and mass spectrometry approach to isolate specific proteins and we identified from breast cancer tissues to detect candidate disease biomarkers for diagnosis and prognosis and proteins involved in Epithelial Mesenchymal Transition in cholangiocarcinoma cell cells. In our four investigations we took particularly of the technical aspects to optimize resolution of the experimental data in both perspectives.

Aim of this thesis was to apply the stable isotopes technique to study pulmonary surfactant kinetics. Lung surfactant is essential to live, because it prevents the alveoli to collapse during normal breathing. Lung surfactant is composed of lipids and specific proteins, and nowadays it is well known that alterations on the composition and amount of surfactant are involved in acute and chronic lung diseases. This work presents two studies about lung surfactant kinetics. The first one is about the synthesis of disaturated phosphatidylcholine, the main lipid in the pulmonary surfactant system, in a murine model of unilateral acid injury. The second one explains an optimized procedure to evaluate surfactant protein B synthesis and a novel method to study surfactant protein C synthesis in both infants and adults, each with stable isotopes technique
Obiettivo di questa tesi è stato quello di applicare l’uso degli isotopi stabili come traccianti metabolici allo studio del metabolismo del surfattante polmonare. Il surfattante polmonare è una sostanza fondamentale per vivere in quanto impedisce agli alveoli di collassare durante l’atto respiratorio. Il surfattante polmonare è composto da lipidi e proteine specifiche, ed è ormai noto che alterazioni nella composizione e nella quantità del surfattante polmonare sono presenti nella malattia respiratoria acuta e cronica. In questo lavoro vengono presentati due studi sulla cinetica del surfattante polmonare: il primo riguarda la sintesi del lipide maggiormente presente nel surfattante, ovvero la fosfatidilcolina disatura, in una condizione di danno unilaterale da acido in un modello murino. Il secondo studio riguarda un metodo ottimizzato per misurare la sintesi della proteina B del surfattante e un nuovo metodo per valutare, sempre con l’utilizzo degli isotopi stabili, la sintesi della proteina C del surfattante in bambini e adulti

L’attuale gold standard diagnostico nella routine clinica utilizzato per escludere la natura maligna di noduli tiroidei, è rappresentato dalla valutazione morfologica del materiale ottenuto da biopsie. Tuttavia, non sempre è possibile arrivare ad una diagnosi citologica affidabile e circa il 20-30% dei noduli risultano “inderterminati per malignità”. I pazienti con questa diagnosi vengono quindi sottoposti a tiroidectomia totale e dopo l’analisi istologica post-operatoria l’80% circa di essi risultano essere benigni. L’impatto dell’operazione sul paziente è rilevante poiché le funzioni fisiologiche della tiroide dovranno essere sostituite cronicamente con l’utilizzo di farmaci, il cui costo, in aggiunta a quello dell’operazione, ha un peso sul bilancio sanitario. Negli ultimi anni, nel campo della ricerca biomedica, grande attenzione è stata riposta verso l’analisi proteomica e verso la sua potenziale applicazione nella ricerca di nuovi biomarcatori, determinanti nel discriminare noduli benigni da maligni in modo da minimizzare la diagnosi di malignità indeterminata. La spettrometria di massa è uno degli strumenti più importanti per ottenere informazioni riguardanti la composizione molecolare di un campione, la presenza di biomolecole e la loro abbondanza. Tra i diversi approcci proteomici in grado di identificare alterazioni molecolari di diversi tipi di lesioni, la tecnica di Imaging MALDI-MSI (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation-Mass Spectrometry Imaging) ha guadagnato sempre più spazio e interesse. MALDI-MSI rappresenta una tecnologia ideale che permette di esplorare la distribuzione spaziale di biomolecole nel tessuto integrando informazioni molecolari e quelle tradizionali morfologiche. Visti i recenti risultati ottenuti tramite l’analisi MALDI-MSI di campioni di tessuto tiroideo nell’identificazione di segnali proteomici in grado di discriminare casi benigni da maligni, l’idea che è nata è stata quella di applicare per la prima volta questo tipo di analisi a campioni citologici ottenuti da biopsie di noduli tiroidei. Prima di poter applicare la tecnica MALDI allo studio clinico, il protocollo di analisi è stato ottimizzato per evitare problemi di degradazione, fenomeni di alterazioni o contaminazioni e formazione di artefatti. Due diversi problemi tecnici quali i) l’interferenza dell’emoglobina a causa dell’elevata vascolarizzazione dell’organo e ii) la stabilità del campione nel tempo prima dell’analisi da un punto di vista morfologico e proteomico, sono stati affrontati e risolti in due studi pianificati come parte del progetto di tesi. In origine lo studio clinico per l’identificazione di potenziali cluster di segnali con proprietà discriminanti prendeva in considerazione un ampio numero di campioni di noduli tiroidei ma, a causa del lento arruolamento di casi maligni per la loro natura rara, la tesi contiene solo i risultati di un analisi preliminare. 18 soggetti sono stati arruolati per il training set (9 noduli benigni e 9 maligni). Il modello di regressione logistica penalizzato (LASSO) è stato costruito su un set di dati di 81 regioni di interesse, in accordo con l’identificazione morfologica operata dal patologo per evitare false informazioni derivanti da cellule diverse dai tirociti. Il modello di classificazione è stato validato su 11 pazienti con diversi tipi di lesioni (i.e. benigna, indeterminata e maligna). I risultati sono molto promettenti e sottolineano la possibilità di introdurre MALDI-MSI come uno strumento complementare nella caratterizzazione diagnostica delle lesioni tiroidee. Sono inoltre stati esaminati gli indici di similarità più utilizzati tra i numerosi profili di spettri ed è stata proposta una nuova misura. Uno studio di simulazione di spettri di massa è stato poi implementato per identificare le migliori misure di similarità in termini di performance, da applicare per comparare profili proteomici.
The actual gold standard to exclude the malignant nature of thyroid nodules in the clinical routine is represented by thyroid Fine Needle Aspirations (FNAs) biopsies. Thyroid FNAs are safe and cost-effective. Approximately the 20-30% of cases have an indeterminate for malignancy final report. These patients undergo diagnostic (and not therapeutic) thyroidectomy, but after surgery the 80% of these thyroid nodules are benign. This overtreatment has of course important consequences in the quality of life of the patients and high healthcare costs. The application of -omics techniques might have a potential role in the research for new diagnostic markers able to discriminate benign from malignant nodules, thus minimizing the challenging cases of indeterminate for malignancy. Mass spectrometry is one of the most important analytical tools able to obtain information regarding the molecular composition of a sample, the presence of biomolecules and their abundance. Among the different proteomics approaches able to extract the molecular alterations of the different type of specimen’s lesion, Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) Mass Spectrometry Imaging (MSI) was strongly emerging. MALDI-MSI represents an ideal technology that enables to explore the spatial distribution of biomolecules within tissue, integrating molecular and traditional morphological information while preserving the integrity of the analysed tissue. Various studies applied MALDI-MSI technology for prognostic purposes and for in real time diagnostic setting, showing the usefulness, advantages and applicability of MALDI-MSI in different fields of pathology. Due to the promising results recently obtained with MALDI-MSI in the identification of proteomic signals able to differentiate between benign and malignant cases from the analysis of thyroid tissue after surgery , the idea was to apply for the first time MALDI-MSI on real thyroid FNAs biopsies. Preliminary to the clinical study, the protocol for the proteomic MALDI-MSI analysis was optimised to avoid degradation, alteration phenomena, contamination and artefacts formation. The methodological improvement of the protocol in a complicated field as thyroid cytological specimens played an important role in this study. Challenging technical aspects, such as i) the interference of haemoglobin due to the high vascularization of the thyroid organ and ii) the stability of the samples over time before the analysis from a morphological and proteomic point of view, were overcome through two studies that were planned and analysed as part of the thesis. The clinical study for the detection of the potential cluster of signals with discriminant capability was originally planned to involve a large sample of thyroid nodules, however, due to the slow enrolment rate of malignant cases, the thesis contains only the results of a preliminary analysis. Eighteen subjects contributed to the training set with 9 benign and 9 malignant thyroid nodules. The statistical model was based on data of 81 specific region of interest, according to the morphological triage performed by the pathologist in order to overcome false information deriving from non thyrocytes cells. The validation phase was performed on 11 patients with different type of lesions (i.e. benign, indeterminate and malignant). Results are very promising and highlight the possibility to introduce MALDI-MSI as a complementary tool for the diagnostic characterization of thyroid lesions. A methodological aspect that emerged from the peculiarity of the proteomic analysis was also investigated. A review of the most used indices for the assessment of the similarity between mass spectra profiles was performed and a new measure was proposed. A simulation study was implemented in order to identify the best similarity measure to use in comparing proteomic profiles.

La presente tesi, sviluppata in collaborazione con il Key Laboratory of Natural Resources of the Changbai Mountain and Functional Molecules - Yanbian University Ministry of Education (Yanji City, Jilin) e il centro di analisi BonassisaLab srl (Foggia, Italia), è incentrata sullo sviluppo e l’ottimizzazione di metodi di analisi adatti alla identificazione e quantificazione di contaminanti emergenti in matrici alimentari e ambientali. Un composto può essere definito contaminante emergente se: è apparso solo recentemente, anche grazie allo sviluppo di nuove metodologie analitiche e di indagine; i meccanismi di tossicità non sono ancora completamente compresi; è oggetto di revisioni legislative che includono nuove informazioni, non prese in considerazione precedentemente. Il loro studio è quindi di elevato interesse per la ricerca, e la determinazione analitica per la maggior parte di tali contaminanti rappresenta una sfida per i laboratori e gli enti governativi. Inoltre, i potenziali rischi per la salute umana a seguito di una loro assunzione e/o esposizione hanno portato ad un maggiore interesse nei loro confronti anche da parte delle organizzazioni dei consumatori e dei produttori e, conseguentemente, alla approvazione di leggi sempre più restrittive per la loro determinazione e quantificazione. Gli studi in questo settore sono attualmente incentrati su: a) classificazione di nuovi contaminanti emergenti, composti o molecole non noti per i quali è stata comprovata la loro tossicità; b) ricerche su contaminanti già noti per i quali gli effetti sugli ecosistemi non sono stati pienamente studiati e compresi; c) studio di problemi emergenti relativi a contaminanti noti, per una migliore comprensione dei rischi ad essi correlati dal punto di vista ambientale e per la salute umana. Il presente progetto di dottorato si innesta in questa tematica di ricerca ed è consistito nello sviluppo e l’ottimizzazione di metodi analitici per la determinazione di alcuni contaminanti emergenti in matrici alimentari ed ambientali mediante tecniche cromatografiche (GC, LC) abbinate a spettrometria di massa (MS). Nello specifico, cinque metodi analitici innovativi sono stati proposti per la determinazione dei piretroidi (PYR) in prodotti di origine animale (1), policlorobifenili (PCB) in campioni di uova (2) e latte (3), matrina e ossimatrina (MT, OMT ) in prodotti di origine vegetale (4) e derivati del benzene (BD) in campioni di acqua marina (5). Il primo lavoro menzionato ha riguardato la determinazione di sei PYRs (fenotrina, permetrina, ciflutrin, cipermetrina, deltametrina, fenvalerato) in campioni di uova e carne utilizzando un metodo analitico di screening sensibile e riproducibile mediante gascromatografia e rivelazione a cattura di elettroni (GC-ECD). Per la fase di preparazione del campione, è stata ottimizzata una procedura di purificazione basata sull'estrazione in fase solida (SPE); è stata ottenuta una separazione efficiente con un tempo di analisi totale inferiore a 60 minuti, comprendendo tutte le fasi analitiche dalla estrazione-purificazione fino alla determinazione cromatografica. Il metodo è stato ampiamente validato seguendo le direttive europee, dimostrandone la conformità in termini di selettività, sensibilità, recupero, precisione e incertezza di misura. Sono stati ottenuti ottimi risultati in termini di linearità in un intervallo di concentrazione compreso tra 50 e 500 μg L-1, con coefficienti lineari superiori a 0.9992. I limiti strumentali di rivelabilità sono risultati compresi tra 0.22 e 0.63 μg L-1, corrispondenti a 0.04 e 0.13 μg kg-1 in matrice. I limiti di rivelabilità nelle uova di gallina e in vari campioni di carne, calcolati su campioni additivati a concentrazioni note di piretroidi, sono rispettivamente compresi nell'intervallo di 0.05 e 0.25 μg kg-1 e 0.07 e 0.23 μg kg-1. I risultati della validazione analitica hanno confermato che il metodo proposto può essere utilizzato in modo affidabile per la determinazione dei piretroidi nelle analisi di controllo ufficiali. Il secondo lavoro ha riguardato un metodo analitico di screening, sensibile e riproducibile, per la determinazione e la quantificazione di sei policlorobifenili non diossino-simili (NDL-PCB, congeneri 28, 52, 101, 138, 153, 180) in uova di gallina basato sull'estrazione accelerata con solvente (ASE) per la determinazione della quantità di grasso da sottoporre ad un processo di purificazione tramite estrazione in fase solida (SPE) con analisi gascromatografica accoppiata ad una rivelatore a cattura di elettroni (GC-ECD). La separazione cromatografica ottimizzata, della durata inferiore ai 25 min, garantisce buone risposte strumentali per i sei NDL-PCB nell'intervallo tra 2.5 e 60.0 μg L-1, con coefficienti di correlazione sempre superiori a 0.9995. I limiti strumentali di rivelabilità sono risultati compresi tra 0.08 e 0.35 μg L-1, corrispondenti a 0.05 e 0.23 ng g-1 di grasso nella matrice, mentre i limiti di rivelabilità del metodo, calcolati su campioni di uova fortificate con concentrazioni note di analita, variano da 1.6 a 3.5 ng g-1 di grasso. Infine, il metodo è stato ampiamente validato in termini di selettività, sensibilità, recupero, precisione, robustezza e incertezza di misura, seguendo le linee guida europee. Nel terzo lavoro, lo studio ha riguardato la determinazione dei sei NDL-PCB analizzati precedentemente in campioni di latte mediante GC-ECD e spettrometria di massa, previa ottimizzazione multivariata della procedura di estrazione del campione attraverso il disegno sperimentale di Box-Behnken (BBD) e la funzione di desiderabilità. Nella definizione delle condizioni di estrazione sono stati considerati tre fattori: la percentuale di acetone nella miscela di estrazione, il rapporto campione/solvente e il tempo di estrazione. Il design a tre fattori ha richiesto 26 esperimenti che sono stati eseguiti in duplicato e in ordine randomizzato per ridurre al minimo gli effetti di distorsione delle variabili non controllate. I fattori ottimizzati (percentuale di acetone: 30%; rapporto campione/solvente: 0.11 g mL-1; tempo di estrazione: 45 min) hanno assicurato un basso consumo di solvente e un tempo di estrazione molto ridotto, consentendo una preparazione rapida e simultanea dei campioni. Il metodo è stato validato secondo le direttive europee attraverso la valutazione della linearità, selettività, LOD, LOQ, recupero, precisione e robustezza. Il quarto lavoro ha riguardato la determinazione quantitativa di biopesticidi a base di matrina in campioni di frutta e verdura tramite cromatografia liquida accoppiata a spettrometira di massa tandem. È stato sviluppato un processo di estrazione molto rapido mediante metanolo acidificato che garantisce tempi e consumi di solvente altamente ridotti e consente la preparazione simultanea di più campioni. Ottimi risultati cromatografici sono stati ottenuti in meno di 10 min. La validazione del metodo è stata eseguita secondo le direttive europee attraverso la valutazione della selettività, della linearità, dei limiti di rivelabilità e quantificazione, di recupero e precisione. Nelle condizioni ottimizzate di estrazione e separazione cromatografica sono state osservate buone risposte nell'intervallo di calibrazione 5-200 μg L-1 ottenendo coefficienti di correlazione superiori a 0.9984. I limiti strumentali di rivelabilità sono rispettivamente pari a 0.032 e 0.033 μg L-1 per la matrina e l'ossimatrina. I limiti di rivelabilità in arance, mele, finocchi e pomodori, calcolati su campioni fortificati con soluzioni standard di matrina e ossimatrina sono compresi rispettivamente nell'intervallo 0.13-1.5 μg kg-1 e 0.17-0.30 μg kg-1. Il metodo, dopo la validazione, è stato applicato con successo alla determinazione di matrina e ossimatrina in 102 campioni di frutta e verdura disponibili in commercio. Infine, l'ultimo capitolo ha riguardato i derivati del benzene (BD), una classe di contaminanti ambientali la cui esposizione rappresenta un grave rischio per la salute umana. Questi composti si diffondono molto rapidamente dall'atmosfera all'ecosistema marino e, per questo motivo, il loro monitoraggio in acqua di mare è molto importante. Per le analisi in traccia di questi composti nei campioni di acqua marina, è stata messa a punto una metodica di nanoestrazione in fase liquida nanoconfinata (NLPNE) abbinata alla determinazione gascromatografica e spettrometria di massa (GC/MS). Le procedure NLPNE ex-situ e in-situ sono state sviluppate e ottimizzate in termini di capacità di estrazione, tempo di analisi, precisione e accuratezza. Rispetto alle tradizionali procedure di estrazione, basate sulla microestrazione in fase solida (SPME) e sull'estrazione liquido-liquido (LLE), i metodi NLPNE qui proposti hanno consentito una rapida analisi in loco dei composti benzenici con basso consumo di solvente, fattori di arricchimento più elevati e con ottimi livelli di automazione. Sono stati ottenuti coefficienti di determinazione compresi tra 0.9929 e 0.9997 per tutti i BD nell'intervallo tra 0.10 e 500 ng mL-1 e 5.00 e 500 ng mL-1, rispettivamente utilizzando la tecnica NLPNE ex situ e in situ. I limiti di rivelabilità ex-situ e in-situ variano da 0.2 a 7.6 ng mL-1 e 0.04-1.00 ng mL-1. I risultati ottenuti suggeriscono che la metodica NLPNE accoppiata a GC-MS può essere considerato una tecnica performante per l’analisi ad alto rendimento di composti in tracce in campioni ambientali, alimentari e biologici.
This thesis, developed in collaboration with the Key Laboratory of Natural Resources of the Changbai Mountain and Functional Molecules - Yanbian University Ministry of Education (Yanji City, Jilin) and the BonassisaLab srl analysis centre (Foggia, Italy), is focused on the development and optimization of analytical methods suitable for the identification and quantification in food and environmental matrices of emerging contaminants. A compound can be defined as an emerging contaminant if: it has appeared only recently thanks to the development of new analytical and investigation methodologies; the toxicity mechanisms are not fully understood; it is under legislative revisions to include new information not previously taken into account. Emerging contaminants are considered a fashionable research topic to the present day and most of them give a challenge for laboratories and regulatory agencies. Furthermore, the potential risks for human health related to their intake and/or exposure have led to deeper interest by consumer organizations and producers and are leading to the approval of more restrictive laws about their determination and quantification. Then, the studies are currently focused on: a) classification of new emerging contaminants, unknown compounds or molecules for which their toxicity has been proven; b) research on contaminants already known for which the effects on ecosystems have not been fully studied and understood; c) study of emerging issues related to known contaminants, for a better understanding of the risks related to them considering the environment and human health. In this research project, the development and optimization of analytical methods for the determination of some emerging contaminants in food and environmental matrices coupling liquid and gas chromatography with mass spectrometry were described. Five novel analytical methods for the determination and quantification of pyrethroids (PYRs) in animal-origin products (1), polychlorinated biphenyls (PCBs) in egg (2) and milk samples (3), matrine and oxymatrine (MT, OMT) in vegetables (4) and benzene derivatives (BDs) in sea-water (5) were developed. The first work mentioned deals with the determination of six PYRs (phenothrin, permethrin, cyfluthrin, cypermethrin, deltamethrin, fenvalerate) in egg and meat samples by a sensitive and reproducible screening analytical method based on gas chromatography and electron capture detection (GC-ECD). A fast cleanup procedure based on solid-phase extraction was used. An efficient separation was obtained with a total analysis time of less than 60 min, including the extraction-purification steps. Good responses for the six pyrethroids were obtained in a range of 50−500 μg L−1, with linear coefficients higher than 0.9992. Instrumental limits of detection were between 0.22 and 0.63 μg L−1, corresponding to 0.04 and 0.13 μg kg−1 in the matrix. Detection limits in chicken eggs and various meat samples, calculated on spiked samples, were in the range of 0.05−0.25 μg kg−1 and 0.07−0.23 μg kg−1, respectively. The validation results confirmed that the proposed GC-ECD method can be used as a reliable screening tool for the determination of pyrethroids in official check analyses. The method was extensively validated following the European directives, demonstrating its conformity in terms of selectivity, sensitivity, recovery, precision, and measurement uncertainty. The second work was about a sensitive and reproducible screening analytical method for the determination of six non-dioxin-like polychlorinated biphenyls (NDL-PCBs, congener 28, 52, 101, 138, 153, 180) in chicken eggs based on accelerated solvent extraction (ASE) procedure for the fat extraction and determination, a solid-phase extraction (SPE) sample clean-up process, and a gas chromatography – electron capture detection (GC-ECD) analysis. The optimized chromatographic separation, in less than 25 min, returned good responses for the six NDL-PCBs in the range of 2.5–60.0 μg L−1, with correlation coefficients always higher than 0.9995. Instrumental limits of detection were between 0.08–0.35 μg L−1, corresponding to 0.05 and 0.23 ng g−1 fat in the matrix, while method detection limits, calculated on spiked egg samples, ranged from 1.6 to 3.5 ng g−1 fat. The method has been extensively validated in terms of selectivity, sensitivity, recovery, precision, ruggedness, and measurement uncertainty, following the European Directives. In the third work, the study regarded the determination of the six NDL-PCBs in milk samples by GC-ECD and mass spectrometry, following a multivariate optimization process of the sample extraction procedure by Box-Behnken design through the global desirability function. Three factors were involved in refining the extraction conditions: the acetone percentage in the extraction mixture, the sample/solvent ratio, and the extraction time. The three-factor design required 26 experiments that were carried out in duplicate and in a randomized order to minimize the bias effects of uncontrolled variables. The optimized factors (acetone percentage: 30%; sample-to-solvent ratio: 0.11 g mL-1; extraction time: 45 min) ensured a low solvent consumption and a reduced extraction time, allowing a rapid and simultaneous preparation of multiple sample extracts. The method was validated according to the European directives through the evaluation of linearity, selectivity, LOD, LOQ, recovery, precision, and ruggedness. The fourth work consisted of the development of a rapid LC/tandem MS method for the quantitative determination of matrine-based biopesticides for the analysis of fruit and vegetable samples. A simple extraction process by acidified methanol was selected, ensuring reduced solvent consumption and time, and allowing a simultaneous preparation of multiple sample extracts. Excellent chromatographic results were obtained in terms of peak shape and efficiency, in less than 10 min. Method validation was performed according to the European directives through the evaluation of selectivity, linearity, detection and quantification limits, recovery, and precision. Under the optimal extraction and chromatographic conditions, good responses were observed in the range of 5–200 μg L-1, with correlation coefficients higher than 0.9984. Instrumental limits of detection were 0.032 and 0.033 μg L-1 for matrine and oxymatrine, respectively. Detection limits in oranges, apples, fennels, and tomatoes, calculated for matrine and oxymatrine on spiked samples, were in the range 0.13–1.5 μg kg-1 and 0.17-0.30 μg kg-1, respectively. The validated method was then successfully applied to the determination of matrine and oxymatrine in 102 commercially available samples of fruit and vegetables. Finally, the last chapter concerned the Benzene Derivatives (BDs), a class of environmental pollutants whose exposure poses a grave risk to human health. These compounds rapidly diffuse from the atmosphere to the marine ecosystem: for this reason, their monitoring in seawater is every day more compelling. For their determination in seawater at trace levels, nanoconfined liquid phase nano extraction (NLPNE) has been applied to the gas chromatography coupled with mass spectrometry analyses (GC/MS). Ex-situ and in-situ NLPNE procedures have been developed and optimized in terms of extraction capabilities, analysis time, precision, and accuracy. Compared to the traditional extraction procedures, based on solid-phase microextraction (SPME) and liquid-liquid extraction (LLE), the proposed NLPNE methods allowed rapid on-site analysis of benzene compounds with low solvent consumption, higher enrichment factors, and improved automation grade. Determination coefficients ranging from 0.9929 to 0.9997 were obtained for all BDs in the range 0.10–500 ng mL-1 and 5.00–500 ng mL-1, for ex-situ and in-situ NLPNE, respectively. Ex-situ and in-situ limits of detection ranged from 0.2 to 7.6 ng mL-1 and 0.04–1.00 ng mL-1. Our results suggest that NLPNE coupled to GC-MS can be considered a powerful technique for high-throughput analyses of trace compounds in environmental, food, and biological samples.

Il progetto sviluppato in questa tesi di Dottorato in Scienze chimiche riguarda lo studio di opere di arte moderna e contemporanea con particolare riferimento alle indagini sui materiali e tecnologie usate dagli artisti. Per tale ricerca sono state sviluppate delle tecniche di indagine innovative, specifiche in grado di rilevare non solamente la natura dei materiali utilizzati ma anche il loro comportamento nel tempo. Questa ricerca si è inserita in un progetto internazionale riguardante appunto la conservazione dell’arte contemporanea (20th Century Oil Paint Project, promosso dall'ICN The Netherlands Institute for Cultural Heritage, Amsterdam in collaborazione con il Courtauld Institute of Art, London, ilTate, London e il Getty Conservation Institute, Los Angeles). Il lavoro di tesi ha portato in particolare alla messa a punto di metodologie di studio dei oleosi attraverso l’impiego di tecniche cromatografiche (GC-MS, Py-GC-MS) che hanno consentito di individuare la presenza e il ruolo di alcuni additivi industriali (come gli stearati di alluminio e zinco e l'olio di ricino idrogenato) che fino ad ora non erano stati rilevati in maniera significativa,ma che rivestono un ruolo importante nella produzione industriale dei materiali dell’arte. La ricerca è stata condotta dapprima su campioni pittorici ad olio realizzati in laboratorio utilizzando leganti oleosi, pigmenti, siccativi e additivi impiegati nella moderna produzione industriale di colori ad olio. I film pittorici sono stati analizzati mediante l’uso di svariate tecniche analitiche, tra cui la spettrometria infrarosso in trasformata di Fourier (FT-IR), la spettrofotometria a raggi X (XRF), la Termogravimetria (TG), la Calorimetria Differenziale a Scansione (DSC) e la Gascromatografia abbinata alla Spettrometria di Massa (GC-MS). La parte sperimentale si è poi incentrata sullo studio di colori ad olio (a tubetto) provenienti da collezioni storiche di famose ditte produttrici di colori ad olio (come ad esempio Winsor&Newton, Talens, Old Holland, Maimeri). L’ultima parte della tesi è stata dedicata allo studio di significative opere moderne e contemporanee di artisti quali Lucio Fontana, Jasper Johns, Karel Appel, Willem de Kooning, Salvador Dalì, Henri Matisse, Isabel Lambert-Rawsthorne, Ethel Walker, etc. I risultati, oltre che a chiarire le situazioni sotto indagine, aprono una serie di nuove prospettive su settori finora poco approfonditi nella produzione artistica e tecnologica dell’arte moderna e contemporanea.
The research project developes in PhD research in Chemical Sciences deals with the study of modern and contemporary works of art, focusing on materials and production techniques employed by artists. In this study innovative and specific analytical techniques have been optimised: the survey has been successful not only in detecting the nature of artistic materials used in the 20th century, but also in studying their behaviours over time. Thid PhD researc has been part of an international project concerning the Conservation of Contemporary Art and has lead to the improvement of new methodologies to study proteinaceous and lipidic binding media by using chromatographic techniques (GC-MS, Py-GC-MS, HPLC). These methods have also allowed for the identification and the role of industrial additives (such as aluminium and zinc stearates and hydrogenated castor oil), which had been not fully studied previously. This part of the PhD research has been developed in the Netherlands, in the laboratories of the ICN (The Netherlands Institute for Cultural Heritage, Amsterdam), under the supervision of Dr. Klaas Jan van den Berg and Mr. Ing. Henk van Keulen. The research has been part of the international project called "20th Century Oil Paint Project", carried out at ICN in collaboration with Courtauld Institute of Art, London, Tate, London and Getty Conservation Institute, Los Angeles. The research was initially focused on the study of laboratory-reconstructed oil films, which were prepared with lipidic binders, additives, pigments and driers used by modern oil manufacturers. The films were studied by using several analytical techniques: FT-IR, XRF, TG-DSC and GC-MS. This study has lead to an improvement of analytical methodologies for the study of manufactured oil samples. Furthermore, the research focused on real samples taken from important modern paintings by Lucio Fontana, Jasper Johns, Karel Appel, Willem de Kooning, Salvador Dalì, Henri Matisse, Isabel Lambert-Rawsthorne, Ethel Walker, etc. The obtained results are a further step in the knowledge of materials used in artistic and technological production in Contemporary Art.

My PhD was performed in Mérieux NutriSciences, a company which provides analytical services. During my PhD I worked on three projects, whose common determinant was the application of mass spectrometry (MS) to the analysis of proteins. The main study deals with MS as a new tool for the analysis of food allergens. Food allergy is an important health problem involving immunological reactions that arise following exposure to protein allergens. In the absence of a cure, patients need to avoid the offending food to prevent allergic reactions. In the European Union, 14 allergens must be indicated in food labels when intentionally added. However, one of the main causes triggering allergic reactions is represented by undesired contamination of food by allergens in production facilities. Even tiny amounts of allergens can trigger severe manifestations; thus, to protect consumers sensitive analytical methods are required. Recently, methods based on MS have received increasing attention for the quantification of food allergens in complex matrices. In the present study, the development of a method based on MS for the simultaneous detection of egg, milk, tree nuts and peanuts allergens into bakery products is described. The method is based on the detection of specific peptides generated from the enzymatic hydrolysis of the target allergens and employs a technique called Multiple Reaction Monitoring, in which the mass spectrometer is operated to selectively acquire signals deriving from specific couples of m/z values, corresponding to a peptide ion and to one of its fragments. The method developed allows to detect target allergens in a specific way and with acceptable sensitivities and can be considered as a valuable alternative to other common analytical techniques, such as ELISA and PCR. A second topic of this thesis is bovine beta-casein, a polymorphic protein for which 12 genetic variants have been identified, the most common being A1 and A2. Some reports suggested a possible association between the consumption of A1 beta-casein and the etiology of some human diseases, including ischemic heart disease and diabetes. At the basis of the effects caused by A1 beta-casein there would be a bioactive peptide with opioid-like activity, released by proteolytic enzymes upon gastrointestinal digestion. This peptide, called beta-casomorphin-7, was shown to be produced only from certain beta-casein isoforms, having a histidine in position 67, including the A1 variant. On the other hand, variants possessing a proline in position 67, such as the A2 variant, would not be able to generate beta-casomorphin-7. Based on these assumptions, some companies now sell “A2 milk”, a milk containing only A2 beta-casein. In this project, a LC-MS analytical method was developed to discriminate between A2 milk and commercial milk, which typically contains a mixture of A1 and A2 beta-casein. The final purpose is to offer milk producers an analytical tool to certify that a milk labeled as “A2 milk” is really as such, eventually capable to identify possible frauds or contaminations. Finally, in this thesis a minor project is described, having as object the enzyme transglutaminase (TGase) from microbial origin. TGase catalyses the formation of isopeptide bonds between carboxamides of glutamine residues and amine groups of lysine, resulting in protein cross-linking. The action of TGase can determine significant changes in the physico-chemical properties of proteins, leading to changes in viscosity, thermal stability and elasticity. For these reasons, TGase finds application as an additive in the food industry. In this study a TGase from an unknown microbial source has been characterized and identified by applying a bottom-up proteomic approach. The identified enzyme is produced from a bacterial strain different from the one most commonly used in food industrial applications, S. mobaraense. Moreover, a method for the measurement of TGase enzymatic activity by the hydroxamate assay has been set up and has now become a service offered by the Mérieux NutriSciences.
Il mio dottorato di ricerca si è svolto in Mérieux NutriSciences, un’ azienda che fornisce servizi analitici. Durante il mio periodo di dottorato ho lavorato su tre progetti, il cui determinante comune era l'applicazione della spettrometria di massa (SM) all'analisi delle proteine. Lo studio principale riguarda la SM applicata all'analisi degli allergeni alimentari. L'allergia alimentare è una patologia importante, dovuta a reazioni immunologiche che insorgono a seguito dell'esposizione di un soggetto ad allergeni proteici. Poiché ad oggi non esiste cura, per prevenire le reazioni allergiche i pazienti devono evitare di assumere alimenti contenenti allergeni. Nell'Unione Europea, 14 allergeni devono essere indicati sulle etichette degli alimenti se aggiunti intenzionalmente. Tuttavia, una delle principali cause di reazione allergica è rappresentata dalla contaminazione indesiderata degli alimenti con allergeni all'interno degli impianti di produzione. Anche piccole quantità di allergene possono scatenare gravi reazioni; dunque, per proteggere i consumatori sono necessari metodi analitici sensibili. Recentemente, i metodi basati sulla SM hanno ricevuto crescente attenzione per la quantificazione degli allergeni alimentari in matrici complesse. Nel presente studio viene descritto lo sviluppo di un metodo basato sulla SM per il rilevamento simultaneo di allergeni da uova, latte, arachidi e frutta secca in prodotti da forno. Il metodo si basa sull'identificazione di specifici peptidi generati dall'idrolisi enzimatica degli allergeni target ed impiega una tecnica chiamata Multiple Reaction Monitoring, in cui lo spettrometro di massa è utilizzato per acquisire selettivamente segnali derivanti da coppie di specifici valori m/z, corrispondenti a uno ione peptidico e ad uno dei suoi frammenti. Il metodo sviluppato consente di rilevare gli allergeni target in modo specifico e con sensibilità accettabile e può essere considerato una valida alternativa ad altre comuni tecniche analitiche, come l’ELISA e la PCR. Un secondo argomento trattato in questa tesi riguarda la beta-caseina bovina, una proteina polimorfica per la quale sono state identificate 12 varianti genetiche, fra cui le più comuni sono la A1 e la A2. Alcuni studi hanno suggerito una possibile associazione fra il consumo di beta-caseina A1 e l'eziologia di alcune malattie, tra cui l’ischemia cardiaca e il diabete. Alla base degli effetti causati dalla beta-caseina A1 ci sarebbe un peptide bioattivo con attività simil-oppiode, rilasciato da specifici enzimi proteolitici durante la digestione. Questo peptide, chiamato beta-casomorphin-7, viene generato solo a partire da alcune isoforme di beta-caseina, contenenti un'istidina in posizione 67, inclusa la variante A1. Al contrario, le varianti che possiedono una prolina in posizione 67, come la variante A2, non sarebbero in grado di generare il peptide beta-casomorphin-7. Sulla base di queste ipotesi, alcune aziende vendono ora il cosiddetto "latte A2", un tipo di latte contenente solo beta-caseina A2. In questo progetto di dottorato è stato sviluppato un metodo analitico LC-MS per discriminare il latte A2 dal latte commerciale, che tipicamente contiene una miscela di beta-caseina A1 e A2. Lo scopo finale è offrire ai produttori di latte uno strumento analitico per certificare che un latte etichettato come "latte A2" sia realmente tale, ed eventualmente in grado di identificare possibili frodi o contaminazioni. Infine, in questa tesi viene descritto un progetto che ha come oggetto l'enzima transglutaminasi (TGasi) di origine microbica. La TGasi catalizza la formazione di legami isopeptidici tra residui di glutammina e di lisina, determinando la formazione di cross-linking fra proteine. L'azione della TGasi può determinare cambiamenti significativi nelle proprietà fisico-chimiche delle proteine, portando a modifiche nella viscosità, nella stabilità termica e nella elasticità. Per questi motivi, la TGasi trova applicazione come additivo nell'industria alimentare. In questo studio, una specie di TGasi di origine microbica è stata caratterizzata e identificata applicando un approccio proteomico “bottom-up”. L'enzima identificato viene prodotto da un ceppo batterico diverso da quello più comunemente utilizzato nelle applicazioni industriali alimentari, denominato S. mobaraense. Infine, è stato sviluppato un metodo per la misurazione dell'attività enzimatica della TGasi mediante il saggio dell'idrossammato, che è ora diventato un servizio analitico offerto da Mérieux NutriSciences.

Il cancro rappresenta una delle principali cause di morte nel mondo, ma causa anche un enorme dispendio di risorse mediche. Sebbene negli ultimi anni siano stati sviluppati trattamenti innovativi come terapia genica, immunoterapia e trattamenti classici (cioè chemioterapia, radioterapia e rimozione chirurgica), ad oggi non esiste un trattamento efficace per curare questa patologia, anche perché i pazienti sviluppano spesso chemioresistenza, radioresistenza e alcuni resistono anche alla terapia genica e all'immunoterapia. La pelle è l’organo più grande del corpo umano. Il carcinoma a cellule basali, il carcinoma a cellule squamose e il melanoma sono i tre tumori della pelle più comuni. Il melanoma si sviluppa originariamente dai melanociti (cellule contenenti pigmento) e la sua incidenza è aumentata notevolmente negli ultimi 30 anni con una bassa sopravvivenza a cinque anni e un basso tasso di prognosi. Gli attuali approcci terapeutici del melanoma non solo potrebbero essere inefficaci, ma anche avere gravi effetti collaterali come la vitiligine. Nell'ambito dello studio del melanoma, l'attuale tesi ha studiato la soppressione del melanoma su diverse piattaforme. In primo luogo, il resveratrolo è stato utilizzato per identificare i potenziali biomarcatori del melanoma. In secondo luogo, attraverso studi precedenti e poi mediante studi in silico, alcuni biomarcatori sono stati ulteriormente valutati. Quindi sono stati studiati modelli di colture cellulari di melanoma in vitro. Abbiamo dimostrato che le cellule del melanoma erano inibite dall'interazione proteina-proteina. In terzo luogo, dopo analisi LC-MS/MS, il database delle proteine è stato utilizzato per analizzare e annotare le funzioni dei potenziali biomarcatori. Quarto, è stato riportato un raro caso di melanoma maligno amelanotico (AMM) che amplia la comprensione e integra i fonotipi del melanoma. Il resveratrolo (RSV) è un tipo di fitoalessina ampiamente distribuita nella dieta mediterranea che potrebbe agire anche da soppressore del tumore. Abbiamo valutato gli effetti dell'RSV sulle cellule di melanoma (A375) e abbiamo scoperto che l'RSV potrebbe inibire la proliferazione delle cellule di melanoma modulando il ciclo cellulare e innescando l'apoptosi; in particolare, l’espressione della Cyclin D1 e PCDH9 sono stati fortemente influenzati dalla durata del trattamento dell'RSV, mentre l’espressione di Rac1 non è stata affatto alterata. Abbiamo ulteriormente esplorato il meccanismo di questi geni mirati del melanoma. Studi in silico hanno mostrato che il PCDH9 potrebbe rappresentare il nuovo biomarcatore del melanoma. Pertanto, l'alterazione dell'espressione di PCDH9 (sovraespressione e interferenza) è stata valutata per esplorare gli effetti di PCDH9 sul melanoma. La comune metalloproteinasi della matrice (MMP) è responsabile della degradazione della matrice extracellulare. È stato dimostrato che MMP2, tra l'insieme di enzimi MMP, gioca un ruolo importante nella migrazione cellulare. I risultati della qRT-PCR hanno mostrato che PCDH9 potrebbe sopprimere le cellule di melanoma influenzando MMP2, CCND1 (Cyclin D1) e RAC1. Il melanoma e i tessuti sani sono stati analizzati analogicamente per dimostrare l'inibizione delle cellule di melanoma da parte del PCDH9. I metodi di Co-IP e LC-MS/MS sono stati utilizzati anche per indagare in profondità la correlazione tra PCDH9 e i suoi effetti di soppressione del melanoma. Abbiamo scoperto che PCDH9 e RAC1 possono predire la prognosi del melanoma maligno e abbiamo ipotizzato che PCDH9 possa modulare la progressione del melanoma attraverso MMP2 e RAC1 riducendo la generazione di ROS dipendente da RAC1 e migliorando il complesso di attività dell'ossidasi NADPH. Abbiamo anche riportato il raro caso di AMM diagnosticato per la prima volta come carcinoma cutaneo a cellule squamose. Questo caso mostra i vari fenotipi del melanoma.
With the medical improvement, the life expectancy has rocketed globally. Cancer as the main Noncommunicable disease (NCDs) is the major barrier to extend longevity, causing also a huge medical resource expense. Although innovative treatments as gene therapy, immunotherapy and classical treatments (i.e. chemotherapy, radiotherapy and surgical removal), there is no effective treatment to cure cancer, even because patients usually develop chemoresistance, radioresistance and some resist to gene therapy and immunotherapy as well. Skin is the largest organ first barrier of human body. The basal cell carcinoma, squamous cell carcinoma and melanoma are three common skin cancers Melanoma is a type of cancer that originally develops from melanocytes (pigment containing cells). Melanoma has dramatically increased during last 30 years with low five-year survival and prognosis rate. The current therapeutic approaches of melanoma not only could bring treatment assistance but also have serious side effects like vitiligo. Under the setting of melanoma study, the current thesis investigated the melanoma suppression on different platforms. Firstly, resveratrol, a common bioactive compound, was used to target the potential biomarkers of melanoma. Secondly, through previous studies and then in silico research, certain biomarkers were furtherly targeted. Then in vitro melanoma-cell-culture models were investigated. We demonstrated that the melanoma cells were inhibited by protein-protein interaction. Third, after LC-MS/MS, the protein database was used to analyze and annotate the functions of the potential biomarkers. Forth, the rare case of amelanotic malignant melanoma (AMM) was reported that enlarged the understanding and supplement the phonotypes of melanoma. Resveratrol (RSV) is a kind of phytoalexin that is widely distributed in Mediterranean diet, that as a bioactive natural product, could be a tumor suppressor. We evaluated the effects of RSV on melanoma cells (A375) and found that RSV could obviously inhibit the proliferation of melanoma cells by modulating cell cycle and triggering apoptosis; Cyclin D1 and PCDH9 were strongly affected by RSV duration while RAC1 was not influenced. We furtherly explored the mechanism of these targeted genes of melanoma. In silico and reference studies exhibited the PCDH9 would be the novel biomarker of melanoma. Therefore, the alteration of PCDH9 expression (overexpression and interference) were performed to explore the effects of PCDH9 on melanoma. The common matrix metalloproteinase (MMPs) is responsible for the extracellular matrix degradation. MMP2 -among the set of enzymes (MMPs)- has been demonstrated to play important roles in cell migration. The results of qRT-PCR exhibited that PCDH9 could suppress melanoma cells by affecting MMP2, CCND1 (Cyclin D1) and RAC1. The melanoma and healthy tissues were analogically analyzed to demonstrate the inhibition of melanoma cells by PCDH9. The methods of Co-IP and LC-MS/MS were used as well to deeply investigate the correlation between PCDH9 and its suppression effects of melanoma. We found that PCDH9 and RAC1 can predict the prognosis of malignant melanoma and hypothesized that PCDH9 can modulate melanoma progression through MMP2 and RAC1 by reducing RAC1-dependent ROS generation and enhancing NADPH oxidase activity complex. The rare AMM firstly diagnosed as cutaneous squamous cell carcinoma (cSCC) was reported. According to the results of immunohistochemical examination (Ki67 (+++), Melan-A (+++), human melanoma black (HMB)45 (+), CD20 (-), cytokeratin (CK)7 (-) and CK5/6 (-) were found), the AMM was confirmed and the patient was applied surgical resection. This case showed the various phenotypes of melanoma.

Scuola di Dottorato Scienza e Tecnica Bernardino Telesio, Organic Materials of Pharmaceutical interest XXVI Ciclo, a.a. 2012-2013
Lo scopo del presente lavoro di tesi è la sintesi di materiali polimerici innovativi funzionalizzati con una porzione antiossidante legata alla catena laterale da utilizzare nella conservazione dei cibi, in particolar modo per prolungare la “shelf life” dei cibi della IV gamma cui appartengono frutta e verdura già lavata e tagliata, pronta all’uso. Generalmente questo genere di alimenti deperisce velocemente e ha una durata limitata a pochi giorni. L’ossidazione è una delle più importanti reazioni di degradazione dei cibi e poichè ne riduce la “shelf-life”, ne limita anche la conservazione con conseguente diminuzione delle vendite. L’active packaging prolunga la “shelf-life” dei cibi e allo stesso tempo ne migliora la sicurezza e le proprietà organolettiche. L’idea innovativa rispetto alle tecniche tradizionali è la preparazione di film bioattivi in cui la molecola antiossidante non è adsorbita sulla superficie del film con procedure di spraying, immersione o rivestimento, ma è legata covalentemente, tramite un linker, alla matrice polimerica. In questo studio è stata evidenziata la sintesi di un PET modificato innovato che reca una catena laterale funzionalizzata con una molecola antiossidante quale il ter-butilidrochinone (TBHQ) o l’idrossitirosolo (Tyr-OH). L’attività antiossidante dei monomeri di PET modificato funzionalizzati con il TBHQ e il Tyr-OH è stata testata tramite test del DPPH che ha confermato l’elevata capacità scavenger dei monomeri stessi. Un altro obiettivo del lavoro di ricerca è stata la caratterizzazione tramite spettrometria di massa di polimeri e copolimeri funzionalizzati. Questo studio è stato svolto in collaborazione con l’Università di Akron, Ohio, USA. Lo scopo del lavoro è stato sviluppare un protocollo di analisi di spettrometria di massa che fornisce informazioni riguardo la composizione dei poliesteri copolimeri, dei gruppi terminali, delle sequenze e della loro architettura. Più nello specifico, l’oggetto dello studio è stato il confronto tra il copolimero lineare poli(caprolattone)-poli(etilene glicole) (PCL-PEG) e l’omopolimero poli(caprolattone). Inoltre è stato condotto uno studio sull’energia di collisione necessaria alla frammentazione per il copolimero PCL-PEG, e gli omopolimeri PCL e PEG. Questo studio è stato condotto utilizzando spettrometri di massa MALDI Q/ToF e MALDI ToF/ToF/.Essendo questi polimeri ampiamente usati in moltissimi campi e per differenti applicazioni, in particolare applicazioni in campo biologico, è stato condotto uno studio di degradazione in mezzo acquoso per capire come e con quale velocità questi polimeri degradano e frammentano in presenza di acqua. Per effettuare questo studio i “frammenti” provenienti dalla degradazione sono stati separati per cromatografia liquida attraverso l’uso di uno strumento UPLC la cui uscita è accoppiata ad uno spettrometro di massa per poter facilmente individuare ed assegnare i vari frammenti.
Università della Calabria

Dottorato di Ricerca in Metodologie per lo Sviluppo di Molecole di Interesse Farmacologico, Ciclo XXII,2009
The late part of the 20th century the advancement of knowledge regarding nutrition and disease prevention provided an opportunity for individuals to affect their own health. This expanding body of information helped people to understand how the environment and their own behaviour affected their body. People now had powerful tools to help maintaining and protecting their health. The understanding of how our diet affects our well being has dramatically changed the lifestyles and attitudes of people, who began to make menu and purchasing decisions based on how foods would affect their heath. A shift toward healthier lifestyles and healthier diets began. Food processors and marketers had to refocus their efforts from promoting foods for pleasure to promoting foods that fit in to a healthy diet. Primarily, the focus was on reducing fat and cholesterol in the diet and supplementing vitamins and minerals. Research began to demonstrate the presence of various phytochemicals in wine and juice make it from fruits and vegetables( such as stilbenes, falvoniods, polyphenols…) and specially in olive oil as ( polyphenol in dialdehyed form: oleochanthal, hydroxyoleocanthal..) These compounds have come to be known as nutraceuticals. The list of nutraceuticals present in wine, fruit drink and olive oil that are believed to have positive biological properties has been expanding. Food processors and developers have become very interested in exploiting these nutraceuticals for the production of foods that are not only part of a healthy diet but also improve the consumer’s health in another specific way. These foods have become known as “functional foods” means quality marker. The aim of this thesis has been to develop a analytical methods to determine the concentration of a group of these nutraceuticals in food , such as, quantitative determination of resveratrol in wine, pterostilbene in blueberry juice and dialdehyde form in olive oil using a sensitive high-performance liquid chromatographic separation method coupling with tandem-mass and isotope dilution to order to optimal the conditions for the analysis method, such as extraction procedure, matrices, column, quality controls, wavelength, mobile phases, run time, optimal separation (gradient, retention times), temperature, capillary voltage, cone voltages, vacuum and labelled internal standards, resulting in the best sensitivity and selectivity,The goodness and satisfactory of the method was performed according to, containing linear measuring range, quantification, lower limit of quantification (LLOQ), lower limit of detection (LLOD), quality controls, precision(RSD %), accuracy, recovery, stability and matrix effects. In conclusion, the described high-performance liquid chromatographic separation method with tandem-mass spectrometry detection and isotope dilution showed a satisfactory overall analytical performance well suited for applications in food quality control.
Università della Calabria