Thèses sur le sujet « Sistema del Complemento »

Memoria para la obtención de Título de Bioquímico
En esta Memoria de Título se purificó L-Ficolina humana. A nivel nacional, no hay esfuerzos reportados en este sentido. Esta purificación se realiza en el contexto de los intereses de una de las líneas centrales de investigación del Laboratorio de Inmunología de la Agresión Microbiana (ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile), relacionada con el rol del Sistema del Complemento humano en la infectividad de Trypanosoma cruzi, agente protozoario de la enfermedad de Chagas. Aunque con un rendimiento moderado, se logró la purificación de L-Ficolina recombinante, a través de cromatografía. Se sienta así la estandarización del protocolo en las condiciones locales, el que deberá ser escalado para cubrir las necesidades de futuros experimentos de infectividad parasitaria, a realizarse ya fuera del contexto de esta Memoria
In this dissertation, we describe the purification of human Complement L-Ficolin. At the national level, there are no reported efforts in this regard. This purification was performed within the context of the interests of one of the central lines of research in our laboratory, related to the role of the Complement System in Trypanosome cruzi (the agent of Chagas disease) infectivity. Although with a modest yield, chromatographic purification of L-Ficolin was achieved. Thus, we established the experimental basic conditions for the purification of this rather elusive molecule. Outside the context of this dissertation, this procedure, adequately scaled, may meet the needs of future experiments on parasite infectivity, mediated by this molecule
Conicyt; Fondecyt

Els avenços realitzats en els últims anys en les tècniques d'extracció i preservació dels òrgans trasplantats, així com en la medicació immunosupressora i l'avaluació de risc immunològic, han permès millorar la supervivència de l'empelt renal i del receptor a curt termini. Aquesta millora no es veu tan clarament reflectida a mitjà i llarg termini. Probablement, una de les causes d'això últim és la funció retardada de l'empelt, una forma de dany renal agut, que es presenta en un 20-50% dels receptors de donant cadàver i que empitjora el pronòstic dels ronyons trasplantats que la pateixen . En aquesta línia, la principal causa de funció retardada de l'empelt és el dany induït per la isquèmia-reperfusió, procés en part inherent a la tècnica del trasplantament renal, que es pot veure agreujat per múltiples factors com poden ser la situació del donant previ a la extracció de l'òrgan, la mateixa intervenció quirúrgica o per característiques del receptor. L'activació de el sistema del complement és un dels principals mecanismes involucrats en la fisiopatologia d'aquest fenomen. L'objectiu de la present tesi és aprofundir en el coneixement de el dany induït per l'activació del sistema del complement en el fenomen d'isquèmia-reperfusió, en l'àmbit del trasplantament renal. Per això, hem dissenyat tres estudis que abasten diferents aspectes clínics i etiopatogènics del dany pel complement en la isquèmia-reperfusió. Inicialment, vam analitzar l'impacte de la funció retardada de l'empelt, en una àmplia cohort de pacients trasplantats renals. Detectem pitjor supervivència de l'empelt i pitjor funció renal a l'any del trasplantament, en aquells pacients que van presentar funció retardada de l'empelt. D'altra banda, analitzem, la dinàmica de les concentracions solubles de el complex d'atac de membrana, producte de l'activació de la via final de el sistema del complement; també, examinem el patró histològic dels dipòsits del complex d'atac de membrana, C3d i el factor H. Aquesta anàlisi va ser realitzat en pacients trasplantats renals, amb i sense funció retardada de l'empelt, seguits de manera prospectiva. Vam trobar un augment rellevant tant dels nivells plasmàtics, com dels dipòsits histològics del complex d'atac de membrana, C3d i factor H, en aquells casos amb funció retardada de l'empelt. A més, vam detectar que una major concentració de nivells plasmàtics de complex d'atac de membrana es relaciona amb pitjor funció renal a 1 i 2 anys després de l'trasplantament. També vam desenvolupar un model d'hipòxia-reoxigenació, utilitzant cèl·lules tubulars proximals humanes (HK-2). Aquest model va revelar activació local de diferents components de sistema del complement, inclòs el complex d'atac de membrana, i els receptors de C5a (C5aR1 i C5L2), un altre producte final de el sistema del complement, poc estudiat en aquest àmbit. Finalment, avaluem l'expressió histològica de C5aR1 i C5L2, en biòpsies de pacients trasplantats renals amb funció retardada de l'empelt i un grup control. Aquesta anàlisi ens va mostrar, major expressió de C5aR1 a la membrana de les cèl·lules tubulars i de C5L2 en endoteli capil·lar peritubular en les biòpsies de pacients amb funció retardada de l'empelt, comparat amb els controls.
Los avances realizados en los últimos años en las técnicas de extracción y preservación de los órganos trasplantados, así como en la medicación inmunosupresora y la evaluación del riesgo inmunológico, han permitido mejorar la supervivencia del injerto renal y del receptor a corto plazo. Esta mejoría no se ve tan claramente reflejada a medio y largo plazo. Probablemente, una de las causas de esto último es la función retrasada del injerto, una forma de daño renal agudo, que se presenta en un 20-50% de los receptores de donante fallecido y que empeora el pronóstico de los riñones trasplantados que la sufren. En esta línea, la principal causa de función retrasada del injerto es el daño inducido por la isquemia-reperfusión, proceso en parte inherente a la técnica del trasplante renal, que puede verse agravado por múltiples factores como pueden ser la situación del donante previo a la extracción del órgano, la propia intervención quirúrgica o por características del receptor. La activación del sistema del complemento es uno de los principales mecanismos involucrados en la fisiopatología de este fenómeno. El objetivo de la presente tesis es profundizar en el conocimiento del daño inducido por la activación del sistema del complemento en el fenómeno de isquemia-reperfusión, en el ámbito del trasplante renal. Para ello, hemos diseñado tres estudios que abarcan diferentes aspectos clínicos y etiopatogénicos del daño por el complemento en la isquemia-reperfusión. Inicialmente, analizamos el impacto de la función retrasada del injerto, en una amplia cohorte de pacientes trasplantados renales. Detectamos peor supervivencia del injerto y peor función renal al año del trasplante, en aquellos pacientes que presentaron función retrasada del injerto. Por otro lado, analizamos, la dinámica de las concentraciones solubles del complejo de ataque de membrana, producto de la activación de la vía final del sistema del complemento; también, examinamos el patrón histológico de los depósitos del complejo de ataque de membrana, C3d y el factor H. Este análisis fue realizado en pacientes trasplantados renales, con y sin función retrasada del injerto, seguidos de forma prospectiva. Encontramos un aumento relevante tanto de los niveles plasmáticos, como de los depósitos histológicos del complejo de ataque de membrana, C3d y factor H, en aquellos casos con función retrasada del injerto. Además, detectamos que una mayor concentración de niveles plasmáticos de complejo de ataque de membrana se relaciona con peor función renal a 1 y 2 años después del trasplante. También desarrollamos un modelo de hipoxia-reoxigenación, utilizando células tubulares proximales humanas (HK-2). Este modelo reveló activación local de diferentes componentes del sistema del complemento, incluido el complejo de ataque de membrana, y los receptores de C5a (C5aR1 y C5L2), otro producto final del sistema del complemento, poco estudiado en este ámbito. Finalmente, evaluamos la expresión histológica de C5aR1 y C5L2, en biopsias de pacientes trasplantados renales con función retrasada del injerto y un grupo control. Este análisis nos mostró, mayor expresión de C5aR1 en la membrana de las células tubulares y de C5L2 en endotelio de capilar peritubular en las biopsias de pacientes con función retrasada del injerto, comparado con los controles.
The advances made during the last years in the extraction and preservation of the organs for transplantation, immunosuppressive medication, and the evaluation of immunological risk have improved patient and renal allograft survival. However, these improvements have had a limited effect on long-term survival. One of the reasons that negatively influence this long-term survival is the appearance of delayed graft function, a form of acute kidney damage, which occurs in 20-50% of deceased donor recipients and worsens the graft outcomes. The leading cause of delayed graft function is the damage induced by ischemia-reperfusion, a process inherent to the kidney transplantation process. The ischemia-reperfusion injury could be aggravating by different variables such as the donor's situation before organ retrieval or recipient characteristics. In the pathophysiology of this phenomenon, the activation of the complement system is highly relevant. This thesis's objective has been to expand our understanding of the damage induced by the activation of the complement system during ischemia-reperfusion injury in kidney transplantation. To this end, we designed three studies that evaluated different clinical and etiopathogenic aspects of the ischemia-reperfusion phenomenon. We initially assessed the impact of delayed graft function in a large cohort of kidney transplant patients. The development of delayed graft function was associated with worse graft survival and worse kidney function in the first year after transplantation. On the other hand, we analyze the dynamics of plasma levels of the membrane attack complex's soluble form, the final product from complement system activation in kidney transplant patients with and without delayed graft function. Additionally, we examined the histological pattern of the deposits of the membrane attack complex, C3d, and factor H in kidney biopsies from patients who were experiencing delayed graft function and controls with normal biopsies. We detected a relevant increase in plasma levels and histological deposits of the membrane attack complex, C3d, and factor H, in those patients with delayed graft function. A high concentration of membrane attack complex levels was related to worse kidney function at one and two years after transplantation. Finally, we developed a model of hypoxia-reoxygenation with human proximal tubular cells (HK-2). We demonstrated local activation of the complement system's different components, including the membrane attack complex, and the C5a receptors (C5aR1 and C5L2), another product of the complement system, scarcely studied in this area. Besides, we observed a higher expression of C5aR1 in the tubular cell membrane and C5L2 in the peritubular capillary endothelium, in biopsies of patients with delayed graft function, compared to controls.
Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Medicina

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
Trypanosoma cruzi, protozoo perteneciente a la familia Trypanosomatidae, es el agente causal de la enfermedad de Chagas. El principal mecanismo de transmisión de esta enfermedad es vectorial, por medio de insectos hemípteros hematófagos de la familia Reduviidae. Los tripomastigotes, formas infectantes del parásito, son capaces de resistir la acción del Sistema del Complemento (C) del hospedero, importante componente efector de la respuesta inmune innata. Se describen 3 vías de activación: clásica (VC), alterna (VA) y de las lectinas (VL), las cuales se activan en forma de cascada, por lo cual el C debe ser finamente regulado, impidiendo el daño en células del hospedero. En mamíferos, una proteínas reguladoras del C es el factor acelerador del decaimiento de la convertasa (DAF). DAF actúa inactivando las proteínas C3 y C5 convertasas de la VC y VA, acelerando su decaimiento. Se ha reportado que T. cruzi expresa factores reguladores del C similares a los del hospedero mamífero, inhibiendo su activación. Entre estos, se ha identificado la expresión de una proteína con función similar a DAF humana (T-DAF), de la cual sólo se han expresado parcialmente algunos fragmentos y se desconoce gran parte de sus funciones. En esta memoria de título se amplificó e insertó la secuencia nucleotídica codificante para la proteína de T. cruzi T-DAF en un vector de expresión de Escherichia coli. Utilizando bacterias transformadas con el plasmidio generado, se expresó y purificó en condiciones nativas la proteína recombinante T-DAF y se caracterizó su estructura tridimensional mediante un modelamiento in silico.
Trypanosoma cruzi, protozoan belonging to the Trypanosomatidae family, is the causative agent of Chagas disease. The main mechanism of transmission of this disease is through blood-sucking insects belonging to the Reduviidae family. Trypomastigotes, infectious forms of the parasite, are able to resist the action of the complement system (C), an important effector of the innate immune response in mammals. C has 3 activation pathways: classical (CP), alternative (AP) and lectin (LP) pathways. These 3 pathways are activated sequentially. For this reason, the activation of the C should be finely regulated in order to prevent damage on the host cells. In mammals, an important C regulatory proteins is the decay accelerating factor (DAF). DAF acts by inhibiting the C3 and C5 convertase proteins activation of the CP and AP, accelerating its decay. It has been reported that the parasite expresses C regulatory proteins similar to those present in the mammalian host, inhibiting C. One of these C regulatory proteins has a similar function of human DAF (T-DAF), however, it has only been expressed partially and most of their functions are unknown. In the present work, the nucleotide sequence coding for the protein of T. cruzi T-DAF was amplified and inserted into an expression vector for Escherichia coli. Using bacteria transformed with this vector, the recombinant protein T-DAF was expressed and purified under native conditions, and its three dimensional structure was characterized by an in silico modeling.
Financiamiento: Proyectos FONDECYT de Iniciación: Nð11110251 y Nð1130113.

INTRODUCCIÓN:

La dermatomiositis (DM) es una enfermedad de origen autoinmune, incluida en el grupo de las miopatías inflamatorias idiopáticas. En el control clínico de este proceso se precisan marcadores que permitan determinar el grado de actividad de la enfermedad, facilitando así el ajuste la terapia inmunomoduladora. Se analiza la relación entre los productos de activación del complemento (PAC) y la actividad de la DM y su utilidad en el seguimiento de la enfermedad y en la predicción de las reagudizaciones en relación a los parámetros bioquímicos habituales.

MÉTODOS:

Se estudiaron 16 pacientes con DM, que fueron seguidos periódicamente. En cada revisión se estableció el grado de actividad cutánea y muscular del proceso y se correlacionó dicha actividad con los niveles plasmáticos de C3a y C5b-9, determinados mediante técnica de ELISA.

RESULTADOS:

Si bien se obtuvo cierta correlación entre la actividad del proceso y los niveles plasmáticos de C3a y C5b-9, la intensidad de dicha correlación no superó a la obtenida por los marcadores bioquímicos tradicionales. En la capacidad de predicción de reagudizaciones, C3a se mostró como el marcador más sensible (100%) con una especificidad suficiente (83.3 %).

CONCLUSIONES:

C3a y en menor medida C5b-9 serían de utilidad en la identificación de pacientes con DM especialmente activas, así como en la predicción de reagudizaciones del proceso. Sin embargo no tienen una utilidad superior al resto de marcadores bioquímicos como marcadores de actividad actual.

El objetivo principal de este estudio de investigación es determinar si existe activación del sistema del complemento en la Insuficiencia Renal Aguda (IRA) humana, como sugieren estudios preclínicos. Como objetivos secundarios hemos estudiado si existe activación de otras vías inflamatorias representadas por la interleuquina-6 (IL-6), interleuquina-10 (IL-10) y NGAL o Lipocalina-2, como marcador de activación de los neutrófilos. Con el objetivo de estudiar la activación del sistema del complemento determinamos la fracción lítica del sistema de complemento ó Complejo Ataque de Membrana (MAC) tanto en plasma, mediante técnicas de ELISA-HS, como en tejido renal, mediante técnicas de tinción por inmunohistoquímica. Se incluyeron en el estudio 156 pacientes, el 52,6% de ellos presentaban IRA y el resto son homólogos respecto a las condiciones clínicas, pero mantuvieron función renal normal. Se incluyeron pacientes con IRA de distintas etiologías (séptica, nefrotoxicidad, isquemia-reperfusión y multifactorial). Las concentraciones plasmáticas de MAC son significativamente más elevadas en pacientes con IRA y se relacionan con parámetros clínicos de gravedad utilizados en la práctica clínica habitual, de tal manera que los pacientes con niveles plasmáticos más elevados de MAC son aquellos que requerirán tratamiento renal sustitutivo durante el ingreso hospitalario y que presentarán una recuperación más lenta de la función renal. Además, las concentraciones de MAC durante el episodio de IRA pueden influir a medio plazo en la función renal, de tal manera que los pacientes que evolucionaron a insuficiencia renal crónica o bien presentaron nuevos episodios de IRA en un período de tres años, son aquellos con los niveles más altos de MAC. Por otro lado, en los pacientes con IRA existe una elevación plasmática significativa de IL-6 y Lipocalina-2, que se relacionan con los mismos parámetros de gravedad de MAC. Ambos biomarcadores muestran distintos grados de correlación con el MAC plasmático e IL-10 en los pacientes más graves, aquellos que fallecerán en el episodio agudo. Los resultados en tejido renal, tanto procedente de autopsia clínica como de biopsia renal, muestran un depósito lineal en la membrana basal tubular de MAC de aquellas muestras de pacientes con IRA, que no se objetiva en pacientes con función renal normal. En las muestras de tejido renal en pacientes con IRA se observa una mayor tinción citoplasmática de Factor H, regulador de la vía alternativa, especialmente en formas histológicas IRA de mayor gravedad, aunque no hemos objetivado diferencias en las concentraciones plasmáticas de Factor H.
The main objective of this study is to establish if complement pathway is activated in human Acute Kidney Injury (AKI), as suggested by pre-clinical studies. Secondary objectives are to determine if other inflammatory pathways are activated, represented by interleukin-6, interleukin-10 and NGAL or Lipocalin-2 as a marker of the neutrophil activation. For this purpose, we evaluated the lytic complex of the complement pathway or Membrane Attack Complex (MAC) in plasma, using ELISA-HS techniques or in kidney tissue by immunochemistry staining. We included 156 patients, 52.6% of them with AKI and 47,4% under the same clinical conditions but with normal kidney function. The study enrolled different AKI etiologies (septic, nephrotoxic, ischemia-reperfusion and multifactorial). Plasma results show that MAC concentrations are significant higher in AKI patients. Furthermore, plasmatic MAC concentrations are related with clinical parameters of severity, AKI patients with higher MAC plasmatic levels need renal replacement therapy during hospitalization and show delayed recovery of renal function. Our data suggest that MAC concentrations during AKI episode could have influence in mid-term renal function, in such a way that the patients developing chronic kidney disease or those suffering new AKI episodes during 3-years follow up, show higher MAC concentrations in the first AKI episode. AKI patients show significantly higher plasmatic IL-6 and Lipocalin-2 concentrations than those with normal kidney function. These concentrations are related with clinical severity parameters and show different degrees of correlation with MAC plasmatic levels. IL-10 is significant higher in critically ill patients who die during an AKI episode. Immunohistochemistry staining results show linear deposits of MAC in tubular basal membranes of AKI patients. Immunohistochemistry staining for Factor H, the main regulator of alternative pathway, shows cytoplasmic pattern with high intensity in AKI patients, displaying a correlation between intensity of staining and histologic patterns of acute tubular necrosis. Plasmatic concentrations of Factor H do not show differences between AKI patients and patients with a normal renal function.

Magíster en Bioquímica Área de Especialización en Bioquímica de Proteínas Recombinantes y Biotecnología y Memoria para optar al título de Bioquímico
Las hemocianinas son metaloglicoproteínas de elevado tamaño presentes en la hemolinfa de algunos moluscos, cuya función principal es el transporte de oxígeno. La hemocianina más estudiada se obtiene de la Lapa Californiana, Megathura crenulata y se conoce como KLH, presentando notorias capacidades inmunomoduladoras, por lo que ha sido utilizada con múltiples fines terapéuticos y de investigación. Sin embargo, las recientemente descubiertas hemocianinas del Loco, Concholepas concholepas, (CCH) y de la Lapa Negra, Fissurella latimarginata, (FLH), han cobrado relevancia, dadas sus mejores propiedades en cuanto a estabilidad y efectos inmunoestimulantes, respectivamente. No obstante, los mecanismos inmunológicos mediante los cuales estas proteínas ejercen sus diversas acciones son poco conocidos. Así, un factor frecuentemente mencionado es su alto contenido de carbohidratos (hasta 9% en peso), con diferencias en su composición entre las especies mencionadas. Interesantemente, se ha descrito en individuos no inmunizados de varias especies, incluyendo los seres humanos, la presencia de anticuerpos naturales reactivos con KLH que estarían dirigidos contra sus carbohidratos, hecho que lleva a considerar como otro factor posible al sistema del complemento. El sistema del complemento es un conjunto de proteínas plasmáticas y de membrana cuya activación, finamente regulada se lleva a cabo en una secuencia de eventos proteolíticos limitados sobre los componentes iniciales. Culmina con la lisis del patógeno mediante la formación de complejos de ataque de membrana. Además, conduce a la opsonización del patógeno y a la coestimulación de linfocitos B, junto con la producción de anafilotoxinas con propiedades inflamatorias, que favorecen la respuesta inmune. Este sistema puede ser activado por la vía clásica, mediante anticuerpos que reconocen al agresor; la vía de las lectinas, mediante diversos carbohidratos presentes en el células agresoras, y la vía alterna, en que el sistema detecta ausencia de moléculas “propias”. En vista de estos antecedentes, proponemos que la presencia, en individuos no inmunizados, de anticuerpos naturales que reconocen a las hemocianinas, conduce a la activación de la vía clásica del sistema del complemento humano por dichas proteínas. Así, el objetivo general de esta tesis ha sido estudiar un rol del complemento que contribuya a explicar la capacidad inmunoestimulante no específica de las hemocianinas en mamíferos. En primera instancia, se analizaron los sueros de 4 pacientes inmunizados con KLH, identificándose dos pacientes con altos niveles de anticuerpos anti-KLH, los cuales se utilizaron como controles positivos para la detección de anticuerpos en donantes no inmunizados con hemocianinas. Así, se detectó en una muestra de 5 donantes, diferentes niveles de anticuerpos no sólo contra KLH, sino que también contra FLH y CCH. Luego, para analizar la especificidad de estos anticuerpos, se realizó una desglicosilación química de las hemocianinas y se observó si esto afectaba la unión de estos anticuerpos, encontrándose que este tratamiento afectó de forma diferencial su reactividad. Específicamente, en algunos casos la desglicosilación disminuyó la unión de los anticuerpos, en otros casos no tuvo efecto y en otros incluso aumentó. Posteriormente, se procedió a analizar la capacidad de algunos sueros para activar la vía clásica del sistema del complemento in vitro, fenómeno que ocurrió con todas las hemocianinas, aunque no se pudo establecer una correlación entre el nivel de anticuerpos y la intensidad de la activación. Además, en concordancia con lo observado anteriormente, la desglicosilación de las hemocianinas tuvo un efecto diferencial en la activación de esta vía, destacándose el efecto sobre FLH, en la cual la desglicosilación aumentó fuertemente tanto la unión de anticuerpos como la activación de la vía clásica. En concordancia con estos resultados, cuando se utilizó un anticuerpo anti-C1q que inhibe específicamente la activación de la vía clásica, esta activación fue revertida. En conjunto, estos resultados apuntan a un nuevo rol para el sistema del complemento, específicamente a través de la vía clásica, con respecto a las notables propiedades inmunomoduladoras no específicas de las hemocianinas de moluscos en mamíferos. Si bien no se pudo definir un rol preponderante para los carbohidratos en todas las hemocianinas, los resultados señalan la necesidad de continuar con esta línea de investigación, para proveer información adicional para un uso seguro de las hemocianinas en biomedicina
Hemocyanins are metalloglycoproteins with large molecular sizes present in the hemolymph of some mollusks, with oxygen transport being their main function. The most studied hemocyanin is obtained from the keyhole limpet, Megathura crenulata and it is known as KLH, with remarkable immunomodulatory capacities, leading to its use in multiple therapeutical and research approaches uses. However, the recently discovered hemocyanins of the Chilean abalone, or “Loco”, Concholepas concholepas (CCH), and that from “Lapa negra”, Fissurella latimarginata, (FLH), have become relevant, given their better properties regarding stability and immunomodulatory effects, respectively. In spite of this, the mechanisms through which these molecules exert their effects are scarcely understood. A frequent explanation is their high carbohydrate content (up to 9% w/w), with differences between their compositions among the mentioned species. Interestingly, in unimmunized individuals from different species, humans included, it has been described the presence of natural antibodies reactive with KLH, possibly through its carbohydrate moieties, leading to the possibility that the complement system is also involved. The complement system is a group of plasma and membrane-bound proteins whose finely regulated activation is carried out in a sequence of limited proteolytic events, involving mainly the initial components. It culminates with the pathogen lysis through formation of membrane attack complexes. It also leads to pathogen opsonization and B cell costimulation, along with the production of anaphylatoxins with inflammatory properties, thus favoring the immune response. This system can be activated through the classical pathway, due to antibodies recognizing an aggressor; the lectin pathway, due to diverse carbohydrates present on the aggressor cells; and the alternate pathway, where the system detects the absence of “self” molecules. Taking these antecedents into account, we propose that the presence, in unimmunized individuals, of antibodies recognizing the hemocyanins, leads to the activation of the classical pathway of the human complement system by these proteins. Thus, the general goal of this thesis has been to study a role of the complement that contributes to explain the non-specific immunostimulatory capacity of the hemocyanins in mammals. First, the sera of 4 patients immunized with KLH were analyzed, and two patients with a high level of anti-KLH antibodies were identified, being used as a positive controls for the detection of antibodies in healthy donors previously unimmunized with hemocyanins. Then we detected in 5 donors, different levels of antibodies not only against KLH, but also against FLH and CCH. In order to analyze the specificity of these antibodies, the hemocyanins were chemically deglycosylated and we observed how this affected the antibody binding in the sera of unimmunized donors, concluding that this treatment affected differentially their reactivity, Specifically, deglycosylation in some cases diminished antibody binding, while in others, no effect was observed and yet, in some it was even increased. Then, the ability of some sera to activate in vitro the classical pathway of the complement system was assessed, a phenomenon that was observed with all hemocyanins, although no correlation between antibody level and activation intensity could be established. Also, as observed before, hemocyanin deglycosylation had a differential effect in the activation of this pathway, with a remarkable effect over FLH, where deglycosylation strongly increased both antibody binding and classical pathway activation. In agreement with these results, when an anti-C1q antibody that specifically inhibits classical pathway activation was used, this activation was reversed. Taken together, these results point towards a new role for the complement system, specifically through the classical pathway, regarding the remarkable non-specific immunomodulatory properties of the molluskan hemocyanins in mammals. Even though we could not define a prevailing role for carbohydrates in all hemocyanins, the results indicate the need to continue with this line of research, to provide additional information for a safe use of hemocyanins in biomedicine
Conicyt, Fondecyt, Proyecto Anillo PIA-ACT 112, BIOSONDA, FUCITED

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario
La enfermedad de Chagas, producida por el protozoo Trypanosoma cruzi, afecta aproximadamente 18 millones de personas en Latinoamérica, existiendo alrededor 200.000 individuos infectados en Chile. En nuestros días, aún no existe vacuna y el tratamiento farmacológico de los casos crónicos es de escasa eficacia, constituyendo uno de los más importantes problemas de salud pública y socioeconómicos de nuestro continente. Aunque el agente causal infecta a todos los mamíferos, no existe información sobre el impacto patológico en animales con valor afectivo o productivo. Numerosos son los antígenos inmunodominantes que se han descrito relacionados con el agente. Uno de ellos es calreticulina, proteína multifuncional altamente conservada presente en el retículo endoplásmico de todas las células de los organismos superiores, con excepción de eritrocitos. Actualmente, el Laboratorio donde se realizó esta Memoria (Inmunología de la Agresión Microbiana, Programa de Inmunología, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile) ha centrado su interés en tres funciones de calreticulina de T. cruzi (TcCRT), tales como: inhibición del sistema del complemento, capacidad ligante de calcio y propiedades anti-angiogénica. Los tripomastigotes infectantes de Trypanosoma cruzi, evaden la respuesta inmune. In vitro, el dominio S de TcCRT (TcS), une C1q del complemento humano, inhibiendo la activación de la ruta clásica. TcCRT induce inmunidad humoral (IgG) in vivo. Por ello, en un intento para generar un correlato in vitro de posibles situaciones inmunomoduladoras de la interacción in vivo entre TcCRT y C1q, se generaron fragmentos inmunoglobulínicos F(ab’)2 anti-TcS y anti-TcCRT recombinante (rTcCRT). Para esto, se inmunizaron conejas con ambos antígenos. Todas respondieron a las inmunizaciones produciendo sueros con alto título de inmunoglobulinas. Estas fueron purificadas por cromatografía de afinidad y se obtuvo la fracción IgG. Los anticuerpos policlonales se sometieron a una digestión enzimática, obteniendo sus fragmentos F(ab’)2, los cuales, fueron purificados y utilizados en un ensayo de ELISA para intentar bloquear la unión de rTcCRT a C1q del complemento humano. En síntesis, tanto rTcCRT como su dominio funcional TcS fueron inmunogénicos, obteniéndose anticuerpos policlonales, de los que se generaron fragmentos F(ab’)2, capaces de bloquear la unión de rTcCRT y TcS a C1q del complemento humano, representando un posible correlato de las situaciones in vivo

Doctor en Ciencias de la Ingeniería, Mención Ingeniería Química y Biotecnología
Calreticulina (CRT) humana completa (HuCRT), su dominio N-terminal y fragmentos de ella (aa 120-180, 135-164) evidencian actividad antiangiogénica in vitro e in vivo en varios modelos tumorales. Por su parte, calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe la migración, proliferación, quimiotaxis y morfogénesis capilar en cuatro especies distintas (Homo sapiens sapiens, Rattus rattus, Mus musculus y Gallus gallus), con efecto antiangiogénico y antitumoral equimolarmente mayor al de HuCRT. Se propone en este trabajo que la función antiangiogénica y antitumoral de TcCRT reside en un subdominio identificable en su dominio N-terminal. Para lograr este objetivo, se localizó el subdominio alineando in silico las secuencias de varias CRTs. Luego, se produjeron dos modelos predictivos de TcCRT: uno de su dominio globular (muy similar a un modelo cristalográfico de TcCRT reciente), y otro del subdominio identificado, con los que se estudiaron sus propiedades estructurales. Se observó que TcCRT es mas polar y rígida que HuCRT, por sus diferencias en secuencia primaria, interacciones iónicas, polares, hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, que estabilizan mejor sus sitios activos (especialmente el de unión a péptidos) y la hacen más apta para unirse a otras proteínas rígidas y cargadas como los dominios colagenosos existentes en C1q (subunidad del primer componente del Sistema del Complemento) y en algunos receptores scavenger.Calreticulina (CRT) humana completa (HuCRT), su dominio N-terminal y fragmentos de ella (aa 120-180, 135-164) evidencian actividad antiangiogénica in vitro e in vivo en varios modelos tumorales. Por su parte, calreticulina de Trypanosoma cruzi (TcCRT) inhibe la migración, proliferación, quimiotaxis y morfogénesis capilar en cuatro especies distintas (Homo sapiens sapiens, Rattus rattus, Mus musculus y Gallus gallus), con efecto antiangiogénico y antitumoral equimolarmente mayor al de HuCRT. Se propone en este trabajo que la función antiangiogénica y antitumoral de TcCRT reside en un subdominio identificable en su dominio N-terminal. Para lograr este objetivo, se localizó el subdominio alineando in silico las secuencias de varias CRTs. Luego, se produjeron dos modelos predictivos de TcCRT: uno de su dominio globular (muy similar a un modelo cristalográfico de TcCRT reciente), y otro del subdominio identificado, con los que se estudiaron sus propiedades estructurales. Se observó que TcCRT es mas polar y rígida que HuCRT, por sus diferencias en secuencia primaria, interacciones iónicas, polares, hidrofóbicas y puentes de hidrógeno, que estabilizan mejor sus sitios activos (especialmente el de unión a péptidos) y la hacen más apta para unirse a otras proteínas rígidas y cargadas como los dominios colagenosos existentes en C1q (subunidad del primer componente del Sistema del Complemento) y en algunos receptores scavenger. A continuación, se realizaron ensayos funcionales con el péptido parasitario sintetizado químicamente según el subdominio estudiado para comprobar in vitro e in vivo estas propiedades. En el ELISA de unión a C1q, se observó que 0,16 µM del péptido se une 1,68 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,08 µM de TcCRT; 0,64 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q y 1,21 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,32 µM de TcCRT; y 2,56 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q que 1,28 µM de TcCRT, sin haber diferencia estadística significativa a 1 µg/ml de C1q en el primer caso y a 2 µg/ml de C1q en el tercer caso. Asimismo, tampoco se detectó diferencia estadística significativa entre el péptido molarmente al doble que TcCRT al inhibir la angiogénesis en membrana corionalantoídea de embriones de Gallus gallus. Todo esto sugiere fuertemente lo postulado en la hipótesis de este trabajo en cuanto al efecto antiangiogénico del péptido parasitario. Todas estas evidencias reafirman la utilidad de TcCRT y de su péptido tipo-vasostatina corto como agentes profilácticos antitumorales, lo cual facilitará el proceso de producción, validación y aplicación de ambas para prevenir el crecimiento de tumores sólidos, proporcionando así una alternativa terapéutica potencial contra el cáncer. A continuación, se realizaron ensayos funcionales con el péptido parasitario sintetizado químicamente según el subdominio estudiado para comprobar in vitro e in vivo estas propiedades. En el ELISA de unión a C1q, se observó que 0,16 µM del péptido se une 1,68 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,08 µM de TcCRT; 0,64 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q y 1,21 veces más a 2 µg/ml de C1q que 0,32 µM de TcCRT; y 2,56 µM del péptido se une 1,26 veces más a 1 µg/ml de C1q que 1,28 µM de TcCRT, sin haber diferencia estadística significativa a 1 µg/ml de C1q en el primer caso y a 2 µg/ml de C1q en el tercer caso. Asimismo, tampoco se detectó diferencia estadística significativa entre el péptido molarmente al doble que TcCRT al inhibir la angiogénesis en membrana corionalantoídea de embriones de Gallus gallus. Todo esto sugiere fuertemente lo postulado en la hipótesis de este trabajo en cuanto al efecto antiangiogénico del péptido parasitario. Todas estas evidencias reafirman la utilidad de TcCRT y de su péptido tipo-vasostatina corto como agentes profilácticos antitumorales, lo cual facilitará el proceso de producción, validación y aplicación de ambas para prevenir el crecimiento de tumores sólidos, proporcionando así una alternativa terapéutica potencial contra el cáncer.

Globalment, aquesta tesi mostra diversos fenòmens que s’associen a la reperfusió després de la isquèmia cerebral. Per una banda, la inducció de la proteïna Hsp-70, a la que s’atribueixen propietats anti-apoptòtiques i protectores, promourà la supervivència neuronal en la zona de la penombra. La generació d’animals transgènics que expressen una proteïna fluorescent sota el promotor del gen Hsp-70 ens ha permès visualitzar en animals vius la zona de penombra mitjançant tècniques de microscòpia confocal intravital, així com monitoritzar aquesta expressió en regions cerebrals utilitzant tecnologia FRI. Malgrat la inducció de molècules protectores que facilitaran la supervivència neuronal a la zona de penombra, la reperfusió també comporta danys secundaris que s’associen principalment a estrès oxidatiu i inflamació. Aquests danys per reperfusió no s’observen en tots els animals sinó que es posen de manifest en aproximadament la meitat dels animals sotmesos a isquèmia transitòria seguida de reperfusió. Hem trobat que la hiperèmia reactiva en el moment de la reperfusió és un biomarcador de dany per reperfusió. El subgrup d’animals amb hiperèmia reactiva és el que és susceptible de respondre a tractaments antioxidants, com hem demostrat amb l’anàleg sintètic de la vitamina E, CR-6. L’administració oral de CR-6 dues hores després de l’inici de la isquèmia, protegeix els animals hiperèmics disminuint el volum d’infart cerebral i atenuant els dèficits neurològics. Aquesta protecció està relacionada amb una disminució de l’estrès oxidatiu a nivell de la vasculatura cerebral, menor alteració de la permeabilitat de la barrera hematoencefàlica, menor infiltració leucocitària i menor inflamació. La isquèmia/reperfusió també activa el complement. Hem demostrat que la via de les lectines està implicada en la lesió cerebral donat que els animals deficients en la proteïna MBL d’aquesta via tenen lesions de menor mida i presenten menys alteracions neurològiques. Hem demostrat que els efectes perjudicials de la MBL són deguts a la disminució del flux sanguini cerebral durant les hores que segueixen a la reperfusió post-isquèmia. Aquesta disminució està relacionada amb el dipòsit de fibrina/fibrinògen en la microvasculatura cerebral de la zona afectada i amb l’activació de la trombina, tal com demostren els efectes beneficiosos de l’inhibidor de trombina argatroban, que s’observen en els animals que tenen MBL però no en els animals deficients. Els resultats d’aquest treball permeten concloure que diferents estratègies per minimitzar el dany per reperfusió podrien incloure la inducció de l’expressió de Hsp-70 per afavorir la supervivència de les neurones de la penombra, i la inhibició tant de l’estrès oxidatiu com de l’activació del complement per la via de les lectines per evitar la trombosis secundària durant la reperfusió, atenuar l’estrès oxidatiu a l’endoteli vascular i prevenir la ruptura de la barrera hematoencefàlica i la inflamació tissular.
Stroke induces strong expression of the 72-kDa heat-shock protein (HSP-70) in the ischaemic brain, and neuronal expression of HSP-70 is associated with the ischaemic penumbra. The aim of this study was to image induction of Hsp-70 gene expression in vivo after brain ischaemia using reporter mice. A genomic DNA sequence of the Hspa1b promoter was used to generate an Hsp70-mPlum far-red fluorescence reporter vector. The construct was tested in cellular systems (NIH3T3 mouse fibroblast cell line) by transient transfection and examining mPlum and Hsp-70 induction under a challenge. After construct validation, mPlum transgenic mice were generated. Focal brain ischaemia was induced by transient intraluminal occlusion of the middle cerebral artery and the mice were imaged in vivo with fluorescence reflectance imaging (FRI) with an intact skull, and with confocal microscopy after opening a cranial window. Cells transfected with the Hsp70-mPlum construct showed mPlum fluorescence after stimulation. One day after induction of ischaemia, reporter mice showed a FRI signal located in the HSP-70-positive zone within the ipsilateral hemisphere, as validated by immunohistochemistry. Live confocal microscopy allowed brain tissue to be visualized at the cellular level. mPlum fluorescence was observed in vivo in the ipsilateral cortex 1 day after induction of ischae- mia in neurons, where it is compatible with penumbra and neuronal viability, and in blood vessels in the core of the infarction. This study showed in vivo induction of Hsp-70 gene expression in ischaemic brain using reporter mice. The fluorescence signal showed in vivo the induction of Hsp-70 in penumbra neurons and in the vasculature within the ischaemic core. Several lines of evidence support the involvement of mannose-binding lectin (MBL) in stroke brain damage. The lectin pathway of the complement system facilitates thrombin activation and clot formation under certain experimental conditions. In the present study, we examine whether MBL promotes thrombosis after ischemia/reperfusion and influences the course and prognosis of ischemic stroke. Middle cerebral artery occlusion/reperfusion was performed in MBL-deficient and wild-type mice, and the brain lesion was assessed by MRI at days 1 and 7. Relative cerebral blood flow was monitored up to 6 hours after middle cerebral artery occlusion with laser speckle contrast imaging. Fibrin(ogen) was analyzed in the brain vasculature and plasma, and the effects of thrombin inhibitor argatroban were evaluated to assess the role of MBL in thrombin activation. Infarct volumes and neurological deficits were smaller in MBL knockout mice than in WT mice. Relative cerebral blood flow values during middle cerebral artery occlusion and at reperfusion were similar in both groups, but decreased during the next 6 hours in the WT group only. Also, the WT mice showed more fibrin(ogen) in brain vessels and a better outcome after argatroban treatment. In contrast, argatroban did not improve the outcome in MBL knockout mice. MBL promotes brain damage and functional impairment after brain ischemia/reperfusion in mice. These effects are secondary to intravascular thrombosis and impaired relative cerebral blood flow during reperfusion. Argatroban protects WT mice, but not MBL knockout mice, emphasizing a role of MBL in local thrombus formation in acute ischemia/reperfusion.

L'estudi de la utilització del sistema immunològic de l'hoste pels virus com a patògens per al seu propi benefici fou el principal objectiu d'aquest treball. Concretament, en aquest treball de tesis es van analitzar dues espècies d'herpesvirus virulents en humans, l'Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) i l'Epstein Barr Virus (EBV). L'entrada d'ambdós virus a les cèl.lules és mediada per receptors del sistema immunològic. Es va estudiar la interacció dels respectius receptors cel.lulars, Herpes Virus Entry mediator A (HveA), i el receptor de complement 2 (CR2), amb les glicoproteïnes virals que s'hi uneixen, i amb llurs lligands naturals, els quals participen en la defensa de l'hoste.
Es va caracteritzar la interacció dels receptors HveA i CR2 amb els seus lligands fent servir proteïnes recombinants o purificades de sèrum; en el cas de HveA ens vam centrar en la localització del lloc d'unió de cada lligand al receptor. En el cas de CR2, es va analitzar la cinètica d'unió dels seus lligands naturals. Per a ambdós receptors, es va analitzar si la unió de la proteïna viral al receptor podria interferir i/o modular-ne la unió dels seus lligands naturals. Els resultats es van analitzar dins del marc de la resposta immunològica de l'hoste mediada pel receptor cel·lular, i en relació al possible paper modificador d'aquesta resposta per part de la proteïna viral.
Per a facilitar el nostre estudi sobre HveA, es van cercar nous lligands peptídics d'aquest receptor, utilitzant llibreries aleatòries de pèptids expressades en el fag M13. Es van aïllar dos pèptids, i es va estudiar la seva interacció amb el receptor i la seva capacitat d'inhibir l'entrada del virus a les cèl·lules, és a dir, com a possibles agents terapèutics.
Our goal in the present work was to study the manipulation of the host immune system by an infecting virus to its own benefit. Specifically, we studied two herpes viruses; Herpes Simplex Virus-1 (HSV-1) and Epstein Barr Virus (EBV), which infect humans. Entry of both viruses into the cell is mediated by the interaction of a specific viral surface glycoprotein with two receptors that participate in the host immune response, the Herpes Virus Entry mediator A (HveA), and complement receptor 2 (CR2). We studied the interaction of these receptors with the viral glycoproteins as well as their host ligands. The latter play a role in the immune response of the host. We characterized these interactions by using recombinant as well as serum-purified proteins. Our study of HveA sought to localize the specific binding site of each ligand on the receptor, while that of CR2 consisted in the kinetic analysis of its interaction with its ligands. We also analyzed whether binding of the viral glycoprotein to each receptor would interfere or modulate its interaction with its host ligands. Our results were analyzed in the context of the role of these receptors in the host immune response, and specifically whether the viral proteins studied undermined the host's ability to defend itself from infection.
To study the relationship between HveA, its natural ligands, and the viral proteins involved in HSV entry, we also screened two phage-displayed combinatorial peptide libraries for peptide ligands of a recombinant form of HveA. We isolated two peptides, and studied their interaction with HveA as well as their ability to block HSV entry into HveA-bearing cells.

Frente a las adversas condiciones climáticas y las distintas limitantes que afectan a los sistemas de producción de leche en pequeña escala (SPLPE), predominantes en los países en desarrollo; se hace necesaria la búsqueda de estrategias de alimentación que favorezcan su productividad. Una alternativa son los forrajes de cereales de grano pequeño cuyas características fisiológicas los hacen adaptables a condiciones de bajas temperaturas y escases hídrica que otros cultivos como el maíz no toleran. En este trabajo se evaluó la inclusión de ensilado de Avena sativa cv Chihuahua como suplemento de vacas en pastoreo sobre una pradera compuesta por Lolium perenne L., X Festuloium cv Spring Green y Trifolium repens cv Ladino analizando la respuesta sobre variables de rendimiento animal, consumo de materia seca y un análisis de costos por alimentación. Se usó un diseño experimental cuadrado latino 3x3 repetido 3 veces, mediante investigación participativa rural, con nueve vacas Holstein en lactancia (peso vivo: 496.2 ± 33.6 kg y rendimiento en leche: 14.8 ± 2.8 kg/vaca/día) en un SPLPE en el noroeste del Estado de México. Se realizó el análisis bromatológico de los alimentos y medición de la materia seca (MS) producida por hectárea en la pradera. Los tratamientos evaluados según la inclusión de ensilado de avena en la dieta, fueron: 0 (T0), 3 (T3) y 6 (T6) kg MS/vaca/día. Adicionalmente, cada tratamiento incluía concentrado comercial como suplemento y nueve horas de pastoreo. El aporte nutricional del alimento ofrecido permitió un rendimiento de leche promedio de 18.9 kg/vaca/día sin diferencias significativas entre los tratamientos, los cuales tampoco causaron efecto sobre la composición química de leche, peso y condición corporal de las vacas (P> 0.05). El consumo de pradera fue mayor para el T0 (P< 0.05) y los costos de alimentación por kilogramo se incrementaron 25 % y 50 % para los tratamientos que incluían 3 y 6 kg MS de ensilado de avena, respectivamente. Se concluye que ante condiciones difíciles de pastoreo, 3 kg MS/vaca/día de ensilado de avena permiten sostener la producción de leche en estos sistemas.
Universidad Autónoma del Estado de México (3676/2014-CIA), el proyecto “Evaluación de la sustentabilidad de sistemas de producción de leche en pequeña escala". CONACYT (129449 CB-2009

El objetivo de este estudio fue evaluar la respuesta productiva de vacas lecheras en pastoreo continuo de praderas de ballico perenne (Lolium perenne) variedad Bargala y festuca alta (Festuca arundinacea) de variedad desconocida, suplementadas con heno de triticale. Así mismo, evaluar las características agronómicas y nutricionales del forraje de las praderas y de los complementos alimenticios utilizados. El experimento se llevó a cabo bajo un diseño experimental de cuadro latino 4x4, utilizando cuatro vacas Holstein, similares en etapa de lactación, número de partos, condición corporal, rendimiento de leche (kg/vaca/día) y peso vivo (kg) previo al inicio del experimento. Los tratamientos evaluados fueron: Tx1: Pastoreo continuo por 8 h/día en pradera de festuca alta (Festuca arudinacea) asociada con trébol blanco (Trifolium repens) + 3.0 kg MS /vaca/día de heno de triticale + 4.45 kg MS de concentrado comercial/vaca/día, Tx2: Pastoreo continuo por 8 h/día en pradera de ryegrass perenne (Lolium perenne cv Bargala) asociada con trébol blanco (Trifolium repens) + 3 kg MS/vaca/día de heno de triticale + 4.45 kg MS de concentrado comercial/vaca/día, Tx3: Pastoreo continuo por 8 h/día en pradera de ryegrass perenne (Lolium perenne cv Bargala) asociada con trébol blanco (Trifolium repens) + 4.45 kg MS de concentrado comercial/vaca/día, y Tx4: Pastoreo continuo por 8 h/día en pradera de festuca alta (Festuca arudinacea) asociada con trébol blanco (Trifolium repens) + 4.45 kg MS de concentrado comercial/vaca/día. Los resultados de rendimiento de leche no presentaron diferencias entre los tratamientos evaluados (P>0.05), con un rendimiento promedio de 14.88 kg por vaca al día. Los valores correspondientes a la condición corporal y peso vivo fueron similares entre tratamientos (P>0.05); manteniendo un promedio de 2.0 para condición corporal y 533 kg para peso vivo. Los contenidos de grasa, lactosa y proteína en leche fueron similares entre tratamientos (P>0.05), así mismo para la concentración de Nitrógeno Ureico (P>0.05) en Leche ( N U L ) con un promedio de 11.97 mg/dL. Las variables agronómicas como: altura de la pradera y acumulación neta de forraje, fueron similares entre tratamientos (P>0.05). El contenido de materia seca, proteína cruda, FDN y FDA; así como la digestibilidad de la materia orgánica, y la energía metabolizable fueron similares entre los tratamientos (P>0.05). Se concluye que no existieron diferencias en las variables de desempeño animal, agronómicas de las praderas y composición química del forraje entre el rygergrass perenne (Lolium perenne) variedad Bargala y festuca alta (Festuca arudinacea) variedad desconocida. La complementación con 3.0 kg de MS de heno de triticale/vaca/día no mostró efecto significativo sobre ninguna de las variables evaluadas.
Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACYT) con clave 129449 CB-2009

Dottorato di Ricerca in Biologia Animale, XIX Ciclo,a.a.2005-2006
In mammals, the bioactive fragment C3a, released from C3 during complement activation, is a potent mediator of inflammatory reactions and exerts its functional activity through the specific binding to cell surface G protein-coupled seven-transmembrane receptors. Recently, a C3a-mediated chemotaxis of hemocytes has been demonstrated in the deuterostome invertebrate Ciona intestinalis and an important role for this molecule in inflammatory processes has been suggested. In this study, we have cloned and characterized the CiC3aR molecule involved in the CiC3a-mediated chemotaxis and studied its expression profile. The sequence of CiC3aR, encoding a 95,394 Da seventransmembrane domain protein, shows the highest sequence homology with mammalian C3aRs. Northern blot analysis revealed that the CiC3aR is expressed abundantly in the heart and neural complex and to a lesser extent, in the ovaries, hemocytes, and larvae. Three polyclonal antibodies raised against peptides corresponding to CiC3aR regions of the first and second extracellular loop and of the third intracellular loop, react specifically in Western blotting with a single band of 98-102 kDa in hemocyte protein extracts. Immunostaining performed on circulating hemocytes with the three specific antibodies revealed that CiC3aR is constitutively expressed only in hyaline and granular amoebocytes. In chemotaxis experiments, the antibodies against the first and second extracellular loop inhibited directional migration of hemocytes toward the synthetic peptide reproducing the CiC3a C-terminal sequence, thus providing the compelling evidence that C. intestinalis.expresses a functional C3aR homologous to the mammalian receptor. These findings further elucidate the evolutionary origin of the vertebrate complement-mediated proinflammatory process
Università della Calabria

Dottorato di Ricerca in Biologia Animale, XXII Ciclo,a.a.2008-2009
Research over the past ten years indicates that the Complement System, the major effector arm of the vertebrate innate immunity, emerged at least 1,300 million years ago, long before the appearance of the adaptive immune response. These studies also pointed to the ascidian Ciona intestinalis (Urochordata), which occupies a key phylogenetic position in chordate evolution, as a suitable animal model for investigating the immune system evolution. In this context, two C3-like molecules, CiC3-1 and CiC3-2, exhibiting all the characteristic features of the mammalian C3s, have been previously identified, sequenced, and characterized in C. intestinalis. Furthermore, it has been found that the activation of CiC3-1 results in the release of the bioactive fragment C3-1a, a potent mediator of inflammatory reactions. The C3-1a fragment exerts its functional activity through the specific binding to a cell surface G protein-coupled seven-transmembrane receptor (CiC3aR), which has been more recently identified and characterized. Both C3-1a and its receptor are expressed only by granular and hyaline amoebocytes, two renewing blood cell types. In Ciona, blood cell proliferation occurs in circulating blood and in lymph nodules, mainly localized in the pharynx. In the present study I have first of all assessed whether Ciona C3 could represent an early molecular marker of amoebocyte proliferation in pharyngeal limph nodules. Using real-time PCR analysis I have found that CiC3-1 is constitutively expressed in the pharynx and that its expression is up-regulated by the treatment of the animals with lipopolysaccharides (LPS), a well-known inflammatory agent. By using two specific anti-C3 and anti-C3a polyclonal antibodies in immunohistological staining of pharynx sections, I have found that also the gene product is present in the pharynx, localized in areas identified as sites of hematogenic activity, and in amoebocytes occupying the pharyngeal bars. The same antibodies used in Western blot analysis indicated that CiC3-1 and its activation products, namely CiC3-1b and CiC3-1a, are present in homogenates of pharynx. The finding that the amount of the bioactive fragment CiC3-1a increases in the pharynx of LPS treated animals, clearly indicates that CiC3-1, present in the pharynx and labeling the maturing amoebocytes, is functionally active. The identification in C. intestinalis of both the partners participating in the complement-mediated inflammatory response gave me the opportunity for further investigating the C3a-C3aR interaction at both the molecular and cellular levels. In another series of experiments, I have focused my attention on cellular mechanisms acknowledged to be fundamental in ligand-receptor interaction. I have analyzed by confocal microscopy the dynamic process of internalization of the CiC3aR, induced by the binding of CiC3-1a in the form of the eighteen amino acid C-terminal peptide CiC3-1a59-76 of CiC3-1a fragment. These experiments have been performed on amoebocytes of circulating blood, which constitutively express both CiC3-1 and CiC3aR. Results of these experiments indicate that CiC3aR, following the agonist stimulus, is internalized in few minutes, and recycled to the cell surface within 30 min, made again available for CiC3-1a binding. My observations also revealed that in response to CiC3aR activation, Ciona arrestin (CiArr) is translocated to the plasma membrane in 30 sec. This localization profile is consistent with the participation of CiArr in CiC3aR internalization, and suggests, for the first time in Ciona, a role for CiArr as the agonist driven switch initiating receptor endocytosis.
Università della Calabria