Thèses sur le sujet « SCUOLA DI DOTTORATO DI RICERCA IN NANOTECNOLOGIE »

2011/2012
Prefazione: La ricerca nel campo dei nanofili appartiene ancora al laboratorio e non all’industria. Cionondimeno, i nanofili sono oggetto di grande attrazione nella comunità scientifica e nanotecnologica, sia per il loro elevato “aspect ratio”, che per le loro capacità semiconduttrici. Il primo ne fa buoni candidati per usi di sensoristica e interazione con la luce, le seconde potrebbero invece sfruttate per la miniaturizzazione di componenti (opto)elettronici. Il GaAs è un materiale semiconduttore III-V con un band-gap diretto di 1,43 eV a temperatura ambiente. Il suo band gap ne fa un materiale più pregiato del silicio, rispetto al quale ha una minore sensibilità al calore ed una maggiore mobilità elettronica. Tali pregi sono accompagnati da un prezzo maggiore, che oggigiorno limita l’uso del GaAs nei componenti optoelettronici a più alta qualità, come per esempio negli usi satellitari. La sintesi di nanofili di GaAs di alta qualità è una possibiità intrigante per combinare le qualità superiori del GaAs con il minor costo del silicio e della sua tecnologia. L’epitassia da fascio molecolare è una tecnica per sintetizzare materiali con la massima purezza. Operando a pressioni minori di 1E-10 Torr, essa è ideale per la ricerca scientifica e per la sintesi di prodotti di altissima qualità. I prezzi di tali caratteristiche sono un’estrema delicatezza dell’apparato ed un controllo maniacale delle condizioni di crescita per assicurare riproducibilità dei risultati. All’inizio del 2009, la comunità di crescitori di nanofili era alle prese con alcune problematiche riguardanti la scelta di un materiale diverso dall’oro per assistere la crescita e conseguentemente di un substrato acconcio; ulteriori complicazioni alla sintesi di nanofili di alta qualità è(ra) il politipismo cristallino dei nanofili di GaAs. L’uso di oro nella sintesi di nanofili comporta inquinamento chimico responsabile di difetti nel materiale e la presenza di nanoparticelle di oro all’estremità dei nanofili li rende non compatibili con la tecnologia del silicio. Con attenzione sul GaAs, a quel tempo non c’era ancora un substrato di semplice preparazione per la crescita di nanofili di GaAs su GaAs e i difetti cristallini erano una piaga presso che impossibile da eliminare. La mia tesi di dottorato è stata votata allo studio di queste due problematiche. Abbiamo studiato un protocollo semplice per la realizzazione di substrati di GaAs capaci di ospitare la crescita di nanofili di GaAs in assenza di Au, depositando uno strato subnanometrico di silicio su substrati deossidati di GaAs ed espondendoli quindi all’aria. Più semplice ancora, la deposizione di Si direttamente su substrati GaAs epiready si è dimostrata altrettanto efficace. Abbiamo affrontato il problema del politipismo cristallino sia durante la crescita, investigando le relazioni tra parametri di crescita e struttura cristallina dei nanofili, sia dopo la crescita, cercando di alterarla tramite riscaldamento. Abbiamo così scoperto che condizioni ricche in As durante la crescita assistita da Ga favoriscono la struttura cristallina wurtzite, al contrario della più stabile struttura zincoblenda, propria del GaAs di bulk. Il protrarsi di condizioni ricche in As portano quindi alla estinzione della nanoparticella di Ga. In collaborazione con dr. Jakob B. Wagner (DTU CEN, Copenaghen, Danimarca), dott. mag. Damiano Cassese ed il gruppo di ricerca di dr. Marco Lazzarino (IOM CNR, Trieste, Italia) abbiamo scoperto che un periodo di riscaldamento di cento ore in flusso di As è capace di alterare la struttura wurtzite di nanofili assistiti Au in zincoblenda. Tale scoperta è stata in principio fatta tramite microscopia elettronica in trasmissione e quindi confermata per mezzo di spettroscopia Raman. Abbiamo studiato la crescita di nanofili di GaAs in assenza di nanoparticella. In collaborazione con dott. mag. Giacomo Priante (IOM CNR, Trieste, Italia) e prof. Vladimir G. Dubrovskii (SPBAU, San Pietroburgo, Russia) abbiamo trovato che anche dopo la totale consunzione della nanoparticella di Ga, i nanofili possono riprendere la crescita in modo assistito da Ga. Altri studi di minore entità sono stati condotti, come la crescita di nanofili di Si su GaAs senza catalizzatore, lo studio di nanotubi in carbonio contenenti nanoparticelle di catalizzatore, lo studio di microscopia elettronica in trasmissione della crescita laterale dei nanofili, l’effetto di “optical limiting” esercitato da sistemi ibridi. I risultati di questi studi, stonando nella logica della tesi, sono presentati in appendice. Altresì, in appendice è raccolta una sistematica della crescita di nanofili di GaAs. Durante i beam times ad ELETTRA, il Sincrotrone di Basovizza, Trieste, il mio lavoro è stato principalmente votato alla sintesi di nanofili di GaAs drogati Si sui substrati di cui sopra. I nanofili sono stati studiati con spettroscopia a raggi X risolta spazialmente sulla linea di luce ESCAMICROSCOPY, in collaborazione con dr. Mattia Fanetti e lo staff della linea di luce. La prima sessione di esperimenti ha mostrato che i nanofili assisiti da Ga sono meno conduttivi degli assistiti da Au per lo stesso drogaggio nominale. La seconda tranche di esperimenti ha permesso la comprensione del meccanismo di incorporazione delle impurezze di Si durante la crescita mediante lo studio della posizione del livello di Fermi nella band gap dei nanofili di GaAs. Abbiamo così capito che alterando il rapporto As/Ga e senza cambiare la temperatura di crescita (andando cioè a crescere in assenza di nanoparticella) è possibile realizzare eterogiunzioni radiali p-n di alta qualità, con la stessa quantità di drogante.
Abstract: Although still belonging to the laboratory world, nanowires are the object of a big attraction in scientific community for their exploitation in technological devices. Two of the most alluring aspects of nanowires are their high aspect ratio, which makes them candidates for sensing uses as well as light harvesting, and their semiconducting nature, that puts forward their employment for nanoscale transistors and logic units. GaAs is a well-known III-V semiconductor material with a direct band-gap of 1.43 eV at room temperature. It has better properties than Si, such as a large direct band- gap, which also provides lower sensibility to heating, and higher electron mobility. Despite its higher cost, GaAs is nowadays commonly used for highest performance logic units and optoelectronics. The synthesis of high quality GaAs nanowires and their implementation on Si technology encourages the idea of putting together the superior GaAs with the cheaper Si. Molecular beam epitaxy is a growth technique that offers the highest possible purity by means of ultra high vacuum growth regime (base pressure < 1E-10 Torr). It is, therefore, ideal for both research and high quality products. Prices of such advantages are an extreme delicateness of the setup and a maniacal control of the growth conditions, to ensure reproducibility in scientific results. At the beginning of 2009, the nanowire grower community was facing some issues such as the choice of a material different from gold assisting the nanowire growth, the growth substrate and the crystal polytypism. The use of Au as the assistant nanowire growth material had two main drawbacks. Firstly, the verified pollution with Au of the growing nanowires would create defects in the material; secondly, the presence of Au nanoparticles at the nanowire free end would make them non- compatible with Si-based technology. Focusing on GaAs, there was no simple protocol for the substrate treatment in order to trigger the Au-free one-dimensional nanowire growth on GaAs. Nanostructure crystal defects were almost impossible to avoid. My Ph.D. work has been devoted to the study of these problems. We studied a simple protocol to obtain GaAs nanowires on GaAs by MBE. We proved that a sub-nanometric Si layer epitaxially deposited on the deoxidized GaAs surface followed by atmospheric oxidation, or direct Si deposition onto epiready GaAs wafers is able to trigger Ga assisted GaAs nanowire growth. We tackled the nanowire polytypism issue both in a “during growth” action, by studying the effects of the growth parameters on the nanowire crystal structure; and with an “after growth” action, by attempting to change the nanowire crystal structure by thermal annealing after the growth itself. In particular we found that As rich conditions during Ga assisted GaAs nanowire growth leads to a favored wurtzite structure as compared to the default zincblende lattice of the bulk GaAs material. Eventually, As rich conditions lead to the total Ga nanoparticle consumption. In collaboration with dr Jakob B. Wagner (DTU CEN, Copenhagen, Denmark), dott. mag. Damiano Cassese and the research group of dr. Marco Lazzarino (IOM CNR, Trieste, Italy), we discovered that a 100 hours long nanowire annealing step under As flux is capable of transforming the wurtzite structure of Au assisted GaAs nanowires in zincblende. This was carried out by means of transmission electron microscopy and was double checked by means of Raman spectroscopy. We studied the growth of GaAs nanowires in absence of growth assisting droplet. In collaboration with dott. Giacomo Priante (IOM CNR, Trieste, Italy) and prof. Vladimir G. Dubrovskii (SPBAU, Saint Petersburg, Russia), we found that after the total consumption of the Ga nanoparticle, GaAs nanowires can resume the Ga assisted growth. Other minor projects such as, the MBE growth of self catalyzed Si nanowires on epiready GaAs, the TEM study of catalyst-embedded carbon nanotubes bundles, TEM study of the nanowire shell overgrowth, optical limiting effect of hybrid systems were pursued. This information, not fitting in the thesis logic, along with systematics of the Ga assisted GaAs nanowire growth are placed in the appendixes. When being assigned beam time at the ELETTRA Synchrotron facility in Trieste, my work has mainly been the synthesis of Si-doped GaAs NWs on our innovative substrates. Nanowires were then studied in spatially resolved X-ray photoemission spectroscopy experiments on the ESCAMICROSCOPY beamline, performed in collaboration with dr. Mattia Fanetti and the ESCAMICROSCOPY staff. The first measurement set showed that Ga assisted nanowires exhibit a much weaker conductivity than their Au catalyzed counterparts, for the same two- dimensional nominal doping. The second set of experiments gave details about the incorporation of Si in nanowires during the growth, by the detection of the Fermi level in the energy gap. We realised that by tuning the As/Ga flux ratio without need of changing the growth temperature (i.e., shifting from vapor-liquid-solid to vapor- solid regime) and for the same impurity flux, core-shell p-n junctions could be synthesized, with a high uniformity grade along the whole nanowire length.
XXV Ciclo
1982

2010/2011
Cantilever sensors have been the subject of growing attention in the last decades and their use as mass detectors proved with attogram sensitivity. The rush towards the detection of mass of few molecules pushed the development of more sensitive devices, which have been pursued mainly through downscaling of the cantilever-based devices. In the field of mass sensing, the performance of microcantilever sensors could be increased by using an array of mechanically coupled micro cantilevers of identical size. In this thesis, we propose three mechanically coupled identical cantilevers, having three localized frequency modes with well-defined symmetry. We measure the oscillation amplitudes of all three cantilevers. We use finite element analysis to investigate the coupling effect on the performance of the system, in particular its mass response. We fabricated prototype micron-sized devices, showing that the mass sensitivity of a triple coupled cantilever (TCC) system is comparable to that of a single resonator. Coupled cantilevers offer several advantages over single cantilevers, including less stringent vacuum requirements for operation, mass localization, insensitivity to surface stress and to distributed a-specific adsorption. We measure the known masses of silica beads of 1µm and 4µm in diameter using TCC. As it is difficult to obtain one single bead at the free end of the cantilevers, we choose to use the Focused Ion Beam. By sequential removing mass from one cantilever in precise sequence, we proved that TCC is also unaffected from a-specific adsorption as is, on the contrary, the case of single resonator. Finally, we proposed shown the use of TCC can be as micromechanical transistor device. We implemented an actuation strategy based on dielectric gradient force which enabled a separate actuation and control of oscillation amplitude, thus realizing a gating effect suitable to be applied for logic operation.
XXIV Ciclo
1980

2011/2012
In this study, the main objective is to analyze the effect of genetic variations (polymorphisms) on clinical outcome of colorectal cancer patients treated with oxaliplatin (FOLFOX4 regimen) and those with prostate cancer treated with radiotherapy, with the aim to identify those pharmacogenetic parameters able to provide an indication of a possible "personalization" of therapy. Nanomedicine is the application of nanotechnology in biomedical field to the prevention and treatment of diseases in the human body. Pharmacological research in oncology is aimed at the discovery of new antitumor molecules and especially to improve the use of drugs already present in therapy. In fact, the response to a chemotherapeutic agent is highly variable both in terms of efficacy and tolerability and this may be due both to differences between individuals and molecular characteristics of the tumor. Pharmacogenetics, along with radiogenetics, are concerned to investigate how the genetic characteristics of each individual can influence the therapeutic effect of the drug or radiation and susceptibility to side effects. In particular, they focus on how the constitutive alterations of genetic asset of each individual, so-called polymorphisms, can affect transport, metabolism or the interaction with the target of a drug or treatment. In this study I have investigated the role of genetic polymorphisms, previously identified in the metastatic disease, as predictive markers of neurotoxicity, hematological and non-hematological toxicities from oxaliplatin in colorectal cancer patients treated with adjuvant FOLFOX4 regimen; and I have also identified radiogenetic markers of response in terms of risk of biochemical PSA recurrence and overall survival in prostate cancer patients. In conclusion, the work of this thesis allowed defining new molecular markers that may have prognostic value in the treatment of colorectal cancer with FOLFOX4 regimen and in prostate cancer with radiotherapy. The application of these biomarkers in clinical practice may be useful for designing a personalization of treatment based on specific genetic characteristics of the patients with colorectal cancer and prostate cancer.
XXIV Ciclo
1983

2009/2010
Tissue engineering in the orthopedic field is mainly focused on the development and design of material to serve as a temporary extracellular matrix or scaffold to overcame the limitation of actual treatments. In fact, current treatments are based on autologous or autogenous bone grafts and as an alternative to these, metals and ceramics. The limitation of this kind of implants is related to shortage of autograft that can be obtained and to donor site morbidity; the possibility of immune rejection and of pathogen transmission from donor to host in the case of allograft; the poor overall integration with the tissue at the implantation site for the metal and ceramic. The aim of study is the development of bio-composite scaffolds for orthopedic applications, based on the combination of polysaccharides (mainly alginate, Alg) engineered with bioactive molecules and nano-hydroxyapatite (nHap). The first step was the synthesis and characterization of the different components of the scaffold. The nHap was synthesized with sol-gel method and the obtained crystals have been chemically and morphologically characterized by mean of Raman spectroscopy, X-Ray Diffraction and Transmission Electron Microscopy. All the collected results confirm the chemical composition of nHap and information about the average dimension of crystals (120nm). The synthesized nHap was used to produce composite hydrogels of Alg and nHap. The porous structure was achieved through freeze-casting. The obtained scaffold was characterized with µCT (µComputed tomography) and confocal microscopy; the histomorphometric data were compared with the parameters of native tissue with an high level of similarity between trabecular bone and scaffolds structure. Subsequently, the scaffolds have been investigated for their cytocompatibility and the results shows high rate of proliferation of cells seeded into the scaffold. The modification with specific proteins or peptides of the backbone of a polymer can be an effective strategy to tailor and control cell attachment, migration, proliferation and differentiation. Incorporation of peptide motifs containing sequences that are recognized by integrin receptors, such as arginine-glycine-aspartic acid (RGD)-based sequences, are now a common strategy to enhance the biological properties as well as differentiation and proliferation of a variety of cells, including osteoblasts. Along the same line, reducing bacterial adhesion is important since microorganism surface attachment is the first critical step in the development of implant-associated infections. To introduce bioactive molecules and antimicrobial agents, enhancing in this way the biological property of the scaffolds, Chitlac was exploited as vector. Chitlac is a lactitolated-derivative of chitosan that can be modified by chemical grafting of bioactive peptides like RGD and that can be use to produce and stabilize silver nanoparticles (nAg) with antimicrobial activity. By adsorbing the Chitlac on the scaffold’s surface we spread the bio-signal inside the structure to induce a specific cell reaction. Alg/nHap scaffolds were coated with Chitlac-RGD and Chitlac-nAg, respectively, and on those, biological and antimicrobial in vivo tests were performed. For both scaffolds we observed good cytocompatibility and, in the case of scaffold with RGD, an improved cell proliferation; moreover, the scaffold with nAg showed a high level of antimicrobial activity. According the results obtained from the previous cytocompatibility tests, preliminary cytocompatibility in vivo tests were performed. The animal model was New Zealand rabbit and the produced scaffolds were inserted into bone defects on femur. Post-operatively, three fluorochromes were administered sequentially every week. After 5 weeks the rabbits were sacrificed and all the implanted bones were analyzed using µ-CT and light and confocal microscopy. We observed a high level of osteointegration of the scaffolds and ingrowth of newly deposited structured lamellar bone inside them, indicating good osteoconductive properties. In conclusion, the developed scaffolds have suitable biological properties both bioactive and antimicrobial. The in vitro results shows a high level of cytocompatibility for all the scaffolds studied and that the presence of Chitlac-nAg does not compromise the compatibility of scaffolds. In the case of scaffolds modified with RGD the results confirm that the presence of bioactive molecule is able to enhance the healing process also with respect to the BAG (BioActive Glass) control. The findings of the present study revealed that the structures here developed could serve as promising filler for orthopedic application.
XXIII Ciclo
1983

2010/2011
In this work I present a novel approach to the use of biomolecules as constructive material for an autonomous DNA-based platform on which is possible to do sensing consequently actuating the object after the transduction of an environmental signal. The new approach is based on a DNA origami obtained by folding a long polynucleotide with hundreds of shorter oligonucleotides and resulting in a well defined and ordered disks of a diameter of about 100nm. Each disk is composed of two main parts, an external ring and an internal disk, connected each other in only two diametrically opposite points. A linear single stranded DNA molecule, the probe, is inserted on the upper face of the internal moving disk, perpendicularly to the connections and to the axis of constrain; as far as the probe remains single stranded, the DNA-object appears planar, but when it gets in contact with its complementary ssDNA called “target”, forming a double stranded DNA, it opens the origami’s structure. The realization of such autonomous organic structure is preliminary to its application in many contests. The actuation principle was first applied for the development of a revertable biosensing platform, where the addition of a third single stranded molecule, displaces the target from the probe restoring the initial state of the origami. The same principle was also improved with real samples such as viral RNAs. In this thesis, I report the setting up of the single components of the device: complex DNA based objects, the switching mechanism, the validation with real samples and the possible applications of the whole system.
XXIV Ciclo
1982

2010/2011
Abstract (Italian version) Questo progetto di dottorato di ricerca è finalizzato allo studio dell'applicazione nella pratica clinica attuale della medicina di comunità, di tests farmacogenetici utili sia per la determinazione di polimorfismi noti per influenzare la dose iniziale di warfarin nella terapia anticoagulante orale, sia per l’analisi dei polimorfismi associati alla risposta di farmaci antidepressivi. Gli studi si sono perciò svolti in collaborazione con la medicina territoriale, al fuori dei centri di eccellenza e le rigorose condizioni in cui di solito vengono eseguiti i trials. In quest’ottica, i risultati finora ottenuti, in accordo con la letteratura corrente, supportano l'impiego dell’analisi dei polimorfismi per la determinazione della corretta dose iniziale di warfarin. Inoltre, il polimorfismo del trasportatore della serotonina (5-HTTLPR) è stato valutato in relazione alla risposta ai farmaci antidepressivi appartenenti alla classe degli inibitori selettivi della ricaptazione della serotonina (SSRI), e anche nella medicina di comunità, sia in pazienti oncologici che psichiatrici, l’analisi di 5-HTTLPR sembra essere uno strumento utile per predire l’esito della risposta al trattamento con SSRI. Infine, con lo sviluppo di nuove tecnologie, i costi per l'analisi genetica sono diminuiti,e possono essere considerati limitati soprattutto in relazione ai vantaggi raggiunti con il loro impiego. In ogni caso, il rapporto costo-efficacia dei test farmacogenetici potrebbe essere migliorato con lo sviluppo di ulteriori devices che permettano un’analisi più veloce ed economica.
Abstract (English version) This PhD project is aimed to the study of the application, in the current clinical practice of the community medicine, of pharmacogenetic tests known to be associated with the prediction of warfarin dose at the initiation of the oral anticoagulant therapy and moreover, the test for the analysis of the polymorphism related to the response to the antidepressant drugs. The study was carried out in the community care, out of the centers of excellence and the strict conditions in which usually the trials are performed. From this perspective, the results obtained so far, according to the current literature, support the use of the analysis of polymorphisms in determining the correct dose of warfarin. Furthermore, polymorphism of the serotonin transporter (5-HTTLPR) has been assessed in relation to response to antidepressant drugs belonging to the class of Selective Serotonin Reuptake Inhibitors (SSRIs), and also in community medicine, both in oncological and psychiatric patients, the analysis of 5-HTTLPR seems to be a useful tool to predict the outcome of the response to treatment with SSRIs. Finally, since the development of new technologies, the costs for genetic analysis have been decreased, and may be considered limited, particularly in relation to the benefits achieved with their use. In any case, the cost-effectiveness of pharmacogenetic tests could be improved by the development of further devices that allow a faster and cheaper analysis.
XXIV Ciclo
1981

2011/2012
ABSTRACT This thesis deals with the control of light absorption in semiconductor devices by the plasmonic resonances of periodically arranged metallic nanostructures integrated on them. Metallic gratings support propagating (SPP) and localized (LSP) plasmonic excitations and surface plasmons-related phenomena, like Extraordinary Optical Transmission (EOT) and plasmonic band gaps, as well as conventional diffraction effects. We combine all the optical resonances outlined to tune the incoupling and distribution of incident photons in the absorbing semiconductor substrate. In particular we consider the application of these concepts to two typologies of optoelectronic devices: photovoltaic solar cells and phototransistors. In the case of photovoltaic devices the objective is to increase the energy conversion efficiency by enhancing light harvesting and re-shaping the absorption profile, in order to improve the collection of photo-generated charge carriers. We begin analyzing a case study, a one-dimensional lamellar grating placed on a silicon substrate, by numerical optical simulations. The aim is to find the coupling conditions of the resonances supported, by designing the geometric parameters of the nanostructures, and showing their impact on the generation profile. These findings are then applied for light trapping purpose to two realistic solar cell layouts. SPP and LSP resonances are able to provide high near field magnification and effectively enhance the absorption of ultrathin organic solar cells. On the other hand, EOT coupled to diffraction orders are more suited to wafer-based Si cells. Then we present the fabrication process developed to realize the designed nanostructures over the large surface area of Si photovoltaic devices. By experiments and simulation we show that an improvement of Internal Quantum Efficiency can be obtained compared to unpatterned devices. Concerning the phototransistors, the aim is use them as compact and scalable biosensors by integrating a plasmonic crystal on the active area. By simulations the grating is designed to maximize transmittance variation due the plasmon resonance shift related to the surface binding of bio-analyte molecules. This event is transduced into an electrical signal at device terminals, as confirmed by characterizations on the first prototypes fabricated. The metallic grating simultaneously works as plasmonic structure and as electronic gate of the transistor in a fully integrated architecture.
SOMMARIO In questa tesi viene trattata la tematica del controllo dell’assorbimento di luce in dispositivi a semiconduttore tramite le risonanze plasmoniche proprie di nanostrutture metalliche integrate con disposizione periodica. Reticoli metallici supportano eccitazioni plasmoniche propaganti (SPP) e localizzate (LSP) e fenomeni correlati ai plasmoni di superficie, quali la trasmissione ottica straordinaria (EOT) e la creazione band gap plasmoniche, così come effetti di diffrazione convenzionali. Tali risonanze ottiche sono state combinate per regolare l’accoppiamento e la distribuzione dei fotoni incidenti in substrati semiconduttori assorbenti. In particolare consideriamo l’applicazione di tali concetti a due tipologie di dispositivi optoelettronici: celle solari fotovoltaiche e foto-transistor. Nel caso dei dispositivi fotovoltaici, l’obiettivo è aumentare l’efficienza di conversione energetica tramite una maggiore raccolta di luce e la redistribuzione del profilo di assorbimento, in modo da migliorare la raccolta dei portatori di carica fotogenerati. L’analisi di un caso di studio, un reticolo lamellare monodimensionale posto su un substrato di silicio, tramite simulazioni ottiche per via numerica, serve a trovare le condizioni di accoppiamento delle risonanze supportate, dimensionando i parametri geometrici delle nanostrutture, e mostrare il loro impatto sul profilo di generazione. Questi risultati sono quindi applicati, per finalità di “light trapping”, a due strutture realistiche di celle solari. Le risonanze SPP e LSP sono capaci di fornire una grande intensificazione del campo vicino e aumentano efficacemente l’assorbimento di celle solari organiche ultra-sottili. D’altro canto, la combinazione di EOT e ordini di diffrazione è più adatta per celle solari spesse in Si. Quindi presentiamo il processo di fabbricazione sviluppato per realizzare le nanostrutture progettate sulle ampie superfici dei dispositivi fotovoltaici in Si. Esperimenti e simulazioni mostrano che è possibile ottenere un aumento dell’efficienza quantica interna rispetto ai dispositivi non nanostrutturati. Per quanto riguarda i foto-transistor, l’obiettivo è utilizzarli come biosensori compatti e scalabili tramite l’integrazione di cristalli plasmonici sull’area attiva. Il reticolo è stato progettato in modo da massimizzare variazioni di trasmittanza dovute alla modulazione delle risonanze plasmoniche indotta dal legame di bio-molecole sulla superficie. Questo evento è trasdotto in un segnale elettrico misurabile ai capi del dispositivo, come confermato dalle caratterizzazioni sui primi prototipi fabbricati. Il reticolo metallico funziona simultaneamente come struttura plasmonica e come gate elettronico del transistor in un’architettura totalmente integrata.
XXV Ciclo
1984

2012/2013
Le recenti scoperte sulla natura dei processi genetici, implicati nelle trasformazioni neoplastiche, ci hanno permesso di identificare le principali lesioni cellulari che portano alla formazione del tumore, individuando in questo modo target selettivi sulla base dei quali progettare nuovi agenti terapeutici efficaci. La terapia bersaglio ha rappresentato una rivoluzione permettendo di superare l’aspecificità del trattamento antitumorale e colpendo, nello specifico, la causa biomolecolare del processo patologico neoplastico. I recenti sviluppi della modellistica molecolare si sono resi indispensabili per la ricerca oncologica. Questi, infatti, aprono delle opportunità per la scoperta di nuovi farmaci attraverso la comprensione delle basi molecolari delle malattie; si tratta di un metodo conveniente per identificare dei composti che siano in grado di bloccare l’azione di molte proteine, suggerite come fattori fondamentali in diversi tipi di neoplasie. In questo lavoro di tesi verrà adoperata un’ampia gamma di tecniche di simulazione molecolare al fine di studiare differenti problemi che possono comparire durante il trattamento chemioterapico. La scoperta di nuovi dettagli nei meccanismi che conducono alla carcinogenesi ha permesso di identificare proteine target innovative e più precise per affrontare la terapia senza effetti collaterali per le cellule sane. In particolare, saranno riportati in dettaglio gli studi che coinvolgono tre nuovi differenti target: il recettore σ1, la proteina -catenina e lo sviluppo di dendrimeri per una terapia di silenziamento genico. Tuttavia, nonostante i successi clinici della terapia bersaglio, molti pazienti che inizialmente hanno risposto positivamente manifestano una recidiva, come risultato di una resistenza acquisita; questo tipo di risposta può manifestarsi dopo un periodo variabile di trattamento cronico. L’approccio delle tecniche in silico può essere utilizzato per predire l’avvento di mutazioni secondarie attivanti e al contempo resistenti alla terapia e quindi aiutare nello sviluppo di una strategia di prevenzione focalizzata su una terapia multi-farmaco. In questo lavoro, verranno discusse in particolare delle mutazioni che coinvolgono i recettori c-Kit e Smoothened, pre e post trattamento. L’ampia serie di esempi illustrati e discussi qui enfatizza il ruolo e le potenzialità del modeling molecolare nello sviluppo della terapia bersaglio anti tumorale. Una valutazione in silico permette di prendere in considerazione la specificità molecolare del problema e ridurre drasticamente i tempi e i costi richiesti per formulare nuovi farmaci e strategie di intervento.
XXVI Ciclo
1986

2011/2012
Carbon nanotechnology has evolved into a truly interdisciplinary field, bridging material science with medicine. Fullerenes (C60) play a major role in this field and are currently explored for biomedical applications such as radiopharmaceuticals and contrast agents, gene delivery and as carriers for chemotherapeutics. Five fullerene derivatives (F1, F2, F3, F4 and F5), functionalized by 1,3-dipolar cycloaddition of azomethine ylides to the C60 cage, were studied in vitro for their toxicity in a number of cell types and with different assays. Cell cytotoxicity on human mammary carcinoma cell line (MCF7), evaluated with the MTT and NRU tests and further confirmed by a flow cytometry approach with DiOC6 and PI probes, showed that derivative F2 was free of necrotic or apoptotic effects even after a long lasting cell exposure. F3 (differing from F2 for an additional positive charge obtained by quaternarization of the pyrrolidinic nitrogen by introducing a methyl group) was more toxic compared to the other compounds in all cellular models employed (HCT116, MCF7, MCF7/ADR, HT-29, H460, B16F10 and MDAMB231). Its IC50 is 20 µM after 72 hr of incubation by MTT test, and cell accumulation in the G1 phase and arrest in G0 phase (30%) was also observed. The mechanism of cellular uptake (studied with a fluorescein-bearing derivative of F2, hereafter called derivative F2-FITC), and the intracellular distribution were analyzed on MCF7 cell line. The studies of F2 biological effects have shown that this compound is able to enter the treated cells, probably by passive diffusion, to distribute within the cell cytoplasm, without getting into the nucleoplasm or into organelles such as lysosomes and mitochondria; these processes were evaluated by flow cytometry and confirmed by confocal microscopy. Experiments were performed on a multidrug resistant human mammary carcinoma cell line MCF7/ADR, a sub-line resistant to Doxorubicin because of the overexpression of the P-glycoprotein (P-gp) extrusion pump. The choice of these cells was based on our objective to conjugate the anticancer drug Doxorubicin to the fullerene vector in order to overcome adriamycin resistance. The F2 cellular uptake on MCF7/ADR and its maintenance of a constant concentration into cells seem to be insensitive to the presence of P-gp over-expression. These data suggest the possibility for derivative F2 to be used as carrier for anticancer drugs. The experiments on conjugated F2-DOX were made above all to verify if the activity of the drug linked to the fullerene remained the same as the free drug. Furthermore we studied the cellular uptake of F2-DOX in both MCF7 and MCF/ADR lines. Cytotoxicity tests have shown that F2-DOX has an irrelevant activity compared to free drug because Doxorubicin cannot get into the nucleus to perform its activity as it remains linked to F2. Nevertheless, the internalization of F2-DOX is higher in MCF7/ADR compared to the free drug. Fluorescent microscopy technique suggested that the F2-DOX inactivity might be associated with the stability of the bond between the carrier and the drug, which is not released and so is localized in the cytosol, as we have also observed for F2. Since many studies showed contradictory results and the molecular and cellular mechanisms of the cytotoxicity of this class of nanomaterials are not yet fully understood we performed a whole genome expression analysis, by high throughput RNA sequencing, using Illumina technologies. All together, the RNA-seq expression data confirmed the experimental evidence collected with previous in vitro studies showing that F3 is definitely the derivative causing more alterations on MCF7 cells on both the molecular and the cellular levels. However, also F2 is capable of affecting the same molecular pathways, although to a much lower intensity, since neither cytotoxic effects nor cell cycle arrest could be documented. The most important, and somewhat unexpected, result of our analysis was certainly the lack of molecular evidence concerning the activation of the main cellular pathways leading to cell death and often linked to fullerene toxicity in literature. In fact apoptosis, autophagy and ROS damage does not seem to be included among the most relevant molecular effects of F3, which on the contrary are mainly linked to the arrest of the transcription and protein synthesis machineries, leading to the entry in the G0 cell cycle phase. The RNA-seq analysis was able to identify several additional effects of fullerenes which had not been previously described, offering a complete overview of the gene expression alterations induced by these compounds on a whole-transcriptome level. Therefore the combination of large scale molecular analysis and the main viability assays might represent a valuable tool for a better understanding of the toxicity of fullerenes and other nanomaterials.
L’impiego di nanostrutture di carbonio, come i fullereni, in campo biomedico è di forte interesse, sia per le sue possibili applicazioni terapeutiche che diagnostiche. Un potenziale vantaggio di questi composti è la possibilità di essere strutturati per essere facilmente internalizzati dalle cellule e grazie alla loro ampia area superficiale e volume interno possono agire come sistemi di drug delivery per il trasporto di farmaci. Cinque fullereni funzionalizzati (F1, F2, F3, F4 e F5) sono stati studiati in vitro per la loro tossicità in un certo numero di linee cellulari e con dosaggi e tempi di incubazione diversi con l’obiettivo di valutare se gli effetti tossici o meno di questi composti possano variare a seconda dalla linea cellulare utilizzata. I modelli di studio utilizzati sono linee cellulari neoplastiche di carcinoma mammario umano (MCF7, MCF7/ADR e MDAMB231), di adenocarcinoma umano di colon (HT-29 e HCT116), di adenocarcinoma polmonare umano non a piccole cellule (H460) e di melanoma murino (B16F10). Gli studi di citotossicità hanno permesso di individuare un fullerene che presenta una limitata tossicità (F2) con il quale sono state eseguite prove citofluorimetriche sulla linea MCF7 che hanno dimostrato come sia in grado di attraversare le membrane plasmatiche e di accumularsi nelle cellule già dopo un’ora, aumentando in quantità fino a 12 ore. L’analisi è stata condotta fino alle 72 ore, tempo in cui il valore di fluorescenza del fullerene sembra rimanere stabile. Mediante microscopia a fluorescenza, sono stati condotti studi di distribuzione sub-cellulare, dai quali è emerso che F2 non colocalizza né a livello mitocondriale nè lisosomiale; quest’ultima evidenza lo renderebbe un vettore stabile per farmaci acido-labili. Inoltre, la mancata internalizzazione del fullerene a livello nucleare escluderebbe la possibilità di un danno diretto a carico del materiale genetico. In parallelo sono stati condotti i primi esperimenti sul coniugato F2-DOX ma le prove di citotossicità hanno indicato che il coniugato, nella linea MCF7 ed MCF7/ADR, ha attività irrilevante rispetto alla Doxorubicina libera. Tuttavia risulta che la Doxorubicina trasportata da F2 viene internalizzata maggiormente nella linea MCF7/ADR rispetto alla linea MCF7, contrariamente a quanto avviene con il farmaco libero. È possibile quindi affermare che F2 si potrebbe dimostrare un valido vettore per eludere il problema della multidrug resistence nei confronti di farmaci antitumorali causata dall’attività estrusiva della pompa P-gp. L’ostacolo da superare rimane quindi la scelta del farmaco da coniugare visto che questo ipotetico vettore non entra nel nucleo (e che quindi la Doxorubicina e altri antitumorali ad azione nucleare non potrebbero svolgere le proprie funzioni) nelle linee studiate. In alternativa si potrebbe pensare di legare il farmaco al fullerene attraverso un legame più debole in modo da facilitarne il rilascio citosolico. Dal momento che molti studi di tossicità hanno mostrato risultati contraddittori ed i meccanismi molecolari di questa classe di nanomateriali non sono ancora pienamente compresi abbiamo effettuato un’analisi dell’intero trascrittoma sfruttando la tecnologia Illumina. I dati ottenuti mediante l’utilizzo di questa tecnica di next generation sequencing (RNA-Seq) hanno confermato l'evidenza sperimentale raccolta con i precedenti studi in vitro dimostrando che F3 è sicuramente il derivato che causa più alterazioni sulle MCF7, sia a livello molecolare che cellulare. Tuttavia è stato osservato che F2 è in grado di pregiudicare le stesse vie molecolari, anche se con un'intensità molto più bassa. Il risultato più importante, e inaspettato, emerso dalle nostre analisi è stato certamente la mancanza di prove molecolari riguardanti l'attivazione delle vie principali che portano alla morte cellulare e spesso legati alla tossicità fullerene, come descritto in letteratura. Apoptosi, autofagia o stress da produzione di ROS non sembrano essere inclusi tra gli effetti molecolari più rilevanti di F3, che al contrario sono principalmente legati all'arresto della trascrizione e alla sintesi proteica, fenomeni che conducono all’arresto della divisione e all'entrata in fase G0. L'analisi di RNA-seq è stata in grado di identificare diversi effetti addizionali dei fullereni che non erano state precedentemente descritti, offrendo una panoramica completa delle alterazioni di espressione genica indotte da questi composti sull’intero trascrittoma. Quindi la combinazione di analisi molecolari su larga scala e saggi di vitalità potrebbe rappresentare un valido strumento per una migliore comprensione della tossicità dei fullereni ed altri nanomateriali.
XXV Ciclo
1984

2012/2013
Materiali e rivestimenti nanostrutturati possono potenzialmente apportare significativi cambiante nel campo della nanoscienze, nonché offrire una nuova generazione di materiali con caratteristiche e performance migliori. A questo proposito le tecniche computazionali diventano uno strumento fondamentale, in grado di ridurre notevolmente i tempi che vanno dall’idea iniziale al prodotto finito. La simulazione molecolare permette infatti la previsione delle proprietà macroscopiche prima che i materiali vengano preparati e caratterizzati sperimentalmente; consente inoltre una migliore comprensione dei fenomeni fisici su scala nanometrica. In questo lavoro di tesi sono presentati alcuni casi studio in cui vengono proposte diverse procedure computazionali per affrontare importanti aspetti come la bagnabilità della superficie, l’effetto della dimensione e della forma delle nanoparticelle e i loro meccanismi di aggregazione/dispersione. In questo contesto, si è dimostrata la vasta applicabilità della modellazione molecolare evidenziando quindi come questa rappresenti un potente strumento per comprendere e controllare le proprietà finali di materiali nanostrutturati, aprendo così la strada ad una progettazione in silico di nuovi materiali.
Nanostructured materials and coatings have the potential to change materials science significantly, as well as to provide a new generation of materials with a quantum improvement in properties. In this regard computational materials science becomes a powerful tool. It is able to rapidly reduce the time from concept to end product. Molecular simulation enables the prediction of properties of these new materials before preparation, processing, and experimental characterization, as well as a better understanding of the physical phenomena at the nanoscale level. In this thesis we present several study cases in which we propose different computational recipes to deal with different important topics such as surface wettability, effect of nanoparticles size and shape and nanoparticles aggregation/dispersion. In this context, we demonstrate the broad applicability of the molecular modelling and we ascertain that molecular simulation represent a powerful tool to understand and control the nanomaterials properties thus opening avenues for the in silico design of new materials.
XXVI Ciclo
1985

2013/2014
Gene therapy is increasingly critical in the treatment of different types of maladies. The approach of gene therapy can be fundamental in dealing with many kinds of tumors, viral infections (e.g., HIV, HSV), and disturbs linked to genetic anomalies. However, the use of nucleic acids is limited by their ability to reach their action site—the target cell and, often, the inside of its nucleus. Dendrimers, on the other hand, are an interesting kind of polymers, the general synthetic scheme of which is relatively of recent development (∼1980). Among the many possible uses of these polymers, they revealed themselves as great nanocarriers for drugs in general, and particularly for genetic material. Many of the properties of these molecules are directly linked to their structure, and this in turn is critically influenced by their molecular composition. Exploiting in silico techniques, we can reveal many informations about the atomistic structure of dendrimers, some of which are otherwise difficult to gather. The interactions between the carrier and its cargo, and also with all the biological systems that are interposed between the administration and the reaching of the target (e.g., serum proteins, lipid membranes. . . ) are of critical importance in the development of new dendrimers for gene therapy. These interactions can be described and studied at a detail once unthinkable, thanks to the in silico simulation of these systems. In this thesis many different molecular simulation techniques will be employed to give a characterization as precise as possible of the structure and interactions of new families of dendrimers. In particular two new families of dendrimers (viologen and carbosilane) will be structurally characterized, and their interactions with albumin and two oligodeoxynucleotide, respectively, will be described. Then, the point of view of these interactions will be changed: the interactions between a fifth generation triethanolamine-core poly(amidoamine) dendrimer (G5 TEA-core PAMAM) and a sticky siRNA will be studied, varying the length and chemical compositions of the overhangs of the siRNA. Studying dendrimers the use of new molecular simulations techniques were deepened, and such techniques will be employed in other parallel projects. We’ll see the steered molecular dynamic method applied in the study of one mutation of the SMO receptor. The development of biological membranes models (that will be used in future to study the interactions of dendrimers with such membranes) was also used to refine and better characterize the σ1 receptor 3D model, previously developed by our research group. A detailed characterization of the putative binding site of this receptor will be given, employing this refined model.
La terapia genica si sta rivelando sempre più importante nel trattamento di diversi tipi di malattie. Da diversi tipi di tumori alle infezioni virali, quale ad esempio da HIV, fino anche a malattie legate ad anomalie genetiche sono tutti disturbi in cui l’approccio della terapia genica può rivelarsi fondamentale. L’utilizzo di acidi nucleici quali agenti terapeutici è fortemente limitato dalla possibilità di portare queste molecole al loro sito d’azione—la cellula bersaglio e, spesso, l’interno del nucleo di quest’ultima. I dendrimeri d’altro canto sono un interessante tipo di polimero, di cui lo schema generale di sintesi è relativamente recente (∼1980). Tra i diversi loro utilizzi, questi polimeri si sono rivelati anche ottimi agenti di trasporto per farmaci, ed in particolare per materiale genetico. Molte delle proprietà di queste molecole derivano direttamente dalla loro struttura, e questa è influenzata criticamente dalla loro composizione. Mediante tecniche in silico è possibile avere molte informazioni riguardo la struttura dei dendrimeri, alcune delle quali sono altrimenti difficilmente ottenibili. L’interazione tra il trasportatore ed il suo “carico”, come anche con tutti i diversi sistemi biologici che si frappongono tra la somministrazione ed il raggiungimento dell’obbiettivo (ad es. proteine seriche, membrane lipidiche...) è un parametro chiave nello sviluppo di nuovi dendrimeri per la terapia genica. Queste interazioni possono essere descritte e studiate con un dettaglio un tempo impossibile, mediante la simulazione in silico di tali sistemi. In questo lavoro di tesi diverse tecniche di simulazione molecolare saranno utilizzate al fine di dare una caratterizzazione quanto più precisa possibile della struttura e delle intera- zioni di nuove classi di dendrimeri. In particolare sarà data una descrizione strutturale di due nuove famiglie di dendrimeri viologeni e carbosilani, e delle loro interazioni rispettivamente con albumina e due diversi oligodeossinucleotidi. Si alternerà poi il punto di vista da cui studiare tale interazione: sarà data una descrizione dell’interazione tra un dendrimero po- liammidoamminico a nucleo trietanolamminico (TEA-core PAMAM) di generazione 5 e uno sticky siRNA, al variare della lunghezza e tipo di “braccia” del siRNA. Nello studio di dendrimeri alcune nuove tecniche di simulazione molecolare sono state approfondite, e tali tecniche sono state utilizzate anche in altri progetti paralleli. Vedremo la steered molecular dynamic applicata allo studio di una mutazione del recettore SMO. Lo sviluppo di modelli di membrane biologiche (utile in futuro per lo studio dell’interazione di dendrimeri con tali membrane) è stato utilizzato per perfezionare e meglio caratterizzare il modello tridimensionale del recettore σ1, precedentemente sviluppato dal nostro gruppo di ricerca. Una caratterizzazione dettagliata del sito di binding putativo di questo recettore sarà descritta, usando tale perfezionato modello.
XXVII Ciclo
1987

2013/2014
This thesis is devoted to the study of the growth of Zinc Selenide (ZnSe) nanowires (NWs) by Au-assisted molecular beam epitaxy (MBE). The growth process consists in many steps which were individually investigated by means of in-situ and ex-situ spectroscopic and microscopic techniques. First, the formation of nanoparticles upon annealing of a thin Au film deposited on different substrates was studied by X-ray photoemission spectroscopy, grazing incident X-ray diffraction and scanning electron microscopy. The nanoparticles were used as seeds for the 1-dimensional ZnSe crystal growth by MBE through evaporation of Zn and Se from elemental solid sources. The obtained NWs were characterized by scanning and transmission electron microscopy and their optical properties were assessed by means of photoluminescence and cathodoluminescence measurements. This systematic investigation approach allowed us to understand the NWs growth mechanism and, as a consequence, to obtain the control over the NWs properties. Indeed, it was found that an interplay between substrate, seed particles and beam fluxes takes place and strongly affects the NWs growth mode. In particular, a chemical interaction between substrate and Au may occur during the annealing, changing chemical composition and physical state of the nanoparticles before the NWs growth. The vapour composition, i.e. the Zn-to-Se beam pressure ratio, can also modify the nanoparticles composition and the NWs growth mechanism. Therefore, by changing the growth conditions, it was possible to grow ZnSe NWs through different mechanisms, with important consequences on their properties, in terms of morphology, crystal quality and optical properties. Understanding the growth mechanism and its effects on the wires properties allowed us to achieve the control over the growth process and the selective growth of ZnSe nanowires with the desired properties. Vertically oriented ZnSe NWs with a defect-free hexagonal crystal structure were obtained on GaAs(111)B substrates, having either Au-Ga alloy nanoparticles or Au nanocrystals on their tips. Uniformly thin and straight blue-emitting ZnSe NWs were also grown on various substrates, after optimizing gold film thickness, annealing and growth temperature. The possible integration of such nanostructores in novel nanodevices was proposed and preliminary demonstrated.
XXVII Ciclo
1986

2013/2014
Resin-based composites (RBCs) are the most widespread restorative dental materials used nowadays. Nanotechnologies allowed the development and improvement of a new generation of RBCs which nevertheless still present many unsolved issues. The most important is secondary caries, which is the recurrence of dental caries in tissues close to the restoration. Dental caries disease is driven by a dysbiotic biofilm colonizing both natural and artificial surfaces. Many approaches have been developed in order to address this issue, mainly the development of bioactive surfaces with contact-active properties, the optimization of surfaces to obtain anti-adhesive properties and the synthesis of biomimetic materials. The aim of this PhD thesis was to explore the use of nanotechnologies in order to synthesize, evaluate and optimize the formulation of RBCs aimed at successfully controlling oral biofilms development. The experimental part explored all three previously mentioned approaches. Regarding the first approach, a lactose-modified Chitosan carrier for silver nanoparticles (nAg) was developed and used as a coating for RBCs in order to study the antibacterial behavior of a novel material possessing contact-killing properties. The results indicated an antibacterial activity of the coating related to nAg concentration, however rinsing procedures interfered with the coating and deprived nAg of their effect. The surface activation of RBC surfaces prior to coating application showed itself good antibacterial properties that are currently under examination. Considering the second approach, experimental resin-based dental materials differing in their compositions were extensively studied, hypothesizing that biofilm formation on the experimental materials may show a dependency on their surface characteristics and nanotexture. In this sense, the anti-adhesive properties of these materials were evaluated as a possible effective way to control biofilm formation without the need for biocidal agents. The results showed that both hydrophobicity of the resin matrix of RBCs and filler content can influence oral biofilm formation. The lowest values of cariogenic biofilm were reached by less hydrophobic resin and by nanofillers. The third approach evaluated the possibility that biomimetic materials (designed to positively interact with dental hard tissues) may have to control oral biofilms, without the need for specifically biocidal agents. Resin-functionalized nanoparticles of dicalcium phosphate dihydrate (nDCPD) were incorporated into an experimental RBC. Results showed that the RBC filled with functionalized nDCPD showed reduced biofilm formation when compared to a RBC filled with non-functionalized nDCPD. In conclusion, all these three approaches proved to significantly impact oral biofilm formation on RBCs surfaces, however the most interesting result suggests the possibility of influencing biofilm formation without necessarily adding biocidal compounds. In fact, recent studies regarding the human microbiome show that many diseases, including dental caries, are caused by an imbalance between host and biofilms. These diseases may be restored by modifying biofilms composition, without attempting to eradicate biofilms.
I materiali compositi a base resinosa sono i materiali maggiormente utilizzati in Odontoiatria Restaurativa. Le nanotecnologie hanno permesso lo sviluppo e l’ottimizzazione di una nuova generazione di compositi che tuttavia presentano tuttora problematiche ancora irrisolte. La più importante è lo sviluppo della carie secondaria, cioè il ripresentarsi della carie dentale nei tessuti vicino al restauro. Tale lesione è promossa da un biofilm disbiotico aderente sia alle superfici naturali che a quelle artificiali. Molte alternative sono state proposte al fine di risolvere il problema, in particolare lo sviluppo di superfici bioattive caratterizzate da inibizione da contatto, l'ottimizzazione delle superfici per ottenere proprietà anti-adesive e la sintesi di materiali biomimetici. L'obiettivo di questa tesi di dottorato è stato utilizzare le nanotecnologie al fine di sintetizzare, valutare e ottimizzare la formulazione di compositi in grado di modulare lo sviluppo del biofilm orale. La parte sperimentale ha compreso l’analisi di tutti e tre gli approcci precedentemente citati. Per quanto riguarda il primo approccio è stato sviluppato un rivestimento per compositi a base di chitosano modificato con lattosio e incorporante nanoparticelle di argento (nAg), in modo da studiare il comportamento antibatterico per inibizione da contatto. I risultati hanno indicato una significativa attività antibatterica del rivestimento che aumentava all’aumentare della concentrazione di nAg. Tuttavia le procedure di risciacquo impiegate per simulare l’ambiente intra-orale hanno interferito con il rivestimento e le nAg privandoli dell’effetto antibatterico. Sorprendentemente, l'attivazione delle superfici di composito prima dell'applicazione del rivestimento ha dimostrato di conferire proprietà antibatteriche alle superfici stesse, e tale possibilità è attualmente oggetto di ulteriori studi. Considerando il secondo approccio sperimentale sono stati testati compositi sperimentali con differenti composizioni ipotizzando che la formazione di biofilm su tali materiali possa dipendere dalle loro caratteristiche di superficie e di nanotexture. In questo senso, le proprietà antiadesive di tali compositi sono state valutate quale un possibile modo per garantire un controllo efficace della formazione di biofilm senza la necessità di incorporazione di molecole antimicrobiche. I risultati hanno dimostrato che sia l’idrofobicità della matrice resinosa che il fipo di riempitivo inorganico possono influenzare la formazione del biofilm. I valori più bassi di sviluppo di biofilm cariogeno sono stati raggiunti dalla resina con minore idrofobicità e dai nanofiller. Il terzo approccio ha valutato la possibilità di modulare lo sviluppo di biofilm orale sulle superfici di materiali biomimetici, cioè progettati per interagire positivamente con i tessuti duri del cavo orale, senza l’aggiunta di molecole ad azione antimicrobica. Nanoparticelle di fosfato bicalcico biidrato (nDCPD) funzionalizzate con monomeri di resina sono stati incorporati in un composito sperimentale. I risultati hanno dimostrato che il composito riempito con nDCPD funzionalizzate mostravano una ridotta formazione di biofilm rispetto a un composito con nDCPD non funzionalizzate. In conclusione, tutti e tre gli approcci testati hanno dimostrato di avere un impatto significativo sulla formazione di biofilm orale sulle superfici dei compositi. Nonostante ciò, il risultato più interessante è stato la possibilità di influenzare la formazione di biofilm senza necessariamente aggiungere composti ad azione antimicrobica. Infatti, recenti studi riguardanti il microbioma umano mostrano che la carie dentaria così come molte altre malattie è causata da uno squilibrio tra i biofilm e l’ospite. Lo stato di saluto può essere quindi ripristinato riuscendo a interagire positivamente con i biofilm modificandone la composizione, senza tentare di debellarli.
XXVII Ciclo
1984

2008/2009
Computational materials science based on multiscale approach is very promising in the domain of nanoscience. It gives the modeler a route from the atomistic description of the system to a trust-worthy estimate of the properties of a material, obtained from the underlying molecules in a quantifiable manner. In this thesis we discuss general guidelines for its implementation in the field of nanomaterials and propose an alternative pathway to link effectively atomistic to mesoscopic scale and this, in turn, to the macroscopic scale. As proofs of concept for the reliability of the proposed approach, we consider several systems of industrial interest, ranging from polymeric nanocomposite materials, to epoxy resins, block copolymers, and gels for biomedical applications. In this context, we ascertain that multiscale molecular modelling can play a crucial role in the design of new materials whose properties are influenced by the structure at nanoscale. The results suggest that the combination of simulations at multiple scales can unleash the power of modeling and yield important insights.
Le tecniche computazionali fondate su un approccio multiscala costituiscono uno strumento molto promettente nel campo della nanoscienza e dei nanomateriali. Esse forniscono al modellatore un percorso quantitativo che parte dalla descrizione atomistica fino alle proprietà finali del materiale. In questo lavoro di tesi sono discusse le linee guida per l’implementazione della modellistica multiscala nel settore dei nanomateriali ed è proposta una strategia alternativa alle soluzioni attualmente esistenti per collegare la scala atomistica alla mesoscala e, successivamente, la mesoscala alla scala macroscopica. Per dimostrare la validità del metodo proposto, sono stati presi in esame differenti sistemi di interesse industriale, i quali comprendono materiali nanocompositi polimerici, resine epossidiche, copolimeri a blocchi, e gel per applicazioni biomediche. In questo contesto, si è evidenziato come la modellistica multiscala possa svolgere un ruolo cruciale nella progettazione di nuovi materiali le cui proprietà sono influenzate dalla struttura a scala nanometrica. I risultati suggeriscono che la combinazione di simulazioni su scale multiple amplifica sinergicamente la potenza della modellazione e può fornire importanti intuizioni.
XXII Ciclo
1978

2008/2009
Questo lavoro riguarda lo sviluppo di materiali nanocompositi per applicazioni biomediche e si configura all’ interno del progetto europeo “Newbone” (EU-FP6); in particolare, lo scopo principale della tesi era realizzare un rivestimento biocompatibile e dotato di proprietà antibatteriche per protesi ortopediche. Sono stati preparati sistemi nanocompositi basati su un polisaccaride derivato dal chitosano (Chitlac) che permette di ottenere soluzioni colloidali di nanoparticelle (argento e oro) con proprietà antibatteriche. Parallelamente, è stato studiato un particolare meccanismo chimico di riduzione degli ioni argento ad opera dei residui di lattitolo del Chitlac; le proprietà ottiche delle nanoparticelle ottenute attraverso questo meccanismo sono state valutate attraverso spettroscopia Raman, evidenziando la possibilità di avere un incremento del segnale grazie al verificarsi dell’ effetto SERS. Essendo state riscontrate migliori proprietà biologiche del sistema a base di argento (Chitlac-nAg) rispetto a quello a base di oro in termini di efficacia antimicrobica e biocompatibilità, Chitlac-nAg è stato scelto per i successivi studi di realizzazione del rivestimento per la protesi. Test sul meccanismo antimicrobico della soluzione ChitlacnAg hanno dimostrato l’interazione tra le nanoparticelle e la membrana batterica. Allo stesso tempo, poiché la mancanza di barriere fisiche può favorire la diffusione delle nanoparticelle all’ interno delle cellule eucariote con rischio di effetti citotossici causati dalla loro internalizzazione, si è voluto realizzare delle strutture tridimensionali a base di Chitlac in grado di intrappolare le nanoparticelle. A questo scopo, sono state sfruttate le proprietà di gelificazione del polisaccaride alginato in modo da ottenere un sistema semi-solido in miscela con Chitlac-nAg; il materiale ottenuto possiede marcate proprietà antibatteriche senza però risultare tossico per le cellule eucariote, come dimostrato da test in vitro e in vivo. Questo risultato è particolarmente importante in relazione allo stato dell’ arte sull’ argomento. Poiché la parte portante della protesi è costituita da un polimero metacrilico, al fine di rivestire questo materiale di substrato è stata messa a punto una tecnica basata sull’ attivazione della superficie e successiva deposizione del rivestimento a base di Chitlac. Questa tecnica permette di ottenere un rivestimento nanocomposito costituito da nanoparticelle di argento incorporate nella matrice di Chitlac. Grazie a questo strato bioattivo la superficie della protesi acquisisce un’ efficace attività antibatterica che si manifesta quando i batteri entrano in diretto contatto con il materiale. Inoltre, test in vitro hanno dimostrato che le cellule eucariote aderiscono e proliferano sul rivestimento nanocomposito, suggerendo quindi una buona integrazione del materiale nei tessuti attorno all’ impianto. La combinazione di tali proprietà ha determinato la scelta di questo rivestimento per il test in vivo su “minipig” a conclusione del progetto europeo: questo test è al momento in via di svolgimento e da esso ci si può attendere una conferma degli incoraggianti risultati ottenuti dagli studi in vitro.
The present work is focused on the development of nanocomposite systems for biomedical applications and has been carried out in the framework of the European Project called “Newbone” (EU-FP6); in particular, the main goal of the thesis was to realize biocompatible coatings for orthopedic prosthesis endowed with antimicrobial properties. Nanocomposite systems based on a chitosan-derived polysaccharide (Chitlac) that stabilizes metal nanoparticles (silver and gold) have been prepared in colloidal solutions which possess broad spectrum antibacterial properties. As a complementary work, it was studied and defined a particular chemical mechanism of silver ions reduction carried out by the lactose moieties of Chitlac; the optical properties of the metallic nanoparticles obtained through this mechanism were tested by means of Raman spectroscopy, thus detecting considerable enhancements of the signal due to the SERS effect (Surface Enhanced Raman Scattering). Given the better biological properties of silver-based systems (Chitlac-nAg) with respect to gold in terms of antimicrobial efficacy and biocompatibility, only the former metal was chosen in the following steps towards the preparation of the nanocomposite coating for the prosthesis. Studies on the biocidal mechanism of the Chitlac-nAg solution ascribed the activity to the interaction metal-bacteria membrane. On the other hand, since the lack of physical barriers to nanoparticle diffusion into eukaryotic cells determines the risk of a massive uptake with cytotoxic outcomes, we focused our attention toward the preparation of Chitlac-based threedimensional structures entrapping silver nanoparticles. To this end, the gel forming properties of the polysaccharide alginate were exploited allowing the production of a semi-solid system in a mixture with Chitlac-nAg: this material displays potent antibacterial properties without showing cytotoxic effects towards eukaryotic cells, as verified by in vitro and in vivo tests. Such result was particularly important in relation to the state of the art in this research field. Since the core material of the prosthesis is made of methacrylic thermosets, in order to coat this substrate material we have devised a technique based on surface activation followed by deposition of the Chitlac-based layer. Such technique allows obtaining a nanocomposite coating where silver nanoparticles are entrapped within the Chitlac matrix. This bioactive layer endows the thermoset surface with considerable antimicrobial properties, as bacteria are rapidly killed upon direct contact with the material. At the same time, in vitro tests proved that eukaryotic cells adhere and proliferate on the nanocomposite coating, which indicates the possibility to have good integration of the material in the tissues surrounding the implant. The combination of these properties determined the choice of our coating for the final in vivo test in a minipig model as a conclusion of the European project; this test is in progress at the moment and it will hopefully confirm the encouraging studies in vitro.
XXII Ciclo
1981

2013/2014
Gli oscillatori micro e nanomeccanici stanno trovando crescente applicazione come biosensori, grazie alla loro elevata sensibilità, alla possibilità di effettuare analisi con un ridotto volume di campione biologico e senza molecole di marcatura secondarie e alla loro integrabilità come sensori in dispositivi di analisi portatili a basso costo. Questo progetto ha come scopo l’utilizzo di oscillatori micromeccanici a geometria verticale (micropillars) come sensori biomolecolari, rispetto ai più comuni oscillatori orizzontali (cantilevers). La struttura dei micropillars, infatti, permette di confinare l’adsorbimento molecolare alla parte superiore dell’oscillatore, consentendo una facile quantificazione della massa depositata attraverso la variazione della frequenza di risonanza; inoltre, i tempi di risposta del sensore risultano ridotti, grazie alla più veloce diffusione delle molecole verso l’area sensibile, rispetto ad altri sensori basati su effetti di superficie e di più grandi dimensioni. Dense matrici di micropillars idrofobici permettono anche la formazione dello stato superidrofobico di Cassie-Baxter, riducendo l’interazione del liquido alla sola parte superiore dell’oscillatore. Durante questo progetto è stato sviluppato un opportuno trattamento idrofobico delle matrici, basato sulla deposizione di un alcanosilano idrofobico, e caratterizzato rispetto alla bagnabilità della matrice e agli effetti sulla risposta meccanica e sulla risoluzione dell’oscillatore come sensore di massa. È stata inoltre verificata la compatibilità di questo trattamento con la formazione di uno strato di oro sulla parte superiore dell’oscillatore, usato come substrato per l’adsorbimento di biorecettori per il riconoscimento e la cattura della biomolecola di interesse. Il risultato di questa ottimizzazione è stato applicato alla rilevazione di un biomarcatore per il tumore alla prostata (PSMA) a concentrazioni utilizzate nella pratica clinica (nanomolari), sia in soluzione fisiologica che in plasma diluito. Infine, è stata dimostrata la misura della frequenza di risonanza dei micropillars a contatto con il liquido nello stato superidrofobico di Cassie-Baxter, come alternativa al problematico utilizzo dei cantilever completamente immersi in liquido, aprendo la strada alla rilevazione in tempo reale di biomolecole da campioni biologici.
Micro and nanomechanical resonators are playing a growing role in biosensing due to their high sensitivity, the possibility of label-free biomolecular detection with a reduced amount of biological sample and their potential integration as sensing tool on low cost, point of care devices. This project focuses on the application of arrays of micropillars resonators for biomolecular sensing, exploiting the advantages coming from the vertical geometry respect to the most common micro and nanocantilever horizontal sensors. Indeed, the biomolecular adsorption can be confined to the micron sized top area of pillars, allowing an easy quantification of the deposited mass and reducing the response time of the resonator due to the faster diffusion on the sensitive area respect to larger, surface based sensors. In addition, the superhydrophobic Cassie-Baxter state can be obtained on dense, hydrophobic micropillars arrays, limiting the interaction with the analyte solution to the top area of pillars. A proper hydrophobization treatment of the arrays, based on the deposition of a hydrophobic alkanosilane coating, has been developed and characterized in terms of wettability of the arrays and of the effects on the mechanical performance and on the mass resolution of the resonators. The compatibility of this treatment with the formation of stable gold layer on top of pillars as a substrate for bioreceptor adsorption has been also verified. The optimized micropillars arrays have been used for the detection of PSMA (Prostate Specific Membrane Antigen) at diagnostically relevant concentrations (nM level) both from physiological solution and from diluted serum. Finally, by exploiting the superhydrophobic Cassie-Baxter state, the direct measurement of the resonance frequency of micropillars in a liquid environment has been demonstrated, as an alternative to the cumbersome application of micro and nanocantilevers on the same conditions, paving the way toward real-time, biomolecular detection from biological samples.
XXVII Ciclo
1983

2012/2013
The present PhD Thesis is about the development of new fabricative strategies to obtain microfluidic devices suitable for InfraRed MicroSpectroscopy (IRMS) studies on living cells in physiological environment and the demonstration of the screening and diagnostic capabilities of this technique for bio-medical applications. IRMS detects the vibrational pattern of molecules allowing the label-free characterization of the chemical profile of a biological specimen and its correlation with the sample morphology. Although powerful and versatile, this technique has been limited until recent years to the study of fixed or dried samples, in order to bypass the problem of water absorptions in the infrared spectral region. The use of microfabrication techniques for the production of Visible-Infrared (Vis-IR) transparent devices has recently opened an innovative approach, able to release some of the constrains encountered when dealing with living cells. Moreover, microfabrication is the best option to achieve long-range reproducibility of the optical path, which is mandatory for an accurate water subtraction in order to disclose cellular IR features. At first, we aimed to develop an IR-Vis transparent microfluidic chip with long-time stability in experimental conditions. The optical transparency was granted by the use of CaF2 or BaF2 as substrates, but their low surface energies imposed a challenge in order to establish reliable microfabrication protocols. With the introduction of a new strategy, that we refer to as “silicon-like”, based on the sputtering of a thin silicon layer onto the IR materials, it was possible to modify the surface properties of the substrates without changing their optical properties. These new substrates allowed the use of several common photo-resists as structural materials. The epoxy-based negative tone SU-8 was chosen for its chemical properties (resistance to solvents and watery media) and its long-term stability in experimental conditions. We established a new sealing protocol exploiting the optical properties of SU-8, able to create a chemical bonding between two already patterned layers of the polymer. It was thus possible to produce a new generation of fluidic chips, characterized by broadband transparency from mid-IR to UV and long-term stability in continuous flow conditions. Subsequently, the devices were employed to perform IRMS measurements on both adherent and circulating cells. In particular, we characterize the spectroscopic features associated to each stage of B16 cell cycle, the changes undergone in living MCF-7 upon exposure to hypo-osmotic and thermal stress and the apoptosis progression of U-937 cells, induced by growth factors removal and CCCP (Carbonyl Cyanide m-Chloro Phenylhydrazone) stimulation. All the studies had the intent to further verify the effectiveness of the microfluidic approach for both circulating and adherent living cells analysis and to prove the capabilities of IRMS as tool for the observation of biochemical processes undergone by live beings. For this reason, to validate the achieved results, a parallel analysis with a well established analytical technique such as the flow-cytometry was performed. The present Thesis demonstrates the capabilities of IRMS coupled with microfluidic technologies, as a diagnostic tool for bio-medical investigation of bio-medical applications. Thanks to the precise control of the cellular microenvironment, as well as its flexibility in terms of experimental design, IRMS could be seen as a new promising frontier for modern biology.
La presente tesi di dottorato concerne lo sviluppo di nuove strategie fabricative, volte all’ottenimento di dispositivi microfluidici per lo studio di cellule vive, in condizioni fisiologiche, tramite MicroSpettroscopia InfraRossa (MSIR). Inoltre intende dimostrare le potenzialità di questa tecnica analitica come mezzo di screening diagnostico in ambito bio-medico. La MSIR prevede la caratterizzazione di bio-molecole tramite l’acquisizione del loro spettro vibrazionale. A tale spettro viene poi associata un’immagine ottica, ottenendo quindi la correlazione tra il profilo morfologico di un campione e il suo contenuto chimico. Inoltre, l’uso della spettroscopia infrarossa permette una diretta analisi del campione senza l’uso di marcatori esterni o protocolli di fissazione. L’utilizzo di questa tecnica, sebbene molto potente e versatile, fino a pochi anni fa è stato limitato a campioni fissati o deidratati al fine di aggirare i problemi derivanti dal forte assorbimento delle molecole d’acqua nell’infrarosso, noti come “barriera di assorbimento dell’acqua”. L’utilizzo di tecniche di micro fabbricazione per la realizzazione di dispositivi trasparenti nelle regioni del visibile e dell’infrarosso ha permesso di sviluppare un nuovo e innovativo approccio allo studio di campioni biologici tramite MSIR, superando le limitazioni connesse alla “barriera di assorbimento dell’acqua” e quindi alla manipolazione di sistemi viventi. Inoltre, l’approccio micro fabbricativo è la migliore strategia per ottenere una perfetta riproducibilità del cammino ottico, necessaria per sottrarre dallo spettro vibrazionale il contributo dell’acqua e ricavare quindi le caratteristiche spettrali delle cellule. Nella parte iniziale di questo lavoro di tesi, si è rivolta particolare attenzione allo sviluppo di nuovi dispositivi microfluidici trasparenti nel visibile e nell’infrarosso caratterizzati da una lunga stabilità nelle condizioni di misura. I substrati comunemente usati nella MSIR (fluoruro di calcio o bario, CaF2 e BaF2 rispettivamente) hanno una bassa energia superficiale che richiede lo sviluppo di nuovi protocolli fabbricativi per l’ottenimento dei dispositivi. Durante questo lavoro è stata proposta una nuova strategia operativa, chiamata “silicon-like”, che prevede la modifica delle proprietà superficiali dei materiali tramite la deposizione di un sottile strato di silicio sulle finestre ottiche. Lo strato di silicio provoca un incremento dell’energia superficiale del substrato senza alterarne le proprietà ottiche e permette l’uso dei comuni resist come materiali strutturali. Tra questi, si è deciso di utilizzare l’SU-8 una resina epossidica con tono negativo le cui proprietà chimico-fisiche (resistenza ai solventi e all’ambiente acquoso) e la sua stabilità nel tempo soddisfano i requisiti imposti dalle condizioni di misura. Infine è stato sviluppato un nuovo protocollo di chiusura per i dispositivi, sfruttando le proprietà ottiche dell’SU-8. Grazie a queste innovazioni è stato possibile sviluppare una nuova generazione di dispositivi microfluidici dotati di grande stabilità nel tempo e ottima trasparenza nelle regioni del visibile e infrarosso. Successivamente i dispositivi sono stati impiegati per condurre diversi studi sia su cellule circolanti che in adesione tramite MSIR. Nello specifico, sono state caratterizzate le caratteristiche spettrali che distinguono ciascuna fase del ciclo cellulare per le cellule B16, i cambiamenti nel contenuto chimico di cellule MCF-7 indotte da stress di tipo termico e osmotico e i riarrangiamenti cellulari subiti dai monociti (U937) durante la progressione attraverso l’apoptosi. Tutti questi studi avevano l’intento di dimostrare l’utilità dell’approccio microfluidico allo studio di cellule vive tramite MSIR e validare le potenzialità della MSIR come tecnica di indagine diagnostica per i processi biochimici in vivo. Per questo, parallelamente agli esperimenti MSIR sono stati condotti degli esperimenti di citofluorimetria, una tecnica di routine in ambito biologico. Questa tesi dimostra le potenzialità della MSIR accoppiata alla microfluidica come mezzo di indagine bio-medica. Grazie al preciso controllo dell’ambiente cellulare e alla flessibilità ottenibile in termini di design degli esperimenti MSIR può essere vista come una nuova frontiera per la biologia moderna.
XXVI Ciclo
1986

2012/2013
Organic photovoltaic (OPV) cells based on Bulk Heterojunction (BHJ) architecture, have reached a record efficiency of 8.3% approaching the value of 10% which is considered the threshold for commercial exploitation of this technology. However, BHJ OPV cells suffer from charge collection issues, which hinder significant further increase of efficiency. A few theoretical studies have given clear indications that the most efficient nanoscale architecture consists of nano interdigitated structure of donor (D) and acceptor (A), the materials composing the active layer of OPV cells. The width of these interdigitated structures needs to be comparable to the exciton diffusion length in the two phases (10-20 nm) while their height has to be of the order of the attenuation length of the light (over 100 nm). However, obtaining this structure is challenging and in spite of the several attempts reported, the results up to date were unsuccessful. In this work an indirect approach is proposed to circumvent problems of direct top-down nanostructuring of the active layer. The idea is to nanostructure by nano imprinting lithography (NIL) an electron-blocking, hole-transporting poly(3,4-ethylenedioxythiophene): poly(4-styrenesulfonate) (PEDOT:PSS) layer, a very common anode buffer layer in OPV. The reason for patterning a PEDOT:PSS layer is that it would act as: A nano interdigitated electrode with increased interface area with the donor material, for enhanced positive charges collection. A framework to guide the nanostructuring of the active layer. A diffraction grating for incident light to increase cells absorbance. However, PEDOT:PSS don't have a clear glass transition temperature and in standard lab condition the obtained structures suffer of deformation problems during stamp separation phase. For these reasons various attempts reported in literature to carry out standard thermal NIL process have led to very modest results in terms of aspect ratio and structure quality. Therefore, we investigated a modified NIL process, Water Vapour Assisted NIL (WVA-NIL), based on the accurate control of the environmental relative humidity to influence mechanical properties of PEDOT:PSS. After process optimization, we were able to fabricate sub-100 nm features in PEDOT:PSS with high aspect ratios (up to 6). WVA-NIL process resulted also to be able to modify, in a controlled and reproducible way, the electronic properties of the material, leading to a conductivity increase up to 5 orders of magnitude and a decrease in work function (Ф) up to 1.5 eV. This open new opportunities to tune PEDOT:PSS properties for specific application, and even for use as cathode instead of anode in OPV. We have investigated the possibility to fabricate nanostructured OPV cells by conformal coating and/or infiltration of PEDOT:PSS nanostructures with different organic semiconductors, either by thermal vacuum evaporation or solution processing, with the purpose of implementing two main architectures consisting of: 1. A nano interdigitated A/D structure, obtained by conformal deposition of the donor material on PEDOT:PSS structures, followed by infiltration with the acceptor material. 2. A BHJ cell with an interdigitated electrode, obtained infiltrating the PEDOT:PSS structures with a blend of the two active materials. As donor materials we tested Poly[2,7-(9,9-dioctyl-dibenzosilole)-alt-4,7-bis(thiophen-2- yl)benzo-2,1,3-thiadiazole] (PSiF-DBT), poly(3-hexylthiophene) (P3HT), pentacene, copper phthalocyanine (CuPc). As acceptor materials were tested: C60; phenyl-C61-butyric acid methyl ester (PCBM); indene-C60 bisadduct (ICBA). Nano interdigitated structures of aspect ratios up to 2 were successfully implemented according to architecture 1, using the combination of Pentacene and PCBM, while the main issues and limitations using the other materials were identified. The architecture 2 was successfully implemented with P3HT-ICBA and P3HT-PCBM BHJ on PEDOT:PSS gratings of lines. From the testing of the obtained cells, the most promising system resulted to be the architecture 2. Nanopatterned P3HT-ICBA BHJ cells have shown a 60% relative increase of efficiency compared to flat BHJ reference cells (in absolute values 1.3% vs 0.8% efficiency). Additional experiments were performed on the hybrid system PSiF-DBT/CuInS2, with a nano interdigitated structure of the two materials. This structure was implemented by NIL processing of PSiF-DBT, followed by an infiltration of the obtained structures with copper and indium xanthates, precursor materials that can be thermally converted into CuInS2. The nano interdigitated structure was successfully obtained, and a first series of cell was produced, showing a more than doubled efficiency, starting from 0.13% of a flat bi-layer cell to 0.30% of the nanostructured one, for thermal conversion performed at 160°C.
---------------------RIASSUNTO IN ITALIANO------------------------------ Le celle fotovoltaiche organiche (OPV) basate sull’architettura “Bulk Heterojunction” (BHJ) hanno raggiunto un record di efficienza del 8,3%, avvicinandosi al 10%, considerato soglia da superare per lo sfruttamento commerciale di questa tecnologia. Tuttavia, le celle fotovoltaiche organiche BHJ soffrono di problemi di raccolta di carica, che impediscono di ottenere ulteriori significativi incrementi di efficienza. Alcuni studi teorici hanno dato chiare indicazioni sul fatto che, la più efficiente nano architettura per le celle fotovoltaiche organiche, consiste in una struttura interdigitata di donore (D) ed accettore (A), i due materiali che compongono lo strato attivo delle celle fotovoltaiche organiche. La larghezza di queste strutture interdigitate deve essere comparabile alla distanza di diffusione degli eccitoni nelle due fasi (10-20 nm), mentre la loro altezza deve essere dell’ordine della lunghezza di attenuazione della luce nel materiale (più di 100 nm). Tuttavia ottenere queste strutture è complesso e nonostante diversi tentativi riportati in letteratura, fino ad ora non si sono ottenuti risultati soddisfacenti. In questo lavoro viene proposto un approccio indiretto che aggira i problemi della nano strutturazione “top-down” dello strato attivo. L’idea è di nano strutturare mediante ”nano imprinting lithography“ (NIL) un film di poly(3,4- ethylenedioxythiophene): poly(4-styrenesulfonate) (PEDOT:PSS), comune strato intermedio anodico delle celle fotovoltaiche organiche. La nano struttura di PEDOT:PSS così ottenuta agirà da: Elettrodo nano interdigitato ad elevata interfaccia di contatto con il materiale donore, per facilitare la raccolta di cariche positive. Da ossatura per guidare la nano strutturazione dello strato attivo. Da reticolo di diffrazione per la luce in modo da incrementare l’assorbimento della cella. Tuttavia il PEDOT:PSS non ha una chiara temperatura di transizione vetrosa, ed in condizioni di laboratorio standard, le strutture soffrono di problemi di deformazione durante la fase di separazione dello stampo. Per questo motivo vari tentativi riportati in letteratura di utilizzare il processo NIL termico standard, hanno portato a risultati modesti in termini di rapporto di forma e qualità delle strutture. Abbiamo quindi studiato un processo NIL modificato, Water Vapour Assisted NIL (WVA-NIL), basato su un'accurato controllo dell’umidità relativa ambientale al fine di influire sulle proprietà meccaniche del PEDOT:PPS. A seguito dell’ottimizzazione del processo siamo stati in grado di fabbricare strutture con dettagli sub-100 nm e con elevato rapporto di forma (fino a 6). Il processo WVA-NIL è inoltre risultato in grado di modificare in modo controllato e riproducibile le proprietà elettroniche del materiale, portando ad un incremento di conducibilità fino a 5 ordini di grandezza ed una riduzione di funzione lavoro (Ф) fino a 1.5 eV. Questo apre la possibilità di regolare le proprietà elettroniche del PEDOT:PSS per applicazioni specifiche, ed addirittura usarlo come catodo anziché come anodo nelle celle OPV. Abbiamo studiato la possibilità di ottenere celle OPV nano strutturate con una deposizione conformale ed/o infiltrazione delle strutture di PEDOT:SS con diversi semiconduttori organici, depositati per evaporazione termica a vuoto o per deposizione da soluzione. Lo scopo di ciò è di ottenere due principali architetture: 1. Una struttura nano interdigitata A/D ottenuta per deposizione conformale del materiale donore sulle strutture di PEDOT:PSS, seguita da infiltrazione con materiale accettore. 2. Una cella BHJ, con un elettrodo interdigitato, ottenuta infiltrando le strutture in PEDOT:PSS con una mistura dei due materiali attivi. Come materiali donori abbiamo testato: Poly[2,7-(9,9-dioctyl-dibenzosilole)-alt-4,7- bis(thiophen-2-yl)benzo-2,1,3-thiadiazole] (PSiF-DBT); poly(3-hexylthiophene) (P3HT); pentacene; ftalocianine di rame (CuPc). Come materiali accettori: C60; phenyl-C61-butyric acid methyl ester (PCBM); indene-C60 bisadduct (ICBA). Strutture nano interdigitate con aspetto di forma fino a 2 sono state ottenute con successo, secondo l’architettura 1, usando la combinazione di materiali Pentacene-PCBM mentre i principali problemi e limitazioni nell’utilizzo degli altri materiali sono stati identificati. La seconda architettura è stata implementata con successo con celle BHJ in P3HT-ICBA e P3HT PCBM, usando reticoli di linee di PEDOT:PSS. Dai test di caratterizzazione delle celle è emerso che il sistema più promettente è costituito dalla architettura 2. Celle BHJ P3HT-ICBA nano strutturate hanno mostrato un aumento relativo di efficienza del 60% confrontate ad una cella BHJ di riferimento planare (in valore assoluto 1,3% contro 0.8%). Sono stati eseguiti anche esperimenti su celle nano interdigitate ibride in PSiF- DBT/CuInS 2 . Questa struttura è stata ottenuta mediate processo NIL del PSiF-DBT, seguito da infiltrazione con xantati di indio e rame, precursori che possono essere convertiti termicamente in CuInS 2 . La struttura nano interdigitata è stata ottenuta con successo e dalla prima serie di celle prodotta, ha mostrato un raddoppio dell’efficienza, passando da 0,13%
XXVI Ciclo
1980

2012/2013
L’acqua è universalmente presente nei sistemi biologici. Le sue peculiari proprietà hanno una forte influenza sulla struttura e sul comportamento chimico di macromolecole biologiche ed alimentari. La dissoluzione di una molecola di soluto in acqua comporta l’interazione dei sui gruppi funzionali con la circostante struttura della fase condensata dell’acqua. La maggior parte delle molecole biologicamente importanti hanno una complessa architettura che mantiene assieme funzionalità polari e componenti idrofobiche. Le interazioni di queste funzionalità con le circostanti molecole d’acqua causano la riorganizzazione delle molecole di solvente attorno al soluto. La risultante organizzazione delle molecole d’acqua differisce da quella delle molecole d’acqua libere in soluzione e riflette la specifica architettura del soluto. Questa strutturazione dell’acqua riveste un ruolo importante in molti processi biologici, tra i quali il ripiegamento delle proteine o il riconoscimento recettore-substrato, che hanno chiare implicazioni anche nelle proprietà degli alimenti. Un’approfondita comprensione a livello atomico dei principi che governano queste interazioni manca. Tuttavia, il raggiungimento di una maggiore conoscenza di come le molecole d’acqua interagiscono con le biomolecole e come questo influenzi l’associazione di biomolecole in soluzione acquosa riveste un interesse primario per comprendere il ruolo fondamentale dei composti attivi in tutti i settori di carattere biologico. In questo lavoro, il comportamento di piccole molecole biologiche alimentari è stato studiato attraverso tecniche computazionali e sperimentali. Simulazioni di dinamica molecolare sulla caffeina in soluzione acquosa sono state condotte per studiare l’interazione tra acqua e caffeina e la riorganizzazione delle molecole d’acqua come conseguenza della presenza della molecola di caffeina in soluzione. Questi studi hanno permesso di testare vari modelli di solvatazione dell’acqua. La molecola di caffeina è stata modellizzata utilizzando un campo di forze CHARMM sviluppato appositamente. La simulazione ha rivelato che la caffeina in soluzione acquosa impone un’organizzazione complessa alle molecole di solvente adiacenti. I dettagli caratteristici di questa strutturazione dell’acqua sono una funzione complicata dell’architettura molecolare del soluto e non dipendono dal modello computazionale di acqua utilizzato. L’auto-aggregazione delle molecole di caffeina in soluzione acquosa è stata studiata attraverso simulazioni di dinamica molecolare, esperimenti di diffrazione a basso angolo ed esperimenti di diffrazione di neutroni con sostituzione isotopica. Le simulazioni sono state eseguite su un sistema di 8 molecole di caffeina in acqua a 27°C, rappresentando una soluzione con una concentrazione 0.1 m, vicina al limite di solubilità a temperatura ambiente. Come atteso, le molecole di caffeina hanno formato aggregati in soluzione, impilandosi come monete. Il sistema era caratterizzato da un equilibrio dinamico tra aggregati di grandi e piccole dimensioni. Il coefficiente osmotico calcolato dalla distribuzione degli aggregati nel corso della simulazione è compatibile con il dato sperimentale. Esperimenti complementari di scattering a basso angolo sono stati condotti su una soluzione acquosa di caffeina con concentrazione 0.1 a 25°C. L’analisi dei dati sperimentali, con un modello in cui le molecole di caffeina sono approssimate a dischi piatti interagenti, ha fornito un valore della distanza di impilamento di 10 Å, compatibile con la distanza tra due molecole di caffeina all’estremità di un trimero e allineate in modo antiparallelo in una sequenza del tipo ABA. Esperimenti di diffrazione di neutroni con sostituzione isotopica sono stati condotti su una soluzione acquosa di caffeina a concentrazione 1 m a 80°C per aumentarne la solubilità e di conseguenza il contrasto. Gli stessi sono stati eseguiti anche sull’acqua pura alla stessa temperatura. La sostituzione isotopica è stata applicata agli atomi di idrogeno dell’acqua. I dati di diffrazione sono stati analizzati mediante simulazioni di dinamica molecolare e attraverso il metodo empirical potential structure refinment. Entrambi gli approcci hanno mostrato la formazione di aggregati di molecole di caffeina impilate in soluzione, con una maggiore tendenza ad associarsi rilevata nelle simulazioni di dinamica molecolare. Il presente studio ha mostrato che nonostante la molecola di caffeina abbia una dimensione inferiore ad 1 nm, la strutturazione delle molecole d’acqua direttamente sopra al piano della caffeina è consistente a quella prevista per una superficie idrofobica estesa. Questo risultato spiega come l’associazione della caffeina possa avere un carattere idrofobico, ma avere un’energia libera di associazione dominata dal contributo entalpico. Ulteriori simulazioni di dinamica molecolare sono state eseguite su diversi sistemi di zuccheri in soluzione acquosa di caffeina. Gli zuccheri esaminati sono: il saccarosio, entrambi gli anomeri del glucosio e il sorbitolo. Tutti gli zuccheri hanno esibito un’affinità per la molecola di caffeina. Nel caso del saccarosio e del glucosio, la natura dell’interazione è un appaiamento tra le facce idrofobiche della caffeina e le facce idrofobiche prodotte dai protoni assiali degli zuccheri. Questa modalità di interazione non ha alterato la formazione di legami idrogeno tra le molecole di zucchero e l’acqua. Il sorbitolo è topologicamente diverso da zuccheri come il saccarosio e il glucosio, in quanto in soluzione è prevalentemente caratterizzato da una struttura a catena estesa. Nonostante ciò, l’associazione del sorbitolo alla caffeina avviene attraverso l’interazione dei protoni alifatici con le facce idrofobiche della caffeina, analogamente al comportamento degli zuccheri ciclici. In aggiunta, l’associazione del sorbitolo alla caffeina non influenza la conformazione media dello zucchero in soluzione. Esperimenti complementari di titolazioni di risonanza magnetica nucleare sono stati condotti su sistemi analoghi misurando la variazione del chemical shift dei protoni degli zuccheri in conseguenza all’aggiunta di caffeina ad una soluzione a concentrazione costante di zucchero (glucosio o saccarosio) e viceversa. L’ampiezza della variazione del chemical shift dei protoni legati all’anello degli zuccheri valida la natura dell’interazione determinata dalle simulazioni di dinamica molecolare.
XXVI Ciclo
1986

2012/2013
Le proteine intrinsecamente disordinate (IDP), nello stato nativo non ripiegate, sono inclini all’aggregazione e direttamente correlate con lo sviluppo di malattie amiloidi. Tra queste, ci siamo focalizzati sullo studio dell’alfa-Sinucleina (AS), una proteina coinvolta nella malattia di Parkinson, un disturbo neurodegenerativo caratterizzato dalla degenerazione dei neuroni dopaminergici e l’accumulo di AS in placche amiloidi. Sebbene lo studio delle interazioni AS-dopamina sia di importanza cruciale nella comprensione dei meccanismi responsabili dello sviluppo della malattia, tuttavia, non sono disponibili dati in letteratura riguardo all’affinità di questo legame nei diversi stati ripiegati/funzionali dell’AS. L’elevata tendenza all’aggregazione delle IDP rende difficile il loro studio in soluzione e anche una stima approssimativa dei parametri relativi all’affinità di legame è estremamente difficile. Nuove tecniche di superficie potrebbero pertanto permettere lo studio delle interazioni di legame di molecole e di farmaci capaci di favorire/inibire l’aggregazione. In particolare, le tecniche di superficie potrebbero permettere un migliore controllo dell’immobilizzazione di queste proteine, particolarmente instabili in soluzione, e di studiare con alta precisione fenomeni di legame. Con questa visione, la microscopia di forza atomica (AFM) rappresenta un’opportunità. Il nanografting, una tecnica litografica per mezzo AFM, permette l’immobilizzazione di proteine orientate con il preciso controllo dei parametri di immobilizzazione. Con AFM e AFM-nanografting, abbiamo prodotto una nuova piattaforma per lo studio di diversi aspetti dell’aggregazione/interazione dell’AS. Abbiamo quindi studiato l’affinità di legame tra AS e dopamina misurando variazioni nell’altezza e nella rugosità della topografia AFM su AS immobilizzata in aree confinate, in funzione della concentrazione di dopamina. Il valore micromolare della costante di dissociazione (Kd) è stato inoltre confermato dallo studio dello spiazzamento di un anticorpo legato all’AS in seguito all’aggiunta di dopamina. Sebbene la Kd calcolata con il nostro approccio sia una stima della reale Kd calcolata in soluzione, in quanto influenzata dall’affollamento delle molecole o ai limiti di diffusione, i nostri risultati sono comunque degni di nota. Infine, abbiamo testato il nostro saggio per lo studio delle fasi preliminari dell’aggregazione dell’AS. In particolare, abbiamo osservato come aggregati confinati di AS siano disciolti dall’azione della dopamina, confermando il suo ruolo nell’inibizione della fibrillazione. In questo modo, abbiamo creato un saggio potenzialmente utilizzabile per lo screening di nuove molecole che interagiscono con l’AS ed eventualmente utilizzabili come farmaci. Inoltre, l’interazione di AS con microdomini della membrana cellulare (lipid rafts) sono oggetto di dibattito. Per questo motivo, abbiamo utilizzato dei doppi strati lipidici modello con composizione capace di mimare quella dei lipid rafts. In particolare, abbiamo caratterizzato con AFM e GISAXS (Grazing Incidence Small Angle X-ray Scattering) delle membrane lipidiche di tre componenti, aventi separazione di fase lipidica, studiando l’effetto dell’umidità e della percentuale di colesterolo su ciascuna fase. Abbiamo quindi studiato l’effetto del legame dell’AS su questo sistema modello. In particolare, immagini di topografia AFM in liquido ci hanno dato la possibilità di discriminare la topografia di strutture filamentose formatesi inseguito all’interazione di AS. Il fenomeno, dipendente dalla fase lipidica della membrana e quindi dall’ordine delle molecole, sembra essere favorito da un blando impacchettamento dei lipidi. Inoltre, utilizzando misure GISAXS, è stato possibile determinare un considerevole riordinamento della membrana in seguito al legame di AS.
Intrinsically disordered proteins (IDPs) are natively unfolded, prone to aggregation and directly correlated with amyloid diseases. Among them, we focused on alpha-Synuclein (AS), a protein related to Parkinson’s disease, a neurogenerative disorder characterized by the degeneration of dopaminergic neurons and the accumulation of AS into amyloid plaques. In particular, the study of AS-dopamine (DA) adducts is crucial for the comprehension of the mechanisms responsible of Parkinson’s disease development. However, according to our knowledge, there is no evidence in literature about AS-DA binding parameters at different folding/functional state of AS. IDPs have in fact a strong propensity to aggregate, making it extremely difficult to get even rough estimation of binding affinities in solution. Therefore, new methods able to study surface immobilized IDPs could be useful for both fundamental studies of binding interactions and drug screening of new compounds able to interact favouring/inhibiting the aggregation process. In particular, the use of a surface-based technique could help to better control the immobilization of such proteins, particularly unstable in solution, and to study with high precision binding events. With this perspective, atomic force microscopy (AFM) offers a challenge. Nanografting, an AFM mediated nanolithographic technique, allows for the nanoscale immobilization of proteins in a well-oriented manner with the precise control of the immobilization parameters. By means of AFM and AFM-nanografting, we produced a new platform able to study different aspects of AS aggregation/interactions. First, we studied AS-dopamine binding affinity by measuring the variation of AFM topographic height on AS nanopatches due to binding of DA on the patch as a function of its concentration in solution, and the correspondent surface roughness variation. The value of the dissociation constant, in the micromolar range, was confirmed by studying the displacement of AS-bound mAbs, after the addition of dopamine. We think that this result is noteworthy, even though we are aware that the Kd values obtained with our assay are probably a very rough estimate of the Kd of the AS/DA interaction occurring in solution, due for instance to AS surface crowding and restrictions to diffusion. Finally, the assay was used to study the early stages of the aggregation process. In particular, dopamine dissolved confined AS aggregates confirming its role in the inhibition of fibrillation. In this way, we created a potential screening assay able to study the interaction of AS with new molecules virtually usable as new drugs. Moreover, the interaction of AS with lipid rafts, specialized microdomains of the cell membrane, is object of a strong debate. For this reason, we created a model supported lipid bilayer with composition able to mimic lipid rafts. In particular, we characterized by both AFM and Grazing Incidence Small Angle X-ray Scattering (GISAXS) a three components membrane presenting a lipid phase separation, focusing on the effect of humidity and cholesterol percentage on the structure of each phase. Then, we studied the effect of AS binding on this membrane model system. In particular, trough AFM imaging in liquid we discriminated the topology of filamentous structures resulting from AS binding. The phenomenon is dependent on the membrane’s lipid phase and order and is favoured by mild packing of lipids. From GISAXS measurements, the occurrence of a strong rearrangement of the membrane upon AS binding was suggested.
XXVI Ciclo
1984

2013/2014
Understanding and controlling the ordering and functionality of organic semiconductors coupled to a dielectric surface, besides constituting a fascinating topic in basic science, has the potential to foster the development of many novel technologies, ranging from efficient and inexpensive photovoltaic cells to flexible electronic components. In the present doctoral work, the well-characterized (110) surface of Rutile TiO2 single crystals, r-TiO2(110), has been selected as an archetypal dielectric substrate for the templated growth of organic molecules and the assessment of their physico-chemical properties at the interface. In particular, this thesis provides: i. a detailed picture of the bonding and structural properties of two polycyclic aromatic hydrocarbons, and ii. a comprehensive study of the electronic structure and on-surface chemistry of three heteroaromatic molecules; both i. and ii. with regard to the interface with r-TiO2(110) in an ultra-high vacuum (UHV) environment. The determination of the electronic and structural properties at the organodielectric interfaces has been achieved via a multitechnique experimental approach consisting of the combination between scanning tunneling microscopy (STM) and electron spectroscopies with synchrotron radiation. While the former can reveal the geometrical details of single adsorbed species, and allow for a close, direct-space inspection of their molecular packing and ordering, the latter provides information on the electronic states and chemical composition of the overlayer. STM has been applied to systems in i. so as to complement the existing knowledge of their electronic structure with structural details on a scale length ranging from several hundred molecules down to a single molecule. Subsequently, a full microscopic and spectroscopic characterization of the interfaces in ii., on which scarce studies are currently available, has been conducted, with particular emphasis on the chemical reactions triggered by thermal annealing. To get a deeper insight into the experimental findings and facilitate their interpretation, selected systems have been modeled by two groups of theoreticians with numerical simulations based on density functional theory (DFT) formalism. The interfaces studied in part i. comprise tetracarboxylic-acid-diimide (PTCDI), a heteroaromatic acceptor, and perylene, an all-carbon aromatic donor, in contact with the r-TiO2(110)-1x1 surface. The substrate twofold symmetry and the large surface corrugation provided by the protruding oxygen rows favor the alignment of the PTCDI long axis along the [001] direction, parallel to the surface rows. STM images reveal that the growth of PTCDI proceeds via island nucleation; there is no evidence for any preferential roles in adsorption played by defect sites, be them oxygen vacancies or hydroxyl groups. Each island consists of aligned monomers adsorbed atop the oxygen rows, and coupled head-to-tail via one hydrogen bond per two facing imide terminations. The competition between molecule-substrate interaction, which displays a mixed van der Waals/covalent character, and intermolecular hydrogen bonds originates a fivefold periodicity in the island with respect to the underlying surface unit cell along the [001] direction, as pointed out by previous He atom scattering studies. In the [1-10] direction, orthogonal to the surface rows, adjacent monomers organize in stripes with one monomer per oxygen row. Such a dense packing is attributed to a strong side-by-side attraction between the electron-deficient rim of one monomer and the $\pi$ electron system of the one at its side, made possible by a moderate tilt angle of PTCDI about its long axis (35°). A similar adsorption geometry emerges for perylene, albeit with some remarkable differences of the self-assembly mechanism. At low coverage, monomers sparsely populate the surface titanium troughs, showing a rather weak intermolecular attraction. As the coverage increases up to a full monolayer, perylene molecules gradually fill the available space in the titanium troughs until a wetting layer is formed and no sticking of additional material is observed due to very weak pi-type interactions between stacked dimers. The side-by-side coupling between tilted monomers in the monolayer favors the coalescence of ordered domains extended across the substrate rows, although frequent line defects disrupt the long range order. Part ii. focuses on the interface between r-TiO2(110) and two classes of heterocyclic compounds: phthalocyanines and porphyrins. The interfacial electronic structure, morphology, conformation and chemical reactivity of in situ grown thin films of metal-free phthalocyanine (2H-Pc), tetraphenyl-porphyrin (2H-TPP) and tert-butyl tetraphenyl-porphyrin (2H-tbTPP) have been extensively investigated by means of STM and electron spectroscopies. The surface sensitivity and chemical selectivity of soft X-ray photoemission (XPS, photon energies 100-1000 eV) and near-edge X-ray absorption (NEXAFS) allowed to monitor the chemical state of the species upon adsorption as well as the orientation of their molecular plane relative to the crystal surface. The differences in the electronic structure and chemical reactivity among the adsorbed heterocycles have been analyzed and correlated to the type of peripheral environment surrounding the macrocycle, i.e. their chemically active part. The experimental results point to the existence of a reaction unaffected by the type of side substituents: the conversion of the macrocyclic aza-type nitrogen atoms to pyrrolic-type nitrogens. Conversely, self-metalation, i.e. the incorporation into the macrocycle of a Ti ion extracted from the substrate, is demonstrated with STM and X-ray spectroscopy for the three compounds, but with significant temperature variations among them. While self-metalation in 2H-Pc starts at room temperature and is quickly completed at 90°C, in 2H-TPP a similar metalation rate of molecules is achieved at 150°C, and in 2H-tbTPP, where two bulky tert-butyl groups departing from each peripheral phenyl ring act as inert spacers increasing the macrocycle distance from the surface, the energy barrier for the activation of the reaction is increased further and self-metalation is quickly achieved only at 200°C. Therefore, one concludes that a careful selection of side substituents proves to be a successful approach towards the tuning of chemical reactivity of these macrocyclic compounds on a metal oxide surface.
XXVII Ciclo
1987

2013/2014
Questo documento riporta risultati di calcoli DFT di rilassamenti periodici e di spettri NEXAFS di core su soglia K per taluni sistemi di stato solido attraverso l’utilizzo di una metodologia computazionale ibrida. Appropriati modelli di cluster di tali rilassamenti vengono presi in considerazione per il calcolo degli spettri NEXAFS a livello finito in uno schema di approccio a orbitali molecolari. Il problema a cui ci si indirizza nella fattispecie riguarda la spettroscopia di molecole adsorbite su superfici. La prima parte del lavoro si focalizza sul calcolo di spettri NEXAFS K-edge di molecole di etilene e piridina adsorbite su superficie di silicio Si(100), rispettivamente ai livelli C1s e N1s/C1s per varie polarizzazioni del fascio di sincrotrone incidente, considerando differenti geometrie di adsorbimento in entrambi i casi. Nella seconda parte, viene fatta una scelta differente per cambiare la natura della superficie adsorbente, passando ad Ag(110) e Au(111) con vari addotti di ossigeno molecolare e di 1,4-paradiaminobenzene rispettivamente. Similmente al caso precedente, si effettuano simulazioni DFT di spettri NEXAFS ai livelli O1s e N1s per varie polarizzazioni del fascio di sincrotrone incidente. In tutti i casi si cerca di ottenere il miglior accordo con gli esperimenti considerati. I nostri studi mostrano una ragionevole convergenza degli spettri angolo-risolti calcolati con le loro controparti sperimentali e portano a concludere l’utilità di questo approccio computazionale nella definizione della geometria più probabile dell’adsorbato sulla superficie considerata.
XXVI Ciclo
1976

2013/2014
A diet rich in fruits and vegetables has been associated with a decreased risk of brain diseases. Some plant-specific compounds occurring in fruits and vegetables, such as flavonoids, have been found to exert neuroprotection, thus decreasing neurological disease risk. The current hypothesis is that neuroprotection is due to the antioxidant properties of flavonoids. The main aims of this PhD thesis were: i) to assess whether some flavonoids are transported from the blood into the brain across the blood-brain barrier, ii) to understand if neuroprotection is mediated by an impact on brain metabolism. The first part of the thesis describes in vivo experiments with cyanidin 3-glucoside (C3G), implementing different metabolomics analyses approaches. Mean Time (MT) parameters are reported as useful indicators of the retention properties of C3G in peripheral tissues. The second part deals with the development and characterisation of a selective and sensitive analytical method, based on Surface-Enhanced Raman Spectroscopy (SERS), enabling the assessment of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS) in living cells.
Una dieta ricca in frutta e verdura è stata associata a un ridotto rischio di malattie neurodegenerative, e alcuni composti antiossidanti presenti in frutta e verdura, come i flavonoidi, sono stati riconosciuti come agenti neuroprotettivi. Gli obiettivi principali dell’attività di ricerca riportata in questa tesi sono stati la valutazione del passaggio dal sangue al cervello, attraverso la barriera emato-encefalica, di alcuni flavonoidi, la comprensione del loro impatto sul metabolismo del cervello e del loro meccanismo d'azione come agenti neuroprotettivi. La prima parte della tesi descrive diversi approcci di analisi metabolomica utilizzati in esperimenti in vivo con cianidina 3-glucoside (C3G). Parametri di tempo medio sono riportati come utili indicatori delle proprietà di ritenzione di C3G nei tessuti periferici. La seconda parte presenta lo sviluppo e la caratterizzazione di un metodo analitico, basato sulla spettroscopia Raman amplificata da superfici (SERS), per la determinazione di specie reattive dell’ossigeno e dell’azoto (ROS/RNS), in cellule viventi.
XXVII Ciclo
1985

2008/2009
Le nanotecnologie sono un campo delle scienze che utilizza materiali e dispositivi ingegnerizzati aventi la più piccola organizzazione funzionale a livello di dimensioni nanometriche. Questo implica che nanodispositivi e nanomateriali possano interagire con i sistemi biologici a livello molecolare con un elevato grado di specificità. É largamente accettato che l’applicazione delle nanotecnologie nell’ambito delle neuroscienze abbia un forte potenziale (Silva, 2006). In questo contesto, i nanotubi di carbonio (CNT), un’innovativa forma di carbonio composta da strutture tubulari di grafite dalle dimensioni nanometriche dotate di buone proprietà di conduzione elettrica, si sono dimostrati promettenti candidati per sviluppare la tecnologia di dispositivi impiantabili in ambito biomedico. Diversi studi hanno dimostrato la biocompatibilità dei substrati di CNT per i neuroni in termini di adesione, crescita e differenziamento cellulare (riassunti in Sucapane et al., 2009). Al fine di aumentare la nostra conoscenza riguardo alle interazioni presenti in sistemi ibridi formati da CNT e neuroni, abbiamo caratterizzato l’attività di reti neuronali cresciuti su supporti di CNT attraverso la tecnica del patch clamp. Il nostro gruppo ha riportato che circuti neuronali cresciuti in vitro su substrati di CNT presentano un’aumentata attività sinaptica spontanea rispetto al controllo a fronte di comparabili proprietà base (proprietà passive di membrana, morfologia e densità dei neuroni) delle colture nelle due condizioni di crescita (Lovat et al., 2005). Si è quindi ipotizzato che tale aumentata attività spontanea potesse originare da una modificazione nel modo in cui i singoli neuroni generano il segnale elettrico. A tal fine, si sono monitorate variazioni nelle proprietà elettrogeniche di singoli neuroni, utilizzando un protocollo standard per caratterizzare l’integrazione di potenziali d’azione retropropaganti nei dendriti (Larkum et al., 1999). In configurazione current clamp, attraverso brevi iniezioni di corrente nel soma della cellula, abbiamo indotto una serie di regolari potenziali d’azione (PA) a varie frequenze nel neurone sotto registrazione, quindi abbiamo studiato la presenza di un’addizionale depolarizzazione somatica dopo l’ultimo PA del treno. Abbiamo osservato che neuroni di controllo mostrano nella maggioranza dei casi una iperpolarizzazione (AHP) del potenziale di membrana dopo l’ultimo PA del treno, mentre una depolarizzazione (ADP) è presente solo in una piccola quota di casi. In presenza di CNT, invece, l’ADP risulta essere l’evento predominante. L’ADP è inoltre abolita dall’applicazione di CoCl2, un bloccante non specifico dei canali calcio voltaggio dipendenti. Per di più, l’area dell’ADP può essere diminuita dall’applicazione di nifedipina (10 μM) e l’ulteriore coapplicazione di NiCl2 (50 μM) elimina totalmente l’ADP, suggerendo che sia i canali calcio voltaggio dipendenti ad alta soglia di attivazione, sia quelli a bassa soglia, siano coinvolti in questo processo (Cellot et al., 2009). Attraverso la microscopia elettronica a trasmissione (TEM) e, più recentemente, mediante quella a scansione (SEM) è stata messa in evidenza la presenza di discontinui punti di stretto contatto tra CNT e membrane neuronali: la nostra ipotesi è che tali strutture ibride siano in grado di favorire la retropropagazione dei PA nei dendriti distali. La maggiore eccitabilità a livello del singolo neurone, inoltre, potrebbe essere responsabile dell’incremento di attività spontanea della rete neuronale. Abbiamo quindi ulteriormente caratterizzato l’attività della rete neuronale attraverso registrazioni da coppie di neuroni, dove il neurone presinaptico veniva stimolato ad avere treni di potenziali d’azione a 20 Hz in configurazione current clamp e simultaneamente il neurone postsinaptico era monitorato in configurazione voltage clamp per vedere la presenza o l’assenza di una risposta sinaptica. I nostri esperimenti indicano che la probabilità di trovare connessioni monosinaptiche gabaergiche tra neuroni è aumentata in presenza di CNT (56% vs 40% in controllo). Inoltre, è stato rilevato un ulteriore effetto dei CNT sulla plasticità a breve termine delle sinapsi: nelle condizioni di controllo, treni di potenziali d’azione nella cellula presinaptica evocano nella cellula postsinaptica nel 90% dei casi una chiara depressione nell’ampiezza di consecutivi ePSCs, mentre solo in meno del 10% è possibile rilevare una facilitazione. Al contrario, in presenza di CNT, nel 39% delle coppie, il neurone postsinaptico risponde in modo chiaramente facilitativo. Nelle più recenti serie di esperimenti, abbiamo voluto indagare più approfonditamente l’origine di questa modificazione in termini di plasticità sinaptica; a tal fine, abbiamo trattato neuroni in controllo e su CNT con tetrodotossina 1 µM per 5 giorni, al fine di bloccare completamente l’attività elettrica della rete neuronale, e abbiamo compiuto delle registrazioni da coppie di neuroni. Mentre la risposta prevalentemente di depressione dei controlli non è modificata da tale trattamento, neuroni cresciuti su substrati di cnt in condizioni di blocco dell’attività elettrica non presentano più sinapsi con caratteristiche di facilitazione, ma hanno un comportamento simile ai contolli. Questi risultati indicano che la facilitazione è una proprietà tipica di sinapsi attive sviluppatesi in presenza di CNT.
XXII Ciclo
1981

2009/2010
Iopamidolo, Iomeprolo e Iopromide sono Mezzi di Contrasto Iodinati Non-ionici (MCIN) usati in urografia e angiografia come soluzioni concentrate. I dati relativi ai MCIN presenti in letteratura mostrano un’abbondanza di informazioni cliniche ma una carenza di dati riguardanti le loro caratteristiche chimico-fisiche. L’efficenza di questi composti in ambito medico è dovuta alla combinazione di tali proprietà. Risulta quindi necessario uno studio relativo ai dettagli molecolari per chiarire i contributi di ogni gruppo funzionale del sistema che determinano le differenze in termini di comportamento chimico-fisico. Le soluzioni concentrate di MCIN sono caratterizzate da bassi valori di viscosità e osmolalità dovuti all’autoassemblamento del sistema che genera aggregati nanostrutturati solubili in soluzione acquosa. Da queste considerazioni, questo lavoro di ricerca si è focalizzata su tecniche spettroscopiche, termodinamiche e di simulazioni di dinamica molecolare per indagare il fenomeno dell’associazione, sia in funzione della temperatura che della concentrazione, relazionato alle interazioni intermolecolari che spesso sono la principale causa della stabilità delle soluzioni concentrate di MCIN. Questi composti possiedono una struttura molecolare relativamente semplice, ma sono sistemi complessi in quanto soggetti all’atropisomerismo che causa la coesistenza di isomeri strutturali (atropisomeri) in soluzione, quindi di diverse geometrie di interazione soluto-soluto. Il primo approccio sperimentale è stata la caratterizazione molecolare attraverso la spettroscopia NMR per determinare gli equilibri conformazionali in termini di percentuali di popolazione in soluzione. Studi termodinamici hanno permesso di classificare Iopamidolo, Iomeprolo e Iopromide in base alle loro caratteristiche idrofiliche ed idrofobiche nei confronti delle molecole di acqua. Parallelamente sono state realizzate simulazioni di dinamica molecolare per ottenere informazioni riguardo la sfera di idratazione (confrontate con i dati termodinamici da letteratura) e sul processo di associazione che è stato studiato in funzione della temperatura sia con la spettroscopia NMR che con quella Brillouin. Ulteriori informazioni sulle interazioni intermolecolari e sull’atropisomerismo sono state ottenute analizzando anche lo stato solido dello Iopamidolo e dello Iomeprolo (sia sui vetri che sui cristalli) tramite tecniche spettroscopiche, calorimetriche e diffrattometriche i cui risultati hanno mostrato analogie in termini di interazioni intermolecolari fra le catene laterali. Inoltre, studi in funzione della temperatura hanno mostrato alcune transizioni solido-solido. L’accumulo di dati sperimentali relativi alla calorimetria isoterma e a scansione, traiettorie di dinamica molecolare ed alle varie spettroscopie, ha permesso di estendere il quadro generale delle conoscenze delle proprietà chimico-fisiche dei MCIN.
Iopamidol, Iomeprol and Iopromide are Non-ionic Iodinated Contrast Media (NICMs) are used as concentrated solutions in x-Ray diagnostics as angiography and urography. The analysis of the current literature knowledge on NICMs shows an clear abundance of clinical diagnosis data but a lack of information on their physico-chemical properties. The success of these molecules in diagnosis is due to a combination of their properties, but a clarification of the role of structural determinants affecting the processes in concentrated solution is necessary. Thus a study of the molecular details may shed light on the differences in physico-chemical behavior. The concentrated solutions of NICMs are characterize by low viscosity and osmolality values due to the self-assembling of the system that generates soluble nano-structured aggregates in aqueous solution. Standing these considerations, the research work focused on spectroscopic, thermodynamics and MD simulation techniques to probe the association phenomenon, as a function of concentration and temperature. The interplay of the intermolecular interactions are the main reason for the stability of the concentrated solution of NICMs. Non-ionic iodinated contrast media have quite a simple molecular structure, but they show a complex behaviour due to the atropisomerism phenomenon. The coexistence of several structural isomers (atropisomers) in solution is at the basis of the different geometries of solute-solute interasctions. Thus, the first study whas been the molecular characterization of these molecules by using NMR spectroscopy to probe the conformational equilibria in terms of conformer population in solution. Thermodynamic approaches provided a classification of Iopamidol, Iomeprol and Iopromide according to their thermodynamics behaviour in terms of hydrophilic and hydrophobic interactions with water molecules. In parallel, MD simulations data were carried out to provide information about hydration shell (which were compared with experimental data from literature) and aggregation process. Similarly, the association was probed by both NMR and experimental thermodynamic data. To have more information on the nature of intermolecular interactions and atropisomerism phenomenon the solids of Iomeprol and Iopamidol (either or glasses and crystals) were analyzed by spectroscopic, calorimetric and diffractometric techniques that shown agreement in terms of intermolecular interactions among side chains. Furthemore, solid-solid transitions were detected as a function of temperature. By collecting experimental data by isothermal and scanning calorimetry, thermodynamic properties, molecular dynamics simulations and expecially by several spectroscopics methods a choerent description of the structure and dynamics of NICMs has been achieved. These results provide new knowledge on thier physico-chemical properties and allow us to interpret some anclear phenomena.
XXIII Ciclo
1980

2008/2009
The chemical transformations of supported PtRh particles ranging in size from a few micrometers to a few nanometres, and nanocrystalline films have been studied under identical oxidizing conditions by means of different chemical and structural characterization techniques; in particular the main technique used has been the scanning photoemission spectromicroscopy (SPEM) available at the EscaMicroscopy beamline of the Elettra Synchrotron Light Source. This novel experimental technique allows sample’s chemical mapping with a spatial resolution of 100nm and the acquisition of photoemission spectra on regions with the same dimension, and allow us to determine the chemical state of single micro-particles. In particular we studied PtRh cluster deposited by PLD (pulsed laser deposition) on a tungsten single crystal (W(110)) covered by a thin magnesium oxide film (MgO). Significant variations of the Pt and Rh atoms reactivity have been revealed by comparing the oxidation states of particles with different dimensions and, for the micron-scale particles, also within the same island. It was demonstrated that a selected oxidation occurs: rhodium atoms undergo stronger and faster oxidation than platinum ones. Furthermore, the oxidation process is composed by many intermediate steps, in which metastable oxides are formed. Very small cluster’s oxidation (<10nm diameter) is significantly faster then the bigger one (>100nm). Some morphological and structural clusters’ modifications after long oxidation treatments were also investigated using a high resolution SEM (<2nm lateral resolution). Other measurements have been performed by using a Low Energy Electron Microscope (LEEM) that combines a high spatial resolution (<5nm) to a high sensitivity to surface structural modifications. In particular the behaviour of the clusters’ polycrystalline structure has been studied during oxidation-reduction treatments. It has been shown that the clusters’ surface is polycrystalline and that each nano crystals have different crystallographic orientation. After oxidation each nano-crystal undergoes a different oxidation rate. The diffraction pattern revealed that after a long oxidation the long range order of the particles’ surface is completely lost. A characterization of the reactivity of the PtRh particles towards oxidation after an “ageing” process based on the repetition of many redox cycles has revealed a change in the stability of the oxides. Other experiments have been realized with SEM and EDX for studying the clusters’ morphology at different annealing temperatures. The results have shown structural, chemical and morphology changes.
XXII Ciclo
1976

2010/2011
Since from the first Industrial Revolution, energy supply, which feeds human activities, has been characterized by consumption of fossil fuels such as coal, crude oil and gas. This supply model is heavely affected by a dramatic limitation, taht is the idea of feeding an infinite system (such as the human activities energy demand) with a finite (in terms of time) source - fossil fuels. Although this issue was already forecast in the early decades of the last century (e.g. G. Ciamician in The photochemistry of the Future, during The Ninth International Congress of Applied Chemistry - New York), it has been largely neglected until the first oil crisis in the 70s, when public eye become aware of the (social) issue coming from the oil dependence. The exponential growth of Earth population and the consequent increase of energy demand and the environmental and pollution issues that characterized last decades leaded large part of scientific and (marginally) politic community to focusing its endeavours to research of more efficient way of exploiting renewable sources and to the fillip of their usage. The main drawback, which affects the usage of renewable energies, is that the supply, whether it comes from the earth or the sun, is never constant. Day turns to night, winds die down and the geothermal heat from the crust of the earth, although seemingly constant, will eventually diminish. The capability of storing energy and release it on demand, therefore, plays a crucial role in the possibility of exploiting renewable energies. The main target of this PhD study is investigation and design of devices capable of collecting thermal energy. According to the idea of gathering the largest quantity of energy in the most efficient way, as storage strategies it has been decided to adopt the latent heat thermal storage method. Suitable materials for accomplishing this task are Phase Change Materials (PCMs); they are a class of materials capable of collecting and releasing a large amount of energy during melting and freezing process at a temperature that may be useful for anthropic activities, such as air heating&cooling, domestic hot water production, industrial processes and energy production. In this thesis in particular, the existence of a convergence point between the possibility to adopt nano-enhanced material into largely used devices (heat exchangers, boilers etc.) is explored. This research has been, therefore, performed focusing mainly onto two different aspects: the possibility of improving thermal properties (melting enthalpy) of PCMs by addiction of nano-enhancer materials and on the other hand design and development of systems which imply the usage of PCMs, eventually nano-doped. The structure of this thesis reflects the division of topics and every part represents one of these task: * in the first part, Phase Change Materials a general overview on the state of art of PCMs is presented. A brief description of strategies for thermal storage is discussed and a dissertation on different typologies of PCMs, main advantages and disadvantages coming from their usage is given. The discussion than continues analysing possible ways of modelling the thermal behaviour during melting or freezing process. Both the analytical and numerical approaches are treated; * in the second part, Nanotechnology and Phase Change Materials, dissertation on thermal variations induced by inclusion of carbon nano tubes is carried out. After a snapshot on the state of the art in the field of nano-doping of PCMs, procedures and results of four commercially available paraffin waxes doped with CNTs have been discussed; * in the third part, Design and Phase Change Materials, devices which exploit PCMs have been designed and (numerically) optimized. A panel heat exchanger, capable to accomplish requirements of modularity and short time heat release has been numerically studied and optimized by genetic algorithm; the possibility of using a nano-enhanced material has been explored. Then, a system for avoiding ice formation on pavement surface during winter time has been developed. PCM elements (pipes) embedded into asphalt concrete of road pavement have been modelled using a commercial FE code. 1D and 2D models have been used and coupled with weather data collected in Trieste during the first week of January 2009; * in the last part, Conclusions, final remarks and further developments are discussed.
XXIV Ciclo
1982

2011/2012
Fossil energy sources are non-renewable being an irreplaceable endowment produced from millennia of biological and geological processes, which means that on the human time-scale they cannot be naturally regenerated and are only available in a finite amount on earth. Scientific and technological data concerning renewable fuels are exponentially growing and in parallel the governments are more and more attracted by these more sustainable energy sources. Overall, solar energy is the most abundant and easily available renewable resource which, however, has its own problems such as neither constantly available nor distributed equally over the surface of the globe. Hydrogen and various bio-fuels, such as bio-ethanol, biodiesel or biogas, have the potentiality to store the solar energy, playing a crucial role in the development of future renewable energy strategies. Nevertheless, as a general comment, it is very difficult and expensive to harness enough power from them to match the effectiveness of non-renewable resources. Thus, it is a big challenge to develop new and high efficient approach to improve the efficiency in production and use of these renewable resources. Nanotechnology is a key area that can help solving this issue. In fact, by using the tools offered by nanotechnology, it is possible to obtain tailored nanostructured catalytic materials that show remarkably better performance than that currently achievable even with state-of- the-art materials. The fields of catalysis, electrocatalysis, photocatalysis and photoelectron- catalysis are all examples of where nanotechnology is deeply impacting on current science, and in particular in energy related applications. The main focus of this PhD thesis is on nanotechnology applied to material science to enhance the performances of various on two important energy-related processes: namely the Fuel Cells (especially the Direct Alcohol Fuel Cell - DAFC) and the hydrogen production process. The H2 production processes include the electrochemical H2 production approach (the water electrolysis technique) and the photocatalytical H2 production approach (the photocatalytic decomposition of water into H2 technique). In the both the energy conversion processes, TiO2 nanotube arrays (TNTA) architectures were used as substrates and the Palladium (Pd) nanoparticles (NPs) were used as supported nanocatalysts. Therefore the most important results in this thesis are the design, realization, functional testing and characterization of supported Pd nanocatalysts on various TiO2 substrates with tailored and well-defined structures, in addition their use for energy-related applications, which are organized as follows: In the Chapter 1, the general principles of the fuel cells technique; the electrolysis technique; the TNTA substrate architecture and the principles of photocatalytic processes for H2 production are outlined or described in details. In addition, the development status and the preparation strategies of catalysts for the alcohol electrochemical oxidation are introduced in this chapter. In the chapter 2, an overview of the main characterization techniques is reported, all of which have been used in this thesis, in order to study the reactivity and the morphological and chemical properties of the samples. The aim of the present chapter is not that of providing exhaustive information about all the techniques. Rather, it is expected to furnish to the reader the main elements to better appreciate the results obtained and described in the following chapters of this thesis. Since the catalytic performance of the nanocatalysts can be finely turned by their shape, which determines surface atomic arrangement and coordination. In the chapter 3,we report a novel method of metal NPs modification, denoted as Electrochemical Milling and Faceting (ECMF), by which large supported Pd NPs (35 nm) of low-index facets supported on TNTA substrate can be milled into many small NPs (7 nm) with some HIF or high density of step atoms. By this approach, the catalytic activity of supported Pd NPs was enhanced by an order of magnitude to the ethanol electrooxidation, and was even 3 times higher than the highest value reported so far. This new approach to the synthesis of HIF-Pd NPs allows one to control metal loading, particle size and surface structure, independently from each other. Furthermore, in a practical catalytic system, such as the DAFC; the electrolysis system and the photocatalytical H2 production system, the electrochemical activity of the supported catalysts is not the only one parameter which needs to be concerned about, the other parameters for the whole test system’s establishment such as the selection and preparation of the substrate material also need to the carefully optimize. In the chapter 4, a new type of Ti network substrate with the TNTA on top was prepared and introduced into the DAFC test system and also used in the electrolysis and photocatalytical H2 production process. This kind of substrate solved the typical problems of the DAFC such as the fuel solution diffusion limitation and the stability of the as supported catalysts drop during the large current density discharge. It was also proved to be a good choice as the substrate for the Photocatalytic decomposition of alkaline ethanol aqueous into H2, which showed good performances of the H2 photochatalytic evolution. Chapter 5 is the conclusion of my PhD thesis. The results clearly demonstrate the novelty and the advantage of the present approach for the obtainment of active and stable electrochemical catalysts for the DAFC and the electrolysis system, and also represent an important step forward in the exploration of new active nanosystems for the conversion of solar light into storable chemical energy. All the findings greatly contributed to the development of catalytic materials for energy-related applications.
XXV Ciclo
1983

2011/2012
Abstract (English) The current limit of knowledge advancement in proteomic analysis of gliomas, the most common primary malignant brain tumors, is related to the high sensitivity required to detect specific biomarkers within few cells volumes. To address this problem we developed a quantitative approach to eventually enable precise, high throughput and low cost analysis of glial cells with potential capability of real-time pathological screening and subtyping of brain tumors. A device consisting in micro-fabricated wells capable to isolate and host living astrocytes was designed and functionalized. Then for the fabrication of a nanobiosensor, able to detect in small volumes the presence of specific biomarkers, ideally for multiplexing assays and meant to fit within the small dimensions of this microdevice, an approach consisting in DNA-directed-immobilization (DDI) of biotinylated antibodies (Abs) on a single stranded DNA (ssDNA) nanoarray, produced by Atomic Force Microscopy (AFM) nanografting, was carefully optimized. The proof of concept was realized with Abs specific for Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), a biomarker which belongs to the family of intermediate filaments and is crucial in cell’s differentiation, within a platform ready for parallelization. Nanosized patches of thiol modified ssDNA were prepared by AFM-based nanografting inside a matrix of self assembled monolayers (SAM) of alkanethiol-modified gold surfaces. Subsequently a complementary DNA strand (cDNA) conjugated to streptavidin (STV) was allowed to covalently bind to the patch by sequence specific DNA hybridization. Finally the biotin binding sites of STV were exploited to immobilize biotinylated monoclonal GFAP Abs (already in use for ELISA assays) on the top of those nanopatches. The efficiency of those nano-immuno arrays was tested by successfully obtaining the immobilization of purified recombinant GFAP protein, down to a concentration of 4 nM, firstly in standard PBS then in multicells’ lysate obtained from U87 glial cultures. The immobilization was detected by means of AFM measuring step by step the increases in the height of the patches and excluding modification of the roughness of both the SAM and the nanopatches after incubation with the cells’ lysate through a signal to noise ratio analysis. Titration curves for a comparison of sensitivity between this technique and the conventional ELISA assays are provided, they indeed confirm that the sensitivity of our nanosensors is at least that of ELISA, with the advantage of the scalability of the device.
Abstract (Italiano) L’attuale limite di avanzamento dello stato dell’arte dell’analisi proteomica dei gliomi cerebrali, la classe istologica di tumori cerebrali più frequente ed aggressiva, è legato alla difficoltà di individuare specifici biomarkers in piccoli volumi cellulari. Per superare questo limite si è deciso di sviluppare un approccio nanoquantitativo che consenta un’analisi proteomica precisa, ad alta sensibilità e basso costo, degli astrociti tumorali, con potenzialità di screening in tempo reale e sottotipizzazione di tumori cerebrali. Previa fabbricazione e funzionalizzazione di micro pozzetti idonei ad ospitare cellule astrocitarie, ci si è dedicati alla realizzazione di biosensori in grado di riconoscere specifici biomarkers e di essere accoppiati ai micro pozzetti. Al fine di immobilizzare anticorpi specifici per proteine di interesse in ambito neuroncologico, è stato scelto un approccio basato sul nanografting con Microscopio a Forza Atomica (AFM) e sull’immobilizzazione diretta sul DNA di anticorpi (DDI). In particolare la prova concettuale è stata condotta con anticorpi specifici per la Glial Fibrillary Acidic Protein (GFAP), un marcatore della differenziazione astrocitaria appartenente alla famiglia dei filamenti intermedi intracellulari, su una piattaforma atta ad una successiva parallelizzazione. I nanocostrutti responsabili del riconoscimento della proteina d’interesse, sono stati realizzati partendo da molecole di DNA a singola elica (ssDNA) graftate in una matrice di monostrati autoassemblati (SAM) di superfici d’oro alchiltiolo modificato. Al fine di sfruttare la capacità della streptavidina (STV) di legarsi ad anticorpi biotinilati è stata successivamente indotta l’ibridazione di un filamento di DNA complementare (cDNA) a quello precedentemente immobilizzato sulla superficie nanoassemblata che presentasse anche una coda di STV. I siti di legame per la biotina intrinseci al tetramero di STV sono quindi stati sfruttati per immobilizzare sulla superficie dei nanocostrutti degli anticorpi monoclonali biotinilati specifici per GFAP (già in uso per i protocolli ELISA). L’efficienza dei nano-immuno costrutti così ottenuti è stata testata ottenendo l’immobilizzazione di GFAP ricombinante anche a basse concentrazioni (fino a 4nM), sia in presenza di standard PBS, sia in presenza di un lisato multicellulare ottenuto da colture gliali di cellule U87. L’immobilizzazione di GFAP è stata confermata dall’incremento in altezza dei nanocostrutti misurato all’AFM escludendo modificazioni del rapporto segnale/rumore sia del SAM che dei nanocostrutti prima e dopo aggiunta di lisato multicellulare. Il limite di sensibilità del prototipo così ottenuto è stato confrontato con quello raggiungibile con protocolli standard ELISA, mostrando una sensibilità almeno comparabile all’ELISA a fronte di un maggiore potenziale diagnostico legato alla sua scalabilità.
XXV Ciclo
1979

2013/2014
The main aim of this project is to provide an answer to the following issues: - on the one hand the definition of the cellular and molecular mechanisms of action of the laser therapy and its interaction with tissues - on the other hand the safety of laser therapy and is potential consequences on cancer behaviour We created a mouse model of oral carcinogenesis to assess potential differences in tumour angiogenesis in tissues treated with laser therapy compared to the control ones, by using both histological analysis and injection of Nano FluoSpheres®. A chemical carcinogen (4-NQO) dissolved in their drinking water was administered to C57BL/6 female mice (n = 50), 8-week old, since this compound is able to induce the formation of multiple oral tumours. Among these, 25 mice underwent to 4 session of laser therapy on consecutive days employing the HPLT-1 protocol, while the remaining mice were used as controls. During the 21st week, 15 animals per group were sacrificed to perform an accurate histological analysis of their tongue, while 10 were subjected to a quantitative assessment of angiogenesis through a 3D reconstruction of the tumour vascular network after the in vivo perfusion with Nano FluoSpheres®. Any increase concerning neither the number/extension of dysplastic and neoplastic areas nor tumour angiogenesis was registered in the treated group. Moreover, treated animals showed a tendency to border and to isolate tumour areas. The laser seemed to normalize tumour vessels, promoting their covering by smooth muscle cells, thus reducing ectasia and vascular permeability, as assessed by reduced Nano FluoSpheres® leakiness. The histological analysis performed on the oral carcinogenesis mice model was compared to the images of the same tumours acquired by Narrow Band Imaging. Three raters experienced in the use of this technology analyzed the images, classifying all visible lesions according to different pathological grades; the obtained results were than compared with the histological analysis, used as reference standard. The statistical analysis revealed both high sensitivity (96%) and specificity (99%) for this technology. Supported by other studies, the Narrow Band Imaging is expected to hold great potential for the clinical evaluation of tumour angiogenesis, as well as for the early detection of potentially malignant lesions of the oral cavity. The important clinical outcome in term of wound healing and our interest in the analysis of cell behaviour after laser therapy were the starting point for the evaluation of the effect of laser therapy on different cell lines: Human Skin Fibroblasts, Human Umbilical Vein Endothelial Cells, Human Coronary Artery Smooth Muscle Cells, Neonatal Rat Ventricular Myocytes, Human Bone Osteosarcoma Epithelial Cells and Mouse B16F10 Melanoma Cells. We set different powers, energies and wavelengths, and we performed the evaluations at different experimental times (6, 24, 48 and 96 hours after the irradiation). In general, laser irradiation resulted in an increase of both cell metabolism (ATPlite) and proliferation (cell count, AlamarBlu, BrdU incorporation), albeit with different timing and intensity in the various cell lines. Consistent with published results, we observed a clear increase in cancer cell metabolism upon laser irradiation; to evaluate the cancer behaviour in vivo, the same melanoma cells were implanted in C57BL/6 female mice (n = 16), 6-week old, at the dorsal subcutaneous level. As soon as the masses were visible to the naked eye (approximately on day 10), mice were homogeneously divided into 4 groups according to tumour size: 3 groups were subjected to different laser protocols (LPLT-6; MPLT-13 and HPLT-7) for 4 consecutive days (days 11 to 14), while the fourth group was used as control. On day 15, all animals were euthanized to measure the tumour volume and weight. A deep histological analysis on tumour invasion and cancer immune response (CD1a, CD4, CD8, CD25, CD68 kp1 and Melan-A) was performed, as well as the analysis of the expression levels of cytokines involved in the immune system activation (TNFα, IFNα and IFNγ). Laser therapy did not foster tumour growth or invasiveness (CD68 kp1 and Melan-A), but rather seemed to contain its extension. Moreover, in the laser groups, tumour infiltration by immune cells was much more higher compared to the control ones (CD4+, CD8+, CD25+ cells), consistent with the increased expression of IFNγ. Of notice, CD1a positive dendritic cells were particularly abundant in the dermis in the control group, while they migrated to "wrap" the tumour in laser groups. Based on these results, we applied the same laser protocols on primary mouse bone marrow dendritic cells, with and without lipopolysaccharide stimulation. These cells did not enhance cell metabolism upon laser treatment, but reduced TNFα and increased IFNγ expression. Finally, CD-1 female mice (n = 30), age 6-7 weeks old, were used to assess the expression of different cytokines (Collagen I, Collagen III, Collagen IV, FSP1, IL-2, IL-6, IL-10, IFNα, IFNβ, IFNγ, MMP-9, PDGFβ, TGFβ, TNFα) after the laser therapy at the dorsal level with and without the presence of a skin wound. The analysis confirmed an increase in the IFNγ expression; a similar trend was registered concerning IL-2, IL-6, IFNα, IFNβ, Collagen I, Collagen III, MMP-9, PDGFβ expression in the laser treated mice compared to controls. From both in vitro and in vivo analysis we can state that the laser therapy is effective in stimulating cell metabolism and proliferation, and in boosting a potent immune response in vivo. We can therefore foresee that the treatment of cutaneous and mucosal lesions in oncological patients can be safely performed even in potentially dysplastic or neoplastic areas.
Il progetto di ricerca nasce da una duplice esigenza clinica: - da un lato quella di poter descrivere e spiegare da un punto di vista biologico e cellulare il funzionamento della terapia laser e la sua interazione con i tessuti - dall’altro quella di valutare il comportamento neoplastico in seguito a biostimolazione laser Per far ciò è stato creato un modello murino di carcinogenesi della lingua, al fine di valutare, sia da un punto di vista istologico sia attraverso l’iniezione di Nano FluoSfere®, se vi siano differenze riguardanti l’angiogenesi tumorale nei tessuti irradiati con laser terapia rispetto ai controlli. A 50 topi (ceppo C57BL/6, sesso femminile, età 8 settimane) è stato somministrato un carcinogeno chimico (4-NQO) disciolto in acqua, noto per indurre la formazione di multipli tumori del cavo orale. Di questi, 25 sono stati sottoposti a 4 sessioni in giornate consecutive di laser terapia utilizzando il protocollo HPLT-1, mentre i rimanenti 25 sono stati utilizzati come controlli. Alla 21° settimana 15 animali per gruppo sono stati sacrificati per eseguire un’accurata analisi istologica della lingua, mentre i restanti sono stati sottoposti ad una valutazione quantitativa dell’angiogenesi tramite ricostruzione 3D della rete vascolare neoplastica dopo perfusione in vivo con Nano FluoSfere®. Non è stato riscontrato alcun aumento delle zone displastiche, neoplastiche, né dell’angiogenesi nei topi trattati con il laser. In particolare, gli animali trattati con il laser hanno presentato una tendenza maggiore ad isolare le zone carcinomatose rispetto ai siti sani. Il laser ha normalizzato i vasi tumorali, inducendone il rivestimento da parte delle cellule muscolari lisce e riducendo l’ectasia e la permeabilità vascolare, senza stravaso di Nano FluoSfere®. I risultati istologici ottenuti sul modello di carcinogenesi orale animale sono stati comparati alle immagini degli stessi tumori, acquisite tramite fibroscopia in Narrow Band Imaging. Tali immagini sono state analizzate da tre raters esperti nell’uso di tale metodica permettendo di eseguire un’attenta analisi sulla neo-angiogenesi. L’analisi statistica ha messo in luce alti indici di sensibilità (96%) e specificità (99%) per questa tecnologia. Supportata da altri studi, la Narrow Band Imaging potrà avere importanti implicazioni sulla valutazione clinica dell’angiogenesi tumorale, così come sulla diagnosi precoce delle lesioni potenzialmente maligne del cavo orale. Visti i risultati ottenuti a livello clinico sulla guarigione delle ferite e visto l’interesse ad analizzare il comportamento cellulare, la terapia laser è stata inoltre testata su differenti linee cellulari: fibroblasti cutanei umani, cellule endoteliali umane derivate da cordone ombelicale, cellule muscolari lisce di arterie cardiache umane, miociti ventricolari di ratto neonatale, cellule di osteosarcoma e di melanoma murino. Sono state utilizzate diverse potenze, energie e lunghezze d’onda, nonché diversi tempi sperimentali (6, 24, 48 e 96 ore a distanza dall’irraggiamento), registrando, seppur con tempistiche ed efficacia differenti, un aumento sia del metabolismo (ATPlite) sia della proliferazione nei gruppi laser (conta cellulare, AlamarBlu, incorporazione di BrdU) in tutte le linee cellulari. Visti i risultati ottenuti su cellule neoplastiche in vitro, le medesime cellule di melanoma sono state impiantate in 16 topi (ceppo C57BL/6, sesso femminile, età 6 settimane) a livello sottocutaneo dorsale. Non appena la massa è risultata visibile ad occhio nudo (giorno 10) i topi sono stati suddivisi in 4 gruppi omogenei per dimensioni del tumore: tre gruppi sono stati sottoposti a differenti trattamenti laser (LPLT-6; MPLT-13 e HPLT-7) per 4 giornate consecutive (giorni 11-14), mentre il quarto è stato utilizzo come controllo. Al giorno 15 tutti gli animali sono stati sacrificati per misurare il volume ed il peso della massa tumorale, per l’analisi dell’invasione e della risposta immunitaria neoplastica (CD1a, CD4, CD8, CD25, CD68 kp1 e Melan-A) tramite colorazioni immunoistochimiche, e per l’analisi dei livelli di espressione di citochine coinvolte a livello immunitario (TNFα, IFNα e IFNγ). La terapia laser non ha provocato una maggior estensione né aggressività delle neoplasie, che al contrario sono risultate più contenute e di dimensioni minori rispetto al gruppo controllo (CD68 kp1 and Melan-A). Inoltre, nei gruppi laser è stato evidenziato un incremento della risposta immunitaria (CD4+, CD8+, CD25+), consistente con l’aumentata espressione di IFNγ. Da sottolineare la diversa disposizione delle cellule dendritiche CD1a positive, maggiormente presenti a livello dermico nel gruppo controllo, e migrate a “contornare” la neoplasia nei gruppi trattati. Sulla base di questi risultati abbiamo utilizzato i medesimi protocolli laser per irradiare cellule dendritiche primarie di topo, con e senza stimolazione mediante lipopolisaccaride. Queste cellule non hanno risposto in termini di modificazione del metabolismo, ma hanno ridotto l’espressione di TNFα e incrementato quella di IFNγ. Infine, in un modello murino sono stati analizzati 30 topi (ceppo CD-1, sesso femminile, età 6-7 settimane) che hanno subito la terapia laser a livello dorsale, con e senza la presenza di una ferita cutanea. L’analisi dell’espressione di un pannello di citochine (Collagene I, Collagene III, Collagene IV, FSP1, IL-2, IL-6, IL-10, IFNα, IFNβ, IFNγ, MMP-9, PDGFβ, TGFβ, TNFα) ha portato a confermare nuovamente l’incremento di IFNγ, ma anche di IL-2, IL-6, IFNα, IFNβ, Collagene I, Collagene III, MMP-9, PDGFβ nei topi laser trattati rispetto ai controlli. Dai risultati ottenuti in vivo ed in vitro possiamo affermare che la laser terapia è efficace nella stimolazione cellulare, aumentandone il metabolismo e la proliferazione, e soprattutto di stimolare una potente risposta immunitaria in vivo. Possiamo pertanto prevedere che il trattamento di lesioni e ferite mucose e cutanee tramite biostimolazione laser potrà essere eseguito in sicurezza anche in aree potenzialmente displastiche o neoplastiche.
XXVII Ciclo
1987

2009/2010
Riassunto Presso la linea di diffrazione MCX (Material Characterization by X-ray diffraction) del Sincrotrone di Trieste e' stata messa a punto una stazione sperimentale che consente di eseguire analisi "in situ" di nanostrutture. Il sistema e' indipendente dal diffrattometro e consente di ottenere in tempi ridotti (grazie all’uso di un Imaging Plate come detector) pattern di diffrazione da polveri o film sottili. La stazione sperimentale e’ dotata di un forno che puo’ riscaldare i campioni fino a 1000ºC. Inoltre e' stato implementato un sistema che consente il flusso di gas attraverso i campioni (contenuti in capillari di vetro o quarzo). L'interfacciamento e' stato realizzato attraverso il software Labview. La struttura e’ stata collocata su un tavolo mobile per agevolarne lo spostamento nell'hutch solo quando necessario. Nel 2009 e' stata accolta l’utenza che ha portato a termine le prime misure. Sono previste le necessarie modifiche che daranno la possibilita' di usare la stazione anche per misure SAXS e di reazioni catalitiche. Abstract An Experimental Station has been set up at the MCX (Material Characterization by X-ray diffraction) beamline at the Italian National Synchrotron Radiation facility ELETTRA (Trieste, Italy). The main goal of the system is the possibility to perform “in situ” analysis of nanostructures. This new capability is independent of the diffractometer (an Imaging Plate has been chosen as a detector) and allows to reduce the required times to obtain diffraction patterns from powder samples and thin films. The Experimental Station is equipped with a furnace that heats the samples till 1000ºC, while the implementation of a gas line allows to flow gases through the samples (placed in glass or quartz capillaries). A Labview program has been developed to control the system. The system is located on a wheeled table, so it can be easily moved inside and outside the hutch only when necessary. In 2009, the first users performed their experiments by using this experimental station. Some developments are planned to allow both Small Angle X-ray Scattering (SAXS) experiments and to follow sample behaviour during catalytic reactions.
XXIII Ciclo
1975

2009/2010
ABSTRACT DEVELOPMENT OF MICROFLUIDIC DEVICES FOR BIOMEDICAL APPLICATIONS OF SYNCHROTRON RADIATION INFRARED MICROSPECTROSCOPY by Birarda Giovanni The detection and measurement of biological processes in a complex living system is a discipline at the edge of Physics, Biology, and Engineering, with major scientific challenges, new technological applications and a great potential impact on dissection of phenomena occurring at tissue, cell, and sub cellular level. The present PhD Thesis dealt with the development of methodologies and technologies to transform InfraRed MicroSpectroscopy (IRMS) into a mature technique to observe in real time biological events, and improving its ability to perform in vitro bio-experiments under physiological conditions. This goal has been achieved through the exploitation of microfabrication techniques to realize lab-on-chip (LOCs) transparent both in the Infrared and Visible region (IR-Vis), which allows measuring living cells. Up to now, IRMS has been almost exclusively employed for studying fixed cellular samples or tissues, allowing acquiring only “still frames” of the phenomena under investigation. The reason for that is to be ascribed both to the spectroscopic difficulties in working in water based environment and to the manufacturing constrains of the most common IR transparent materials, that limit the design flexibility of LOC devices suitable for IR analysis. We have overcome the so called “water absorption barrier” by extending microfluidic concepts to calcium fluoride, implementing innovative fabrication solutions for the realization of custom devices for IRMS studies of living cells subjected to different chemical and physical stimuli. Exploiting the high brightness of Synchrotron Radiation (SR) IR sources, that allows sampling at diffraction limited spatial resolution, we demonstrated the feasibility of the detection of intra-cellular processes. In parallel, novel strategies for IR data acquisition and analysis have been developed, opening the possibility to execute novel original experiments. Our studies were focused on the immune system, and in particular in evaluating the biochemical rearrangements characterizing human circulating leukocytes during their deformation, either when induced by purely mechanical stimuli or in response to a chemical gradient. Thanks to the microfabrication approach, we were able to mimic the cellular microenvironment both for studying pressure-driven micro-capillary circulation and chemically-driven extravasations of white blood cells. The present Thesis demonstrates that the “synergy of micro-approaches”, or rather the combination of micro-fabrication and IR micro-spectroscopy, can be exploited for extending the frontiers of Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) to unexplored fields of life sciences. Through the careful control of the cellular microenvironment, crucial for an accurate data analysis as well as fundamental for the reliability of biological conclusions, some light could be shed on phenomena never investigated with IRMS, such as mechano-biology we directly explored, pulling down the water-barrier.
RIASSUNTO SVILUPPO DI DISPOSITIVI MICROFLUIDICI PER APPLICAZIONI BIOMEDICHE DELLA MICROSPETTROSCOPIA INFRAROSSA CON RADIAZIONE DI SINCROTRONE di Birarda Giovanni L’identificazione e la quantificazione di processi biologici in un complesso sistema vivente può essere ritenuta una disciplina al confine tra la Fisica, la Biologia e l’Ingegneria, con importanti sfide scientifiche, innovazioni tecnologiche e un grande impatto sulla dissezione di fenomeni a livello tissutale, cellulare e sub cellulare. Il presente lavoro di Dottorato ha avuto come obiettivo lo sviluppo di metodologie e tecnologie atte a rendere la MicroSpettroscopia InfraRossa (MSIR) una tecnica matura allo studio in tempo reale di fenomeni biologici, permettendo di effettuare esperimenti “in vitro” in condizioni fisiologiche. Questo obiettivo è stato raggiunto tramite l’utilizzo delle tecniche di microfabbricazione per la realizzazione di un “Lab-on-Chip” (LOC) trasparente sia nella regione dell’infrarosso che nel visibile, tramite il quale misurare cellule vive. Infatti fin’ora la MISR è stata impiegata quasi esclusivamente per lo studio di campioni di tessuti o di cellule fissati, permettendo di registrare solo “singoli fotogrammi” dei fenomeni sotto indagine. La ragione di questa limitazione è da imputarsi alle difficoltà spettroscopiche che si incotrano nell’investigazione di sistemi acquosi e ai limiti di fabbricazione dei più comuni materiali IR trasparenti, che hanno limitato la flessibilità di design necessaria alla realizzazione di LOC adatti alle analisi tramite MSIR. Siamo riusciti a superare la cosiddetta “barriera di assorbimento dell’acqua” tramite l’estensione dei concetti della microfluidica e dellamicrofabbricazione al calcio fluoruro, implementando soluzioni fabbricative che hanno permesso lo studio tramite MSIR di cellule viventi sottoposte a differenti stimoli sia di natura chimica che fisica. Grazie all’alta brillanza della Radiazione di Sinctrotrone (SR) IR, che permette il campionamento con una risoluzione spaziale al limte di diffrazione, abbiamo dimostrato la fattibilità dell’individuazione dei processi intra celluari. Contemporaneamente sono state sviluppate nuove strategie per l’acquisizione dei dati e per la loro analisi, permettendo il design di esperimenti innovativi. I nostri studi si sono concentrati sullo studio del sistema immunitario, in particolare nella valutazione della risposta biochimica caraterristica dei leucociti circolanti durante la loro deformazione, sia indotta da cause di tipo puramente meccanico, sia in risposta a gradienti chimici. Grazie alla microfabbricazione, siamo stati capaci di simulare il microambiente cellulare sia per lo studio dei globuli bianchi durante la circolazione microcapillare sia durante l’extravasazione indotta da gradienti chimici. La presente Tesi dimostra che la sinergia dei “micro” approcci, o piuttosto la combinazione di microfabbricazione e microspettroscopia IR, può essere usata per estendere le frontiere della MSIR a nuovi campi nello studio delle scienze della vita. Attraverso il preciso controllo del microambiente cellulare, cruciale per un’accurata analisi dei dati e fondamentale per l’attendibilità delle conclusioni biologiche, si possono chiarire fenomeni finora mai investigati tramite MSIR, come la meccano-biologia che abbiamo esplorato direttamente, abbattendo la barriera dell’acqua.
XXIII Ciclo
1981

2010/2011
Presented in this thesis are experimental results obtained on the preparation of tailored architectures based on transition metals for applications in heterogeneous catalysis. The major focus of these studies was the preparation of active and thermally stable materials for several catalytic reactions and the accurate study of size-activity relationships in ceria-based systems. An array of preparation procedures was described starting with relatively simple approaches to more advanced methods based on self-assembly and the preparation of artificial atoms. Detailed catalytic and characterization studies unambiguously demonstrated the properties and functions of the prepared materials as well as their different and improved characteristics with respect to state-of-the-art conventional systems. Initially, relatively simple procedures for the encapsulation of Pd and Au inside ceria layers demonstrated the promise of the embedding procedure and its limitations (Chapter 3). In the case of Pd catalysts, improvements in stability for the water-gas-shift reaction of Pd@CeO2 over a Pd/CeO2 catalyst formed by impregnation suggested that the formation of Pd-ceria, core-shell catalysts have great promise for this application. However, the need to develop core-shell structures that effectively prevented Pd sintering but left the Pd accessible to gas-phase reactants was imperative. In the case of Au catalysts, very good catalytic activity under real PROX conditions was obtained with low metal loading (1 wt %). Moreover, the small deactivation observed for the embedded Au@CeO2 catalysts after aging at 250 °C was fully reversible upon mild oxidation treatment. In both cases, it was clear that a correct balance between encapsulation of the particles and manipulation of the pore structure around them was fundamental to achieve materials with the desired performance and thermal stability. In order to better manipulate the metal-support interface and tailor the core-shell structure to a fine extent, we then prepared functionalized Pd and Pt nanoparticles with rather small average diameter and narrow size distribution (Chapter 4). The main focus of the chapter was to prepare particles that exposed on the edge of the monolayer carboxyl groups by using a functionalized protecting thiol (11-mercaptoundecanoic acid, MUA), useful for the subsequent reaction with the metal oxide precursors. A systematic study of the synthetic conditions applied to the production of the nanoparticles (reaction temperature, thiol/Pd molar ratio and reductant addition rate) as well as their morphological outcome has been properly addressed. The procedure was then extended, with minor modifications, to the preparation of MUA-Pt nanoparticles. Finally, the MUA-Pd nanoparticles have been scrutinized as highly efficient, easily handled and re-usable catalysts for Suzuki cross-coupling reaction with different aryl halides. The functionalized Pd and Pt nanoparticles were then employed for the successful preparation of dispersible metal@oxide core-shell nanostructures (Chapter 5). We showed that the method is versatile allowing the preparation of several combinations using Pd or Pt as metal core and titania, zirconia or ceria as oxide shell. The method is based on the self-assembly between the MUA-Pd or MUA-Pt nanoparticles and titanium, zirconium or cerium alkoxides. The core-shell nanostructures were effectively dispersible in a range of organic solvents without any sign of agglomeration. We demonstrated that the dimension of the metal core and the thickness of the oxide layer could be tuned and that the metal phase was accessible. The applicability of these structures for the preparation of heterogeneous catalysts was then demonstrated in several areas. In particular, the results showed that the ceria in the core-shell catalysts deposited onto alumina exhibited different redox properties from those found for the ceria in conventional catalysts, possibly due to structural changes associated with the Pd-core template (Chapter 6). Even when the Pd in the oxidized catalysts was accessible to gas-phase reactants, reduction of the ceria could cause encapsulation of the Pd, which can in turn lead to deactivation of the catalyst for reactions like water-gas shift. However, these same properties can be advantageous for other applications, such as the case of SOFC electrodes. In addition to the high thermal stability of the core-shell catalysts, it was demonstrated that the synergic interactions between Pd and ceria increased the oxidation activity of Pd/CeO2 catalysts with the consequence that high power densities and thermal stabilities have been obtained for their use as fuel cell materials under high-temperature reaction conditions. The method for the preparation of dispersible core-shell structures was then adapted for their deposition around Multi Wall Carbon Nanotubes (MWNTs) (Chapter 7). In particular, a modular procedure for the preparation of nanocomposites where MWNTs were embedded inside mesoporous oxide layers containing metal particles dispersed within was reported. We showed that the different materials have very promising catalytic activity for different heterogeneous reactions. In particular, in stark contrast with what observed with the Pd@CeO2 structures dispersed on alumina (Chapter 6), it was shown that the nanocomposites with MWNTs were much more stable under WGS conditions, demonstrating the importance of the support properties to tune the final catalytic performances. A further application of the dispersible Pd@CeO2 structures consisted in their deposition as single entities onto a modified alumina (Chapter 8). The materials showed outstanding catalytic properties for methane oxidation. The synergic effect between the core and the shell components and the self-assembly of the building blocks in solution helped to form stable and active materials that demonstrate unusual, promoting catalytic properties. In a final stage, we developed a unique capability of prepared d8 metal particles (Ni, Pd and Pt) to study the size-activity relationships of ceria-based materials (Chapter 9). The extremely precise particle size was advantageously employed to prepare catalysts with finely tuned metal-support interface. We definitely proved that CO oxidation on the d8 metals deposited on CeO2 is size-dependent, with a direct participation in the reaction of metal atoms at the perimeter and ceria oxygen lattice. This study is of guidance for the preparation of embedded systems with tailored interface to further enhance the performance of the core-shell-type catalysts. In conclusion, this thesis provided numerous methods for the preparation of tailored nanoarchitectures and their application in several areas of heterogeneous catalysis. The work was based on the precise tailoring of the building blocks in order to organize them trough self-assembly and supramolecular chemistry principles in hierarchical, final structures with defined metal-support interfaces. It is expected that these principles will be of guidance for the development of this concept and its extension to other areas, associated with the increasingly better ability to further tune the special properties of the materials presented in this thesis.
XXIV Ciclo
1984

2010/2011
Under physiological conditions in the brain, molecules are released with high spatial and temporal resolution. A lot of efforts have been done in the last years in order to develop techniques that mimic this situation. Among them, we mention the use of micropipettes for the ejection of fluids, the use of AFM (Atomic Force Microscopy), microfluidic devices and optical manipulation. The latter approach exploits light to manipulate the samples, e.g. to create transient pores in the cell membrane or to move small objects carrying a stimulus. This Thesis concerns with the development of new techniques for the local delivery of molecules based on optical manipulation technologies, and in particular on optical tweezers. Sub-micrometer particles in a compact trap, such as the single-beam gradient or optical tweezers, can be localized within a small fraction of a wavelength of light or moved over long distances of many centimeters without any mechanical contact. A three-dimensional trap is simply created by focusing a laser beam through a microscope objective with high numerical aperture. We studied three types of vectors for local delivery of molecules, which can be optically manipulated: microbeads, micron-sized liposomes and Quantum dots (Qdots). Silica microbeads can be covalently functionalized on their surface with the protein of interest and placed in contact with the desired part of a cell. In order to validate the technique, we functionalized beads with a secretory molecule, the neurotrophin Brain-derived neurotrophic factor (BDNF). BDNF is a key regulator of neuronal development and plasticity. We showed that single BDNF-coated microbeads can be extracted with optical tweezers from small reservoirs and positioned with submicrometric precision to specific sites on the dendrites of cultured hippocampal neurons. Localized contact of microbeads functionalized with BDNF induced focal increase of Calcium signaling in the stimulated dendrite, specific activation of the TrkB receptor pathway and influenced the development of growth cones. Remarkably, a single BDNF-coated bead positioned on a dendrite was found to be enough for TrkB phosphorylation, an efficient and long-lasting activation of Calcium signaling in the soma, and c-Fos signaling in the nucleus, comparable to bath stimulation conditions. Moreover, since BDNF is covalently cross-linked to the bead surface we could demonstrate that activation of some of the TrkB receptor pathway does not necessarily require BDNF endocytosis. In the case of liposomes, the molecules of interest were encapsulated within their lumen. Single liposomes were trapped and transported by means of optical tweezers to the site of stimulation on cultured neurons. Finally, the release of liposome content was induced by application of UV-pulses that broke the liposome membrane. In order to test the effect of the UV-induced release, liposomes with a diameter ranging from 1 to 10 μm (fL to pL volumes), were filled with KCl and tested on neuronal cells. Neuronal cultures, loaded with Ca2+ dye, were monitored by imaging intracellular Ca2+. An efficient release from the liposomes was demonstrated by detectable Calcium signals, indicating induced depolarization of the neuronal cells by KCl. Afterwards, this technique was used to address a biological issue, that is the effect of two proteins (Semaphorin 3A and Netrin-1) on growth cones. The growth cone is an intracellular apparatus located at the tip of the neurite of developing neurons. Its motility governs axonal path-finding and the construction of neuronal networks. Growth cones are highly dynamic structures that respond to external stimuli turning towards or away from the chemical gradient. We were able to demonstrate an attractive effect of Netrin-1 on the growth cones of primary hippocampal neurons. On the contrary, Semaphorin 3A showed a repellant behavior. To correlate the high resolution of vector manipulation with high resolution of imaging we used STimulated Emission Depletion (STED) to investigate the intimate organization of two main cytoskeleton components: actin and tubulin filaments. STED microscopy allowed imaging of actin bundles in the filopodia and organized network in lamellipodia with un-precedent resolution, beyond the diffraction barrier. Lastly, we used liposomes to encapsulate Quantum dots. Qdots are bright and photostable nanocrystals. Due to their small size, similar to that of proteins, Qdots may be endocyted along the receptor-mediated endocytosis pathway, when they are functionalized with the appropriate ligand. As case study we considered the BDNF-TrkB endocytotic pathway. We optimized the protocol for the direct binding of BDNF to Qdots and we demonstrated the possibility of encapsulating and releasing them from liposomes. Concluding, two different approaches for local stimulation of neurons, based on optical manipulation of microvectors, were presented and validated in this thesis. Indirect optical manipulation of nanovectors (Qdots) encapsulated in liposomes has been demonstrated as well. The techniques were then successfully applied to address some biological issues, that in turn required the optimization of other imaging tools (super resolution microscopy and Qdots).
XXIV Ciclo
1984

2010/2011
The objective of this project was to develop new nanotechnology-based strategies to increase embryonic stem cells (ESCs) differentiation into neuronal lineage. In particular it was chosen to investigate a nanostructured physical support for in vitro stem cell culture in which both the nanometrical topography and mechanical properties are well controlled and characterized. Nanopatterned substrates were designed to have physical properties as close as possible to the in vivo microenvironment where stem cells normally grow and differentiate based on the assumption that mimicking the natural niche equilibrium is of fundamental importance for stem cell fate. First, an original nanotechnological approach to fabricate the substrates for in vitro neuronal precursors culture was developed. Secondly the substrate geometrical and mechanical parameters were optimized in order to achieve the maximum differentiation yield of ESCs-derived neuronal precursors (NPs). It was reached a neuronal yield of 74±7% at 48 hours after NPs differentiation induction, which represents the highest yield ever published using nanopatterned substrates with controlled and highthroughput reproducible nanometrical features for cell culture. Moreover it was demonstrated that the mechanical properties of the substrate play a major role with respect to other parameters, such as substrate composition and geometry. A time-dependent analysis showed that the first hours after cell seeding are crucial in the determination of the final differentiation yield. A further control of ESCs differentiation by manipulating the substrates physical parameters, required a deep understanding of the cell-substrate interaction, therefore it was studied the behavior of neuronal precursors when placed and grown on different artificial substrates using atomic force microscope, scanning electron microscope, and single cell force spectroscopy measurements. The latter lead to a quantification of the forces that develop between neuronal precursors and substrate and provided a clear relationship between adhesion forces and differentiation. My results suggested the importance of the physical parameter involved in the regulation of the neuronal differentiation and to new guidelines for future applications in regenerative medicine.
XXIV Ciclo
1984

2012/2013
Scopo della tesi è l’utilizzo dell’elevato grado di discriminazione della tecnica APECS (spettroscopia in coincidenza fotoelettrone- elettrone Auger) per ottenere informazioni singolari, altrimenti non ottenibili con spettroscopie più tradizionali, in campi di applicazione di ampio interesse nelle scienze dei materiali, come i sistemi magnetici a bassa dimensionalità o i materiali ibridi in cui molecole organiche sono assemblate su substrati conduttori o semiconduttori, Nei decadimenti Auger core-valenza-valenza, si creano due lacune in banda di valenza. Nella spettroscopia Auger tradizionale, si misura solo uno dei due elettroni che lasciano la banda (l’elettrone Auger) e di conseguenza si perdono molti dettagli inerenti l’altro elettrone che va a riempire il livello di core. Nell’APECS, la detezione in coincidenza dell’elettrone Auger insieme al fotoelettrone che lo ha generato permette di porre dei vincoli su tale elettrone che lascia la banda di valenza e va a riempire la lacuna di core, fornendo così informazioni aggiuntive sullo stato finale Auger a due lacune. Nella tecnica APCES risolta in angolo (AR-APECS), sfruttando alcuni vincoli posti sui sottolivelli m degli elettroni emessi, si raggiunge una selettività in spin sullo stato finale a due lacune, che peraltro è sensibile anche alla correlazione elettronica. La tecnica AR-APECS è stata utilizzata per lo studio di sistemi ferromagnetici (FM) metallici e antiferromagnetici (AFM) di ossidi di metalli. Misure AR-APCES per il sistema FM Ni/Cu(001) mostrano la sensibilità della tecnica allo spin-splitting della banda di valenza, come pure agli effetti di correlazione nella forma di riga Auger M23M45M45 del nichel. Un forte effetto di correlazione è attribuito all’interno della sola sottobanda maggioritaria. Si sono eseguiti anche studi in funzione dello spessore i quali suggeriscono che tale correlazione nello stato finale Auger a due lacune segue un andamento di tipo di confinamento quantistico. Nel caso del sistema AFM NIo/Ag(001), gli spettri AR-APECS acquisiti nel fase AFM mostrano un forte dicroismo geometrico dovuto alla selettività in spin che agisce sui termini di multipletto (singoletto, tripletto, quintetto) che sono tipici di una descrizione di tipo atomico. Tale dicroismo svanisce completamente nella fase paramagnetica. Ciò apre alla possibilità di monitorare le transizioni magnetiche da un punto di vista locale, senza dover riferirsi a un ordine a lungo raggio della periodicità cristallina o misurazioni termodinamiche di volume. Dall’altro lato, la tecnica APECS offre la possibilità di sondare la banda di valenza in modo chimicamente selettivo, sfruttando lo shift chimico dei livelli di core (una tipica caratteristica della tecnica di fotoemissione XPS) del fotoelettrone rivelato in coincidenza con l’elettrone Auger. Con la tecnica APECS si è studiato, con un approccio atomico, il fenomeno di trasferimento di carica che coinvolge la macromolecola rame-ftalocianina (CuPC) all’interfaccia con una superficie di alluminio. I risultati indicano che il trasferimento di carica dal substrato di alluminio alla molecola non è uniformemente distribuito su tutta la molecola, ma gli anelli benzenici mostrano un’entità maggiore di trasferimento di carica rispetto agli anelli pirrolici.
XXVI Ciclo
1985

2010/2011
The objectives of this doctoral research involve the development of tools, in particular micro-nano devices for the study of mechanical properties of single living cells and for the analyses of mechanosensitive ionic channels (MSCs). BioMEMS (Biological Micro Electro Mechanical Systems) have been devised and used to investigate MSCs and the cell mechanics in a completely innovative way. Living cells in adhesion can be studied in a physiological condition; the mechanical stretch can be controlled and measured; the MSCs activity can be evaluate using different techniques from patch clamp to AFM (atomic force microscope) or fluorescence essays. Silicon BioMEMS have been designed and tested to evaluate morphological modifications of the stretched cells, and hysteretic behavior has been assessed. However, since they are not transparent, the use of this devices has been limited. Also completely transparent devices have been designed and microfabricated. These BioMEMS will allow testing cells and combining measurements of the mechanical properties, the cell’s morphology (with optical systems and atomic force microscopy), and MSCs activity (with patch clamp and/or conductive AFM). In this doctoral research, BioMEMS have been devised and realized, the measurement set-up optimized and a surface treatment protocol developed.
XXIV Ciclo
1980

2011/2012
In the last years, gold nanoparticles (AuNPs) protected by an organic shell of ligands have received a large interest for applications in the biomedical field in particular for diagnosis, imaging and therapy. This class of nanomaterials is largely used because of the easy of synthesis with different core sizes and shapes and controlled dispersion. Moreover, NPs can be protected by a large variety of organic compounds, with different functionalities and to allow the linkage of drugs and biomolecules. The nature of the ligand is responsible of the solubility of the NPs and could be also tuned in order to have NPs soluble in water and in the biological environment. Additionally, at least gold is no toxic, biocompatible and could be easily released from the body. The present thesis is focused on three projects. The first one deals with the study of the morphology of gold nanoparticles coated by a mixture of hydrogenated and fluorinated ligands which solubility in water is favored by the presence of PEG chains. Few years ago, our research group has shown that mixtures of these hydrogenated and fluorinated ligands, forming the monolayer of gold nanoparticles, phase-segregate in separated domains because of the reciprocal immiscibility of the two chains. During this thesis, we wanted to investigate more deeply the organization of such monolayers and in particular, to understand the shape and the size of these domains. In collaboration with the group of Prof. S. Pricl and Prof. M. Fermeglia of the University of Trieste, in silico experiments have been performed in order to predict the size and the shape of these domains. Moreover, we have studied how the shape and the size of these domains is influenced by the ratio between the two thiols, the size of the core and the difference in length between the two ligands. The obtained results were supported by further ESR experiments performed by Prof. Lucarini of the University of Bologna. ESR experiments have allowed us to estimate the value of the affinity constants of the probe for the fluorinated and hydrogenated domains of the monolayer and to establish that mixed monolayers have chemical and physical properties that cannot be predicted by simply knowing the properties of homoligand monolayers. The results that have been reported in a recent publication on ACS Nano are presented in Chapter 3. The second project of this PhD thesis is based on the synthesis and characterization of water soluble gold nanoparticles coated by different ratios of charged hydrogenated ligands and commercially available fluorinated ligands. Some of these nanoparticles, with an average core diameter between 3 and 4 nm, have been used for preliminary investigations in vitro. In particular, cell membrane permeation and the cellular toxicity have been evaluated. These experiments have been performed in collaboration with the group of Prof. Stellacci in IFOM-IEO, Milan. Preliminary results are described in Chapter 4. The last part of this PhD project is focused on the synthesis and characterization of NPs coated by mixtures of commercially available fluorinated and hydrogenated thiols. These NPs present the advantages over those described in Chapter 3 and Chapter 4 because they are suited for a direct “visualization” by STM experiments and may help us in understanding the rules governing the organization of mixtures of fluorinated and hydrogenated ligands on a curved surface. The choice to synthesize NPs without charged groups is dictated by the limitations of STM technique. In Chapter 5 synthetic aspects and preliminary STM results would be presented.
XXV Ciclo
1983

2012/2013
Dye-sensitized solar cells (DSSCs) represent a promising alternative to silicon-based technology. From the first publications about DSSCs in the 90s, they are considered an important breakthrough for achieving high efficiency by using relatively inexpensive and abundant materials. Stability and efficiency are two crucial points in the development of this new class of hybrid photovoltaic devices. Most of the DSSC studies carried out over the past twenty years are based on the optimization of these two aspects. In particular, no particular efficiency improvement was obtained in the last period, although many efforts have been made for the research of appropriate solutions able to allow to fabricate more efficient devices. In this scenario, the topic of interest for this thesis is to further enhance the photovoltaic performance of DSSCs by integrating a nano-engineered TiOx photoanode obtained by means of a new nanostructuring method. This novel method, called ASB-SANS (Auxiliary Solvent-Based Sublimation-Aided NanoStructuring) allows the fast nanostructuring of a material in conditions of room temperature and atmospheric pressure. The nanostructuring process occurs by means of an auxiliary sublimating substance that, after having influenced the spatial arrangement of the material to be nanostructured, sublimates away from the system spontaneously. So-obtained TiOx photoanodes are characterized by an inner surface area which is higher than that of commonly used photoanodes. This implies that higher dye loading values are possible, in turn meaning an increase of photogenerated charge carriers upon sunlight absorption, hence an overall increase of the DSSC efficiency. This thesis is structured as following: - Chapter 1 is a general introduction to the photovoltaics and dye-sensitized solar cells, such as the operating principles and the characteristics of the dye cell; - Chapter 2 presents the motivation and objectives of PhD work, with particular interest in the state of art on the semiconductor layer optimization; - Chapter 3 contains a description of the two instrumental systems assembled by the author and colleagues for the characterization of photovoltaic devices (current/voltage recording system and IPCE system). A particular focus is put on the development of a tool for the determination of the photovoltaic quantum efficiency obtained by the conversion of a common UV-Vis spectrometer; - Chapter 4 is focused on the description of two methods for the determination of the active sites (dye grafting points) of the TiOx surface: the first based on the acetic acid adsorption and the second on the dye molecules adsorption. These methods are used for the characterization of all fabricated photoanodes; - Chapter 5 starts with the proven effectiveness of the ASB-SANS method applied to nanostructuring, over relatively large areas, a semiconducting polymer widely used in organic solar cells. The chapter is then focused on the description of the ASB-SANS method applied to fabricate our nano-engineered photoanodes; - Chapter 6 presents the results obtained by the application of the nano-engineered photoanodes in photovoltaic devices; - Chapter 7 reports some final conclusions together with our outlooks in the future research and development of the nano-engineered photoanodes for dye-sensitized solar cells.
Le celle solari a colorante organico (DSSC) proposte da Grätzel rappresentano una promettente alternativa alle tecnologie basate sul silicio già in commercio. Dalle prime pubblicazioni negli anni 90 esse hanno reppresentato un importante passo avanti per raggiungere un’efficienza relativamente alta utilizzando materiali poco costosi e abbondanti in natura. Gli aspetti più importanti per lo sviluppo di questa tecnologia sono la stabilità e l’efficienza, su cui si fonda la maggior parte degli studi sulle DSSC condotti negli ultimi vent’anni. In particolare, nonostante gli sforzi enormi nella ricerca di soluzioni appropriate che consentissero di fabbricare dispositivi più efficienti, nessun particolare incremento di efficienze è stato registrato. In questo scenario, il presente lavoro di tesi ha come scopo il miglioramento della performance fotovoltaica di DSSC attraverso l’integrazione al loro interno di un fotoanodo di TiOx nanostrutturato utilizzando un nuovo metodo di fabbricazione. Questo metodo, denominato ASB-SANS (Auxiliary Solvent- Based Sublimation-Aided NanoStructuring) permette la nanostrutturazione di un materiale senza dispendio di tempo ed in condizioni di temperatura ambiente e pressione atmosferica. La nanostrutturazione di un materiale avviene per mezzo di un sublimante ausiliario che, dopo aver influenzato la disposizione spaziale del materiale, si allontana dal sistema spontaneamente per semplice sublimazione. I fotoanodi di TiOx così ottenuti presentano una superficie esposta all’attacco del colorante maggiore di quella esposta generalmente dai fotoanodi comunemente impiegati. Ciò comporta un aumento della quantità di colorante che il fotoanodo può adsorbire che si traduce in un aumento della quantità di portatori di carica che si possono generare per effetto dell’assorbimento della luce solare. Il miglioramento della corrente generata nel dispositivo influenzerà positivamente l’efficienza globale della cella DSSC. Il presente lavoro di tesi è strutturato nel seguente modo: - il Capitolo 1 costituisce l’introduzione alla tematica di interesse con un approfondimento descrittivo dei componenti di una DSSC e del suo funzionamento; - il Capitolo 2 espone la motivazione e gli obbiettivi del lavoro di dottorato con particolare interesse verso lo stato dell’arte inerente alla motivazione espressa; - il Capitolo 3 contiene la descrizione accurata dei sistemi di caratterizzazione di dispositivi fotovoltaici. Di particolare rilievo è la messa a punto di uno strumento per la determinazione dell’efficienza quantica. Quest’ultimo è stato ottenuto assemblando un comune spettrometro UV-Vis con un multimetro per la registrazione delle correnti generate dalla cella; - il Capitolo 4 improntato sulla descrizione di due metodi per la determinazione dei siti attivi (punti di attacco del colorante) presenti sulla superficie del TiOx: il primo basato sull’adsorbimento dell’acido acetico e il secondo sull’adsorbimento delle molecole di colorante. Tali metodi serviranno per la caratterizzazione dei fotoanodi nanostrutturati; - il Capitolo 5 si apre con la provata efficacia del metodo di nanostrutturazione ASB-SANS applicato su polimeri di interesse fotovoltaico. Il fulcro del capitolo è tutto rivolto alla descrizione del metodo applicato al sistema di nanoparticelle di TiOx, con tute le soluzioni tecniche adottate per renderlo altrettanto efficace su questo genere di sistemi; - il Capitolo 6 riporta i risultati ottenuti per l’applicazione dei fotoanodi del capitolo 5 all’interno dei dispositivi fotovoltaici; - il capitolo 7 conclude il lavoro e riporta le eventuali prospettive per il futuro.
XXVI Ciclo
1984

2008/2009
La richiesta mondiale di energia è in costante crescita a causa di diversi fattori tra cui incremento della qualità della vita, incremento della popolazione, l’industrializzazione, la crescita economica dei Paesi in via di sviluppo, etc. Saranno quindi essenziali importanti cambiamenti nelle tecnologie utilizzate per la produzione di energia per soddisfare la crescente domanda energetica nel rispetto delle severe limitazioni ambientali richieste per uno sviluppo sostenibile. In questo contesto viene riconosciuto all’idrogeno l’importante ruolo di vettore energetico (in concomitanza con lo sviluppo della tecnologia delle celle a combustibile) oltre che di molecola essenziale per un vasto numero di processi industriali. L’obbiettivo di questo lavoro è stato lo sviluppo di catalizzatori nano strutturati per la produzione di idrogeno a partire da risorse alternative, siano esse rinnovabili (etanolo e glicerolo) o facilmente trasportabili (metanolo ed ammoniaca). Lo scopo di questa tesi è quello di migliorare le prestazioni dei catalizzatori impiegati nei processi di produzione dell’idrogeno attraverso la comprensione dei meccanismi di reazione e ottimizzate modulando la fase attiva a livello di nanoscala. In particolare sono stati sviluppati catalizzatori per la reazione di reforming in fase gas di metanolo e etanolo (Cu/Ni/Co supportati su ZnO/Al2O3), per la reazione reforming in fase gas di glicerolo (Pt supportato su MOx/Al2O3 con MOx = CeO2 o La2O3) e per la reazione di decomposizione dell’ammoniaca (nanoparticelle di Ru incapsulate in una matrice di ZrO2 drogata La e Fe/Mo supportati su variamente drogata ZrO2 o su Al2O3 modificata). Questo lavoro è derivato da una fruttuosa collaborazione industriale con ACTA S.p.A.. e parte dei risultati ottenuti sono stati recentemente oggetto di brevetto internazionale (WO/2009/016177).
(english version)Worldwide energy requirement is steadily increasing because of many reasons, such as enhancement of the quality of life, population increase, industrialization, rapid economic growth of developing countries, etc. Important changes in the energy production technologies will be essential to fit the increased energy demand with the stringent environmental limitations required by a sustainable development. In this context, H2 is recognized as an important energy vector (in combination with fuel cells) and as an essential molecule required by a large number of industrial processes. The aim of this work was the development of nanostructured catalysts for hydrogen production starting from alternative sources, such as renewable materials (ethanol and glycerol) or easily transportable liquids (methanol and ammonia). This thesis is aimed at improving the performances of catalysts involved in H2 production processes by understanding the reaction mechanisms and by tuning the nature of the catalysts’ active phase at the nanoscale level. In particular, nanostructured catalysts were developed for methanol and ethanol steam reforming (Cu/Ni/Co supported on ZnO/Al2O3), glycerol steam reforming (Pt supported on MOx/Al2O3 with MOx = CeO2 or La2O3) and NH3 decomposition (Ru nanoparticles embedded into La-doped ZrO2 and Fe/Mo supported on doped ZrO2 or modified Al2O3). This work was part of a fruitful collaboration with ACTA S.p.A.. Remarkably, part of the results obtained from this collaboration has been recently the subject of a recent world patent (WO/2009/016177).
XXII Ciclo
1979

2008/2009
Zirconia based materials have been widely used in construction of dental prosthesis because of their mechanical and aesthetical properties and a lot of money have been invested in their development, but no one of the producers considered the aging of zirconia. In this job have been demonstrated, with Raman spectroscopy, the low temperature degradation of zirconia and has been investigated the residual stress in zirconia-alumina composites at room temperature and in open-air after 8 years of aging, then have been investigated the phase trasformation of tetragonal zirconia into monocline form of pure zirconia and alumina-zirconia composites tested in water with a thermal fatigue cycle between 5°C and 55°C. A partial solution of the problem is proposed. Atomic Force Microsopy and Near-field Scanning Optical Microscopy techniques have been tested as method of investigation and validation of the results.
I materiali a base di zirconia trovano vasto impiego nella realizzazione di protesi dentali grazie alle loro proprietà meccaniche ed estetiche e molti soldi sono stati investiti nel loro sviluppo, ma nessuno dei produttori ha considerato il fenomeno di invecchiamento della zirconia. In questo lavoro è stato dimostrato, attraverso l‘impiego della spettroscopia Raman, il degrado a bassa temperatura della zirconia ed è stato analizzato lo stato tensionale interno in compositi allumina-zirconia mantenuti a temperatura ambiente in aria per 8 anni; a seguire è stata analizzata la trasformazione di fase da tetragonale a monoclino della zirconia in campioni sia di zirconia pura che in campioni di composito alumina-zirconia, testati in acqua e sottoposti ad un ciclo di fatica termica tra 5°C e 55°C. Viene anche proposto un metodo corretivo del problema. La microscopia a forza atomica e la microscopia ottica in campo prossimo sono state testate come strumento di verifica e validazione dei dati ottenuti.
XXII Ciclo
1980

2010/2011
In the present thesis I dealt the issue of molecular ordering and charge transfer at two types of organic-inorganic interfaces that are representative of the basic constituents of an organic electron device. I investigated i.) the influence of a selected dielectric surface on the ordering of an overlayer of several organic molecules and ii.) the electronic transport properties of a single molecular junction with a metal electrode. Both systems have been characterized by a structural and electronic point of view. Among the techniques available for structural investigation, I made extensive use of Helium Atom Scattering (HAS) and Scanning Tunneling Microscopy (STM). The electronic properties, with particular emphasis to the charge transfer, have been addressed by two methods chosen according to the dimensionality of the system under consideration. For the charge transfer at laterally extended interfaces I used synchrotron based techniques, like Resonant Photoemssion Spectroscopy (RPES), while for the charge transport through a single molecule I used and developed the STM-based break junction technique (STM-BJ). For the first type of interface, I focused on the coupling between the TiO2(110)-1x1 surface and different organic semiconductor molecules: C60, pentacene, perylene-tetracarboxilic-acid-diimide (PTCDI) and perylene. The strong anisotropy of the substrate has been found to drive the adsorption geometry of the molecules leading to the formation of ordered phases (at least for the first layer). In particular pentacene, PTCDI and perylene (polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs) display a common self-assembly mechanism, where the molecules lay on the surface with their long axis oriented parallel to the [001] substrate direction. In the transverse direction [1-10] these molecules are observed to match the substrate periodicity by tilting the molecular plane around the long axis by an angle that depends on the molecular width. Nevertheless the molecule-to-substrate interaction is very weak as indicated by the molecular electronic structure, which is observed by X-ray spectroscopy to remain mostly unperturbed in the first molecular layer. Only PTCDI bears a major interaction with the TiO2(110)-1x1 surface, but confined to the molecular orbitals closest to the gap. The main experimental evidence of this interaction is the appearance of a new molecular filled state in the valence band region close to the Fermi level. By a combined RPES and NEXAFS study we have found that this new electronic state is due to the charge transfer occurring from the substrate Ti defect state (i.e. the excess of electrons associated with oxygen vacancies) to the lowest unoccupied molecular orbital (LUMO). For the second type of hybrid interface, instead, I exploited the nitrogen-link chemistry in order to bridge a phthalocyanine to two gold electrodes and to measure its conductance. In particular, by using the Tetraaza-Cu-Phthalocyanine I investigated the pyridine-gold bond that is relatively weak and insensitive to the local structure, a fundamental requirement for the establishment of well defined and stable transport properties. The weak interaction between the molecule and a representative metal electrode, namely the Au(100) surface, has been confirmed by spectroscopic and STM experiments. At RT the molecules have been found to diffuse on the surface and only at LT (55 K) they can be observed to self-organize into large molecular domains. On these domains, reliable and reproducible single molecule conductance measurements have been performed by using the STM-based break junction method. The conductance value obtained for the Tetraaza-Cu-Phthalocyanine (7x10-4 G0) has been rationalized in terms of the molecular length and degree of conjugation, as well as by correlation to the energy level alignment at the junction.
XXIV Ciclo
1984

2013/2014
Lo scopo del presente progetto di Dottorato riguarda la possibilità di riconoscere ed identificare le cellule mesenchimali del cancro sfruttando il metabolismo iper-attivato, nonché de-regolato, delle stesse. Una delle differenze principali tra le cellule epiteliali e quelle mesenchimali, del cancro, è il metabolismo ed in particolare il così detto Effetto Warburg (da Otto Einrich Warburg il suo scopritore e sostenitore, nel 1926). Nello specifico, questo effetto riguarda la caratteristica delle cellule tumorali di preferire, come via metabolica, la glicolisi alla classica fosforilazione ossidativa, anche in presenza di ossigeno. Questo processo, infatti, porta a produzione ed accumulo di acido lattico e ad una riduzione della quantità disponibile di glucosio nel mezzo esterno. Negli ultimi anni si è scoperto quanti e quali vantaggi competitivi, dal punto di vista proliferativo, comporti questa trasformazione, consentendo così anche lo sviluppo di numerose tecniche terapeutiche e diagnostiche basate proprio sulla trasformazione della fisiologica normalità. Questo progetto di dottorato si è proposto di sviluppare una nuova metodica diagnostica in grado di distinguere le cellule mesenchimali del cancro da quelle epiteliali tramite lo studio del loro metabolismo e senza l’ausilio di anticorpi. Essendosi prefisso, infatti, come scopo finale quello di fornire un contributo nel campo della diagnosi preventiva e della prognosi a basso costo; una degli intenzioni principali del presente progetto era quello di ridurre al minimo l’utilizzo di anticorpi nel processo di identificazione dei due sottotipi tumorali. Questo progetto ha così sviluppato un sistema basato su nanoparticelle magnetiche (MNPs), in particolare di cobalto ferrite, con lo scopo di favorire l’ avanzamento nel campo delle attuali tecniche di isolamento magnetico. Nello specifico le MNPs sono state sintetizzate e funzionalizzate con un analogo fluorescente del glucosio (il 2-2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose, 2-NBDG) e caratterizzate con spettroscopia infrarossa e microscopia elettronica. Al fine di poterne monitorare in vitro la captazione da parte delle cellule tumorali, sono state utilizzate due ben note linee cellulari di tumore alla mammella, le MCF7 e le MDA-MB-231, definite rispettivamente: epithelial-like e mesenchymal-like. Ne è stata valutata la captazione e quindi l’internalizzazione da parte di queste due linee di cancro al seno, dimostrandola con 3 differenti metodiche (microscopia confocale, saggio di immuno-cito-chimica e analisi con microscopia elettronica accoppiata a milling ionico micro-guidato). In particolare è stato dimostrato come aumentando la concentrazione di glucosio nel mezzo (da 5.5 a 25 mM), le cellule epiteliali riducano drasticamente l’uptake di MNPs mentre esso si conservi nel sottotipo mesenchimale. Tale differente comportamento è infatti basato sul differente metabolismo dei due sottotipi tumorali, il quale consente, senza l’utilizzo di anticorpi, di individuare il sottotipo mesenchimale, più metabolicamente attivo (e tipicamente più aggressivo), da quello epiteliale. Successivamente è stato ricercato il meccanismo molecolare responsabile di tale internalizzazione tramite l’inibizione del più espresso trasportatore di membrana del glucosio, Glut1, con un inibitore selettivo (STF-31). La specifica captazione da parte delle cellule mesenchymal-like è stata infine studiata come potenziale caratteristica da sfruttare per eventuali trattamenti di ipertermia, o termoterapia. Nello specifico è stato utilizzato un laser infrarosso che focalizzato in maniera accurata e precisa su uno degli aggregati di MNPs (dimensionalmente compatibile con la risoluzione della microscopia ottica), presenti all’interno delle cellule, ne ha permesso l’induzione selettiva di morte (necrosi o apoptosi in base tipicamente al tempo e all’intensità dell’esposizione). La possibilità di indurre una morte selettiva nelle cellule tramite la somministrazione di nanoparticelle magnetiche, è attualmente ben nota sia in ricerca che in terapia, ma esclusivamente tramite l’ausilio di campi magnetici oscillanti, onde radio o raggi infrarossi non focalizzati. Infine per le applicazioni diagnostiche, che questo progetto si era prefissato, è stato studiato e sviluppato un dispositivo microfluidico utile all’isolamento di cellule tumorali tramite il principio di displacement magnetico. Tale dispositivo è stato studiato tramite simulazioni a computer ed in seguito prodotto per i successivi test. Ne sono stati valutati i parametri fondamentali ed infine studiato sperimentalmente con biglie magnetiche di dimensioni comparabili alle cellule, riportando infine i calcoli teorici per l’applicazione su campioni contenenti cellule tumorali. Le dimostrazioni applicative che questa tesi di Dottorato ha fornito potranno portare, nel prossimo futuro, ad un avanzamento nel campo della diagnostica del cancro, consentendo di sviluppare sistemi a basso costo e quindi check-up più frequenti e mirati. Infine le prove di ipertermia eseguite, sfruttando le nanoparticelle magnetiche, forniscono interessanti spunti per possibili nuove terapie mirate.
In cancer diagnosis the recognition of epithelial and mesenchymal cancer cells is one of the most difficult challenges. The former subtype have a well recognized method for their identification that uses an anti Epithelial Cell Adhesion Molecule (Ep-CAM) antibody. In contrast, the mesenchymal subtype lacks of a well spread and well expressed membrane marker lowering, consequently, the possibilities to develop a widely-usable assay. Currently, the proposed methods and techniques use several specific antibodies to recognize and isolate the mesenchymal cancer cells from whole blood. In this Doctorate thesis we exploit the possibility to use metabolism instead of membrane markers to recognize and isolate mesenchymal cancer cell from a complex environment like the one in the presence of cells with other subtype characteristics. The metabolism of cancer cells is characterized by a higher rate of glycolysis respect to non-neoplastic cells. Mesenchymal cells, in particular, exhibit a hyper activated ATP production and an enhanced glucose uptake. Based on these fundamentals, we developed a new approach for mesenchymal cancer cells detection by means of magnetic CoFe2O4 nanoparticles (MNPs) coated by 2-2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose (2-NBDG), a fluorescent glucose analogue and by D-glucose molecule, as control. MNPs were synthesized, functionalized and finally characterized by Fourier Transform Infra Red (FTIR) spectroscopy and Scanning Electron Microscopy (SEM). MNPs mean size was around 27 nm for every sample. Considering two types of BC cells: epithelial-like (MCF-7) and mesenchymal-like (MDA-MB-231), it has been demonstrated that increasing the glucose concentration in the medium from 1 g/L (low glucose) to 4.5 g/L (high glucose), results in a selectively MNPs internalization by the mesenchymal subtype. In particular we used a breast cancer (BC) cell lines co-culture and thus we demonstrated the mesenchymal predisposition to uptake glucose coated MNPs both in normal and in high glucose conditions. We observed that the mesenchymal-like cells (MDA-MB-231), respect to the luminal-epithelial ones (MCF7), internalized a statistically significant higher amount of glucose coated CoFe2O4 NPs in both glucose concentrations. Internalization was investigated using advanced techniques as immunofluorescence, immuno-cyto-chemical assay, confocal microscopy and Focused Ion Beam (FIB) - SEM. The internalization MNPs mechanism has been further investigated by the selective blockage of glucose transporter channels, via a specific inhibitor (STF-31), resulting in a proportional uptake decrease as a consequence of the treatment. From a therapeutic point of view, the presence of MNPs inside the mesenchymal-like cells has been exploited for hyperthermia studies by exposing the cells to a localized Infra Red (IR) laser beam. Cells without MNPs were not affected by the IR laser while cells positive to MNPs have been warmed due to the IR absorbance characteristics of cobalt ferrite core, leading to cell damages and rearrangements. We, moreover, investigated the ability of White Blood Cells (WBCs), obtained by healthy donor, to internalize the CoFe2O4 – 2-NBDG NPs at both glucose medium concentrations, leading to a possible diagnostics applications in whole blood cells analysis. For this purpose, a microfluidics device has been developed for a possible isolation of MNPs-positive cells by applying an external magnetic field. The microfluidics chip was fabricated by the soft optical lithography method and the so obtained PDMS mold was bound to a glass slide by oxygen plasma treatment. Finite element computer simulation has been carried out for better understanding the magnetic displacement principles in microfluidics devices. Finally, the set up has been fabricated and tested with micron-sized magnetic beads for the separation yield evaluation. Concluding, thinking in terms of diagnostics we could infer that this method may lead to an alternative technique for mesenchymal cancer cells detection and isolation thanks to the magnetic properties of the MNPs used. Indeed, by applying an external magnetic field to a mixed sample of mesenchymal/epithelial cancer cells and WBCs it would be possible to isolate the mesenchymal-MNPs-positive ones. Moreover, our demonstration of localized heating could lead in the future to a possible therapeutics application in thermotherapy field.
XXVII Ciclo
1984

2013/2014
Advanced nanotechnologies allow the manipulation of molecules with nanoscale precision, and can be used for the production of sensitive devices for protein or nucleic acids detection for clinical use. DNA nano-assemblies are an excellent route for ultrasensitive DNA/RNA detection and for DNA-protein conjugated immobilization, for bio interaction studies, through the careful detection of single strand DNA (ssDNA) hybridization with complementary target sequences. For DNA nanoscale devices, the control of DNA surface density and conformation is crucial in order to achieve the highest reproducibility and to optimize the sensitivity. An improved understanding of the chemical and physical properties of the nanoscale DNA assemblies and of the recognition process is necessary for device performance optimization. In this framework, we first focused on the understanding of the mechanisms that optimize and limit hybridization efficiency in variable density DNA monolayers. We performed Atomic Force Microscopy (AFM) assisted-Nanografting and AFM measurements to realize reference patches into a DNA self-assembled monolayer, and to carefully monitoring DNA hybridization. We then performed molecular dynamics (MD) simulations, in collaboration with a theoretical group, to capture the energetic hybridization limit in high dense DNA monolayers. We found that no more than 44% of the substrate ssDNA can be successfully hybridized, limited by molecular and electrostatic crowding effect connected to the highly charged nature of DNA. To further capture the conformational properties of DNA monolayers, and their relation to biorecognition, we characterized the ionic strength effect on ssDNA nano-assembled of different density by careful AFM topography measurements in liquid environment. We confined ssDNA brushes with controlled surface densities within a bio-repellent self-assembled monolayer. We then monitored the topographic brush height variation upon changing salt type (NaCl, KCl, CaCl2 and MgCl2 ) and concentration inside the liquid cell. We showed that the measured height is related to scaling law of salt concentration, in agreement with the theory of polyelectrolyte brush. Using this scaling model to fit our experimental data, we quantified structural parameters such as the average internucleotide distance (d) for ssDNA brushes of different, estimated surface density σ, featuring a strong dependence of d on different salts species. This result is crucial for the structural designing of synthetic nucleic acids and, more generally, nucleic acid-based devices with controlled physical behaviors. In the last part of the work, we apply all knowledge learned on hybridization mechanism to a clinical problem. We studied the hybridization mechanism to distinguish single base mismatch and to detect at high sensitivity, without any labeling and amplification, microRNAs (miRNAs) connected to hearth failure disease. Our results demonstrate that the AFM nanolithography can serve as a sensitive and selective readout system to discriminate single nucleotide polymorphism. Also, our device allows for the detection of more than one sequence of miRNAs on a same assay with target in picomolar (100pM) range concentration.
I recenti sviluppi delle nanotecnologie permettono di manipolare singole molecole con precisione nanometrica, e possono essere utilizzati per la produzione di dispositivi innovativi ad alta sensitivita` per la rivelazione di proteine e acidi nucleici, per usi clinici. Nanostrutture di DNA a singolo filamento rappresentano una eccellente soluzione per la rivelazione ultrasensibile di frammenti di DNA/RNA e per l’immobilizzazione di coniugati DNA-proteina per studi di bioriconoscimento, attaverso lo studio dell’ibridazione del DNA con le sequenze target complementari. Nello sviluppo di dipositivi alle nanoscale basati sul DNA, il controllo di parametri quali la densita` di superficie e la conformazione del DNA, risulta cruciale per raggiungere gli alti livelli di riproducibilita` richiesti e per ottimizzare la sensitivita`. Studiare e capire in dettaglio le proprieta` chimico -fisiche di strutture alle nanoscale di DNA a singolo filamento, e del relativo processo di bioriconoscimento risulta quindi fondamentale per ottimizzare le prestazioni del dispositivo associato. In questo contesto, ci siamo dapprima focalizzati sullo studio dei meccanismi che ottimizzano e limitano l’efficienza di ibridazione in monolayer di DNA. Usando il microscopio a forza atomica (AFM) e una tecnica di nanolitografia basata sull’AFM, il nanografting, abbiamo costruito delle nanostrutture di riferimento in film di DNA autoassemblati, ad alta densita`, ed abbiamo accuratamente monitorato con l’AFM e con simulazioni di dinamica molecolare, il limite di ibridazione in tali film. In collaborazione con un gruppo di fisici teorici, abbiamo trovato un limite di ibridazione pari a circa il 44% delle sequenze probe, collegandolo a effetti di repulsione elettrostatica dovuta all’ alta densita` a di carica nei monolayer di DNA, un polielettrolita altamente carico in soluzione. In un secondo tempo, per cogliere le proprieta` conformazionali dei monolayer di DNA, e la loro relazione con la capacita` di bioriconoscimento, abbiamo creato delle nanostrutture di DNA a singolo filamento, a densit variabile, in un monostrato autoassemblato di molecole bio-repellenti, e caratterizzato l’effetto della forza ionica della soluzione a mezzo di misure topografiche fatte con l’ AFM, in liquido. Da misure di variazione dell’ altezza topografica delle nanostrutture di DNA in funzione dei diversi sali usati in soluzione (NaCl, KCl, CaCl2 and MgCl2 ) e della loro concentrazione, abbiamo dimostrato che, per ogni sale, l’ altezza` legata alla concentrazione da una legge di scala, in accordo con la teoria dei polyelectrolyte brush. Utilizzando questa legge di scala, abbiamo fatto un fit dei dati sperimentali, quantificando un importante parametro strutturale, la distanza media tra nucleotidi nel filamento (d), per nanostrutture di DNA con divesra densita`, anch’essa stimata dal nostro fit. Questo risultato e` fondamentale per il disegno di acidi nucleici sintetici e piu` in generale per la progettazione di dispositivi miniaturizzati per la rivelazione di acidi nucleici. Nella parte finale di questo lavoro di tesi, abbiamo applicato le conoscenze acquisite sui meccanismi di ibridazione del DNA su scale nanometriche, per realizzare dispositivi utili a scopi clinici. Abbiamo studiato il meccanismo di ibridazione per distinguere un mismatch tra due filamenti complementari di DNA relativo a una singola base e alla rivelazione di micro-RNA, biomarcatori rilevanti per monitorare specifiche malattie quali, nel presente caso, malattie cardiovascolari. Abbiamo dimostrato che i nostri nanodispositivi dimostrano un’ottima risoluzione (100 pM o meglio) e che possono essere utilizzati senza bisogno di amplificazione del materiale genetico originale, o di altre modificazioni, in estratti provenienti da plasmi umani. Queste piattaforme possono essere ulteriormente sviluppate per il monitoraggio di polimorfismi di singolo nucleotide, estremamente rilevanti dal punto di vista clinico
XXVII Ciclo
1986

2013/2014
Lo scopo di questa tesi di dottorato è stato studiare l'effetto sulla durabilità dell’interfaccia adesiva del chitosano, modificato con gruppi metacrilici, con l’obiettivo di migliorare l'affidabilità clinica dei restauri dentali. Attualmente, la ricerca in questo settore mira ad aumentare la durata nel tempo del legame resina-dentina. Questa ricerca propone un nuovo concetto di sistema adesivo bi-funzionale basato su un biopolimero naturale in grado di creare doppia reticolazione covalente. Il chitosano è un polimero biocompatibile e non tossico. In questo studio è stato ipotizzato che il chitosano modificato con gruppi metacrilici sia in grado di legarsi covalentemente alla resina dei restauri dentale e, grazie alla presenza di cariche positive residue sul polisaccaride, di interagire elettrostaticamente con la dentina demineralizzata. Il Chitosano metacrilato è stato introdotto nel primer di un sistema adesivo sperimentale etch&rinse a tre passaggi per valutarne la forza di legame alla dentina. Le prove d’invecchiamento sono state condotte utilizzando due metodiche: invecchiamento statico e dinamico. Il secondo metodo simula la presenza del sistema adesivo nell’ambiente orale, sottoposto sia a carico masticatorio, che a stress termici. Le metodiche d’invecchiamento sono necessarie per valutare la stabilità nel tempo dei restauri dentali. L'introduzione del chitosano modificato con gruppi metacrilici nel primer di un sistema adesivo etch&rinse ha determinato: buoni valori di adesione dopo 24 ore (T0 μTBS); (2) buona stabilità dello strato ibrido quando sottoposto a simulazione meccanica della masticazione e stress termici (TCS μTBS). In sintesi, la prima parte di questa tesi di dottorato ha avuto lo scopo di esaminare lo stato dell'arte dei materiali dentali attualmente utilizzati in odontoiatria e il problema più importante in odontoiatria restaurativa: la degradazione dell'interfaccia adesiva. La seconda fase di questa ricerca è stata dedicata al trovare la formulazione ottimale di un sistema adesivo contenente chitosano modificato con gruppi metacrilici. Diverse formulazioni sono state testate e il sistema sperimentale identificato come A3* è stato considerato la migliore formulazione utilizzabile come sistema adesivo. Questa formulazione è stata poi nominata Chit-MA70. Sono stati eseguiti diversi test per valutare le caratteristiche dell’adesivo sperimentale, compresi test meccanici (test di microtensile). L'espressione del nanoleakage è stata valutata utilizzando la microscopia ottica e la microscopia elettronica a scansione (SEM). Per valutare la sostantività del chitosano sullo strato adesivo, il polimero è stato marcato con fluoresceina e i campioni sono stati osservati al microscopio confocale a scansione laser (CLSM). Nella fase finale di questo studio sono stati condotti test di citotossicità per valutare l'effetto del sistema adesivo Chit-MA70 sulla vitalità cellulare. Le prove eseguite su fibroblasti gengivali hanno rivelato una tossicità ridotta, se non praticamente assente, del sistema adesivo contenente chitosano metacrilato. Considerando i buoni risultati di questo studio, il chitosano modificato con gruppi metacrilici è stato proposto come componente di un sistema adesivo sperimentale. I risultati ottenuti utilizzando questo nuovo sistema adesivo sono stati rivendicati in un brevetto (febbraio 2014) e pubblicati in Biomacromolecules nel mese di ottobre (2014).
The purpose of this thesis was to investigate the effect of a methacrylate-modified chitosan on the durability of adhesive interfaces to improve the clinical performance of dental restorations. Current research in this field aims at increasing the resin-dentin bond durability. The aim of this project was the development of an innovative nano-engineered biocompatible dental adhesive system capable to form covalent chemical bonds with both the dentin collagen and the resin-based restorative materials. This research proposes a new concept of bi-functional reactive adhesive system based on a natural biopolymer capable to create double covalent reticulation. Chitosan is a biocompatible, biodegradable and non-toxic biopolymer. In the present work, chitosan was modified with methacrylate moieties and a physical-chemical characterization was carried out. This research speculated that the modified chitosan was able to covalently bind to the restorative resin and, due to the presence of residual positive charges on the polysaccharide, to electrostatically interact with the demineralized dentine. Chitosan bearing methacrylate groups was blended within the primer of a three- step etch&rinse experimental dentine bonding system to assay its bonding ability to dentine. Additionally, bonded interfaces were challenged with a chewing simulation associated with thermo cycling to assay their stability over time. The introduction of chitosan-modified monomers within the primer of an experimental three-step etch-and-rinse adhesive, improved (1) immediate bond strength (T0 μTBS); (2) stability of the hybrid layer after simulated chewing and thermo cycling (TCS μTBS). In summary, the first part of this PhD thesis aimed to review the state of the art of dental materials currently used in dentistry and the most important problem in restorative dentistry: the degradation of bonded interface focusing on the fundamental processes that are responsible for the degradation of the adhesive interface. The second part of this doctoral thesis was dedicated to find the optimal formulation of a chitosan–containing dental adhesive system. Several formulations were were tested and the one identified as A3* was considered the best formulation to be used as an adhesive system. This formulation was then named Chit-MA70. Several tests were carried out, including mechanical tests such as the microtensile bond strength test. The nanoleakage expression was evaluated using optical microscopy and scanning electron microscopy. The evaluation of the substantivity of chitosan on the adhesive layer was evaluated by labeling the methacrylate-modified chitosan, contained into the primer, with fluorescein and then observing the samples by confocal laser scanning microscopy. In the end, cytotoxicity tests were performed to evaluate the effect on cell viability of the adhesive system Chit-MA70. Tests carried out on gingival fibroblasts revealed a reduced if not practically absent toxicity of the adhesive system containing methacrylate-modified chitosan. Considering the good results of this study, the methacrylate-modified chitosan has been proposed as a component of a novel adhesive system. The findings on this new dental adhesive with methacrylate-modified chitosan were claimed into a patent in February 2014 and published in Biomacromolecules in October 2014.
XXVII Ciclo
1986

2009/2010
Le celle fotovoltaiche basate su strati sottili di materiali organici hanno raggiunto efficienze dell' 8.3% ed hanno le potenzialità per diventare un'alternativa a basso costo delle celle basate su silicio amorfo. Alcune delle problematiche legate alle proprietà intrinseche di generazione, separazione e trasporto delle cariche possono essere affrontate non solo con lo studio della chimica e dei processi per materiali organici e fullerene, ma anche con lo sviluppo di nuove architetture delle celle basate sul controllo e l'organizzazione alla scala del nanometro. Il presente lavoro di tesi è basato sulla convinzione che quest'ultimo approccio, complementare a quello basato sul miglioramento delle proprietà intrinseche dei materiali, contribuirà sostanzialmente al progresso di questo campo della ricerca applicata. L'obiettivo di questo lavoro è quello di dimostrare il principio di funzionamento di una serie di diversi e nuovi prototipi di dispositivi basati su micro- e nano-architetture. In particolare, abbiamo realizzato: un nanomodulo di 1 cm2 che mostra una tensione di circuito aperto di quasi 1 kV, una cella solare basata su un'eterogiunzione con interfaccia avente strutture di 20 nm interpenetrate, e abbiamo ottimizzato deposizione di ossido di indio stagno (ITO) per lo sviluppo di un nostro dispositivo di intrappolamento della luce basato su serie di microlenti. Tuttatavia, riteniamo che ulteriori sforzi nella stessa direzione siano necessari per dimostrare l'utilità delle nano-architetture nel fotovoltaico organico. Parte del lavoro di ricerca è stato dedicato allo sviluppo e messa in opera di strumentazione specifica per la lavorazione e caratterizzazione per il fotovoltaico come un evaporatore in vuoto ad angolo inclinato connesso ad una camera a guanti in azoto per la deposizione di metalli e di organici.
Thin-film photovoltaic (PV) cells based on the bulk hetero-junction of organic materials reached a record efficiency of 8.3% and have the potential to become a lower-cost alternative to amorphous silicon. Some of the issues related to the intrinsic properties of generation, separation and transport of charges, may be addressed not just by working on the details of the chemistry and processing of the organic/fullerenes materials, but also by implementing new cell architectures organized and well controlled down to the nanoscale. The present work of thesis is based on the conviction that the latter approach, complementary to that focused on the improvement of the intrinsic properties of the materials, will substantially contribute to the progress of this field of applied research. The goal of this work is that of demonstrating the working principle of a series of different and new micro- and nano-architectures into prototypical organic solar devices. In particular, we realized: a 1 cm2 nanomodule with almost 1 kV of open circuit voltage, a solar cell with a controlled nanostructured interface heterojunction with interpenetrating features of 20 nm, and we optimized the sputtering deposition of indium tin oxide (ITO) for our light trapping device based on microlenses array. However, we believe that additional efforts in the same direction will be necessary to demonstrate the usefulness of nanoarchitectures in organic photovoltaics. Part of the research work was devoted to the development and the commission of specific instrumentation for PV processing and characterization as an oblique angle vacuum evaporator connected to a nitrogen glove-box for the deposition of metals and organics.
XXIII Ciclo
1980

2013/2014
In the last decades cell mechanics has been increasingly associated to cell health and function. Elasticity is one of the most investigated mechanical properties of cells and is now considered as a potential label free marker of cancer progression. In this Thesis I report on the characterization of cells based on their mechanical properties. Three different biophysical micromanipulation tools have been used: Optical Tweezers (OT), Atomic Force Microscopy (AFM) and Speckle Sensing Microscopy (SSM). We chose three breast cell lines selected as a model to study cancer progression: MDA-MB-231, a highly aggressive cell line belonging to the Basal cell-like phenotype; MCF-7, a less aggressive tumour cell line, belonging to the Luminal A cell-like tumour subtype; and HBL-100, a non neoplastic cell line, derived from the milk of a Caucasian woman, normal control for breast basal-myoepithelial cells. The viscoelastic properties of the three cell lines have been measured using complementary approaches, thus allowing a thorough characterization: OT membrane tether pulling, OT and AFM vertical cell indentation and speckle interferometry with SSM. With AFM and OT techniques we performed local measurements on specific parts of the cell; while with SSM we considered the cell as a whole viscoelastic body and we analyzed groups of cells at the same time. OT membrane tether pulling uses a microbead trapped by the laser beam to pull cellular membrane tethers; from the resultant Force-Elongation (FE) curve, some viscoelastic parameters of the cell itself have been extracted and compared. The experimental approach results to be inefficient and time consuming and it has been, therefore, substituted by OT vertical indentation. The new approach uses the OT in a similar way of the AFM technique, i.e. indenting the cell with a micron sized bead trapped by the laser. The elastic modulus has been therefore measured by vertical cell indentation, employing AFM and OT as two complementary techniques: with AFM we applied nN forces at high loading rates, while with OT we operated at pN forces at low loading rates. OT has been implemented in an inverted optical microscope and the elastic modulus of the three cell lines results to be: 23.4 (HBL-100), 31.2 (MCF-7) and 12.6 (MDA-MB-231) Pa. AFM indentation approach has been performed using the Bioscope Catalyst in Peak Force Quantitative Nanomechanical Mapping (PF-QNM) mode. Bioscope is able of applying nN forces by means of a nano-sized tip attached at the end of a cantilever. This new AFM mode allows mapping different mechanical properties of the cell under scan. The elastic modulus of the three cell lines has been extracted, providing more information about the mechanical alterations undergoing tumorigenesis. The mean values measured near the cell nucleus were: 91.1 (HBL-100), 81.8 (MCF-7), 57.6 (MDA-MB-231) kPa. These results show that there is an inverse correlation between cell stiffness and breast cancer cell aggressiveness, since MDA-MB-231, the most aggressive cell line, has an elastic modulus significantly lower than the other two cell lines, both with OT and AFM measurements. The difference values obtained by AFM and OT are the result of the different regimes used by these techniques: AFM applies higher forces and higher loading rates in comparison to OT. Nevertheless, the trend of the values between the cell lines was the same, showing that the aggressive cells were much softer than the other two. The combination of the two techniques is proposed for a more complete characterization of the mechanical properties of cells in different mechanical conditions. Moreover we show that the stiffness of the substrate influences the elasticity of the cells; OT vertical indentation has been applied to HBL-100 cells cultured on bare and collagen coated substrates and their elastic modulus was 26±9 for bare and 19±7 Pa for collagen. These results show that cells adapt their structures to that of the substrate and demonstrate the potential of this setup for low-force probing of cell mechanics. SSM has been originally proposed by our group in an international collaboration for fast diagnosis of malaria making available the analysis of thousand of cells per minute. It is based on the analysis of the speckles formed by light scattered by the cells when illuminated by a tilted laser beam. Speckle dynamics reflects the thermal vibration of the cell, which is linked to its stiffness. In this work SSM has been applied to MCF 7 cell line for cell mechanics characterization. The final goal of this PhD Thesis is the characterization of the mechanical properties of cancer cells, by means of an integrated method based on rigorous biophysical techniques to understand the disease progression and differentiation towards metastasis.
XXVII Ciclo
1984

2013/2014
The present thesis focused on nanofilled dental resins. The first year activity focused on depth of cure analysis of nanofilled composites. The second year activity focused on hardness, depth of cure and shrinkage stress analysis of bulk fill resin composites. The third year focused on degree of conversion and hardness of nanofilled resin cements.
XXVII Ciclo
1980

2008/2009
The notable progresses achieved in the medical biotechnology research allowed to identify the common genetic origin of many different pathologies. Genes that, for unknown reasons, mutate during the lifetime of the patient synthesize proteins and receptors that lose the control by grow factors. These aberrant proteins are consequently always active and give rise to a series of cascade signals that result in an uncontrolled proliferation of tumor cells. In this framework, the use of small inhibitor molecules to deactivate these proteins, and consequently to block the diseases, constitutes a revolutionary concept that is the base of the “target therapy”. However, during the treatment, patients develop almost unavoidably resistance toward these kind of drugs that is caused by mutations that interest the amino acidic chains of determined tyrosine kinases (i.e. KIT, PDGFRα, etc.). In this thesis we used molecular modelling techniques to gain an insight in the binding between proteins and inhibitors. In particular, we were able to obtain unique information about the interactions that stabilize the complexation, and consequently about the destabilizing effect induced by mutations in the protein and receptor structures. Our data show that different drugs penetrate differently inside the binding site of kinases during the inhibition. Consequently, the efficiency of each inhibitor molecule is strongly dependent on the situation (mutations) presented by each patient. It becomes thus necessary to create a benchmark of responses related to all the most common mutations treated with different drugs. In this direction, molecular simulation can really support clinical scientists in the comprehension of drug resistance phenomena – a virtual microscope, able to provide unique details to cancer research.
I notevoli progressi compiuti dalla ricerca nelle biotecnologie mediche ha permesso di identificare la comune origine genetica di diverse patologie. Geni che, per cause ancora sconosciute, mutano durante la vita del paziente, sintetizzano proteine e recettori che perdono il controllo da parte dei fattori di crescita. Queste proteine aberranti sono di conseguenza sempre attive e generano una serie di segnali “a cascata” che risultano in una proliferazione incontrollata delle cellule tumorali. In questo ambito, l’uso di piccole molecole inibitrici per deattivare queste proteine, bloccando di conseguenza la progressione delle malattie, costituisce il concetto rivoluzionario che sta alla base della terapia a “bersaglio molecolare” (target therapy). Durante il trattamento tuttavia i pazienti sviluppano quasi inevitabilmente una sorta di resistenza nei confronti dei questo tipo di farmaci che è causato dalla comparsa di mutazioni che interessano la catena aminoacidica di determinate chinasi (KIT, PDGFRα, ecc.). In questa tesi sono state utilizzate tecniche di modellistica molecolare per ottenere un’analisi dettagliata del binding tra proteine e inibitori. In particolare, è stato possibile ottenere importanti informazioni sulle interazioni che stabilizzano la complessazione, e di conseguenza sull’effetto destabilizzante generato da mutazioni che compaiono sulla struttura di proteine e recettori. I nostri risultati mostrano che farmaci diversi penetrano differentemente all’interno del sito di binding delle chinasi durante l’inibizione. L’efficienza di ciascun inibitore risulta quindi essere fortemente dipendente dalla situazione (mutazioni) del singolo paziente. Diviene dunque necessaria la creazione di un benchmark contenente i responsi di tutte le più comuni mutazioni trattate con diversi farmaci. In questa direzione, la simulazione molecolare può fornire un supporto reale alla clinica nella comprensione dei fenomeni di resistenza ai farmaci: un microscopio virtuale, capace di fornire dettagli unici alla ricerca sul cancro.
XXII Ciclo
1981

2012/2013
In this work the fabrication and characterization of boron-doped diamond (BDD) nanoelectrode arrays are discussed. NEAs were obtained by creating an array of nanoholes by electron beam lithography (EBL) and Nanoimprint Lithography in a thin film of polycarbonate deposited on top of the macroelectrode. This approach leads to the formation of recessed nanoelectrodes. NEAs have been characterized with cyclic voltammetry and have provided voltammetric signals controlled by pure radial diffusion. Short ss-DNA have been immobilized on polycarbonate surface and hybridization experiments were carried out. Fluorescent and enzymatic labels were used in order to detect immobilization and hybridization of DNA. ECL preliminar experiment were also carried out on our NEAs.
XXVI Ciclo
1984