Littérature scientifique sur le sujet « Screening di mutazioni »

SommarioLe tecniche di sequenziamento di nuova generazione hanno rivoluzionato l’identificazione dei geni-malattia, accelerando la scoperta di nuove mutazioni e nuovi geni candidati per le malattie della tiroide. Per far fronte a questo flusso di nuove informazioni genetiche è importante disporre di modelli animali adeguati per studiare i meccanismi che regolano lo sviluppo della tiroide, la biodisponibilità e l’azione degli ormoni tiroidei. Zebrafish (Danio rerio), con il suo rapido sviluppo embrionale esterno, è stato ampiamente utilizzato in biologia dello sviluppo. Ad oggi, quasi tutti i componenti dell’asse tiroideo zebrafish sono stati caratterizzati e sono strutturalmente e funzionalmente paragonabili a quelli dei vertebrati superiori. La disponibilità di linee transgeniche di zebrafish fluorescenti consente l’analisi in tempo reale dell’organogenesi tiroidea e delle sue alterazioni. Il knockdown transitorio ottenuto con l’uso del morfolino permette di silenziare l’espressione di un gene di interesse e ottenere prontamente informazioni sul suo contributo durante lo sviluppo dell’asse tiroideo in zebrafish. Gli strumenti recentemente disponibili per il knockout genico stabile (es. CRISPR/Cas9) hanno ulteriormente aumentato il valore di zebrafish nello studio della patologia tiroidea. Entrambi i modelli di malattia possono essere inoltre utili per lo screening di nuovi farmaci e molecole che potranno essere utili per pianificare i successivi studi clinici.

La sindrome di Pendred è, in ordine di frequenza, la seconda causa di ipoacusia su base genetica autosomica recessiva. Si manifesta con un ipoacusia accompagnata dalla presenza di un gozzo tiroideo con eventuale ipotiroidismo. Tali caratteristiche si accompagnano a malformazioni dell’orecchio interno, quali l’acquedotto vestibolare largo. Nel 50% dei casi vi è una mutazione del gene SLC26A4. Riportiamo nel presente lavoro il caso di una paziente portoghese di 47 anni affetta da ipoacusia di grado severo/profondo e ipotiroidismo. La madre e la sorella della paziente, entrambe decedute, erano a loro volta affette da ipoacusia associata a gozzo tiroideo. La risonanza magnetica e la TC hanno entrambe evidenziato un allargamento dell’acquedotto vestibolare e del sacco endolinfatico. La paziente è stata sottoposta a uno studio di GJB2 e GJB6 seguiti da uno screening di tutti gli esoni di SLC26A4 e delle regioni introniche 8 e 14. È stata rilevata, per la prima volta in omozigosi, una mutazione c.918 + 2T>C nella regione intronica 7 del gene SLC26A4. Sequenziando i campioni di controllo è stata rilevata una nuova mutazione c.821C>G presente in eterozigosi nell’estone 7 del gene SLC26A4, per la quale si è ipotizzato un ruolo dannoso. Il presente studio ha condotto alla scoperta di due nuovi genotipi di SLC26A4, e alla miglior definizione degli aspetti fenotipici associati alla sindrome di Pendred.

2012/2013
L’anemia di Fanconi (FA) è una malattia genetica rara caratterizzata da malformazioni congenite, pancitopenia, predisposizione al cancro e aumentata sensibilità ad agenti, quali diepossibutano e mitomicina C, che formano legami tra i due filamenti di DNA. La FA è causata da almeno 16 geni che costituiscono, insieme ad altri componenti, un pathaway di riparazione del DNA. L’eterogeneità è uno dei principali motivi che complica la diagnosi molecolare della FA. E’ pertanto necessario un processo a più livelli che implica lo screening di molti esoni o, in alternativa, l’allestimento di linee cellulari e l’analisi di complementazione per la caratterizzazione del gene candidato. Gli scopi di questa tesi pertanto sono diretti a: • Ridurre i tempi per l’identificazione del gene mutato sostituendo l’analisi di complementazione con quella di espressione delle proteine FA basandosi sul presupposto che prodotti mutati siano rapidamente degradati; • Caratterizzare dal punto di vista molecolare gli effetti delle varianti identificate dall’analisi di sequenza. Per quanto riguarda il primo obiettivo, ci siamo focalizzati sullo studio della proteina FANCA in 44 linee cellulari linfoblastoidi appartenenti ai diversi gruppi di complementazione. E’ emerso che, fatta eccezione per FA-G, l’espressione di FANCA non è alterata da mutazioni nei geni FANCB, FANCC e FANCD2. Per quanto riguarda i pazienti con mutazioni in FANCA, invece, abbiamo osservato una correlazione tra il tipo di mutazione e il livello di espressione della proteina che può quelli essere paragonabile a quella dei controlli nel caso di mutazioni missenso o ampie delezioni in frame. In accordo con l’ipotesi invece, in presenza di mutazioni nonsenso e frameshift in entrambi gli alleli del gene, non si ha produzione di proteina. Sulla base di questi dati possiamo concludere che l’analisi di FANCA non è soddisfacente per assegnare ai pazienti il corrispondente gruppo di complementazione. Tuttavia, da questo studio è emersa l’ipotesi di un’associazione tra l’espressione stabile delle proteine FANCA mutate e un fenotipo meno grave nei pazienti. I dati preliminari dimostrano che queste proteine non sono traslocate nel nucleo e che quindi un’eventuale attività residua non sia da attribuire al processo di riparazione del DNA. Un potenziale ruolo andrebbe forse indagato a livello citoplasmatico dove, come sta emergendo dalla letteratura, almeno FANCG e FANCC, svolgono una funzione all’interno del mitocondrio tale da giustificare l’elevato grado di stress ossidativo delle cellule FA. Per il secondo obiettivo, lo studio dei casi arruolati nell'ambito dell'AIEOP (Associazione Italiana Ematologia Oncologia Pediatrica) ha consentito l'identificazione delle mutazioni in 100 famiglie. Dall’analisi dei dati emerge che la maggior parte delle mutazioni colpisce il gene FANCA (85%), seguito da FANCG (9%), FANCC (3%), FANCD2 (2%) e FANCB (1%). In assenza del dato di complementazione e/o in presenza di varianti alle quali non è sempre possibile attribuire un chiaro effetto patogenetico, sono state eseguite ulteriori indagini. Si citano a titolo di esempio la caratterizzazione delle ampie delezioni intrageniche mediante MLPA, l’analisi bioinformatica e a livello di RNA delle alterazioni di splicing che, qualora in frame, sono state ulteriormente confermate anche a livello proteico e, infine, lo studio bioinformatico di patogenicità delle sostituzioni aminoacidiche. La formulazione di un algoritmo efficace e rapido per la diagnosi molecolare della FA, nonché la chiara definizione del significato patogenetico delle varianti identificate, è molto importante per corretta presa in carico del paziente e della famiglia sia per l’identificazione dei portatori che per la diagnosi prenatale.
XXVI Ciclo
1984

It is well established that several forms of inheritable idiopathic epilepsy sindrome are ion channelopathies, that is pathologies associated with dysfunctional ion channels, even if the functional link between channel dysfunction and clinical phenotype is often unresolved. Hyperpolarization-activated, Cyclic-Nucleotide gated (HCN) channels are a class of voltage- and cAMP-dependent channels. They mediate the hyperpolarization-activated Ih current, which control synaptic integration and intrinsic excitability in various brain areas. Ih is pathologically altered after experimentally-induced seizures and has been proposed to have a role in different forms of epileptogenesis. Hcn1 and Hcn2 genes variants have been identified in patients with febrile seizure or GEFS+. While existing data therefore clearly show a link between HCN channel dysfunction and epileptogenesis, no specific mutation-induced HCN channel modification has so far been correlated functionally with increased neuronal excitability. To investigate this we used a candidate gene approach and screened a panel of idiopathic generalized epilepsy patients and related families for mutations in the Hcn1 and Hcn2 genes. We found a form of sporadic IGE associated with a recessive point mutation in the gene coding for the HCN2 channel. The protein mutation E515K is located in the C-linker region (exon 5 of the Hcn2 gene). Functional analysis revealed that homomeric mutant, but not heteromeric wild-type/E515K channels, have a negative shift in the activation kinetics. Furthermore, the time-constant curve for homomeric E515K channels was also shifted to the negative direction. Moreover, omomeric mutant, but not heteromeric wild type/mutant channels, showed a lowering of the threshold of action potential firing and a strongly increased cell excitability and firing frequency when compared to wild-type channels. In conclusion, our results show that the homozygous E515K mutation in human HCN2 channels is a loss-of-function mutation causing a large negative shift of the activation curve and slowing of activation, and a consequent strong reduction of Ih availability near resting voltages. These changes cause a substantial increase of neuronal excitability, a condition predisposing to epileptogenesis, and are associated with a recessive type of inheritance compatible with the idiopathic generalized epilepsy of the proband in the family pedigree.