Littérature scientifique sur le sujet « Rigenerazione tissutale »

Il crescente settore multidisciplinare dell’ingegneria tissutale mira a rigenerare, migliorare o sostituire in modo prevedibile i tessuti danneggiati o mancanti per una varietà di condizioni causate da traumi, malattie e vecchiaia. Per garantire che i metodi per l’ingegneria tissutale siano ampiamente applicabili in ambito clinico, è necessario modificarli in modo da renderli prontamente disponibili e relativamente facili da usare nella routine clinica quotidiana. Pertanto, i passaggi tra la preparazione e l’applicazione devono essere ridotti al minimo e ottimizzati per renderli pratici e l’implementazione realistica. L’obiettivo generale di sviluppare concentrati piastrinici di origine naturale può essere prodotto vicino al paziente e accelerare il processo di impianto essendo finanziariamente realistico per il paziente e per il sistema sanitario. La fibrina ricca di piastrine (PRF) e i suoi derivati sono stati utilizzati in un’ampia varietà di campi medici per la rigenerazione dei tessuti molli. In conclusione, i risultati della presente revisione sistematica evidenziano gli effetti positivi del PRF sulla guarigione delle ferite dopo terapia rigenerativa per la gestione di vari difetti dei tessuti molli riscontrabili nel wound care. Growing multidisciplinary field of tissue engineering aims to regenerate, improve or replace predictably damaged or missing tissues for a variety of conditions caused by trauma, disease and old age. To ensure that tissue engineering methods are widely applicable in the clinical setting, it is necessary to modify them in such a way that they are readily available and relatively easy to use in daily clinical routine. Therefore, the steps between preparation and application must be minimized and optimized to make them realistic implementation. General objective of developing platelet concentrates of natural origin can be produced close to the patient and accelerate the implantation process, being financially realistic for the patient and the health system. Fibrin rich in platelets and leukocytes (PRF) and its derivatives have been used in a wide variety of medical fields for soft tissue regeneration. In conclusion, the results of this systematic review highlight the positive effects of PRF on wound healing after regenerative therapy for the management of various soft tissue defects found in wound care.

L’estrazione di uno o più elementi dentari innesca una serie di processi biologici che modificano notevolmente l’alveolo post-estrattivo o la cresta alveolare, determinando una notevole contrazione ossea. L’obiettivo primario dello studio è valutare il potenziale rigenerativo dell’osso eterologo e PRF associato a terapia fotodinamica laser-assistita in siti post estrattivi. L’obiettivo secondario è valutare la sopravvivenza implantare nei pazienti trattati con questa tecnica di preservazione della cresta alveolare. Obiettivo terziario è valutare la guarigione della ferita chirurgica nelle settimane successive all’intervento. Sono stati selezionati 15 pazienti che necessitavano di estrazioni dentarie, sono stati raccolti i dati clinici e radiografici pre operatori; i pazienti sono stati preparati all’intervento chirurgico che è consistito nell’estrazione degli elementi compromessi, esecuzione della terapia fotodinamica laser-assistita, innesto di osso eterologo e PRF, sutura. A distanza di 9 mesi è stato effettuato il rientro chirurgico per il posizionamento di impianti e sono stati raccolti i dati post operatori. I risultati hanno mostrato una notevole riduzione della contrazione ossea in seguito a estrazione dentaria con la tecnica utilizzata, che ha permesso il posizionamento degli impianti in tutti i casi con un’ottima guarigione dei tessuti molli. Questa tecnica si è quindi mostrata molto efficace riducendo l’invasività chirurgica per i pazienti.

Il presente elaborato riassume un’analisi della letteratura scientifica corrente relativa all’approccio proposto dall’ingegneria tissutale per la sostituzione/rigenerazione del tessuto tendineo e legamentoso e analizza le fasi che conducono alla realizzazione di un costrutto con a bordo cellule specifiche. I tendini e i legamenti sono tessuti fibrosi specializzati che svolgono principalmente una funzione meccanica: i primi permettono la trasmissione delle forze dal muscolo all’osso per generare il movimento, i secondi invece garantiscono la stabilità tra le giunture ossee che collegano. Gravi lesioni di tali strutture sono associate all’insorgere di incombenti problematiche a livello motorio e la caratteristica peculiare di mancata rigenerazione spontanea ha indotto alla ricerca di fonti alternative per la loro ricostruzione. L’esperienza relativa alla preparazione e all’uso di innesti allogenici e xenogenici finalizzati alla rigenerazione tissutale mostrano una difficoltà nella coltura cellulare in vitro, una prolungata risposta infiammatoria in vivo, nonché dei tempi troppo lunghi per l’impianto. L’utilizzo di scaffold, ovvero supporti 3D realizzati con materiale sintetico (p.es. acido poliglicolico) o naturale (p.es. collagene) per ospitare la crescita di cellule adeguate, sembra un approccio alternativo promettente. In particolare, in questo documento sono state riassunte due esperienze di riparazione tissutale, ispirate alla strategia sopra indicata, per il recupero del tendine d’Achille e del legamento crociato anteriore (ACL) del ginocchio, due distretti affetti da lesioni di natura principalmente traumatica e caratterizzati da specifiche proprietà che devono essere soddisfatte in vitro e in vivo.

Lo studio ha previsto prima una scansione con TC-doppia energia (TC-DE) di pezzi anatomici da cadaveri (ossa e tessuti molli) per definire i parametri di scansione TC, necessari al successivo utilizzo sul paziente. Successivamente è stato analizzato il miglior rapporto tra dose radiante erogata e qualità̀ dell’immagine e valutati i sistemi di riduzione di dose (VEO e ASIR) e degli artefatti metallici (GSI e MAR). Il sistema VEO ha permesso una ottimale valutazione del tessuto osseo con una riduzione di dose di oltre il 50% rispetto al sistema ASIR; con il sistema GSI abbiamo individuato i livelli mono-energetici che meglio riducessero gli artefatti da protesi metallica e utilizzato il software MAR per ridurre gli artefatti post-processing. Le immagini sono state importate in formato DICOM in un software dedicato per la loro visualizzazione, segmentazione e processazione per riprodurre l'anatomia del tessuto osseo. La stampa di scaffold 3D che riproducessero il tessuto originale è stata effettuata mediante un Bioplotter. Il Bioink a base di fibroina della seta è stato utilizzato per realizzare lo scaffold e, definita l'archittettura d'interesse, sono stati ottimizzati i parametri di stampa. Sono stati utilizzati un bioink senza calcio (SFG) e uno con cloruro di calcio (SFG-CaCl2). Le cellule mesenchimali (MSCs) sono state inglobate nei bioinks e si è evidenziato che in entrambi i bioinks le cellule erano distribuite in modo omogeneo ed erano vitali a tutti i tempi sperimentali (giorno 1, 7, 14, 21) analizzati. Utilizzando specifici fattori osteogenici (FO) si è indotto in entrambi i bioinks il differenziamento cellulare in senso osteogenico. In particolare, in presenza di FO si è evidenziato un incremento della mineralizzazione nel bioink SFG-CaCl2 rispetto a quella ottenuta nel bioink SFG. Inoltre, in assenza di FO solo nel bioink SFG-CaCl2 si è notata la presenza di precipitati di calcio indicativi dell’avvenuto differenziamento osteogenico.
Firstly, we performed a double-energy CT scan (CT-DE) of anatomical pieces from cadavers (bones and soft tissues) to define the radiological parameters, that were necessary to subsequent move on the patient. Subsequently, the best ratio between delivered radiant dose and image quality was analyzed and dose reduction systems (VEO and ASIR) and metal artefacts reduction systems (GSI and MAR) were evaluated. The VEO system allowed an optimal evaluation of the bone tissue with a dose reduction of over 50% compared to the ASIR system; with the GSI system we have identified the mono-energy levels that better reduced artifacts from metal prosthesis and that were used with MAR software to reduce post-processing artifacts. The images were imported in DICOM format in a dedicated software for their visualization, segmentation and processing to reproduce the anatomy of the bone tissue. The printing of 3D scaffolds that reproduced the original tissue was done using a Bioplotter. The silk fibroin Bioink was used to prepare the scaffold and, to define the architecture of interest. All the printing parameters were optimized. The Bioink were prepared both without calcium (SFG) or with calcium chloride (SFG-CaCl2). Mesenchymal cells (MSCs) were incorporated into the bioinks and we observed that in both bioinks the cells were homogeneously distributed and viable at all experimental times (day 1, 7, 14, 21) analyzed. Using specific osteogenic factors (FO), in both bioinks MSCs osteogenic differentiation was induced. In particular, in the presence of FO, we found an increase in mineralization in SFG-CaCl2 bioink compared to that obtained in SFG bioink. Moreover, in the absence of FO only in the bioink SFG-CaCl2 the presence of calcium precipitates were noted indicating that the osteogenic differentiation occured.

La terapia rigenerativa cellulare ha attirato in questi ultimi anni un'attenzione sempre maggiore da parte dei ricercatori; numerosi studi, pre-clinici e clinici hanno messo in evidenza come questo tipo di approccio terapeutico abbia le potenzialità per far recuperare la funzionalità cardiaca compromessa. Tuttavia, i risultati dei primi trials clinici hanno dato sinora risultati controversi. E' stato dimostrato che le cellule staminali adulte, sia che esse originino dal tessuto muscolare che dal midollo osseo, non si differenziano in cardiomiociti in grado di migliorare la funzionalità cardiaca. Dati recenti suggeriscono l'esistenza di cellule staminali cardiache residenti nel cuore adulto, con potenzialità di differenziamento verso i vari tipi cellulari presenti nel cuore (cardiomiociti, cellule endoteliali, cellule muscolari lisce). Le cellule staminali cardiache rappresentano l'opzione più promettente per la terapia rigenerativa cardiaca: infatti, esse non comportano problematiche di tipo etico né tantomeno complicanze di natura immunologica come le cellule staminali embrionali. Recentemente un gruppo di ricercatori ha isolato con successo cellule staminali cardiache (CSCs) da frammenti bioptici endomiocardici umani, espandendole in vitro per diverse generazioni e conservandone le potenzialità differenziative in cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce.Purtoppo la terapia cellulare, in generale, soffre ancora di limitazioni correlate alla variabilità dell'engrafment cellulare e all'alta percentuale di morte per apoptosi che fa seguito al trapianto (circa 80%). Inoltre, questo tipo di approccio risulta inadeguato o quantomeno insufficiente in caso di lesioni infartuali di notevoli dimensioni. Parallelamente, la ricerca nel campo dell'ingegneria tissutale applicata alla patologia cardiaca ha compiuto notevoli progressi negli ultimi anni e numerosi studi in vivo e in vitro ne attestano le notevoli potenzialità terapeutiche. Sono state infatti recentemente sviluppate, tecniche di bio-ingegneria che prevedono l'incorporazione delle cellule staminali in matrici biodegradabili con formazione di biocomplessi, al fine di migliorare la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule staminali stesse in vivo. Tali costrutti incorporano gli elementi cellulari in una struttura tridimensionale che può essere utilizzata per sostituire l'area di miocardio danneggiata in una maniera più fisiologica ed efficace: infatti, le matrici a base di collagene sono in grado di reintegrare la matrice extracellulare cardiaca danneggiata a seguito dell'insulto ischemico. Tuttavia non sono stati ancora identificati i biocomplessi matrice/cellula staminale più adeguati. La nostra ipotesi è che le cellule staminali cardiache autologhe possano rappresentare la scelta più efficace e realistica da utilizzare per la creazione di biocomplessi. La possibilità di mettere a confronto, l'attività biologica delle CSCs, con quella di altri tipi di cellule staminali adulte (sulle quali sono già stati condotti numerosi studi pre-clinici e clinici), dovrebbe definitivamente individuare e caratterizzare i vantaggi e gli svantaggi del migliore biocomplesso applicabile nella pratica clinica. La creazione di un modello sperimentale animale ottimale e la messa a punto di protocolli diagnostici per il monitoraggio in vivo del comportamento delle cellule staminali servirà come punto di partenza per la realizzazione di studi pre-clinici in animali di grande taglia e di studi clinici di fase I-II.
Cell therapy for regeneration, has received extensive attention and the accumulated evidence from both pre-clinical and clinical studies suggests that it has the potential to restore heart function. However, the results from first clinical trials are mixed, with benefits ranging from absent to transient and, at most, marginal. These studies indicate that adult stem cells, whether muscular or bone marrow-derived, fail to generate new cardiomyocytes, capable to improve cardiac function. Emerging evidence suggests that several subpopulations of resident cardiac stem cells (CSCs) have the ability to differentiate into cardiac myocytes, vascular smooth muscle and endothelial cells. CSCs represent a logical source to exploit in cardiac regeneration therapy bacause, unlike other adult stem cells, they are likely to be intrinsecally programmed to generate cardiac tissue in vitro and to increase cardiac tissue viability in vivo. In addition, autologous CSCs can be employed avoiding ethical and immunological problems associated with the use of embryonic stem cells. Recently, a group of our network has successfully isolated CPCs/CSCs from small biopsies of human myocardium and expanded them ex vivo trough several generations without loosing differentiation potential into cardiomyocytes and vascular cells, bringing autologous transplantation of cardiac stem cells closer to clinical translation. However cell therapy in general suffers limitatations related to variable cell retention, survival and significant cell death or apoptosis, early after implantation in the diseased myocardium. Furthermore, cell transplantation may not always be suitable for catastrophic events like large myocardial damage. For this reason, hybrid therapies that incorporate tissue engineering are being developed as potentially new therapeutic approaches for repair of myocardial tissue. Tissue engineering (TE) involves seeding a biodegradable scaffold with cells that grow into morphologically recognizable tissue both in vitro and in vivo. Recent advances in cell culture and TE have facilitated the development of suitable cell-engineered biodegradable grafts. The optimal biomaterials and cell types, however, have not been identified. Our hypothesis is that autologous cardiac stem cells could represent the most efficient and reliable cell type to be used for an hybrid therapy (tissue engineering/stem cells) to restore myocardial function in ischemic myocardial desease. TE joints the physical replacement of the diseased structure with new cardiac tissue built from a biodegradable scaffold, with the regenerating activity of the optimal cell types. A bioengineered tissue graft (biocomplex) would be the ideal treatment to repair cardiac ischemic diseases. The possibility to compare the biological activity of the CSCs with other adult SCs, should definitely individuate and characterize the advantages and disadvantages of the best clinical applicable biocomplex. Moreover, the creation of the appropriate animal model and the realization of diagnostic protocols aimed to monitor the in vivo cell fate, will be used as pre-clinical background for large animals and phase I-II clinical studies.

Il tessuto muscolare scheletrico costituisce circa il 40% della massa corporea ed è di fondamentale importanza per un organismo in quanto è responsabile dei movimenti, della postura e dell’equilibrio, oltre che di importanti funzioni metaboliche. La perdita di questo tessuto può essere causata da una malattia progressiva oppure da un danno accidentale e tuttavia il muscolo scheletrico ha la capacità di rigenerarsi in modo rapido e completo così da prevenire la perdita di massa muscolare. Le cellule satelliti, cellule localizzate tra la membrana plasmatica e la lamina basale di ciascuna fibra, sono considerate le cellule staminali muscolari: in occasione di un qualsiasi processo degenerativo, esse vengono attivate ed iniziano a proliferare. Le cellule figlie migrano per formare catene di cellule satelliti disposte longitudinalmente sotto la lamina basale, qui si fondono tra di loro o con altri miotubi preesistenti per formare nuove fibre muscolari multinucleate. Le cellule satelliti hanno una limitata capacità proliferativa e probabilmente non possono sostenere molteplici cicli di rigenerazione durante fasi ripetute di degenerazione e rigenerazione, ciò è verosimilmente la causa della natura progressiva delle distrofie muscolari. L’ingegneria tissutale del muscolo, ovvero l’utilizzo di un’impalcatura artificiale a supporto di mioblasti/cellule staminali, sta delineandosi da alcuni anni come una strategia terapeutica innovativa per la cura di molte malattie del sistema muscolare scheletrico. Lo scopo dell’ingegneria tissutale è recuperare tessuti ed organi persi, danneggiati o compromessi, partendo da cellule proliferanti in coltura per terminare con strutture cellulari differenziate tessuto-simili. La matrice extracellulare (ECM) gioca un ruolo essenziale nel determinare il comportamento delle cellule durante i processi di rimodellamento tissutale che portano a strutturare tissuti maturi. Quindi, è auspicabile controllare il differenziamento cellulare durante la rigenerazione del tessuto, mimando l’ECM mediante l’uso di materiali ingegnerizzati. La modifica delle proprieta’ biofisiche e meccaniche di questi biomateriali puo’ essere usata come strategia per indurre risposte cellulari specifiche. Inoltre, un biomateriale iniettabile sotto forma di idrogel, avendo queste caratteristiche, ha come vantaggio ulteriore quello di essere facilmente engrafted in vivo al fine di trasportare cellule staminali e/o molecole bioattive per promuovere il rinnovamento tissutale. La nostra ricerca ha avuto come scopo l’utilizzo di un idrogel iniettabile fatto di glicole polietilenico (PEG) coniugato al fibrinogeno, il PEG-fibrinogeno (PF). Questo biomateriale è stato usato come scaffold per la ricostruzione muscolare in vitro ad opera di mesoangioblasti (Mabs), cellule progenitrici mesodermiche associate ai vasi, e di mioblasti (cellule satelliti, SCs) isolati freschi. Inoltre il PF è stato testato come carrier per il delivery dei Mabs in vivo al fine di incrementare il processo rigenerativo di muscoli danneggiati. Gli scaffold di PF usati per le colture in tre-dimensioni in vitro hanno permesso una buona sopravvivenza cellulare ed hanno accelerato il processo differenziativo in muscolo scheletrico, portando alla formazione di miotubi contrattili entro le ventriquattro ore (normalmente, le colture in due dimensioni richiedono tre giorni prima di esibire la formazione di miotubi). Inoltre, utilizzando il biomateriale con un disegno più complesso, cioè contenente al suo interno dei microcanali creati con la microablazione laser, il PF ha permesso l’allineamento delle cellule lungo i canali, quindi il differenziamento e la formazione di fibre muscolari mature ben orientate. In una prima serie di esperimenti in vivo siamo riusciti ad indurre il differenziamento di tessuti simil muscolo da PF e Mabs impiantati sotto la cute in topi immunodeficienti. Il PF ha mostrato di essere in grado di promuovere la crescita ed il differenziamento dei precursori miogenici, proprio come accade in vitro, portando alla formazione di un vero e proprio organoide, senza dare segni di tumorigenicità. Nella seconda serie di esperimenti in vivo, invece, il PF è stato usato come carrier di Mabs in muscoli danneggiati (tibiali anteriori) di topi immunodeficienti. La presenza del PF ha permesso un’aumentata sopravvivenza delle cellule trapiantate, una migliore ritenzione cellulare in situ e un complessivo miglioramento nell’engraftment cellulare, che si è tradotto in una più rapida rigenerazione del tessuto danneggiato. In conclusione, i biomateriali ed in particolare gli idrogel come il PF possono essere facilmente utilizzati per il trasferimento di cellule muscolari scheletriche, mediante una semplice procedura di iniezione one-step, e quindi potrebbero avere un enorme impatto nel trattamento di patologie degenerative a carico dei muscoli scheletrici, come la distrofia muscolare.
Tissue engineering aims to replace lost, damaged or failing tissue and organs, starting with cultured proliferating cells and ending with tissue-like structures. The extracellular matrix (ECM) plays a pivotal role in determining cell behavior during tissue remodelling processes leading to complete differentiated structures. Therefore it is desirable to control cell differentiation during tissue regeneration by mimicking the ECM using engineered biomaterials. To modify the biophysical and mechanical properties of these biomaterials can be used as a strategy to elicit specific cellular responses. Moreover, an injectable hydrogel biomaterial, having such capabilities, should have the advantage to be easily engrafted in vivo in order to carry stem cell and/or bioactive molecules to promote tissue renewal. Our research is thus focused on the use of an injectable hydrogel made from polyethylene glycol (PEG) conjugated to Fibrinogen. The PEG-Fibrinogen (PF) is used as scaffold for in vitro muscle reconstruction, seeded and cultured with mesoangioblasts (vessel associated progenitor cells) and freshly isolated muscle satellite cells (SCs). The PF, which can be controlled in terms of its matrix modulus, is tested in vivo as mesoangioblast carrier for muscle regeneration. The PF scaffold used for in vitro 3-D cultures promoted good survival of miogenic precursors and accelerated skeletal muscle differentiation (contractile myotubes) within 24 hours (normally, 2-D cultures take three days to exhibit myotube formation). The confining geometry of the microchannels created with microablation in the PF scaffolds promoted the development of oriented mature muscle fibers. Sub-cutaneous PF/miogenic precursors implants in Rag2 Chain -/- mice were able to form a “muscle organoid”. Finally, in vivo experiments using PF as a cell carrier showed increased transplanted cell survival, ameliorated in situ cellular retention and an overall improvement in cell engraftment. Injectable hydrogel biomaterials can be readily applied for skeletal muscle cell delivery by a simple one-step injection procedure and could have a noteworthy impact in the treatment of muscular dystrophy.

Il sistema nervoso centrale svolge un ruolo chiave nella raccolta, integrazione ed elaborazione delle informazioni provenienti dagli organi di senso e dall’ambiente interno dell’organismo. La sua struttura, formata da una complessa rete neurale finemente organizzata può essere soggetta a danni di vario tipo, che ne minano le funzionalità. Per far fronte a tale evenienza, negli ultimi anni, sta emergendo una nuova scienza dal carattere fortemente multidisciplinare, ovvero la medicina neurorigenerativa. Essa comprende l’ingegneria tissutale, che mira all’ingegnerizzazione dei materiali per la produzione di supporti per la rigenerazione (scaffold), la neurologia, e l’ingegneria biomedica. Scopo di questa tesi è stato quello di passare in rassegna le ricerche più recenti sui materiali impiegati per la medicina neurorigenerativa, così come le tecniche e le tecnologie emergenti per il loro processo. In particolare, i polimeri naturali e di sintesi rappresentano una reale potenzialità per possibili interventi terapeutici. D’altra parte, tecnologie di processo quali l’electrospinning e la stampa tridimensionale (3D BIOPRINTING) hanno consentito di progredire notevolmente nella fabbricazione di supporti finalizzati allo sviluppo di impianti neurorigenerativi eterologhi o coadiuvanti l’impianto autologo. In particolare, il 3D Bioprinting è una tecnologia che ha la potenzialità di consentire, in un prossimo futuro, di riprodurre con precisione sempre maggiore la delicata organizzazione spaziale e strutturale gerarchica della matrice extracellulare neuronale. I vantaggi e le applicazioni del Bioprinting sono potenzialmente vastissimi e ancora in fase di esplorazione. L’impatto di nuove tecnologie, nuovi materiali e tecniche bioigegneristiche d’avanguardia potrebbero rappresentare non solo un passo avanti nel campo della rigenerazione neurale, ma anche per la comprensione di processi fisiologici ed ancor di più patofisiologici del Sistema Nervoso Centrale.

L’ingegneria tissutale rappresenta oggi una delle tematiche più importanti di ricerca in ambito medico-ingegneristico. Questa disciplina si pone come obiettivo di far fronte alla mancanza, sostituzione o riparazione di tessuto attraverso lo sviluppo di scaffolds opportunamente ottimizzati. I polimeri naturali rappresentano una classe di materiali particolarmente indicata per soddisfare i requisiti richiesti soprattutto per la biocompatibilità che spesso li caratterizza. La gelatina è uno dei materiali che si presta alla realizzazione di scaffolds innovativi ad altissima biocompatibilità nonostante le scarse proprietà meccaniche e la facilità di degradazione. Proprio per questo è possibile migliorarne le prestazioni attraverso l’ottimizzazione di processi di blending con altri polimeri, in questo caso le nanofibre di cellulosa e l’impiego di agenti reticolanti. Lo scopo di questo lavoro di tesi, svolto presso l’Istituto di Scienza e Tecnologia dei Materiali Ceramici (ISTEC-CNR) di Faenza, è la progettazione, lo sviluppo e la caratterizzazione di scaffolds polimerici porosi a base di gelatina e nanocellulosa opportunamente reticolati per un ampio range di applicazioni nell’ambito dell’ingegneria tissutale. A questo scopo, sono stati sviluppati cinque dispositivi 3D porosi, ottenuti tramite liofilizzazione, che differiscono per il tipo di processo reticolante applicato. Il progetto ha previsto una prima fase di ricerca bibliografica che ha permesso di conoscere lo stato dell’arte sull’argomento trattato. Si è potuto così procedere alla realizzazione degli scaffolds e a una prima caratterizzazione di carattere chimico-fisico e morfologico. A questo punto, sulla base dei dati ottenuti, sono stati scelti i campioni su cui effettuare ulteriori caratterizzazioni meccaniche. In ultimo, sono stati analizzati e rielaborati tutti i risultati.

Le malattie respiratorie colpiscono milioni di persone in tutto il mondo, indipendentemente dalla fascia d'età o dallo status socioeconomico, emergendo come una delle principali cause di disabilità e morte. Molte di esse possono alterare la struttura e la funzione di diversi tratti respiratori, influenzando in modo sostanziale la vita dei pazienti. Purtroppo, il numero di persone affette da questi disturbi è drammaticamente in aumento a causa della pandemia da COVID-19 in corso. In caso di ampie alterazioni strutturali, i trattamenti medici disponibili e le strategie chirurgiche standard sono inefficaci o totalmente inapplicabili. Nonostante gli approcci chirurgici e le strategie di “tissue-engineering” (TE) proposti per affrontare questa urgente necessità medica, ad oggi nessuna strategia è diventata una procedura clinica ben consolidata e applicata di routine. Una delle maggiori difficoltà riscontrate in questi approcci clinici è la rigenerazione di un epitelio stabile sul costrutto trapiantato. Questa caratteristica è indispensabile per preservare la funzionalità respiratoria, evitare infezioni, formazione di tessuto di granulazione e re-stenosi. La fonte cellulare più appropriata per la rigenerazione dell’epitelio respiratorio in approcci di TE sarebbero le cellule epiteliali adulte del tessuto stesso. Tuttavia, la loro espansione in-vitro è resa difficile dal fatto è stato osservato siano capaci di dividersi efficientemente solo per pochissimi passaggi, oltre i quali perdono il loro potenziale di differenziazione e la capacità di formare una barriera funzionale. Pertanto si pensa che tali cellule siano inadatte e inaffidabili per approcci di TE. In questo studio abbiamo dimostrato la sicurezza e l’efficacia di un sistema di coltura, clinicamente validato per l’espansione di diversi tessuti epiteliali, nel mantenere il potenziale di proliferazione e differenziazione a lungo termine delle cellule epiteliali delle vie aeree. Inoltre, abbiamo stabilito dei controlli di qualità riproducibili da adottare nei diversi stadi di un approccio di TE. Tali controlli di qualità comprendono/verificano 1) le proprietà rigenerative delle cellule estratte dalla biopsia, 2) l'espressione di alcuni marcatori critici che identificano l'identità cellulare, l'integrità tessutale e il differenziamento epiteliale precoce delle colture. Questi marcatori devono essere verificati sia durante l'espansione cellulare in-vitro, sia durante il processo di TE. 3) Di cruciale importanza, abbiamo identificato le cellule staminali dell'epitelio delle vie aeree. Queste cellule sono in grado di auto-rinnovarsi, sopportando anche condizioni di differenziazione estreme per rigenerare il tessuto, mantenendo la sua eterogeneità fisiologica. Abbiamo ipotizzato l'uso di alcuni fattori di trascrizione, come possibili marcatori molecolari da adottare, in alternativa all'analisi clonale, per la valutazione della percentuale di cellule staminali all'interno di una coltura delle vie aeree. Inoltre, le molte analisi condotte a livello di singola cellula ci ha permesso di comprendere i meccanismi alla base del processo di specializzazione cellulare. Questo ci ha portato a proporre un modello che descrive come il rinnovamento epiteliale delle vie aeree e il processo di differenziazione potrebbero avvenire. Infine, grazie alle conoscenze acquisite durante la caratterizzazione delle colture in-vitro e alla coerenza dei risultati ottenuti da molti donatori umani, abbiamo deciso di avviare uno studio pilota che prevede la ricostruzione di uno pseudo-turbinato per il trattamento dei pazienti affetti da sindrome del naso vuoto. In questa tesi, presentiamo anche la nostra strategia di TE e i dati ottenuti dalle fasi iniziali su cui si basa questo approccio.
Respiratory diseases affect millions of people globally, regardless of age, group or socioeconomic status, emerging as one of the major causes of disability and death overall. Many diseases can alter the structure and function of the different tracts of the respiratory system, substantially affecting the patients' life. Even worst, the number of people affected by these disorders is dramatically increasing due to the ongoing COVID-19 pandemic. In the case of wide structural alterations, the available medical treatments and the standard surgical strategies are ineffective or totally inapplicable. Despite the surgical based approaches and the tissue-engineering (TE) strategies tested to face this urgent medical need, the positive results obtained have been very few and, to date, no strategy has become a well-established and routinely-applied clinical procedure. One of the major difficulties encountered in these clinical approaches is the regeneration of a stable/self-renewing epithelium onto the transplanted graft. This feature is imperative to preserve the respiratory function, avoid infections, granulation tissue formation and re-stenosis. In TE strategies, the adult airway epithelial cells would be the most appropriate cellular source for restoring the airway epithelium. However, many difficulties have been encountered in the in-vitro expansion of these cells. Indeed, they were described as effectively dividing for a very limited number of passages, beyond which they lose their differentiative potential and the ability to form a functional barrier. Therefore, it is reported that autologous airway epithelial cells do not meet the clinical regeneration needs and are unsuitable and unreliable cell sources for TE approaches. In the present study, we proved the ability of a culture system, largely used for the clinical expansion of different epithelial tissues, to safely and effectively maintain the long-term proliferative and differentiation potential of airway epithelial cells. Moreover, we established reproducible quality controls to be adopted from the biopsy collection up to the first steps of the generation of a TE construct. These quality controls include/verify 1) the tissue-regenerative properties of the cells extracted from the biopsy, 2) the expression of some critical markers identifying the cellular identity, the tissue integrity and the early epithelial differentiation of the cultures. These markers have to be verified during both the in-vitro cell expansion and during the TE process. 3) Crucial, we assessed the heterogeneity of the basal cells, identifying the stem cells of the airway epithelium. These cells can self-renew, withstanding even extreme differentiation conditions to regenerate the tissue, maintaining its physiological heterogeneity. Here, we hypothesized the use of some transcription factors as possible molecular markers to be adopted, alternatively to the clonal analysis, to evaluate the percentage of stem cells within an airway culture. Moreover, the multiple analyses conducted at the single-cell level allowed us to understand the mechanisms that underlie the cellular differentiation/specialization process. Therefore, here we propose a model showing how the airway epithelial renewal and differentiation process could occur. Finally, thanks to the knowledge acquired during the in-vitro cultures characterization and to the consistency of the results obtained from many human donors, we decided to start a pilot study envisaging the reconstruction of a pseudo-turbinate for the treatment of Empty Nose Syndrome’s patients. In this manuscript, we present our TE strategy and the data obtained by the initials steps on which this approach is based.

Ogni anno vengono praticati a livello mondiale più di due milioni di interventi di bone grafting. L’incidenza delle patologie legate al tessuto osseo, causate da traumi, malattie o tumori, sta sempre più aumentando, anche a causa dell’invecchiamento della popolazione mondiale. Come diretta conseguenza si riscontra una crescita della richiesta di trattamento dei difetti dell’osso. Le tecniche ad oggi adottate nella pratica clinica, quali autograft ed allograft, presentano delle complicanze, come infezioni, morbidità del sito donatore, perdita di proprietà meccaniche del tessuto. L’ingegneria dei tessuti si pone come strategia innovativa per la riparazione del tessuto osseo, attraverso l’utilizzo di scaffolds realizzati con biomateriali su cui coltivare cellule staminali da indirizzare verso il fenotipo osteogenico. Poiché risulta di fondamentale importanza ricreare in vitro un ambiente di coltura il più fedele possibile a quello in vivo, nel presente elaborato si analizzano applicazioni di costrutti all’interno di bioreattori. Una corretta interazione tra questi dispositivi, i biomateriali e le cellule permette di aumentare sia l’efficacia che la controllabilità e la riproducibilità dei processi dell’ingegneria dei tessuti. È quindi la combinazione intelligente dei vari fattori caratterizzanti l’ingegneria tissutale ossea che può portare a colmare quel gap presente tra ricerca e applicazione, affinché una strategia così promettente trovi un’effettiva trasposizione nella pratica clinica.