Littérature scientifique sur le sujet « Réparation des mésappariement »

Background: Muir-Torre syndrome (MTS) is a rare genodermatosis considered a subtype of hereditary nonpolyposis colorectal cancer and traditionally associated with mutations in the mismatch repair genes. Objective: We describe a 51-year-old male with primary manifestations of recurrent sebaceous adenoma of the upper eyelid, a positive cancer family history, and metachronous occurrence of colorectal cancer. Method: The diagnosis of MTS was established based on the clinical course, family history, and histopathologic findings, although further immunohistologic testing revealed the absence of MSH2 mutation. We additionally performed an updated summary of published MTS cases with sebaceous neoplasms originating from the eyelid and conjunctiva for the period 2005 to 2011. Conclusion: This patient, the second Greek case described in the international literature, is of interest mainly because of the metachronous occurrence of the visceral malignancy in combination with the absence of MSH2 mutation. The need for high clinical suspicion for MTS in cases with sebaceous lesions of the periocular region should therefore be reinforced regardless of the mutational screening test undertaken. Contexte: Le syndrome de Muir-Torre (SMT) est une génodermatose rare, considérée comme un sous-type du cancer colorectal héréditaire, non polyposique, et habituellement associée à des mutations des gènes de réparation des mésappariements. Objectif: Nous faisons état ici du cas d'un homme de 51 ans, présentant l'accumulation de faits suivants: manifestations primaires d'adénome sébacé récidivant de la paupière supérieure, antécédents familiaux de cancer, et apparition asynchrone d'un cancer colorectal. Méthode: Le diagnostic de SMT a été posé à partir de l'évolution clinique, des antécédents familiaux, et de l'examen histopathologique, bien que les analyses immunohistologiques ultérieures aient révélé l'absence de mutation du gène MSH2. Nous avons également procédé à la mise à jour d'un résumé de cas publiés de SMT, accompagné de néoplasmes sébacés prenant naissance dans la paupière et la conjonctive, qui se sont produits durant la période de 2005 à 2011. Conclusion: Ce qui fait surtout l'intérêt du présent cas, le deuxième cas grec décrit dans la documentation internationale, est l'apparition asynchrone d'un cancer des viscères malgré l'absence de mutation du gène MSH2. Ce cas vient donc renforcer la nécessité d'avoir constamment à l'esprit la possibilité de SMT dans les cas de lésions sébacées dans la région périoculaire, et ce, indépendamment du test de dépistage de mutations.

La déficience du système de réparation des mésappariements de bases aboutit à une instabilité des séquences répétées ou microsatellites (MSI) qui engendre des mutations au niveau de gènes cibles de l’oncogenèse MSI. L'objectif de ma Thèse consistait à définir les conséquences fonctionnelles des mutations d’un nouveau gène cible de la tumorigenèse colorectale MSI : le gène SMAP1 (Small ArfGAP1) qui code une protéine de la famille ArfGAP (ADP ribosylation factor GTPase Activating Protein) spécifique d’Arf6, protéine impliquée dans de nombreux mécanismes cellulaires. Les mutations de SMAP1 sont spécifiques des tumeurs MSI de différentes origines tissulaires et n’apparaissent qu’au niveau de la répétition (A10). Dans les tumeurs colorectales primaires, la fréquence de mutations de SMAP1 observées diminue au cours de la progression tumorale suggérant que les tumeurs dépourvues de mutations de SMAP1 sont plus invasives. D’un point de vue fonctionnel, les mutations de SMAP1 ont pour conséquences un défaut dans le recyclage rapide du récepteur à la transferrine, une augmentation de la prolifération cellulaire et une diminution du pouvoir invasif en maintenant les jonctions adhérentes. Ainsi, nos observations montrant que les mutations de SMAP1 augmentent le pouvoir prolifératif mais diminuent le pouvoir invasif des lignées cellulaires issues de CCR MSI pourraient expliquer certaines caractéristiques cliniques des CCR MSI, les tumeurs MSI étant en effet des tumeurs volumineuses, ayant un faible pouvoir métastatique
Tumours that are deficient in mismatch repair system accumulate numerous mutations throughout the genome in repeated sequences, called microsatellites. Genes that contain microsatellite in their sequence are target genes of microsatellite instability (MSI). The aim of my thesis was to determine the functional consequences of mutations occurring in a newly identified target gene of the MSI oncogenesis : SMAP1 (Small ArfGAP1), which encodes a protein of the ArfGAP (ADP ribosylation factor GTPase Activating Protein) family specific for Arf6, a protein involved in clathrin-mediated endocytosis and actin remodelling. SMAP1 mutations are specific for MSI tumours of various tissue origins and occur in its coding poly (A)10 microsatellite. SMAP1 mutations are especially frequent in MSI colorectal cancers (CRC), in which its mutation frequency decreases with tumour progression suggesting that tumours devoid of SMAP1 mutations are more invasive. Functional experiments allowed us to show that SMAP1 mutations lead to a defect in the fast recycling step of the transferrin receptor trafficking, to increased cell proliferation and to decreased invasiveness by maintaining the adherent junctions. Interestingly, our observations showing that SMAP1 mutations increase the proliferative potential but reduce the invasiveness of MSI CRC-derived cell lines may explain some of the MSI CRCs clinical features, notably their large size and low metastatic potential

La réparation post-réplicative des mésappariements dans l'ADN est présente dans presque tous les organismes. Une absence ou un dysfonctionnement dans son mécanisme mène à un phénotype mutant et, chez l'humain, à un prédisposition au cancer. Chez Escherichia coli (E. Coli), ce mécanisme est initié par MutS qui, après avoir reconnu le mésappariement, recrute et s'associe à une ATPase : MutL. L'activation de l'endonucléase MutH permet une coupure de brin non méthylé sur le premier 5'- GATC hémiméthylé trouvé à proximité (jusqu'à lkbp) du mésappariement. Suite cela, une hélicase, UvrD, intervient afin de séparer le brin endommagé du brin matrice pour préparer son excision et sa re-synthèse. Malgré une très bonne compréhension générale du système, de nombreuses questions restent sans réponse. Je propose dans cette thèse une étude détaillée des paramètres mécaniques et cinétiques des étapes d'initiation et d'excision du système de réparation des mésappariements. L'utilisation de pinces magnétiques m'a permis de décrire un système de communication entre le dégât et le site de coupure, et de comprendre le mécanisme de chargement de l'hélicase UvrD avant excision du brin contenant le mésappariement
Postreplicative DNA mismatch repair is present in almost all organisme. Absence or failure of this system leads to mutator phenotype and, in humans, predisposition to cancer. In E. Coli the process is initiated by MutS that recognizes the mismatch and associates with an ATPase : MutL. Activation of the endonuclease MutH leads to nicking of the unmethylated single strand at the first hemymethylated 5'- GATC site (up to lkbp) close to the mismatch. Once the DNA is nicked, an helicase, UvrD, unwinds the DNA to extract and later excise the damaged strand to allow for its re-synthesis. In this PhD I propose a single-molecule analysis of the mismatch repair initiation and excision steps in Escherichia coli from a mechanical and kinetic standpoint. Using a single molecule technique, I have been able to show that a diffusion mechanism of proteins MutS and MutL from mismatch to a GATC site is the most likely, and to deciphe the mechanism by which UvrD is loaded at the nicking site to start the excision process

Les cancers MSI sont déficients dans le système de réparation des mésappariements de base de l'ADN (système « Mismatch Repair »). L'inactivation de ce système est à l'origine de l'accumulation d'erreurs de réplication non réparées dans le génome de ces tumeurs, en particulier au niveau des séquences répétées, dites microsatellites de l'ADN ; ces tumeurs sont désignées MSI pour « Microsatellites Instables ». Les cancers MSI sont héréditaires, associés au syndrome colorectal familial (syndrome de Lynch ou HNPCC), et représentant également 15-20% des tumeurs sporadiques du côlon, de l'estomac et de l'endomètre. Plus récemment, un phénotype MSI a été rapporté dans d'autres tumeurs de survenue sporadique, notemment du fait de travaux réalisés dans le laboratoire d'acceuil ; ce phénotype a été décrit en particulier dans les lymphomes non hodgkiniens (LNH), mais cela uniquement dans les LNH survenant dans un contexte d'immunodépression (ID-RL), i. E. Chez les patients SIDA ou greffés d'organes et traités par immunosuppresseurs au long cours. Les objectifs de mon travail de thèse ont été dans ce contexte : (i) de préciser l'incidence de MSI dans les ID-RL et les caractéristiques cliniques et biologiques de ces lymphomes comparativement aux autres ID-RL (ID-RL non-MSI) ; (ii) de mettre en évidence une association éventuelle à MSI au sein d'autres types tumoraux fréquents du patient ID, e. G. Dans les cancers spino-cellulaires cutanés (ID-SCC) et les sarcomes de Kaposi (ID-KS). Mes travaux établissent que le phénotype MSI est rarement observé dans les ID-RL, venant représenter 2-5% des LNH du patient SIDA et 10% environ des LNH post-greffe (PTLD). Brièvement, les PTLD MSI se caractérisent par leur survenue tardive après la greffe (médiane > 5 ans), une faible association à l'EBV (< 50%), et une origine lymphocytaire T fréquente (50% des PTLD T sont MSI). MSI est significativement associé dans ces tumeurs à la prise d'Azathioprine (Imurel) par les patients. Par ailleurs, les pertes d'expression de protéines MMR sont panachées dans les ID-RL et affectent aussi bien MLH1, que MSH2 ou MSH6. L'inactivation de l'expression de ces protéines est significativement associée à l'inactivation de la protéine MGMT en raison d'une méthylation fréquente du promoteur du gène dans la tumeur. Enfin, les ID-RL MSI se caractérisent par une relative stabilité sur le plan cytogénétique et la survenue fréquente de mutations de l'oncogène BRAF (Borie et al. , Int. J Cancer 2010). Dans les SCC et les KS, mes travaux n'ont pas permis d'identifier de tumeurs MSI, suggérant la non participation de ce processus oncogénique à la tumorigenèse cutanée chez le patient ID (Borie et al. , Am. J. Transpl. , 2010). Ces études ont généralement porté sur de larges séries de tumeurs ID-RL, SCC et KS, permettant de conclure sur la part de MSI dans l'oncogenèse de ces tumeurs. De manière intéressante, certaines caractéristiques cliniques et moléculaires originales associées aux ID-RL MSI sont maintenant identifiées. En perspective, la nécessité de développer désormais des études visant à mieux identifier les caractéristiques pronostiques et de réponse aux traitements de ces tumeurs par rapport aux autres ID-RL serait d'intérêt, en particulier pour les PTLD-T. A l'instar de ce qui a été rapporté pour d'autres localisations tumorales chez l'homme, MSI pourrait être en effet un facteur à prendre en compte dans la prise en charge de ces lymphomes chez les patients
MSI cancers arise as a consequence of loss of fonction of the DNA Mismatch repair system ("MMR" System). Inactivation of this system results in accumulation of replication errors in the genome of these tumors, in particular in repetitive séquences of the DNA called microsatellites; these tumors are therefore called MSI for " Instable Microsatellite". MSI cancers are inherited diseases associated with familial the colorectal cancer (Lynch syndrom or HNPCC), and represent 15-20 % of sporadic colorectal, gastric and endometrial cancers. Recently, the MSI phenotype was reported in other sporadic cancers. In particular owing to the works realized in our laboratory; this phenotype was described in non Hodgkin lymphomas (NHLs), but only in the NHL arising in an immuno-suppression context ( ID-RL), i. E. HIV-related or after organ transplantation. The objectives of my thesis were in this context: i) to specify the incidence of MSI in the ID-RL and establish the clinical and biological characteristics of these lymphomas compared with the other ID-RL (ID-RL not -MSI); ii) to search for a possible association between MSI and other frequent immuno-supression related tumoral types, e. G. In the squamous cell carcinomas cancers (ID-SCC) and the Kaposi's sarcomas (ID-KS). We established that the MSI phenotype is rarely observed in the ID-RL, representing 2-5 % of HIV-related NHL and approximately 10 % of PTLD. Briefly, MSI PTLD are characterized by their late occurrence after organ transplantation (median > 5 years), rare association with EBV (< 50 %), and frequent T phenotype (50 % of the PTLD T are MSI). MSI is significantly associated in these tumors after Azathioprine (Imurel) treatement. Further, loss of expression of the MMR proteins is heterogeneous in the ID-RL : MLH1, as well MSH2 or MSH6 can be involved. Loss of expression of O6 methyl guanine transferase (MGMT), a repair enzyme whose inactivation helps in selection of MMR deficient clones, was significantly associated with MSI in ID-RL. Finally, ID-RL MSI are characterized by few chromosomal rearangements and frequent mutations of the oncogene BRAF (Borie and al. , Int. J Cancer on 2010). My work involved the study of large series of tumors ID-RL, SCC and KS, to better understand the role of MSI in the oncogenetic process. Interestingly, I contributed to the identification of original clinical and molecular features of ID-RL MSI. Prospectives studies are needed to better define prognostic factors and therapeutic protocols of these tumors as compared with to the other ID-RL. This would be in particular interest, in PTLD-T. Following the example of what has been reported in other tumors, MSI could indeed be a factor to take into account in the treatment of these lymphomas

Contexte : Le cancer colorectal (CCR) déficient en réparation des mésappariements (MMR-D), hypermuté et aux microsatellites instables (MSI) est moins enclin au développement de métastases, et présente un pronostic défavorable après récidive, par rapport au CCR aux microsatellites stables (MSS). Les mécanismes derrière ces deux phénomènes sont encore inexpliqués, principalement en raison du manque d'un bon modèle in vivo de cancer métastatique MSI.Méthodes : Nous avons inactivé le gène Msh2 dans la lignée cellulaire de cancer du sein 4T1luc+, exprimant la luciférase. Le phénotype MMR-D, marqué par une accumulation de mutations ponctuelles à l'échelle du génome et d'insertion-délétion (indels) aux sites de microsatellites, a été établi par des passages sériels in vitro avant l'injection orthotopique dans le coussinet adipeux mammaire inférieur gauche de souris BALB/c. Le développement métastatique a été suivi par imagerie in vivo de l'activité luciférase. Les tumeurs primaires des souris, ayant développé des métastases ou non, ont été séquencées, et des analyses génomiques et transcriptomiques menées. La caractérisation des cellules CD45+ a été réalisée par cytométrie en flux spectrale sur les tumeurs primaires, les sites secondaires (tissu pulmonaire), la moelle osseuse et le sang, avant et après l'implantation tumorale, afin de mieux comprendre les différents microenvironnements associés.Résultats : Une différence significative dans l'apparition des métastases a été observée entre souris porteuses de tumeurs MSS et MSI (100 % contre 82,3 %, p = 0,0456). De plus, les souris présentant des métastases MSI ont montré un développement métastatique moins prononcé à certains sites par rapport aux souris MSS. Le séquençage de l'exome complet (WXS) a révélé que la charge mutationnelle tumorale (mutations non-synonymes/megabase), les indels, ainsi que le MSIscore (pourcentage de microsatellites instables) étaient plus élevés dans les tumeurs MSI comparées aux MSS, mais ces différences n'expliquent pas l'écart de développement métastatique. Les analyses transcriptomiques ont mis en évidence que les tumeurs MSS expriment des programmes associés à la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), tandis que les tumeurs primaires MSI et les tumeurs métastatiques MSI étaient respectivement enrichies en signatures prolifératives et immunitaires. Il est à noter que les tumeurs métastatiques MSI étaient spécifiquement enrichies d'une signature hybride EMT, un indicateur d'agressivité tumorale. Par ailleurs, la cytométrie spectrale a permis d'identifier des populations spécifiques de macrophages et de neutrophiles associés aux tumeurs MSI (TAMs-MSI et TANs-MSI) tant dans les tumeurs primaires que sur les sites métastatiques. Enfin, nous avons découvert que l'infiltration de TANs-MSI (mais pas de TAMs-MSI) au niveau des sites secondaires précédait le développement métastatique et pourrait contribuer à la formation d'une niche pré-métastatique spécifique au MSI.Conclusion : Nous avons établi un modèle de cancer métastatique MSI, reproduisant les caractéristiques principales de la maladie, telles qu'une accumulation de mutation et d'indels élévé, ainsi qu'un potentiel métastatique diminué. Nos résultats montrent que la progression métastatique dans ce modèle MSI est associée à une réduction de l'activité immunitaire à la tumeur primaire, et que les tumeurs métastatiques MSI présentent un enrichissement en signatures prolifératives et en signatures hybrides EMT, pouvant ainsi expliquer le mauvais pronostic observé après récidive chez les patients. De plus, ce modèle a mis en lumière des populations myéloïdes spécifiques aux tumeurs MSI ainsi qu'une niche pré-métastatique potentielle liée au MSI. Ce modèle constitue ainsi un outil précieux pour la recherche fondamentale et translationnelle sur le cancer métastatique MSI, tout en apportant de nouvelles perspectives sur les interactions entre le développement métastatique et le phénotype MSI
Background: It is established that mismatch repair deficient (MMR-D), hypermutated and microsatellite instable (MSI) colorectal cancer (CRC) is less prone to metastasis, and has worse prognosis after recurrence, than microsatellite stable (MSS) CRC. The mechanisms behind both these phenomena are still elusive, mainly due to the lack of a good in vivo model of metastatic MSI cancer.Methods: We generated Msh2 knockouts in the luciferase expressing breast cancer cell line 4T1luc+. The MMR-D phenotype, an accumulation of point mutations genome-wide and insertion-deletion (indels) at microsatellite sites, was established by serial passages in vitro before orthotopic injection in the lower left mammary fat pad of BALB/c mice. Metastasis development was assessed through in vivo imaging of luciferase activity. Primary tumors of mice bearing metastasis, or not, were sequenced, and genomic and transcriptomic analysis were performed. Spectral flow cytometry of CD45+ cells was carried out on primary tumors, secondary site (lung tissue), bone marrow and blood before and after tumor engraftment, to characterize the different microenvironments.Results: A significant difference in metastasis occurrence was noted between the MSS and MSI tumor-bearing mice (100% vs 82.3%, p = 0.0456). Moreover, MSI metastatic mice exhibited less site-specific metastatic development compared to their MSS counterparts. Whole exome sequencing (WXS) revealed that tumor mutation burden (TMB, non-synonymous mutations/megabase), indels, and MSIscore (percentage of instable microsatellites) were elevated in the MSI tumors compared to MSS, but did not explain the difference in metastasis occurrence. Transcriptomic analyses demonstrated that MSS tumors express epithelial-mesenchymal transition (EMT) related programs, while MSI metastatic and MSI localized primary tumor were enriched in proliferative and immune related signatures, respectively. Interestingly, MSI metastatic tumor were uniquely enriched with a hybrid EMT signature, a marker of cancer aggressiveness. Furthermore, spectral cytometry uncovered MSI-specific populations of tumor-associated macrophages and neutrophils (MSI-TAMs and MSI-TANs) at the primary tumor and metastatic sites. Finally, we discovered that MSI-TANs (but not MSI-TAMs) infiltration at secondary site predate metastatic development, and may participate in the creation of an MSI-specific pre-metastatic niche.Conclusion: We successfully developed a model of MSI metastatic cancer, recapitulating the hallmarks of the disease, namely elevated TMB, indels and MSIscore, as well as decreased metastatic potential. We have shown that metastatic development in our MSI model is associated with lower immune activity at the primary tumor, and that MSI metastatic tumors are enriched in proliferative and hybrid EMT signatures, that may explain the poor prognosis after recurrence in patients. At last, this model unveiled MSI-specific tumor-associated myeloid populations, and a potential MSI pre-metastatic niche. We provide here a model for fundamental and translational research on MSI metastatic disease, and provide insights on the crosstalk between metastasis development and the MSI phenotype

La méiose est un processus de ségrégation des chromosomes essentiel pour la gamétogenèse chez tous les organismes qui présentent une reproduction sexuée. Ce mécanisme nécessite des connections entre chromosomes homologues et des structures intermédiaires d’ADN appelées Jonction de Holliday. Ces jonctions sont résolues principalement par complexe MutLγ (Mlh1-Mlh3). Des mutations sur les gènes impliqués en méiose s’accompagnent chez l’homme de problèmes allant de la stérilité à des réarrangements chromosomiques comme la trisomie. Mlh1-Mlh3 joue aussi un rôle dans la voie de réparation des mésappariements de l’ADN (MisMatch Repair - MMR). Notre laboratoire a révélé la première structure cristalline de la région C-terminale du complexe MutLα (Mlh1-Pms1) qui est l’endonucléase majeure de la voie MMR. Mon projet de thèse s’insère dans le cadre de l’étude des différentes fonctions des MutL eucaryotes et plus particulièrement sur le mécanisme moléculaire de MutLγ (Mlh1-Mlh3). Au cours de ma thèse, nous avons déterminé la structure cristalline du domaine C-terminale du complexe Mlh1-Mlh3 qui contient le site d’endonucléase et caractérisé 3 états du site actif. Nous avons montré le rôle de Mlh1 dans le site endonucléase. Nous avons caractérisé la spécificité de ce domaine pour les Jonctions de Holliday et proposé un modèle du site de fixation de l’ADN sur le complexe entier. Ce modèle a permis de proposer un nouveau mutant de séparation de fonction de Mlh1-Mlh3, appelé KERE, qui a été analysé par gel retard et génétique
Meiosis is key process in sexual reproduction, where chromosomes are segregated. During this process, a parental diploid cell divides into haploid gametes. This mechanism requires connections between homologous chromosomes and intermediate DNA structures called Holliday Junctions. These junctions are mainly resolved by MutLγ (Mlh1-Mlh3) complex. Mutations of genes involved in meiosis are associated with human diseases including sterility and chromosomal rearrangements such as trisomy. Mlh1-Mlh3 plays also a role in DNA mismatch repair (MMR). Our laboratory has characterized the first crystal structure of the C-terminal region of the MutLα complex (Mlh1-Pms1) which is the major endonuclease in MMR. My thesis aims at understanding the molecular mechanism of MutLγ (Mlh1-Mlh3) mainly involved in meiosis and to compare it with Mlh1-Pms1 mainly involved in MMR.We determined the crystal structure of the C-terminal domain of the MutLγ complex which contains the endonuclease site. We characterized the structure of three different states of the active site. We showed how Mlh1 is an integral part of the Mlh3 endonuclease site. We characterized the specificity of this domain for Holliday Junctions and proposed a model of the full-length complex and its DNA binding sites. Finally, we design new separation of function allele of Mlh1-Mlh3, called KERE, which was analyzed by EMSA and genetic experiments

Les cellules vivantes sont constamment soumises à des agents, endogènes et exogènes, qui peuvent induire des lésions sur l'ADN. Ces agents peuvent menacer l'intégrité du génome, bloquer les processus de réplication, transcription et traduction, ou encore avoir des effets génotoxiques. Les organismes ont alors développé des systèmes de surveillance qui coordonnent la réparation de l'ADN et la progression du cycle cellulaire afin de lutter contre l'accumulation de dommages sur leur ADN. Les mécanismes de réparation de l'ADN, découverts à la fois dans les organismes procaryotes et eucaryotes, ont pour rôle le maintien de l'intégrité du matériel génétique. Ces mécanismes comprennent la réparation par excision de nucléotides (NER), la réparation par excision de bases (BER), la réparation des mésappariements (MMR) et la réparation des cassures double-brin (DSBR). La réparation couplée à la transcription (RCT) est une sous-voie de la réparation par excision de nucléotides qui permet une réparation rapide des lésions uniquement localisées sur le brin transcrit et affectant des gènes en cours de transcription. Elle se différencie de la sous-voie de la réparation du génome global (GGR) qui opère sur l'ensemble du génome sans distinction entre les brins transcrits et non transcrits. L'implication dans la RCT de l'ARN Polymérase (ARNP) et de la protéine Mfd (Mutation Frequency Decline), aussi connue sous le nom TRCF (Transcription Repair Coupling Factor), est ce qui permet la réparation préférentielle du brin transcrit. Le blocage de l'ARNP par une lésion sur le brin transcrit agit comme un senseur de dommage et déclenche la RCT. En effet, l'ARNP bloquée doit être déplacée afin de rendre la lésion accessible aux facteurs de réparation avals. Chez E. Coli c'est la translocase Mfd qui joue ce rôle : elle déplace l'ARNP bloquée et coordonne l'assemblage des facteurs UvrAB(C) au site de la lésion. Des études récentes ont montré que, après s'être lié à l'ARNP et l'avoir déplacée, Mfd reste sur l'ADN sous la forme d'un complexe de translocation stable impliquant l'ARNP même si cette dernière n'est plus directement liée à l'ADN. La technique de nanomanipulation par pince magnétique de molécules uniques d'ADN portant une lésion a été utilisée afin de comprendre comment UvrAB(C) sont recrutés via le complexe Mfd-ARNP. Cette technique a permis d'observer en temps réel jusqu'à l'incision par UvrC la RCT, qui comporte un grand nombre d'étapes et implique de nombreuses protéines. Il a été observé que le recrutement d'UvrA et d'UvrAB par le complexe Mfd-ARNP stoppe la translocation du complexe sur l'ADN et entraine la dissolution du complexe avec un passage de relais moléculaire dans une cinétique lente. La combinaison de la nanomanipulation de molécule-unique avec la fluorescence montre en outre que la dissolution du complexe entraine non seulement la perte de l'ARNP mais aussi celle de Mfd. Ce passage de témoin moléculaire permet d'avoir une réaction d'incision du brin endommagé par UvrC plus rapide par rapport à ce qui se produit lors de la réaction sur une molécule unique dans le cadre de la réparation globale du génome. Un modèle global intégrant les protéines impliquées dans la RCT et la GGR et donnant les caractéristiques cinétiques des différentes réactions se produisant en parallèle dans les deux sous-voies a été proposé
The DNA in living cells is constantly threatened by damages from both endogenous and exogenous agents, which can threaten genomic integrity, block processes of replication, transcription and translation and have also genotoxic effects. In response to the DNA damage challenge, organisms have evolved diverse surveillance mechanisms to coordinate DNA repair and cell-cycle progression. Multiple DNA repair mechanisms, discovered in both prokaryotic and eukaryotic organisms, bear the responsibility of maintaining genomic integrity; these mechanisms include nucleotide excision repair (NER), base excision repair (BER), mismatch repair (MMR) and double strand break repair (DSBR). Transcription-coupled DNA repair (TCR) is a specialized NER subpathway characterized by enhanced repair of the template strand of actively transcribed genes as compared to the classical global genome repair (GGR) subpathway of NER which does not distinguish between template and non-template strands. TCR achieves specialization via the involvement of RNA polymerase (RNAP) and the Mfd (Mutation Frequency Decline) protein, also known as TRCF (transcription repair coupling factor). TCR repair initiates when RNAP stalls at a DNA lesion on the transcribed strand and serves as the da mage sensor. The stalled RNAP must be displaced so as to make the lesion accessible to downstream repair components. E. Coli Mfd translocase participates in this process by displacing stalled RNAP from the lesion and then coordinating assembly of the UvrAB(C) components at th( damage site. Recent studies have shown that after binding to and displacing stalled RNAP, Mfd remains on the DNA in the form of a stable, translocating complex with evicted RNAP. So as to understand how UvrAB(C) are recruited via the Mfd-RNAP complex, magnetic trapping of individual, damaged DNA molecules was employed to observe-in real-time this multi¬component, multi-step reaction, up to and including the DNA incision reaction by UvrC. It was found that the recruitment of UvrA and UvrAB to the Mfd-RNAP complex halts the translocating complex and then causes dissolution of the complex in a molecular "hand-off" with slow kinetics Correlative single-molecule nanomanipulation and fluorescence further show that dissolution of the complex leads to loss of not only RNAP but also Mfd. Hand-off then allows for enhanced incision of damaged DNA by the UvrC component as compared to the equivalent single-moleculE GGR incision reaction. A global model integrating TCR and GGR components in repair was proposed, with the overall timescales for the parallel reactions provided

Bien que le cancer colorectal (CCR) soit relativement peu fréquent en Tunisie, la proportion de cancers colorectaux développés à un âge précoce est particulièrement élevée, suggérant une susceptibilité génétique. Néanmoins, jusqu'à présent, aucune étude génétique n'a été réalisée dans la population tunisienne. Le syndrome de Lynch ou syndrome HNPCC (cancer colo-rectal héréditaire sans polypose) constitue la cause la plus fréquente de CCR héréditaire. Il est dû à des mutations germinales affectant les gènes MMR de réparation des mésappariements de l'ADN. Notre travail de Thèse a eu pour objectif principal d'étudier les caractéristiques cliniques et génétiques du syndrome de Lynch en Tunisie. L'étude a porté sur 31 familles tunisiennes suspectées de syndrome de Lynch, dont 13 (42%) répondants aux critères d'Amsterdam. Dix mutations différentes, dont 8 nouvelles, ont été identifiées dans 11 familles (35,5%) : 5 dans MSH2 et 5 dans MLH1, dont un réarrangement de grande taille. Ainsi, dans la population tunisienne, au moins 35,5% des cancers développés dans le cadre d'une suspicion de syndrome de Lynch sont liés à des mutations germinales des gènes MMR. Ceci constitue une donnée particulièrement importante à prendre en considération pour la prise en charge des patients et de leur famille. L'identification des patients présentant avec un risque élevé de développer un CCR reste problématique. Celle-ci repose essentiellement sur l'histoire familiale des patients. Néanmoins, la recherche d'instabilité microsatellitaire et l'étude de l'expression des protéines MMR sont d'un intérêt majeur pour le dépistage du syndrome de Lynch. Une partie de notre travail a eu pour objectif de tenter d'identifier de nouveaux marqueurs d'aide au diagnostic de susceptibilité au cancer colorectal. Nous avons étudié le phénotype et les caractéristiques génétiques des tumeurs de 51 patients sélectionnés selon les critères de Bethesda. Comme attendu, la présence d'instabilité microsatellitaire et la perte d'expression des protéines MMR était significativement associées à l'existence chez les patients d'antécédents familiaux de cancers colorectaux (P < 0,001). De plus, la mucine sécrétée MUC5AC qui n'est pas exprimée dans le côlon adulte normal était plus fréquemment exprimée dans les tumeurs des patients présentant une histoire familiale de cancer colorectal (P = 0,039). Bien que préliminaire, ce résultat suggère que l'étude de l'expression de MUC5AC pourrait avoir un intérêt pour l'aide au dépistage des patients à haut risque de développer un cancer colorectal

Le systeme hex assure la reparation generalisee des mesappariements chez streptococcus pneumoniae. Il intervient pour corriger les erreurs de replication et agit en recombinaison homologue entre sequences non-identiques pour eliminer des recombinants potentiels. Des systemes apparentes existent dans tout le monde vivant. Par leur role antirecombinogene, ils pourraient etre impliques dans le controle de la fidelite des echanges genetiques, constituant une barriere a la recombinaison tant intrachromosomique que interespece. Cette hypothese est appuyee par des donnees obtenues pour le systeme mut d'escherichia coli. Mais notre etude sur l'action du systeme hex en recombinaison entre sequences partiellement divergentes (homeologues) remet en cause l'universalite de cette proposition. Les resultats obtenus montrent que le systeme hex se revele incapable d'inhiber la recombinaison entre sequences divergentes de 5%. Cette absence d'action correspond a un blocage complet (saturation) de hex du a l'exces de mesappariements presents sur l'heteroduplex forme entre sequences homeologues. La presence d'un fragment divergent unique suffit a saturer hex. Cette inhibition est egalement retrouvee en recombinaison heterospecifique. La saturation de hex est corrigee par surproduction, dans la cellule, de l'une ou l'autre des proteines du systeme, hexa ou hexb, alors que leur role dans la reparation n'est pas equivalent. Ce resultat paradoxal est explique dans un modele. L'analyse de recombinants obtenus avec de l'adn divergent dans des receptrices hex#+ et hex#- montre que la saturation n'est pas un phenomene du tout ou rien, par lequel la reparation serait soit complete, soit non initiee. En effet, de plus petites sequences sont integrees dans une souche hex#+, ce qui apparait comme le resultat d'une correction par cycles successifs, initiee aux extremites du fragment donneur vers les mesappariements les plus proches. Cette analyse a precise le modele de correction des mesappariements par le systeme hex. Un autre aspect de mon travail m'a amenee a developper, a la fois, une methode de classification des streptocoques exploitant le phenomene de saturation de hex, et un test d'identification du pneumocoque par une sonde nucleique correspondant a une sequence particuliere de cet organisme, l'element box

Une élévation majeure de la charge mutationnelle (hypermutation) est observée dans certains gliomes. Néanmoins, les mécanismes de ce phénomène et ses implications thérapeutiques notamment concernant la réponse à la chimiothérapie ou à l'immunothérapie sont encore mal connus. Sur le plan du mécanisme, une association entre hypermutation et mutations des gènes de la voie de réparation des mésappariements de l'ADN (MMR) a été rapportée dans les gliomes, cependant la plupart des mutations MMR observées dans ce contexte n'étaient pas fonctionnellement caractérisées, et leur rôle dans le développement d’hypermutation restait de ce fait incertain. De plus, l'impact de l'hypermutation sur l'immunogénicité des cellules gliales et sur leur sensibilité au blocage des points de contrôles immunitaires (par exemple par traitement anti-PD-1) n’est pas connu. Dans cette étude, nous analysons de manière exhaustive les déterminants cliniques et moléculaires de la charge et des signatures mutationnelle dans 10 294 gliomes, dont 558 (5,4%) tumeurs hypermutées. Nous identifions deux principales voies responsables d'hypermutation dans les gliomes : une voie "de novo" associée à des déficits constitutionnels du système MMR et de la polymérase epsilon (POLE), ainsi qu'une voie "post-traitement", plus fréquente, associée à l'acquisition de déficits MMR et de résistance secondaire dans les gliomes récidivant après chimiothérapie par temozolomide. Expérimentalement, la signature mutationnelle des gliomes hypermutés post-traitement (signature COSMIC 11) était reproduite par les dommages induits par le témozolomide dans les cellules MMR déficientes. Alors que le déficit MMR s'associe à l'acquisition de résistance au témozolomide, des données cliniques et expérimentales suggèrent que les cellules MMR déficientes conservent une sensibilité à la nitrosourée lomustine. De façon inattendue, les gliomes MMR déficients présentaient des caractéristiques uniques, notamment l'absence d'infiltrats lymphocytaires T marqués, une hétérogénéité intratumorale importante, une survie diminuée ainsi qu’un faible taux de réponse aux traitements anti-PD-1. De plus, alors que l'instabilité des microsatellites n'etait pas détectée par des analyses en bulk dans les gliomes MMR déficients, le séquençage du génome entier à l'échelle de la cellule unique de gliome hypermuté post-traitement permettait de démontrer la presence de mutations des microsatellites. Collectivement, ces résultats supportent un modèle dans lequel des spécificités dans le profil mutationnel des gliomes hypermutés pourraient expliquer l’absence de reconnaissance par le système immunitaire ainsi que l’absence de réponse aux traitements par anti-PD-1 dans les gliomes MMR déficients. Nos données suggèrent un changement de pratique selon lequel la recherche d’hypermutation par séquençage tumoral lors de la récidive après traitement pourrait informer le pronostic et guider la prise en charge thérapeutique des patients
High tumor mutational burden (hypermutation) is observed in some gliomas; however, the mechanisms by which hypermutation develops and whether it predicts chemotherapy or immunotherapy response are poorly understood. Mechanistically, an association between hypermutation and mutations in the DNA mismatch-repair (MMR) genes has been reported in gliomas, but most MMR mutations observed in this context were not functionally characterized, and their role in causing hypermutation remains unclear. Furthermore, whether hypermutation enhances tumor immunogenicity and renders gliomas responsive to immune checkpoint blockade (e.g. PD-1 blockade) is not known. Here, we comprehensively analyze the clinical and molecular determinants of mutational burden and signatures in 10,294 gliomas, including 558 (5.4%) hypermutated tumors. We delineate two main pathways to hypermutation: a de novo pathway associated with constitutional defects in DNA polymerase and MMR genes, and a more common, post-treatment pathway, associated with acquired resistance driven by MMR defects in chemotherapy-sensitive gliomas recurring after temozolomide. Experimentally, the mutational signature of post-treatment hypermutated gliomas (COSMIC signature 11) was recapitulated by temozolomide-induced damage in MMR-deficient cells. While MMR deficiency was associated with acquired temozolomide resistance in glioma models, clinical and experimental evidence suggest that MMR-deficient cells retain sensitivity to the chloroethylating nitrosourea lomustine. MMR-deficient gliomas exhibited unique features including the lack of prominent T-cell infiltrates, extensive intratumoral heterogeneity, poor survival and low response rate to PD-1 blockade. Moreover, while microsatellite instability in MMR-deficient gliomas was not detected by bulk analyses, single-cell whole-genome sequencing of post-treatment hypermutated glioma cells demonstrated microsatellite mutations. Collectively, these results support a model where differences in the mutation landscape and antigen clonality of MMR-deficient gliomas relative to other MMR-deficient cancers may explain the lack of both immune recognition and response to PD-1 blockade in gliomas. Our data suggest a change in practice whereby tumor re-sequencing at relapse to identify progression and hypermutation could inform prognosis and guide therapeutic management