Thèses sur le sujet « Protéines fluorescentes – Propriétés mécaniques »

Depuis la découverte de la protéine fluorescente verte (GFP), celle des protéines fluorescentes photoactivables (PAFPs) a initié une révolution dans le domaine de la technologie des FP. Certaines PAFPs sont capables d'être irréversiblement photo converties d'une couleur à une autre alors que d'autres peuvent être réversiblement commutées entre des formes allumées ou éteintes. Ces protéines son intensivement employées dans les techniques de microscopie optique, particulièrement en "nanoscopie" qui permet d'atteindre une résolution optique 1 0 fois meilleure que la limite d'Abbe. Afin de développer plus en avant ces techniques, la nécessité d'obtenir des sondes fluorescentes plus lumineuses pouvant se photoconvertir ou se photocommuter efficacement est cruciale. En même temps, les marqueurs fluorescents doivent être monomériques et photostables. Pour mieux comprendre les mécanismes des phototransformations des PAFPs, trois membres de la famille ont été étudiés: EosFP, Dendra2 et IrisFP. Le phénomène de photoconversion du vert au rouge de photocommutation réversible et de photoblanchiment ont été étudiés grâce à une combinaison de cristallographie des rayons X et dl microspectrophotométrie, en utilisant le laboratoire Cryobench de l'ESRF/IBS. Les résultats nous ont permis de proposer un mécanisme de photoconversion pour EosFP et Dendra2 et de découvrir et caractériser IrisFP, première PAFP combinant à la fois les propriétés de photoconversion et de photocommutation. Les modifications structurales du chromophore associées à la formation d'un état radicalaire induit par les rayons X, probablement impliqué dans la voie de photoblanchiment des P AFPs, ont aussi été caracterisées
Since the discovery of the green fluorescent protein (GFP), the one of photoactivatable fluorescent proteins (P AFPs), notably from Anthozoan species, triggered a revolution in the field of FP technology. Sorne PAFPs are capable of being irreversibly photoconverted from a green- to a red-emitting form while other ones can be reversibly switched on and off, depending on specific excitation wavelengths. These proteins are being extensively used in optical microscopy techniques, particularly in "nanoscopy", which pro vides optical resolution 10 fold beyond the Abbe limit. Ln order to further develop these techniques, notably in term of time-resolution, the need to obtain brighter fluorescent probes that photoconvert or photoswitch efficiently is crucial. At the same time, fluorescent highlighters generally need to be monomeric and photostable. Ln order to better understand the mechanisms of phototransformations in PAFPs, three members of the family have been studied: EosFP, Dendra2 and IrisFP. The phenomena of green-to-red photoconversion, reversible photoswitching and non-reversible photobleaching have been studied by a combination of X-ray crystallography and microspectrophotometry using the Cryobench laboratory of the ESRF/IBS. Together, the results have a\lowed us to propose a mechanism for the photo conversion of EosFP and Dendra2 and to discover and characterize IrisFP, the first PAFP combining both properties of photoconversion and photoswitching. The structural modifications of the chromophore associated with an X-ray induced radical state, likely to be involved in thé photobleaching pathway of PAFPs, were also characterized

Les protéines fluorescentes sont très largement utilisées dans les études de biologie moléculaire depuis maintenant une vingtaine d’année. Pour autant, l’origine de leurs propriétés photophysiques n’est pas totalement élucidée. Dans cette thèse, nous avons essayé d’améliorer la compréhension de la photophysique de deux protéines fluorescentes particulières : Padron et EosFP.Dans la protéine Padron, nous avons étudié l’isomérisation du chromophore et cherché à déterminer si la protonation et l’isomérisation sont simultanées ou successives. Pendant l’isomérisation, le donneur de proton potentiel est le résidu Tyr159. Nous avons d’abord montré que dans le vide, le transfert de proton est peu probable quelle que soit la géométrie du chromophore. Dans la protéine (où l’effet de l’environnement n’est pas négligeable) nous avons mis en évidence par dynamique moléculaire que, durant l’isomérisation, le transfert de proton n’est presque jamais favorable et reste donc un marginal.Par ailleurs, ces mêmes dynamiques ont montré que, à la fin de l’isomérisation, il apparaît de nombreux chemins de molécules d’eau reliant le chromophore au solvant et pouvant permettre un transfert de proton. On conclut doncque l’isomérisation et la protonation ne sont pas simultanées mais successives.Dans le cas de la protéine EosFP, nous avons analysé l’effet d’une molécule d’eau présente dans une partie des structures cristallines. Les dynamiques avec le chromophore à l’état fondamental ont montré que cette molécule ne joue pas de rôle, que ce soit sur le réseau de liaison hydrogène ou sur le spectre d’absorption. Par contre, à l’état excité, les dynamiques ont montré que l’extinction de fluorescence est beaucoup plus rapide sans la molécule d’eau qu’en sa présence.Par ailleurs, ces dynamiques ont mis en évidence que la protéine bloque souvent le chromophore dans des géométries où il ne peut pas retourner à l’état fondamental ni par fluorescence, ni par conversion interne. Ces géométries « noires» jouent un rôle important dans la photophysique.Pour tenir compte de ces géométries, nous avons calculé le rendement quantique et le temps de vie de fluorescence par intégration directe le long des trajectoires et par cinétique chimique. Dans les deux cas, nous avons obtenu un accord qualitatif avec l’expérience
Fluorescent proteins are widely used in biology studies since 20 years. Yet, the origin of their photophysical properties aren’t totally explained. Here, we try to improve the understanding of two particular fluorescent proteins: Padron and EosFP.In the protein Padron, we work on the isomerization of chromophore and try to determine whether isomerization and protonation are simultaneous or successive processes. During the isomerization, the potential donor is Tyr159.First, we show that, in vacuum, the proton transfer is quite unlikely whatever the chromophore geometry.In the protein (where the environment effect isn’t negligible) we evidence with molecular dynamics that, during isomerization, proton transfer stays marginal.In addition, these dynamics shown the appearance, at the end of isomerization, of a lot of water molecules channel between the chromophore and the solvent allowing a proton transfer. We conclude that isomerization and protonation are successive processes.In the case of the protein EosFP, we first analyze the effect of a water molecule which is found only in some of the crystallographic structures.Molecular dynamics of the protein with the chromophore in the ground state show that the water molecule doesn’t play any role neither in the hydrogen bond network nor in the absorption spectra.On the contrary, in the excited state, dynamics without this water show a significant faster decay of fluorescence that those with the molecule.In addition, those dynamics have demonstrate that during long period, the protein retains the chromophore in geometries in which it is unable to convert to the ground state, neither by fluorescence nor by internal conversion. Those “dark” geometries play a crucial role in the photophysics.To take them into account, we calculate the quantum yield and the fluorescence lifetime by direct integration along trajectories and by a kinetic scheme. We obtain a good qualitative agreement with the two methods

Du fait de leur importance pour la fonction, les propriétés mécaniques des protéines font aujourd'hui l'objet d'une attention toute particulière. Nous avons utilisé divers outils de la modélisation moléculaire afin d'améliorer notre compréhension de ces propriétés. Nous avons étudié, par le biais de simulations de dynamique moléculaire, la dynamique de molécules d'adhésion cellulaire, les E-cadhérines. Dans ce cadre, nous nous sommes intéressés à l'influence des ions calcium sur la flexibilité de la molécule et sur la dimérisation. Nous avons également étudié les trois formes dimériques observées expérimentalement et discuté leur rôle potentiel dans les phénomènes d'adhésion. Nous avons par ailleurs développé divers outils méthodologiques pour l'étude des protéines. Le premier consiste en une nouvelle mesure de la flexibilité des protéines à l'échelle du résidu, obtenue par des minimisations d'énergie sous contrainte. Cette méthode permet en outre de repérer des domaines dynamiques au sein des architectures protéiques par l'étude des déformations engendrées lors de l'application des contraintes. Nous avons également développé un nouveau modèle de représentation des protéines à mi-chemin entre la représentation "tout-atome" et les représentations "gros grains", qui devrait permettre l'étude de systèmes de grande taille en conservant une précision atomique dans les zones les plus importantes de la protéine
Due to their importance for function, the mechanical properties of proteins are the subject of great attention. We have used molecular modeling techniques to gain a better understanding of these properties. We have notably used molecular dynamics simulations to study the dynamics of E-cadherin molecules which are involved in cellular adhesion. The influence of the presence of calcium ions has been monitored in the context of the change in flexibility and dimerisation. We have also examined three dimeric conformations observed experimentally and discussed their potential involvement in adhesion. We have also developed various methodological tools for the theoretical study of proteins. The first is a new index to measure protein flexibility at the single amino acid level, via the use of restrained energy minimisations. This method also allows us to determine dynamical domains within protein structures by analyzing the deformations caused by the restraints. We have also developed a new multi-scale representation of proteins, containing both coarse-grained and all-atom residues. This representation should allow us to study large Systems while keeping atomic precision within the most important parts of the protein

La bêta-lactoglobuline est une protéine globulaire présente dans le sérum du lait. Quand une solution de bêta-lactoglobuline est chauffée les protéines se dénaturent ce qui conduit à leur agrégation. Si la concentration de protéines est plus grande qu'une valeur critique un gel est formé. Le processus d'agrégation et de gélification dépend beaucoup des conditions externes comme la concentration de sel ajouté ou le pH. Cette influence peut être expliquée par des interactions électrostatiques. En effet la bêta-lactoglobuline comme les protéines en générales est un polyélectrolyte dont la densité de charges dépend du pH. Par conséquent les interactions électrostatiques dépendent du pH, mais également de la concentration en sel puisque celui-ci peut les écranter. L'objective de cette thèse est d'étudier l'influence des interactions électrostatiques sur la structure des agrégats et des gels de bêta-lactoglobuline et sur leurs propriétés mécaniques. Cette étude revêt un aspect fondamental parce que la bêta-lactoglobuline peut être considérée comme une protéine globulaire modèle. Mais l'étude a aussi un but applicatif puisque la bêta-lactoglobuline est le composant protéique majeur du lactosérum et est de ce fait beaucoup utilisée dans l'industrie agro-alimentaire. La structure des agrégats et des gels a été caractérisée par diffusion de rayonnement et microscopie confocale. Les résultats principaux sont que la structure des agrégats est peu influencée par les interactions électrostatiques, mais que la structure du gel en dépend très fortement. Par exemple l'aspect visuel des gels change de transparent comme l'eau à pH 6. 2 à opaque comme le lait à pH 5. 8. La diminution de la répulsion électrostatique via la diminution du pH ou via l'augmentation de la concentration en sel rend la structure des gels plus hétérogènes. Elle influence aussi leur module élastique. Par contre, la variation des propriétés mécaniques des gels ne peut pas être corrélée à la variation de leur structure.

Mes travaux de recherche portent sur le développement de modèles gros-grains et d'algorithmes pour l'étude des propriétés mécaniques des protéines et des interactions protéine-protéine. Sur le plan mécanique, le programme ProPHet (Probing Protein Heterogeneity) permet de sonder la rigidité protéique à l'échelle du résidu et d'étudier la réponse d'un système moléculaire soumis à une déformation anisotrope. Cette réponse mécanique peut être mise en rapport avec les propriétés structurales de la protéine concernée (notamment j'agencement de ses différents éléments de structure secondaire), mais aussi avec son fonctionnement biologique (comme l'activité enzymatique. Du point de vue des interactions protéine-protéine, l'analyse des résultats des calculs effectués avec le programme MAXDo (Macromolecular Association via Cross-Docking) sur une grille d'internautes )(WorldCommunityGrid) permet mieux comprendre la spécificité des phénomènes de reconnaissance protéique

La Enhanced Cyan Fluorescent Protein (ECFP) est un variant spectral de la Green Fluorescent Protein extraite de la méduse Aequaria Victoria (GFPav). La ECFP, émettant dans le cyan, est un des donneurs les plus utilisés dans les études de transfert résonnant d'énergie d'excitation et est integré dans de nombreuses constructions de biosenseurs. Pourtant, elle souffre de nombreux inconvenients. Notamment elle pésente des propriétés photophysiques complexes et une forte sensibilité environnementale qui sont des freins à une interprétation quantitative de ses signaux de fluorescence en imagerie cellulaire. Notre objectif vise à mettre au point, grâce à l'introduction d'un minimum de mutations, un dérivé de la ECFP présentant des propriétés d'émission simplifiées et performantes ainsi qu'une faible sensibilité environementale. Des mutations ont été introduites, par mutagenèse dirigée, à deux positions clefs de la séquence peptidique de la ECFP ce qui a permis de générer des dérivés présentant des propriétés photophysiques et une sensibilité au pH modulées. En particulier, nous avons réussit à générer une protéine fluorescente, l'Aquamarine, aux propriétés photophysiques quasi-idéales caractérisée par un rendement quantique de l'ordre de 0,9 et des déclins d'émission de fluorescence quasi-monexponentiels. Elle présente également une sensibilité au pH fortement réduite avec un pH de demi-transition acide de 3,3.Ce manuscrit présente l'étude détaillée des propriétés d'émission de fluorescence des diverses protéines générées. Plusieurs paramètres présentant un intérêt particulièrement important pour une utilisation adéquate en imagerie de fluorescence ont été évalués. Outre la sensibilité au pH établie sur une large gamme de pH (2,5-11), une attention particulière a été portée sur les performances photophysiques (monoexponentialité du déclin d'émission de fluorescence, durée de vie moyenne, rendement quantique, brillance,...) de ces dérivés. De plus, grâce à des expériences de dichroïsme circulaire, des informations sur les changements structuraux, dont ces dérivés sont le siège à pH très acide, ont été obtenues. Enfin, l'examen détaillé des données spectroscopiques stationnaires et résolues en temps a permis de mettre en lumière l'existence de plusieurs espèces émissives contribuant à la photophysique de ces protéines et à l'origine de leur transition acide. L'ensemble de ces résultats constitue une première approche pour une meilleure compréhension de la relation structure-photophysique-dynamique de la ECFP et de ces dérivés.

Le diabète est associé à divers types de complications au niveau vasculaire affectant la micro et la macro-vasculature, ce qui contribue à l'augmentation de l'incidence d'infarctus du myocarde, d'ACV, de néphropathie et de rétinopathie. Parmi les mécanismes expliquant l'apparition de ces complications, la glycation des protéines joue un rôle important. En effet, il est connu que la glycation des protéines de la matrice extracellulaire (élastine, collagène) affecte les propriétés mécaniques des tissus constitués de celles-ci. Nous pensons que la glycation des protéines du cytosquelette peut également affecter les propriétés mécaniques de cellules présentes au niveau de la vasculature, telles que la cellule du muscle lisse vasculaire ou la cellule endothéliale, et ainsi affecter les fonctions cellulaires dépendantes d'une réorganisation du cytosquelette, telles que la contraction cellulaire. Le glyoxal (GO) est un composé hautement réactif de la famille des oxoaldéhydes, considéré comme un puissant agent de glycation au niveau cellulaire, puisqu'il réagit rapidement avec les groupements amines des protéines de façon à former des produits de glycation avancés (PGA). L'étude présentée dans cette thèse démontre d'une part que l'exposition à cet agent de glycation entraîne une augmentation de la rigidité cellulaire ainsi qu'une augmentation de la réponse contractile cellulaire générée par la machinerie actomyosine, en réponse à l'AngII. À la lumière de ces résultats, nous proposons qu'une exposition au GO peut induire des modifications post-traductionnelles de type non-enzymatique des protéines impliquées dans la machinerie contractile et ainsi altérer la fonction contractile cellulaire. C'est pourquoi nous avons en second lieu évalué la glycation de trois protéines impliquées dans la machinerie contractile (actine, ROCK, gelsoline) par un essai basé sur la réaction d'une sonde fluorescente et perméable à la membrane cellulaire, soit le carboxyfluorescéine diacetate succinimidyl ester (CFDA-SE), avec les amines primaires des protéines. Par cet essai, nous avons observé une augmentation de la glycation de l'actine et de ROCK, de même qu'une augmentation de l'interaction entre l'actine et la GSN. Cette thèse montre également l'implication de l'activité kinase de ROCK dans l'amplification de la réponse contractile, suggérant que la glycation de ROCK pourrait moduler son activité. En conclusion, la modification des protéines cellulaires par le GO pourrait affecter leurs fonctions et propriétés mécaniques, notamment par la modulation d'importantes interactions protéine-protéine impliquées dans la contraction cellulaire et dans l'organisation du cytosquelette.

Les canaux mécanosensibles de large conductance (MscL) sont des protéines membranaires intégrales permettant à la bactérie de survivre lors de chocs hypo-osmotiques. Leur principale caractéristique est de s'ouvrir en réponse à un stress mécanique : une tension de la membrane. La compréhension de leur mode d'activation est un prérequis pour élaborer un modèle global de la sensibilité à la tension membranaire. Nous avons étudié les premières étapes du mécanisme d'ouverture du MscL induites par une diminution de l'épaisseur membranaire, ainsi que les interactions gouvernant ces changements conformationnels par des simulations de dynamique moléculaire. La comparaison des analyses en composantes principales des trajectoires et en modes normaux nous a permis de mettre en évidence l'influence de la membrane sur la dynamique intrinsèque du canal. Nous avons ensuite étudié des canaux MscL issus de différents organismes et présentant des sensibilités mécaniques différentes. Des différences significatives de comportement des deux systèmes plongés dans des membranes d'épaisseur variable ont été mises en évidence. Ces différences nous ont conduits à exploré le rôle des différentes régions et notamment le rôle des boucles périplasmiques en construisant des canaux hybrides par combinaison de régions provenant d'organismes différents. Les résultats obtenus confirment le rôle primordial des boucles périplasmiques dans la sensibilité du MscL
Mechanosensitive channels of large conductance are integral membrane proteins that permit the bacterium to survive when hypo-osmotic shock occurs. Their principal characteristic is to open in response to a mechanical stress : a tension of the membrane. Understanding their mode of activation is necessary to work out a global model of the mechanism of sensitivity to membrane tension. We studied the first stages of the gating mechanism of MscL induced by membrane thinning, as well as the interactions controlling these conformational changes by moleculardynamics simulations. The comparison of principal component analysis of the trajectories and the directions given by the normal modes enabled us to highlight the influence of the membrane on the intrinsic dynamics of the channel. We then studied MscL channels from various organisms and having different sensitivities. Significant differences between the behaviours of the two Systems plunged in membranes of variable thickness were highlighted. These differences led us to explore the role of the various domains and in particular the role of the periplasmic loops by building hybrid channels by combination of domains from different organisms. The results obtained confirm the fundamental role of the periplasmic loops in the sensitivity of the MscL

Le gluten de blé est une ressource protéique renouvelable et abondante pouvant être utilisée pour la fabrication de matériaux thermoplastiques biodégradables. L'objectif de cette thèse était de voir dans quelle mesure les paramètres de l'environnement physico-chimique du gluten (température, cisaillement, plastifiant, agent de charge, agent réducteur de ponts disulfure et protéase) permettent de modifier sa réactivité et les propriétés fonctionnelles des matériaux. L'influence du temps et de la température d'un traitement thermomécanique sur le degré de réticulation et de dégradation des protéines de gluten a été bien caractérisée et reliée à l'évolution rhéologique de tan ô, dans le domaine linéaire. Une diminution de la taille moyenne des protéines par rupture des liaisons covalentes (disulfure ou peptidique) entraîne un ralentissement de la cinétique de réticulation. Dans le cas de la protéolyse, il contribue également à diminuer le potentiel de réactivité par formation d'espèces non réactives. La réticulation du réseau de gluten par liaisons covalentes sous l'action d'un traitement thermomécanique est enfin en grande partie inhibée en conditions acides. L'étude de différentes natures de plastifiants a montré que leur effet plastifiant était essentiellement relié à la formation de liaisons hydrogènes et nous a permis de les classer en trois familles selon leur potentiel d'interaction avec le gluten. La vitesse de plastification du gluten semble conditionnée par l'efficacité de son mouillage par le plastifiant, facilité en conditions hydratées. Un mécanisme de plastification du gluten a pu être proposé. Les propriétés mécaniques des matériaux à base de gluten varient fortement avec l'état thermoplastique des protéines. L'augmentation du degré de réticulation du réseau de gluten permet d'augmenter les résistances mécanique et à l'eau des matériaux. La résistance à l'eau est également accrue par plastification dans un environnement hydrophobe. Enfin, un comportement collant a pu être caractérisé pour certains matériaux, pouvant donner lieu à des applications dans le domaine des auto-adhésifs
Wheat gluten is a renewable and abundant protein resource that can be used to make biodegradable thermoplastic materials. The aim of this thesis was to investigate in which extent parameters of gluten physico-chemical environment (temperature, shear, plasticizer, filler, disulfure bonds reducing agent, protease) could modify gluten reactivity and materials functional properties. Influence of the time and temperature of a thermo mechanical treatment on gluten proteins aggregation and degradation degree was characterized and related to the rheological evolution of tan ô, in the linear domain. A decrease in protein mean molecular size by breaking of covalent bonds (disulfure or peptidic) leads to a slowing down of gluten aggregation kinetic. In the case of proteolysis, it also contributes to decrease the reactivity potential by creation of non-reactive species. Finally, gluten network cross linking by covalent bonds induced by a thermo mechanical treatment is mostly inhibited in an acidic environment. Study of plasticizers of different natures showed that their plasticizing effect is mainly related to the formation of hydrogen bonds and enabled us to classify them in three groups according to their potential of interactions with gluten. Gluten plasticization speed rate seems to be governed by the efficiency of gluten wetting by the plasticizer. This wetting is improved in hydrated conditions. A gluten plasticization mechanism was proposed. Mechanical properties of gluten-based materials greatly change with the thermoplastic state of proteins. Increase in cross linking degree of gluten network enables to improve mechanical and water resistance of materials. Using a hydrophobic plasticizer also increases water resistance. Finally, an adhesive behaviour was characterized for some materials for which an application as pressure sensitive adhesives could be possible

De nombreux phénomènes biologiques s'accompagnent de déformations de la membrane cellulaire. Ce processus est souvent induit par des protéines, tout particulièrement par des protéines possédant un des différents domaines BAR. Dans le même temps, la courbure membranaire contrôle l'interaction entre protéines, donc elle représente un mécanisme essentiel de signalisation dans la cellule. Dans mon travail, présenté en deux thèses, je combine la modélisation théorique, l'imagerie à haute résolution, et la microscopie quantitative pour étudier l'assemblage des protéines à domaine BAR sur les membranes et leur influence sur la forme et la mécanique membranaire. Mes simulations expliquent le mécanisme moléculaire sous-jacent de l'auto-assemblage des protéines BAR et la façon dont leur comportement collectif affecte le remodelage de la membrane à grande échelle. Grâce à des expériences de biophysique, j'ai pu mettre en évidence un nouveau mécanisme de fission des tubules membranaires induit par des protéines BAR et des moteurs moléculaires. J'ai également étudié la formation de structures en "scaffold" par ces protéines et comment elles modifient le comportement mécanique de la membrane. Ces résultats sont essentiels pour comprendre la voie d'endocytose, découverte récemment, qui est contrôlées par une protéine BAR, l'endophiline. Mon travail qui combine théorie et expériences propose des explications sur la manière dont les propriétés mécaniques de la membrane peuvent réguler la dynamique des protéines dans la cellule
Many biological phenomena are accompanied by the change in shape of the cell membrane. This process is often mediated by curvature-generating proteins, most notably by those containing one of many BAR domains. At the same time, membrane curvature controls the way proteins interact with one another and so it acts as a vital signaling mechanism in the cell. In our work, presented in two theses, we combine theoretical modeling, high-resolution imaging, and quantitative microscopy techniques to study the assembly of BAR proteins on the membrane and its influence on membrane shape and mechanics. Our simulations elucidate the molecular mechanism underlying the self-assembly of BAR proteins on the membrane and the way their collective behavior affects the large-scale membrane reshaping. Experimental biophysical methods demonstrate a novel mechanism of membrane fission mediated by BAR proteins and molecular motors. It also quantifies how the formation of protein scaffolds alters the mechanical behavior of the membrane. These results are essential for understanding a newly discovered pathway of endocytosis, mediated by a BAR protein endophilin. Our combined theoretical and experimental approach gives vital Glues on how the mechanical properties of the membrane may regulate protein dynamics in living cells

Certains processus cellulaires sont gouvernés par les propriétés mécaniques intrinsèques des membranes biologiques. L'une d'elles, l'élasticité de courbure, peut être mesurée sur des membranes modèles par analyse des fluctuations thermiques de vésicules géantes. Dans un premier temps, on étudie l'influence du cholestérol sur l'évolution du module d'élasticité de courbure, kc, de membranes lipidiques. La dépendance de kc avec la nature, la concentration et le mode d'insertion de divers peptides et protéines membranaires est ensuite démontrée. Finalement, l'élaboration d'un montage de micromanipulation sous microscope de vésicules géantes a permis d'étudier les perturbations morphologiques induites par l'action d'un peptide lytique, la mélittine.

La mise en forme de biomateriaux d'emballage a base de proteines myofibrillaires a ete realisee selon deux methodes. La fabrication de films transparents par la voie humide est basee sur la dispersion des proteines en milieu aqueux, l'etalement en couche mince et l'elimination de la phase solvante. La fabrication de materiaux rigides par la voie seche est basee sur l'application des proprietes thermoplastiques des proteines en milieu faiblement hydrate. Les biomateriaux a base de proteines myofibrillaires possedent des proprietes fonctionnelles interessantes. Ils resistent a l'eau et certains materiaux rigides meme sont etanches pendant plusieurs heures. La resistance mecanique des films est voisine de celle des films de polyethylene. Les films sont largement plus permeables a la vapeur d'eau que les films synthetiques classiques, mais ils sont beaucoup moins permeables a l'o#2 et au co#2 que des films de polyethylene. Au contraire des materiaux synthetiques, les proprietes fonctionnelles des materiaux a base de proteines myofibrillaires sont fortement dependantes des variations d'humidite relative et de temperature ambiantes ou de l'addition de plastifiants hydrophiles. L'incorporation de composes lipidiques ou d'amidon a finalement ete testee pour ameliorer les proprietes barrieres a l'eau ou pour diminuer les couts des materiaux.

Cette thèse visait à caractériser la composition en polysaccharides des fibres de bois de tension chez le peuplier et établir de possibles corrélations avec les mécanismes de création de la tension. A cette fin, nous avons étudié le bois de jeunes peupliers qui ont poussé sous conditions contrôlées. Nous avons pu déterminer la composition en polysaccharides des couches G isolées ainsi que la structure de ces polysaccharides. L’évolution de cette composition au long de la différentiation du bois de tension et du bois opposé a été évaluée à l’aide de 178 anticorps dirigés contre les principaux polysaccharides pariétales. La fonction de deux protéines à arabinogalactanes avec domaine fascicline-like a été également étudiée à l’aide des anticorps produits à cet effet. La génétique inverse a été également utilisée pour compléter l’étude de la fonction d’une de ces protéines dans la formation du bois de tension. Les résultats obtenus ont mis en évidence une évolution de la composition de la couche G au cours de la différenciation. Des différences entre la composition de la couche S2 des fibres du bois de tension et du bois opposé ont aussi été détectées. Une grande quantité de pectines de type RG-I a été décelé dans la couche G, molécules qui pourraient participer à la formation d’un gel. Le gonflement de ce gel serait responsable de la mise en tension des microfibrilles de cellulose. Cependant, nos travaux ne montrent aucune évidence pour la présence de xyloglucanes dans la couche G. Des indices en faveur de l’implication des FLAs dans la construction de la couche G ont été également trouvés dans cette étude. Ce travail de thèse ouvre des perspectives pour l’identification du déterminisme moléculaire à l’origine de la création de la tension dans le bois de tension
This work aimed at characterizing the composition in polysaccharides of poplar tension wood fibres and a possible correlation with mechanisms for creating tension. Firstly, we isolated G-layers from tension wood formed in young poplars which grows in a greenhouse under controlled conditions and determine its polysaccharides composition and the structure of these polysaccharides. Therefore, we investigate the polysaccharide distribution during tension and opposite wood fibres differentiation by using 178 antibodies raised against the major wall polysaccharides. The distribution and function of two fasciclin-like arabinogalactan proteins were studied using two antibodies produced to this end and the function of one of the proteins were studied by reverse genetics. This work show an evolution in the polysaccharides composition of G-layer through its differentiation and also differences concerning S2 layer composition between tension and opposite wood fibres. No evidences for the presence of xyloglucans in the G-layer. However, this work shows the presence of a high quantity of RG-I type pectin which may be implicated in a gel-like structure formation which swelling could be responsible for tension creation in cellulose microfibrils. Our results suggest an implication of fasciclin-like arabinogalactan proteins in G-layer construction. Further, this work opens up new perspectives towards identification of molecular basis of tension creation in tension wood

Par ce travail expérimental, nous essayons d’établir un lien entre les propriétés mécaniques de gels d’actine branchés de levure et la composition biochimique des réseaux. L’actine est un polymère semi-flexible qui fait partie du cytosquelette. De nombreux partenaires protéiques de l’actine (notés ABPs par la suite) se lient aux filaments d’actine et les agencent en différents types de réseaux. Arp2/3 est un complexe protéique qui génère la croissance de réseaux d’actine branchés. Les réseaux d’actine branchés en croissance intéressent tout particulièrement physiciens comme biologistes car ils sont capables de développer des forces nécessaires à de nombreux processus vitaux pour la cellule, comme l’endocytose. Nous avons ici étudié les propriétés mécaniques de gels d’actine branchés reconstitués in vitro, en nous focalisant sur le rôle d’un type d’ABPs en particulier, les protéines de réticulation. Il nous a été possible de quantifier et de comparer l’effet de trois protéines de réticulation différentes sur la mécanique des réseaux d’actine branchés de levure.Afin de mener à bien cette étude, nous avons combiné deux puissantes techniques expérimentales.Nous avons utilisé une technique de mesure des propriétés mécaniques basée sur l’utilisation de colloïdes superparamagnétiques développée au laboratoire. Cette technique permet de réaliser des mesures quantitatives et à haut débit sur des gels polymères très fins (quelques centaines de nanomètres d’épaisseur). Les réseaux ont été reconstitués in vitro grâce à la fonctionnalisation des billes superparamagnétiques avec Las17, une protéine que notre collaborateur biologiste a identifiée comme suffisant à activer Arp2/3 chez la levure. Nous avons de plus combiné deux approches complémentaires en travaillant à la fois sur des extraits cellulaires de levure contenant toutes les ABPs des réseaux Arp2/3 et à la fois sur des mélanges de quelques protéines purifiées.L’approche « top-down » est basée sur l’utilisation d’extraits cellulaires de mutants de la levure n’exprimant pas une ou des protéine(s) d’intérêt(s), et l’approche « bottom-up » sur l’addition de la protéine étudiée dans le système simplifié de quelques protéines purifiées
In this experimental work we tried to quantify the mechanical properties of yeast branchedactin networks with regard to their biochemical composition. Actin is a semi-flexible biopolymerthat is assembled as part of the cytoskeleton. Proteins partners of actin (ABPs) shape itsfilaments into different type of networks. Arp2/3 is a protein complex that has the propertyto generate branched actin gels. Growing branched actin networks are of particular interest forboth biologists and physicists because of their ability to generate forces necessary to many vitalprocesses such as endocytosis. Here we study in vitro the mechanical properties of such networks,and we focus on the role of one type of actin binding proteins, the crosslinkers. This family ofproteins appears to play a role in both the elastic, viscous and plastic properties of the gels. Weare able to quantify and to compare the impact of three different crosslinkers on branched actinnetworks in yeast.In order to conduct said study, we combined two powerful experimental methods. We used asuperparamagnetic particle-based mechanical measurement technique that was developed in thelab and allows quantitative, high-throughput measurements on very thin gels. And the networkswere reconstituted in vitro by functionalization of the magnetic particles with Las17, which hasbeen showed to activate Arp2/3 for the yeast by our biologist collaborator. We furthermoreworked on both yeast extracts containing all the ABPs of the Arp2/3 networks, and with setsof a few purified proteins, in order to combine a « top-down » (use of mutations in yeast toprevent the expression of protein(s) of interest) and a « bottom-up » (addition of a protein ofinterest in a simplified system) approaches

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013.
L'activité mécanique des cellules générée par l'interaction entre la matrice extracellulaire (MEC) et le cytosquelette d'actine est essentielle pour la régulation de l'adhésion, de l'étalement et de la migration des cellules lors du développement normal ou tumoral. La stimulation mécanique des cellules découle majoritairement des forces externes appliquées par la MEC ou bien des forces internes générées par la contraction de l'actomyosine. Ces stimuli mécaniques convergent aux intégrines situées aux points focaux d'adhérence (FA) reliant la MEC à l'actine fibrillaire. La formation des FA requiert des molécules adaptatrices pour l'actine, telle que la vinculine, ainsi que des molécules de signalisation, comme la FAK (« focal adhesion kinase ») ou les PKC (« protein kinase C »). Les filaments intermédiaires (FI) de kératines 8/18 (K8/K18) sont exprimés dans l'ensemble de l'épithélium simple, mais constituent les seuls FI présents dans les hépatocytes et les hépatomes. Bien que plusieurs évidences suggèrent une participation des FI K8/K18 dans la régulation de l'activité mécanique des cellules, le mécanisme exact demeure énigmatique. Les travaux présentés dans cette thèse examinent les mécanismes impliqués dans la modulation de l'activité mécanique des cellules par les FI K8/K18. Par une approche s'appuyant sur l'utilisation d'une pince optique et de substrats de rigidité variable, les résultats montrent que les FI K8/K18 contribuent à la rigidité cellulaire et aux mécanismes mécanosenseurs, en raison d'une modulation de la signalisation RhoA-ROCK responsable de la dynamique de l'actine fibrillaire, plutôt que de leurs propriétés viscoélastiques. Par ailleurs, la PKCô est identifiée comme un médiateur de la modulation de l'étalement et de la migration associée aux FI K8/K18 chez les hépatomes, via une boucle de rétroaction positive affectant la FAK et l'intégrine aux FA. En fait, ces éléments corrèlent avec l'assemblage d'un complexe formé de RACK1 « Receptor of Activated C Kinase 1», pi-intégrine, plectine, PKC et c-Src. À noter que les mécanismes dépendant de RhoA et PKC sont mutuellement impliqués dans la modulation de la migration et de la rigidité des cellules associées aux FI K8/K18. Dans leur ensemble, les résultats démontrent une implication incontestable des FI K8/K18 dans la modulation de l'homéostasie mécanique des cellules de l'épithélium simple.

Cette étude se situe dans le contexte de la conception de biomatériaux biofonctionnalisés. Nous proposons ici de développer de telles surfaces par le greffage d'une monocouche de peptides adhésion de type RGD. Le greffage du peptide est ainsi bien établi et caractérisé par mouillabilité, XPS, PM-IRRAS, et MFA. La seconde stratégie consiste à adsorber des protéines adhésives sur des surfaces de silice silanisée. La MFA montre ensuite sa potentialité dans létude de cellules vivantes, dans leur milieu de culture. Différents états d'adhésion de ces cellules sont établis suivant la surface de dépôt. La perte d'adhérence est testée pour chaque condition envisagée, en appliquant une force extérieure avec la sonde du MFA. L'évolution du comportement dynamique des cellules est ensuite suivie. Nous présentons enfin une nouvelle approche pour corréler les propriétés mécaniques des cellules osseuses à leur état d'adhésion, à partir de l'analyse d'images obtenues par MFA.

Des modifications et synthèses de polyuréthanes ont été réalisés afin d'améliorer leur comportement biologique. Le greffage d'une chaîne et son taux d'incorporation. Diverses voies de synthèse pour obtenir des polyuréthanes comportant des motifs amino-acides sont effectuées, l'intérêt porté aux polymères correspondant résulte de l'absence de produits toxiques générés à l'issue de leur hydrolyse susceptible d'intervenir in vivo. L'étude des propriétés physico-chimiques, notamment la mouillabilité, des matériaux est réalisée ainsi que la détermination de leurs propriétés mécaniques. Leur biocompatibilité a fait l'objet d'un début d'évaluation par l'étude "in vitro" de l'adsorption des protéines plasmatiques et l'étude de la cytotoxicité de liquides d'extraction des matériaux, obtenus dans des conditions normalisées. Les polyuréthanes sont obtenus sous forme de films, mais la confection de tubes est envisageable soit par injection, soit par pulvérisation
Synthesis and modifications of polyuréthanes are realized to improve their biological behaviour. The grafting of an alkyl chain is discussed according to the fixation site which is choosen, the chain length and the incorporation rate. Different synthesis routes are effected to obtain polyurethanes with amino-acid skeleton, the interest bringing to the correspondant polymers results of the absence of toxic products generated by their hydrolysis open to step in "in vivo". Physico-chemical properties of the materials are studied, especially the wettability. The determination of their mechanical properties is realized. Their biocompatibility is the object of a beginning of evaluation by the study of the adsorption of plasma proteins and the cytotoxicity of extraction liquids released from the materials in normalized conditions. These polyurethanes are obtained in the form of sheets but it is possible to obtain tubes by injection of pulverisation

Le séchage par atomisation est un procédé relativement bien maîtrisé, certains aspects de la transition goutte-particule n’étant pas encore totalement compris. Ainsi, comprendre précisément comment la particule est formée et comment ce phénomène peut être contrôlé reste aujourd’hui un défi majeur. Ce projet visait à découpler la complexité du phénomène de séchage via une approche multi-échelles. La formation de particules à partir de protéines laitières (protéines de lactosérum et micelles de caséines) a été étudiée avec différents systèmes expérimentaux (gouttes suspendue, confinée, mono-dispersées et enfin pulvérisées) dans des environnements de séchage contrôlés (température de séchage: 20°C à 190°C et l'humidité relative: 40% à 2%).Les résultats obtenus montrent que le séchage d'une goutte de protéine comprend trois étapes distinctes, mises en évidence par l’apparition d'événements morphologiques spécifiques (rétrécissement à vitesse établie, flambage, formation de vacuole). Selon le type de protéines, ces étapes diffèrent en termes de cinétique de séchage et de dynamique structurale, conduisant à des formes de grains caractéristiques. Ces différents comportements peuvent être rattachés aux conditions particulières de la formation d’une peau en surface et aux modes de dissipation des contraintes internes par les matériaux protéiques. De manière générale, l’approche multi-échelles de ce travail a permis de mettre en évidence la signature particulière de protéines laitières dans un état concentré et l'impact de la matière dans le processus de séchage
Spray drying is a well-established process but certain aspects of droplet-particle transition are not yet fully understood, resulting in variability in terms of powder quality and performance. Therefore, understanding precisely how the particle is formed and how it can be controlled still remain a major challenge. This PhD project aims to break down the complexity of the drying phenomenon using an exploratory multi-scale approach. Particle formation of milk proteins (whey proteins and casein micelles) was investigated using different experimental systems (single pendant droplet, confined droplet, mono-dispersed droplets and spraying cone droplets) in controlled drying environments (drying temperature: 20°C to 190°C and relative humidity: 40% to 2%).The results showed that the drying of a single protein droplet included three distinct stages highlighted with the occurrence of specific morphological events (constant rate shrinkage, buckling instability, vacuole nucleation). According to the type of proteins, these drying stages differed in drying kinetics and droplet dynamics, leading to characteristic and reproducible particle shapes whatever the droplet configuration and the drying conditions. These different kinds of drying behaviour were related to specific skin formation conditions and different responses of the protein material to internal stress. Finally, by means of this multi-scale approach, this work highlighted the particular signature of milk proteins in a concentrated state and in general the impact of the matter in the droplet drying process

Du fait de sa haute conservation et de ses fonctions clés dans le virus VIH-1, la protéine de la nucléocapside NC est une cible de choix pour développer de nouveaux anti-viraux. Bien que la compréhension mécanistique des propriétés chaperonnes de NC vis-à-vis des acides nucléiques ait connu d’importants progrès, les aspects dynamiques de ces propriétés restent mal comprises, faute notamment d’outils appropriés pour les suivre au niveau moléculaire. L’objectif de ce travail de thèse a été de caractériser au niveau moléculaire la dynamique des interactions de NC avec les acides nucléiques, à l’aide d’outils fluorescents développés au laboratoire ou en collaboration. En utilisant des peptides NC et des oligonucléotides marqués en différentes positions par des analogues fluorescents d’acides aminés et de nucléosides, respectivement, nous avons pu donner une image complète du processus dynamique sous-tendant le mécanisme chaperon de NC dans le second transfert de brins de la transcription inverse du cycle du VIH-1. Cette compréhension est fondamentale pour concevoir des stratégies rationnelles afin de cibler le rôle spécifique de NC dans ses interactions avec ses cibles nucléiques
Due to its high conservation and key functions in the HIV-1 virus, the nucleocapsid protein NC is a potential target for the development of new anti-viral drugs. Although the mechanistic understanding of the NC nucleic acid chaperone properties has achieved a significant progress, the dynamic aspects of these properties remain poorly understood, mainly due to the lack of the appropriate tools to monitor them at the molecular level. The objective of this thesis was to characterize the dynamic interactions of NC with nucleic acids at the molecular level using new fluorescent tools developed in the laboratory or in collaboration. Using NC peptides and its target oligonucleotides labeled in different positions by fluorescent amino acid and nucleoside analogs, respectively, we were able to give a complete picture of the dynamic processes underlying the chaperone activity of NC in the second strand transfer of HIV-1 reverse transcription. This understanding is fundamental to design rational strategies in order to target the specific role of NC in interaction with its nucleic acid targets

Depuis toujours l'humanité accorde une importance particulière aux gestes sportifs. De vastes catégories de muscles existent chez l'être vivant et leurs évolutions se produisent avec les modifications fonctionnelles imposées par l'environnement. Dans ces conditions, certains muscles sont sollicités différemment et s'adaptent à la nouvelle fonction imposée. Cette sollicitation induit une réorganisation structurale et fonctionnelle, entraînant une évolution des caractéristiques biochimiques et mécaniques qui tend à refléter la plasticité musculaire. Dans ce travail, nous avons essayé d'induire une hyperactivité de nature posturale, obtenue grâce à la suspension du rat, sur un muscle phasique de la patte antérieure: l'épitrochléaris. Ainsi le rat doit utiliser ses pattes antérieures pour se déplacer et assurer sa posture. Les résultats obtenus montrent que l'épitrochléaris acquiert en 21 jours des caractéristiques de muscle plus lent: augmentation des fibres et des chaînes lourdes de myosine de type l, diminution de la vitesse maximale de raccourcissement, meilleure résistance à la fatigue et accroissement de la raideur. Par la modélisation de la relation force-vitesse, nous suggérons l'importance des chaînes légères de myosine dans ce processus adaptatif. De plus, nous montrons une augmentation du nombre total de fibres musculaires. Ceci serait le résultat d'une division mitotique des cellules satellites qui donneraient naissance à des fibres nouvelles indifférenciées et se transformeraient en fibres lentes. Cette étude confirme le lien entre types de fibres, protéines contractiles et propriétés mécaniques. La plasticité observée est sûrement liée au régime particulier de travail du muscle au cours de la suspension, notamment la nécessité d'une activité posturale importante
Since a long time, the humanity has given a particular place to the study of athletic gestures. It was discovered that a wide category of muscles existed in living beings and that their evolution occurred due to alterations imposed by their environment. Ln new conditions, some muscles respond in a new pattern and hence adapt themselves to a newly imposed function. This induces a structural and functional re-ordering of the muscles, leading to changes in biochemical and mechanical characteristics which tend to reflect muscle plasticity. Ln our work, a rats were suspended to induce hyperactivity of postural nature in a phasic muscle of the forelimb : the epitrochlearis. Thus, the rat has to use its forelimb to move around or to maintain his posture. Results show that, after 21 days, the epitrochlearis behaves as a slower muscle : fibbers and myosin heavy chains of type 1 are increased, maximal shortening velocity is decreased, resistance to fatigue is improved and stiffness is increased. Thanks to a model including the force-velocity relationship, the role of the myosin light chains in this adaptative process is emphasized. Moreover, an increase in the total number of muscle fibbers is observed. This could be the result of a mitotic division of satellite cells which are able to generate new undifferentiated fibbers. These fibbers should transform themselves into slow fibbers. This study confirms the relationship between fibber types, contractile proteins and mechanical properties. The observed plasticity is certainly related to the original work by the muscle during suspension, notably, the need of an important postural activity

Les microtubules sont des filaments protéiques dynamiques, essentiels au bon fonctionnement de la plupart des cellules eucaryotes. L’organisation de ce réseau de fibres constitue un enjeu majeur pour la cellule, puisque c’est de cette organisation que découle une grande partie de ses fonctions. Dans les cellules animales, la protéine EB1 (End Binding-1) est impliquée dans la polarisation du réseau de microtubules. Arabidopsis thaliana possède trois gènes orthologues bien conservés, mais dont les fonctions sont encore mal connues, alors même que l’orientation et l’organisation du réseau de microtubule sont critiques pour le développement des plantes. En particulier, dans les cellules en élongation, le réseau cortical de microtubules est perpendiculaire à l’axe de croissance et permet, en participant à la synthèse de la paroi, de restreindre la croissance en épaisseur au profit d’un allongement. Les microtubules corticaux ne sont pas isolés les uns des autres, ils s’associent latéralement pour former des faisceaux, ajoutant ainsi un niveau de complexité, et donc de régulation, à l’architecture du réseau microtubulaire chez Arabidopsis thaliana. La formation et la maintenance du réseau de faisceaux parallèles de microtubules constituent l’objet principal de ce travail de thèse. Chez Arabidopsis thaliana, EB1 est impliquée, à l’échelle macroscopique, dans la croissance directionnelle des racines. Toutefois, les fonctions subcellulaires de la protéine étaient peu connues au début de nos investigations. Tout d’abord, notre étude a permis de montrer que le réseau cortical de microtubules est désorganisé chez des plantes mutantes dépourvues de protéine EB1 cytoplasmique. De plus, la combinaison de la microscopie super-résolue STED et d’une procédure d’analyse d’image que nous avons élaborée au laboratoire, a mis en évidence une diminution significative du nombre de microtubules par faisceau en absence de EB1. Nous avons également observé une hypersensibilité des racines mutantes à la dureté du milieu, confirmant des données publiées précédemment. Pris dans leur ensemble, ces résultats suggèrent : (1) l’importance de l’organisation du réseau cortical de microtubules dans la réponse de la racine au toucher ; (2) une probable interdépendance entre organisation du réseau et formation des faisceaux. Ensuite, afin de confirmer le probable lien fonctionnel entre la formation des faisceaux de microtubules et organisation globale du réseau microtubulaire cortical, nous avons étudié des plantes mutantes pour MAP65-1, une protéine déjà décrite pour sa capacité à former des faisceaux in vitro. Nos premiers résultats, tendent à confirmer cette fonction de MAP65-1 in vivo et révèle, pour la première fois, une implication significative de cette protéine dans l’arrangement parallèle des microtubules corticaux. Si ce résultat ne met pas en évidence la relation de cause à effet qui relie ces deux phénomènes, il confirme toutefois l’existence d’un lien entre les deux niveaux de régulation. Enfin, dans le but de mieux comprendre les mécanismes permettant aux protéines EB1 et MAP65-1 de former des faisceaux de microtubules, nous avons entamé une analyse de leurs propriétés intrinsèques in vitro, en système purifié. Les premiers résultats, très préliminaires, indique un effet stimulateur de EB1 sur la capacité de MAP65-1 à former des faisceaux de microtubules. Cette thèse a contribué à la compréhension des mécanismes qui régissent l’organisation du réseau de microtubules corticaux chez Arabidopsis thaliana, incluant la formation des faisceaux de microtubules et le rôle joué par EB1 et MAP65-1 dans ce contexte. Elle confirme également l’implication du réseau de microtubules dans le contrôle de la croissance racinaire et suggère fortement sa participation à la réponse aux contraintes mécaniques
Microtubules are essential dynamic filaments of most eukaryotic cells. Microtubule network organization is tightly controlled within cells since most of microtubule functions come from their spatial arrangement. In animal cells, EB1 (End Binding-1 protein) is well known as a major regulator of microtubule network polarization. Though well conserved throughout evolution, Arabidopsis thaliana possesses three EB1 orthologous genes with unclear functions, while microtubule network orientation and organization are critical for plant development. During plant cell expansion, cortical microtubules are organized as parallel fibers that are perpendicular to the elongation axis. This particular organization is thought to promote cell elongation rather than thickening by controlling cell wall synthesis. Cortical microtubule are not isolated from each other, they are laterally associated within bundles, bringing an additional level of complexity, and therefore of regulation, to the microtubule network in plants. Microtubule bundles formation and maintenance are the main interest of this PhD-thesis work. In plants, EB1 proteins had already been involved in directional root growth, but their subcellular functions remained unclear. Our study revealed first that the cortical microtubule network is disorganized in plants lacking cytoplasmic-EB1 protein. Moreover, using super-resolution microscopy combined with an original image processing, we showed that the average number of microtubules per bundle is significantly reduced in the absence of EB1. In addition, EB1-defective roots display a hypersensitivity to medium hardness as mentioned elsewhere before. Altogether, our data suggest: (1) an involvement of the microtubule network in root response to touch; (2) a possible relationship between microtubule-network organization and bundle formation. Then, in order to confirm the functional link between bundle formation and network organization, we tackle the study of MAP65-1 mutant plants. MAP65-1 is a protein well described for its ability to make microtubule bundles in vitro. Our investigations confirmed this function for MAP65-1 in vivo and reveal its involvement in cortical microtubule network organization. Although this result does not reveal any causal connection between both phenomena, it highlights the link between the two levels of complexity that are bundle formation and spatial arrangement of microtubules. Finally, to get insight into the molecular mechanisms allowing EB1 and MAP65-1 to make microtubule bundles, we developed in vitro experiments using purified components. Preliminary results indicate that EB1 stimulates MAP65-1 ability to make bundles, but this remains to be further investigated. Hence, this thesis work contributed to decipher the mechanisms governing microtubule network organization in Arabidopsis thaliana. In particular, it revealed the involvement of EB1 proteins and MAP65-1 in this task. This work further confirmed the role of microtubules in root growth and strongly suggested their involvement in the response to mechanical sensing

La découverte de protéines fluorescentes photo-transformables (PTFP) au cours des dernières décennies a révolutionné le domaine de la microscopie optique. Les protéines fluorescentes réversiblement commutables (RSFP), en particulier, sont couramment utilisées pour les techniques de microscopie à super-résolution comme en RESOLFT (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions) par exemple. Par photoactivation, les RSFP passent d'un état "on" - fluorescent - à un état "off" - éteint - qui, combiné à des systèmes d'illumination avancés permet d'imager des composants cellulaires préalablement marqués à une résolution nanométrique. De nombreuses études cristallographiques sur les RSFP ont apporté des informations structurelles importantes et ont permis de dresser des hypothèses quant à leur comportement photo-physique. Elles ont également guidé l'ingénierie des protéines fluorescentes afin d'améliorer leur conception et leur utilisation in vivo. Cependant, les cristaux de ces protéines qui sont étudiées à des températures cryogéniques ne permettent pas de capturer la dynamique moléculaire des RSFP dans le but de comprendre, voir d'améliorer leur propriétés photo-physique. C'est pourquoi au cours de ma thèse, j'ai majoritairement utilisé la résonance magnétique nucléaire (RMN) en solution multidimensionnelle sur une RSFP verte - appelée rsFolder - afin de compléter et améliorer nos connaissances sur ces protéines. À l'aide d'un dispositif d'éclairage laser in situ portatif couplé au spectromètre RMN, j'ai pu extraire des informations dynamiques locales quantitatives concernant les états "on" et "off" fluorescents de rsFolder qui sont respectivement caractérisés par un chromophore en conformation cis et trans. Les signatures des résidus dans l'état "off" non fluorescent ont été identifiées à l'aide d'expériences de RMN d'échange induite par LASER. L'état "off" métastable de rsFolder apparaît plus dynamique dans l'échelle de temps de la milliseconde que l'état "on" fluorescent. La RMN a également permis de mettre en lumière quatre configurations du chromophore possible qui sont pH dépendante. De plus, j'ai observé pour la première fois l'isomérisation du chromophore induite par le pH cis-trans. Les valeurs dérivées de la RMN des énergies d'activation concernant l'isomérisation et les différences d'énergie libre entre le chromophore cis et trans ont permis de cartographier le paysage d'énergie libre de l'état fondamental de rsFolder à différents pH. Enfin, la comparaison de données de RMN et des mesures optiques sur rsFolder ainsi que sur différents mutants a mis en évidence le rôle important que la RMN peut jouer dans le domaine de l'ingénierie des RSFPs.Dans l'ensemble, mes travaux de thèse ont permis non seulement d'établir un système d'illumination in situ fiable, accompagné d'expériences de RMN pertinentes dans le but d'étudier les RSFP mais aussi de souligner l'importance de la dynamique moléculaire dans la compréhension des propriétés photo-physiques des RSFPs
The discovery of Phototransformable Fluorescent proteins (PTFPs) over the last decades has revolutionized the field of microscopy. Reversibly photo-switchable fluorescent proteins (RSFPs), in particular, are currently routinely used for Super Resolution Microscopy techniques, such as RESOLFT (REversible Saturable OpticaL Fluorescence Transitions). Photo-induced switching between a fluorescent "on"- and a dark "off"-state, in combination with advanced illumination schemes has allowed for imaging nanometer sized compartments in biological cells. Crystallographic studies of such RSFPs have provided useful mechanistic explanations for their photophysical behaviour and has guided fluorescent protein engineering into designing better tags. However, the crystal forms of such proteins studied at cryogenic temperatures fail to capture dynamics present in RSFPs which could potentially play a significant role in their photophysics. So far, only a single NMR study for the RSFP Dronpa has been reported in the literature (Mizuno, 2008). During my PhD thesis, I was able to complement crystallographic studies of rsFolder, a green RSFP, with a dynamic perspective using multidimensional solution NMR spectroscopy.Using a portable in-situ laser illumination device coupled with the NMR spectrometer, I was able to extract quantitative local dynamic information for both the fluorescent "on"- and "off"-states of rsFolder, characterized by a primarily cis and trans chromophore, respectively. NMR signatures of residues in the non-fluorescent "off"-state were identified using LASER-driven Exchange NMR experiments. The metastable photo-induced "off"-state of rsFolder appears more dynamic on the millisecond timescale than the fluorescent "on"-state. NMR investigations of the chromophore resulted in the deciphering of four configurations, populated in a pH-dependent fashion. Moreover, pH-induced cis-trans isomerization of the chromophore was observed, in the absence of light. NMR-derived values of activation energies for isomerization and free energy differences between the cis and trans chromophore enabled the mapping of the ground-state free energy landscape of rsFolder at different pH values and buffer compositions. Lastly, comparing NMR observables with optical measurements on rsFolder and mutants highlights the potential role that NMR can play in the field of RSFP engineering. Altogether, my PhD work yielded in not only a reliable in-situ illumination set-up accompanied with relevant NMR experiments to study RSFPs, but also highlighted the importance of dynamics in understanding RSFPs' photophysical properties

Le but de cette thèse est de sonder la flexibilité de NCp7 et de Δ(-)PBS, deux bio-molécules impliquées dans le second saut de brin de la transcription inverse du VIH. Deux stratégies expérimentales ont été mises en place. Un nouveau montage de spectroscopie ultra-rapide de fluorescence par down-conversion a été construit. Les dynamiques de quenching de la 2-aminopurine (2Ap), insérée en position 6, 8 et 10 de la boucle Δ(-)PBS ont pu être entièrement résolues à une résolution sub-ps. Pour chaque position, 4 temps de vie ont été révélés. Des mesures d'anisotropie confirment que les deux composantes < 5 ps sont liées à un empilement de la 2Ap avec les Guanines avoisinantes. Cet empilement est site-spécifique, prouvé par l'augmentation significative de leurs amplitudes lorsque la 2Ap est située près de la tige (position 10). La faible proportion de conformations reliées à un quenching collisionnel est significative de la faible exposition des 2Ap au solvant et de l'encombrement général de la boucle. La seconde approche avait pour but d'étudier l'effet du repliement du squelette protéique de [35-50] NCp7 autour de son atome de zinc par CID et par LID. Les spectres CID de la protéine nue sont expliqués par le modèle du proton mobile et une description détaillée d'un schéma de fragmentation spécifique autour du Tryptophane (Trp) a été soulignée, attribué une Lysine voisine. Un seul fragment issu de l'excitation à 266 nm a été identifié, son apparition entre en compétition avec les fragments CID du Trp. L'effet général du repliement autour du Zinc se traduit par une augmentation du taux de fragmentation autour du Trp et par une perte de spécificité pour le reste du spectre.Les flexibilités de Δ(-)PBS et NCp7 ont été respectivement évaluées par spectroscopie ultra-rapide de type down-conversion et par spectrométrie en phase gazeuse. La première méthode nécessite l'utilisation d'une sonde fluorescente non invasive, la 2-aminopurine (2Ap), placée en position 6, 8 et 10 de la boucle Δ(-)PBS. Notre résolution temporelle permet de résoudre entièrement les dynamiques locales de quenching et d'anisotropie de la 2Ap. Les composantes liées au quenching statique et quenching collisionnel ont été discriminées et révèlent les degrés d'empilement / encombrement locaux de la boucle. L'effet du repliement de [35-50] NCp7 autour de son atome de zinc a été étudié par CID et par LID à 266 nm. La protéine nue présente un interessant shéma de fragmentation autour du Tryptophane (Trp), exalté par la complexation avec le zinc, au prix une perte de spécificité pour le reste du spectre. Un seul fragment LID a été identifié, un mécanisme de sa formation est proposé.

Chaque espèce vivante acquiert une forme qui lui est propre. La génération de forces mécaniques est l'une des stratégies utilisées par les cellules pour sculpter les organes. Lors du développement animal, les forces mécaniques générées dans le plan des jonctions adhérentes sont importantes pour le remodelage des tissus épithéliaux. Ces forces planaires ont été particulièrement étudiées ces dernières années. C'est le cas notamment de la constriction apicale des cellules lors de l'invagination du mésoderme de l'embryon de drosophile. La réduction de l'apex des cellules est considérée comme un processus fondamental pour la formation de la pliure initiale de cet épithélium. Toutefois, il a été découvert récemment que des forces peuvent aussi être générées dans l'axe apico-basal des cellules. L'équipe dans laquelle j'ai effectué ma thèse a montré que de telles forces sont requises pour la formation de plis dans la patte de la drosophile lors de son développement. Dans ce processus, avant de disparaitre par apoptose (ou mort programmée), les cellules vont former une structure apico-basale appelé "câble de myosine" qui, en se contractant, va induire une déformation des cellules voisines, aboutissant progressivement à la formation de plis. Cependant, les mécanismes requis pour la génération de la force apico-basale restaient inconnus. L'objectif de ma thèse était donc de chercher comment ces cellules destinées à mourir pouvaient générer une force efficace. L'hypothèse de travail était que ce câble de myosine devait être ancré au pôle apical et au pôle basal de la cellule afin de fournir une résistance permettant la génération d'une force efficace pouvant être transmise aux cellules voisines. J'ai donc cherché à identifier ces points d'ancrage grâce à des techniques d'imagerie et de génétique. Dans un premier temps, j'ai identifié le point d'ancrage apical du câble. En effet, les cellules apoptotiques réduisent leur apex mais conservent leurs jonctions adhérentes au niveau desquelles co-localise l'extrémité apicale du câble de myosine. Dans un deuxième temps, j'ai cherché quel pourrait être le point d'ancrage basal du câble de myosine. Une observation surprenante montre que le noyau des cellules apoptotiques est systématiquement relocalisé au pôle basal et que le câble de myosine rentre en contact avec lui. J'ai testé si le noyau joue un rôle dans l'ancrage du câble de myosine en perturbant sa localisation basale. La perte de fonction de Klarsicht, une protéine du complexe LINC, empêche la cellule d'induire une déformation des cellules voisines, montrant que dans ce contexte où le noyau n'est pas relocalisé au pôle basal de la cellule, la force n'est pas ou peu produite. Finalement, j'ai pu montrer que le noyau est lui-même ancré au pôle basal de la cellule afin de fournir un point de résistance lors de la contraction du câble. En effet, j'ai étudié la mobilité des noyaux, montrant d'une part que les noyaux apoptotiques sont moins mobiles que ceux des cellules non-apoptotiques et, d'autre part, que l'actine et la Taline, un composant des adhésions basales, sont requises pour la stabilisation du noyau apoptotique. De plus, j'ai observé que, lors de la contraction du câble, le noyau remonte simultanément et que celui-ci se déforme localement. Finalement, des expériences d'ablation laser du câble de myosine montrent un relâchement de la surface apicale et un recul du noyau. Ainsi, la force émise par les cellules apoptotiques est transmise dans l'axe apico-basal par une liaison adhérence apicale-câble-noyau. Mon travail met en lumière un mécanisme original de génération de force. Ce nouveau mécanisme de force apico-basale pourrait être conservé dans d'autres types cellulaires engagés dans des processus d'invagination au cours de la morphogenèse. Mes résultats montrent également que le noyau joue un rôle nouveau, au-delà de son rôle de protection du génome, en participant activement à la génération d'une force
Each animal species acquires a specific shape during development. The generation of mechanical forces is one of the strategies used by cells to sculpt organs. During animal development, the mechanical forces generated in the plane of adherens junctions are important for epithelium remodeling. These planar forces have been extensively studied over the last years. This is particularly the case during apical constriction of mesodermal cells during drosophila embryo gastrulation. The reduction of the cell's apex is considered a fundamental process to trigger invagination of this tissue. However, recently, it has been shown that forces can also be generated along the cell apico-basal axis. The team in which I did my thesis has shown that these forces are important for the formation of folds during drosophila leg development. In this process, before their disappearance, cells form an apico-basal myosin structure, called "myosin cable". The force created by the contraction of the cable is transmitted to the cell's neighbors, inducing cell shape changes progressively resulting in fold formation. However, the mechanisms required for apico-basal force generation remained unknown. The goal of my thesis was to study in detail how the cells destined to die could generate an effective force. We made the hypothesis that the myosin cable should be anchored at the apical and basal cell poles in order to promote a resistance to the cable contraction, and to allow force transmission to the neighbors. Therefore, my aim was to identify these anchoring points thanks to imaging and genetics technics. First, I had identified apical anchor point. Indeed, apoptotic cells reduce their apex but maintain their adherens junctions. The apical extremity of the myosin cable colocalizes to this adhesion structure. Secondly, I searched for the basal anchor point of myosin cable. Surprisingly, I observed that the nucleus of apoptotic cells is systematically relocated on the basal cell half and that the myosin cable contacts it. I tested whether the nucleus plays a role in myosin cable anchorage by perturbing its basal localization. The loss of function of Klarsicht, a LINC complex protein, prevents the cell to deform its neighbors, showing that, in this context the force is strongly or totally abolished. Finally, I have shown that the apoptotic nucleus itself is anchored to the basal side in order to promote a resistance during cable contraction. Indeed, I studied nuclei mobility and showed that apoptotic nuclei are less mobile than non-apoptotic nuclei. I also showed that F-actin and Talin, a basal adhesion component, are required for apoptotic nucleus stability. Furthermore, I have observed that, during cable contraction, the nucleus moves back apically and that it deforms locally. Finally, laser ablation experiments of the myosin cable show an apical recoil of apical surface and a basal recoil of the nucleus. Thus, the force generated by the apoptotic cells is transmitted in the apico-basal axis thanks to the link between apical adherence, cable and nucleus. My work highlights a new mechanism of force generation. This new mechanism of apico-basal force could be conserved in other cell types in additional invagination processes during morphogenesis. My results also show that the nucleus plays a new role, beyond the protection of the genome, by participating actively in force generation

Dans ce travail, nous avons étudié le mécanisme d'émission de la partie optiquement active du complexe luciférine-luciférase. Ce système bioluminescent est largement utilisé dans un très grand nombre d'approches bioanalytiques. Ce phénomène naturel résulte en l'émission de lumière visible (vert-jaune-rouge) à partir du photoproduit : l’oxyluciférine. Une des hypothèses couramment admise pour expliquer le mécanisme d’émission de l’oxyluciféreine fait intervenir un équilibre complexe entre six espèces chimiques, mais le détail exact du mécanisme reste à élucider. Les principales conclusions présentées ici repose sur l'identification des six formes chimiques de l’oxyluciférine impliquées dans le mécanisme d'émission de fluorescence et la caractérisation d’un point de vu dynamique du transfert de proton à l’état excité. Ces résultats ont été obtenus par l'étude des propriétés optiques de différents analogues structuraux de l’oxyluciférine dans un tampon aqueux. Différent techniques de spectroscopie (état stable et résolue en temps) et des approches chimiométriques ont été appliquées pour étudier ce mécanisme d'émission. En outre, les propriétés photophysiques de l’oxyluciférine en complexe avec l'enzyme luciférase (Luciola cruciata) ont été étudiées également en milieu aqueux. En parallèle, les dérivés présentant des propriétés d’émission sensibles à l’environnement ont été utilisés pour visualiser l'interaction entre biomolécules. En particulier, nous avons démontré que l’oxyluciférine peut être utilisée pour cartographier le pH intracellulaire à l'aide de la microscopie de fluorescence dans des cellules vivantes. Avec l'aide d'un autre dérivé de l'oxyluciférine nous avons été en mesure de caractériser l'interaction entre une protéine du VIH-1 et des séquences d'oligonucléotide au moyen de mesures ratiométriques. Enfin, nous avons développé une approche basée sur le marquage de résidus cystéine pour suivre, in vitro, l'interaction protéine-protéine
In this work, we investigated the emission mechanism of the optically active part of the firefly luciferin-luciferase complex. This bioluminescent system is widely used in bioanalytical assay. This amazing natural phenomenon results in the emission of visible light (yellow-green-red) from the photoproduct Oxyluciferin. This color tuning mechanism involves six chemical species, but their active involvement in the excited state proton transfer (ESPT) mechanism was poorly understood so far. One of the main finding presented here relies on the identification of six chemical forms of Oxyluciferin involved in the color tuning fluorescence emission mechanism. This result was obtained by studying the optical properties of different structural analogues of firefly Oxyluciferin in aqueous buffer. Different spectroscopic (steady state and time-resolved) and chemometric approaches have been applied to reveal the emission mechanism. In addition, the photophysical properties of Oxyluciferin in complex with the Luciferase enzyme Luciola cruciata have been studied in aqueous buffer as well. In parallel, derivatives displaying environment sensitive emission were used to monitor biomolecular interactions. In particular, we demonstrated that Oxyluciferin can be employed to map intracellular pH by using fluorescence microscopy within living cells. With the help of another Oxyluciferin derivative we were able to monitor the interaction between a HIV-1 protein and different oligonucleotide sequences by means of ratiometric measurements. Finally we develop an approach based on cysteine labeling to monitor in vitro protein-protein interaction

Le but de cette thèse est de mettre en relation les propriétés structurale, dynamique et fonctionnelle de la forme humaine d’une nouvelle protéine découverte dans le cerveau des vertébrés en 2000 : la Neuroglobine. Dans un premier temps, j’ai réalisé une étude théorique dans laquelle un mécanisme à deux voies menant à la forme pentacoordinée avec cystéines oxydées a été mis en avant. A travers ce mécanisme, un conformère de la Neuroglobine au sein duquel le groupe prosthétique hème a basculé au cœur de la structure protéique a été déterminé. A partir des structures de ce mécanisme, une étude sur la diffusion de petits ligands au sein des cavités internes de la protéine à l’aide de la méthode de métadynamique a mis en évidence que la formation du pont disufure intramoléculaire favorisait la poche de ligation. De plus un certain nombre de voies de sortie pour les ligands a pu être obtenu. Pour compléter ce premier aspect de la thèse, une étude des propriétés mécaniques, communes avec les autres globines, a montré l’importance de quatre résidus centraux, dit mécaniquement sensibles, qui régulent les canaux d’accès aux différentes poches internes de la protéine, appelé phénomène de respiration. Dans un second temps, je me suis intéressé à l’interaction de la Neuroglobine avec un petit ligand via une étude expérimentale par ITC. La première conclusion importante est que la cinétique de ligation est plus importante lorsque le pont disulfure est formé. De plus j’ai observé une diminution de la cinétique lors du passage Wild Type vers C120S puis réaugmentation de la cinétique lors du passage C120S vers C46G/C55S/C120. Afin de comprendre ce phénomène, une simulation de la Neuroglobine triplement mutée a été réalisée au cours de laquelle un réseau de deux liaisons hydrogènes a été mis en avant. Ce réseau change considérablement les voies d’entrée/sortie pour les ligands. Ainsi la mutation 120 ferme une/ou plusieurs voies de sortie alors que la mutation 46 ouvre la voie naturelle des globines. Le changement observé étant important, une étude par RMN de Ngb TM et WT cystéines réduites a montré qu’il y avait une différence de structure entre ces formes pas seulement au niveau des points de mutation mais sur l’ensemble de la structure. Ces nouveaux résultats mettent ainsi en évidence le rôle important des trois cystéines chez la Neuroglobine humaine
In this PhD work, I tried to link together the different structural, dynamic and fonctional properties of a new human protein discovered in the mamals brain in 2000: the Neuroglobin. First of all, I established a new two ways mecanism in order to get the pentacoodinated oxydized cysteins state using theoritical method. One of this mecanism’s conformer shows an important heme sliding inside of the proteic structure. Furthermore with help of metadynamic method, I studied the small ligand diffusion and migration in the internal cavity network. I showed the higher ligand affinity when the disulfide bridge is bond and we proposed an important number of exit pathways. Then we developed a method to understand the mechanical properties of the globins and we found four residues mechanically sensitive which form together a control access pathway between internal cavities, called breath phenomenon. Secondly I used ITC method in order to characterize the interaction between the Neuroglobin and a small ligand. From this experiment we highlighted that the kinetic ligation is faster when the disulfide bridge is formed. Then I noticed a relative decrease of the velocity when the mutation C120S is operated followed by a relative increase of the velocity for the triple mutation C46G/C55S/C120 compared to the Wild Type data. To understand these results, I performed a molecular simulation of the triple mutation Neuroglobin form. During this trajectory, I discovered a structure with a two hydrogen bonds network, which significantly changes the ligand entry/exit pathways. The 120 mutation closes one/several exit pathways while the 46 mutation opens the natural globin exit pathway. Because of the considerable structural change observed in the triple mutation Neuroglobin form, I decided to produce NMR results. These last points reveal a relative structure difference between the Wild Type oxidized cysteins form and the triple mutation form not only on the mutation points but also on the global structure. All these new results highlight the essential role of the three cysteins in the human Neuroglobin

Les protéines fibreuses (kératine, élastine, collagène, fibroïne…) représentent 1/3 des protéinesconstitutives des mammifères et des oiseaux. Ce sont des protéines qui ont une fonction de protection et/oumécanique. La soie apparait comme le système le plus « simple » car elle est principalement constituée demotifs de répétition à base d’alanine et de glycine, deux petits acides aminés. Certaines soies présentent despropriétés mécaniques comparables ou supérieures à celles des fibres synthétiques et seraient susceptiblesd’être de nouveau largement utilisées dans des applications techniques (par exemple biomédicales) si lavariabilité de leurs propriétés était maîtrisée. Ce travail porte sur la structure des soies grèges ou décreuséesde Bombyx mori (ver à soie domestique), de Nephila madagascariensis (araignée sauvage, fibre sansenveloppe de séricine), de Bombyx mori génétiquement modifié (incluant un gène de Nephila) et sur unesoie recombinante 4RepCT (Escherichia coli). La soie est analysée par spectrométrie Raman (et IRTF) ettraction uni-axiale, ainsi que par le couplage de ces méthodes. L’analyse de la région des bas nombresd’onde en spectroscopie Raman a permis de caractériser des régions ordonnées de 2 à 3 μm de long etdistantes d’environ 60 μm. Il s’agit de la première mise en évidence d’une hétérogénéité de structure de lasoie. Le couplage avec la traction uni-axiale montre une sollicitation de ces régions ordonnées sousdéformation, suggérant une organisation de la soie selon le modèle de Prevorsek, c’est à dire qu’une mêmechaîne macromoléculaire appartient à la fois à des régions amorphes et à des régions ordonnées. L’étudestatistique des propriétés mécaniques de la soie de ver et d’araignée montre une grande distribution, maisune bonne stabilité dans le temps (dizaines d’années). La modification génétique ne procure pasd’amélioration des propriétés mécaniques de la fibre, seulement une légère diminution de la variabilité.Diverses stratégies sont mises en oeuvre pour tenter d’échapper à cette variabilité : production bactérienne,solubilisation de la soie et régénération sous forme de films. Le rôle de l’eau lors de la biosynthèse de lasoie, ainsi que l’effet de divers paramètres (filtration, pH, séchage…) lors de la préparation des films ont étéétudiés. Nous avons pu confirmer que la présence d’agrégats de protéines favorise l’organisation dans lesfilms et 2 types de films ont donc été préparés. Les films les plus amorphes présentent les propriétésmécaniques les plus intéressantes, même si elles n’atteignent de quelques % de celles des fibres. Lafabrication de composites à matrice de soie régénérée renforcée par des fibres de soie permet d’augmenterla résistance et la déformation à rupture. Ces premiers résultats sont encourageants pour le développementde matériaux composites fibres de soie/matrice de soie régénérée
Fibrous proteins (keratin, elastin, collagen, fibroin ...) make up to one third of the proteins ofmammals and birds. They are structural proteins with a protective and/or mechanical function. Silk appearsto be the ‘simplest’ model because it mainly consists of two small amino acids residues (alanine andglycine). Some silks have comparable or superior mechanical properties compared to those of syntheticfibres and could be used in technical applications (e.g. biomedical) if the variability of their properties canbe controlled. This work focuses on the structure of silks from: Bombyx mori (domestic silkworm)degummed or not, Nephila madagascariensis (wild spider, no sericin coating), GM Bombyx mori (includinga gene of Nephila) a recombinant spider silk 4RepCT (Escherichia Coli). Silk is analyzed by Ramanspectroscopy (and FTIR), uni-axial tensile testing, and also by the coupling of these methods. The analysisof the low wavenumbers region in Raman spectroscopy allowed the characterization of ordered regions of 2to 3 microns separated by about 60 microns. This is the first evidence of the heterogeneous structure ofsilk. Coupling with the uni-axial tensile test shows that these ordered regions are stressed under macroscopicdeformation, suggesting silk organization according to Prevorsek’s model, i.e. that the samemacromolecular chain belongs to both amorphous and ordered regions. The statistical study of themechanical properties of silkworm and spider silks shows great dispersion, but a good stability over time(decades). Genetic modification does not improve the fibres mechanical properties but a slight decrease intheir variability. Various strategies have been investigated to control the variability: bacterial production,solubilization of silk and films regeneration. The role of water in silk biosynthesis, as well as the effect ofvarious parameters (filtration, pH, drying ...) during the preparation of the films were studied. It wasconfirmed that the presence of protein aggregates promotes the organization in film and two types of filmswere prepared. The most amorphous ones have the most interesting mechanical properties, though only afew percent of those from the starting fibres. The fabrication of regenerated silk matrix compositesreinforced by silk fibres increases the strength and strain to failure. These initial results are encouraging forthe development of silk fibres/regenerated silk matrix composite materials

La mégacaryopoïèse regroupe l’ensemble des processus de différenciation et de maturation des mégacaryocytes (MKs) dans le but de produire des plaquettes capables d’arrêter les saignements. Or ces mécanismes sont mal connus. Afin de mieux les comprendre, nous avons mimé l’environnement médullaire in vitro, en 3D à l’aide d’un hydrogel de rigidité comparable à celle de la moelle osseuse. Dans cette étude nous avons: i) caractérisé le comportement physique de l’hydrogel de méthylcellulose et mis au point la culture de progéniteurs mégacaryocytaires dans ce système, ii) montré la capacité du MK à ressentir les contraintes physiques de son environnement, ainsi que, iii) l’impact de ces contraintes sur la maturation des MKs et la génération des proplaquettes, et enfin, iv) mis en évidence l’existence d’une réponse cellulaire des MKs à la rigidité. Les MKs sont « mécanosensibles », c’est-à-dire capables de ressentir les modifications physiques de leur environnement et de s’y adapter. L’activation de voies de mécanotransduction (dont MKL1) et la réorganisation du cytosquelette en réponse aux contraintes physiques extracellulaires favorisent la maturation des MKs, en termes de ploïdie, d’ultrastructure et in fine de génération de proplaquettes
Megakaryopoiesis is the process of differentiation and maturation of megakaryocytes (MKs) in the aim to produce platelets able to prevent hemorrhages. These mechanisms are not well known. To better understand the process of platelet formation, we mimicked the medullar microenvironment in vitro, in 3D using hydrogel of stiffness comparable to the bone marrow. In this study we: i) characterized the physical properties of the hydrogel and design the culture of hematopoietic progenitors in this system, ii) showed the MKs ability to feel the physical constraints of their environment, then iii) showed the impact of these constraints on the MK maturation and proplatelet generation, and finally iv) highlighted the MK response to stiffness. MKs are “mecanosensitives”, being able to feel and to adapt to the physicals modifications of the environment. The activation of mechanotransduction pathways (including MKL1) and the cytoskeleton reorganization in response to extracellular physical constraints improves MK maturation, in terms of ploïdy, ultrastructure and ultimately proplatelet generation

Les cellules vivantes sont capables de réagir aux signaux mécaniques tels que la rigidité de la surface sur laquelle elles adhèrent, les forces de tractions ou compressions auxquelles elles sont soumises, le flux de liquide à la surface de leur membrane ou encore la géométrie de leurs adhésions ou de leur forme globale. Ces signaux influent sur des processus cellulaires tels que la prolifération, la différenciation, la migration et la mort cellulaire. Ces processus sont finement régulés par des réactions biochimiques qui forment un réseau de signalisation. La mécanotransduction est la traduction du signal mécanique en signal biochimique.C’est dans le but d’étudier la mécanotransduction que nous avons étudié l’utilisation d’ultrasons pour stimuler mécaniquement les cellules à des fréquences temporelles et spatiales relativement élevées. De nombreux montages expérimentaux et de nombreuses voies ont été considérées dans cette partie très exploratoire. Nous en retenons finalement des pistes prometteuses pour la continuation future de ce projet.Nous avons développé ce que nous nommons des substrats actifs, qui nous permettent de contrôler à la fois spatialement et temporellement la stimulation mécanique appliquée à des cellules vivantes. Ces substrats actifs consistent en des micropiliers de fer incrustés dans un élastomère peu rigide (PDMS) et manipulés par deux électroaimants. Nous pouvons contrôler dynamiquement le déplacement des piliers qui vont déformer localement et de manière continue la surface. Cette déformation va ensuite déformer en traction ou en compression les cellules vivantes étalées sur la surface à proximité. En employant des marqueurs fluorescents nous pouvons réaliser de la Microscopie de Forces de Traction et surveiller la contrainte appliquée par les piliers aux cellules à travers la surface de PDMS, et nous pouvons étudier la réponse mécanique des cellules. De plus, ces substrats sont compatibles avec la microscopie de fluorescence en cellule vivante, ce qui rend possible l’observation de la réponse cellulaire au niveau morphologique (forme des adhésions focales, activité protrusive, …) et surtout biochimique.En effet, pour étudier la réponse biochimique des cellules après une stimulation mécanique, nous observons par microscopie de fluorescence des biosenseurs portant des paires de fluorophores donneur/accepteur. Ces biosenseurs nous permettent d’observer l’activité de protéines impliquées dans la signalisation cellulaire en calculant l’efficacité de Transfert d’Énergie Résonnant de Förster (FRET) de ces biosenseurs. Pour ce faire, les échantillons sont illuminés alternativement aux longueurs d’ondes d’excitation des fluorophores donneurs puis accepteurs. Le signal de fluorescence est collecté simultanément dans un canal d’émission du donneur et un canal d’émission de l’accepteur. Une grande partie de ma thèse a été consacrée à la mise au point d’une méthode quantitative pour analyser les images de fluorescence afin de mesurer une efficacité de FRET qui ne dépende pas de facteurs expérimentaux ni de la quantité de biosenseurs présents dans les cellules. Nous évaluons alors les différentes méthodes pour déterminer les facteurs de correction répandus corrigeant le débordement de spectre du donneur dans le canal accepteur et l’excitation directe de l’accepteur à la longueur d’onde d’excitation du donneur. Pour obtenir des mesures plus quantitatives, nous avons mis au point une nouvelles méthode pour déterminer 2 facteurs de correction supplémentaires. Nous comparons cette méthode à la seule préexistante et évaluons l’influence des paramètres de traitement des images sur les valeurs d’efficacité de FRET mesurées
Living cells can react to mechanical signals such as the rigidity of the surface they adhere on, the traction or compression forces applied on them, the liquid flow at their membrane surface or the geometry of their adhesions or of their overall shape. Those signals influence cellular processes such as proliferation, differentiation, migration or cell death. Those processes are tightly regulated by biochemical reactions that constitute a signaling network. Mechanotransduction is the translation of the mechanical signal into the biochemical one.In order to study mechanotransduction, we have considered the use of ultrasounds to mechanically stimulate cells at relatively high temporal and spatial frequencies. Numerous setups and options have been considered in this very exploratory project. Finally, we will retain some promising leads for the continuation of this project.We have developed what we call active substrates that allows us to control both spatially and temporally the mechanical stimulation on living cells. Those active substrates consist of iron micropillars embedded in a soft elastomer and actuated by 2 electromagnets. We can control dynamically the displacement of the pillar that will deform locally and continuously the surface. This deformation will then deform in traction or in compression the living cells spread on the surface nearby. Thanks to fluorescent trackers we can perform Traction Force Microscopy and monitor the stress applied by the pillars to the cells through the PDMS surface, and we can look at the mechanical response of the cells. Moreover, those substrates are compatible with live cell fluorescence microscopy, which makes possible the observation of the cellular response at the morphological level (focal adhesions, protrusive activity, …) and most importantly at the biochemical level.Indeed, in order to study the cellular biochemical response after a mechanical stimulation, we use fluorescence microscopy to observe biosensors containing pairs of donor/acceptor fluorophores. Those biosensors allow us to monitor the activity of proteins implied in cellular signaling by computing the Förster Resonance Energy Transfer (FRET) efficiency of those biosensors. To do so, samples are alternatively excited at donor and acceptor excitation wavelengths. The fluorescence signal is then simultaneously measured in donor and acceptor emission channels. A substantial part of my thesis has been dedicated to the development of a quantitative method to analyze fluorescence images in order to measure FRET efficiencies that do not depend on experimental factors or biosensors concentration in cells. We assess different methods to compute standard correction factors that account for spectral bleed-through and direct excitation of acceptors at donor excitation wavelength. To obtain more quantitative measurements, we have developed a new method to compute 2 additional correction factors. We compare this method with the only one preexisting, and we assess the influence of image processing parameters on FRET efficiency values

Le but de cette thèse était d’identifier les mécanismes moléculaires responsables des propriétés particulières de la couche G et les propriétés mécaniques remarquables du bois de tension (BT). Trois acteurs moléculaires potentiels (des protéines à arabinogalactane avec domaine fasciclin-like (FLA), une protéine chitinase-like (CTL) et une β-galactosidase (BGAL)) ont été choisis et étudiés dans: analyse phylogénétique, analyses d'expression et caractérisation de peupliers transgéniques affectés dans l’expression de chacun de ces acteurs. La caractérisation fine de ce matériel a révélé que CTL2 et les FLA jouent un rôle dans la régulation de la cristallinité de la cellulose dans le BT. CTL2 apparaît également important dans l'organisation de la paroi cellulaire et des propriétés mécaniques des tiges. BGAL a été avant proposé pour une fonction dans modification de pectine RG-I potentiellement important pour des propriétés mécaniques de BT. Le bois de tension exhibe une activité BGAL plus élevée que dans le bois opposé. L’inhibition par RNAi de l’expression de BGAL7, spécifiquement exprimée dans le BT, n’est pas responsable à lui seul de la forte activité BGAL présente dans le BT. En contrepoint à l’étude menée sur le peuplier, nous avons également évalué la présence d’acteurs moléculaires potentiellement responsables des propriétés mécaniques du BT chez le simarouba qui développe dans leur BT des fibres ayant leurs sous-couches de la paroi intermédiaire entre la G et la S2. Des protéines à arabinogalactanes ainsi que des pectines du type RG-I sont présentes dans les fibres de BT de peuplier et de simarouba et pourraient avoir une fonction dans un mécanisme commun de génération des contraintes dans le BT. Finalement, un modèle est proposé sur le rôle présumé des différents acteurs moléculaires étudié dans la régulation des propriétés de la couche G et la génération des fortes contraintes du bois de tension
The aim of this thesis was to approach the underlying molecular mechanisms responsible for the particular properties of the G-layer and the outstanding mechanical properties of tension wood (TW). Accordingly, three potential molecular players (fasciclin-like arabinogalactan protein (FLA), chitinase-like protein (CTL) and β-galactosidase (BGAL)) were chosen and studied through a phylogenetic analysis, expression analyses and most importantly characterization of RNAi transgenic poplars. This multilevel characterization revealed that CTL2 and FLAs have function in the regulation of cellulose crystallinity in TW. CTL2 was also shown to be important both for the cell wall organization and stem mechanical properties. BGAL was studied in a light of the previously reported modifications of RG-I pectin, potentially important for the mechanical properties of TW. Study of BGAL revealed that the enzyme has higher activity in TW than in opposite wood. BGAL7, whose gene was expressed specifically in TW, does not seem to be responsible for the higher BGAL activity in TW. In comparison to poplar, we analyzed the occurrence of molecular players potentially responsible for TW mechanical properties in simarouba, a tropical species, which develops different TW fiber. Arabinogalactan proteins and RG-I pectin potentially targeted by BGAL were localized in TW fibers both in poplar and simarouba and therefore may be involved in a common mechanism of tensile stress generation in different TW types. A model was finally proposed to elucidate a potential function of the studied molecular players in the regulation of G-layer properties and tensile stress generation

Les traitements thermomécaniques permettent une mise en forme temporaire et aisée de la chevelure, propriétés recherchées par les utilisateurs. Cependant, les effets obtenus ne sont pas toujours à la hauteur des attentes, notamment en raison d’une mauvaise tenue de la forme dans le temps et de possibles endommagements de la chevelure. Dans le but d’améliorer les appareils de coiffage existants, nous souhaitons comprendre les effets de ces traitements sur le cheveu, pour ensuite déterminer les conditions permettant d’atteindre la meilleure rémanence de la forme tout en minimisant la dégradation du cheveu. Pour ce faire, nous nous appuyons sur des expériences de traction, microdiffraction X et spectroscopie infrarouge. Tout d’abord, nous avons étudié l’organisation structurale de cheveux naturels. Nous avons mis en évidence une distribution de structure cœur – peau avec un cœur de structure régulière d’autant plus excentré que la courbure est marquée. Ensuite, nous avons dégagé les principaux paramètres sur. lesquels jouer lors de la mise en forme: température du mandrin, contrainte et durée d’application. Les effets de ces paramètres sur le comportement mécanique et la nanostructure du cheveu ont été évalués. Il ressort de notre étude que la contrainte de mise en forme est déterminante : nous avons défini la gamme de contraintes permettant de préserver la structure et les propriétés mécaniques du cheveu et celle occasionnant la dégradation du cheveu, voire une restructuration en feuillets bêta. Nous avons également évalué l’efficacité des différentes conditions de traitement à produire une forme durable dans le temps. En complément, nous nous sommes intéressés au mécanisme structural survenant lors de l’étirement de cheveux natifs ou préalablement traités, en couplant étirement continu d’un cheveu et analyse par microdiffraction X. Ainsi nous avons réussi à suivre l’évolution sous étirement d’une structure de cheveu transformée en feuillets bêta. Les résultats originaux obtenus au cours de ce travail, qui établissent un lien entre les mécanismes moléculaires et le comportement macroscopique du cheveu, permettent d’envisager le développement de nouveaux traitements thermomécaniques à l’échelle industrielle
Thermomechanical hair styling is preferred by users for easy and temporary reshaping of hair. However, the result is not always up to expectations, particularly due to poor shape stability over time and possible hair damage. In this work, we aim to improve hairstyling devices. To this end, we need to understand the effects of such treatments on hair in order to determine conditions which allow the best shape holding while minimizing hair damage. To achieve this, we use tensile testing, X-ray diffraction and infrared spectroscopy experiments. First, we studied the structural organization of natural hair. We highlighted a “core-skin” distribution of structures with a regular core which is all the more off-centered as curvature is high. Subsequently, we identified the main parameters of thermomechanical reshaping: temperature, stress and application time. Then, we evaluated the effects of these parameters on mechanical behavior and hair nanostructure. Our study shows that applied stress is a key factor: we defined stresses range allowing preservation of hair structure and its mechanical properties and the one leading to degradation or even driving to beta-sheets transition. Efficiency of the different treatment conditions in producing long-lasting shape over time was then evaluated. In addition, we analyzed the structural mechanisms that occur during stretching for native and pretreated hair: we used X-ray microdiffraction coupled with continuous stretching of hair. Consequently, we were able to monitor a beta sheet structure in hair during stretching. The original results obtained during this work, bridging internal molecular mechanisms and macroscopic behavior of hair, will allow to develop new thermomechanical treatments at industrial scale

Détermination de la densité de déformation dans ces deux composés par diffraction de rayons X (méthode X-X) et calculs ab initio SCF, après avoir calculé et comparé les phases des facteurs de structure à partir de deux modèles multipolaires (hansen-coppens et hirshfeld)

Le byssus est un amas de fibres que les moules produisent afin de s’ancrer aux surfaces immergées sous l’eau. Ces fibres sont pourvues de propriétés mécaniques impressionnantes combinant rigidité, élasticité et ténacité élevées. De plus, elles possèdent un comportement d’auto-guérison de leurs propriétés mécaniques en fonction du temps lorsque la contrainte initialement appliquée est retirée. Les propriétés mécaniques de ces fibres sont le résultat de l’agencement hiérarchique de protéines de type copolymère blocs riches en collagène et de la présence de métaux formant des liens sacrificiels réversibles avec certains acides aminés comme les DOPA et les histidines. Bien que cette fibre soit très intéressante pour la production de matériaux grâce à son contenu élevé en collagène potentiellement biocompatible, cette ressource naturelle est traitée comme un déchet par les mytiliculteurs. L’objectif de cette thèse était de valoriser cette fibre en extrayant les protéines pour générer une nouvelle classe de matériaux biomimétiques. Un hydrolysat de protéines de byssus (BPH) riche en acides aminés chargés, i.e. ~30 % mol, et permettant de former des films a pu être généré. Lorsque solubilisé à pH 10.5, le BPH forme un hydrogel contenant des structures en triple hélice de collagène et des feuillets β anti-parallèles intra- et inter-moléculaires. Suite à l’évaporation de l’eau, le film de BPH résultant est insoluble en milieu aqueux à cause des structures secondaires très stables agissant comme points de réticulation effectifs. Les propriétés mécaniques des films de BPH sont modulables en fonction du pH. Au point isoélectrique (pI = 4.5), les interactions électrostatiques entre les charges opposées agissent comme points de réticulation et augmentent la rigidité des films et leur contrainte à la rupture sans affecter la déformation à la rupture. À pH plus élevé ou plus bas que le pI, les performances mécaniques des films sont plus faibles à cause de la répulsion entre les groupements fonctionnels de même charge qui interagissent plutôt avec les molécules d’eau et causent le gonflement de la matrice protéique des films. Le BPH contenant un nombre élevé d’acides aminés chargés et réactifs, nous avons pu réticuler les films de manière covalente à l’aide d’EDC ou de glutaraldéhyde. Les propriétés mécaniques des films sont modulables en fonction de la concentration d’EDC utilisée lors de la réticulation ou en employant du glutaraldéhyde comme agent réticulant. Les films sont à la fois plus rigides et plus forts avec un degré de réticulation élevé, mais perdent leur extensibilité à mesure que les segments libres de s’étirer lors d’une traction deviennent entravés par les points de réticulation. La réticulation augmente également la résistance à la dégradation enzymatique par la collagénase, les films les plus fortement réticulés lui étant pratiquement insensibles. La spectroscopie infrarouge montre enfin que la réticulation entraîne une transition de feuillets β anti-parallèles inter-moléculaires vers des structures de type hélices de collagène/PPII hydratées. Des liens sacrificiels ont été formés dans les films de BPH par traitement au pI et/ou avec différents métaux, i.e. Na+, Ca2+, Fe3+, afin de moduler les propriétés mécaniques statiques et d’évaluer le rôle de ces traitements sur le comportement d’auto-guérison lors de tests mécaniques cycliques avec différents temps de repos. Plus la valence des ions métalliques ajoutés augmente, plus les propriétés mécaniques statiques affichent un module, une contrainte à la rupture et une ténacité élevés sans toutefois affecter la déformation à la rupture, confirmant la formation de liens sacrificiels. Les tests mécaniques cycliques montrent que les traitements au pI ou avec Ca2+ créent des liens sacrificiels ioniques réversibles qui mènent à un processus d’auto-guérison des performances mécaniques dépendant du pH. L’ajout de Fe3+ à différentes concentrations module les performances mécaniques sur un plus large intervalle et la nature plus covalente de son interaction avec les acides aminés permet d’atteindre des valeurs nettement plus élevées que les autres traitements étudiés. Le Fe3+ permet aussi la formation de liens sacrificiels réversibles menant à l’auto-guérison des propriétés mécaniques. Les spectroscopies Raman et infrarouge confirment que le fer crée des liaisons avec plusieurs acides aminés, dont les histidines et les DOPA. Les résultats dans leur ensemble démontrent que les films de BPH sont des hydrogels biomimétiques du byssus qui peuvent être traités ou réticulés de différentes façons afin de moduler leurs performances mécaniques. Ils pourraient ainsi servir de matrices pour des applications potentielles dans le domaine pharmaceutique ou en ingénierie tissulaire.
The byssus is a set of protein-based anchoring threads produced by marine mussels to tether to water immersed surfaces. These fibers have impressive mechanical properties combining stiffness, elasticity and toughness, as well as a self-healing behavior of their mechanical performance upon rest following removal of stress. These properties are the result of collagen-rich block copolymer-like proteins hierarchically assembled and of the presence of organo-metallic reversible sacrificial bonds. Even though these fibers have outstanding mechanical properties and a high content of potentially biocompatible collagen, the mussel farming industry still treats them as a waste. The main objective of this thesis was to use byssus as a sustainable biological feedstock to produce a new family of biomimetic protein-based materials. We developed a method to produce a byssus protein hydrolyzate (BPH) rich in charged amino acids (~30 % mol) and with good film-forming capabilities. A hydrogel rich in inter- and intra-molecular anti-parallel β-sheets and in collagen triple helical structures forms following the BPH solubilization at pH 10.5. After evaporation of water, the resulting film is insoluble in aqueous media as a result of the BPH self-assembly into stable secondary structures. The mechanical properties of the films are pH-responsive owing to their high electrostatic charges content that act like effective crosslinking points at the isoelectric point (pI = 4.5), but causes swelling of the protein matrix and loss of mechanical performance at pH higher or lower than the pI. The strain at fracture remains constant, which increases the toughness of the materials when moving toward the pI. The high content in charged and reactive amino acids was used to covalently crosslink the BPH films using either EDC or glutaraldehyde. Increasing the crosslinking degree gives rise to stiffer and stronger films but leads to a loss of extensibility as a consequence of protein chains being trapped by the crosslinking points. The crosslinked films become resistant to collagenase degradation even though infrared spectroscopy shows the conversion of aggregated strands to hydrated collagen/PPII related structures following the crosslinking reaction. Thus, the crosslinked collagen-related structural elements hinder the collagenase action on the BPH films. Sacrificial bonds were formed in the BPH films by treatments at their pI and/or with various metallic ions, i.e. Na+, Ca2+, Fe3+, in order to tune the mechanical properties and to evaluate the role of sacrificial bonds on the self-healing behavior during cyclic mechanical testing. Using metallic ions of higher valence to treat the films results in an increase of the modulus, strength and toughness without reducing the strain at fracture, confirming the formation of organo-metallic sacrificial bonds. Cyclic mechanical testing shows that pI and Ca2+ treatments create reversible ionic sacrificial bonds that induce a pH-dependent self-healing behavior. Fe3+ addition at various concentrations enables tuning the mechanical performances over a larger interval and to reach higher values than other treatments. This behavior is attributed to the more covalent nature of the iron-amino acids bonding and to the affinity of iron with numerous amino acids, including histidines and DOPA, as detected using Raman and infrared spectroscopy. Iron addition also leads to the formation of reversible sacrificial bonds that procure a self-healing behavior of the mechanical properties to BPH films. Altogether, our results show that the BPH films are byssus biomimetic hydrogels whose mechanical properties can be tuned by using various treatments or crosslinking reactions. The materials could thus find a niche as protein matrix in domains such as the pharmaceutical industry or soft tissue engineering.