Littérature scientifique sur le sujet « Penicillina G Amidas »

La descarga de metales pesados en el ambiente genera impactos significativos en la salud humana y ciclos biológicos. Algunos microorganismos son conocidos por su alta capacidad de adsorción de metales, entre estos los hongos. El objetivo del presente trabajo fue evaluar la capacidad de remoción de Pb (II) y Cd (II) en soluciones acuosas con hongos Penicillium sp., aislando la cepa fúngica del suelo de la mina el Alacrán (CórdobaColombia) y determinando la influencia en las variables pH, concentración inicial de metales y temperatura, analizando las isotermas de Freundlich y Langmüir, Verificando los grupos funcionales que intervienen en la adsorción por análisis infrarrojo (IR), con el fin potencializar su uso en el saneamiento de aguas residuales. Los análisis se realizaron empleando los equipos Thermo scientific de absorción atómica modelo ICE 3000 serie y espectrofotómetro FT-IR Nicolet Is5 realizando control de calidad con material de referencia de Pb y Cd SRM-1643e. A 51,5 mg L^-1 de Pb y Cd se pudo encontrar los mayores porcentajes de remoción para 0,5 g de biomasa. Las máximas adsorciones se dieron a pH ácido (4-5) y 60 °C, logrando remociones del 92,4% para Pb y 80% para Cd. Las isotermas se ajustan mejor al modelo Langmuir. El análisis IR muestra grupos -OH, -NH, C-N, C-H, N-H, C=O, amida I y amidas II y polisacáridos, atribuyendo esto la atracción en los metales y la biomasa fúngica.

2006/2007
In questo studio di tesi sono stati sviluppati ed ottimizzati nuovi supporti rigidi per la sintesi in fase solida in collaborazione con l’azienda Resindion srl. (Mitsubishi Chemical Corporation). Tali supporti, denominati Synbeads, sono stati poi caratterizzati dal punto di vista chimico e fisico ed applicati alla sintesi peptidica in fase solida. La parte iniziale dello studio si è concentrata sulla messa a punto del processo di polimerizzazione in modo da ottenere dei polimeri Synbeads caratterizzati da un grado di porosità ottimale e da una omogenea distribuzione del diametro particellare. Questi due parametri infatti influiscono notevolmente sull’applicabilità dei polimeri per sintesi su fase solida: - il grado di porosità, nei polimeri rigidi e che quindi non rigonfiano in solvente, deve garantire un buon trasferimento di massa dei reagenti e nello stesso tempo assicurare una buona resistenza dei polimeri stessi allo stress meccanico - la distribuzione particellare deve essere compresa in un ben definito range di diametro, in modo da permettere l’utilizzo dei Synbeads anche in sistemi automatizzati, senza che vi siano presente né particelle fini che potrebbero intasare i filtri, né particelle di dimensioni troppo grandi che potrebbero rendere difficoltoso il trasferimento delle stesse nei sistemi automatici. La successiva fase di ottimizzazione dei Synbeads si è concentrata su altri due parametri molto importanti, ossia la lunghezza dello spaziatore tra la matrice polimerica e il gruppo funzionale e la densità di gruppi funzionali presenti sui polimeri: - una distanza ottimale del gruppo funzionale dalla matrice del polimero ne garantisce la completa accessibilità chimica, evitando problematiche legate all’ingombro sterico - la densità di gruppi funzionali deve assicurare sia una buona capacità di carico (mmoli di gruppi funzionali per gdry di polimero) sia una completa accessibilità chimica di tutti i gruppi funzionali presenti sul polimero. In seguito a questo studio di ottimizzazione sono stati preparati i Synbeads con gruppo funzionale amminico (Synbeads A310). Partendo quindi dalle caratteristiche chimico-fisiche ottimizzate per la produzione dei Synbeads A310, sono stai messi a punto dei protocolli per la preparazione e la caratterizzazione dei altri Synbeads recanti gruppi funzionali diversi, ossia clorometilenici, bromometilenic, carbossilici ed idrossilici. Successivamente, i Synbeads A310 sono stati funzionalizzati con diversi linker che ne permettano applicazioni diverse nella sintesi in fase solida. Infatti, i Synbeads recanti i linker sono stati utilizzati per la preparazione da diversi Fmoc-AA-Wang-Synbeads e per la sintesi di un pentapeptide. Questo pentapeptide costituisce la sequenza dei primi cinque aminoacidi del Fuzeon®, un peptide che presenta attività inibitoria nei confronti dell’HIV. L’applicazione dei Synbeads è stata studiata anche per quanto riguarda il loro possibile utilizzo nella sintesi peptidica automatizzata con l’impiego di microonde, in particolare nel sistema Liberty CEM®. Grazie alle caratteristiche chimico-fisiche dei Synbeads e alla messa a punto di protocolli sintetici adatti a questi polimeri rigidi, si è potuto ottenere il prodotto desiderato con buone rese e un elevato grado di purezza. Nella parte finale di questo studio di tesi è stata indagata la distribuzione dei gruppi funzionali all’interno della matrice dei Synbeads. Combinando la tecnica ATR-FT IR con luce convenzionale e con luce di sincrotrone è possibile seguire la diffusione dei reagenti all’interno della matrice polimerica e verificare l’omogeneità della matrice stessa. Dopo aver messo a punto questa metodologia analitica, che permette un’indagine approfondita di ciò che avviene all’interno della matrice dei polimeri rigidi non trasparenti, un altro approccio analitico è stato sviluppato. Al fine di poter verificare in modo più rapido l’omogeneità della matrice polimerica, sezioni di Synbeads funzionalizzati con diverse concentrazioni di fluoresceina sono stati analizzati, permettendo in tal modo di verificare anche la distribuzione dei gruppi funzionali. Questo studio di dottorato quindi ha permesso di ottenere una nuova classe di polimeri rigidi per la sintesi su fase solida, i Synbeads, che hanno dimostrato di permettere l’ottenimento di ottimi risultati sia nella sintesi classica che in quella assistita da microonde. Nuovi approcci analitici sono stati studiati e applicati per verificare l’omogeneità della matrice polimerica e seguire i fenomeni di diffusione all’interno della matrice stessa. In tal modo, i Synbeads presentano un ottimo potenziale per un’applicazione su larga scala in processi industriali.
XX Ciclo
1979

La pénicilline g amidase (pga) d'e. Coli atcc 11105 est une enzyme de haut intérêt industriel, utilisée pour la production des antibiotiques de type b-lactame. Les pga bactériennes ont la particularité d'être des hétérodimères, produits par une double protéolyse interne d'un précurseur protéique. L'utilisation au niveau industriel de la surproduction de pga par bactéries recombinées semble limitée par l'existence de ce processus de maturation. J'ai employé différentes approches pour essayer d'apporter des informations sur ce processus. Par une étude in vivo, j'ai montré que la surproduction du précurseur pga chez e. Coli, a partir de son gène cloné, entraine son agrégation dans le periplasme et que la présence de saccharose dans le milieu de culture limite cette agrégation periplasmique. Par une étude in vitro, j'ai montré que la maturation protéolytique du précurseur pga fait vraisemblablement appel à une étape autocatalytique. En effet, j'ai pu obtenir une activité pga par dénaturation, puis renaturation de précurseur pga, purifie par électroélution. J'ai étudié, in vitro, l'effet sur l'efficacité de maturation des conditions de renaturation-maturation, ainsi que la cinétique de repliement-maturation du précurseur pga. Sur la base des résultats obtenus, un modèle de renaturation-maturation in vitro du précurseur pga est proposa. Par ailleurs, un effet très complexe de la température sur le processus de renaturation-maturation in vitro a été mis en évidence. Enfin, j'ai à la fois caractérisé le phénotype et identifié les mutations portées par un grand nombre de mutants du gène pga, produits par mutagenèse au hasard par le bisulfite. La majorité de ces mutants sont affectés au niveau du processus de maturation et les résultats obtenus démontrent l'importance de l'intégrité structurale du précurseur dans le processus complexe de repliement et de maturation protéolytique. Par ailleurs, six des précurseurs mutants présentaient des propriétés intéressantes, que j'ai étudiées in vivo et in vitro

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Universidade Federal de Minas Gerais
This master's thesis project aims at studying the dynamic optimization of the operation of a bench scale (up to 5L) automated, agitated and aerated bioreactor, where the semi-continuous cultivation of recombinant Pichia pastoris is run. This yeast was cloned using the PGK1 promoter, which precludes the use of methanol as inducer, expressing constitutively the enzyme penicillin G Acylase (PGA) from Bacillus megaterium. While the group of molecular biology of DEQUFSCar is working on cloning the PGA, d P. pastoris expressing the enzyme - amylase from Bacillus subtilis was cultivated. This clone, provided by prof. Fernando Torres, UnB, uses the same construction and, therefore, its kinetics of growth and production should be very similar to the PGA s. Cultivation of recombinant Pichia pastoris was performed in flasks (skaker) using standard culture medium, aiming at obtaining kinetic data, which are the starting point for the escalation to a benchtop bioreactor. Following that, tests were performed in a 5L bioreactor in batch and fed batch operation modes. With the bioreactor data , kinetic parameters of growth, to be further used in the simulations, were estimated, using a hybrid algorithm (which combines the global method Simulated Annealing, with the local one Levenberg- Marquardt). This algorithm, is implemented in Matlab and available in the software library of Ladabio (Laboratory of Development and Automation of Bioprocesses ). From these data, models of microbial growth and of production were developed, following a classic approach (unstructured, non-segregated). Computer simulations using different feeding strategies and employing these models allowed mapping the dynamics of the system. From this information, optimal control strategies were proposed to define optimal feeding profiles. Cellular concentrations of 5.4 g/L (dry weight) were reached in shaker (20h of cultivation, when glucose is exhausted), expressing 218 U/mL of -amylase, compared to 11.4 g/L (dry weight) that were achieved in cultures in a bioreactor in batch simple (10h of cultivation, when glucose is exhausted), expressing 156 U/mL of -amylase In fed-batch cultures, cell concentrations of up to 45 g/L were achieved, expressing up to 260 U/mL of - amylase, with a productivity of 5.2 U/mL/ h. In fed-batch cultures of P. pastoris expressing PGA, cell concentrations of up to 35 g/L were achieved. Enzyme activity was not detected in the culture broth due to the effect of glycosylation. Immunodetection reaction confirmed the expression of the recombinant enzyme. Four specific growth rate equations were adjusted, with different types of inhibition by one product, detected at significant levels by liquid chromatography highperformance, but not yet identified. This metabolite was added as an inhibitor in kinetic models, using the peak areas, normalized as a pseudoconcentration. The best fit to the experimental data were the Monod kinetic model with non-competitive inhibition. Typical values obtained for the maximum specific growth and glucose/ cell conversion factor in bioreactor were max=0,24 h-1 and YX/S = 0,48. Algorithm for optimal control in open loop was developed and successfully implemented, providing a robust profiles of great power, whose validation is proposed as a continuation of this work.
Este mestrado se propoe a estudar a otimizacao dinamica de biorreator automatizado, tipo tanque agitado e aerado, em escala de bancada (ate 5L), onde se processa o cultivo semi-continuo de Pichia pastoris recombinante. Essa levedura foi clonada pelo grupo do prof. Fernando Torres, da UnB, utilizando o promotor PGK1, que dispensa a utilizacao de metanol como indutor, expressando constitutivamente a enzima -amilase de Bacillus subtilis. Durante a execucao deste mestrado, a enzima penicilina G acilase (PGA) de Bacillus megaterium esta sendo clonada pelo grupo de biologia molecular do DEQ-UFSCar usando a mesma construcao e, portanto, a cinetica de crescimento e producao da PGA heterologa devera ser muito semelhante as da -amilase, utilizada como estudo de caso para otimizacao do bioprocesso. Cultivos de Pichia pastoris recombinante foram realizados em frascos agitados, utilizando meio de cultivo padrao, objetivando o levantamento de dados cineticos, ponto de partida para o escalonamento em biorreator de bancada. Posteriormente, foram realizados ensaios em biorreator de 5L, em batelada e batelada alimentada. Com os dados obtidos nos cultivos em biorreator, e utilizando algoritmo hibrido para estimativa de parametros (que combina o metodo global Simulated Annealing, com o local de Levenberg-Marquardt), implementado em MatLab e disponivel no LaDABio (Laboratorio de Desenvolvimento e Automacao de Bioprocessos), foram ajustados parametros cineticos de crescimento, para serem utilizados nas simulacoes dos cultivos em biorreator. A partir dai, foi desenvolvido modelo de crescimento microbiano e de producao, utilizando um enfoque classico (modelo nao-estruturado, nao-segregado) para descrever o sistema. Com isso, torna-se possivel realizar simulacoes em computador usando diferentes estrategias de alimentacao, para mapear a dinamica do sistema. A seguir, foram desenvolvidos algoritmos de controle otimo em malha aberta para definicao de estrategias de alimentacao. Concentracoes celulares de 5,4 g/L (massa seca) foram alcancadas em cultivos em camara rotatoria (20h de cultivo, quando se esgota a glicose), expressando 218 U/mL de -amilase, comparado com 11,4 g/L(massa seca) que foram atingidos em cultivos em biorreator em bateladas simples (10h de cultivo, quando se esgota a glicose), expressando 156 U/mL de -amilase. Em cultivos em batelada alimentada concentracoes celulares de ate 45 g/L foram atingidas, expressando ate 260 U/mL de -amilase, com uma produtividade de 5,2 U/mL/h. Em cultivo em batelada alimentada de P. pastoris expressando PGA, concentracoes celulares de ate 35 g/L foram atingidas. Nao foi detectada atividade enzimatica no caldo de cultivo devido ao efeito da glicosilacao. Reacao de imunodeteccao confirmou a expressao da enzima recombinante. Foram ajustadas quatro equacoes de velocidade especifica de crescimento, com diferentes tipos de inibicao por um produto, detectado em niveis importantes por cromatografia liquida de alto desempenho, mas ainda nao identificado. Esse metabolito foi inserido como inibidor nos modelos cineticos, utilizando as areas dos picos, normalizadas, como uma pseudoconcentracao. Os melhores ajustes aos dados experimentais foram com modelo cinetico de Monod com inibicao nao-competitiva. Valores tipicos obtidos para a velocidade especifica maxima de crescimento e de fator de conversao glicose/celula em biorreator foram max = 0,24 h-1 e YX/S = 0,48. Algoritmo de controle otimo em malha aberta foi desenvolvido e implementado com sucesso, prevendo de forma robusta perfis otimos de alimentacao, cuja validacao fica proposta como continuidade deste trabalho.