Littérature scientifique sur le sujet « Osteosarcoma, cellule staminali tumorali, cancer stem cells »

Il glioblastoma multiforme (GBM) è un astrocitoma di IV grado, è il più comune tra i tumori maligni cerebrali. La sopravvivenza media dei pazienti trattati è inferiore a 16 mesi e non è significativamente migliorata in questi ultimi decenni, sottolineando le difficoltà nell’efficace caratterizzazione e trattamento di questo tipo di tumore. L’alta frequenza di recidiva del GBM, il suo elevato potere infiltrante e la resistenza alla radio e chemioterapia rendono urgente lo sviluppo di strategie di trattamento maggiormente efficaci per la cura di questo tumore. La resistenza ai trattamenti convenzionali è legata alla presenza di una sottopopolazione di cellule tumorali con caratteristiche staminali definite glioma stem cells (GSCs), in grado di sostenere la propagazione del tumore e di guidarne la recidiva. Interessanti evidenze preliminari suggeriscono che pazienti diabetici con GBM, trattati con agonisti di PPARɤ (peroxisome proliferator-activated receptor gamma) mostrano una sopravvivenza media maggiore rispetto a pazienti riceventi la terapia standard per il trattamento del GBM. Da qui nasce l’interesse di uno studio più approfondito sui potenziali effetti antineoplastici di un agonista di PPARɤ, il Pioglitazone, farmaco insulino-sensibilizzante, attualmente impiegato in clinica per il trattamento del diabete di tipo II. Inoltre, in diversi studi condotti su diversi tipi di cellule di glioma, è stato dimostrato un effetto Pioglitazone nella riduzione della proliferazione cellulare, nell’invasività e nell’induzione della morte cellulare per apoptosi. Lo scopo di questo studio è stato dunque quello di verificare se il Pioglitazone possa avere gli stessi effetti antineoplastici anche su linee di cellule staminali tumorali da GBM utilizzate nel nostro laboratorio e già precedentemente caratterizzate e pubblicate (GBM2, G179, G166, G144, Glins2 e GBM04) al fine di individuare nuove potenziali strategie terapeutiche. Sono state condotte diverse analisi tra cui saggi di vitalità (MTT e Trypan Blue) e valutazione dell’indice mitotico, analisi morfologica e di immunofluorescenza, analisi di espressione tramite RT-PCR e saggio di invasione cellulare. Tutte queste analisi hanno messo in luce l’estrema variabilità di risposta di queste linee a conferma dell’ eterogeneità che caratterizza questo tipo di tumore. Dai risultati ottenuti si possono suddividere le linee in base alla loro sensibilità/resistenza al trattamento con Pioglitazone o alla possibile attivazione di vie indipendenti dal recettore di PPARɤ attivate da questo farmaco. Questo studio rappresenta un inizio di valutazione dei potenziali effetti antineoplastici del Pioglitazone e ci ha permesso di identificare tra le nostre linee in esame quelle più o meno responsive al trattamento farmacologico, per poter procedere con studi futuri più specifici e selettivi.

Epithelial Ovarian Cancer (EOC) is a very malignant neoplasm, accounting for 5% of cancer mortality in women. Although progress has been made in EOC treatments by improved debulking surgery and platinum-taxane regimens, the 5-year survival rate of advanced-stage EOC remains below 30%. This poor prognosis relies on the one hand on the late diagnosis and on the other on the chemo-resistance occurring after only a few months from the completion of treatment. The reasons for recurrence and cancer drug resistance remain uncertain. Recent evidence suggests that EOC, akin most tumors, contains a tiny population of cells, named cancer stem cells (CSC), probably responsible for chemotherapy resistance and tumor recurrence. Ovarian CSC are characterized by the co-expression of two surface markers: CD44 (hyaluronic acid receptor) and CD117 (stem cell factor receptor or c-kit). Recently, our research group demonstrated that ovarian CD44/CD117 co-expressing cells, which represent 1-2% of cancer cells from ascitic effusions of EOC-bearing patients, are endowed with canonical stemness properties and are able to resist in vitro and in vivo glucose starvation. We reported that this glucose deprivation resistance is mostly due to the ability of ovarian CSC to privilege oxidative phosphorylation, rather than the aerobic glycolysis (Warburg effect) exploited by the non-stem tumor bulk. However, independently of CSC fraction, our experiments also highlighted that not all the analyzed EOC samples presented a similar glucose addiction. Thus, investigating this issue and its related metabolic aspects is the first aim of the current project. Concerning this aim, we showed that tumor cells from EOC patients can be categorized, according to their in vitro viability under glucose starvation, into glucose deprivation-sensitive (glucose-addicted, GA) and glucose deprivation-resistant (glucose non-addicted, GNA). Although deregulated glucose metabolism is usually observed in cancer, whether this metabolic trait influences response to or is modulated by cytotoxic drugs is unknown; therefore, we addressed the possible correlation of these glucose addiction profiles with the patient response to platinum (PLT) regimens. In this regard, when EOC cells were cultured in the absence of glucose, all samples from PLT-sensitive patients felt into the GA group; compared to GNA samples, they disclosed higher expression of glucose metabolic enzymes, higher proliferation rates and in vitro sensitivity to PLT, as well as reduced multi-drug resistance pump expression. On the other hand, the samples derived from PLT-resistant patients felt into the GNA category. The close association between PLT sensitivity and glucose metabolic profile was confirmed in a xenograft model, where a stringent parallelism between PLT sensitivity/resistance and glucose metabolism was identified. Finally, in a cohort of naïve EOC patients categorized as GA or GNA at diagnosis, Kaplan Meier curves showed that the GA phenotype was associated with significantly better progression-free survival, compared to GNA patients. Overall, these results suggest that in vitro glucose addiction of EOC cells could be regarded as a reliable marker to predict the patient response to platinum regimens. Investigating the molecular traits leading to the distinctive glucose metabolism of EOC samples is the second aim of this project. In this regard, microRNA (miRNA), that are small non-coding RNA molecules, represent a promising field, in view of their ability to modulate many genes and pathways. Moreover, their involvement in cancer development and progression has already been reported in ovarian cancer, and recently miRNA also emerged to regulate cell metabolism in several normal and cancer tissues. Thus, we performed a miRNA profile on EOC patient-derived samples, comparing both GA versus GNA samples and CSC versus non-CSC, in order to establish whether the miRNA signature behind the metabolic differences of EOC samples is associated with the total tumor bulk or rather with a specific cell fraction. The data did not reveal any miRNA differentially expressed in GA compared to GNA cells, but several miRNA resulted significantly deregulated in CSC versus non-CSC. We focused our attention on mir-602, which was found up-regulated in CSC; indeed, despite little information about this miRNA, its target Casein Kinase 1 Delta (CSNK1D), which displays a key role in cell proliferation and asymmetric division, seemed very interesting in view of its involvement in breast cancer progression. We demonstrated that CSNK1D is down-regulated in CSC, according to mir-602 over-expression. Moreover, the in vitro inhibition of mir-602 reduced the expression of the major stemness-associated genes in CSC, suggesting that mir-602 could regulate some cell stemness pathways. Since none of the analyzed stemness genes is directly targeted by mir-602, it is reasonable to advance that mir-602 could indirectly activate the expression of such genes through its inhibitory function on CSNK1D; thus, we propose that cell stemness signaling is inhibited by casein kinase, whose translation is in turn repressed by mir-602. Although a few further experiments are needed to validate our idea, this project highlights a possible miRNA-mediated regulatory mechanism of cell stemness features in EOC.
Il tumore ovarico di tipo epiteliale (EOC – Epithelial Ovarian Cancer) rappresenta la prima causa di morte per neoplasia ginecologica. Sebbene la chirurgia e la chemioterapia a base di carbo/cis-platino abbiano migliorato la prognosi delle pazienti affette da tale carcinoma, il tasso di sopravvivenza a 5 anni dalla diagnosi di EOC in stadio avanzato rimane inferiore al 30%. Tale elevata mortalità è riconducibile alla diagnosi in fase tardiva ed all’insorgenza di resistenza alla chemioterapia di prima linea, che porta a frequenti ricadute entro pochi mesi dalla conclusione dei trattamenti. Le cause della comparsa di fenomeni di resistenza alla terapia, e della conseguente ricorrenza del tumore, è ancora incerta. Recenti studi hanno indicato che la crescita del carcinoma epiteliale dell’ovaio è sostenuta da una minima popolazione di cellule, dette cellule tumorali staminali (CSC - Cancer Stem Cells), probabilmente responsabili della ricomparsa del tumore al termine delle sedute farmacologiche. Un consenso generale supporta l’idea che l’eliminazione di questa popolazione rappresenti uno dei più importanti obiettivi della terapia anti-tumorale. Tuttavia, si ha ancora una scarsa conoscenza dei meccanismi che conferiscono un vantaggio di sopravvivenza alle CSC sulle cellule tumorali non staminali, rendendo così arduo lo sviluppo di terapie mirate anti-CSC. Le CSC del carcinoma epiteliale ovarico sono caratterizzate dall’espressione di due marcatori di superficie cellulare: CD44 (recettore dell’acido ialuronico) e CD117 (c-kit o recettore del fattore cellulare staminale SCF). Recentemente, il nostro gruppo di ricerca ha dimostrato che le cellule ovariche co-esprimenti CD44 e CD117, che rappresentano l’1-2% delle cellule tumorali provenienti dall’ascite delle pazienti affette da EOC, possiedono le canoniche proprietà staminali e sono in grado di sopravvivere in vitro ed in vivo alla deprivazione di glucosio. Abbiamo inoltre osservato che tale resistenza all’assenza di glucosio è principalmente dovuta alla capacità delle CSC, contrariamente alle cellule tumorali non staminali, di privilegiare la fosforilazione ossidativa anziché la glicolisi aerobica (Warburg Effect). Tuttavia, indipendentemente dalla frazione delle cellule tumorali staminali, l’analisi comparativa tra i diversi campioni di EOC ha evidenziato che non tutti presentano la stessa dipendenza dai glucidi; per alcuni, infatti, pochi giorni in vitro senza glucosio sono sufficienti a ridurre significativamente la vitalità cellulare, mentre per altri lo stesso effetto è ottenibile solo dopo molte settimane di coltura nelle stesse condizioni. Dunque, approfondire tale questione e gli aspetti metabolici ad essa correlati è il primo scopo di questo progetto. A tal proposito, sulla base della vitalità cellulare in condizioni di coltura senza glucosio, abbiamo potuto suddividere le cellule derivanti da asciti di pazienti con EOC in due categorie: sensibili alla deprivazione di glucosio (GA – Glucose-Addicted) e resistenti a tale deprivazione (GNA – Glucose Non-Addicted). Sebbene variazioni nella regolazione del metabolismo del glucosio siano state frequentemente osservate nei casi di neoplasia, non è ancora noto se questo diverso tratto metabolico influenzi la risposta dei pazienti alle terapie, o se sia da queste modulato. Pertanto, abbiamo deciso di ricercare una eventuale correlazione tra i diversi profili di dipendenza dal glucosio da noi riscontrati e la risposta dei pazienti al trattamento a base di carbo/cis-platino. Infatti, da un punto di vista clinico, i pazienti vengono categorizzati come platino-resistenti o platino-sensibili, a seconda che la neoplasia recidivi entro od oltre i 6 mesi, rispettivamente, dalla fine della chemioterapia di prima linea. I nostri esperimenti hanno rivelato che, quando le cellule di EOC vengono coltivate in assenza di glucosio, tutti i campioni provenienti da pazienti platino-sensibili ricadono all’interno del gruppo GA; confrontati con i campioni GNA, i GA mostrano una maggiore produzione degli enzimi del metabolismo glucidico, un maggior tasso di proliferazione, e una minore espressione delle pompe cellulari per l’espulsione dei farmaci. Parallelamente, i campioni derivanti dai pazienti platino-resistenti rientrano nella categoria GNA. La stretta associazione tra la sensibilità ai chemioterapici e il profilo cellulare di utilizzo del glucosio è stata confermata in un modello murino di xenotrapianti, nel quale è stato identificato uno stringente parallelismo tra risposta al platino e metabolismo glucidico. Infine, in una coorte di pazienti non chemio-trattate affette da EOC, le quali erano state categorizzate come GA o GNA alla diagnosi, le curve di Kaplan Meier hanno messo in luce che il fenotipo GA, rispetto a quello GNA, è associato con un maggior periodo di sopravvivenza senza recidive, in modo statisticamente significativo. Nel complesso, questi dati suggeriscono che il grado di dipendenza dai glucidi delle cellule di EOC, osservabile in vitro, può rappresentare un valido marcatore per predire la risposta dei pazienti alla chemioterapia a base di platino. Analizzare il tratto molecolare che determina il peculiare metabolismo glucidico dei campioni di EOC costituisce il secondo obiettivo del nostro progetto di ricerca. A tal riguardo, i microRNA (miRNA), ossia piccole molecole di RNA non codificante, rappresentano un promettente settore di studio, in qualità della proprietà di queste strutture molecolari di regolare molti geni e vie di segnale. Inoltre, il loro coinvolgimento nello sviluppo e nella progressione tumorale è già stato dimostrato per il carcinoma ovarico, e recentemente i miRNA sono risultati essere importanti modulatori del metabolismo cellulare in molti tessuti normali e neoplastici. Pertanto, il nostro gruppo di ricerca ha prodotto un profilo di espressione di miRNA su cellule derivanti da pazienti affette da EOC, confrontando sia campioni GA contro GNA, sia CSC contro non-CSC; il nostro fine è stabilire se il pattern di miRNA alla base delle differenze metaboliche tra i campioni di EOC sia associato alla totale massa tumorale o piuttosto ad una specifica frazione cellulare neoplastica. Questi dati non hanno rivelato alcun miRNA differentemente espresso tra cellule GA e GNA; tuttavia, molti miRNA sono risultati deregolati nelle CSC rispetto alle non-CSC. Noi ci siamo focalizzati sul mir-602, up-regolato delle CSC; infatti, nonostante la scarsa conoscenza su questo miRNA, il suo target chinasi Caseina 1 Delta (CSNK1D), che detiene un ruolo chiave nella proliferazione cellulare e nella divisione asimmetrica, ci è parso molto interessante in virtù del suo già dimostrato coinvolgimento nella progressione del carcinoma mammario. In questo contesto, i nostri esperimenti hanno dimostrato che CSNK1D è down-espressa nelle CSC, in accordo alla up-modulazione del mir-602. Inoltre, l’inibizione in vitro del mir-602 riduce nelle CSC l’espressione della maggior parte dei geni associati alle proprietà staminali, suggerendo che il mir-602 potrebbe controllare alcune delle vie di segnale correlate alla staminalità. Dato che nessuno dei geni di staminalità analizzati si lega direttamente al mir-602, appare ragionevole supporre che suddetto miRNA possa indirettamente attivare l’espressione di tali geni tramite la sua funzione inibitoria su CSNK1D. Dunque, secondo la nostra ipotesi, le caratteristiche staminali sarebbero inibite dalla chinasi Caseina, la quale sarebbe a sua volta repressa dal mir-602. Nonostante molti altri esperimenti siano necessari per confermare questa nostra teoria, il progetto qui presentato mette in rilievo la possibile esistenza di un meccanismo di regolazione, mediato dal mir-602, responsabile delle proprietà di staminalità delle cellule del carcinoma epiteliale ovarico.

Secondo la teoria delle cellule staminali tumorali, lo sviluppo del tumore sarebbe sostenuto dalla presenza di una distinta sottopopolazione di cellule tumorali, denominate cancer stem cells (CSCs), dotate della capacità di autorigenerarsi e di una spiccata resistenza agli agenti chemioterapici. Nel presente studio, è stato messo a punto un protocollo di crescita volto all’arricchimento in CSCs, mediante formazione di sfere, delle linee cellulari Hep-2 (carcinoma della laringe), T24 (carcinoma della vescica), MG63 (osteosarcoma), CaCo-2 (carcinoma del colon-retto) e A549 (carcinoma polmonare). Successivamente è stata effettuata un caratterizzazione molecolare e fenotipica delle popolazioni arricchite in CSCs, mediante rispettivamente l’analisi di espressione di markers di staminalità e la valutazione in vivo del potenziale tumorigenico. Inoltre, a carico delle CSCs e delle cellule di controllo, sono stati analizzati i livelli dell’enzima nicotinamide N-metiltrasferasi (NNMT). L’analisi immunocitochimica e mediante Real-Time PCR hanno evidenziato elevati livelli di espressione dei markers di staminalità nelle popolazioni cellulari arricchite in CSCs rispetto ai controlli. In seguito all’inoculo in topi atimici delle cellule relative alla linea Hep-2, la popolazione arricchita in CSCs dava luogo a masse tumorali di dimensioni maggiori rispetto a quelle originatesi dalle cellule di controllo, evidenza che suggerisce la spiccata capacità da parte delle CSCs di indurre la formazione in vivo di tumori. Le analisi condotte a carico dell’NNMT mostrano un’overespressione dell’enzima nelle popolazioni arricchite in CSCs rispetto ai controlli. In considerazione dell’importante ruolo svolto dalle CSCs nello sviluppo di recidive e nella diffusione metastatica, i risultati riportati in questo lavoro potrebbero contribuire allo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per il trattamento del cancro e suggeriscono il significativo coinvolgimento dell’NNMT nel metabolismo della cellula neoplastica.
According to cancer stem cells theory, tumor development would be maintained by a distinct subpopulation of tumor cells, termed cancer stem cells (CSCs), that have the ability to self-renew and to resist to chemotherapeutic agents. In the present study, we setup a culture system to enrich CSCs from Hep-2 (laryngeal cancer), T24 (bladder cancer), MG63 (osteosarcoma), CaCo-2 (colorectal cancer) and A549 (lung cancer) cancer cell lines, through sphere formation. We further performed molecular and phenotypic characterization of CSC-enriched cell populations, by exploring the expression levels of stem markers and in vivo evaluating their tumorigenic potential, respectively. Moreover, we investigated the expression levels of the enzyme nicotinamide N-methyltransferase (NNMT) in CSCs and parental cells. Real-Time PCR and immunocytochemistry revealed that CSC-enriched populations showed increased expression levels of stem markers compared with controls. After subcutaneous injection of Hep-2 cells into immunocompromised mice, CSC-enriched population yielded tumors of a much larger size compared with those generated by parental cells, suggesting the strong ability of CSCs to form tumors in vivo. NNMT expression analysis revealed enzyme upregulation in CSC-enriched populations compared to parental counterpart. Considering the fundamental role of CSCs in tumor relapse and onset of metastases, findings reported in this work could contribute to the development of new therapeutic strategies for cancer treatment and suggest an important involvement of NNMT in cancer cell metabolism.

Ovarian cancer is the fourth leading cause of cancer-related death in women and the leading cause of gynecologic cancer death. Moreover, it is regarded as a therapy resistant tumor, because it shows the formation of more aggressive recurrence of the primary tumor as a result of chemotherapy. This chemo-resistance is thought to be related to the presence of the Cancer Stem Cells (CSC). Tumor cells are characterized by a high glycolytic metabolism even in the presence of oxygen, the so-called Warburg effect; however, it is unclear whether this condition is also shared by CSC. We identified ovarian CSC, according to their co-expression of CD44 and CD117 markers, in 40 samples of ascitic effusions from ovarian cancer-bearing patients. We have analyzed phenotipic characteristics by investigating stemness marker expression by flow-cytometry, spheroid formation assay, tumorigenicity in vivo and gene expression in RT-PCR. For the analysis of metabolic characteristics, ovarian cancer cells were FACS-sorted in to CD44+CD117+ and CD44+CD117- cell populations and analyzed through specific metabolic gene-cards. Results were confirmed also through Western Blot for specific metabolic enzymes and functional assay of mitochondrial activity. We have demonstrated that CD44+CD117+ EOC cells presented high tumorigenicity and expressed stemness-associated markers and multidrug resistance pumps. Moreover, the CD44+CD117+ cell population overexpressed genes associated with glucose uptake, oxidative phosphorylation (OXPHOS), and fatty acid -oxidation, indicating higher ability to direct pyruvate towards the Krebs cycle. Consistent with a metabolic profile dominated by OXPHOS, the CD44+CD117+ cells showed higher mitochondrial reactive oxygen species (ROS) production and elevated membrane potential, and underwent apoptosis upon inhibition of the mitochondrial respiratory chain. The CSC also had a high rate of pentose phosphate pathway (PPP) activity, which is not typical of cells privileging OXPHOS over glycolysis, and may rather reflect the PPP role in recharging scavenging enzymes. Furthermore, CSC resisted in vitro and in vivo glucose deprivation, while maintaining their CSC phenotype and OXPHOS profile. In this study, we show that a subpopulation of CD44+CD117+ EOC cells fulfilling the canonical properties of CSC does not preferentially exploit a glycolytic metabolism, privileging instead the mitochondrial respiratory pathway. These observations could explain the CSC resistance to anti-angiogenic therapies, and indicate this peculiar metabolic profile as a possible target of novel treatment strategies.
Il cancro all’ovaio viene considerato un tumore resistente alla terapia e questa farmaco-resistenza si pensa sia correlata alla presenza delle cellule staminali tumorali (CSC). Le cellule staminali tumorali sono una rara e piccola popolazione cellulare responsabile dell’insorgenza del tumore, del mantenimento della sua crescita, dei casi di recidive e metastasi, in seguito alla loro proprietà di farmaco-resistenza. Considerando queste premesse, è indispensabile caratterizzare queste cellule in modo da trovare un possibile bersaglio terapeutico e migliorare i risultati delle terapie attuali. Le cellule tumorali sono caratterizzate da un metabolismo altamente glicolitico anche in presenza di ossigeno, denominato “Effetto Warburg”. Poco si conosce riguardo al metabolismo delle cellule staminali tumorali, e soprattutto non è noto se l’effetto Warburg è una condizione condivisa. Questo progetto di ricerca si prefigge di: - caratterizzare le CSC nel campioni primari di liquido ascitico di cancro all’ovaio; - studiare il profilo metabolico delle CSC isolate, per identificare eventuali differenze con la controparte differenziata. RISULTATI: Inizialmente abbiamo identificato le CSC, secondo la co-espressione dei marcatori CD44 (il recettore dell’acido ialuronico), e CD117 [c-kit, recettore della citochina SCF (Stem Cell Factor)] in 40 campioni di liquido ascitico di cancro all’ovaio di pazienti in cura all’ospedale di Padova. Questa rara popolazione cellulare CD44+CD117+ è in grado di formare strutture sferoidali; è altamente tumorigenica in topi immunodeficienti; presenta farmaco-resistenza, dimostrata con trattamenti in vitro con farmaci solitamente utilizzati in clinica; ed è caratterizzata da un’alta espressione di geni codificanti: pathway di staminalità (Nanog, Oct4, Sox2), pompe o enzimi detossificanti, coinvolti nei fenomeni di farmaco-resistenza (ABCG2, MRP1, MRP2 e ALDH1A) e enzimi coinvolti nel fenomeno della transizione epitelio-mesenchimale, importante nei processi di metastasi (SNAIL1, SNAIL2, ZEB1, ZEB2, TWIST1). Complessivamente, questi risultati dimostrano che le cellule CD44+CD117+ rappresentano una popolazione con caratteristiche di staminalità. A seguito di questa caratterizzazione fenotipica, abbiamo studiato il profilo metabolico delle cellule CD44+CD117+, confrontandolo con quello della controparte non-staminale (CD44+CD117-). In primo luogo, abbiamo esaminato l’espressione di geni coinvolti in diverse importanti vie metaboliche, tra cui: il metabolismo del glucosio, il ciclo dell'acido tricarbossilico (TCA), la catena di trasporto degli elettroni (ETC) nel processo della respirazione mitocondriale, la via dei pentoso fosfati (PPP), e la β-ossidazione degli acidi grassi. Le cellule CD44+CD117+ mostrano alti livelli di espressione dei geni associati alla glicolisi, e sono caratterizzate da una forte dipendenza dalla via dei pentoso fosfati e della β-ossidazione degli acidi grassi, dimostrata da una significativa diminuzione della loro vitalità in seguito a trattamento in vitro con due inibitori specifici delle due vie metaboliche (DHEA e Etomoxir rispettivamente). Inoltre le cellule CD44+CD117+ sono caratterizzate da un'alta espressione dei geni codificati enzimi coinvolti nel ciclo di Krebs e nella fosforilazione ossidativa (OXPHOS). Questo risultato ci ha permesso di analizzare l'espressione di un enzima chiave del ciclo di Krebs, la piruvato deidrogenasi (PDH), fondamentale nel trasporto del piruvato dalla glicolisi alla respirazione cellulare. Abbiamo verificato livelli di espressione comparabili dell’enzima PDH nelle due popolazioni cellulari CD44+CD117+ e CD44+CD117-, mentre l’enzima PDHK1, che inattiva la piruvato deidrogenasi tramite fosforilazione, risulta meno espressa nella popolazione CD44+CD117+. Questi dati suggeriscono che nelle cellule staminali tumorali venga privilegiato il trasporto del piruvato verso i mitocondri, per catalizzare il metabolismo della respirazione mitocondriale. Alla luce di questi risultati, abbiamo studiato l’attività mitocondriale nella popolazione staminale e nella controparte non staminale. In particolare le cellule CD44+CD117+ sono caratterizzate da bassi livelli di ROS (specie reattive dell’ossigeno) totali, da alti livelli di ROS mitocondriali, da una iper-polarizzazione del potenziale di membrana mitocondriale in seguito a trattamento con oligomicina (inibitore dell’ATP-sintasi) e da una drammatica diminuzione della vitalità cellulare in seguito a trattamento con inibitori specifici della catena di trasporto degli elettroni (ETC) (oligomicina inibitore dell’ATP-sintasi; rotenone inibitore del complesso I e antimicina inibitore del complesso III). Complessivamente, questi risultati ci hanno suggerito un modello sperimentale del profilo metabolico delle cellule staminali tumorali CD44+CD117+, le quali privilegiano la via della respirazione mitocondriale, a discapito della via glicolitica. Inoltre, abbiamo dimostrato che un trattamento in vitro e in vivo (2DG) di deprivazione di glucosio o blocco della via glicolitica seleziona una popolazione di cellule con caratteristiche di staminalità: incremento dell’espressione dei marcatori CD44 e CD117, farmaco-resistenza, tumorigenicità in vivo, formazion dii sferoidi in vitro ed espressione di geni convolti in pathway tipici delle cellule staminali. Questa popolazione cellulare ha mostrato una down-regolazione della maggior parte delle vie metaboliche, entrando in uno stato di quiescenza pur mantenendo livelli di espressione significativi dei geni codificanti enzimi del metabolismo ossidativo e iper-polarizzazione del potenziale di membrana mitocondriale, nonché dell’attività dei mitocondri. A conclusione del progetto e come ulteriore dimostrazione del profilo metabolico ossidativo delle cellule staminali tumorali, contrario all’effetto Warburg sfruttato dalle cellule tumorali, abbiamo eseguito degli esperimenti in vitro con due farmaci che colpiscono le vie metaboliche della respirazione cellulare: Metformina e CPI-613. Metformina inibisce il complesso I della catena di trasporto degli elettroni ed è attualmente in uso in studi clinici come farmaco antitumorale promettente; CPI-613 è un farmaco innovativo che inibisce due enzimi chiave del ciclo degli acidi tricarbossilici, PDH e α-KGH. Trattamenti in vitro con questi farmaci hanno dimostrato una significativa diminuzione della vitalità delle cellule CD44+CD117+, fondamentale verifica della loro dipendenza da questo profilo metabolico. CONCLUSIONI: In questo studio abbiamo investigato il profilo metabolico delle cellule staminali tumorali, isolate ex-vivo da campioni di liquidi ascitici di pazienti con carcinoma ovarico, dimostrando che le CSC ovariche, a differenza delle cellule differenziate neoplastiche, sfuggono all’effetto Warburg, utilizzando preferibilmente una respirazione ossidativa. Questa osservazione può indicare nuove strade e nuove strategie per approcci di terapie mirate nei confronti delle CSC, alla luce delle peculiari caratteristiche del loro metabolismo.

Recent reports have shown that tumor growth is supported by a specific subpopulation of stem cells, known as cancer stem cells (CSCs) or tumor-initiating cells. This cells have stem-like features, such as self renewal,multipotency, high migration capacity, drug resistance and aberrant differentiation. CSCs have been detected in several kind of tumors and in cancer cell lines grown as non-adherent spheres in serum–free medium under intense stimulation whit growth factors. Presence of cancer stem-like cells in thyroid differentiated carcinoma has not yet fully investigated and the literature on such issue is still limited. The objective of this study was to identify and characterize CSCs from a cancer cell line from papillary thyroid carcinoma (B-CPAP) and a cell line, derived from human thyroid follicular cells (N-THY-ORI 3-1), as control. Thyrospheres from B-CPAP cells could be propagated up to ten generations, whereas those from N-THY-ORI 3-1 lasted only for four generations. The “stemness” profile was evaluated by functional assays and RT-PCR. B-CPAP sphere forming efficiency (SFE) and self renewal increased exponentially at every generation with maximum value at the 8th. By contrast, N-THY-ORI 3-1 SFE and self renewal progressively decreased along generations. RT-PCR showed mRNA expression of stem cell markers (Oct 4, Nanog, ABCG2) and early and thyroid late differentiation markers (PAX8, TTF1, Tg) in B-CPAP thyrosphere. In particular, ABCG2 expression significantly increased in thyrospheres at 9th generation. On the contrary, PAX8, TTF1 and Tg showed a decrease in thyrosphere along the generation of spheres, while p63 maintained the same expression in all samples. Thyrospheres from non tumorigenic cell line were positive for mRNA expression of stem cell markers (Oct4, Nanog, ABCG2,) and PAX8. In this cell line, Nanog and ABCG2 mRNA expression increased along the generations. To isolate stem-like cells in tumor and normal thyrospheres, we used the fluorescent dye PKH26. The single cells suspensions from thyrospheres were then FACS sorted. According to fluorescent intensity we selected two populations: the brightest fluorescent cells (PKH26 high), which constitute the putative stem cell population and the dimmest fluorescent cells (PKH26 low), which represent proliferating and differentiated cells. Both populations were able to form sphere, but only PKH26 high formed secondary spheres. The molecular analysis showed a higher stem cell marker mRNA expression in PKH26 high compare to PKH26 low cells. On the contrary TTF-1, PAX8 and Tg mRNA were more expressed in PKH26 low cells. Take together, our data show, for the first time, that B-CPAP and N-THY-ORI 3-cell lines contain cells with features and properties of stem cell.

Epithelial ovarian cancer (EOC), the most lethal gynecological malignancy, is normally treated with surgery followed by platinum and taxane-based chemotherapy. Despite an initial high response rate, the majority of patients eventually relapse and die. The cause could be ascribed to a subpopulation of cancer cells, named cancer stem cells (CSC), endowed with self-renewal, high tumorigenic and metastatic potential, and drug resistance. Therefore, CSC eradication could be envisioned as a successful treatment. Part of the work included in this thesis stemmed from the idea that ovarian CSC could enjoy some growth advantage, deriving from intrinsic properties or from autocrine/paracrine circuits operating in tumor microenvironment. Our group and others demonstrated that CD44+CD117+ cells are likely EOC CSC. Recent studies indicated autophagy as a mechanism to survive chemotherapy and that CSC in particular could rely on this metabolic process. For this reason, we decided to evaluate autophagy activation and the effects of its perturbation in CSC from EOC ascitic effusions and from patient-derived xenografts (PDX) and we found that they presented a higher basal autophagy level compared to non-CSC. Autophagy blockade with chloroquine impaired CSC viability, in vitro spheroid growth, and in vivo tumorigenic potential. In addition, autophagy inhibition and carboplatin treatment had a synergistic effect both in vitro and in vivo. Our results suggest a possible clinical application of the combined therapy in EOC as this approach would counteract tumor growth and impair the CSC compartment at the same time, thus reducing tumor relapse. As the microenvironment contribution to CSC maintenance is revealing its growing importance, we focused on SCF, the ligand of CD117 (or c-Kit). Indeed, the SCF/c-Kit axis regulates cell viability, proliferation and differentiation both in physiological conditions and in cancer. Notably, SCF exists both as a soluble and transmembrane protein. We found that the EOC ascites contained high amounts of the cytokine. Soluble SCF was detected only in tumor-associated fibroblasts and macrophages supernatants, whereas the membrane isoform was also expressed by cancer cells. Both SCF isoforms were effective in activating Akt pathway in CD117+ cells, while the tyrosine kinase inhibitor imatinib abolished this effect. Accordingly, results obtained in spheroid assays suggest that SCF stimulation could enhance the canonical CSC properties and imatinib pre-treatment inhibited them. Overall, SCF stimulation might help CSC to survive in selective culture conditions and, more extensively, could support CSC survival in patient ascitic fluid. Besides the role played by CSC in tumor outgrowth, the malignant cells forming the tumor bulk are sustained by pro-tumorigenic protein activation. Thus, we investigated the role of casein kinase 1 delta (CK1δ), member of a kinase family involved in many cellular processes, which is genetically amplified in ovarian cancer and overexpressed in other cancer types. Since CK1δ inhibition induced cell cycle arrest and apoptosis in a variety of tumor cell lines and delayed tumor growth in vivo, we evaluated the effects of CK1δ knockdown on two EOC cell lines (OVCAR3 and IGROV1) both in vitro and in vivo. Silenced cells grew more slowly and were less tumorigenic in vivo. Moreover, CK1δ knockdown sensitized ovarian cancer cells to carboplatin treatment. Interestingly, CK1δ-depleted OVCAR3 cells resulted more prone to migrate in vitro and more metastatic in vivo, but these results need further confirmation in IGROV1 cells. Since numerous small molecule inhibitors targeting CK1δ have been synthesized and tested, it would be important to unveil the molecular mechanism linking CK1δ to metastatic potential before these compounds enter the clinic for EOC management. This thesis encompasses three different topics, characterized by the common aim of investigating EOC biology from different perspectives, in order to highlight novel weak points of this deadly disease.
Il carcinoma ovarico (EOC) è solitamente trattato tramite chirurgia e chemioterapia a base di platino e taxani. Nonostante un’iniziale risposta, nella maggior parte delle pazienti l’esito è la ricaduta e la morte. La causa può essere legata ad una popolazione di cellule cancerose, le cellule staminali tumorali (CSC), dotate di capacità di autorinnovamento, grande potenziale tumorigenico e metastatico e resistenza ai chemioterapici. Per questo, la loro eradicazione potrebbe essere una strategia terapeutica molto efficace. Parte di questo lavoro deriva dall’idea che le CSC godano di un vantaggio di crescita dovuto a caratteristiche intrinseche o a circuiti paracrini che si instaurano nel microambiente neoplastico. Il nostro gruppo ha dimostrato che le cellule CD44+CD117+ sono verosimilmente le CSC nell’EOC. Studi recenti hanno dimostrato che l’autofagia è un meccanismo di sopravvivenza alla chemioterapia e che le CSC potrebbero dipendere da questo processo. Abbiamo quindi valutato i livelli di autofagia e gli effetti causati da sue alterazioni su CSC isolate da asciti di pazienti con EOC e da xenotrapianti. Le CSC presentano un livello autofagico basale più alto rispetto alle non-CSC. Il blocco dell’autofagia compromette la vitalità delle CSC, la formazione di sferoidi in vitro e il loro potenziale tumorigenico in vivo. Inoltre, l’inibizione dell’autofagia e il trattamento con carboplatino (CPT) mostrano un effetto sinergico sia in vitro che in vivo. I nostri risultati suggeriscono una possibile applicazione clinica nell’EOC di tale terapia combinata, in quanto contrasterebbe la crescita tumorale colpendo al contempo il compartimento staminale, riducendo così il rischio di recidiva. Visto il contributo dato dal microambiente al mantenimento delle CSC, abbiamo posto la nostra attenzione su SCF, il ligando di CD117 (c-Kit). Infatti, l’asse SCF/c-Kit controlla la vitalità, la proliferazione e il differenziamento cellulare sia in contesti fisiologici che nel cancro. SCF esiste sia in forma solubile che associata alla membrana plasmatica. Abbiamo misurato alte concentrazioni della citochina in asciti delle pazienti affette da EOC. La forma solubile è rilevabile solo in surnatanti di macrofagi e fibroblasti associati al tumore, mentre quella di membrana è espressa anche da cellule tumorali. Entrambe le isoforme possono attivare la via di Akt in cellule CD117+, mentre l’inibitore tirosin-chinasico imatinib blocca questo effetto. Similmente, i saggi su sferoidi suggeriscono che la stimolazione mediata da SCF può potenziare le proprietà canoniche delle CSC, inibite dal pretrattamento con imatinib. La stimolazione da parte di SCF può quindi favorire la sopravvivenza delle CSC, e supportarle all’interno dell’ascite. A parte le CSC, il cancro è sostenuto dall’attivazione di proteine pro-tumorali. Per questo, abbiamo indagato il ruolo della casein chinasi 1 delta (CK1δ), coinvolta in molteplici processi cellulari, la cui amplificazione genica o iperespressione è stata descritta nell’EOC e in molte altre neoplasie. Poiché è noto che l’inibizione di CK1δ induce arresto del ciclo cellulare e apoptosi in linee cellulari tumorali e rallenta la crescita dei tumori in vivo, abbiamo valutato in vitro e in vivo gli effetti del silenziamento della CK1δ su due linee cellulari di carcinoma ovarico (OVCAR3 e IGROV1). Le cellule silenziate crescono più lentamente e sono meno tumorigeniche. Inoltre, il silenziamento di CK1δ sensibilizza le cellule al trattamento con CPT. Inoltre, le cellule OVCAR3 silenziate per CK1δ risultano più prone a migrare in vitro e più metastatiche in vivo. Poiché sono state sintetizzate numerose molecole che inibiscono la CK1δ, sarebbe importante delineare il meccanismo molecolare che lega la CK1δ al potenziale metastatico prima che questi composti possano entrare nella pratica clinica per il trattamento dell’EOC. Questa tesi è comprensiva di tre differenti macroaree, caratterizzate dal comune scopo di studiare la biologia dell’EOC da differenti punti di vista, al fine di portare alla luce nuovi punti deboli di questa malattia mortale.

In questa tesi di Dottorato abbiamo preso in esame diversi campioni umani di osteosarcoma (O), al fine di isolare le cellule staminali tuin vitro models we could morali (CSCs) e stabilire così modelli cellulari di OS-CSCs (Osteosarcoma Cancer Stem Cells) per individuare caratteristiche peculiari e/o marcatori genetici e molecolari che le contraddistinguono dalle altre cellule differenziate di OS, cosicché possano essere utilizzati quali possibili bersagli per lo sviluppo di nuove e più efficaci terapie. In this work we have collected several human samples of osteosarcoma, from which we have isolated a particular subpopulation, the cancer stem cells, which are probably at the base of all the cancerous processes and in particular of metastastic process.Thank's to the establishment of different cellular models we will be able to investigate on new molecular markers and targets which could be useful in the research of filed